Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изоформы субъединиц актин связывающего белка САР у позвоночных

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Изоформы субъединиц актин связывающего белка САР у позвоночных"

РГ8 ОД - 3 ОКТ 1996

КОРШУНОВА Юлия Олегоина

На пршшх |>укописи

УДК - 57(1.362;576.535 5

ИЛОФОРМЫ СУБЪЕДИНИЦ АКТИН-СВЛЗЫВАЮЩЕГО БЕЛКА САР

У ПОЗВОНОЧНЫХ

03.00.25 - Клеточная биологин

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидат» бж>лЬ| »И«.тк»1.ч наук.....

САНКТ - ПЕТЕРБУРГ 199(5

Работа выполнена Научный руководитель: Оффшшальные оппоненты:

физики

Велушее учреждение:

Защита состоится:

Медицинском школе Вашингтонского универс»гтета, г. Сент-Луис, США профессор Дж. Купер, Вашингтонский университет, г. Сент-Луис

доктор бполошчсских наук, профессор, Г.ГГ.Пинаев,

Институт цитолоти РАН, С.-ПсТербург;.

доктор биологических наук, профессор, Н.АЛанНой,

С.-Йстербургский Институт ядерной" РАН.

Ьиолого-ночвенный факультет С.-Пстсрбургх'коп» государственного университета

1990 гола в 13 часов На заседаний' Диссертационного совета

Д.002.73.01 Института иКголоГйи РАН по адресу: 1У41Ы, Санкт-Пегербурп ТйхорсикйГгпроспек!. л.4

С диссертацией можно ознакомился и библиотеке Инстйтхта цитологии РАН

Автореферат разослан [996 года

Ученый секретарь Дйсссртаииониого Совета

д.б.н.

Л.Н.Писарева

Акту ял м«гч-ть т'чы. Актин является одним из главных белков тггоскелета • совокупности стр)">стур, определяющих форму клетки и пространственную организацию органелл. Помимо чисто структурной ради актин участи уст в клеточной подвижности, цитокинезе, секреции, локализации матричной IMtK. передаче енгаолоп и в других процессах в клетке.Как показали гкепернменты ня дрожжах, актин необходим дял жизнедеятельности клетки. Рад патологических состояний (фибртзы, злокачественные перерождения) характеризуются серьезными аномалиями актнноиых стру^стур клетки.

Основное свойство актина • способность полнчррнзоватьгя с образованием длинных филаментов. Мономеры связываются в филаменты благодаря наличию у каждого кз них двух немдетггнчных контактных поверхностей.

условно названых "оперенным" н "заостренным" ¡юнцами. Н фнлампгге "ялшч^мчнп,;(Г конец каждого мономерного звеня соединен с "оперенным" концом следующего звена , я "оперенный" с "заостренным" предыдущего. Благодаря такой oprnmciaiuui, штитпый фнламепт является цепью мономерных звеньев, ориситнропаных в одну епцхшу. Укорочение (за счет диссоциации), как и нараедвлиис происходит и« обоих концах, но с разной скоростью. Скорость полнмернадшш /денолимеригдц!'« значительно иышс ня "оперенном" конце, поэтому его иногда называют "быстрым" или бмстрорлстущнм, тогда как "заостренный" конец называют "медленным" нлН медленнорастущим.

Упорядоченное расположение актиповых фкламетвв в клетке н лабильность актиновых структур в ходе клеточного цикла и под воздействием окружающей <:редм предполагает наличие белков, которые регулируют полимеризацию актнна п поддерживают определенные актиновые структуры. Различают несколько групп актпнепязывяющих белков. Моторные белки (миозины) связываются с актином в присутствие АТФ и принимают участие в транспорте вдоль актиновых филаментов. Другие белки участвуют в оргвштции и регуляции иоличгртпции яктииоимх фкламептоп. К ним относятся белки, которые связываются с мономерным актином

(профили!!,тимозин), беЛКИ , КОТОрЫС СВЯЗЫПЯЮТСЯ С "медленным" КОНЦОМ ф|1Л.ЧЧ<'НГ<т (тропомодулип), белки, которые связываются вдоль аклтовых филаментов (а-актннпн). Но самую большую группу актни-связывающих белков составляют белки, способные связываться с "быстрым" концом актиновых филамептов. САР белок - один из таких белков, который связываясь с "быстрым" концом актинопого филамшгта, ингибнрует полимеризацию / деполимеризацию на атом конце. CAI'белок - »го гетродимерный белок, субъсдиницы которого (а и р) имеют лишь незначительную гомологию между собой, а также с другими белками. По отдельности гу(гьсдш:ицы нестабильны, и потеря одной субгедшшцы приводит к потери всего белка.

Несмотря на то, что биохимические свойства - этого белка достаточно хорошо изучены in vitro, о генах, кодирующие эти субъединицы известно мало. Из позвоночных только для цыпленка были клонированы кДНК, кодирующие субьединицы САР-белка. Оп[юделение нуклеотидных последовательностей показало наличие двух н:юформ а-су&ъединицы. Существуют ли изоформы (5 -субьединицы? Существуют ли пяоформм субъединиц САР белка у других организмов? Каков механизм образование изофорч? Насколько гомологичны белки из разных организмов? Ответы на rent вопросы цепнм

сямп по себе н актуальны для дальнейших »(■'следований функций САР-белка у полномочных.

Цели нзалачи исследования. Целью данной работы было сравнение аминокислотных последовательностей суб-ьелнннц САР-бслка у рапных позвоночных, а также изучение структуры пион у мыши, как н|м>дставителя позпоночных. Другой целью работы было карп1|*11(янш! генов, кодирующих с)<гьедшш«ы САР-белка у мыши, что позволило бы определит» вероятность нахождения известных м\тацлй в этих генах.

Для выполнения поставленных задач были клоннропаны кДНК, кодирующие субъсднннцы CVP-белка у различных позвоночных. IIa ociioiiaiiiui определенных нуклеотидних последовательностей клонироваиых кДНК были оп|к.'делсны последовательности суб-ьеднннц (¡АРбслков из различных организмов. Гены, кодирующие обгеднннцм САР-белка мыши, были картированы н клонн]>овл>1Ы. Пьучцая новизна работы. При изучении субъеднннц САР-белка у цыпленка было »»бнпружено не таил» две и.1о<|юрмы а-субьеднницы, но также и дне изо({юрмы ß -субьединицы. Определение нуклеотндиой последовательности кДПК, кодирующей вторую »|:мм|юрму ß -суГгмдиннпм, показало, что она отличается от известной субы-динним отсутствием около 100 нуклеотидов на З'коннс. Г>го позволило 1)|х\(ш>.юж1гл., что нэо»|юрмы возникают в результате альтернативного снппПспига одной» т(«1нгкршгга. Новая иэоформв была названа ß2. Изоформы ß -субъсднницы САР-белка были найдены тпк;ке у мыши и у человека. Сравнение аминокислотных последовательностей ß -субъеднннц, определенных на основе нуклеиггндных последовательностей, показало, что нзоформы очень консервативны у различных полномочных.

{{лоннрование кДНК а-гуОъелиншил САР-белка мыши показало также наличие двух №о<|трм. И;им|юрмы были обнаружены н у человека. Сравнение аминокислотных последовательностей а-субъсдиниц САР-бслка пс.казало, что н;кх}>ормы а-еубъедшншы также консервативны.

Каргн|>опя1П1с генов мыши, кодирующих изо<|>ормы с\<гьедиинц САР-бслка, , показало, что пзоформы ß -субъединнцы кодируются одним геном, тогда как нзо<|юрчы Ct-субымншши кодируются цялпымн генами . Ьыло обнаружено три п-па, гомологичных «I- нзо<)х)рме. Анализ клопов из геномной библиотеки мыши показа;!, «гго два из трех генов являются псевдогенамн.

Наличие . одного гена, кодирующего ß -субъедннину. подтверийаст предположение о том, что изо<}х>рмы ßl н ß2 образуются в |н'зультате альтернативного сплайсинга. Анализ клонов из геномной библиотеки мыши также подтвердил это предположение, пиками, «гго структур п'иа в этом районе соотж-тствуст возможности пльтернптнвного сплайсинга.

