Изопероксидазы и полипептиды запасных белков как биохимические маркеры кукурузы, риса и сорго

Савич, Игорь Михайлович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изопероксидазы и полипептиды запасных белков как биохимические маркеры кукурузы, риса и сорго
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изопероксидазы и полипептиды запасных белков как биохимические маркеры кукурузы, риса и сорго"

( >.

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А. Н. БАХА

На правах рукописи

САВИЧ Игорь Михайлович

ИЗОПЕРОКСИДАЗЫ И ПОЛИПЕПТИДЫ ЗАПАСНЫХ БЕЛКОВ КАК БИОХИМИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ КУКУРУЗЫ, РИСА И СОРГО

03.00.04 — биологическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва—1991

Работа выполнена в лаборатории физиологии и биохимии растений Казахского научно-исследовательского института земледелия им. В. Р. Вильямса, Восточное отделение ВАСХНИЛ.

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Ю. В. Перуанский.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор В. В. Мосолов;

доктор биологических наук И. П. Гаврилюк; доктор химических наук Ц. А. Егоров.

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии и биохимии им. М. А. Аитхожина АН КазССР.

Защита диссертации состоится » 1992 г. в 10 часов

на заседании специализированного совета (Д 002.9o.01) по защите диссертации на соискание ученой степени доктора наук при Институте биохимии им. А. Н. Баха АН СССР (117071, Москва, Ленинский пр., 33, корпус 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы АН СССР ( 117071, Москва, Ленинский пр., 33, корпус 1).

Автореферат разослан « » Ах_1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета

доктор биологических наук Т. А. ВАЛУЕВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ

ДШЗДШВ^МШЕв&ВДН». Создание высокоурожайных сортов и Гйбрддоз сэльскохозяйогя8шшх к7лвгур, сочегзпщих устойчивость к о гроссо зыгл факторам среда с другими хозя;'5ствепио ценными признаками - основная задача современной селекции. Распознавание селекционных образцов по морфологическим характеристикам в полевых условна: - трудоемкий и длительный процесс. Использование лабораторных методов анализа позволяет быстро оценивать растительный материал по требуемым параметрами этой связи разработка теоретических и прикладных основ биохимического тестирования сельскохозяйственных культур диктуется необходимоетыо ускорения,поешрняя эффективности и удешевления селекционного процесса, а гэк;;;о биотехнологических изысканий.

Высокий а специфический полиморфизм запасти белков ¡i ферментов, выявляемый элвктроЗоретическеми методами - основная база для пмсодахоя методов с применением белковых маркеров,главным образом, пшеницы и ячменя (Конзрев.1283; Перуаиганй,193б; СозпновДЗЗб). Изученность в этом аспекте белков кукурузы, риса и особенно сорго намного слабое. Использование количественных методов в определении относительного содержания белковых компонентов или изофер-монтов, разделенных электрофоре зон или пзоэлекх^офокусировэнием (K3Î) о последующей математической обработкой данных, способствует получении ценной информации о растительном объекте. Дальнейшее развитие изложенных принципов ш;гог послужить базой ддя прогнозирования определенных признаков растений по результатам анализа белкового col. :ва зерновки или просо с гик, что обеспечит большую целенаправленность отдельных этапов селекционного процесса я бко-гехнологичссках исследований. Успехи в клонировании гедад зеипа (Ефимов с coaвт., 1988» C-oldebrough et al. ,IS36) и других про-ламянов ставят задачу установления связи между отдельными поли-пепгидамя и биолога ческиш свойствами расгеняй.

В этой езязи представляется актуальным комплексное псследо» ваше двух групп белков,контраст:-!;-: по консервативности примз-кенссм современных биохимических методов и компьютерной техники.

• Цольи насгояцой работы яааялось изучение физико-химических особенностей изотерм пзроксядаяц проростков и иолппепгадов (групп, суб<?ракцпй) зтаасйг'х бзлкоз зернз и установления.возможности их использования в кзтаеггз информативных дрезтюкоз з маркирован:: к биологически:: с:у>йс?з п ¿аотюзпЯ'-

вании генотипов кукурузы, сорго и риса.

В работе решались следующие основные задачи:

1. Исследовать свойства изопероксидаз (сродство к различнш донорам водорода, аминокислотный и углеводный составы, гидро^о'б-ность, устойчивость к денатуратам и др.) с использованием количественных методов и многомерного'анализа.

2. Установить специфичность спектра криоиэоформ пэроксидазы для цзлей биохимического тестирования кукурузы на холодоустойчивое И . _ • " '. ; " .'' ' .. . ; -

3. Выявить физико-химические особенности полипептидов глобу- .. л иное, пролашнов, глвтолинов (уровень полиморфизма, аминокислот- . ный состав.шчшзатели гидрофэбности к др.) с последующей разработкой спссоба распознавания белков и определения их гомологии.

4. Изучить'информативность изопероксидаз проростков я полипептидов запасных балков зерна при кластеризации генотипов с использованием принципов многомерной статистики.

- 5. Оптимизировав способы выделения и электрофоретического разделения запасных белков зерна, разработать методе: биохимической идентификации и паспортизации 1'о но типов кукурузы, сорго и риса.

ЙУИЙЙЙЛ!Показано,что при низкотемпературном стрессе формируется характерный набор криоизсфри пероксэдазы4ко-торь.) отражает степень холодоустойчивости самоопшшных линий, кукурузы. Выявлено две группы изопероксидаз проростков, в условиях холодового стресса. Одна группа.практически Л отличалась от контрольных язоферментов, во второй-(криоизозиш) отмечены качественные отличия по субстратной спещй&ичвосги, удельной активности» аминокислотному составу, антигенной структуре, степени гликозили- • рования. Выявлена корреляционная зависимость между относительным содержанием свободных и мембраносвяззниых изоформ пероксвдазы • листьев проростков., полипептидов запасных белков зерна и некоторыми хозяйственно 'ценными признаками кукурузы и сорго.Показана'возможность использования кластерного анализа при распознавании генотипов с требуемыми свойствами. О продоле и аминокислотный состав и показатели гидрофобностя суб$ракций "и полипептидов запасных белков кукурузы, сорго и риса. Выявлены закономерности в корреляционной , зависимости между содержанием аминокислот в.гцдрофобностью разляч-ных белков пшеницы, ячменя, кукурузы, сорго в риса. Установлена степень гомологии меаду различными классами белков с-вспользо^ кием коэффициентов корреляции между"гидрофобное«.*) и содержат:*. .»

аминокислот. Обнаружен новы*! тип запасного белка в зерна кукуру-. -зы, сорго и ряса.

йшдазшд^шдаш^зшд* разработаны способы: выявления-холодоустойчивых лпшЛ кукурузы; отборп высокобелковых форм растений, выращенных в экстремальных условиях; отбора хозяйственно ценных генотипов сорго; идентификации, распознавания и паспортизации генотипов ряса, кукурузы и сорго; определения уровня гибридноетя семян кукурузы; определения удельной активности изо-пврокевдаз в полиакрвламвдном геле (ПДА!); определения глдрофоб-носги полиморфных белков пс^ле тс электрофорегичсского разделения В ПЛАТ; выявления изоперокевдаз, обладающих антигенной активностью; определения молекулярной массы белков после электрофореза в ШАГ с додецил сульфатом нагрия (ДДС- líe ); распознавания белков и определения уровня вх гомологии. Кроме того, усовершенствован ряд при- ■ боров и биохимических мэгодов с целью сокращения времени анализа и повышения эффективности и производительности груда. С помощью разработанных методов выявлено 60 самоопыяетшх линий с повшен-ной холодоустойчивостью, определена степень биологической чистоты более чем у 200 самоопшенных линий и уровень гцбридности более чем у 20 гибридов кукурузы. Выделено более 40 iano типов сорго,обладающих повяленными шрмовш.я достоинствами. Соответствующие образцы включены в селекционный процесс в Казахском НИИ земледелия. При непосредственном участии автора созданы и проходят государственное сортоиспытание гибриды кукурузы Казахстанский 5А ТВ, Казахстанский Ш МВ.и высоко сахаристый сорт _орго Казахстанское I.

- Выявлено две группы изоформ пероксидэвы. Для одной характерны количественные изменения, для другой - свойственна глубокая качественная трансформация бечеов.

Состав криоизоформ перокевдазы специфичен для каждого генотипа.и '. может служить показателем холодоустойчивости кукуруз и и сорго.

- Полиморфизм проламинов можно использовать для биохимической идентификации, паспортизации и для других сходных целей генотипов кукурузы, сорго а риса. ■

- Обнаружен новый тип запасного белка в иер-я-е кукурузы, сорго и

. риса,'отличающийся.от известных ранее по составу и физико-химическим свойствам.

- Широкое использование кластерного анализа* в биохимических иссле-доЕэтаа* пэзголяет получать ценную и^ормацяэ <5 закономерностях

строения, свойствах изучаемых объектов и составлявших'их биополимеров.

I» Материалы диссертации докладывались на-. Республиканской конференции по физиологическим основам повышения продуктивности и устойчивости зерновых.'культур (Алма-Ата,1976), 2-й конференции биохимиков республик Средней Азии и Казахстана (Фрунзе.1976)р IV Республиканской конференции "Физиологические основа повшония продуктивности ззриових культур" (Алма-Ата, ' 1980), Вдесоюзной школ? семинаре !Л1У "Биологические мембрани" (Звенигород, 1907), Международном симпозиуме "Клеточшга и генназ-биотехнологии для зерновых злаков" (Лша-Дта,К39), Втором Всесоюзном совещании "Генетика развития" (Ташкент, 1990), Координа-ционьлм совещании биохимиков системы ВНР (Ленинград,I9SU),Республиканской конференции "ЙРоблош теоретической и прикладной генетики в Казахстана (Алма-Ата, I99U). Результаты работы неоднократно докладывались на заседаниях методических комиссии Восгоч-«охх» солскцонтра ВЛСХ1КЛ .п ученых советах КазИИИЗ.

Основние подозрения работы оевлцени в 55 статьях б T03iicax#I'f авторских свидетельствах и Т. положительном решении 'на выдачу авторство свидетельств п. ■

Диссертация состоит из введения, обзора литературипх данных Цглам ), экспериментальной части (7 л.ав), заключения, пыоодов, списка литературы (331 источник) и приложения (% стр.), Работа излокеио na 261 сдаиицо машинописного текста, содержит 4ü рисунков и 29 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве основных объектов исследования использовали зрелые семена и проростки кукурузы.(20 гибрвдов,74 самоопилешшо линии),сорго (3U сортообразцов) и риса" (23 сортообразцз).

Свободные-пароксидази выделяли трис-глициновым буером pH 8,3, содержащим сахарозы (СаЕич,1967), мембраносвяэашме-растворами тритона X-IOO, ДДС- на (Савич с соэвг.,1937),либо I М или 0,4^ раствором целлпДазы "Онозуга" ( Griaoii, Idiot,

IS8ü) с последусцш диализом и лио^. ильным высушиванием.

Глобулины В1Д0ЛД7Ш растворами Ь'оСЗ. различной .концентрации (Порушский, Спвпч, 1976; Singt/shepherd Д967),прслакинн -- "3S этанолом, 40% этанолом с-2 Li мочованц при нагревай:«! (A.c.TIS-1333), 7Qi изопропанолом с 4 М ыочов.та:, либо G5;'i ! лро~

пвшлом с нагрезэнием (ПерупнскиЙ, Савич, 1988, 1989), глютелины,-растворамя ДДС- На с последующим осаздением белка этанолом или изопроланологл (вето ,1961; Galili, Feldman ,1985; Савич.Перуан-• ский, 1988).

Для разделения белков на гликозилировашше и негликозилиро-вашша использовали конканавалин' А (Головацкий, Савчик,1937).

Электрофорез пероксидаз проводили в 10% ПААГ в трис-IiCI система (Davis .,1954). В раде случаев в гель д- бавляли мочевину в различных концентрациях (Савич, 1937). ».ЭФ' пероксидаз проводили в 5% ПААГ о амфоликами pH 3,5-10,0 на приборе Multiphor (1KB, Швеция), двумерный электрофорез-в этой яз система после электрофореза первого направления в 10? ПААГ (Савич, 1989).

Препаративный электрофорез пероксидаз проводили в ID% Г1ААГ с последующим элвированием изоферлентов из геля раствором ДДС-На (Савпч, 1289), препаративное ИЗЭ . - в слое ультродекса в интервалах pH 8,0—9,5 и 7.0-10.0 с'применением технологии и оборудования фирмы ь KB (Швеция). Препаративно выделенные изоформы перок-епдазы использованы для определения их аминокислотного состава на ашшозналпзэгоре фирмы ЫСВ модели.4101, а такяо для получения моноспецяЦичаскях гфоличьнх ангисыворогок.

