Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимические и биотехнологические аспекты селекции кукурузы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимические и биотехнологические аспекты селекции кукурузы"

? Г б ОД

РОССИЙСКАЯ ЛКЛДЕЛиЬЧ сельскохозяйственных наук

ВСЕРОССИЙСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ РАСТЕНИЕВОДСТВА имени Н. И. ВАВИЛОВА

На правах рукописи САВИН Владимир Николаевич

УДК 633.15:581.19:631.527

БИОХИМИЧЕСКИЕ И БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ

АСПЕКТЫ СЕЛЕКЦИИ КУКУРУЗЫ

Специальность: 03.00.04 — Биохимия

Л в т о р сфер а т диссертации на соискание ученой стспснл доктора биологических наук

Санкт-Петербург — 1993

Работа выполнена в Казахском научно-исследовательском институте земледелия им. В. Р. Вильямса в 1983—1992 гг.

Научные консультанты: Ю. В. Перуанский, профессор,

доктор биологических наук; О. Ш. Шегебаев, профессор, доктор биологических наук.

Официальные оппоненты: Л1. П. Попов, доктор технических наук, профессор;

И. П. Гаврилюк, доктор биологических наук, профессор;

А. В. Конарев, доктор биологических наук.

Ведущее учреждение— Кыргызский научно-исследовательский институт земледелия.

мая

Защита диссертации состоится « СС г»_»У-л ^__ 1993 г.

в « » часов на заседании специализированного совета Д 020.18.02 во Всероссийском научно-исследовательском институте растениеводства им. Н. И. Вавилова по адресу: 190000, Санкт-Петербург, ул. Герцена, д. 44.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ растениеводства им. Н. И. Вавилова.

— ******

Ученый секретарь специализированного совета, доктор биологических наук

Э. А. ГОНЧАРОВА

Актуальность проблемы. В Казахстане кукуруза возделыва-ется во всех почвенно-климатических зонах. Особый интерес к этой культуре""связан'с" перспективой ее продвижения в северные регионы Казахстана. В связи с этим актуально создание и внедрение в производство скороспелых гибридов обладающих высоким качеством продукции, устойчивых к болезням, вредителям, стрессовым факторам среды и т. д. . Имеет значение и степень их гибридности, от которой во многом зависит продуктивность.

Широкий круг решаемых, проблем-наряду с интенсификацией требует объединенных усилий специалистов-смежников: биохимиков, биотехнологов и других. К настоящему времени складывается ситуация, когда достижения фундаментальных наук занимают ведущие позиции в решении многих проблем растениеводства, являются научным обеспечением селекционных исследований. На их основе разрабатываются принципиально новые приемы и пути создания высокопродуктивных сортов и гибридов сельскохозяйственных культур.

При создании селекционно-ценных генотипов одними из первых возникают проблемы, связанные с их распознаванием и паспортизацией. Необходимо отметить, что основной формой хранения и распространения селекционного материала являются семена и определение их принадлежности к тому или иному генотипу традиционными способами трудоемкий длительный процесс. Здесь не обойтись без помощи биохимиков не только в смысле упрощения и удешевления метода, но и, пожалуй, главное для повышения разрешающей способности и объективности оценки. Имеющийся практический, опыт по использованию белков как генетических маркеров (Конзрев, 1980; 1983) хорошо зарекомендовал методы биохимического тестирования для решения вопросов по идентификации.

В плане создания исходных форм для селекционных нужд большие надежды возлагаются на. хромосомную инженерию и клеточную биотехнологию. Эфомосомная инженерия еще не дала ощутимого результата. Для технологий in vitro культивирования клеток и тканей'четко просматриваются деэ направления: эксплуатация сомаклональной вариабельности для создания генетически разнообразных форм с целью вовлечения' их в Селекционный процесс .и -экспрессное получение константного материала на основе'удгюеиия набора хромосом у гаплоидных растений-ре-

■ генерантов (Бутенко, 1979; Муромцев и др. , 1990).

Известно, что заключительным этапом научно-исследовательской работы является процесс творческого осмысления эмпирически полученных данных. Для' этих целей привлекаются различные статистические (биометрические) приёмы и математическое моделирование. Б этой связи компьютеризация открывает широкую перспективу биологу-аналитику для творческого поиска оптимальных путей в решении биологических вопросов на основе знаний по специальной проблематике.

Цель и задачи. Выявить среди фракций эндоспермального белка зерна кукурузы информативную в качестве биохимического критерия для идентификации и паспортизации генотипов, разработать технологию получения регенерантов, оптимизировать процесс обработки данных по результатам биологических исследований.

В работе решались следующие задачи:

- разработать способы выделения-электрофорез двух фракций эндоспермального белка кукурузы - зеина и глютелина.

- провести сравнительное электрофоретическое. изучешгз гетерогенности и полиморфизма альбуминов, глобулинов, зеиноп и глотелинов; предложить способ идентификации самоопыленных линий но выделившейся информативной фракции; выработать унифицированную систему записи белковых формул и приспособить их для компьютерной обработки.

- изучить на инцухт-семьях (П - Г5) характер формирования константности самоопыленной линии, привлекая в качестве биохимического критерия данные электрофореза наиболее информативной фракций.

- изучить некоторые вакономерности морфогенеза в культуре незрелых и зрелых-зародышей, незрелых початков, пророст

. ков корешков и пыльников кукурузы; разработать номенклатуру морфологических признаков каллусных культур с целью создания на ее основе системы для компьютерной обработки информации.

- оптимизировать технологию культивирования незрелых зародышей для получения регенерантов. ■ •

- провести электрофоретическое изучение пероксидазы Иг культивируемой ткани,: определить степень ее пригодности ДЛР

. иелей распознавания функционального состояния каллусов.

- адаптировать- дм ЮШ ;1лго|ч1г«н билнатрической обра-

- Б -

ботки и унифицировать схему диалога._пользовате.гь-ЗВМ;. исследования проводить с привлечением приемов математического моделирования и планирования.

" - разработать унифицированную схему компьютерных баз данных по биохимии и биотехнологии, сформировать единый банк для приема и выдачи информации по типу справочно-информационная система.

Научная новизна. .Разработана система выделение-электрофорез в полиакриламидном геле двух фракций эндоспермально-го белка из зерка кукурузы - зеина и глгателина; получено" аь-торское свидетельство СССР N 1194333 на "Способ идентификации самоопыленных линий кукурузы по компонентному составу зеина". По результатам биохимических исследований и на основе математического моделирования изучена система взаимодействия аминокислот в белках кукурузы, (зеины, 'глютелины), выявлена их роль в формировании гидрофобности; построены модели гидрофобных взаимодействий. Методом кластерного .анализа данных электрофореза зеина при позерновом анализе показана степень сходства и различия самоопьшенных линий кукурузы. Предложена технология культивирования незрелых зародышей кукурузы для получения растений-регенерантов. Разработана схема для градации показателей отзывчивости на культивирование, входящая в компьютеризированную полузмпирическую модель, имитирующую результативность технологий in vitro получения регеиерантов кукурузы. разработана унифицированная система регистрационных карточек, обеспечивающих кодификацию и структуризацию экспериментально полученных данных при внесении их на хранение ь память компьютера.

Практическая значимость. Составлены белковые формулы используемые для целей идентификации и паспортизации самоопыленных линий кукурузы различного происхождения (селекции КазНИИ земледелия им. В. Р. Вильямса и Украинского НИИ растениеводства. ct лекции и генетики им. Б. Я. Юрьева), на их основе выявлены константные* 'самоопыленные линии. Среди образцов кукурузы маетной селекции выявлены генотипы, обладающие высокой епиоион<дп'1>ю к регенерации. Данные тестирования ге-нитиноь кукурузы на молекулярном (белковые формулы) и ткане-вим iотзывчивость на in vit.ro культивирование) включены в информационный банк, фс-рми^ую!ций "машинный" интеллект. Пред-

ложен сгенерированный пакет прикладных программ (ППП) биометрической обработки, включающий и ряд специальных программ для решения биохимических, биотехнологических и селекционных задач; • ППП адаптирован для работы на ПЭВМ. Предложены устройства, повышающие (в 10-15 раз) производительность труда при биохимическом тестировании генотипов: 1. "Устройство для размола зерна кукурузы" обеспечивает качественный помол отдельных зерновок; 2. "Устройство для определения относительной злекгрофоретической подвижности белковых: компонентов" способствует объективности, точности в установлении специфичности и различий при сравнении электрофоретических спектров.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на конференциях и семинарах Кокчетав (1985), КазНИИЗ (1987), ВОГИС (1990),' ВЦ КАСХН (1991), Актюбинск (1992), изложены в ' ".Методических указаниях по идентификации, сортов пшеницы и ячменя на основе составляющих их проламиновых биотипов" (Алма-Ата, 1985), "Методических указаниях, по культивированию . тканей кукурузы (комыотерная обработка данных) и моделирование" (Алма-Ата,- 1991), "Методических указаниях по моделированию и планированию биологического эксперимента на персональных компьютерах" (Алма-Ата, 1991). Чисть работы, касающаяся биохимических исследований, участвовала в качество раздела конкурсной работы "Полиморфизм запасных и каталитических белков и его использование в селекции", удостоенную диплома НТО за лучшую разработку в области науки и техники среди молодых ученых Каз ССР за 1986 год (г.. Алма-Ата). Резуль-. таты работы неоднократно докладывались На заседаниях методических комиссий и ученых советах Казахского НИИ земледелия ■им. В. Р. Вильямса.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 1. , авторское.свидетельство, Э методических указания, 22 научные статьи в журналах союзного и республиканского уровня, 7 те-' аисов. ' . '

Структура и обьем работы: Диссертационная работа изложена на 286 страницах машинописного текста.' Состоит из введения, .обзора литературы, 5 глав экспериментальных исследо-' Ваний, выводов, предложений, списка литературы и прилолк-ния. Текст иллюстрирован 51 таблицей, 32 рисунками, список ус-

- 7 -

пользованной литературы содержит 493 источника.

- - -----: МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ------

Материал - кукуруза (Zea mays L.). Для исследования использовали 48.самоопыленных линий, 10 инцухт семей, 18 гибридов, 5 гибридных комбинаций, 5 перспективных селекционных номера.