Научпо-практнчсскос значение. U данной работе было показано наличие двух изофорч субьедпниц САР-белка у позвоночных. (¿.тонирование кДНК длв этих вжи|юрм позволяет получ)гть антитела, специфичные для нзоформ. .'>nv позволит п|юшттн ряд пнголоппескнх экспериментов по определению локализации кзо<}х>рм в клетке, что позволит приблизиться к пониманию роли двух нзоформ. Клони|ч>вание кДНК также

позволяет 3ki'ii|xiccii|>omtb эти iikkJx)j)mu ill vitro для выявления нх биохимических особенностей.

Большое знамение имеет клонирование генов, кодируют»«* субьеднннцы САР-белка, так как это позволит провести ряд геномных манипуляций (нниктнпация гена, замена гена одной изоформы на ген другой изоформы), которые помогут «опять роль САР-белка у позвоночных.

Анробпнря работы. По теме диссертации опубликовано 4 работы Результаты диссертационной работы 6ia.ni доложены на кош|к;ренцях Американского общества клеточной биологии (декабрь 1993 года, г.Пью-Орлеан, декабрь 1!Н)5 года г.Паншнгтон). Апробация работы нронедена на заседании Лаборатории генетики митоза Института цитологии РАН 22 мия 1996 года.

Обт^м 'л ртруитурц чиссгртЯ'ШИ Диссертация состоит из введения, обзора литературы, наложения методов и результатов экспериментов, обсуждения результатов, заключения, выводов н списка цитируемой литературы, содержащего 118 источников. Работа изложена на 115 страницах н иллюстрирована 15 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Бактериальные штаммы. XLblue (lael®, JacZ M15, TnlO (Tetr)j ; BB4 (supP58 supE44 hsdR5l4 gal K2 gaíT22 «rp R55 met Bl tonA AlacUI69 F[proAB+, Incl», lac Z M55, TnlO (Tetr )); XL- blue MRA ( (mcRA) 183 (mcrCB - hsd SMR - mrr) 173 end A stipE44 tbil recAl gyrA9ß relAl lac) ;Y1090 (F ■ :: (lac)ÜI69 Ion-100 arnDI39rpsL (Slrr) supF mcrA trpC22:.TnlO (pMC9; Telr Ampr)) Нее бактериальные штаммы были кутшены в фирме "New England Biolabe". Плаямидм. pBUieScriptSK(pDS) - плнзмида размером 3,989 т.и.о., содержащая бактериальный ген Лтрг.Плпзмпда была куплена у (}>нрмы "Stratngen". рСехЗ плнзмида размером 6,400 т.п.о., содержащая бактериальный гон АтрГ и ген,

кодирующий глютатнон-З-трянсфсрязу. Нлазмида была куплена у |])ир.мы "Strategen". рМА1.-с2 - плазмкда размером 6,699 т.п.о., содержащая бактериальным ген Ашрг и ген, кодирующим мальтозо-связывающпй белок. Пляэмида была куплена у фирМы "New England Biolabs".

Скрининг экспрессирующейся библиотеки кДНК при помощи антител. Титр фаговой

библиотеки был определен высеванием ряда разведений на чашки Петри с газоном соответствующею атому фагу штамма E.coli. Для первичного скрининга использовали чашки Петри диаметром 150мм, содержащие 105 фаговых колоний. Чашки инкубировали при соответСгпукнцеи данному фагу температуре до появления крошечных фаговых бляшек. После зтого на поверхность агара помещали ннтроцеллюлоаные фильтры, предварительно смоченные в растворе ИПТГ (10м!\1) и высушенные. Расположение фильтров относительно чашек метили при помощи надрезов. Чашки с фильтрами дополнительно инкубировали при 37^С в течении 30 минут. Затем фильтры снимали с чашек и номещплч в блокирующий раствор (1х TÍ'BS

с 1% жслппиюм). Раствор 1х THIS содержа 0.5 M NaCI. 20 мМ Трис рН 8.0, 0.05 % Твнн-20. Ив чашки накладывали второй (JxubTp, и чашки дополнительно инкубировали в течсиш; двух чагов при 37ПС. Ik?c снятые с чашек фильтры никубировали о 1 блокирующем [wii-пюрс » течение 30 минут при комнатной температуре, а затем переносили в |мстиор первичных ангнтгл (1х TTBS, 1% желатин, черничные eifnmvia до конечной концентрации 100 мкг/мл). В этом растворе фильтры иику^ировалн в течение ночи при 4"С при постоянном перемешивании. Фильтры споласкивали 3 раза раствором IxTTBS н переносили в раствор с соответствующими вторичными анпптлдми и мнкубнроп&лн в течение двух часов при комнатной температуре. Затем фильтры опять споласкивали раствором IxTTHS, инкубировали в проявляющем буфере , до ноиплгннл слпбой фиолетовой окраски, после чего фильтры споласкивались ;|1!гтнллн|и>м1иоП водой. 11а'юж1гте.'1Ы1Ым c4irra.ni сигнал, положение которого совпадало на двух репликах г одной чашки. Обычно сигнал на «торой реплике был значительно слабее, чем на первой, После совмещения надрезов lia чашке и на фильтр яш|> ил места, ео<глмгтсгиукнцего паложитслыюму сигналу, Вырезали с помощью наконечника от автоматической инпеткл с обрезанным концом и переносили в пробирку, содержащею 2(К) мкл распю|>о SM (0.58% NaCÎ, 0.1% MgSO,|' 50 мМ Трис pli 7.5, 2% желатина) с небольшим количеством хлороформа. После определения титра (¡mm. ди(|>фуид|||>овлт11ето п рагггюр, 103 (Jwronux частиц высевали на чашку Петри с газоном бактерии-хозяина. ГУгу чашку использовали для повторного скрининга. Скрининг повторяли до получения чистого нолож1ггелЫ1ого клона.

Выделение ДНК из рекомбинантпых бактерно<|игов. /tin выделения ДНК был» использован метод, описанный Helnis cl al. 1978. lia чашки Петри диаметром 100 мм г галопом пмсевллн Ï0"*-10^ фаговых частиц. Чашки инкубировали при оптпмплыюй для данного (|мгя температуре в течение ночи, после чего чашки охлггждплн н залипали 5 мл раствора, содержащего 10 мМ Трис рН 8.0, 2 м.М MgCl2-Чашки инку(ж|юнлл1| при качании в течение ночи нри Раствор, собранный с

чтшчс, ¡»избавляли дистиллированной водой. (1:1) и. наносили па колонку с катнонообменной смолой DK53 (2 мл). После промывки колонки 5 объемами промывочного 6y(|x'|wi (10 мМ Трис pli 8.0, 10 мМ Mg(OAr)2i СО мМ NaOAcj, фаг аллюнровялн с колонки бу<|>ером, годержащем 10 м.М Трис pli Г.О, 50 м.М Mg (ОАс)2, Наличие (¡mi гп во ф|>лк11нлх алк>ата проверяли с homouu.k) злектро<|>ореза в агарозном геле. Для этого Юмкл из каждой фракции смешивали с раствором, подержавшим 2.5 % SDS, 0.1 м.М ЭДТА, 25% глицерина, 0.001% бромфеиолового синего, и инкубировали 10 мин. при

«5 °С. Затем смесь центрифугировали (5 мин., 12000 g), и супернаталт нпноенли нл 0.7 % агарозный гель, содержащий бромистый зтидий (1 мкг/мл). Элект|>о<|юрез щюводилн при 10 Н/ем в течение 30 минут, и для локализации-полос ДНК гель освещали ультрафиолетом. Наличие полосы ДНК говорило о наличие (|«га в дяной фрлшиш. К фикциям. содержаншм фаг, добавляли пропчпшзу К до.конечной концеит|>пцц11 0.1 мг\мл и раствор SDS до конечной коншчггрлннп 0.4 %. Смесь инкубировали 5 мин. при комнатной температуре, после чего к ней добавляли 4 M рпетоор ацетата калил до конечной концентрации 0.4 М. (лить iinrjH'iw-'ni до ЮО^С растворения осадка, после чего ее. 1шкуби)н>шин ив .n.;iv п течение 30 мин. Смесь

цагтрнфугнровалн 5 минут при 12000xg, н к супернатанту добавляли равное количество 10% нзонропилоиого спирта. После 30 мин. инкубации при -20"С смесь центрифугировали 5 минут при 12000х#, :i осадок ДИК проминали 70 % этиловым спиртом. Осадок высушивали на воздухе и растворяли в 25 мкл днстиллнрованой воды. Выделение ДНК из агарозного геля. Палосу.соотяетствуннцую немому фрагменту ДНК, вырезали из агароаиого гели (0.4-1.0 %) и помещали в пробирку üíiímom 0.5 мл с проколотыми дном и крышкой. Отверстие и дне п|>едплр1п<'лмн> закрывав,™ слоем снлнконировлнной стекловаты. Г>ту пробирку вставляли в щюбнрку обьемпч 1.7 мл, и обе пробирки центрифугировали 5 мин. при SOOOxg. ('.обрпннмй н бмшую щх/шрку раствор очищали последовательной гжгтрякцлей фенолом и хлоро<|юрмом, после чего ДНК осаждали 95% этанолом. Осадок ДНК промывали 70% этннолом, высушивали и растворяли в 10 мкл днстиллнрованой воды.