Одно-, двумерный и ракетный иммуноэлектрофорезы проводили в трис-барбитуратном буфере, pH 8,3, в агзрознше пластинках на приборе Multiphor (Еггй, Гаврилтас» 1987;.Брель, 1977). Исследование) пероксидаз иммукоГОЗ осуществляли в агарозном геле с интервалом pH 7,0-10,0 и итяшзоферкзнтным ангшзом с использованием лазерного деь -томогра (Савич, 1290).

Электрофорез запасных белков зерна глобулинов, пролашшоз и глютелинов проводили в уксуснокислой системе в б, 7,5 я I0i ИкНГ с различной концентрацией •ючевшш в геле Шэурер,1971; ÜepyaHCKKii, Садиков, IS73; Попереля, Лсыка, 1938), а гаю*э в щелочной 'иегемо в 10, 12,5 п 1Ъ% -П.4ЛГ с ДДС-Иа ( Lsemli ,IS70). ИЗФ проводили нз приборе Multiphor в ПААГ с различнойкон-ценгрзцп'эй мочсшшу в голе (Перуанский, Савич, IS38). Двуизркый электрофорез осуществляли после рззгонкл белков в первом направлении s уксуснокислом ПААГ с ".гочеганой, а го втором - методом 1135, лпйо электрофорезом с ДДС-За . Гол и прокрашивали пак па белок кумассг; а -2CQ, н -250, серебряным реагентом ( Ksrril et в1, ,I£3I), Tt:;t я па глпколроузиш влшюновиа х-олуйхз я ро-актипол Е'гфТа (Когщ,)31ьога с с^арг. ЛТО4; Könnt et ai. ,IS3*)«

С целью определения аминокислотного состава отдельных полп-пептдаов или их групп запасные белки разделяли методами электрофореза-в уксусной-кислой'системе с мочевиной (Перуанский, Садыков, 1973) и с ДДС-на ( Laemmli ,1970). Белки из геля экстрагировали растворами NaoH ■ .мочевины или. ДДС- Ma ■ а определяли аминокислотный состав на аминоанализаторе модели 4101 ( ьКВ.Шво-ция) по'стандартной методике.

Гидрофобные свойства белков исследовали по связывании с ДДС- На в.рзстюре ( Kato et al.1934). либо в ШГ U.C.I45I599), • а также колоночной хроматографией на TSK- гелях. Kïi-65, .ш-75 • и окгил-сефарозе CL-4B, . В ряде случаев белки подвергали очистке на колонках г сефздексом о -200 или ультрогеле АсА-34. Параметры гидрофоЗности (средний гидрофобноетъ. содержание ыеполяршх бо- . кових цепей и полярность) "вычисляли с использованием аминокислотного состава белкав ( Bigelow .1967; Роршиви.йоаоп .1932).

Глобулины и пролашны в'виде агарозно- белковых пленок сканировали на КК-аиализаторе "ИиТ'рапид-61" (ВИР) в диапазоне 1800-2400 им в режиме оптической плотности.

Пептидное картирование полипептадов пролашшов осуществляли после их препаративного воделения из ПААГ с последующим расщеплением И -броыосукцишмцдом ( Hnzi!:er et al.,I30û) Л двумерным разделением пептидов на целлвлозных цяастинках фарш Eastman Kodak СС1ЛЛ) (Сзвич с соавт.,1£85).

После всох ладов электрофоуетичоского разделения гели.' с окрашенными белковыш зонами или проявившими порокеддазиую актив-ноегь. сканировали с помощь» лазерного денситометра. Соотношение белковых-компонентов рассчитывали по шоцадпм поду.че.:нш. ликов, cyi.аду- которых принимала за Ю0«.Повториосгь опытов 3-4-х и более кратная. ' •

.Данные обрабатывали обычными статистическими методами вычисляли ошибку среднего.арифметического, коэффициенты корреляции (Лакан, 1978), а также методами многомерной статистики (Мартынов с соавт.,1933) на ЭВМ ЕС-1022 (ВЦ ВО ВАСШЛ).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ'И ИХ ОБСУЩЩИЕ

I. Известно,что низкотемпературный стресс,ак-

тивизируя гидролитические процессы, способствует накоплению мочевины т клетках (Дузу, 1980). Последняя, как полагают некоторый авторы (Дузу, 1980; ГогтеХ et el. .*90б). обладает определоннь.

криопротекгорныч свойством. Поэтому сохранение ферментативной активности отдельных изоформ пероксидазы в среде с высокими концентрациями мочевины (6-8 М), выявленное'в настоящем"исследовании, имеет определенный биологический смысл. Наибольшуо устойчивость к действии мочевины проявили мембраносвязашше пероксидазы кукурузы и пшеницы по сравнении со свободными. Использовав для экспериментов пероксидазы, выделенные из листьев проростков линий кукурузы различной холодоустойчивости, была гаццзна специфическая реакция отдельных множественных форм пероксидазы (ГШ) на наличие мочевины в инкубационной сгзсв. При обработке дантс-по соотношении НЗЩ методом кластерного анализа выявлено несколько кластеров. Анализ их состава показал, что при воздействии на IШ мочевиной в концентрации 4 и б М линии кукурузы в целом группировались по степени их холодостойкости. •

Имеются сведения о неодинаковой способности 1йП окислять те или иные доноры водорода (Груиин. Ивакин, 1986; 1тЪегЬу о.ь о1» ,1984; 1Ди ,1975 и др.), чго возможно, является одним из ааадтннзе механизмов расгенийиа стрессовые факторы среды. Как показали наши исследования наибольшее количество 1©П в ПААГ после элек!р'офореза выявлялось с применением беизвдигз-НС1 п о-дианизя-дстна, нзименьшее-с использованием п-анизидина и кофейной кислом. При выдерживании проростков в условиях гипотермии происходила существенная трансформация акгигаости большинства Ш>П по отношению ко всем использованным донорам водорода. Наиболее значительное изменение пктйвяоеги о плече но для кагоднмх №П с относительной электрофоретической подвижностью (ОЗП) 30,75 и анодных Щ>П с ОЭП 9,40,45. Обнаружено-две группы 1Ш1 листьев проростков кукурузы, одна из которых окисляла все использованные органические соединения, а,другая действовала голые"-нэ бензядин-НИ, о дяанизидин. Но данным кластерного анализа бензидян-НС1 и кофейная кислота спецпфигтю проявляли ШП самоопкяэнннх лвнпЙ различной степени холодоустойчивости.

Учитывая полученные данные с различима донорами, водорода, были проведены эксперименты на проростках кукуруза различного возраста (3, 5, 7, 12 суток)с различной степень» холодоустойчивости. После разделения белков электрофорезом в катодном и анодном направлениях, а также ЧЭФ гели проявляли раствором' бонзидлна-НС1 и Н?0?. (рис.1). Используя количественные данные по соотношений

оэп

иэт

5J 5.7

6.5

7.2

8.3 В,В 9,2

9.4 9.7

/0.65

Рис.1. Схемы катодного (А), анодного (Б) и ИЭФ (В) пероксвдаз листьев 7-дневных проростков кукурузы

Ш1 с последующей обработкой да»'чых методом кластерного анализа' выявлено, что пероксидазы лисгьев 7-дневных проростков после вы-держивс:шя последних на холоду наиболее специфично трансформировались по состав:'. Соотношение криоЬКШ приводило к однозначной кластевизации генотипов .кукурузы л соответствии с их адаптационной способность» к пониженным температурам (рис,2). Б "ервнй мастер ыодили только холодостойкие линии, второй кластер содержал два субкдасгера, один, из которых состоял только иг холодостойких форм, а другой включал линии средней холодостойкости.

^Описанные вше изменения относиташгого содержания ЩП лисгьев проростов били выявлены после сравнительно продолжительного крио-cipecca (4 суток). Этот период ыокно рассматриватьнэк адаптгдиои-ный, который протекает неодинаково у генотипов кукуруз'i с различной холодоустойчивостью. Известно, что' уже после 3-4 часов охлаждения проростков начинается синтез специфических белков холодэвого шока (Кузнецову соавт.,1987). В этой связи оказалось, что после 4-часоюго охлзздония проростков происходили характерные изык ..ия с дву..я нзопероксидазамя с ОЭП 30 и 75. когоркз, если судить ..о данным литера туры, кодирувтся локусош-Рх5 и Рх! соответственно

по-г)

60-

20-

£мп

3 4 2 Г 8 5 7 9 Ю П/28 П12в 9 ! 2 3 5 7 4 в 10

Рпс.2. Лсвдогракш сашоныленных линий кукурузцалосгроенние с учетом соотношения кагоднкх ЫШ листьев 7-дневных проростков. I - ВИР 157 ТВ, 2 - ВНР 153 ЗТ, 3 - 04787,

4 - 0634, 5 - ВИР 26 ТЗ, б - Б1-Р 25 МВ. 7 - 04732, 8 - 04299, 9 - ВИР 133 ЗТ, -10 - ВИР 133 ТС, II - Хрущевская ."ВО, 12 - 04784. А - контроль, Б • после кркосгресса

( ЗготЬс1сег в* ей., 19"5). Било обнаружено, чтопосле 4-часового солодового воздействия суша активностей данных изофермзитов, измеряемая в относительных единицах по площади пиков денси?огромм,у холодосгоГ,!..'"- линий товгаалась, а к 4 сухам охлавдзнпя достигала приблизительно первоначального уровня. *

Из- изложенного вше шжно сделать вывод о том, что для ввдз-лейия холодоусгойчпшх лшщй кукурузы необходимо колачостсепно определить соотношение катодных кркоГЙП л ист м в 7-дт,евпых проросг-ков с погощья данситомэхрнрованлп пластинок ПААг. Ц:зчТ<оено даниыо опыхних я контрольного образца (лигпк-дцфферснцЕзтора с высокой холодоусюйчшюсгья) обрабатывай г класгсрэтп анализом тп СБ!,!, ¡; са:.:соп1йовпц0 линии» сбъздаяшхяагся з одет. кластер с холодостоек:?.«

об рззцогл, искользуа* для дальтпГлоД седет:т::ог"эЛ проробогкп при соз-д"5п:п! хе.'гпдо?егоачялгз гяСрпдяз кукурузы.'Ир;, огсугстг-и; дссхупноЗ кс;лпз-:гср:'о;; хс;-::п-;т ллгпч (рзстзигам/ля) холодосго;],:!":

лзплЯ кугтК'з.ч птп.-э зсдал?>зок»гь дян.-.'.жТ' в.гсзп'мкетк ;' г/:с го,~пг; с СЗ! СЭ :: 75 :п::: хг/.одг;: :;;>

пророп;;:п, УЧягпмл иуг.?ховгслк.опь пгрояоида?!:'!:.

ттдя зка.и!гз *9С?ч.то»,» Сгптт, ч^с'ь лногогой глпат:т;:;; .':">:•«

оставляя растение для получения потомства. Последнее является особенно ценным на начальных этапах селекционного процесса при дефиците семенного материала.

Описанные изменения изопероксидазного состава проростков,по всей видимости, связаны с работой транскрипционно-трансляционного аппарата клетки (Титов, Критенко,1985)и, возможно, генетически предопределены (XасооЬ, ра.11оп ,1336). Однако остается открытым вопрос сопряжены ли они с активизацией (изменением конфорлацпц) отдельных изотерментов пли обусловлены лишь количественны:« накоплением тех или иных Ш1. Одним из решений поставленной задачи является измерение вакиейдего параметра фермента - удельной .активности. Так гак препаративное выделение отдельных лзодзрментов -- трудоемкий и многозвенный процесс, связанный зачастуя с потерей минорных изоформ, был разработав метод определения удельной активности МФП непосредственно после разделения пх суммарного препарата в ШАГ электрофорезом или (А.с.1451599). Метод заключается в наизеениа равных количеств препарата фермента на два дорожки ПЛАТ, которые после окончания электрофороза разъединяют е одну из них обрабатывают на пероксидазную активность, а другую -на белок. Величину ферментативной активности и белкового содержания находят после денситоме дарования гелей по заранее построенным калибровочным графикам с использованием стандартного препарата порокездазы из хрена. Отнеся полученные данные по ферментативной активности к бечкоьому содержанию ШП. рассчитаны взличшш удельной активности отдельных нзоформ.