Методы исследования. Высев, изоляцию, самоопыление, морфологическую .характеристику растущих растений проводили общепринятым методом в отделе селекции и первичного семеноводства кукурузы КазКЙМ земледелия им. R Р. Вильямса.

Выделение-электрофорез зеинов проводили по разработанному нами методу (авторское свидетельство СССР 1194333). Паспортизацию самоопыленных линий кукурузы осуществляли по ■ выборке 50 - 100 зерновок из средней пробы семян, идентификацию - по 5 - 10 зерновкам. ... :

Выделение альбуминов и глобулинов проводили по прописи . J. W. Cross, W.R. AdaiTS (1983), глютелины- по методу, разработанному для глютелинов пшеницы (Galiii, Feldman, 1983), разделение в системе U, К. Laemml i (,1970), гели размером 120 х 120 х 1 мм. Перед электрофорезом белки глютелинового типа подвергали алкилированию с помощью раствора акриламида по J. F. Cavins, ML Friedman (1968).

Окрашивание белковых спектров проводили 0,1% раствором красителя кумасси бриллиантового голубого R-250 в 12,5% растворе трихлоруксусной кислоты (ТХУ), обесцвечивание - 7% уксусной кислотой в 10% растворе этанола. Окрашивание "серебряным" реагентом по С.R. Merrii et al. , (1981) . .

Запись белковых формул осуществляли в соответствии с номенклатурами разработанными нами для электрофоретических спектров кащого иэ класса белков кукурузы: альбуминов, глобулинов., геинов, глютелинов. .

Для аминокислотного анализа белка из электрофоретических "субфракции глютелина кукурузы проводили препаративный электрофорез в пластинах толщиной 3 мм. Аминокислотный состав определяли • на автоанализаторе фирмы LKB.. Расчет аминокислотного состава.осуществляли с учетом коэффициентов коррекции для. треонина, .серина, ., валина, изолейцина, тирозина (Kohleiv Palter, 1967)'. Полярность белков рассчитывали по Н.

- в -

F. Fisher (1964), содержание неполярных боковых цепей (НБЦ) • по D. F,. Waught (1964), средней гидрофобности по С.С. Bigelow (1967) и Lawson et all (1984). Молекулярную массу полипептидов определяли при SDS-электрофорезе по Laemmli (1970) в 10 и 15% ПААГ. Соотношение белка компонентов в пределах спектра рассчитывали, исходя из площадей пиков, полученных при ден-. ситометрии. ;

* . Солевые основы питательных сред готовили по прописям для N6 (Chu, Wang et al, 1975), КБ (Murasige, Scoog, 1962)/ в зависимости от целей и решаемых задач при культивировании вносили органические добавки по F. J. Novak et al. (1983) , J.

F. Pe toi i no, A. M.'Jones (1986), H. S. Tsay, S.'h. Miao, J.M . Widcholm (1986), A. S. Wang (1987), P. Suprasanna, K.V. Rao,

G. M. Reddy (1989). Культивирование незрелых зародышей кукурузы проводили по предложенной нами схеме (Сайб, Савин, и др. ,1991; Савин, Сайб,* Карабаев, 1991), используя модификации среды MS. /

Учет результатов каллусогенеза проводили с использованием разработанного, нами для ПЭВМ автоматизированного иден-' тификатора состояний каллусов (Савин, Калыгулова, • 1991) и спектра катодной пероксидазы (Савин, Алимгазинова, " 1992). . Катодный электрофорез пероксидаз (от "+*' к "-") осуществляли по В. J. Davis (1964) в (6 х 70 мм) ПААГ, используя трис-гли-циновый буфер (pH 8,3). Относительную активность изоформ определяли методом Е. Н. Liu (1973) по реакции с солянокислым бензидином в ацетатном буфере (pH 4,8) (Перуанский, Алимгазинова, 1985). Региртрацию результатов деления - белковую

* формулу пероксидазы записывали на основе указания ОЭП в соответствии с разработанной нами номенклатурой.

Оборудование и реактивы. Размол зерновок осуществляли на специальном устройстве (Савин RH. , \рац. предл. N 42,

* КазНйИЗ). -Разделение в пластичатом геле осуществляли на аппарате "Хиау Калур" (Эстония), цилиндрическом - в изготовленном нами сосуде (250 х 250 мм), аналогичным прибору фирмы Reanal. Чтение злектрофореграмм для регистрами результатов разделения в ,виде формул проводили на специально изготовленном нами устройстве (Савин В. Е рац. предл. N35 КазНИИЗ). ' Оптическую плотность компонентов белка регистрировали с помощью фотометрической приставки для сканирования цилиндри-

- - - 9 - -

.ческих гелей, изготовленную на основе стандартных блоков автоанализатора "Техникон- I I". Использовались реактивы фирм "Reanal" ( Венгрия), ' "Merk" (Германия),- "Sigma" (США), "Pharmacia" (Швеция), "Viskid", ' "Serva" (Германия), "Chemapol" (Чехословакия); . "Chemicals" (Великобритания) и отечественного производства квалификации х. ч. , или о. с. ч.. '

Программное обеспечение для ПЭВМ. Всё программное обеспечение рассчитано для работы на IBM PC АТ/ХТ и совместимых с ними отечественными ПЭВМ серии ЕС, , Искра .Статистическую обработку осуществляли, используя разработанные, модифицированные и адаптированные алгоритмы интегрированного нами .пакета прикладных программ для биометрической обработки данных цифровой информации (Калугулова, Абугалиева, Савин, и др.-, 1990; Абугалиева, 1991). Планирование эксперимента, решение оптимизационных задач - по алгоритмам Доспехова (1968). и Максимова (1980) в адаптированном нами для ПЭВМ варианте. Расчет ' показателей полярности и гидрофобности по данным аминокислотного , состава; белков осуществляли на основе специально " сгенерированных наш алгоритмов, работающих в среде пакета Eurika Моделирование осуществляли с привлечением разработанных для ЭВМ ЕС-1022, ЕС-1033 алгоритмов PUTAN (разработчик Ариханов С. П., БелНИШГИ АСУ), СХ 82 ( разработчик ГВЦ АН СССР), CLUST ( разработчик С. П. Мартынов (Мартынов и др., 1983) в транслированном нами для ПЭВМ варианте, а так же эксплуатировали в готовом виде программу ABAT (разработчик НТЦ г. Оренбург), пакет программ Eurika (разработчик фирма .Borland). Построенные математические аналоги, проверенные на "работоспособность" вносили в созданную нами библиотеку моделей, хранимую в памяти компьютера,- Специально сгенерирован алгоритм - полуэмпирическая модель для имитации результативности биотехнологического процесса Она включает модифицируемую часть т математический аналог и стандартный комплекс (разработанную схему градаций и поправок). Полуэмпирическая модель легко настраивается (модифицируемая часть из библиотеки моделей), для прогнозирование по любым сельскохозяйственным культурам.

Накапливаемая в процессе биологических исследований информация вносилась в сгенерированный информационный банк,. снабженный специально разработанным сервисным, программным

"■' - 10 -

обеспечением (Савин, Калыгулова, 1991). Компьютерное обеспе-печение представляет справочно-информационную систему ("машинный интеллект") ' • типа автоматизированное рабочее- место (АРМ) биолога-аналитика. ,

■ t ■ • . .

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ /'•

Эндоспермальные белки кукурузы • > Одним из условий при. создании селекционного материала традиционным или биотехнологическим способами является его паспортизация и распознавание. Для этих целей весьма перспективны приемы биохимического тестирования' по электрофоре-тическим спектрам зндоспермальных белков. , В этой связи возникла потребность в разработке приемов экспрессного выявления специфичности и маркирования создаваемых ..форм растений. Это весьма актуально в условиях требования повышения эффективности биохимических и биотехнологических изысканий.

Спиртовая фракция (зеин). В серии опытов подобраны ус-. • ловия выделение-электрофорез белков "зеинового комплекса. Состав экстрагента и условия выделения этих.белков детерминированы свойствами их растворимости в спиртах, мочевине и значительной термостабильностью. Гетерогенность обусловлена условиями подготовки к электрофореэу и условиями делений. .

Анализ показал, что выявляемая гетерогенность зависит на 41,9% (Гф-15. 43; Ft(5X)«5.99) от геометрических параметров гелей И на 29, IX (Рф-10. 71; Ft(5X)-5. 99) - от присутствия 'мочевины в экстрагенте. Доля влияния третьего фактора (специфичность генотипа) незначительна - в пределах трех : процентов и в этой связи не подвергалась дальнейшему математическому анализу. Зависимость;гетерогенности от учитываемых " факторов достаточно высока - свыше 70%. Однако, дисперсионный метод не i дает ответа на .основной вопрос - как и каким •образом каждый из факторов влияет на результативность . процесса. В этой связи осуществили изучение с моделированием.

Модель множественной зависимости (линейный вариант) гетерогенности (Y) от уровня мочевины в экстрагенте (XI) и геометрических параметров гелеьых столбиков (Хй), построенная с привлечением данных по всем испытуемым генотипам, имеет следующие характеристики параметров: j

Y = 39.523 + 7. 105*Х1 + 4. 301 *Х2 (F^/Fri; bZ] = 2.5-1)

Ранжирование факторов согласно, коэффициентов регрессии пока-..1, эывает, первенствующую роль, для XI - влияния- концентрации мо-_ чевины в экстрагенте. Для него опредилился и один из экстремумов системы . - минимум. Мочевина вскрывает потенциал гетерогенности, используемые' геометрические параметры гелей способствуют ее выявлению. В этой связи данный фактор (XI) использован нами в качестве, основного (ведущего) для управления результативностью разделения. Анализ показал наличие изменений в спектре .и по количественным характеристикам. При этом по отношению к мочевине можно определить две группы . белковых компонентов - "ыочевшгаые-минус"' (дояоряые) - и "мо-чевинные-плюс" (акцепторные). Первые, из них деградируют под -воздействием мочевины - снижают уровень белкового содержания, вторые - наоборот. Нелинейное моделирование и экспериментальные данные показали, что; наиболее результативными' являются концентрации мочевины в регионе 1,5 - 2,0 моля (М). • Оптимум определён в"2,0 М. В дальнейшем, все операции По извлечению осуществляли при найденном оптимуме. ; Сравнительный анализ результатов деления в цилиндрический и плоских" гелях показал идентичность спектров по числу и позициям занимаемым компонентами. .