Очистка белков, слитых с тлютатион-З-трансферазой (GST). 100 мл ночной культуры бактерий с соответствующей илазмидой ннокулнровалн в I литр пимы "Turbo" и пмряншвалн при с хорошей аэрацией. Через 1-2 ч к культуре добавляли раствор ИНТ!' до конечной концентрации 0.1 мМ, и продолжали вмртцнпяние еще 4 часа. После этого культуру охлаждали до

4<>С и цситрифупцювалн 15 минут при 50008000 g на холоду. Осадок растворяли в 80 мл холодного раствора MTI'BS (150 м.М NaCI, 20мМ NaH2I'04i 20 мМ Na2HP04( 0.01 % NaN3, рН 7.3),к которому были добавлены ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ, DTT до конечной концентрации 0.1 мМ и ингибиторы протсаз (конечные концентрации : 0.1 мМ ФМСФ, 0.1 мкМ пепстатина Д, 0.1 мкМ люпептнна, 0.1 мМ бензамидина). Для улучшения экстракции белка к растиорснному осадку добавляли мочевину до конечной концентрации 1 М. Полученную суспензию подвергали на холоду действию ультразвука до легкого потемнения. К озвученной суспензии добавляли саркозил до конечной концентращш 0.2%. После итого суспензию центрифугировали 20 мин при 15000 х д.К сунериатянту добавляли Трнтон Х-100 до конечной концещ^лции 1%.

Гранулы глютатион-ara розы (75 мг сухих гранул на 1 мл еути'риатшгтя) замачивали в раствор MTPBS в течение часа, осаждали центрифугированием (5 мии. при 5000хд) и ресуснсндировалн в бактериальном экстракте. После инкубации гранул с бактериальным экстрактом при 4^С в течение 30 мин при качании смесь переносили в колонку, и колонку промывали 20 объемами MTPÜS с ЭДТЛ (1 мМ), ДТТ (0.1 мМ), нротеазнмми ингибиторами и Тритоном х-100 (1%), а затем 20 объемами этого же раствора, но без Тритона х-100. GST-слнтый белок яллюцровали раствором, содержащего 50 мМ Трнс (pli 9.0), 20 мМ глн/гатноня, 0.01 % N«N'3 и протеазпые ингибиторы. В ходе оллгоцни собирали фракции, каждая из которых составляла 20 % от объема колонки. Анализ фракций проводили электрофорезом в 12.5 % SDS-полиакриламидном геле. Белки в геле окрашивали раствором Кумасси. Очистка белков, слитых с мальтозосвязывающим белком MAL. Очистку белков, слитых с MAL, проводили способом, описанным для очистки белков, слитых с GST, с тем исключением, что вместо глютятион-агарозы использовали мальтозо-агярозу, и п бу«)>ер для экст|шкции не добавляли мочевин}'.

Очшткя антител, 1>елок, глнтнй с MAI-, диялнзогшлн при 4®С против связывающего fkji|M'|M (0.1 M NallCOß (|>И 8.5) и 0.5 M NaCI). Концентрацию белка определяли no митеигипностн зоны в (шлнакриллмндном геле, окрашенном раствором Кумасси. 1Со1|11('|гг|М11(11я сч чтя ил яла приГмныгтслмю 2мг/мл. Для получения колонки объемом 5мл, 1.7 г С.М1г-гсч|м1|к>лы замачивали lia 15 минут и 10 мл 10 мМ HCl при комнатной температуре. :)«tt-m с(х|м1[и»у переносили па стеклянный фильтр и промывали 100мл HCl (10 мМ), а зятем 10 мл связывающего 6yi}*'|w. Промытую се«|>арозу смешивали с pacTmi|M)M отдиализонанного белка. Смесь iniKy6if[M)iuwTii на а равняющейся нлвт<1>орме в течение ночи при и iieiMTtMioeiLTii в колонку. Связывание белка определяли

грпиппшгм концентраций белка п растворе до и после инкубации с CNHr-сефароэой. , Колонку ii|H)MMiia:iii 50 мл связывающего б>т}>ера, зятем 50 мл промывочного буфера (0.1 M лш-гйтя Na pli 4.0. 0.5 M NaCI) и 25 мл Ix ТГЙЯ.

К 10 мл аитисыворотки, тиучеиной против того же бплкя, но сл1гтого с GST, добавляли 1мл 10х TTBS и 0.55 мл NaCI (4 M), затем смесь центрифугировали (10 мин KlOOOxji), и гупернатпнт медлен« наносили на колонку. Каюику промывали 200мл Ix 'ITHS, содержащего 0.5 M NaCI. 1>елок плкшровалн 0.2 M раствором глшиша (pli 2.8), содержащею 0.01 % NaNß. Фикции объемом I мл собирали в пробирки, содержлщне 50 мкл ) M |»arnw|ta Трис (pH 8.5). Концентрацию белка яо франтих измеряли по поглощению света с длиной полны 280 нм на спектрофотометре. Ф|шкцни, содержа тие нянГххпынес количество белка, обм-дннялн, диал изо вали П]кптш l'IIS И Х|)П11НЛИ при

Определение нуклссггндпоА последовательности с использованием модифицнроваиой Д11К-полнмеразы Т7 . (секпеназы). Определение иуклеотидной последовательности |1|н)|м)дн.'т по методу C.iiim'|mi, с использованием iinfiojia для определенна иуклеотидной последовательности <|н1рмм t'SH согласно инструкции изпгпхнггеля, и 35.4-а-тио-дЦТФ. 11ро.(укты реакций |>л:1деля.||г ¡иектрофореэом в 6 % полна криламндном геле с 0 M мочевиной при 40 Н/см.

Определение нуклеотмдноА поеледователыюстм ДНК при помощи ПЦР. Одиипуклстид. используемый как праймер для определения иуклеотидной последовательности, мстили полинуклсптидкинязоА и g- ЗЗр.дтф (|1Лц g. 32р.д'|-ф) I hmivib меченого п|>аймсра доГмялялн к реакционным смесям, содержащих одни tu пет14[нх ддНТФ (50 мкл). дНТФ (Юмкл), ДНК-матрицу (100нг). 6yi|»p для Taq-патпме|>лзы и Тафнолнмеразу (I ед). Реакции ннкубнропали при следующем режиме : 15 циклоп : 94°С, 30 сек (дештртцня): 40 55^С. 30 сек (отжиг); 72°С. 30 сек (полимеризация). 15 циклов :

30 сек (денатурация ) ;

30 c»f к

(полимеризация)

Температуру отжига выбирали на 50с ннже температуры плавления п|>аимс|>я. Продукты реакций разделяли в С% шуншкрилвмндном геле, как описано выше.

ПЦР.ПЦР проподилн в рпепюре. содержащем 20нМ каждою п|шнме|>л. 20 мМ Трнс рИ8.3. 1.5 мМ MgCl2. 25 м.М KCl. 0.05% твин 20.но 50 мкМ каждою дНТФ и Taq-полнмерпзу (2 ед.) (куплена у фирмы Perkin-Kliuer О tus). Условии ПЦР подбирали

.IUI ДПСТИЖГНИН liniLiyilllCIO prjV.TbTflTlI.