Анализируя результаты исследования, мокио разделить №П кукурузы 'И пшеницы на два группы. К первой относились с-аби. чгее №П, на удельную активность которых низкотемпературный стресс не оказывал существенного влияния. Вторая, группа состояла из криоцзоформ, удельная активность которых при холодовом юздойстши изменялась в 2-3 и более раз ШИ гибридов кукурузы с изоэлектрцческими' точками (ИЭТ) 3,25; 5,10; 6,60; 7,20 с ОЭП 22,46 и др., а такк* М5П сортов пшеницы с ИЭТ 3.90; 4,10; 5,40; 5,95; 7,70 с ОЭП 6, 70 и др.). Трансформация удельной активно'сти криоЬЙП по-ввдиьпму связана либо с изменением ко»$оркаци:1 всей молекулы или субстратсвп- ■ зывающего участка активного центра (Александров, 1985;Алексеев с соавт.,1383), либо в отдельных случаях, с биосинтезом новых форм перокевдазы, резко отличающихся по удельной активности от ЫЗП, имеющихся в клетках при опт шг. .ьных теишературных условия:- .

Вследствие высокой удельной активности основных (катодных). МЗП не удалось выяснить причины их изменчивости при криострессе. Поскольку известно,что основные изофсрмонты пероксидазы являются довольно сильными иммтпогенаш ( clark,сопгоу .1934) предпринята дальнейшая работа по выяснению путей трансформации основных МШ проростков нмыунохамическими методами. Для этого двумя высокоочН' ценными группами Щ-П кукурузы с ИЗТ 8.3-8.3 и 9.1-9,2 были проим-мунизированы-кролика я получены к ним специ$"ческие антисыворотки (Савич, 1990).

Цри сравнения измен екчй относительного содержания Ш1 из 7-дневных дроросгков кукурузы а норме и после низкотемпературного стресса с их омцунол'мнческой активностью (данные пммуно-ИЭФ) найдено, что эти изменения носили иногда разнонаправленный характер. Так. уменьшение относительного содержания изоформы с ИЗТ 8,3 почти в 3 раза практически, не отражалось на интенсивности образования дуги преципитации. II наоборот, когда холодовый стресс не влиял йа относительное содержание пзо^ор.щ с ПЭТ 9,2 у нехолодоустоачи-¿ых самоопшхетшх линий, ее антигенная активность при этом значительно возрастала. В других случаях следует указать'на совпадение йзмеиеняя относительного содержания" ЬШ с их способное гьо образовывать иммунные комплексы (ШТ с ИЭТ 8,8 и 9,1, У холодостойких самоопыленных линий). По-видимому для основных пероксвдаз существует два механизма изменчивости при криострессе проростков кукурузы: по первому происходят лишь количественные изменения в. их содержании, по B'vipoiiy осуществляется качественная трансформация изоформ с существенными изменениями их. физико-химических свойств.Последнее приводит к С1руктурныи' перестройкам белковых молекул, что S свои очередь влияет на антигенную активность к специфическим антителам. Обнаружено, что подобная шд^икация антигенной структуры изопе-роксидаз происходит по-разкому у генотипов, различающихся по холодоустойчивости. ...

В связи с тем, что цри гшотермия происходят, не тгдысо количественные изменения в содержании ton,, .но л их качественные преобразования шяно предпэлога^ь о возмогдасгп. биосинтеза новых изоформ (криоформ) или существенном перераспределении имевшихся ранее (изменения в мпкрогетерогенносги). Для изучения этого вопроса пс-йользовзн вмянокислопыА анализ,а на отдельных этапах • двумерный. электрофорез. '

, Аминокислотный анализ препаративно, наделенных 1ЯП в норме и

после охлаждения проростков кукурузы показал, что у холодоустойчивого гибрида Днепровский 247 МБ увеличивалось содержание лизина, лейцина и уменьшалось - глицина, серина, аспарагиновой кислоты практически во всех 1,Ш (табл.1). В то же время у нехолодостоЕ-кого гибрида Г-1001 выявленные закономерности были выражены' менее четко. Что касается средней гидрофобности, то для 1Ш холодостойкого гибрида обнаружено ее увеличение в опытных образцах по сравнению с контрольными.

После, обработки результатов аминокислотного анализа ЩД одним из методов многомерной статистики в норде и после охлаждения проростков выявлено, соответственно, три и четыре кластера.ЦричаМ в опытах без охлаждения в кластерах оказались !ЙП разных гибридов и какой-либо закономерности в их группировании определить не удалось. Однако, после охлаздения проростков зфансформация оминокис-лотного состава привела к кластеризации четырех ГШ гибрвда Г-1001 с высокой электроС&оретической' подвижностью' во второй клас- ' тер. При этом четыре ШЩ другого гибрида Днепровский 247 Ш оказались в третьем кластере. Характерно.что четыре кластера в опытах после охлаздения сформировали два'супер-кластера, в каадый.из которых вошли, в основном, Шй своего гибрида (рис.3).

Использование корреляционного анализа позволило выделить • пары аминокислот, связи иеэду которыми оставались устойчивыми независим от условий опытов (греонин-гистщшн, изолейцин-лейцин, лвЯцин-^ениладочии и др.). Обозначилась и другая группа па]» аминокислот, весьма чутко реагирующих на воздействие холод«,; .¡;а рас- ' тения (пролин-лйзйн, вадин-аргинин, треонин-лизин и др.), КоосН фициа'нты корреляции между последними в значительной с.-пани опре- . делялись температурой окружающей среды. Аналогичные закономерности в изменчивости аминокислотного- состава изоцюрм пероксвдазы обнаружены в у пшеницы при использовании контрастных по морозоустойчивости сортов (Богаршя 56 и Альбадум 114).

Обнаруженный феномен изменчивости аминокислотного состава 1ЖИ кукурузы и пщеиицы при воздействии низкими температурами на . Проростки можно объяснить неоднородностью отдельных ЩЛ. Это действительно било обнаружено при проведении двумерного о.'*екгро- • пореза (Савич, 1989). '

Такта образом, при жестком холодовом воздействий на щхэрост-ки кукурузы и пшеницы происходит изменение вксцрессии генов,-вечзвдях за синтез изоферментов пержевдази. При этог-: усилш. л-'

Аминокислотный состав основных изоформ пероксвдазы листьев 7-дновных проростков гибрвда кгогрузы, Днецровскяй 247 Ш, мол Л

Аминокислоты : Контроль : После криострессз

" % %) " *75 '

Аспарагтговая 9,34 8,90 5,26 5,65

Треонин 3,27 4,10 3,82 З.Л9

Серии 8,87 12,32 6,06 5,23

Глутаминовая 9,81 • 13,01 10,70 10,73

Пролнн 3,97 6,84 5,48 5,65

Глицин 18,69 20,09 16,90 16,10

Аланин 8,17 8,22 8,13 6,21

Валин 3,50 3,42 5,74 3,95

Мзтионин 1,40 0,68 2,23 1,41

Изолейцин 5,37 3,65 5,26 5,65

Лейцин 7,24' 4,79 10,20 9,60

Тирозин 1,40 Г. 14 2,07 2,26

Зенилаланин 2,33 1,60 3,18 3,39

Гистидин 6,54 4,33 4,15 6,50

Лизин 4,90 3.20 5,90 6,50

Аргинин 5,14 3.-12 4,96 7,06

щ^штхяятШют

Гидрофобносгь, кал. О) 803 695 1020 1001

Ш) 506 518 569 564

НБЦ и,24 0,21 0,32 0,31

Полярность 1.19 1,27 . 0,89 1,11

ся образованна специфических крио-ШУП, которые блпгодгря иным Фиянко-;:гг,тчес::гм свойсгвэи (смстючлсяогпкЗ сосгав.заряд мэлэкулы, гидрофойгасть) глохтт ¿зрмально йупкцаоппрсгзгь в отроссогкх ус-

ло еж.

Как язсэс;ко«бодкз'Шстш пзопзрексгдяо рзотедаЯ содержат в своем соо?зЕв углеюдгкз остатки (Сарсапбаоь, Пслйкб^гово.'ШЗб; ЗоЬгг еб .-а. дсзгз). Одгокэ янчормсц'тл с'; язг.ганчявости углеводного состава "31 при кргястрочсв п капзотрггсзм ;пи количеств-зигот:

1 II, 7л 1 и Ш IV

Рис.3. Дендрограмш основных ЮТ листьев 7-ддавиых проростков кукурузы, построенные с учетом их аминокислотного состава.

А - контроль, Б - после криостресса

Цифрами обозначены ОЭП соответствующих г.ИП (без штриха - Днепровски!: 247 МВ, сг штрихом - Г-1001)

аспектах отсутствует. Как показали результату настоящего исследования в соспле свободных МГЛ проростков с ИЭТ 3,3; 3,5; 3,9; 4,1; 4,3; 5,0; 5,1; 9,1; 10,65 обнаружены, остатки глюкозы, а • 11ФП с ЮТ 8,8 и 9,2 содержали оста пси маннозы. С помощью кластерного анализа показано, что холодэвый стресс значительно 'зменял степень гчикозалирования отдельных Ш1, а также их качественный состав. • .

Коррелящюншй анализ содержания -свободних.нз связанных со структурами ГШ.и МШ-гликопротешюв, иозюлил выявить взаимосвязь меаду группой целочных №П суммарного препарата и кислыми .счофор-мами - гликопротеинрми с остатками глюкозы, а тагосе пезду БЗД с остатками глюкозы и маннозы с ИЭТ 7,2-8,8 и некоторыми изоформами, содержащими остатки глдаозы (на рисунке 4 представлены в графитес* ком вида толы:о коэффициенты'корреляции 0,7 и выше), Холодовый стресс изменял соотношение пероксцдаз-гликопротеиков, что приводило к изменении коэффициентов корреляции между изоформами.Ках. видно из рчсутса 4, количество высоких корреляционных связей ноеилось намного больше. Усиливалась взаимосвязь между щелочными (И2? 0,3; Г.2; 10,65),. нейтральными (ИЭТ 7,2) и кислима (ИЭТ

Г'

Рве.4. Взаимосвязь мезду свободными МШ суммарного препарата (С), изоформоми, содержащими остатки глюкозы (Г) и остатки глюкозы в ыаннозы (Г+.М) листьев 7-дневных проросгкоа кукурузы (по ;;ашшм 1Ш). Сплошше линии -положительные коэффициенты корреляции, прерывистые --с тщательные.

Вердая часть схемы - контроль, нижняя (со штрихом) ■ после криосгресса

3,5; 4,1; 5*0) изотермами с остатками глюкозы я шннозы с одной стороны и щелочной группой суммарного препарата и ГГИ.содергмщих мономеры глюкозы - с другой. Аналогичное усиление взаимосвязи выявлено для аошевязаншле перокевдаз. При этом обнаружена тесная взаимосвязь кислых 1,Щ суммарного препарата ионосвязаглой фракции с'кислыми и нейтрально' заряженными Ш?П, .содержащими тономерн глю-' козы и шшозы.- '

Такш образом, обобщая вышесказанное необходим» отметить,что большинство свободных я ионослязанных МФП лиегьез проростков кукурузы являются гликопротеннами. В их состав входят в различных соотношениях остатка глюкозы и маннозы. Как . показано с помо^ьз количественной оценки содергшкйя Ш1 и кластерного апзляза' хо:;з-

довдй стресс существенно изменяет углеводный состав изоформ па-роксидазы как в количествённом, так и в качественном отношении. Очевидно происходят пострансляционные изменения ,с участием клеточных глокозидаз. Цри этом число высоких коэффициентов корреляции меяду изоформами. пероксддазы возрастает.

Изучение связей между биохимическими показателями и хозяйственно ценными признаками культурных растений - важный этап в ■ускорении селекционного процесса. Наиболее перспективными в чтом отношение являются запасные белки зерна и'ферменты цроростков (Перуанский,193б). Из последних прежде всего следует выделить пёроксидазу - полифункциональный фермент, кодируемый большим числом локу^ов (Левитес, IS66) и,как слодсгвие,ойлада»вдВ значительным полиморфизмом Это дает основание предположить о сопряженности отдельных 1Ш.И-&Х групп с биологическими свойствами . растений. С учетом того, что наряду с высоким полиморфизмом и повсеместным распространением в растительных тканях, пероксядаза . обладает чувствигашюстью на уровне радиоизогопных меток ( Monroe, 1984), а получение ее препаратов на требует болтшго количества растительного материала и дополнительной очистки, данный фермент идеально отвечает требованиям, предъявляемым к биохимическим маркерам. •

Как показали результаты исследований,использование в качестве информативных признаков при многомерном анализе данных о составе различных фракций пероксидазы позволяе т выделить геногшш,со читающие 2-3 и более приздакоз, ценных в хозяйственном отношения (Савич, IS80). Так, при применении свободной фракции пероксвдазы выделяются в зависимости от вида электрофоретическ- -*> разделения: • скороспелые формы с хорошей всходастьв при пониженной температуре и большим количеством зерен в по.чатках; высокорослые растения с крупней початками и большой массой 1000 зерен; либй. холодоустойчива. линии с хорошей энергией прорастании и всхожестью при пониженных температурах в сочоташи с большим количеством крупных зерен в початках, - •

Если в качества информативных признаков учимцши данные по соотношению поиосвязанных МВД кукурузы, то образцы грушжрова- . лксь в кластеры, состоящие из двухпочатковцх высокорослых.растений с большим количеством листьев; высокорослых pacreiwi! с толо-тш.-л стеблями и относительно коротким вегетационным период-либо холодостойких, с высокой онер.'иой прорастания н всхо:.. .„тьв - при пониженных температурах (рис.5).