После электрофоретического разделения в пределах спектра четко просматривается 5 обособленных групп (субфракций) компонентов, обозначеных А, В, „С, 0, Е в порядке подвижности. Для регистрации результатов деления и хранения их в памяти компьютера пройдены этапы построения натурных, квазина-. -.турных, математических.. . аналогов . для. электрофоретических / спектров (табл. 1)." Разработана сйстема записи в виде белковых формул, включающая буквенные символы, указывающие при- . ,надлежност.ь к субфракции и цифровые индексы ОЭП относи. т'ельно: репера. '. " Например,': белковая (зеиновая) формула для ' самоопыленной линии с номером ' по каталогу КазНШЗ.. 04309, имеет 'еид:-- ' .'" •■'•■ ■- •"■•'■ •

Л 22 24 25 27 В 31 34 С 38 40 0 52 Е 82 87 97 ;. Для-объективности • .решения вопроса о выборе реперного компонента использовали один из методов многомерной статистики -кластерный анализ (СЬиЗТ). В результате в качестве репера ' выбран компоненг-из'группы С с подвижности 40 единиц ОЭП. . Дальнейшие исследования показали, что субфракции, имеют гра-

' - ж -

Таблица 1.

• Примеры отображения оригинала (реальной системы)

и построение его (её) моделей

(На примере построения различного типа моделей (аналогов) электрофоретических спектров зндоспермальных

белков зерна кукурузы) '

Этапы отображения реального объекта * : ~~

Оригинал

Электрофоретический спектр (эф сп) спирторастворимых белков (зеинов), получаемый по нашей методике A.C. СССР N 1194333. Эф сп представляет собой ряд (систему) поперечных полос в цилиндрическом 5 X 100 мм.полиакриламидном геле (ПААГ). (Аналогично для других белков из эндосперма кукурузы - альбуминов, глобулинов, глютелинов разделяемых в ПААГ). .

Создаваемые аналоги

1/ Физические модели :1.1. Натурные модели. . Множество эф сп получаемых при анализе (изучении) различных генотипов кукурузы.' Эф сп являются макетами, опытными образцами г 1.2. Аналоговые модели. Фотографии, рисунки, схемы, макеты выполненых в различном исполнении - с дополнением (и без) характеристик цифровыми данными и пояснениями для фотографии, схем, чертежей т. е. аналоги эф сп. (Например - экран - устройства для чтения электрофореграмм 113, является аналогом зф сп, имитирующим все возможные варианты позиции белковых полос в геле **).

2. Математические модели (вариант детерминированные модели) 2.1. Описание зф сп.при помощи символов (букв и цифр), • . отображающих число, позиции, взамное расположение белковых полос в геле - регистрация информации в . виде формул ("белковых формул"). .• 2.2. Введение в формулы дополнительных характеристик:

- частот встречаемости белковых компонентов

в пределах анализируемои.совокупности (выборки)

- уровня белкового содержания для отдельных' компонентов в пределах зф сп. •

- обозначение молекулярных масс для отдельных полипептидов

- аминокислотного состава для белка из отдельных компонентов или -для субфракции в пределах эф сп.

- обозначение молекулярных масс для отдельных полипептидов - '■'[■. -ит, д. ...

* - Этапы приведены в порядке возрастания степени

абстрагирования аналога от оригинала

** - Работа на устройстве представляет собой поиск оптимального варианта и считывание данных ОЭП в процессе имитации возможных ситуации.

Ницы (ОЭП): О - 27 (А .субфракция), 28 - 35 (В), 36 - 40 (С)', 41 - 59 (D), 60 - 100 и выше '(E). .

Глютелин. За .основу-для-методической-разработки-был избран метод, предложенный для глютелина пшеницы (Galill, ..Feldman, 1983). . Экстракцию,осуществляли согласно прописи. Еелки перед электрофорезом подвергали алкилированию. Элект-рофоретйческое разделение осуществляли в пластине 10% ПААГ по 'методу U.K. Laemmli (1970). Аналогично, как для зеинов, по форме и подвижности полипептидов спектр разделен на 6 субфракций, имеющих . : границы в единицах ОЭП и молекулярных ' массах: 0-33 ( 65-80kd А субфракция), 34-40 (58-63kd - В), 41-46 (51-5Gkd - С), 47'"- 60 (42-50kd - D), 61-75 ( 35-41 kd -Е) ,76- 100.'(19-31kd - F). Запись осуществляли в виде формул ' с указанием позиций-полипептидов в ОЭП.

Для анализа эндоспермальных белков кукурузы нами модифицирован метод,' . . разработанный ..на глютелинах пшеницы. Для выяснения природы исследуемых белков кукурузы проведен •аминокислотный анализ. . Исследованию подвергли препаративно выделенные белки электрофоретических субфракций. Установлено, что белки в пределах спектра не идентичны по составу аминокислот. Различия касаются уровня содержания отдельных из них. Наибольшие колебания отмечены по семи аминокислотам: лизину (0,3-5,3), метионину (0,3-3,0), глицину (3,4-12,6), аспарагиновой (4,4-12,4), лейцину (6,2-17,2), пролину (4,9-11,6), валину (2,4 - 6,6).

• Для объективности в установлении природы исследуемых . нами белков провели сравнительный анализ с привлечением мно-... гомерной статистики. Сравнению пЬдвергали составы аминокислот'различных по растворимости фракций белка, используя данные ряда авторов и наши данные. По результатам кластеризации установлена,-что., белки АгЕ. электрофоретических субфракции, лежащие, в регионе 35-80 kd, наиболее близки по составу ами-- нокислот к глкггелинам, F - представлены зеинами. Дендрограм-■'.ма (рис. 1) наглядно отражает сходство-различие белков.

По данным состава аминокислот для анализируемых нами „белков в - автоматическом режиме осуществлен расчет показате-. лей полярности и гдрофэбности. Статистический ансамбль по варьированию уровня аминокислот и некоторых показателей гид-'."рофпбности. послужил основой для.; построения математических

DCl-RJ 80_

I

I"

I- II _l-

I I I Г I

II 13 110 16

I I'

I I 8

7

)

_! -i I I

I I "II ;i i Г

9 13

I J

I I I i" I 6 5 21 4 14 15 I 18

I'

I

19

1 I, I I. I I "I I I I 1 I ) ! I. II Г I t. T:

17

I. I

I : LI I I I ( II I I I I I I. I.II. I II I • I I ' I II 1 -I I III t II I I "I I 0. II I 20 I

12

Рисунок 1, Дендрограмма сходства - различия белков зерна кукурузы построенная (ю данным аминокислотного состава.

На рисунке цифровыми индексами обозначены: 1, 2 - 6-белок, экстрагированныий по G.Qalili, М. Feldman (1983) и его злектрофоретические субфракции: .2 - F субфракция; 3 - Е, 4 - и, б - С, 6 - А; 7, 8, 9 -/ соотвественно -эеин-1, зеин-2, зеин 23 + зеин 21 .( Gianazza et al. , 1R77); 10, 11, 12, 13 - соотвествено -/зеин, СВГ, водо- ' растворимых СВГ, водонерастворимйй СВР (Paulis, Wall,

1977); 14, 15, 16, 17 - соотвественно - Альбумин, глобулин, зеин, глюгелин (Paulis, 1^82); 18, 19, .20 -соответствено 1,11,111 хроматографрческие фракции восстановленных белков; 21 - полипептиды глютелина (Перуанский, Савич, 1987)

Г

, ■ - - 16 - •

моделей множественной зависимости. Конкретизация картины из, менчивости в зависимости между варьированием уровня содержа-• • ния аминокислот " и показателями гидрофобности" осуществлена в виде вероятностно-статистических (феноменологических) моде. лей. При выстраивании математических аналогов множественной зависимости мы стремились сочетаь лаконичность параметризации с достаточной степенью адекватности моделей. В результате расчетов найдены оптимумы в лаконичной форме описывающие систему взаимодействия аминокислот при формировании гидрофобных свойств (табл. 2): j Проверку "работоспособности" - ( прогностичности}, выстроенных': математических аналогов осуществляли с привлечением данных КГБ. Перуанского и КМ. Са-.вича (1987). Результаты проверки показали удовлетворительную ' работу моделей. Они могут служить в качестве итогового представления и применяться для решения теоретических и прикладных проблем. Например, формализованные в моделях представления уже являются приближенными экспертными оценками систем.

' Альбумины и глобулины. Исследования- проводили по методу J. W. Cross,.. W.R. Adams. (1983). Результаты электрофореза показали, что полипептиды альбуминов располагались в регионе от 10 до 70 kd, глобулинов - от 20 до 70 kd. Картина деления показала большую гетерогенность альбуминов в спектре которых регистрировалось на 6 - 8 полипептидов больше. Аналогично как для зеинов и глютелинов определен субфракционный состав и осуществлено буквенное обозначение. Электрофоретические . исследования показали, что субфракции в спектре имеют границы в ОЭП и молекулярных массах: 22 - 35 единиц ОЭП (70 -, 50kd - А-субфракция),' 38 - 70 ОЭП (3050kd - В субфракция), : 85 - 125 ОЭП (10i25kd - С-субфракция). Для злектрофоретичес-ких спектров альбуминов и глобулинов принята единая номенклатура. „V '•' .

Белки семян кукурузы,В.прикладных исследованиях.

Одним из перспективных направлений в использовании маркерных свойств белков является привлечение их для целей ' Идентификации й паспортизации генотипов. Для решения этих вопросов необходимо выяснить степень пригодности каждой' из фракций, выявить наиболее информативную.. Сравнительное исследование специфичности белковых фракций проводади, исполь-

I-

Таблица 2.

•Математические.додели описывающее взаимодействие аминокислот в белках кукурузы при формировании показателей гидрофобностей по !_аизоп, '

полярности и 'НБЦ.