Скрининг фаговой библиотеки кДПК с помощью гибридизации. Чашки с <|шгош>П библиотекой приготовлялись так как было описано для скрининга с помощью антител. Как н в случаи скрининга с анпггеламн, с каждой чашки было снято две реплики. П качестве пробы использовали ДИК, меченную 32р с использованием набора " 1'пгпеИ И " фирмы Рготе^а согласно инструкции изготовителя. Гнбрнднлациго щюнодили в течение ночи при 0о"С в растпоре, содержащем 5х ЯЯС. 50 % дек(Т|«ш сулы}«т, О 5 % БИй, 5х (жетвор Денхардта (0.1% нолнпшшлпиррплидона, 0.1% фи кола, 0.Г/, бмчмт сывороточною альбумина) и денатурированную ДНК нз спермы лосося ¡конечная концентртщня 1мг / мл). Фильтры отмывали при 65^С в (мк-гно]»', содержащем 0.1 х йБС и 0.1% 81)3. Литорадн»г|мм|)ию проводили с пленкой Ко<1ак Х-ОМЛТ с усиливающим экраном при - 70°С в течение ночи. Сигналы, ноиторнющтч-л ня аптогра(|>ах обоих фильтров с одной чашки, считали положительными. Как н в случае скрининга с антителами, скрининг повторяли до получения чистого положгггелытт клона.

Саузсрн - внклиэ. Перенос аа иптроцеллюлатную мембрану осущ(*твлялн с помощью капшиярного метода. В качестве пробы использовали либо меченую ДНК, лгбо меченые олнгонуклеотнды, При использовании меченой ДНК гибридизацию и отмывку проводили при условиях использованмх, для скрининга библиотеки. При использовании меченого олнгоиуклеотидя гибридизацию проводили в течение 3-4 часов при температуре, рапной температуре плавления олигонуклеотндя минус 12 ^С. Отмывку при атом прозводнлн при той же температуре в растворе 2 х &5С, 0.2 % ЗОБ. А иго радиографию проводили при с усиливающим экраном в течении ночн.

Реакция обратной транскрипции. К 5 мкг РНК нз яичек мыши (куплена у фирмы "Б1гя1аден") добавляли РПКазин (40 ед) и обратную транскриптяяу МО-Ми!.. V (50 ед.) (куплена у фирмы "Рготе^а". Реакция проводились п течение 30 мин. при

37*>С в

растворе, содержащем 250 мМ Трис р!I 8.3, 15 мМ МйС12, 350 мМ КС1, 50 мМ Д1Т, но 10 и\! каждого дИТФ и 10 и\! прайме(>я. По окончании 1/4 (к-ашщн нсполшхмлась непосредственно в ПЦР , которая нроводгчагь как оннгпно выше, в течение 35 циклов при следующих условиях: 95

0С х 1 мин; ■ю(к: х 1 мин; 72<»С х 1чнн

РЕЗУЛЬТАТЫ.

Клонирование кДНК изоформы Р-субъединицы САР-белка. С'пггалось, что р-субъсдиншш САР- белка не имеет изоформ. Однако антитела против р-субьедшпшм распознавали дополнительное пятно на двумерных электрофореграммах белков из некоторых тканей, что позволяло предположить наличие второй ияо<{трмм (рис.1).

Для 1)]м>1м:рШ1 этого предположения использовали а1гпггелд против суб-ьединицы для скрининга акспрессирующейся фаговой библиотеки кДНК нз эмбриона цыпленка { нрсдостаплена др. С.Крайг , США ).

30 положительных клонов были дополнительно проверены с помощью гибридизации с радиоактивной пробой, приготовленной и» кодирующей чисто кДНК известной нзо<()ормы р-субъедин и цы. Условия отмывки был» выбраны пестроте (2Х5ЯС при

В качестве отрицательного контроля был использован клон фага 1§и1, не содержащий никаких вставок, а в качестве положительного - плазмнда (1 нг), содержащая кДНК известной субъединицы р. Из 30 клонов только 3 дали

5.0 5.5 6.0 6.5 р|

1'ис.1 Г^фнчсскос щх-дствалснне Пестри-блот* жи-ктрофоргграммы белкой из гсрлмя

11ыплснкл.

положительный сигнал с пробой. ДНКю этих клонив была выделена н использовалась в дальнейших экспериментах. »ставка из клоня, имевшею оба КооШсайта. была выслана, очищена в пгя|нхшом геле и липцюмшл в плазмнду рИЯ. Полученная плазмида была нсиолкюпяна для ощх-дг.к-ння нуклиггнлной последовательности. Последовательность пгтяпки совпадала с иоследопптилыиитыо известной 1ш«[*>рми. однако. у ш-гапкн отгутггвондлн 80 первых нуклеотндов кодирующей последовательности, я также отсутствовали основания "<>5-877 на 3" конце, в результате чего вместо ¡53 последних кодонов присутствовали 27 друшх.

Для определения недостающей последовательности в начале гена было решено определить куклеотпдиую последовательность двух других клопов, которые также могли содержать кДНК новой изоформы. Поскольку иставку из этих клонов было невозможно вырезать с помощью реетрнктазы КсеШ, то было решено амплнфшицкишть вставки в этих клонах с помощью ПЦР, используя олигонуклеигмды, комплементарные (fwironmi участкам вектора. Амплифицирошшые вставки были очнщенм от щмймеров а.'1скт[ки|н)|м_*зом в агярозмом геле н нпюлиювалигь непосредственно в («."акциях для определения нуклеотиднмх последовательностей, без промежуточной» клтн^кшлння в плазмидный вектор.

Последовательность одной из вставок не имела m-piiux 1 ,*»0 нуклеогилоп, го em. представляла непшшоразмернуга кДНК. Последовательность ш-тивкн (12 ¡ п о ) in другого клоня содержала полностью кодирующею часть н учястпк нетранелнруемоЙ последовательности, идентичный с нетранелнруемоЙ ногледпилте..н-н<х-т|.ю одного ш клонов ßl. В обеих вставках, как и в первом клоне, отсугетвокало 112 пук н-опкюв нл 3'- коша». Остальная носледоаательипт. точно соответствовала последовательности изоформы ßl. Таким образом, белок, предсказаний на основе »юследоягамм«»"!-»» новой изоформы (ß2), отличался от изоформы ßl тем, что 33 аминокислоты па С-конце были заменены на 23 другие аминокислоты. Изозлектрнческлл точка новой нзо<|юрмм, расчитаная на основе аминокислотной последовательности, совпадала с изоапектричсской точкой второго пятна на двумерной злектро<}>о[к.'грлмме. Это подтверждало, что определенная последовательность действительно кодирует новую изоформу, ß2.

Получение антител, специфичных для Р2-изоформы щлитпкл. Дне нзо<|юрмы отличаются друг от друга только несколькими амшкишелогами ня С-яонце. Дан того, чтобы получить антитела, специфически узнающие р2-суб,ьедит1цу, бил» гконструн|>ованы гибридные белки, содержащие 25 С-конценмх аминокислот jV.Î, слитых с глкггатион - S- трянп}х:разой (GST) или мальтозо-гялзмплюшнм беловом (MAL), н экспрессирующпсся в бактерии Е. coli. Own белок о^диодшя.н.и использовать для иммунизации, а другой для очистки полученных антител.

Для получения тбридных белков, содержащих С- концевые послсдопп гельное-п» р2-»шх|юрмы, имнлифши^хшали фрагмент длиной 129 нуклеотндоп, кодирующий аминокислоты на С-конце. Эти олигонуклеотидм также содержали гмн n.i д.»! (ихггрпктпям EeoRI на 5'-концах, Амплифицнрованый фрагмент ДНК был клонирован п KcoHI-ciiiir плазмиды, содержащей либо последовательность, кодирующую белок OST, либо последовательность, кодирующую белок MAL. Для проверки прапилмхщп соединения ß2-GST и ß2-MAL плазмид были определены их пугелеотидные последовательности. После этого плазмкды были трансформированы и бактериальный штамм XL blue. Трани}>орманты были использованы для выделения гибридных балкон. Гибридные белки были очищены афинной хроматографией ня колонках с глюгатиоп еефарозой или мальтозо-сефарозои..