При использований для обработки на ЭВМ данных по соотношении поездептгасвязэнных МОП ввделялись свмоопвленные линии кукурузы, сочагавщиа холодоустойчивость с повышенной всхожестыз-при низких гемпвра турах и большим количеством зерен в початках, либо первые два признака со скороспелостью. Слэдует отмогвгь.чго поскольку хо-лодовый стресс значительно трансформировал состав всех трех фракция пероксндазы изменялся и состав кластеров. При зтом происходило наиболее чаткоз группирование генотипов но ох холодоустойчивости, энергии црораогснвя и всхожести при пошиенйых гзжсрзтурах в сочетании с гакяии цгнкыии свойствами растений как количество ререн в початках, массе 1000 зерен и высокОрослосгьэ. Это можно проиллюстрировать кластеризацией сакоопиленных линий по соотношения связанных пэроксидаз по денным"ИЭФ (рис.5).

г пчегкеы гагат net и si imtirb ti a rt v

ent4*si ittstsei ¡cantil rtttnttn* Í TToTv « и га"п?Т

Рис.5. Дандрограшы сомоопылептшх линий кукурузы, построенные с учетом соотношения iío но с вяз энных (А,Б) и ковзлентко-связанных (В,Г) пзофорл пвроксидозы листт~в 7-дневннх проростков ну1сурузы.

А, В - контроль; Б.Г - г.осло криосгрессз I - 04731, 2 - Р ¿323, 3 - Р 2325. 4 - Л 672, 5 - ? 2306, 6 - Р 2327, 7 - Р 2516, 8 - BMP 26 ТВ, 9 - Ж 184-2, 10 - 1Ж .142, II - U5394 c.I3Ü2. 12 - ХЛГ 162, 13 - 05324 с.1300, 14 - U634, 15. - 05349

Использование корреляционного анализа позволило выявить высокие достоверные коэффициенты корреляции между содержанием отдельных МШ всех трех фракций порокеэдазы и таких показателей как холодоустойчивость, масса 1000 зерен, длина початка, .продолжитель-' но с гь. вегетации и др. В таблице 2 показаны в качестве примера, •связи между содержанием-'неко торых иокосвязанных ШД и биологическими свойствами растений.кукурузы. Так же как для свободной и ковален^носвязанкой фракции наибольшее количество коэффициентов корреляции обнаружено для Min, разделенных ИЭФ. Из данных таблицы видно/ что. в целом гшы коэффициентов корреляции конно разделить на две большие группы. На одну группу (стабильную) холодовый стресс не оказывал значительного юшкния, коэффициенты корреляции другой подвергались существенны.! изменениям (табл.2). Наличие аналогичных групп -пероксидаз обнаружено такж.о для свободной и кова-лентносвязайиой фракций проростков кукурузы, а также для проростков сорго (Савич, 1989). - .

Исходя из данных литературы и по результатам собственных исследований возможны, по крайней мере, два пути индукции стрессовых изоформ перокеддазы: I) биосинтез de novo и 2)/ыолекулярно-структурные перестройки, ферментов, имеющихся в клетке (рис.6) .Для первого пути ваяна экспрессия генов стрессовых белков ( Austin, 1987). Имеющиеся сведения указывают па наличие в ядре ¡слетки таких генов, которые начинает функционировать в экстремальных условиях и синтезируют новые белки с иной (ВоШшков с коавг.,1986; Коса-ковская, 1983; ¿ach, цо ,ISoS) или со сходной ( Ееегсаупаку, 1986) молекулярной массой, л о отличающиеся специфической антигенной г^руктурой. В настоящем исследовании последнее найдено для крпоформ пероксадазы проростков кукурузы.

Эксперименты с пигибированием транскрипции актшюшцшюм Д. и трансляции - цлклогекеншдом ц хлоралениколоы показали снижение адапта"ионных свойств озимой пшеницы при холодовом и тепловом, стрессах (Бурбаиова, Родченко, 1937; Титов, Крктенко, 1985) .IIa примере кукурузы и льна продемонстрированы быстрые изменения в геноме в ответ на стрессовые воздействия. Кулис полагает (Cullia, 1986), что данные процессы могут ограниченно реорганизовывать геном в определенных участках. Но исключено,что эти участки включают струкгурино и регулягорные гены. Описан ген, способный постраис-лкцтнно мод;^! ;яровйть продукты независимых кодирующих пероксп-дазу доку<у>п (aiclc at nl. ,1979).

Коэффициенты корреляции медду ионосвязвнннма листьев 7-дневных проростков и биологическими признаками кукурузы

Таблица 2

!енты корреляции медду ионосвязвнннма ¿'.Ш листьев [х проростков и биологическими признаками кукурузы

Признаки" Контроль П^Лрио-

■ Катодный электрофорез

39х - количество, листьев на растении -0,17 -0/54

39 - продолжительность веигации -0,45 -0,63

70- - количество листьев на растеши -0,53 -0,',5

75 - продолжительность вегетации »0,75 0,06'

•75 - количество листьев на растения -0,32 0,72

75 - высота растения -0Д4 0,63

Анодный электрофорез

9 - длина початга -0,16 . 0,67

92 - всхожесть не опр. 0,34

ИЗО

3,3й- количество листьев на растении -0,73 -0,30

3,9 - энергия прорастания 0,16 0,61

6,5 - масса 1000 зерен 0,84 0,32

6,5 « диаметр початка 0,68 0,24

8.3 - од., -анпе белка в эндосперме 0,51 0,60 9,1 - холодоустойчивость 0,18 0,60

9.4 - всхожесть ' 0,63 0,32 9,4 - холодоустойчивость 0,01 0,92 • 9,7 диаметр стебля . -0,09 0,60 10,0- количество початков на растений 0,56 • 0,61 10,65 - масса 1000 зорен 0,72 0,27 10,65 - длина лочагка • • 0,61. 0,33

. х - ОЭП и т ИЭТ соответствующих МФП

К молекулфко-структурным перестройкам следует пр^де всего отнести конформациокныэ изменения пероксвдаз проростков пшеницы цри действии холодом, что выражается в трансформации сродства фер-

Нормальный набор изопароксиаз

Изменение в блоспнгезе

■ Работа оегуля-гпрных генов

¡Изменения в сис-

теме трансляция

Функционирование генов сгрес соеых белков

Глккозили-роЕзнве

действие саецефичес ких про те-

Конфо: мацион 1Ш2 изменена 'третичной структуры

Трансформации активного центра

Переход латентной $ормы в акгпввуп

ЕоЕые стрессов:;? Езофорвд пезоксй' даз

Исходные пзоферненгы. но с пиши йизико-химическем'и свойствами

СтрессоЕыГ; набор Езопероксияаз

Рлс.б. Возшгнай механизм трансформации нгопероксвдаз

манюв к донорам водорода (Алексеев с соавт.,1983). В настоящем исследовании показано, что охлавдение проростков кукурузы существенно изменяет сродство отдельных !Ш к донорам водорода. По данным кластерного анализа ббнзидин-НС1 и кофейная кислота специфично проявляли 1Ш самоопыленных линий кукурузы с различной степенью холодоустойчивости.

С поьющыз корреляционного анализа на пророотках кукурузы и сорго показано наличие трех групп корреляционных зависимостей между 1Ш. 7 первой (стабильной) холодовый стресс сколько-нибудь существенно не влиял на коэффициенты корреляции. Во второй группе (шоковой) коэффициенты корреляция между №1 значительно изменялись уже после 4-часоюго низкотемпературного воздействия и третья группа (адаптационная) состояла из изоформ пероксидазы, взаимосвязи мажду которыми изменялись только после длительного криосгресса (4 суток). На основании проведенных экспериментов было выявлено,что МОД различных по холодоустойчивости генотипов кукурузы по разному реагируют на продолжительность гипотермии и на этой основе разработан метод определения холодоустойчивости кукурузы ш динамике изменчивости двух катодных изоформ пероксидазы (А.С. 1519585).

Дальнейшее изучение изоформ пероксидазы с использованием количественного подхода позволило выявить два механизма изменчивости: по-первому происходят лишь количественные изменения в содержании ГШ, по-второму - их качественная трансформация. Это вцранает-ся в изменении их удельной активности, аминокислотного состава, микрогетерогенности, антигенной струкг/ры, степени гликозилирова-ния.

■ Таким образом, в результате всех упомянутых процессов при воздействии на растения стрессовых факторов в клетках формируется уникальный стрессовый набор гопэроксэдаз(рис.6).»В устойчивых растительных организмах данные изоформы образуют оптимальное для нормального функционирования соотношение белков с требуемыми свойствами. У растений, не устойчивых к стрессовым воздействиям, генетического потенциала организма не хватает для того, чтобы сформировать оптимальный изоферыеигный комплекс, и ~ критических'ситуациях это монет привести к летальному исходу.- Разумеется, в сложных саюрегулцрувцих системах, каковыми являйся растения, где тлеется громадное количество биополимеров и надмолекулярных структур и образовании, выживаемость организма ни в коей мере не определяется одними пзроксидазами, однако последние г,лгут нести достаточную пп-

формацию о физиологическом состоянии растений и служить критерием устойчивости к стрессовым факторам. • ' •

ЙЙ0ЙЩДУ> Глобулины-солерастворимыа белки, содержание которых в евдосперма .злаковых, относительно невелико. Как правкш,глобулины иксграгируюг из зерна I M Heel на холоду. Недавно в зерне пшеницы обнаружены высокомолекулярные бедки, для экстракции которых необходима повышенная температура (40-60°) и водные растворы, солей или детергентов. При электрофорезе в щелочных условиях с ДДС- Na белки обнаруживались в виде трех полос (^иплетов). На основании того,что гриплетиые белки быстро расходовались при прорастании и накапливались в белковых телах п^и созревании, авторы ( singh,shepherd .IS87) отвели им роль■ запасных белков.

Как показали наши исследования,белки,■выделенные из эндосперма кукурузы, сорго и риса I-M раствором îleci при температуре 60° по электрофоретической подвижности совпадали.с термостабильными белками пшеницы. Использование позернового анализа и сканирование гелей денситометром позволило установить варьирование по соотношению полипептидов внутри линий кукурузы." сорго. По молекулярной массе термос га б ильные белки, обнаружили отличия медпУ.видами растений. Самый легкий из триплехных. йелков кукурузы имел молекулярную массу 166 кД, аналогичный - у сорго - 175 кД, пшеницы - 145 кД. риса - 140 J-JU • • - -

С помощью коло ночной гель-проникающей хроматографии на удь-трагеле ЛсЛ-34 трипдетные белки были отдалены от средкемолекуляр-Ных (50-100 ьД) глобулинов. Как показал аминокислотный состав, гри-плетные белки отличались от среднемолекулярных глобулинов по содержанию аспарагиношй и глутаминовой кислот. Наиболее гидрофобными среди изученных белков были среднемолекулярше глобулины пшеницы и сорю, наибольшей полярностью отличались триплетныо белки кукурузы. Сам по себе состав триплатных белков был. необычен для глобулинов, что выражалось в повышенном содержании серина, глута- ■ ыиновой кислоты, пролина, глицина и пониженным - аспарагиновой кислоты, треонина, лизина и аргинина. Ниже будет, показано, что. применение раствзров этанола или нзоцропаиола при нагревании извлекало из зерен кукурузы, сорго и риса белки сходного аминокислотного состава (в - и Е-субфракции) (см.табл.6). Более того, электрофорез в уксуснокислой системе с мочевиной в ШАГ позволил установить сходную электрофоретическую подвижность тер,мостабияышх глобул-иВ - и Е субфракций. Иммунохимическиш методами была обнару-г

гомология триплепшх белков пшеницы лег/мину■гороха, аналогичным запасным белкам овса,, риса я некоторых двудольных растений ( Stegh et ей.,1988).

В настоящем исследовании методом двойной 'иммунодиффузии в згарозном геле установлено антигенное сходства между термостабиль-ньг.та глобулинами и глвтелинами'кукурузы, выделенными растворами ДДС- Na . Однако, полученная антисыворогка к глюгелинам кукурузы не реагировала с гермост8бйлъными глобулинами пшеницы, риса,сорго. Лнтизеиновая сыворотка также не давала итда/нопреципитатоп с этими белками.