(По данным аминокислотного состава' препаративно выделенных из ПААГ белков после 505-электрофореза)

I-

Характеристики параметров в системах взаимодействия аминокислот (оптимумы согласно показателям адекватности)

, I.. Взаимодействия в зеин-глютелиновых белках _

1. формирование гидрофобности по Bigelow

Y - -207.896 + 211/ 204*Lys - 230.128*Arg + 102. 423*Tyr +

27. 459*Рго - 7. 632*Gly - 66. 362*Met + 6.790*1 le + 63. 698*Leu + 61.094*Phe - 13. 029*Asp + 76.011*His .+ 29.582*The

2. формирование гидрофобности no Lawson

Y - 262.856 - 6.949*Lys + 14. 8l0*Yyr + 16. 612*Pro +

15.040*Lea + 12.624*Asp

з'. формирование показателей полярности

Y - -2. 321 - 0. 277*Tyf - 0. 086*Pro + 0. 058*Gly -

0.163*1 le + 0.184*Leu + 0.351*Phe + 0. 223*Asp

4. формирование показателей НВЦ

Y - 0.441 - О. 062*Lys + 0. 076*Arg - 0.072*Tyr + 0. 011*Pro +

0. 052*Met + 0. 006*Leu + 0.005*Asp + 0. 067*His

II. Взаимодействия в глютелиновых белках

' 1. формирование гидрофобности по Bigelow 1381.769 - 25. 523*61 у + 39. 505*Leu - 83.182*Phe -29. 43Q*Asp . .

2. формирование гидрофобности по Lawson 989.057 - 4.942*Gly - 6. 591*Leu + 4. 005*Phe -- 3. 030*Asp - 14.'795*Н)3 - 46. 428*The

Y - 0,

3. формирование показателей полярности I. 746 - 0. 055*Leu + 0. 005*his + 0. 047*Gly

4. формирование показателей НБЦ 0.138 + 0. 004*Gly + 0. 019*Leu + 0. 002*Абр - 0. 018*Hls

Y

зуя один и тот же набор генотипов. Степень различия генотипов, выявляемая по данным электрофореза тех или иных белков,

. служила одним из-критериев при выборе информативного способа --------

исследований.

Альбумин. Установлено,...что, у различных, образцов кукурузы спектры альбумина укомплектованы идентично и характеризуются одной формулой: А 22 27 32 _34 В 39 43 48 51 52 55 58 62 С 85 92 100 105 118 12б! В этой:связи использование SDS-Na электрофоретических спектров альбуминов для целей идентификации и, паспортизация генотипов кукурузы невозможно.

• Глобулин. В зависимости'- от генотипа, число полос в спектре глобулина ■ колеблется от 9 до 12: •• Различия между генотипами кукурузы отмечалось в основном по В-электрофорети-ческой субфракции - информативная . зона, в которой регистрировалось от 4 до 7 полипептидов, располагающихся по 7 пози-. циям. Для отдельных генотипов (04314-III и 04731) в пределах

. испытуемой выборки был характерен полный их комплект.

Зеин. Электрофоретическое исследование зеина показало, что каждая из самоопыленных линий, в пределах испытуемой выборки, имеет основной тип спектра, который преобладает в ней по частоте встречаемости. Доля его относительно высока - зачастую свыше 80%.

• Глютелин. Различия между генотипами наблюдаются по В электрофоретической субфракции - информативная зона, представленная белками глютелинового типа. Регистрировалось 2-3 полипептида, занимающих четыре позиции (0ЭП):34, 35, 35,5 37. В пределах испытуемой выборки генотипов, согласно укомплектованности В зоны лолипелтидами, регистрировалось три типа спектров с наборами: I. В 30,5 35 .37;' II. В 30,5 35,5 37;

' III. В 30,5 34 35 37.

• Как видно из вышеизложенного и таблицы 3, индикаторные . возможности (в плане распознавания генотипов) четырех элект-рофоретически анализируемых фракции зндоспермального белка неодинаковы. Альбумины не приемлемы для'идентификации. Среди остальных, согласно индексам различия, расчитываемым по прописи R. Lawson et al. (1980), менее информативны глютелины -индексы лежат в диапозоне 0 - 67., наиболее перспективны зе-..ины 5,9 - 29,0%, глобулины занимают промежуточное положе-\ ние. Зекны и.были, избраны для дальнейшчх исследований.'

Таблица 3.

Информативность и перспективы использования белков зерна. ¡__1-------------------------------|

N1 фракции I различие I целесообразность использования!

I белков Iгенотипов I данных электрофореза' I

I ----------Г----'-----------}—---—---------—---------¡' .

1. Альбумин нет различий идентификация невозможна 1 2. Глобулин 3 типа спектра идентификация невозможна; в ка-для 10 линий честве•дополнительного критерия Для характеристик; в комплексе с глютелинами' возможна иденти-. ' ' фикация й паспортизация. ' *

3. Глютелин 7 типов спектров идентификация близкородственных для 10-линий (сестринских) линий кукурузы не . : • всегда возможна; в комлексе с

' глобулинами возможна идентифика '' ' ' ция, паспортизация. ' .-

4. Зеин все линии имеют идентификация, паспортизация,.

специфичные- определение степени гибридности, г спектры завершенности формирования

. Полиморфизм,спирторастворимых белков ■ при инцухтировании. * •'■

Критерием завершенности создания инбредной кукурузы являются морфологические признаки - размер, формгС окраска органов, как. наиболее доступные экспериментатору. Сроком завершения формирования линии в практической работе считается * пятый год при самоопылении. Для составления общей картины о ' ■ ; характере варьирования в системе полиморфизм зеина - глубина инцухтирования провели электрофоретйческое изучение выделив-. " -шейся информативной фракции зндоспермального белка. . . .

По результатам исследований установлена специфика формирования, константности компонентного состава -эл'ёктрофорети-ческих спектров для анализируемых белков (табл. 4) и ее особенности. Статистический анализ показал, что полиморфизм (по , числу типов спектра) в поколениях у линий р 34.8Х (Гф^4.1; Рт(1%)-2. 88) определен особенностями испытуемых инцухт-семей_ и на 31,ЗХ (Рф - 8.3; Рт(1%)- 3,83), испольйуемой схемой се-' ; лекционного процесса. Показатели достаточно высоки чтобы ими пренебречь и подчеркивают'перспективность предлагаемой, рис- •

; :..•■'. • - 19 -

темы выделение-электрофорез для целей установления завершенности формирования инцухт-семей.

,. ... - - Таблица 4.

Специфичность достижения костантности по компонентному составу субфракций в процессе инцухтирования

I Характеристика электрофоретических субфракций

¡

В, С, D

i Практически у ¡ В зависимости от ! Не выявлено четкой карти I всех инцухт-се I генотипа состав Iны по формированию кон I ыей кукурузы с i компонентов стаби-!стантности состава компо (первых лет (F1-I лизируется в F2-F3I нентовпри самоопылении. IF2) при самоопы! при самоопылении , i Процесс формирования спе 1лении комплект I 1цифичен для каждой из ис I компонентов noel ! пытуемых линий кукурузы I тоянен 'I' ' • : !

i ' ' •■' ■ i '• ■ i • . ' _

При создании линий отмечается специфичность в формирования константности и на уровне элекрофоретических субфракций (табл. 4). Наблюдается следующая картина. В процессе инцухтирования каждый из генотипов отрабатывает определенный тип спектра. Наряду с этим сроки достижения константности в укомплектованности электрофоретических субфракции компонентами в пределах инцухт-семьи неодинаковы. Экспериментальные данные свидетельствуют о консервативности состава компонент тов Е-электрофоретической субфракции. Практически у всех испытуемых инцухт-семей набор компонентов постоянен с первых лет при самоопылении.

При селекции отбираются биотипы (табл. Б). Их отбор, согласно нашим данным, может происходить двумя путями:

Первый вариант. В процессе селекции отбирается тип, характеризующийся определенной формулой и регистрирующийся во всех поколениях, начиная с первого. Частота его встречаемости не менее 50%. При отборе и самоопылении он сохраняется и "размножается", сопутствующие быстро выбраковываются.

Второй вариант "смена .лидера". В процессе селекции происходит отбор определенной формы, уровень которой в рашшх

-'•/-•■ - 20 - " ''•/•.

., Таблица 5. •

• Белковые (зеиновые) формулы.генотипов кукурузы участвующих в создании гибридов'-

Типы' спектров

> 1. Самоопыленные линии

■ ВИР-139 . '

А 25 27 В 31 34 С 36 40 0 48 52 Е 87 97

• 0352

А 24 25 27 В 31 34 С 36 40 О 48 54 Е 87 97

0645

А 22 24 25 27 В 29 31 34 С 36 38 40 Б 48 52 Е 87 97 .

04299

А 22 24 25 27 В 29 31 34 С 38 40 0 44 48 52 58 Е 87 97

04732 '

А 24 25 ¿7 В 29 31 34 С 36 38 40 0 44 46 48 Е 82 87 97'

0516

А 25 27 В 31 34 С 36 40 И 44 48 52 54 Е 82 87 97

0634

А-25 27 В 29 31 34 С 38 40 Б 48 54 Е 87 97

04295

А 20 22 24 25 27 В 29 31 34 С 36 38 40 0 44 48 52 Е 87 97 ' • 0538

А 24 25 27 В 29 31 34 С 40 Б 44 46 48 Е 87 97

0757

А 24 25 27 В 29 31 34 С 36 40 Б 44 48 52 Е 82 97

2. Инцухт-семьи ' 04309 -

• А 22'24 25 27 В 31 34 С 38 40 Б 46 52 Е 82 87 97

04314(1)

А 24 25 27 В 29 30 31-34 С 36 38 40 0 44 46 48 52 Е 82 87 97 : 04314 (II)

А 24 25 27 В 29 31 34 С 36 40 В 44 46 48 52 56 Е 82 87 97 • 04314(111)

* А22 24 25 .27 В29 30 31 34 С36 38 40 044 46 48 52 56 58 Е82 87

04729

А 25 27 В 29 30 31 34 С 36 ДО В 46 Е 82 87 97

. '04731 . .