После афинной хроматографии белок ß2-OST диализовали против физиологического раствора и использовался для иммунизации кроликов. Иммунизация и получение аптисывороток были выполнены фирмой Cocalieo.

AimicUHopoTKii, полученные в результате иммунизации, содержали антитела не только против 25 аминокислот Р2-нзо<{юрмы, но также анпггела против CST. Для получения антител, специфичных для р2, использовали нммуноафииную хримптогдофию на колонке с Р'2 ■ MAL-агарозой.

Очищенные жтггела выявляли только одно пятно, соответствующее нзоформе Р2 на -двумерных ;(лекг|хх1х>рег)>аммах белков сердца цыпленка. Это по.ттверждало, что клоннровлняя к ДНК кодирует новую нз<х|юрму, {32.

Поиск кДНК изоформ субъединиц котирующего белка мыши. Для первоначального скрининга была вл/гга (}тшвал библиотека кДНК из скелетных мышц новорожденного мышонка. Скрининг поводили гибридизацией с радиоактивной пробой. В качестве проб ппипиюнллн кДШ» ||:нх|юрм цыпленка (al, a2 или pi). 1) гнбрнднзлшшнном скрининге использовали следущне условия отмывки : 2 х 65 "С, 30 м»ш в растворе 0.2xSSC, 0.2 % S1)S. Проверка IOC клонов кДНК обнаружила 30 положительных клонов для н|м>бы pi, С клонов для пробы al и 4 клана для пробы <х2. ¡>ги клоны были очищены и из них была выделена ДНИ.

Определение нуклеотидиой последовательности двух p-мзоформ САР-бслка мыши, /tin тот чтобы ОГЛИЧ1П1. клоны содержащие рЬнэо^юрму от клонов содержащих Р2, была п|>овсд<-ия дит-тбрнднзацня. На мемб|>ану были нанесены одинаковые количества ДНК из Р-положительных клонов. Для тбрнднзацнн использовали олнгонуклеотидную пробу, послсдователыюсп. которой нрнсугспювалд в кДНК pi-нзоформы цыпленка и отсутствовала в кДНК Р2-иэо<|х>рмы. В качестве положительного KoirrjKnn на мембрану была нанесена нлазмида (1нг), содержащая кДПК р1-нзо<}(ормы цыпленка. а в кпчегтве отрицательного - нлазмнда. содержания кДНК нзоформы Р2. В параллслыюм эксперименте ДНК тех же клонов гибрид изо вали с пробой, общей для обеих изоформ. ДНК из всех клонов дала положительный сигнал с алипонуклеотндом, последовательность кото|н»го была обшей для двух субъгдиниц, но таи.ко 20 клонов дали положительный сишал с Р!-специфичной пробой. Мы предположили, что это клоны содержат кДНК р|-изо<]х>рмы, тогда как отрицательные клоны содержат кДНК Р2- нлх|>ормы.

ДНК из всех клонов была расщеплена рестрнктазой Ecoltl, которая вырезает вставку кДНК, н размеры вставок были определены злектро<|ю{кяом в 0.7% агарозном геле. Наиболее длинные вставки для изоформ pi (1.0 т.п.о.) и р2 (1.0 т.п.о.) были клонн|>о1Шны в гиазмиду pBS и их последовательность была определена с использованием ееквеназы..

Срлпненне пуклеотндшах последовательностей нзо*)юрм мыши и цыпленка показало уровни гомологии 91% для пары pi и 85% для пары Р2. Соответствующие аминокислотные последовательности идентичны на 98% и 99%, мхггветгтвенно. Как и ' у цыпленка. нуклеотндные последовательности Р-нзси|х)рм мыши отличаются наличием или отсутствием 112 иуклеотидов на З'конце.

Клонирование и определение нуклеотидиой последовательности нз<х|х»рм а-субъсдиннцы САР-белка мыши. Вставки из всех положительных клонов, полученных при скрипит с библиотеки пробпми al и а2, были вырезаны ¡ичтриктазон Kcolll. и

клонированы в.плазмиду ptiS. Нунпсотидная последовательность вставок 1« всех motion была частично определена методом Сэнгера с секиеназой.

Анализ нуклеотидных последовательностей показал, что все встапки содержат только одну изоформу - Сх2. Нуклеотидная иоследовательиость самой длншюн вставки (1.7 т.п.о.) 6i>oa определена полностью.

1 (оследовательность кДНК изо<}х)р.мы а2 мыши гомологична на 8.4% с последовательностью и;кх|)ормы а2 цыпленка, и на 72% с последовательностью нзо<1юрми al цыпленка. Охгпкгггтпукшще белки гомологичны на 94% и 8Г>%.

Ми одни нэ положительных клонов не содержал кДНК al. Расчитмвяк обнаружить кДПК в другой библиотеке, мы пропели скрининг независимой библиотеки кДНК из культуры мышиных клеток Т4 в фаговом векторе IgtlO. lîeicrop IgtIO позволяет tiej>eno;»rrb клониртмтную ДИК в (¡юрму цлалмидм (pBS). Скрининг проводили гибридизацией с пробой кДПК и;ии|юрмы a! цьшлешta. H (хмультпте было получено 7 положительных клонов, которые очистили и перевели в <(>орму илазмиды Последовательность m-тянок полученных плязмнд были частично определив с помощью метода Сэнгера.

Анализ определенных последовательностей показал,что все клоны соотпотствунгт нэо<|)ормс al. Последовательность самой длинной вставки (3 т.п.о.) была полностью определена. I [уклеотидная последовательность а!-нзо<}>ормы мыши шнчт 84% гомологии с al-нзоформой цыпленка и 73% с а2-нзоформой цыпленка. Предсказанная аминокислотная последовательность al мыши имеет 92% гомологии с последовательностью al цыпленка н 85% с последовательностью а2 цыпленка. Эти дянные говорят о том, что клоннроаяная ДНК кодирует al-изоформу САР-белка мыши.

Таким об|тзоч, мы пока.шли, что у мыши.кяк и у ны пленка есть две то<|>ормы a-субъсдиннцм и дне и;ин|х)(1М14 Р-пбьгдшнщы САР-белка.

Определение нуклеотндной последовательности кДНК а2- нзоформы субъедишщы САР-белка человека. При п|к>веркн базы данных нуклеотидных последовательностей с помощью п[К)Г|шммы " III.AST " было обнаружено, что при определении нуклеотндной последовательности одного из случайно выбранных клонов из фаговой библиотеки нланценты человека была обнаружена последовательность, которая имела сильную гомологию с последовательностям а-с\<гы"днниц iuj пленка и мыши. ГНот клон (ндентификлинонный номер H 800200) был любезно и ¡к'доставлен нам др. Солресом, США.

Неганку кДНК из этого клона выслали рестрнктазой Xliol и клонировали в Х1к>1-сайт илазмиды pBS. ,'1ля определения нуклеотндной последовательногтн вставим мы использовали так называемый метод " shotgun Вставка из плазмиды была кы|х'.тлнп н лнш|ю|шна сама с собой, с тем чтобы получить длинные конкатемерные молекулы. Г?атем пти молекулы были фрагмситирошшы ультразвуком до размера 0.5-1.0 кв. и полуичшые ф|>агмснты 6ij.ui клонп|юваны в <|>аг ,N113. Из 55 клоноп М13 была выделена оджшепочечняя ДНК, которую использовали для определения нуклеотндной поеледовятелыихтн методом [ЩР.

Оп|м:де.11ЧН1ые пое.н 'довятельностн были объединены в контигн, которые (»■рекрыяя.тн большую часть последовательности кДНК. Для онре.тсленля

последовательности между контнгамн были сшггсзироианы новые олшонуклеотлды, комплементарные последовательностям на краях контнгов. 1>гн олитнуклеотнды были использованы в качкие нраймеров прн определении нуклеотпдной последовательности иставкн в исходной плазмпде с помощью 11ЦР. Так была определена вся последовательность а-субъеднннцы CU'- белка человека. Прн сравнении этой последовательности с последовательностями а-субъеднниц из других организмов мы заключили, что клоиированая кДИК Кодирует а2-изоформу.