ИК-спектроскопия позволила выявить одинаковые максчумы поглощения у триплегных белков кукурузы, сорго и риса в области 14501460; 1720-1725; 2165-2170; и 2310 ш, а у аналогичных бел го а пшеницы обнаружено два общих пика в областях 1720-1725 и 2165-2170 w

Таким образом,.представленные данные позволяют сделать вывод о наличии в зерне кукурузы, сорго и риоа термостабильных,высокомолекулярных белков со своеобразным аминокислотным составом. 3 связи с тем, что они аналогичны ранее обнаруженным триплетным белкам запасного типа пшеницы, можно использовать их в качества маркерных прлипептядов раннего'прорастания и соьровзния кукуруэд,сорго и риса.

; Дроламлны - наиболее несбалансированные по амино-

кислотному, составу,-но в то гч время характерные белки злзк;овнх. Использование для их экстракции 702 этанола, содержащего 2 М мочевины для ; '"урузы П риса та 70» изоцропанола, содержащего 4 М газчевияы для сорго с последующим электрофорезом или ИЭФ в ПААГ, повволило получать високогетерогенные и специфичные для каждого генотипа спектры белков.

После электрофореза компоненты спиргорас творшлэго белка риса формировали 4 группы ила субфракции. Для удобства определения ОЭП, относительная подвижность мощного компонента, расположенного в центральной части спектра п хорошо вдвнтифедяруешго ка электро-форегра!,мах принята за 50. Относительно его положения рассчитывала ОЭП остальных белковых полос. СУбфракция А вк.~эчала компоненты с ОЭП ог О ДО 33, В - от 39 до 59, .С - от бй до 76 и в - от 77 до 100 (габл.З). С помощьп предложенной схемг регистрации положения белковых компонентов оказалось возможным представить казднй сорт в виде специфической белковой формулы (габл.З).

Для целей идентификации самоолалешпас' лапвй кухугузн -Зал раз-

работай метод ИЭФ (А.с.1423070 ). Как показали данные ИЭФ полипептиды спирторастворимого белка зерна кунуруэы-зеина занимали в геле 43 позиции согласно своим ИЭТ (последние находили по белкам-маркерам с. известными ИЭТ), ИЭФ - спектры, эеиновых бег ков отчетлив^ делились на три зоны или субфракциа, которые обозначены с*;, _/з и у.. оС - субфракция преде гашена 11-16 полипецгвдами слабой интенсивности, £ -субфракция состояла из П-15 долипепги-дов, содержащих большое количество белка и $ -субфракция. - наиболее бедная пь числу полипептидов (0-4) и их белковому содержанию. Первые' две субфракци.. по характеру, локализации полипептидов. дополнительно подразделены на. три группы: о, 1 рН 4,00-4,80; ©< г РН 4,81-6,09; о^ з рН 6,10-6,76;рН 6,77-7,20 ^2 рН 7,21-7,55; А 3 рН 56-8,13. $ -субфракция вкчвчала полипептиды с ИЭТ в интервале рН 8,14-9,00. Исходя из полипепгвдтого состава зеина, составлены белковые формулы самоопылениях линий, где позиции полипептидов обозначены их ИЭТ (табл.3). .

Фракционирование белков из зерна сорго встречает дополнительные трудности из-за наличия танинов (полифечолов), сосредоточенных главным образом во внешних слоях зерновки (тау1ог еЪ а1.,1984). Поэтому необходимо перед извлечением белков освобождаться от танинов,водной экстракцией. Как покзе^.п: результаты исследования,наибо- • лее полиморфный спектр спирторас,своримого белка кафирнна в ПДАГ. выявляется при экстракции белков 70'.'. изопропаюлом, содержащим 4 14 мочевины при нагревании. Для расчета ОЭП положение одного из компонентов кафирина, легко идентифицируемого' на электрофоредаммах,принято за 40. Весь спектр до харакгеру-состлвляющих компонентов и их локализации разделен на 5 групп или- субсидий: А (с ОЭП от 0 до 30), В (31-40), С; (41-54), Ь (55-54), Е <65-100), На ось зании данных, по ОЗП качщого компонента, составлены кафи^-иновые (белдошо) формулы. Каждому генотипу свойственна своя уникальная формула (таил.Я). Для распознавания близкородственных.генотипов желательно применять метод ИЭФ кафиршкших белков (см.рир.7К

На основе метода электрофореза восстановленные 8вияршх".б.ел- ' ков,.разработан к внесен в пракшку-контроля за семаиоврдчсским процессом метод определения уровня гибрвдности семян ктцуруеы V (А.с. 1595407). ,

Применение количественны/ методов а налив а (денек гоыетрирова-ние гелей) с последующим вычислением относительного содержания каадого компонента и обработкой полуденных данных методом класхе

Таблица 3

Белковые (цроламиновые) формулы генотипов злановаг

Наименование образца:

Белковая формула

Аасг В

Лрияубавекий В ВНИИР 1390

Рис (по данш-1 электрофореза)

А II 12.15 16 19 21 22 В 40 50 55 58 С 52 66 69 . 75 в

А 27 29 -В 40 50 55 58 С 62 60 70 В

В 40 ¿0 55 ¿6 С 62 65 5

85 . 85 95 77 85

Кукуруза (цо данным ;

Йстювска*{ 4 40^4 55 1 4,95^25 5.35 1 ■ 380 4,80 а,и0 5,93 ^а

,/7 6,80 7,00 : 7,33 7,40 : 7,65 7,75 .03 7,10 7,15 : 7,50 7,60 : 8,05

ХДГ 192

4,40 4,55. 4,80

4,95 5,25 5,35 5,93

6,13 6,35 6,50 6,30

6,80.7,00 7,03

7,33 7.40: 7,50

7,75 7,80 8,05

8,30

Оорго (по данным электрофореза)

55 Е 74 94

В 55 59 Е 68 74 94

В 32 34 37 40 С 42 45 47 51 53 Б 55 57 62 В 67 82 94

Ранний

янтарь 161 А 19 24 27 29 В 32 34 37 40 С 42 44 47 51 Б Днепровское

69 А 18 23 26 29 В 32 35 37 40 С 42 49

Низкорослое 93 С А 25 29

ного анализа-позволяет выявлять сходство и различия исследуемых генотипов го составу проламинов.

Таким образом, опирать на..полиморфизм спнрторастворпмых белков зерна риса, кукурузы и сорго,разработаны способы идентификации, и паспортизации генотипов. Предложенная форма записи положения белковых компонентов (полипептвдов) допускает хранение информации в памяти ЭВМ с последующим созданием банка данных генетических ресурсов этих видов растений.Использ^вание количественных принципов тестирования и компьютерной техники дает возможность распознавать родственные по происхождению сортообразцы или выявлять чужеродный генетический материал.

Для выяснения природы субфракций проламинов, полученных электр'форезом в уксуснокислой системе, был.проведен аминокислотный анализ. В таблице 4 представлены по в и Е субфракциям по

двум видам растений: кукурузе и сорго. Субфракции А, В и С являлись истинными цроламинами и характеризовались пониженным содержанием лизина и повышенным - глутаминовой кислоты, (аналогичным составом, обладали А.и В субфракции белка риса). СУбфракциа о и Е имели очень своеобразный аминокислотный состав, не похожий ни на один класс запасных-белков. Наиболее характерными особенностями этих двух групп компонентов было высокое содержание глгщина, серина и пониженное - лейцина (табл.4). Близкий состав имела- в - субфракция белка риса (Перуанский,Савич, 19901..Субфракции А, В и С оказались более гидрофобными (повышенная средняя гидрофобноегь. Содержание НБЦ а пониженная полярность) по сравнение с субфракциями о и Е (гаьл.4).

Используя принцип двумерного электрофореза, был изучен полч-пеп тканый состав спир гора с творимых белков кукурузы и сорго. Дри этом обнаружено, что субфракции А и В сосгоялй из грех трупп полипептвдов, причем на долю высокомолекулярной группы (100-400 кД). субфракции А приходилось 53полипептидов, в основной группой субфракции В были низкоыолекуляркьге полипептиды (19-24 цД) . Субфракция С состоя/т только из полиезптидов 19-24 кД. Белки О и Е субфракций представлены низкомолекулярнши полипепгодами с молекулярной массой 20 и 17 кД соответственно. При восстановлении дисуль-фидных связей количество полипептвдов резко сокращалось и осшвная их масса сосредотачивалась в зоне от 25 до 15 кД. Это иллистриру-егся на примере проламинов сорго (рис.?:).

Аминокислотный состав и и Е субфракций спиртораетворимого белка кукурузы (линия Ш-13), сорго (сорт Днепровское 69) мол.#

Аминокислоты : Кукуруза : Сорго

: о : Е. : Б : Е

Аспарагиновая 5,52 .4,58 7,20 7,05

Треонин 2,94 2,97 3,52 3,32

Серии : 14,34 . 9,57 9,10 . 9,13

Глутаминовая 10,II 21,77 17,33 ■ 15,77

Пролин 5,33 13,95 8,37 11,83

Глицин 25,37 15,70 9,40 13,28

Алании . . 4,96 6,27 10,57 9,96

Валил- 6,43 3,98 2,20 3,И

Изолейцин• 4,23 2,22 3,67 3,94

Лейцин . б'.ео 8,09 13,22 8,92

Тирозин 2,02 2,09 1,76 1,04

фенилаланин 2,02 2,49 3,52 2,70

Гиствдин 3,13 2,83 3,67 2,08

Лизин 2,76 1,15 3,52 3,94

Аргинин 2,76- 1,69 1,62 2,49

Показатели гвдрофобносги

Гидрофобноеть, (Э) 753 914 1155 978

кал (Ц) 468 717 793 677

Полярность 0,96 • 1,03 0,96 0,91

НБЦ 0,26 0,33 0,33 0,32

.Исследование индивидуальных полипептидов зеина, выделенных препаративным электрофорезом.з ЖАТ с ДНО Не позволило установить их разнородность по аминокислотному составу, гидрофобноети, способности связывать кушсси й -250 и серебро. Пептидные карты зешюв были специфичны, что свидетельствует о различиях в первичной структура.

ГвдрофоСность - фундаментальное свойство бвополклеров, определяющее их химическую и функциональную активность. Благодаря гад-рофобности белковш ыолекулц сохраняют свою пространственную струк-

ta-

КЛ

Рис.?. Схемы электрофореза в .12,5$ ПЛАТ с JffiC- Ка (А,Б ) и Юф бЛйАГ с мочевиной (В, Г) спцрто-растворимых белков зерна сорго.

А,В - невосстановленныеj Б,Г - восстановленные белки

туру в водных растворах. Гидрофобность конкретного б&тка зависит от его аминокислотного состава (ВДимов, 1987; Bigelow ,1967), химического состава водной среда (Заславский, 1985) и маяв г опре- . деляться различными способами. Поскольку меяду показателями гвдро-фобносги, полученными различными методвми, корреляцгонная вависи- ■ юсгь отсутствует, полагают :( Shimizu et а1^19дб), что они определяют различные свойства белковых молекул и могуг дополнять друг друга с

Выше была представлена гидрофобность пероксидаз, глобулинов, проламинов, подсчитанная на основании их аминокислотного, состава (табл.1,4). Из полученных данных ясно, что проламины являются наиболее гидрофобными белками в силу своего химического состава.Исследование их поверхностной гидрофобносги осуществляли с использованием гвдрофоб.,ой хромпгографии на TSK-гелях HW -65 £ и Ht - 75 f , а также с применением октид-сефарозы CI-4B» Ступенчатое влвирование белков изопропанолоы возрастаидей конценградии с поиле-дую-им электрофоретическим анализом фракций позволило выявить сле-дуадее: 40« изопропанолом элюировались, в основном, полипаптиды аеина с молекулярной из ссой 19-24 кД, 50-60* - полипептвды с молекулярной массой 4L -63 кД и окончательный смыв с колонки собирал • наибе лее высокомолекулярную группу полйшптидов (100-400 кД). Низко молекулярные по.;ипоптидц (12-16 кД) в 20-30^ изопропвноле с ге- . л^вым мзгриксом не связывались.

На основании полученных данных группы „олипептядов веина мокно расположить в следующем порядке по возрастанию гкцрофобности: 12-I-) -, IL-20; 22-24; 45-63; 100-400 кД пли по данным электрофореза ¡з ум _ гта:пс..оЯ системе в ПЛАТ с ыочекшой по субфракдия:,-. Е, D , ■

С«В я А»

Кспсльзованиэ разработанного нами метода определения гвдро-фобиосга белков послэ ах разделения в ПААГ по ДДС- на - связывающей сшсоСюстя (A.C.I45I5S9), показало, что наиболее гидрофобными (Звва 3 я С субфракции.