А 20 22 24 25 27 В 29 31 34 С 36 38 40 В 44 46 48 Е 87 97

04732 (1)

А 22 24 25 21? В 29 31 34 С 36 38 40 Б 46 48 Е 82 87 97 " • 04732 (1)

А 25 27 В 29 31 34 С 38 40 В 44 46 48 Е 82 87. 97

04861 -1

А 22 24 25 27 В29 30 31 34 С36 38 40 044 48 52 Е82 87 97 •

' ' 04892

А 25 27 В 29 30 31 '34 С 36 38 40 В 46 48 Е 82 87 97

«

Обозначения и номерация генотипов кукурузы согласно принятому в отделе селекции и первичного семеноьодства кукурузы КазНШ земледелия

Поколениях незначителен, вследствие чего она. может и не по-Падть в выборку. Далее, отобранная из совокупности генотипов форма, при самоопылении и размножении становится лидирующей по частоте- встречаемости/' Происходит" смена~"лидера.

То данным биохимических исследований инцухт-семей (Р1-Р5) построены . модели в математической форме описываюийе процесс формирования самоопыленных линий. Аналоги описывают его протекание у инцухт-семей с завершением и незавершением 'формирования. Модели используются для'планирования исследований.

• Электрофоретическое исследование белков' спиртораствори-мой фракции "показало; возможность,использования их специфичность'и для' маркирования интенсивности ростовых процессов на ранних этапах проращивания. По -спектрам наблюдалась четкая картина расхода, белкового содержания с течением времени. Параметры выстроеной модели для анализируемого процесса, показатели её адекватность и -моделирование позволило получить итоговое представление, где ведущая, согласно ряда показателей, роль. ч принадлежит выделившейся . Е-элегсгрофоретической .субфракции - информативная зона.

Идентификация и паспортизация как составные части характеристики генотипов кукурузы.

В результате исследования разноразмерных выборок установлено наличие взаимной согласованности между объемом выборки и степенью полноты информации о генотипе. При этом, в пределах нашего опыта установлено: во-первых, разные обьемн выборок на 25,6% ответственны за изменчивость результативного признака - число регистрируемых типов, спектра! во-вторых, 47,8" изменчивости обусловлены особенностями линий - степень полиморфизма, константность. В этой связи нами построены модели отражающие зависимость между- числом регистрируемых вариантов (У) и объемом выборочных.исследований (X) для слабо-, средне- и высокололимрфных генотипов. ,. Математические аналоги демонстрируют специфичность в наступлении затухания притока новой информации с достижением определенных уровней обьема-выборок - для . соответствующих групп (по полиморфное™) образцов кукурузы. Адекватность выстроенных аналогов пог'во-. ля«т использовать-, результаты моделирования (вриант прогниви-

рования) для планирования объемов выборочных исследований. Моделирование и практический опыт показывают; что для большинства линий кукурузы размер выборки при их паспортизации составляет;50 -.100 зерновок из средней .пробы семян, , для идентификации - б - 10. В связи с этим, объёмы 10 и 100 (две по 50) зерновок определены как оптимальные соответственно-., для идентификации и паспортизации. Паспортизованы 35 генотипов кукурузы. Кластерный анализ показывет четкие . различия -у между генотипами и группировку их в два суперкластера - об-: разцы селекцентров харьковского и КазНИИЗ (рис 2). у

In vitro культивирование тканей кукурузы 'У. фактический опыт работ показал, что требования, предъявляемые к донорным растениям, вполне удовлетворяются при их • получении способами: 1 - в теплице с регулировкой днев- У ной/ночной температуры в пределах 25 - 28/15 - 18 С, с фото- у периодом 16 часов при освещении под лампами "облучатель тепличный "Ф0Т0С-4"; 2 - в полевых условиях, применяя агротехнику, . принятую для селекционных посевов региона исследований . (юга Казахстана). •; ■. ',. '' ' 'У . .у-.У-;. у' ■'••.'•.'.';'

Сравнительный анализ результатов, культивирования раз- • личных эксплантов: незрелых початков (11 генотипов), незрелых (17) и; зрелых (7) зародышей; тканей корешков (7), пыль- '.'у ников (14) -'-. показал .различную, степень отзывчивости и..' специфичности реакций для каддого вида эксплантов кукурузы, у По усреднённым данным частота индуцирования каллусов 'для по-\ . чатков равна 69,9%, , несколько ниде - 56,3% для незрелых зародышей. Шльники не. являются благоприятным"объектом> полу- • чети надежных результатов. Изучение.. взаимодействий '. в системе генотипы - экспланты показало, что результативность ■ вховдения в культуру На 82,7% обусловлена типом эксплантат Критерии Фишера (Гф=18.93; "Рт(5%}-5Л4) позволяют трактовать У это явление, как характерное в целом для культивируемых ткау ней кукуруза Доля влияния специфичности генотипа на резуль-. тативнссть мала - не превышала 4,2% и была характерна, лишь ; для нашей матрицы наблюдений (Рф »0. 64; Ft(5%) -4. 76). Вопрос оставался, открытым. Остальные - характеристики свидетельство--; вали о преимуществе^ незрелых зародышей. Они и"'были избраны в ;у качестве Джсплантой для -дальнейших-.исследований. . ; у ;. : '

0(1-«

!

! Г| "111 ¡¡I

I »

I .

1 I

I I

I

Г

г

I

Г1 11

Г! 11 Г!! 1I I!! I ! I ¡111048611 II!0645 ! 1104731 ! И 1

104295•

04299

11 II

_11 П I ¡¡п (и пут III

I II' ¡"1 !1 053811111 III

II ¡1075711 ВИР-44! IIII III 1111' 10352 11111 II0634 1111 I ПП1 ¡04729

I II ПГр-380 11111.04314

I .'¡¡ВИР-139 ¡11104892.

I I ¡05362 . 11104309 1,10516. - ■.• . •1105364 -

I ВИР-16 105350

Но-14............" 04732 """ ' '

гГ1

II I

III III

гп г им

III I ! I Ш

11111 11111 11111

11111

11111.

11111

Хпг-175! 11! I

Хяг-251111

Хлг-1921II

Хлг-1821Г

ХДГ-164!

• йз-139

М

11

II

Хлг-331 Хлг-34 Но-13

Рисунок 2.- Дендрограмма сходства и различия генотипов кукурузы по результатам статистической обработки данных . .. ■электрофоретического изучения•рендомизированных

и репрезентативных выборок семян.

- 24 -

Для оптимизации условий культивирования при инициации' эмбриогенеза из незрелых зародышей экперимент проводили на средах по солям для Ш, N6, В5. Такой выбор сред осуществили по результатам кластеризации. Сравнительному анализу подвергли составы макро- и микросолей у наиболее широкоисполь-эуемых питательных сред. По результатам счета и на дендрог-раммах наибольшее сходство выявлено для сред KG, ■' N6,. В5 и Нича Евклидовы . расстояния между ними лежали в пределах 43 условных единиц, при максимальном в 128 для отдельных'сравниваемых минеральных основ. Сходство-различие минеральных основ определяемое по евклидовым расстояниям или по агрега-тивному показателю служили в дальнейшем и в качестве зависи-. мой переменной при моделировании. . • '

Результаты обработки данных о культивировании по прог- , рамме KOFACT (многофакторный анализ) позволяют решить один из основных вопросов - ведущим является фактор "среды культивирования". В нашем примере квадраты корреляционных отношении достигают уровня свыше '70%. Кроме того,' обработка поз-: воляе'т судить о высокой степени достоверности полученных1 результатов (Гф=26. 69; при Ft=3. 64): .Остальные характеристики, выдаваемые при расчетах, например, частота, средняя арифметическая, частоты вхождения, свидетельствуют о преиму-. ществе для культивирования эксплантов кукурузы солевой основы по КС. Фактор специфичность генотипов относился к разряду сопутствующих - задействован на 5%. Однако, судя по критериям 09; при Ft=3. 64), ■ мы не можем отвергнуть для него ; нулевую гипотезу. Вопрос о её роли оставался открытым.. Опре- . деление лишь среднестатистических характеристик (частоты каллусогенеза, дисперсия для частот я т. д..) не может обеспе-'. чить объективного выявления достоинств и недостатков сравни-: ваемых генотипов, невозможно достоверно решить вопрос как и каким образом зависит результативность анализируемого процесса от какого или каких-либо факторов.* За среднестатистическим показателем теряется специфика их действия или взаимодействия. В этой связи выяснение роли специфики генотипа в системе генотип-среда осуществляли и с привлечением математического моделирования.' Перспектива решения этих вопросов , представляет особый научный интерес.' Кроме того, моделирование позволяет расширить- представлений о специфичности иопы-

.- 25 -

туемых генотипов. Например, конкретизируется степень их пластичности - биологический смысл коэффициента регрессии.

------ По результатам" исследований"" пр0"таб"уЖро"ваны""шкалы для

отзывчивости на изменения микро-, макросолей и на молярность солевой основы в целом. Результаты ранжирования образцов показали, что генотип Целинный 450 по реакции на все факторы среды проявил себя как наименее пластичный. Следовательно, в эксперименте по модификации сред, теоретически ожидается хо-рошовоспроизводимый результат. Это подтверждается и практическими результатами - приблизительно одинаковой отзывчивостью при культивировании на различных средах. В этой связи ih vitro культура этого генотипа является удобной в качестве контрольной при методических разработках. Высокопластичные дают широкую возможность для работ по оптимизации питательных сред с целью поиска её вариантов - например, на максимальную отзывчивость. 1

Для расширения оценки и представления о результативности культивирования, например, от химических (соли среды) факторов составляется модель множественной зависимости, когда факторами системы являются отдельные ее составляющие компоненты. Например, при анализе с моделированием, установлено, что более благоприятен для оптимизации фактор микросоли: Y-12. 595*0. 0016*1 уровень макро-) +0. 0024*(уровень микро-) Такой подход вполне приемлем не только для описания наблюдаемых зависимостей, но и для оптимизации уровня фактора на требуемый уровень отклика. Аналогичный подход вполне правомерен и для решения вопроса об оптимуме уровня и других агентов, например, гормонов, Сахаров. Согласно данным'литературы, "при' культивировании незрелых зародышей кукурузы с целью осуществления эмбриогенеза наиболее популярны следующие добавки (мг/л): 2,4-0.-. от 0,25 до 3,0, тиамин - от 0,5 до 2,0, меэоиноаит - 100, пролин - от 60 до 1400, сахароза -от 20000 до 120000, Как известно, высокие, концентрации органических добавок являются.мутагенными факторами. В этой связи мы снижали уровни их содержания. Для вхождения в культуру нами использованы найденные оптимуми (мг/л): ■ сахароии -30000, L-пролина - 500, мезоиноьита - 100, тиамина - i и по .0,3 ДЛЯ пиклор;чма, дикамба, 2.4-D (Сайб, Савин и др. 1УУ1; Савин, Сайб, Карабаев, 1991).