Наличие нзоформы Р2 у человека. Для проверки наличия нзоформ р-с}бъсднниц у человека мы амнлнфицнровалн с помощью ПЦР Л'конец кДПК р-субъединнцы, используя н качестве матрицы »(«новую библиотеку кДПК из печени человека, любезно »ям предоставленную др. Меклер, США. При этом использовали праймер, синтезирований на основе общей последовательности Р-нзоформ (в середине кодирующей части), в сочетании с одним из нраймеров, комплементарным флашогюй последовательности фага. Амплифнцированый ф(>агме1гг был клонирован в ЕсоНУ-сайт плаишды pBSv Последовательности вставок 15 пасенных плазмнд были определены с помощью тех же праЛмероп, которые использовались при амплификации. Последовательность верх вставок была идеш-ична и гомологична последовательностям Р2-изоформ мыши и цыпленка. Таким образом, мы установили, что Р2-нзоформа также существует и у человека. кДНК, кодирующая pi-субгедшшцу человека, не была обнаружена.

Определение структуры гена, кодирующего р -субъединицу у мыши. кДНК изоформ Р-субъсдшшцы отличаются друг от друга только наличием »«ли отсутствием 112 нуклеотндов. Это позволяет предположить, что PJ и Р2 кодируются одним геном, а их мРНК возникает В результате альтернативного сплайсинга общего транскрнпта. Для проперкн этого предположения было решено определить структуру гена, кодирующего Р-субъсдиницы.

Прн гнбридизационном скрипите геномной библиотеки с радиоактивной пробой кДНП pl-субъединицы было получено 7 положтсльных фаговых клонов. Гибридизация ДНК т этих клонов с олигонуклеотидами из различных частей кДНК, кодирующей pi-субтьединицу, показала, «гго 3 клопа содержат последовательность из 3' конца, включая ' нстранслнрусмый район, а также район, различный для двух изсх}юрм. Последовательность ДНК из этих трех клонов была частично определена с помощью ПЦР 11 праймеров, синтсзированых на основе последовательности кДНК р-субьсдиницы мыши. Последовательность всех клонов была одинакова и показывала наличие экзона, который отсутствовал у Р2-изоформы. Таким образом, возможность альтернативного сплайсинга подтверждалась структурой гена.

Частичное определение последовательности четырех других клонов показало, что ген разбит по крайней мере на 5 экзонов, и его длина составляет не менее 40 т.п.о. Картирование гена,кодирующего 0 -субьединицы. Поскольку для мыши построены достаточно подробные генетические карты, то было бы шггерестно картировать гены, кодирующие субъединицы САР белка и определить нет ли в том же районе генома известных мутациий, приводящих к наследственным дефектам, и, если такие мутации есть, не затрагивают ли они гены субъединиц САР белка.

Картирование проводили методом возвратного скрещивания. В скрпцнвамие исиользовали мышей двух видов : Mas sprettw (S) п M. domes lieus C57BL/I>J (В). Потомство первого поколсн!1я (FI) было скощено с одной из родительских линий (S). Геномную ДНК особей из шггомстаа этого возвратного скрещивания {F2) анализировали на гомо- и гетрознготность fio картируемому гену. Сравнивая это расщепление с расщеплением множества ранее картированых маркеров, можно 011[хмел1ггь (»асположение картируемого гена относительно известных локусов. Для тою чтобы воспользоваться этим методом, необходимо найти рсстрнкцнонный натнмо(к))нзм ДНК, сцепленный с геном ß-субьеднннны. Поиски р<м.трнкционных полиморфизмов |||юво;ц1ЛН методом Сауэерн-блотов с гмбридизацнонной пробой кДНК ß 1 -е)<Ь<еднннцы.

Рахшчия меж;1у |м)днтелыкимн видами были обнаружены при расщеплении |хгт|)нкта:имн limiilll, Kpnl. Pst I. Пнте|>естно отметить, tro Саузернблоты с геномной ДНК вида В показывали таило одну полосу, гибрндизутощуюся с пробой ßl, для всех исшиыиншнмх реетрнктяз. Г>го потверждает, что по крайнеЛ мерс у этого видя существует тпл1.ко один и'н. кодирующий Р-сз<гъед1ППщу. Наличие двух полос, гибриднзуккцнхея с пробой ß при использовании геномной ДНК другого вида (S), мож1Т б|ль объяснено наличием внутри гена дополнительных сайгой для некоторых ре<ТрН1ГГЛЗ.

Выявленные с помощью Сауэерн-блата различия между двумя видами не могли быть использованы для картирования, так как аллель вида S маскировала бы гетерозиготу, поэтому было решено использовать для картирования вндоспеннфичные олигонукле<ггиды. Для этого с помощью ПНР из геномной ДНК обоих пндоп мыши был ячплифпцнровян ф|>агмент длиной около 100 нуклеотидов из нетранслирующейся .1' последовательности кДНК. Амплнфпцн|*>ияныс фрагменты бы-in очищены от пряйчероп и HciHviuioiuwiHci. непос|х'.итпенно для определения нуклеотндной последовательности. С[1Л1шемие 1>п|м'.(е.1енпых последовательностей позтхлило обнаружить два межвидовых различия CGC.G (S) - С,С,С,С,С, (В) и ТСТСПТСАС (S) - СТСТСЛСАСЛ (В). .'>го iiojbuciilto гкоиструи^шять 4 аллсл1гнсцнфичных олнгонуклеотнда Эти олнгонуклеотнды гнбрндн.юпаин г амплнфнцнронаными 3' концами генов ß-субьедшшц обоих видов, а затем мембраны с гибридами ДНК отмывали при различных темиер«т\|и»х в [wirrmipe, содержащем 2xS.SC и 0.2% SDS. Г>ги предварительные эксперименты помогли ои|>едслнть температуру отмывки, при кото[юй наблюдалась отчетливая межвидовая дискриминация.

11.1 геномной ДНК 01 мышей (поколение F2) были амплнфицироваиы соответствующие фрагменты, и зги фрагме!гты были прогибрпднзнрованы с аллелесиецнфнчнымн олигонуклеотидами. Результаты показали, что амплнфицпровлпые (фрагменты нз 1еномной ДНК особей F2 гнбрнднзовались с олигонуклеотидами, спец|к]шчпычн ,и>< вида S. 'по и следовало ожидать, тогда как ямплифнцированые фрагменты нз геномной ДИК только нескольких особей гнбрндизовалнсь с атшонук.-н-отндямн. специфичными для вида В. В случаях, когда гибрнднза'щя наблюдалась со всеми олиюнуклеоггидамн. мы считали особей гетрозиготнымн, П г случаях когда шбрпдпзацня наблюдались только с S - специфичными олнгонуклеотндамн, мы считали особей гомозиготными.

Данные о генотипе каждой особи но гену р-суб-ьеднницы ОЛР белка был! посланы в лаб«|шторню Джексон, где они были сравнены с растеплением у тех Ж1 особей но другим генам. Косегрегация гена Р-С)бъединнцы с соответствующими ране« картнронапымн маркерами позволила локализовать этот ген на 4 хромосоме ш расстоянии 74.5 сМ от центромера.

Картирование генов, кодирующих а-субъедипицы. Сравнение поеледователыюстеГ кД11К двух н;им|)орм а- субьедшшцы позволило предположить, что они, в отличии от Р изофпрм, кодируются разными генами. Картирование генов а- субыгдиииц проводил* тем же методом возвратного скрещивания, что и картирование гена Р-гу<гы;дннниы.

М|К!Д1шр1ггслы1ые эксперименты показали, что различия между двумя видам! мыши, М. яргсИи и М. вошсйНгия С57ВЬ/6,1, можно определить с помощью Саузерн блота геномной ДНК, расщепленной рестрнкгазой ЕсоШ. При гибридизации блата < радиоактивной пробой, приготовленной из кДНК а1-суб«.,диннцы, выявлялось с па-юсы, которые имели разный размер у двух видов. Эти различия могут бып использованы дал картирования. Наличие трех полос мы объясняли тем, что ген может содержать внутренне сайты для згой рестрнктазы, которых пег в кДНК.

При гибридизации того же блота с пробой а2 выянлялась только одна полоса размер которой был различен у двух видов.Эгн различии тоже могут быть использовань при картировании.