Суммируя вшесказанноа следует отметить, что с помощью растворов спиртов (эта"ола, изопропанола), содержащих мочевину из зерна кукурузы, сорго и риса экстрагируются наряду с проламинами запасные белки, аминокислотный состав которых отличается от известных презде. Их особенностью является пониженная гидрофобность и небольшая масса составляющих полипептвдов. Наибольшая танинофобность также присуща белкам D п Е субфракций (Савич, Перуанский,ISS0). По результатам различных способов найдено,что наиболее гидрофобными являются В- я С-субфракцяи. Обнаружено,что разделение проламиновых белков электрофорезом в ПЛАТ с ДДС-на или мочевиной происходит а соответствии с их поверхностной гидрофобдастыо.

Известно, что многообразие полипептвдов зекна обусловлено (Золыпим количеством генов (более ICO), ответственных за их биосинтез, которые локализованы в хромосомах 4,7 и 10 ( За ave, salaaini, 1984; Ottofconl, Lteffenson ,1987). Благодаря этому можно предположить о существовании определенной сопряженности межд: отдельными полапептдвдми (их группами) и биологическими особенностями кукурузы. Подобные взаимосвязи обнаружены у сортов и биотипов пшеницы (Перуанский, Абугалнеиа. 1985; Созшюв,1ЭД5; Попереля, 1989 ). На исключено, что такие же закономерности могут быть выявлены а у ■сорго.

Обработка данных по количественному содержанию полипептвдов невосстановленного зегаа (электрофорегическое разделение) методом кластерного анализа позволила выделить в один из кластеров холодо-устойчяшз сатоццлешше линии, состояцио, а основном, из высоких растений с крупными початками а большим количеством зерен в них. Цоачо восстановления дисульфпдных связей полипептидный состав и характер кластеризации самоопыленных линий кукурузы резко изменялся в сторону.уменшениа количества кластеров и перераспределения в них генотипов. При отом, а связи с укрупненном кластеров,отличия лглшЗ по средним значения:.! хозяйственно ценных признаков сглаживались, Тем не менее образца одного из кластеров ¡плели определенные преимущества по всхожести, скороспелости, величине початков я массе 1000 заре и по сравнению с двумя другим;!. Результаты корреляционно-

го анализа показали, чго наибольшее количество достоверных коэффициентов корреляции обнаружено для средне- и нпзкомолекулярных полипептидов зеина (22-56 кД) и такими показателями, как число рядков в початке, число зерен в початке, высота растений, продолжительность вегетации..

Применение ИЭФ зеиновых белков с последующим математическим анализом взаимосвязей между полппептидэми и. биологическими показателями растений позволило выявить большое количество коэффициентов корреляции. Обнаружена сопряженность между содержанием отдельных полипептвдов и элементами продуктивности, фенологическими признаками, а также всхожестью и энергией прорастания семян (рис.8),.

Аналогичная работа была проделана с-генотипами сорго. При' математической обработке относительного содержания полипептидов невосстановленного кафирина после электрофореза в ПААГ с ДДС- Ыа генотипы сорго формировали четыре кластера. При этом выделялись группы образцов ш урожайности-зел-пюй массы, содержанию белка и танина. При восстановлении дисульфвдных связей резко изменялось не только распределение полипе^гидов в ПААГ (рис.7),- но и состав кластеров. В связи с тем, чго количество мастеров уменьшалось до трех, оплечена, также как и для линий кукурузы,. большая сглаженность по биологическим параметрам. Выявлены достоверные коэффициенты корреляции между содержанием отдельных субфракций невосстановленного. кафирина с одной стороны и энергией прорастания, урожайностью зерна - с другой (Савич, Перуанский,1989). •

Методом ИЭФ в ПААГ с мочевиной кафирино'вые белки были разделены на значительное количество полипептидов по.их ИЭТ (см.рис.7). Обработка данк-х по-соотношения полипептвдов невосстановленного кафирина позволила группировать соргообразцы сорг*1 в пять, кластеров (рис.9). В пятый кластер входили наиболее урожайные по.вех -ной массе формы, отличающиеся высокорослостью. Однако они были • довольно позднеспелые, с невысокой массой 1000 зерен и содержанием белка. Первый кластер формировали соргообразцы с наибольшей урожайностью зерна г -высок'им уровнем танина.

При восстановлении дисулгфидных связей с помощыз 2-меркапго-этаноле и алкили^ования балков характер спектра кафирина после ИЭФ резко менялся '(см.рис.7), что находило ,'сЕое отражение в из-' менении кластеризации сортообразцов сорго. При этом два высокоурожайных сорта Днепровское 69 и Цунами 85 входили во второй кластер. Наихудиигз образцы по урожайности, но с , высскогегпповга гзрвэм образовывали чет;зертый кластер (рис.9).

Рис.О. Коэффициенты корреляции мезду полипептидаыи невосстановленного (_] и восстановленного спирторастворкмого белка кукурузы.

Внутри геометрических фигур: I - количество рядков в початке, 2 --количество зерен п початке, 3 - энергия прорастания, 4 - всхожесть, 5 - висота растений, б - высота прикрепления початка, 7 - число дней до всходов,.8 - число ". дней до цветения, 9 - число дней до опадения. Остальные цифры - ИЭТ соответствующих полипепт^псв

После проведения корреляционного анализа обнаружен ряд достоверных коэффициентов корреляции мезду содержанием отдельных полипептидов кислой области (ИЭТ 4,0-5,8) и урожайностью, высотой растений; нейтральной зоны (7,2-7,55) и высотой растений, массой 1000 зерен; щелочного диапазона (ПЭТ 8,1-8,8) и содержанием белка, танина в зерне, продолжительностью вегетации.

Перспективным способом быстрого получения информации о физико-химических свойствах рзстителытх объектах яапяется ИК-спекг-роскопня в'ближней области. В связи с тем, что разработаны методы определения индивидуальных балков в сиоси альбуминов и глобулинов по характерном пикам поглощения ПК-спектров ( С1а-М;иг, сепАгеаи, 1937), а ?агс::з шмечоны подходи прогнозирования качества зерна и стеблевой масси кукурузы ( кейЫигзег е^ а1,1936), представляется актуальным, с одной оироны птюк связей поляпоптвдпого состава запасных белков злаковых с их ПК-спектральными характеристиками, а с другой - мехду пиками поглощения ближней Щ-области запасных белков и биологическими особенностями растений.

Корреляционный анализ данных по огпоаагсдыгзгу елдзр^зни» полипептидог зопга и опгичсскоя гиотногть» ИК-спехтроз позволил выявить высо'-яо кпоффкциенты корреляции мезду охдельпют полипеп-

Рио.9. Дандрограммы сортообразцов сорго» построенные с учетом

соотношения полипептвдов невосстановленного.(А) и восстановленного (Б) кафирина

I - Днепровское 69, 2 - Низкорослое 93 С; 3 - Краснодарская 196?, 4 - РаннгЯ янтарь 161, 5 - Алма-Атинский 87, б - Сарваши, 7 - Суд-зерн, 8 - Низкорослое 93 Ф, 9 - А-278. 10 - Б-278, II - Цунвкй 76, 12 - Алма-Атинский 81, 13 - Казахстанское низкорослое I;S4 Сахарное МС 4-14, 15 - Красный янгдрь 3562, 16 - Цунами 85, 17 - Сахар-.' ное 35.

гидами всех субфракций зеина и зонами поглощения в областях . I330-1525 и 1800-2400. Обнаружена также корреляционная завнсиюсть. между оптической плотностью ИК-обласгей зеина и диаметром початков, стеблей, ' также числа 8врен и рядков в початке. Аналогичное исследование, проведенное на соргообразцах сорго также показало зависимость оптических характеристик ИК-спекгров кафцрина от е^о полипептидного состава. ICpoi.ig того выявлены достоверные коэффициенты корреляции между интенсивностью-поглощения ИК-областей кафя-рина и хозяйственно ценными признаками сорго. Особенно тесная связь обнаружена гсжду поглощением кафирина б областях I7I0-I750 и 1910-1950 ш с одной стороны и содержанием белка и танина в sep-п - с другой, соответственно.

Та; образом» используя принципы количественной оценки ог-нэсегяль!;} д содержания субфракций, полипегтвдов проламинов в гласторный впзлпг генотипы кукурузы .и сорго группировали по ere-' пеки сго^стьч и различия зеивовше и кафириновых белков. В ряде плучзов оказолось, что псследованныа образцы объединялись в клас-

геры о определенными хозяйственно полезными признаками. Показана различная степень информативности полипептидов невосстановленного и восстановленного цроламина. Выявлены достоверные коэффициенты корреляции мезду относительным содержанием полипептидов и биологическими показателями растений. Обнаружены высокие коэффициенты корреляции между поглощением в определенной области ИК-спектров цроламинов и хоьлйственпо полезными признаками растений.

1йНШпВй» По сравнения с цроламинами глютелины кукурузы, сорго а риса изучены слабо. В результате проведанных методических исследований цри апробировании различных методов извлечения этих белков из зерна найдено»что оптимальным методом для их быстрой и полной экстракции является двухэташюе выделение растворами ДЦС-iîa с последующим осаждением глютелинов растворами спиртов ( Dama . ISBI). Исдшьзованно электрофоретических методов и аминокислотного анализа позволило выявить значительный полиморфизм этих белков.С помощьв препаративного электрофореза в ПААГ с ДДС- На выделены отдельные полипептида глютелина. Аминокислотный состав части из них приведен в таблица 5.

" Аминокислотный анализ показал принадлежность всех выделенных подипептвдов одному классу.белков - глвтелину (сравниголы.:» низкое содержание глугаминовой кислоты и повышенное - лизина и глицина). Наиболее гидрофобными полипептидами кукурузы оказались сред-немолекулярные полипептвды, а сорго - высоко- и низкомолекулярныа (табл.5). Использование кластерного анализа показало, чю группирование полипептидов глвтелина осуществилось согласно их гидро-фобнооти (Перуанский, Савич, 1987).

Использование различных' самоопылении линий кукурузы при электрофорезе глюталина выявило вариабельность как по количеству полипептидпа, так и по их относитмьному содержанию. После математической обработки данных по соотношению полипептадов исследуемые линии группировались в рад кнастеров, неравнозначных по отдельным биологическим свойствам. Так, линии одного из кластеров характеризовались хорошей всхолсестью и энергией прорастания, высокорослое гью, скороспелостьи, но низкими холодостойкостью, белоковостью и массой 1000 зерен. В го жо время^ друюй кластер включал генопшы.отличав-диесл хорошей холодостойкостью, белковостью.зерна и крупными початками, Результаты корреляционного анализа свидетельствовали о том, что наибольшей информативностьо обладали средне- и низкомолекулярные полипэпгиаы Глюголина (Савич, Перуанский, 1987).

Аминокислотный состав высокогвдрофобных полппепгидов глюгелица из зерна кукурузы (линия Грушевская 380) и сорго (сорт Днепроюкие 69) ыол.%

Аминокислот ''Кукуруза : Сорго

Полипепгвды с молекулярной мессой, кД

: 34,8 :28,С- :98 и :. 49,0 : 22,0

:29,0 :.ПЗ :

Аспарагиновая 11,66 6,46 6,70 5,05 7,59

Треонин 2,32 3,36 4,00 4,50 :з,24

Серин 11,02 6,29 11.44 6,90 5,97

Глутам-лговая 18,04 21,31 19.69 16,21 23,00

Пролин 7,60 9.6" 6.С5 7,78 . 11,78

глицин 7,48 6,80 12,65 9,50 9,21

Алании 7,95. 10,24 13,63 13,12 14,58

Валян 6,38 4.28 5,68 5,33 4,64

Метпоиин 0,81 0,50 0,66 1,72 0,59

Изолейцин 3,07 3,52 2,39 3,08 2,43

Лейцин 12,12 13,42 8,08 9,96 9,06

Тирозин 0,70 0,17 .1,75 • 2,26 1,92

фенилаланин 2,49 4,28 2,48 ' 3,33 2,06

Гистцдин 4,23 3,19 1.01 2,32 1,03

Лизин 1,80 2,18 1.62. 4,48 1,25

Аргинин 2,32 4,36 1.87 4,53 1.69

Показатели гидрофобносги

Гвдрофобность (Э) 900 1023 808 1016 946

кал (ц) 671 720 .598 643 738

ПЕЦ 0,33 0,39 0,27 0,32 0,32

Полярность 1,08 0,94 1,05 1,00. 0,96

Представленные выше данные показали. что кластерный анализ являег-

ся хорошим инструментом для распознавания белков по их аминокислотному составу. Однако в ряде случаев он моаег оказаться неэффективным, когда белки различных классов имеют близкий состав аминокислот (например, глиадин и высокомолекулярный глюгелин пшеницы). В этой связи представляет интерес выяснение корреляционных связей дозду'

содержанием отдельных амкнокислот и интегральным показателем, каковы:.! является гидрофобноеть. Для этой цели был проанализирован аминокислотный состав различных классов белков из зорна пшеницы, ячменя, кукурузы, сорго и риса. Использованы собственные данные и имевшиеся в литературе.