•' ' ' ' - 26 ' .'V-'. ■ .

В последующем культивирование, с целью получения эмбри-огенйых каллусов из незрелых зародышей, осуществляли на средах с солевой основой по МБ с оптимальны»® уровнями органических добавок. При необходимости наращивания массы каллуса путём пролиферации или её сохранения культивирование продол-дали на среде того же состава, со' сниженным уровнем содержа, ния гормонов - по 0,2 мг/л для Пиклорама, Дикамба и 2,4-0 (Сайб, Савин и др., 1991; Савин, ; Сайб, Карабаев,. 1991). _ Сравнительный анализ результативности вхождения в культуру на КБ среде с различным уровнем органических добавок показал, что в пределах нашего опыта показатель на 99.02% (Гф 176,6; Рт - 19.0) определен специфичностью.генотипа. Предлагаемая технология приемлема для работы с широким набором генотипов {самоопылённые линии, гибриды, гибридные комбина-• ции, перспективные селекционные номера) кукурузы. Экспериментальные данные доказали хорошо воспроизводимый результат по показателям эмбриогенез, регенерация и в получении жизнеспособных регенерантов. В этой связи, дальнейшие исследот , вания, по культивировании незрелых зародышей, проводили по вышеизложенной технологии. ' . > . л

Растения-реГенеранты имели различные морфологические проявления. Степень сходства-различия в пределах генотипа между сомакдонами и между отдельными вариантами в пределах испытуемой совокупности . определяли с привлечением алгоритма СИСТ. Для сомаклонов в пределах генотипа ¡сходство-различие можно определить как степень "родства"! Семена от сомаклонов высаживали для получена.потомства - исходных форм для вовлечения их в селекционный процесс. V ~

Практический опыт работ- по, культивированию различных ^ эксплантов кукурузы показал наличие всевозможных морфологи; «еских реакции каллусных культур. Накапливаемую информацию систематизировали по схеме: ; ' / ;

Текстура ----г—-----'-------! результат о!-->5 (отл. )• -

(плотный, рыхлый, смешаный) \ культивир-|\ Щ-->4 (хор.)

Цвет , --------—.--------!-->ованиядлИ-->Ы ■

(желтый, белый и т.д.) I каждого IЩ-->3 (удовл)

Ризогенез----------------— У экспланта/ к!-->2 (неуд.)

.(слабый, среднии, интенсивный) ' , а!-->1 (гибель)

.- 27 -

' На основе собираемой таким образом информации и статистической обработки данных, разработаны номенклатура мор-уфологических; признаков каллусной_ткани, регистрационная карточка (рис. 3) для осуществления записи в память компьютера, и автоматизированный идентификатор состояния культур ш vitro. Основной частью идентификатора являются математические аналоги (модели), кодировано описывающие реально встречающиеся морфотипы каллусов. •

Для успешной работы идентификатора по задаваемым коман-» . дам потребовалось введение в разрабатываемую номенклатуру градации для проявлении морфологических признаков, требующих ■ в некоторой степени и .количественного выражения .по отдельные ' показателям: слабое, среднее, тотальное. . Регистрационная карточка'выполняет роль "буферной системы" - автоматически кодирует вносимую в память компьютера и дешифрует требуемую .. информации.

Методом электрофореза в ПААГ изучены катодные перокси-. дазы каллусных тканей, индуцированных из незрелых зародышей Кукурузы. С целью оптимизаций чтения электрофореграмм и регистрации результатов деления разработана номенклатура для электрофоретического спектра. По форме и подвижности компонентов спектр разбит на три'зоны с границами в единицах ОЭП: 0-30 (Л-субфракция), 31 - 70 (В), 71 - 100 и выше (С). В качестве реберного выбран наиболее быстрый и четко просматриваемый компонент. Его подвижность определена в 100 единиц ОЭП.

В пределах испытуемой выборки каллусных культур для различных генотипов кукурузы установлены .множественные формы • . пероксидазы. В спектрах в зависимости о? принадлежности к генотипу и функционального состояния каллусов выявлялось 6 -14 изоформ. По результата^ электрофореза достаточно четко маркируется функциональное состояние каллусных культур. При этом критериями могут служить качественные (число полос в спектре) и количественные (относительная активность изоформ) показатели. Утрата тотихотентности или тенденция к ухудшению . состояния маркируется, снигениец. активности вплоть до её потери у отдельных изоформ. Наибольшие вариации (качественные и количественные показатели) характерны для быстроподвижной зоны (С) - информативная зона ' ,

АВТОМАТИЗИРОВАННЫЙ ЖУРНАЛ.

ПЕРЕЧЕНЬ регистрируемых признаков

ГШШЖВ ГВДЕНтИ-1 ¡вводимые в ЭВМ1ФИКАТОР!

х. культуры

1 N. п/п-

2 Названий с. ■

3 Генотип

4 Тип экспланта: - 1. соцветие .

- 2. зародыш

- 3. пыльники

Б Среда (характеристика среды) 6 Условия культивирования ■ .«

КЛАССИФИКАЦИЯ' (ЮШЖЛАТУРА)' морфологических признаков каллуса

7 Текстура: - 1. плотная

-г. рыхлая

8 Цвет: - 1. интенсивно-желтый

' - 2. белый ■ - 3. желтый ;■

- 4. серо-белый ' •

- 5. зелёный •

- 6. бурый

- 7. красный

9 Ризогенеэ: - 1. отсутствие

10 ' . ' - 2. наличие:.

- 1 локальное

- 2 среднее

- 3 тотальное-1.отсутствие 2. наличие:.

- 1 локальное

- Ъ среднее . . -

. - 3 тотальное (гибель)

Среда регенерации(кратк. х-ка) Условия культивирования ■ Регенерация: - 1. наличие

- 2. отсутствие . Морфология регенеранта (до 1см.): Цвет листьев: - 1. зелёные .

- 2. светло-зелёные ' . ' ■ - 3. белые -•. 4. бурые ' Корнеобразование: - 1. слабое

- 2. среднее " ' . - 3. нормальное

11 Некрозы:

12

15

кукуруза Грушевская-380:

М5+1мг/л 2,4-Е 32 С; в темноте:

2 1

- *

• КБ. 16/8 д/н 1 .

-*. * ■ . т ' , "/■

1 •■.

набор ! оценок!

V I

отлично!

• I

■ ч »

хорошо' I

. I

удовле-! твори- ! тельно I I

•"'■■• I' неудов-1' летвори! тельно ].

гибель!

* - после ввода реквизита ("-") дальнейшая регистрации для порядкового номера автоматически прекращается.

Рисунок. 3. Схема организации совокупности данных для их . хранения,' накопления и обработке на ПЭГМ "ЖУРНАЛ НАБЛЮДЕНИИ";

Д 7 - 29 - ■

Сравнительный анализ методов биохимического тестирования и компьютерного распознавания при установлении состояния культивируеьшх in vitro_тканей показал совпадение результа— тов в определении характеристик функциональных свойств.

Необходимо отметить, что генотипы, имеющие высокую способность к формированию эмбриогенного каллуса, необязательно регенерирует растения с высокой частотой. И наоборот, с низкой . способностью к образованию эмбриогенного каллуса могут хорошо регенерировать растения. Ото свидетельствует о возможности наличия различных генетических детерминант при наследовании названных признаков. В этой связи для испытуемых генотипов целесообразна и характеристика по степени проявления отзывчивости на каждом этапе культивирования.

По результатам экспериментальных исследований разработана схема градаций по отзывчивости на культивирование для этапов эмбриогенеза, регенерации и построены модели множественной зависимости получения взрослых растений регенерантов . (Y) от регенерационной (Хр), эмбриогенной (Хк) отзывчивости и числа зксплантов (Хэ): V

(1.) - Y - -1.108 v 0:0114*Хэ + 0".0007*хк + 0. 696*Хр (2. ) Y - -2. 939 + 0. 053*Хз + '0.193*Хк + 0. 096*Хр где (1) - модель, описывающая технологии получения растений регенерантов получаемых по нашей схеме, (2) - по схеме Novak et all (1983). Единый тип математической модели и параметры конкретно для каждой из них делают правомерным и доступным сравнительный анализ испытуемых технологий. На основе схемы градаций и моделей сгенерирован программный комплекс, обь-единяющий математические аналоги (модифицируемая часть) и-алгоритмизированную схему (стандартная) биотехнологического процесса с поправками на специфичность генотипов (рис. 4). В таком варианте комплекс представляет полуэмиирическую модель. Она легко настраивается - вводимая модель на любой требуемый обьект исследования и позволяет анализировать любые модели по единой схеме. Результаты проигрывания на дисплее возможных ситуаций значительно сокращают ъремя на поисковые работы оптимальных вариантов или дают информацию для . разработки стратегии планируемых исследований.

Для процесса моделирования на основе полуэмпирической модели характерно наличие Двух моментов:

на входе вносится иформация о выборке 1

численное значение ! объёма выборки I

—Г

I )

ввод

1'

У - А - В~Ж + С Хк + Р Хр теоретическая модель -.

автоматизированный расчет параметров Хк и Хр с учетом отзывчивости на культивирование

! . У =■ А - В~Яз + С~Ш +

автоматизированный расчет и построение частных моделей 1 получения растений. биотехнологическим сособом ; I

"1 I ! I I I

'вывод.•

I ■ .

выходе получаем информацию с полной характеристикой частных моделей, являющихся аналогами ^реализуемых . конкретных вариантов технологии культивирования V ;

/

Уа

Л

А - В Хза + С Хка + Б Хра

уГ - А* - в 541*+' ' с 5<кг V Ь' хр!