Геномная ДНК из 94 особей (поколение К2) была расщеплена |>естрнктазоЯ ЕсоШ и нспол1>зована для Саузерн- блотов, которые были прогнбридизоваиы либо ^ пробой а1, либо с пробой а2, что позволило определить гомо- и гетерозиготных особей. Расщсплсние по трем полосам а! было независимым, что говорило об их соответствии трем генам, а не трем частям одного гена, как мы первоначально предполагали. !>п гены были названы а!-1 (соответствует паюсе большого размера), а1-2 (соответствуй полосе среднего размера) и а1-3 (соответствует полосе наименьшей) размера).

Данные по расщеплению трех генов а1 и гена о2 были посланы в лаборатории Джексон (США), где они были сравнены с расщеплениями известных маркеров. Эгс позволило определить положение генов в геноме. Гены а1-1, а!-2 и а1-3 были картированы на хромосомах 3, 1 и 9, соответственно. Ген, коднрущин а2- изоформу, был картирован на хромосоме 6 па расстоянии 1сМ от центромера. Частичное определение структуры генов а1. Одни или два нз трех жшюжны* генов а1-изоформы могут быть псевдогенами. Для проверки этой возмзжпостн было решеис попытаться клонировать все три гена, проведя гибрнднзационный скрининг геномной библиотеки мыши с пробой а1. В результате этого скрининга было получено 32 положительных клона.

Длй анализа клонов использовали Саузерн-блот ДНК рекомбинантпых клонов, расщепленных реегрикт^зой ЕсоШ. Гибридизацию проводили с радиоактивной пробой а1. Условия гибридизации и отмывки были строгими. Мы ожидали, что размеры ЕсоШ-фрагментов в клонах будут соответствовать размерам фрагментов, вылвленых на Саузерн блотах геномной ДНК, расщепленной этим же ферментом. Действительно, • размер фрагментов, гибридизующихся с пробой о1, у 9 клонов соответствовали размеру

наименьшей полосы. У 7 клонов эти фрагмс1гты соответствовал средней полосе. Размеру наибольшей паюсы соответствовал RcoRl-фрагмснт только ш одного клона.

Фрагменты из остальных клонов имели различную длину, отличную от длины 4>|>агмс1тш на геномном Сяузерн блотс.

Последовательность ДНК одного клона из каждой группы, соответствующей пине фрагментов на геномном ('.ауперн-блотс, была определена с помощью Г1ЦР и ираймеров, еннтезнрованыг. нп основе нуклеотидной последовательности кДНК ol-мзо(|м>рчы мыши. Оп|>сде.тгние частичной последовательности ДИН клонов, содержащих ;J>pnrMcirn4, соответствующие полосам al-2 и al-3, показало, что они содержат последовательность кДИК al. Отсутствие »иггронов, а также наличие мутаций в кодирующей части гена, прнво;1ящих к преждевременной остановке транскрипции, свидетельствовало в пользу тога, что яти клоны содержат иссвдогсны.

Он|1едслснне частичной последовательности /IHK к/юня, содержащего фрагммгг, мхгпитстиуюшнй шхлосе наибольшего размера на геномном' Сяузерн блоте, показало, что зтот клон содерж1гг 2 последних зкзона нз 3' области кДИК. Наличие ннт|к>нпа, которые очень ре;жо встречаются в ясевзогенах, и отсутствие мутаций в экзонах заставляет предположить, тго полоса наибольшего размера на геномном Саузсрне-блогс соответствует настоящему гену, кодирующему al-нзоформу су<гъедшшцы СЛР-белка у мыши.

ИЦР-амшшфикация новой м:юфор«4Ы аЗ. Совсем недавно была обнаружена кДНК, последовательность которой на -10% гомологична последовательности а- субъсдишщы. Белок, подсказанный на основе этой последовательности, также имеет сходство с а-су'бы'днннцеД, «астму новый ген был назван САР аЗ. Хотя зтя новая нзоформл имеет сходство с другими а нзо<)х)рмами. это сходство гораздо меньше, чем между al- и а2-нз<х|х>рчими. Свойства повой н:их|х>рчы пока не изучены.

Поскатьку нухлеотидная последовательность кДНК была известна, то мы пмплнфицировали ее нз РНК с помощью обратной транскрипции н НЦР- Поскольку было и:нмч-пт, 'mi пи ;жг|1[му1'|1|>и'п'я п тестнкулярпых зародышевых клетках, то было (кчнено взять РНК из яичек. Лч11лифици|>овяпый и|юдукт (размером окаю 0.8 т.п.о.) был клошцмшан в KroHVcaftr iLin.ndi.iij pDS. Последовательность вставки была ощх'де.кчш с помощью НЦР н плн|онукл<чт1дов, которые либо соответствовали фшншпым п(м'ледователывмчнм вектора, либо являлись теми же олнгонуклпотндамп, которые нсполиюшынсь для ямшпфнклцин кДИК или при скрининге бактериальных колоний.

Последователыннт». вставки совпадала с омублнкованой последовательностью аЗ-ц.их(м>рмы. за исключением т'клептидных замен в некоторых позтшях. ihn замены могли возникнуть в результате ошибок Taq-нолимерязы, но не исключено также, что они приставляют собой внутривндопвые рахтнчня. Поскольку полученная вставка была в основном гомолошчна кД11К аЗ- н;мк|юрмы, она была использована в дальнейших :жеперпм1чп11х.

Картирование гена. кодирующего новую нзт|юрму а- субъединицы. Для картировании а.Ч иецолмоплли метод возвратного скрещивания, который был

IH'IIO.TMlllylll tin К11[1ТН]М1Ш\||11Н ICHOB ДЛЯ Р II а су^гьсднннц.'

Вначале были проведены предварительные эксперименты, целью которых было' найти рестрнкцнонныс варианты аЗ у М. Spretus н М. domesticus C5711L/6J, которые можно было бы нспалыюмть для картирования. При расщеплении рестрнктазрй ЕсоШ межвидовые различия выявлялись на Саузерн-блоте наиболее отчетливо и могли быть использованы для картирования. /(111ч из 94 особей (поколение F2), расщепленную ресгрнктазоЙ EcoRJ, анализировали с помощью Саузсрн-блота. В качестве пробы нснол1>зовалась кДНК 0(3, меченная радиоактивным фосфором (*^Р).

Результаты |>ас1цснлсння но гену аЗ были посланы в лабораторию Джэксон (США), где они были сравнены с рашеплением по другим маркерам, что позволило картировать ген, кодирующий аЗ, на шестой хромосоме на растояннн приблизительно G9..VM от центромера.

Сравнение аминокислотных последовательностей субьсдиниц САР-белка из различных организмов. При сравнение аминокислотных последовательностей a it Р субьеднниц САР белка среди позвоночных использовали пртграмму MegAligu (рис.2 и рис.3, соответственно). Последовательности кДНК из рапичных видов были пасены из базы данных GenBattk или определены в настоящей работе.

Huutrl till,к/ Mowte/ . l>Ot| Нимлл

IMlkl

NovMl

(hick;

Uouje2

D09

Нимап

mm i hji ми i пи|пм i (tikiT-.i i hi yi ч,-» mi i i^m^h и'.aamai aijim^i

I»

Л1

M

1(1

MAUMt>KVM)l I kVRUlkl | IIIAI'1'l.l I 41 VI M/kNI I I MlltM I *1 I. A AHA I Ayililil>jl IfVUlUl /0 MtmtORvSW UVRlkkkt типчпмт Мч«1 11 I N1 lAkllk) Jnj»NWl".'t H'Vkll It

MAIN МЦ1 Mil I kVRIUkl IIHM't'll IMVIMibUllttthl»,) IKH.kktikikQtKI l*JI lmltlt.1 /0

MAIltllUt SOIIIVRIAAkl IIIIAI'IM I hi VI hrtvUI 11 XNIINI IkllAAUAi IKJi !I>VMI И 'О

tU>lllllJI Stll I kVRIAAII llHkl'I'MIMVI I f MSI»*I| I Ml (.kill*I AiJ»M |М;1 |ИНК< 'О

WAOl lltjl 4011 kVklkklt 1 iHkt'lal I «II VI M№KI I I И11Ч1 I Kl LAAMAt A<Ji*l1^1 IPVkllU /0

» ил.