Как показали результаты исследований для различных типов белков выявлено большое количество корреляционных связей между содержанием аминокислот, а также между содержанием' аминокислот и гтарофобноегью. Причем обнаружена высокая специфичность этих показателей. Для выяснения степени сходства мезду белками из различных видов растений бшо подсчитано количество пар близких коэффициен-■ тов корреляции. Процент -гомологии вычисляли, приняв общее количество парных корреляций за 100«.

Наибольшее сходство по белкам альбумиио-глобулииовой фракции выявлено между пшеницей и ячменем, а также рисом и кукурузой. Наиболее удалены друг от друга пары: пшеница-рис, пшеница-спрго, рис-сорго (табл.б). Вычисление степени гомологии между проламинами различных видов растений показало,что наиболее близки друг другу пшеница-ячмень, ячмень-рис, рис-кукуруза, рис-сорго (уровень гомологии от 30 до (габл.б). В этой связи следует вспомнить,что проламины злаковых имеют много общего по первичной структуре составлявших их тюлтвпттов ( ,1979) и в ¡ммунохимическом отношении ( вЗ-егке-VепЪ 1 ат.з ,1932) . Высокий уровень гомологии на молекулярном уровне показан мезду генами зеина и кафирииа ( ве поев е* «1. , 1989). На ¡меньшее сходство обнаружено между глиадином 'пшеницы и зеином кукурузы, а также между глиадином пшеницы и кафи-рпном сорго (табл.6).

На основании корреляционного анализа подсчитан уровень сходства между глютелинами различных злаковых. Наиболее близки оказались глюгелины ячменя и пшеницы; риса п кукурузы; пшеницы и сорго; ячменя и сорго (табл.6). В этой же таблице показан уровень гомологии между различными классами белков исследованных злаговых.

Таким образом, разработан способ распознавания белков п количественного подсчета уровня сходства и отличия мезду ними. Используя принцип сравнения^ пар коэффициентов корреляции между содержанием'аминокислот, а также между нши п гидрофобностьо выявлен • неодинаковый уровень гомологии, между белковый! фракциями зерна пшеницы, ячменя, кукурузы, сорго ириса. Показано,что з отдельных случаях может быть большее сходство между разнородными белками

Уровень гомологии <») мезду оелками зерна злаковых, вычисленный по коэффициентам корреляций мсгздг• аминокислотами и средней гидрофоб но с гью

Алзбу:лякы-гло оул:«...

Дроламияы

Глвгелины

j:i _ о ^ г. :- : сорго : яч- рис: куку- : сорго :пше~ : яч- : рис: кукуру- сорго

■ i :> .'Д .нлцз . :..сг;ь руза : .ница . мень : : за

' г.^ ч-т-

ГЬзиицэ 45,0 26,3 32,9 26,3 12,6 21,8 17,2 14,9 12,6 9,0 11,2 13,5 7,9 7,9

32,9 36,8 30,3 II. 5 21,3 19,5 17,2 • I6.I 14,6 16.3 14.6 13.5 13,5

^ijC 42,1 28,9 ' 11,5 20,7 21,8 18,4 17.2 11,2 13,5 т9,1 15,7 14,6

Кукуруза 34,2 14,9 20,7 18,4 23,0 20.7 14,6 14,6 20,2 24.7 18.0-

Сорго 12,6 18,4 16,1 17,2 19,5 18,0 14.6 16,9 19.1 16.9

1£:скицэ 30,7 25,0 14.8 15,9 23,3 15,6 12.2 12.2 II. I

Яч:.:зш> 40.1 2I.& 29,6 33,3 40,0 21,1. 24.4, 23,3

Pr:c 42,0 33,0 21,1 22.2 22,2 21.1 20.0

'ЛГ-''J? ysa 26.1 14.4 12.2 •16.7 17,8 16.7

C-ojpro 13,3 13.3 14,4 21,1 22,2

Шенпцз 45.7 22.8 28,3 31,5

Ячмень - 28.3 28,3 37,0 ■

?ПС 30,4 25,0

29.5

одного ввда растения, нежели между однотипными белками различных культур,-

ВЫВОДЫ

1, Обнаружены.изоформы пероксидазы, сохраняющие ферментативную активность в среде с высокой концентрацией мочевины и при наличии дегергенгов.С помощью разработанных методов выявлены особенности кркоизоформ пер^ксидазы по сродству к донорам водорода,удельной акгавности.амишкяслотному coi,гаву, гвдрофобносги,антигенной структура, степени гликозилирования. Предложен механизм образования стрессовых изофермеитов пероксвдазы.

2. С помощь» количественных методов анализа множественных форм пероксвдазы, продемонстрирована уникальность элсктрофоретических спектров криоформ фермента и на их основе разработаны биохимический методы тестирования кукурузы и сорго на холодоустойчивость,

3. В составе глобулинов зерна кукурузы, риса и сорго найдены и препаративно выделены триплетные белки.Определены их аминокислотный, полип ептвдный составы п ПК-характеристики. Установлена их межсортовая изменчивость по соотношению полипаптццов, а гакясе антигешюа сходство о глюгелннами.

4. "ог^д :: , лекгрофороза, изоэлектрофокусировэния и IZC-спект-роскоп ап уст:-различная степень информативности при многомерном онал.::>е содержания свободных и шибрздосвязашшх изоформ пероксндззи пророс псов, субфрякций, групп и отдельных полшептидов запасных белков зерновки .в группировании генотипов кукурузы,сорго и риса с зажимки биологическими параметрами, ' 5. Pa'.;u¡tíoi'„¡iu способы биохимической идентификации, распознавания п naci!L.p;-:':¡annH генотипов кукурузы, сорго и риса, а также способ определения уровня гибридиости кукугузы с использованием рлекгрофорерз пли кзоэлектрофокуейрования запасных белков семян. Прпмсшснке количественных методов оценки. содержания отдельных белковых компонентов с последующей обработкой данных методами многомерной сгпг:;сг;пш позволяет ьолучать информацию о сходстве а отличиях объектов исследования, а также выявлять чужеродные примеси.

6, Определен аминокислотный состав л некоторые показатели гидрофобноеги субфракш.'й, групп и отдельных полшептидов глобулинов, проламппов и глюхелинов кукурузы, сорго и риса.На основании Еыяаченнш закономерностей 'в корреляционной зависимости мезду со-дор;ание;.1 аминокислот и гпдрофобностью, разработан способ распоз-

навания белков и определения уровня их гомология. Выяснена степень различия между белками зрелых семян пшеницы,ячменя.кукурузн сорго и риса.

7. Выявлены достоверные коэффициенты корреляции между содер канием свободных, ионосвязанных, ковалентносвязанных изоформ пероксцдазы, а также субфракций, групп и полипепгвдов запасных белков 8ерновки с одной стороны и хозяйственно полезными признаками и биологическими свойствами растений кукурузы и сорго - с другой.

8. Обнаружен новый тип запасного белка в семенах кукурузы, сорго и риса, отличающийся от других известных классов белков го аминокислотному и полипептидному составам, показа гелям гидрофоб-ности, способности связывать красители, антигенной структуре и наличию углеводных остатков.

9. Кластерный анализ, как мшгод распознавания образов,являзг' ся высоко информативным средством для широкого круга биохимически: исследований, начиная с прикчадных задач в классификации генотипов и кончая фундаментальными проблемами распознавания биополимеров, а также установления факторов регуляции экспрессии гонов.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ СОВМЕСТНОЙ РАБОТЫ БИОХИМИКОВ И

БИЭ ТЕХНОЛОГОВ ПРИ СОЗДАНИИ НОВЫХ ЛИНИЙ,СОРТОВ И ГИБРВДОВ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР

1. Разработанные методы идентификации и паспортизацая образце кукурузы, сорго и риса го електрофоретическим и ИЭФ-опекграм запасных белков следует использовать на всех этапах селекционного процесса для контроля чистоты растительного материалам изучении наследования тех вли иных признаков, для определения уровня гиб-, ридносги и константности форд, а также вбио технологических йссж дованиях при со здании новых высокопродуктивных и с другими ценныг свойствами сортов я гибридов глаковых.

2. Разработанные методы диагностики холодоустойчивости генотипов кукурузы и сорго по множественным криоформам пероксидавы необходимо применять при браковке бесперспективных по холодоусго{ чивосги образцов при селекционной проработке исходного материала на ранних стадиях селекционного процесса,а также при создании ценных в хозяйственном отношении форм растений методами биотехнологии.

■ 3. Следует шире использовать количественные методы анализа при электрофоретическом разделении белков с последующей обработкой данных методами многомерной статистики на ЭВМ, что позволяет получать ценную информации о закономерностях строения и биосинтеза самих белков и выявлять меру сходства и различия объектов исследования.

' 4. фи селегции злаковых на высокобелковосгь для аридных зон необходимо учитывать наряду с мелком содержание крахмала л зерновке» оставляя для дальнейшей селекционной проработки перспективные образцы с соотношением крахмал/белок ^ 3.5. Селекцию на кормовую ценность сорго следует вести с учетом оптимального содержания важнейших ингредиентов вегетативной массы при отношении саха-Рв'/белок. ^ 50 и минимальном количестве танина.

СПИСОК РАЮГ.ОПУШГОВАШПЯ ГО ШЕ ДИССЕРТАЦШ

1. Caвич U.M.. Перуанская О.Н. Содержание и качество белка казахстанского pisca // Вестник с.-х. науки Казахстана.- 1975.-№ 12.- С.48-51.

2. Перуанский Ю.В.. Савич И.М. Качество зерна риса // Сельское хозяйство si рубежом.- 1975,- Л 9.- С.18-21.

3. Перуанский Ю.В., Савич И.М. Аминокислотный сос.ав белка зерна риса.// Прикл.биохимия и микробиол.- 1976.- 12. И 2,- С.181-185.

4. Савич И.М., Соколов O.A.. Наумова H.H. Повышение содержания и качества белка зерна риса // Сельское хозяйство за рубежом.-1976.- Й 9.- С."-5.

5. Савич И.М., Перуанская О.Н. Аминокислотный состав компонентов цроламинов ptica //Республиканская конф. го физиологическим основам повышения продуктивности и устойчивости зерновых культур. Тезисы докладов.- Алма-Ата,- 1976.- C.I93-I94.

6. Савич-U.M. О коррелятивных связях в соотношении крахмала и белка в сернах риса // Вторая кокф. биохимиков республик Средней Азии и Казахстана (техническая биохимия). Тезисы докладов.-Фрунзе: Клим. 1976.- С.126-128.

7. Савич U.M., Перуанский Ю.В. Определение качества зерна риса // Селекция и семеноводство.- 1978.- J& 2.- С.32-33.

8. Перуанский Ю.В., Савич И.М.. Хзан А.И. Содержание и качество крахмально-белкового комплекса рисо-просянкозых форм // Вестник с.-х. науки Казахстана,- 1979.- ß I.- С.31-34.

9. Савич И.1,1.а Перуанский Ю.В. Об идентификации сортообр&з*~,л\; цов риса по элекгрофорегическим спектрам проламина // Вестник с.-х. науки Казахстана,- 1979.- Ü 6.- С.92-93.

10. Перуанский Ю.В., Ззьач И.М. Состав альбуминов и глобулинов зерна риса // 1У Республ.конф. физиологические основы повышения продуктивности и устойчивости зерновых культур. Тезисы докладов.- Алма-Ата.г 1930.- C.I8I-I82.

11. Савич И.М. О полиморфизме цроламинов риса N Там ке.-1930.- С.201-202.

12. Савич И.М. Состав проламина зерна риса // физиология в биохимия культурных растений.-1980.- 12, II 4.- С.404-408.

13. "Савич И.М. Электрофорегическве спектры проламина крас-нозерного риса // Вестник с.-х. науки Казахстана.- 1980.- № 12.-С.84-86.

14. Савич U.M., Савин В.Н., Перуанский Ю.В. Электрофореги-ческое изучение самоошиенных линий кукурузы // Вестник с.-х. науки Казахстана.- 1985,- К 9.- С.23-°5.

15. Савич U.M., Перуанский Ю.В. Спектр запасных бачков злаков и его использование в идентификации сортов // Физиология и биохимия культурных растений.- 1986.- 18, JS 2.- С.131-138.

16. Савич И.Г,!., Хвал А.И., Перуанский Ю.В. Новая форма риса// Веогнчк с.-х. науки Казахстана,- 1986.- $ 8.- С.32-34.