Ут- А- В 54т +" С 5<кт + *Ь Хрт

V /

Рисунок 4.. Логическая схема алгоритма "Имитация" для. моделирования возможных ситуаций по зависимым параметрам . . .в,процессе культивирования:-клеток кукурузы. . . •*. ; :

' ..' . . - 31 -

1. эксплуатация "машинного" ("искусственного") интеллекта ПЭВМ справочно-информационных сведении из памяти

- ПЭВМ (банк данных) и по результатам обработки._______________________

2. участие пользователя (эксперта), вооруженного знани-.. ями по специальной проблематике.

Оптимизация биохимических и биотехнологических исследований

С целью упрощения' и обеспечения оперативности процесса .. снятия статистических .характеристик нами (Калугулова и др, 1990; Савин, Калыгулова, 1991) для ПЭВМ создан интегрированный пакет прикладных программ (КППГО, для которых сгенерирована единая модель диалога пользователь-комьютер. В пакет включены наиболее широко используемые биологами методы биометрической и специальной обработки: STATIC, DISP1, DISP2, KOFACT, CLUST, . PUTAN и другие. Едйная модель диалога позво-• ляет работать с однажды подготовленными данными по всем ви-. ' дам алгоритмов - пакетный режим работа

Составлена компьютерная библиотека функций, используемая для моделирования. По мере' разработки математические аналоги для реальных обьектов и процессов вносятся в библиотеку моделей. Аналоги используются для различных целей: анализа испытуемого процесса, оптимизации, планирования исследований, поиска стратегии управления анализируемым процессом и др.

Для накапливаемой в процессе биологических исследований информации созданы компьютерные базы данных по тематикам на, ших исследований. Принята однотипная схема упорядочения данных по результатам всех биохимических исследований, разработаны регистрационные карточки. Регистрационные, карточки выводимые на, дисплей компьютера, выполняют роль "буферной системы" и обеспечивюёт достаточную доступность в работе на ПЭВМ любому пользователю. Биолог-аналитик постоянно работает с удобновоспринимаемой информацией. 'Белковые формулы альбуминов, глобулинов, зеинов и глютелинов формируют "генетичес--■ кие" базы данных. Базы данных, включая и биотехнологическую, сгенерированы в информационный банк (рис. 5).

Весь комплекс компьютерного обеспечения сгенерирован в справочно-информационную систему по типу автоматизированное

| Всевозможные данные получаемые в результате I плановых исследований или по наблюдениям

I Банк данных * I <-

"машинный"• интеллект - I -знания об обьёктах реальных! системах) К—>1

/ -->! Пакет прикладных I

! программ ** I

- К программы для !

I обработки . V; I

цифровых данных) I

!Базы данных

Л \

Гпо-специальным ! .

I • ' I

. I проблемаматикам

STAT D1SP1 DISP2I PN ZC KFACT I CLUST СХ82 I

11

11

I Сервисные I! созданные на асноЕе! I ! программы . !!

' обеспечивающие!I эмпирического / ! ¡доступ^ работу!! . . . / ! ! с данными -. Г! опыта /

выборка, сортировка!'■ . / / I и т. д. . ! I /

Г~

Математическое . моделирование и . планирование /< -—> I (разработка страте / ! гии и тактики экс

! перимента)

Г

I I I

Автоматизированная справочно-советующая система выбора I методов и приёмов биохимических и биотехнологических■ I ■ , ■ исследований I

Рисунок Б. Схема, информационно-справочной системы

* •. - банк данных включает базы данных по биохимии ; ' 1

и биотехнологии

** -- ППП представлен. интегрированным пакетом программ для ■.'" биометрической обработки данных. .-."

- 33 - . _ .,..-■

рабочее место (АРМ) для биолога, компьютеризированную на базе IBM PC AT/XT. В неё входит информационный банк данных, включающий базы данных по- биохимии —"генетические" базы (коды ВА, BGO, BZ, BGU), биотехнологии (код ВТ); ряд сервисных программ для удобства общения с памятью компьютера; информационно-поисковая система "Картотека"; комплекс алгоритмов для статистической обработки данных цифровой информации (коды STATIC, DISP, СУЯ2,' CLUST, GENT "и др. ); библиотеки функций и математических моделей, используемые для "машинного, эксперимента"; .компьютеризированный алгоритм оптимизации объемов выборочных исследований (код - PN); имитационная полуэмпирическая математическая модель (код ZT), описывающая процессы получения зеленых растений через культуру in vitro. Эксплуатация комплекса дает эффект большой системы.

, Компьютерная обработка имеющейся информации превращает ее в новые знания об испытуемом обьекте или системе объектов. Ключей к производительности является наработанное программное обеспечение. . Зкспрессность получения .требуемой информации и относительная доступность в обращении с программным обеспечением способствует высвобождению сил и времени для творческой работы по специальной проблематике.

ВЫВОДЫ

На основе экспериментальных исследований, проведенных нами по изучению биохимических и биотехнологических проблем с привлечением статистической обработки данных сделаны следующие выводы:

1. Метод выделение-гпектрофорез, включающий экстракцию-белка из муки эндосперма спиртовым раствором (70% этанол) мочевины (2М) и деле|.че в ПААГ при рН 3,1 в уксусно-кислой среде позволяет'получигь.четкую картину гетерогенности спир-торастворимых белков ' кукурузы. Ведуцим фактором позволяющим управлять результативностью деления является мочевина. Данный метод можно рекомендовать для широкого использования.

С. Белки ц;ч ГзОЗ-РЛО электрофоретических юн, получаемых Hf>H разде-лении бглкоаой (Нунции, экстрагируемой из эндосперма кукурузы G, GtiM Т рис-НС] v рН 6,8) буфером, содержащим ЗХ CDS-Na, С>1 Ш,, 10% гдиЦ'-рина, 0,001% бромфенолового синего, по данным аминокислотного анализа и некоторым Показателям

•' . ■ ■ '. -■'34 - _ ';-

гидрофобности разнокачественны. Белки А - Е электрофорети-ческих зон согласно аминокислотному составу являются глюте- ' линами, Р - зеином. Установлена информативность глютелиновой ■ части спектра для целей идентификации генотипов кукурузы. •:

3. По результатам изучения аминокислотного состава зей-нов и глютелинов кукурузы найдены математические аналоги в лаконичной форме (уравнение), описывающие систему' множественного взаимодействия аминокислот при формировании гидро- ' фобных свойств. Проверка адекватности и "работоспособности"

(прогностичности) найденных ' аналогов показала удовлетворительную аппроксимацию функции отклика в зоне интерполяции и за рядом фактически сделанных наблюдений. Результаты модели- ; рования, являясь одной из форм конкретизации научного пред-,, видения могут использоваться для решения, теоретических и . прикладных задач. _ _ . .. V- ; • ,'-.■'-

4. Для злектрофоретических спектров исследуемых классов.' белков предложена унифицированная схема регистрации.результатов деления с помощью буквенных символов и цифровых.индексов - белковых формул. - Буквенным символом указывается принадлежность к электрофоретической зоне,". цифровым индексом -' позиции компонента (полипептида) относительно.репера. Эта форма представления данных легко формализуется в запись на.. хранение в памяти компьютера и для статистической ■ обработки. • . Характеристика спетров с указанием "позиций компонентов (полипептидов) относительно ■ ,■ репера носит .достаточный'минимум : информации, обеспечивающий .'объективность и экспрессность в ■■ установлении специфичности, проведении идентификации и пас-' / портиэации создаваемых генотипов кукурузы. • ■ -

5. Спирторастворимые белки (зеины) в ; подобранных нами условиях выделение-электрофорез обладают наибольшей,.в срав- -нении с другими фракциями, ■' специфичностью. Разработан, "Способ идентификации самоопыленных линий кукурузы по компонентному составу. зеина" (Авторское свидетельство СССР. N ; 1194333), позволяющий, идентифицировать и паспортизировать. .' создаваемые генотипы.. Электрофоретические спектры глобулинов

и глютелинов недостаточно информативны и поэтому■ могут быть,.' использоЕаны в качестве дополнительных критериев, при характеристике, генотипов кукурузы. ..:.......,■

г .6. Результаты злектрофоретических -анализов зеина могут .

• - 35 -

служить в качестве объективного критерия для оценки завершенности формирования самоопыленных линий. Построенные модели, описывающие. процесс формирования константности ин-цухт-семей по биохимическому показателю, используются для разработки стратегии и тактики проводимых исследований -планирования и оптимизации объема выборки. Для паспортизации на основе белковых формул достаточно анализировать 100 (две по 50) зерновок из средней пробы семян и 5-10 - для идентификации ранее охарактеризованной линии кукурузы.

7. В системе.генотипы -> различные экспланты кукурузы -> отзывчивость на культивирование, определяющим является тип экспланта, специфичность генотипов не накладывает сильных ограничений. Для целей получения сомаклональных вариантов наиболее удобным объектом являются незрелые зародыши. При изучении с моделированием для них выявлено преимущество солевой основы по. Мурасиге-Скуга и предложен оптимальный уровень органических добавок для инициации соматического эмбриогенеза

. 8, Разработаная нами номенклатура морфологических характеристик тканей в культуре in vitro, включающая градации для признаков текстура, цвет, ризогенез и сгенерированная на ее основе регистрационная карточка, позволяют автоматизиро-Еанно формализовать и систематизировать информацию о результатах культивирования при внесении в ("Журнал наблюдений") память компьютера. Идентификатор состояний тканевой культуры, содержит введенные в "Журнал", математические аналоги (модели) для каллусов, используемые в автоматическом режиме в качестве воспроизводимой меры для распознавания.

9. Электрофоретическое тестирование пероксидазы служит для распознавания каллусных культур сохраняющих тотипотент-ность; для катодной пероксидазы наиболее информативна зона С. Данные количественной характеристики - по активности изо-форм являются объективным критерием при ранней диагностике функционального состояния культивируемых in vitro тканей. Дли катодной пероксидазы из каллусной ткани кукурузы разработана номенклатура электрофоретического спектра с делением на зоны - А, В, С (в порядке подвижности) и регистрация позиций с указанием ОЭП.