DPAIITIHtDlC'ICkllW'kHIIISMMWII'litkini'WPMVIhkvMWHISVHklltk'VklHn'IICV

SO 90 100 110 l.»0 11» HsS

tK«vmiH(,DH.«4HWBK4U4DHllHU40r4JI'fDTI Ml XQHRDAIDUt AAl>XDKir>lCI HQ

DDCVl I TEHCOICNMIIDPRNQISIXFPHI RKtA^DPQPIDVOCOl klRRE H0SAI RAtv«DHYi«l HO DIQVl ITEHtDlCNCkFlOPXHXISf XFPtURACAIOPRPttl VI HkliiRRHSVI lkMKkrvkl НГГЧСУ HO EDQVlllE HCDlCNCRl IDPKNRKIXIDHI RKIA1DPRPTI AEMAll^RRlSVt lALRkYVMH1PKt,v 14« tDQVlltlH&DLCttCKHDPXNRKIAIDHlRIiAIIPRPYIAINAVlMRI^VllAlRAIVRIMfPIHV HO EOQVlIIEHCOlOtGKFlDPXHRltlXIDHlRXi A1DPRPCIVINAVI i>R HVEIAIRAIVXH1YP4CV HO

CMckl

Mousil

Chick?

Mouic2

Oog

Hu«ton

Chlckt

Holiktl

ChtckZ

Mouje2

Oog

Hunan

tYVYCXXIDCOOTl lAClESHOIQAKHFWllCRRR WKF IITPSYIOVVCIIкIQVUYYIOCXVQIVSHX 150 160 1/0 110 190 200 210

CYVYCXSI0&QQTllAClESHQFQPXNFO4CR*RSEIIXf IIIPPTAQVAAVIRIQVHY YIDCWQIVSHX 210 CTVrAKJIOGQqtlUCHSHQFQPXNFRHtRRRHOKI UlPPSAQVVbVl RlQVHrYf DUVQIVSKI Лв (TVYCKriDGQQIlIACIESKQFQAKNFfthCRRRSEflkf USPS! 1QVACHK1QVMYY1D&4VQL V^HX 210 CTVYCXXVDGQQJlIACIESHQFQAXHFRNIifiRRSt^XF FVIPSllQVVbllKIQYHYYIOGXVQlVSHX 210 CTVY(XXlD&QQIf lAClESHQFQAXNFRNCRHRSEflKF II IPSTIIfVVCIlXlQVHYYIO&MVQlVSHK 210 CTVYCXXIOCQQTItAClESHQFQAKNFllNCRftRWIIXF TI TPSTIQyVGIl XtQVHY YEDCWQtVSHK 210

■ ■I

DlQDilTVSMEVQTAXEFIXIVEAAEItE Y^TAISFNfQTM^pTTFXAtRRQLPV TRTXIDWSXILSTXK

гге . гзо г<о ги гьв г/о . 2ia

OIQOSVQVSSOTQTAXEFlXllENAENEYQTAISENYQTMSDTTFAAtRRQtPVrRIXIORMXItSYXIC /10 DVQDSVTVSNEIQTTXEFIKI1ESAEHEYQTAX5ENYQ1MSDTTFXALRRQIPVTRTKI0II4KI1.SYKIC /10 DIQDSITVSNEAQTAXEFIXIVEAAENEYQTAISEKYQTMSOTTFKAIRRQIPV YRTXIDflNXILSYXlf 210 DIQDSLTVSNEVQTAKEFIXIVEAAENEVQTAISENYQTUSDnFKALRRQLPVTItTXIMSXlLSYkK 210 OIQDSlWSNEVQIAXEFlXlVEAAEMEYQTAISEIfYQTMSPTIFKAlRRQlPVTRIKIDltMKllSYKlC 210 DIQOSLTVSNEVQTAXEFIKIVCAAEHEYQTAlSENYQIHSPTrFXAtRRQLPV TRTKIDkrVKI LSYXK 210

Chlckl Housel ChlckZ . Mouse2 Dog Нимп

XEUQHI KEMQNA XEUQN« XEMQNA KEMQRA «ЕНОХА

216 2>Б 216 2S6 216 2>e

H

Рис. 2 -Сопоставление аминокислотных последовательностей a-нзоформ у

позвоночных.

От И

инсъг

Меи**/

(КкН к?

Н^п?

см«м

(М(И Иои«#1

СМ«к2

Рис. 3 Сопоставление аминокислотных последовательностей Р-пас<|юрмг у

Сюзэоночных.

ПМНОДМ.

К Показано существование двух илоформ р- субгсдиницы САР-белкд у цыпленка. 2. Получены антитела, специфичные к Р2-нэоформе САР - белка Л. Нзофорчы обеих с><Ьедншщ существуют у разных видов позвоночных.

4. Клонированы кДМК, кодирующие изоформы САР-белка у различных организмов.

5. Сравнение нуклеоткдноЛ последовательности кДНК субъедшжц САР-белка у

различных организмов показало высокую консервативность этого белка у

ПОЗВОНОЧНЫХ.

6. Клонированы гены» кодирующие изо<|х>рмы с^бъедишщ САР-белка мглтг.

и> «в ь»» 1.0 ?*•

('< П( РНЭдЯ \Р1 И>1 УРЧ111|)| I Ч1»*!** 1кинчуупишюткжчоч

|жш.чт имумчитVччуа»}»'»Vи нмх^скиошвшг'чяцшмгм пнугшюи нуо^и щавокууьюш 1 о»»noi.es

15 199 II» 7*9 139 на

Т*Ч*>*^МТ{>*>Р1 * IУМ* «И !*}»>&! ТИ иу11Уи*Р10МСГНУ1П11ДСМ

оогво« 1>итчуи»01Г>«сгАСуц иким тиинто^шскаирътпи с v с лччаювгпсип ссуиуп »рюьсга су и итьс

¿»«1*с(*оч1нуу1уои$итнгкV и тч»Iдт»к$гсди ?»о( ?У$РС*Р* у ив I*-* 1)9 ив т гее м*

Т^ТУ»! VI ОГК» Г ?'.?>

■ а а > а -о ' т *

Л» 249 259 269 2)9 .

|||г(;я1у{с«с>|х1а1г1миуг(хга0}у«>и>51м]р1)чосуко1о«(1^о«1то«()1у!о(»оч 177

**К«1УСОИ(МЛЯ1«|С{ТГССГКр1У»;1«Н(?ГМСЧ1^«С^ИЧ01У£*ивЧ?<3^ 171

7. Гены, кодирующие изоформы субъединиц САР-белка мыши, картированы, и

рассмотрена возможность нахождения известных наследственных аномалий в этих генах.

8. Показано, что (1-изоформы кодируются одним геном н возникают в результате

альтернативного сплайсинга, тогда как изоформы а- субьедлинны кодируются различными генами.

9. Показано существование 3 генов для al-изоформы САР-белка мыши, 2 из которых

являются псевдогенами.

10. Картирован ген, кодирующий новую изоформу а- субъедншщы у мыши -аЗ. В

районе этого гена отсутствуют известные наследственные аномалии.

Публикации на тему диссертации

D.A.Schafer, YtO.Korshunova, T.A.Schroer, J.A.Cooper "Cloning and characterization с novel isoform of the b-subunit of capping protein" // Тезисы к конфереици Американского общества Клеточной биологин,- 1993 год, г. Нью-Орлеан

D.A.Schafer, Y.O.Korshunova, T.A.Schroer, J.A.Cooper " Differential localization ani sequence analysis of capping protein b-subunit isoform of vertebrates" // J.Cell Biol., . 1994- т127,- c453-465

Y.O.Korshunova, M.C.Hart, D.A.Schafer, J.A.Cooper "Mouse capping protein: cDN/ sequence, tissue expression, gene mapping and disruption" // Тезисы к конфереицш Американского общества" Клеточной биологии,-. 1995 год, г. Вашингтон

M.C.Hart, Y.O.Korshunova, J.A.Cooper * Mouse capping protein alpha subunits: cDM sequence, tissue expression and gene mapping" // J.Cell Biol.,- 1996r (в печати)

Tun.BilUUijts^eb.Zot.Tup foo.