J7. Савич II.lv!. Мочевина как дифференциатор- изоперокепдаз проростков кукурузы // Известия /Л Казахской ССР. Серпя биологическая.- ID-3G.- № 5,- С.67-72.

18. Перуанский Ю.В., Савич И.М. ПолппепггдныЗ к аминокислотный составы суслракцнй веяна // Физиология п биохимия культурных растений.- IS37.- 19, К I.— С,66-72.

19. Псруанскин 13. В., Булатова K.M., Савич И.М. Глителян шга-нйщ. как биохимический критерий в селекции // Во стоик с.-х. науки Казахстан?:.- 1537.- Г- 3.- С.22-24. ;

20. Перуанскгй Ю.Б., Савпч И.М. Сра сил тельное изучение шлп-ие»г:"-'?в зеана и глятшша кугурузы // Сельскохозяйственная бзоло-гкя,-. 1957.- J; 5.- С. ст-а.

2Т. Сир'тч II.f.;. Изопзроксгдозкк'' осгав пророст) в кукуру^г п' ionv г': • '.¿"УС^йчиеость // СбльокоУоглЛогЕСшгзй бсол<пт.':.~

л;:-:'/ . D.Саки КХ., Сзрисй ¡¡.С, Скпи ыш -.■.■........." ">('•<■'' "Ч:."1!'!: г уел;.тсгго'.'. 'J-';.T лу //

Селекция и семеноводетвэ,- 1987.- ü 3.~ С.24-25.

23. Савич И.М. Действие температурного стресса на изоферменг-ный и аминокислотный состав йероксидаз проростков кукурузы // Вестник с.-х. науки Казахстана,- 1987,- № 5,- С.25-29.

24. Перуанский Ю.В., Савич U.M. Разнокачественность субфракций зеина и составляющих их полипелтщюв у самоопыленных линий кукурузы // Док...ады ВАСХ1ШЛ.- 1987,- № 5.- C.8-I0.

25. Савич И.М. Зависимость кластеризации пероксидаз гибридов кукурузы от параметров анализа П Известия АН Казахской ССР. Серия биологическая,- 1987.- № 4.- С.16-21.

26. Савич И.М., Перуанский Ü.B. Состав субфракций зеина // Прикладная биохимия и микробиология.- 1987.- 23, К 5,- С.670-678.

27. Савич И.М., Перуанский Ю.В. Полипептиды зеина и глютели-на - биохимические показатели хозяйственно ценных признаков са~ моопшенных линий кукурузы // Вестник с.-х. науки Казахстана.-IS87.~№ 10,- С.25-30.

28. A.C.1327850 СССР, !ЖИ А 01 H Ï/04. Способ оценки белковости зерна в экстремальных условиях выращивания растений ! Ю.В. Перуанский, И.М.Савич,' Сариев B.C.- Опубл. 07.08.87.Бюл.№ 29.-C.I0.

29. Савич И.М. Использование изопероксидаз проростков кукурузы в тестфованяи селекционного материала // Вестник с.-х. науки Казахстана 1988.- té 2.- С.23-29. ,

30. Перуанский Ю.В., Савич И.М. Распознавшие самоопцяенных линий кукурузы азоэлектрофокусированием белкоя займового домшюк-'са // Доклады ВАСШЛ.- IS88.- JS 2.- C.II-I3.

31. Савич И.М.. Такибаева T.JI., Перуанский Ю.В. Удельная активность изопероксидаз проростков кукурузы и пшеницы в условиях твтературилго стресса // Физиология и биохимия культурных растений,-. 1968.- 20, * 2.- С.128-133.

32. Савич И.Ц., Такябаева Т.Л., Алвмгазинова Б.Ш, Действие детергентов и мочевины на пероксидази пшеницы, кукурузы и сахарной свеклы // физиология растений.- 1988.- 35, № 2.- С.361-368.

33. Перуанский Ю.В., Савич И.М..Гликопротевди зенновош комплекса зерна кукурузы // Известия АН Казахской ССР. Серия.биологическая.- 1988.-' Ii 2.- С.20-25.

34. Перуанский Ю.В., Савич И.М. Использование полиморфизма кафдртщ для'идентификации генотипов сорго // Вестник с.-х. науки Казахстана.- 1988.- $ 7.- С.29-31,

35. А.С.-1423070 СССР, МКИ Л 01 Н 1/06. Способ распознавания генотипов самоопылеиньк линий кукурузы / И.М;Савич, Ю.В.Перуанский.-0публ.15.09.88. Бюл. & 34.- С.16.

■ 36. Са.ьлч И.М. Действие пониженных температур ьа изопероксидазы проростков кукурузы // Физиология и биохимия культурных растений.-

1988.- 21, № 5. - С.497-503.

37. Савич И.М., Перуанский Ю.В. Получение препаратов зеина и глагелина // Прикладная биохимия и микробиология.- 1988.- 24, № 5,-С.685-691. - .

38. Савич И.М.,'Тажибаева Т.Л. Влияние холодового стресса на' изопероксвдазы проростков кукурузы и пшеницы, различавшиеся по.' изоэлекг>ическим точкам // Физиология: растений.- 1988.- 35, й 5,-С.841-847. •

39. А.С.1423587 СССР. МКИ С 12 9/42,0 01 Н 33/48. Способ определения активности изопероксидаз / И.М.Савич", Ю.В.Перуанский, Т.Л.Тажибаева.- Опубл.15.09.88.Бил. Ун 34.- С.124.

40. Савич И.М. Неоднозначность воздействия мочевины на активность изопероксидаз различных линий кукурузы // Известия АН Казахской ССР.Серия биологическая,- 1988.- й 6. - С.29-34.

41. Перуанский Ю.В., Савич И.М. Выделение , аминокислотный и полипепгидный составы глютелинов зерна сорго // Доклады ВАСХНИЯ.-

1989.- й I.- С.14-17.

42. А.С.1451599 СССР, МКИ й 01 Н 33/48. Способ определения гидрофобносги белков / Ю.В.Перуанский. И.М.Савич.- Опубл.15.01.89. Бюл. Ц г.- С.177.

43. А.С.1449064 СССР. МКИ А 01 Н 1/04. Способ оценки генотипов кукурузы на поишенное качество зерна / Ю.В.Перуанский, И.М.Савич.-Опубл. 07.01.89. Бол. № I.- С.9.

44. Савич И.М. Трансформация сродства изопероксидаз проростков кукурузы к донорам водорода при гипотермии // Известия АН Казахской ССР, Серия биологическая.- 1989.- К 2.- С.16-22.

45. Перуанский Ю.В., Савич И.М. Использование кластерного анализа в оценке уровня гибридности семян кукурузы //.Вестник с.-х. наук- Казахстана.- 1989,- Л 5,- С.П-14.

46. Перуанский Ю.В., Савич И.М., Макаров В.М. Кормовая ценность сорго в связи с содержанием танина // Селекция и семеноводство.- 1969.- й 3.- С.21-22.

47. Перуанский Ю.В., Савич И.М. Запасные белки кукурузы и сорго // Доклады ВАСХНШ1.- 1989.- й 6.- С.12-15.

48. Савич И.М. Пероксвдазы - стрессовые белки растений // Успв-хи современной биологии.- 1389.- 107, № 3.- С.406-417.

49. Савпч И.М. Аминокислотный состав щелочных изопероксвдаз кукурузы при действии низкотемпературного стресса // Прикладная биохимия и микробиология.- 1989.- 25, й 5.- С.634-643.

50. Савич И.М., Перуанский Ю.В. Аминокислотный и полипептидный составы кафьрина сорго // физиология и биохимия культурных растений.- 1989.-21, № 5.- С.487-493.

51. Савич И.М. Изопероксидазы проростков сорго при холодо-вом сгрсссе // физиология и биохимия культурных растений.- 1989.21 , & 6,- С.566-572.

52. Савич И.М., Перуанский Ю.В. Биохимическое обеспечение диагностики.криоустойчивостп зерновых II Физиология и биохимия культурных растений.- 1990.- 22, & I,- С.13-19.

53. А.С.1519585 СССР, МКИ А 01й 7/00. Способ выявления холодоустойчивых сзшопшенпих линий кукурузы / И.М.Савич,- Опубл. 07.11.89. БеЛЛ:« 41.- СЛ4.

54. Перуанский Ю.В.,. Сэвич И.М. Биохимическая идентификация генотипов риса II Доклады ВАСХНИЛ.- 1920.- 4.- С.20-24.

55. А.С. 1569711 СССР, МКИ О 01 33/535. Способ определения изопероксидаз-антигенов / И.М,Савич.0публ.07.06.90. Бал. Ц 21.-С.185.

56. Перуанский Ю.В.,Савич И.1.1. Оценка исходного материала по содержание сахара и белка .в соке стеблей сахарного сорго II Селекция и семеноводство.- 1990.- гё 4.- С.20-21.

57. Савич И.М. Изменение- антигенной с труте тур и основных изопероксидаз проростков кукурузы при криострессе II Физиология растений,- 1990.- 37, 4.- С.766-773.

58. Савич И.М. Белковые компоненты зерна - показатели биологических свойств'злаковых // Второе Всесоюзное совещание "Генетика развития". Тезисц докладов,- Ташкент,- 1990.- С.130-131.

59. Алимтазиновз Б.Ш., Савич И.М.■ Аминокислотный состав щелочных изопероксидаз листьев сахарной свеклы // Изв. АН КазССР. Сер.¿иол,- 1990,- й 5.- С.76-79.

60. Савич И.1.1., Перу он ск ей Ю.В. Распознавание генетического разнообразия сорго биохимическими методами // Материалы Республиканской конференции "Пробурчу теоретической и прикладной генетики в Казахстане".- Алма-Ата,- 1990.- С.67-68.

61. Савич И.М. ,Поруанскйй О.В. Танинофильность проламинов

зерна злаковых //Физиология к биохимия кулм.растений.-1990. -22, № 5. г С.493-495.

62. Савич U.M. Биохимическое распознавание сортов сорго для целей практической селекцгч и семеноводства // Bl зтник с.-х. науки Казахстана. - 1990. - № II. - С.20-23.

63. A.C. 1595407 СССР, МКЙ А 0.1 Н 1/04. Способ определения Уровня гибридкостя семян кукурузы / И.М.Савич. - Опубл.30.09.90. Бюл. № 36. - С.Т.4.

64.А.С. 1604273 СССР, МКИ 4 0.1 Н 1/06, 5 01 к 33/68. Способ идентификации генотипов сорго / Ю.В.Перуанский, И.М.Савич. Опубл. 07.П.90. Бюл. № 41. - С.22.

65. Перуанский .Ю.Р.,Савич И.М.,Тажибаева Т.Л. 0тноси1ельное содержание и аминокислотный состав изопероксидаз лисзьев проростков пшеницы и кукурузы как критерий устойчивости к низкотемпературному стрессу // Сельскохозяйственная биология. - I99I. -№ I. - C.I39-I46.

66. A.C. 1604274 СССР, МКИ А 01 Н 1/08, в 01 М 33/68. Способ распознавания генотипов риса / Ю.В.Перуанский, И.М.Савич. Огтубл. 07.11.90. Бюл. № 41. - С.22.

67. Савич И.И. Нсмбранносвязаннае изопероксидозы листьев проростков кукурузы в тестировании растительного материала // . Вестник с.-х. науки Казахстана. - 1991. - № 3. - C.I5-20.

68. A.c. I630702 СССР, МКИ А 01 Н 1/04. Способ отбора хозяйственно ценных генотипов сорго / Ю.В.Перуанский, И.М.Савич. Опубл. 28.02.91. Бюл. 8. - С..Т.О.

69. Савич ЙД\ Гидрофобные свойсгва зеляа кукурузы // Химия природных соединений. - 1991. - № I. - C.T05-I08.

70. Сович И.М., Перуанский Ю.В. Биологическая анйорнаякв-нссть зеиновых- полипептидов эндосперка кукурузы // Сельскохозяйственная биология. - 1991. - 15 3. - С.86-94.

71. A.C. 1659850 СССР, ШШ S 01 Ii 33/68. Способ распознавания белков / И.М.Савич. Опубл. aO.Q6.9I. Бил. J? 24.

72. A.C. Г56П82 СССР, С 07 К 3/02. Способ определения- тани: зольности белков / Й.М.Сазкч, Ю.В.ИзруансниН. Опубл.07.07.91. Бюл. № 25.

73. A.C. 166Т6П9 СССР, ШШ С 01 П 27/26* С 07 Ü 3/02. Способ определения шлскулпрноП иовсн белкап / Опубл.07.07.91. туол. 2s.

Информация о работе

Савич, Игорь Михайлович
доктора биологических наук
Москва, 1991
ВАК 03.00.04

Автореферат

Похожие работы