10. Унифицирована схема диалога пользователь-ЭВМ для '

эксплуатации разработанных, модифицированных и адаптирован-1 ных нами алгоритмов. Алгоритмы, ориентированные на решение комплекса взаимосвязанных задач по биометрической обработке данных сгенерированы в интегрирований пакет, прикладных программ (ИППП). Интерактивный режим работы, русифицированная система меню и подсказок значительно упрощает обработку данных цифровой информации, делает ее . доступной . широкому кругу пользователи. . ' ' • ' ;

11. На основе разработанных регистрационных карточек,. позволяющих автоматизирванно структурировать .вносимую на хранение в память компьютера информацию в ' виде баз данных . сгенерирована компьютеризированная справочно-информационная система Базы данных по биохимии и биотехнологии объединены в информационный банк - "машинный интеллект", сервисные, программы открывают доступ для внесения и пользования -имеющейся информацией. .' ,

П Р.Б Д ЛОЖ Е Н И Я ■ .. биохимикам, биотехнологам и селекционерам ■"

1. В качестве биохимического критерия идентификации и', паспортизации создаваемых генотипов кукурузы следует использовать зле^трофоретический спектр зеиновых и других эндос-пермальных белков ;зера кукурузы.' Размер .выборки из средней пробы семян по ,100 зёрен. У ; ..

2. В целях обеспечения объективности, воспроизводимости результатов и экспрессности при массовой оценке селекционного материала рекомендуется использовать: устройство для размола отдельных зерновок, . электрофорез зеиновых белков, уст-, ройство для чтения электрофореграмм. ^ ? . " ■. .

3. Для получения растений-регенераентов с целью вовлечения их в селекционный процесс использовать технологию культивирования незрелых зародышей на основе среды Мурасиге-Скуга, используя следующие добавки (мг/л): I. инициация эмбриогенеза - по 0,3 Пиклорама, Дикамба и 2,4-0, 1 тиамина, 100 мевоинозита, 500 пролина, 30000 сахарозы; 11; пролиферация каллусов -. аналогично как в I - при снижении. Пиклорама, , Дикамба и 2,4-Б до 0,2; 1Т1. регенерация на среде без гормонов; IV. укоренение с .использованием 1/2 солевой основы.

4. Для оперативного, решения задач по биометрической,об

' работке данных цифровой информации предлагается промышленная эксплуатация сгенерированного нами пакета пользовательских прикладных программ, ориентированного на широкий круг пользователей.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Савин ЕЕ , Теняков Е А. Устройство для чтения элект-рофореграмм белков. Вестн. с.-х. науки Казахстана, 1984, N

5, 85-86

2. Перуанский Ю. Е , Савин Е Е Зеиновые формулы самоопы-. ленных линий кукурузы. Доклады ВАСХНИЛ, 1984, N 12, 10-11.

3. Перуанский КХ В. , Савин В. Я Способ идентификации самоопыленных линий кукурузы по компонентному составу зеина. Авторское свидетельство СССР N 1194333.

4. Перуанский К1 В , Савин Е Е Метод изучения гетерогенности зеина кукурузы. Физиология и биохимия культурных растений, 1985, т. 17, N 4 , 390-393.

Б.Савин ЕЕ. Устройство для. регистрации позиций белко- ' вых полос в геле. Селекц. и сем-во. М. , 1985, N 4, 36-37.

6. Савин Е Н Устройство- для размалывания отдельных зерновок. Вестн. е. - х. науки Казахстана, 1985, N 4, 41-43.

7. Савич И. М. , Савин Е Е , Перуанский Ю. Е , Электрофоре-тическое изучение зеина самоопыленных линий кукурузы. -Вестник сельскохозяйственной науки Казахстана, 1985, N 9, с. 23-25.

8. Савин В. Е Методы и оборудование для идентификации самоопыленных линий кукурузы по компонентному составу зеина. Тезисы докл. респ. конф. "Проблемы интенсификации земледелия • в Казахстане", 1985, 137 с.

9. Перуанский Ю. Е , Надиров Б. Т. , Абугалиева А. И. , Дух-нов С. Е , Савин Е Е Методические указания по идентификации сортов пшеницы и ячменя на осноре составляющих их проламино-ВЫХ биотипов. Ю ВАСХНИЛ, Алма-Ата, 1985, 14 с.

10. Савин Е Е Метод электрофореза для оценки гомозигот-ности по зеииу самоопыленных линий кукурузы. Б сб.: "Биохимические показатели в селекции зерновых культур". Алма-Ата, 1986, 40-47.

11. Зозуля А. Л. , Перуанский К1 В. , Савин Е Е Об идентификации самоопыленных линий кукурузы по' эеиновым формулам.

Селекция и семеноводство, Киев, 1986 л

12. Савин Е Н. Идентификация самоопыленных лиий кукурузы по белкам зерновки. Вестник с. -х. науки Казахстана, 1988, N 9, 21-23

13. Калугулова Р. Е., Абугалиева А. И., Савин Е Е , Ток-санбаева'Е С., Бижанов А. Б. Прикладные программы для ПЭВМ в селекции и биотехнологии. Веб.:. Проблемы теоретической и прикладной генетике в Казахстане. Алма-Ата, Гылым, .1990," 105 -106. ' •.,'..■/>- .

14. Савин В.Е Электрофоретические спектры запасных белков из эндосперма-кукурузы 1. Материал, методы, устройства и программное обеспечение проводимых исследований. Алма-Ата, 1991, с. 10, Деп. в КазНИИНКИ, N р 3384 . .';. ";.'•. '

15.Савин КН. Электрофоретические спектры запасных бел-; ков из эндосперма кукурузы 2. Регистрация результатов элект-рофоретического разделения и компьютерная обработка данных АлмаАта, 1991, с. 10, Деп.. в КазНИИНКИ, N р 3385

16. Савин Е Е Электрофоретические спектры запасных белков из эндосперма кукурузы 3. Сравнительный анализ специфичности фракции белка. , Алма-Ата, 1991, с^- 12, Деп. в КазНИИНКИ. N р 3386

17. Савин ЕЕ Электрофоретические спектры запасных белков из эндосперма кукурузы 4. Полиморфизм зеина у самоопыленных линий при инцухтировании Алма-Ата, 1991, с. 15, Деп. в КазНИИНКИ, N р 3387 .. • . '

18. Савин Е Е Электрофоретические спектры запасных белков из эндосперма кукурузы 5. Идентификация и паспортизация генотипов кукурузы по белкам зеинового комплекса. Алма-Ата, 1991, с. 10, Деп. в КазНИИНКИ, N р 3388 : •

19. Савин Е Е , Сайб А Р., Карабаев М. К.- Получение, со-у маклональных вариантов кукурузы. - Алма-Ата, 1991, .с. ,3, Деп. . в КазНИИНКИ. N р 3500 У;

20. Абугалиева А. И. , Духнов С. Н. . Мусин Н. К , Тадибаева Т. Л., Савин Е Е Полиморфизм запасных и каталитических бел- -ков и его использование в селекции. Алма-Ата, 1991, с. 98, Деп. в КазНИИНКИ, N р 3514

21.Савин ЕЕ Автоматизированная система поиска научно- ' технической литературы "Картотека". Бестн,' с.-х. науки Ка" чадезайа. 1991,. N 1, 101-103 '

- 39 -

22. Сазин В. Н. Моделирование и оптимизация схем культивирования эксилантов кукурузы с использованием ПЭВМ. Вестн. с. -х. науки Казахстана, 1991, N 3, 25-31.-------------------------------

23. Савин В. Н. Моделирование и планирование биологического эксперимента Вестн. с.-х. науки Казахстана, 1991, N 9, 24-29.

24. Савин В.Н. Культура in vitro незрелых зародышей кукурузе!. Вестн. с.-х. науки Казахстана, 1991, N 10, 25-30

25. Савин В. Н. Математическая модель процесса получения in vitro регенерантов кукурузы и планирование эксперимента. Тез, докл, Н. -т. семинара "Состояние и пути решения задач с использованием ЭВМ по повышению эффективности аграрной науки" (23- 25 сент. , 1991 г., пос. Алмалыбак), КАСХН, Алмалы-бак, 1991, 8 с.

26. Савин ail Справочно-информационная система для биотехнолога. Тез. докл. Н. -т. семинара "Состояние и пути решения, задач с использованием ЭВМ по повышению эффективности аграрной науки" (23- 25 сент., 1,991 г., пос. Алмалыбак), КАСХН, Алмалыбак," 1991, 9 с.

27. Савин В. Н. Методические указания по моделированию и планированию биологического эксперимента на персональных компьютерах. КазНИИз, КАСХН, Алма-Ата, 1991, 40 с.

28. Савин В. Н. Методические указания по культивированию in vitro тканей кукурузы (подготовка и проведение лабораторных исследований) и компьютерной обработке биологической информации. КазНИИз, ВО ВАСХНИЛ, Алма-Ата, 1991, 32 с.

29. Савин В. Н. Эмбриогенез и регенерация растений кукурузы в культуре in vitro Материалы Всесоюзн. научн. коиф. по с.-х. биотехнологии (Тезисы выступл.) Целиноград. Целиноград, 1991, 13-14.

30. Савин a 1L , Кгишгулова Р. Е. Автоматизированная обработка биологической информации. Биотехнология, Приложение к экспресс информации "Новости науки Казахстана" 1991, 67-68.

1 31. Сайб Л. Р. , Савин В. II, Карабаев М. К. , Сейфуллин Я. JL , Юнуоов Н. Л. -О.. Влияние генотипа на формирование мор-фогенного каллуса и регенерацию растений кукурузы в культуре in vitro. Изв. АН КазССР,-Сер. биол. , 1991, N6, 33-37.

32. Савин В. Н. Математические модели гидрофобных взаимодействий в белках кукуруза" Тез. Респ. н.-п. конф. , лосвя-

щенной 35-летию Актюбинской ГОСХОЗ: "Пути увеличения производства и улучшения качества сельскохозяйственной продукции в Казахстане", март 1992, Актюбинск, 1992, с. 47-49.

33. Савин Е Е', Алимгазинова Б. Ш. Пероксидаза как биохимический критерий функционального состояния культивируемых тканей кукурузы. Тез. Респ. н. -п. конф. , посвященной 35-летию Актюбинской . ГОСХОЗ: "Пути- увеличения производства и улучшения качества сельскохозяйственной продукции в Казахстане", март 1992, Актюбинск, 1992, с. 61-62.

Разшшжшк на ригапрнщг Тил. Л|ГС РеспуАлши К.мктк Зак ////: