Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИЗМЕНЕНИЕ ГОРМОНАЛЬНОГО СТАТУСА КЛЕТОК ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ ПАССИРОВАНИИ КУЛЬТУРЫ КАЛЛУСНОЙ ТКАНИ ТАБАКА И ПЕРЕХОДЕ К ГОРМОНОНЕЗАВИСИМОСТИ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "ИЗМЕНЕНИЕ ГОРМОНАЛЬНОГО СТАТУСА КЛЕТОК ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ ПАССИРОВАНИИ КУЛЬТУРЫ КАЛЛУСНОЙ ТКАНИ ТАБАКА И ПЕРЕХОДЕ К ГОРМОНОНЕЗАВИСИМОСТИ"

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

- На правах рукописи.

ХАМАНГОДА Тусит Джанака Приякелум

УДК 633.71 :581.143.6

ИЗМЕНЕНИЕ ГОРМОНАЛЬНОГО СТАТУСА КЛЕТОК ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ ПАССИРОВАНИИ КУЛЬТУРЫ КАЛЛУСНОИ ТКАНИ ТАБАКА И ПЕРЕХОДЕ К ГОРМОНОНЕЗАВИСИМОСТИ

Специальность 03.00.23 — Биотехнология /

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1994

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии Московской сельскохозяйственной академии имени К А Тимирязева

Научный руководитель — доктор биологических наук, академик РАСХН В. С. Шевелуха.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук, профессор Н. И. Якушкина, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник В. А. Высоцкий.

Ведущее учреждение — Институт физиологии растений Российской Академии Наук

Защита состоится «р » июня 1994 г в часов на

заседании специализированного ученого совета Д 120 35 07 в Московской сельскохозяиствг ной академии им К А. Тимирязева.

.1Д{м~о: 127550, г. Мое1 Тимирязевская, 49, сектор

защиты диссертаций

С дисс шией мо ьомиться в Центральной биб-

лиотеке МО '

Авторе - _ .,ан-« » _ 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета —

кандидат биологических наук

А. С. Лосева

Актуальность т облегли. Обнаруженное более 50 лет назад Готре явление,; выражающееся в, приобретении клетками ..некоторых- пере- . садочных- кудътур,: способности расти на среде: без гормонов .которое «б^учило название "привыкания"',до настоящего Бремени привлекает фимани9 исследоЕатолеа;однакч механизм его Есё: ещё окончательно не выяснен. Гориононозаваоимос.ть< мо;кет; проявляться- до отношению к ауксинам или Ьитокининам,• а:также по отношению к обоим этим гормонам,- • -.;-.. 3 г. :■>■-,: " ; .. : . : •

ВозникцоЕение гормональной, автономии. цриЕлекаег; внимание, в силу нескольких ОбСТОЯТОЛЬСТЕ.Пре.-адегЕСеГО "прИЕШ1ЩИе"клетки, несмотря на некоторые различия,имеют Сходство с опухолевыми,■ клетками■:корончатых' галлов и других, растительных опухолей.чгр; позволяет использовать их,сравнительное изучение для выяснения : механизмов;различных типов, гормононезавиоимости, а также способствует ВиЯСШ9НИЮиробЛЭ!ЛЫ.опухолевого роста;, ■. . . :»: .,

• Для биотехнологии,изучение ^Еления "привыкания"прадс|арляет интерес Е связи с тем,;что;возникновение:гормональной автономии •и клеточная- селекция чашетЕсет. совпадают .по Еремени.Для. кле -'. ТОЧНОЦ селекиии; ИСПОЛЬЗУЮТ В ОСНОВНОМ: ДЛИТвЛЬНО, КуЛЬТИЕИруеМые

клеточныетканевые пересадочане.^кудьтурн;. многие ¡из. которых, -- в .этих условиях\магут нерехс*.ци!гь: К' автономному -росту- на -беэгор-. мональних цитательных средах...Поэтому при клеточной .сеиокршг ■

■ нельзя на-учитывать способности длительно пассируемых- культур к "прИЕЫКаННЮ". . > ( л: , ;,

-. С »фактической точки.-з^ния-изучение "приЕЫкания"необхо5И-. ыо, чтооц знать цоследстрия э?ого лвленшг для ^лчток,- а также . •1 ди;прогнозирования■ способности; переходаклеточных и тканевых * культур к^тормононсзаЕисцмому:,"привыкшему^состоянию. В ЭТОЙ , ' связи изучение явления "привыкания" приобретает вакное значение ■для-успешной разработки.биотехнологических методов селекции ра-

■ СТеНИ]Ь -. • - , .','.-. Л,- '.

ЫЖаШу

Пели в задачи исгледорания

Целями раооти било получение дополнительних данных о геханизме "приЕикания" ни основе Изучения динамики содер ^ния эндогенных горюнов к процесса пе,входа каллу~нои ткани табака к гормоно-незаЕисимогти, а так г.е опенка роли апдогенних го;монов и клеточной децИфц.реНШфОЕКИ Е РОаНИКНОЕбНИИ гормональной автономии, «лл достижение этих иелеи ошш поставлены следующие задачи:

1) получить гормоноиеааЕиси-'ую ткань тайака,

2) оиредечить дина. ику о„е, ашш эндогеннпх гормонов (ПУК и ^сатина) е провесов перехода каллуснсй ткани табака к го{* ононе швисшюсти,

3) для сравнения пронести определение динамики содержания эндоге шшх гормонор к длительно культивируемой кадлугной ткини огурца, не >ер«ход1щеи за период исследования к гог^ононе¿авиоимости,

4) для выяснения счаиготеяпи мезду состоянием клеточной диф^ерениирОЕКИ и г^риочальннм статусом клеток определить динамику содер,ания эндогенных гор'оноЕ I и пе, е-ходе каллу^ной ткани табака и огураа ко ЕторичноН диф-4^реииироЕке и морфогенезу.

• II учная новтна

ВшрЕье проеча1! ена дяналка содерлашп 'ндогогшых гормонов (ПУК и зеатина) в процессе перехода лисгоеого каллуса таДака к гормон он е а эеи сизому росту, а так е проведено сравнительное определение дина'шки с одер на ни-1 гормонов е сеглдольном каллусе огурца, на иереходящем за период иследоваякл к гО|ИОналыюй ые-# тономии. Показано, что при переходе клеток эк?пл< нта к дедиффо-рениироЕКе и каллусоооразованию происходит резкое они*ен*ш совещания эндогенных гормонов, оссюенно 11УК, после чего начина-

ется постеленное увеличение их количества, однако б каллусе табака к моменту* "иривыкания"оно не достигает исходного урошя е экспланте.,Несмотря на то, что е каллусе огурца примерно за тот же период содержание эндогенных гормонов^ превысило исходный уросень.он 'не переходил, к гормононезависимому росту и требова-д присутствия экзогейных гормонов е питательной среде. Таким образом, получены убедительные доказательства того, что переход к "привыканию1^ сЁязан не о,увеличением количества эндогенных гормонов, а со снижением чувствительности клеток к эндогенным гормонам; которое,.как предполагается, является результате»» нарастания э процессе длительного культивирования клеточной дедифференснроЕки. .. ■

■. Проведены , также определения динамики * содержания эндогенных гордонов 1фи переходе иаллусньсс клеток табака и огурпа к морфогенезу. Показано, что на начальных этапах перехода к'морфогене-зу, в основе которого':лежит Еторичная дифференпироЕка так же; как и'при деди|>ференпироЕкё; наблвдается снижение уровня гормонов е клетках; что связывается с использованием их в процессах синтеза нуклеиновых кислот и белка,происходящих при клеточной перестройке, . ...

Пракуическач значимость; . ■..•■.-

Предложен метод прогнозирования способности,каллусноД ткани к "привыканию" на основании резкого .снижения содержания эндогенных ауксиноЕ в клетках экспланта при переходе к каллусообразо-ванию. - ■

Рекомендовано учитывать способность к "привыканию" при клеточной' ее лекпии.

Предложено использовать снижение содержанпя;эндогенных гормонов при переносе каллусноп ткани на питательную среду для регенерации кок показатель начала морцогонвза," ..=

Лпгод.ЧШ1.1 гяботы. .Материалы диссертации доложены на:

1) второй 'кон]:эренииимРагулятори роста' и развитиярас».ещ:11". . .

; в мсхя-;в 1993г., ,7 .■/■• ... ^ ■ ' Л Л У '...-/ ЛХ/

2) заседании кафедры сельскохозяйственной, биотехнология №ХА.' '■

Публикации.' По. матери а лам диссерташш опубликована I работа и I работа принята к печати.. ' .. . { : •. V .

Обгём и. структура диссертшши'.' ;.. .. : ' ' •. • ' У".'".;;'

Диссертапионная.работа' состоит иэ^Еведонкя,обзора, литературы,-. ■; ; . экспериментальной .части., ,'включаюдей методический:раздел,рв:■;'• •-. зультати и.обсуждение, заключения в выводов. Материалы диссер-'.' тгции изложены на 115-и страницах-текста,: содеркат'13 таблиц и II рисунков. Библиография Еклтает; 146 источников отечествен— ' ной. и зарубежной литературы.,; ' V у-л' :•'*■'

Оглекти » методы иссдедовзстяЛ -'••'('':•' V--

ОсЗъекта'/щ исследования являлся листовой каллус ■ табака - сорта • ■■ V Висконсин 38 и. семядольный каллус огурда сорта Эстафета 17. Для получения каллуса табака использовали фрагменты из оснований • молодых листьев: I-месячных растений,еы'ращенных в сосудах с поч-. еой в комнатной, тошшпа.' Каллу сную ткань табака получали на 2-х питательных средах: среде-.А, .' состоящей;, из шнералышх солей и витаминов по Мурасигё в Скугу СМ-С) + 2 мг/л ПУК а 0,2 мг/л . у-кинетинай среде Б, которая отличалась;тем,что.вместо МУК.в ■ . её состав входила 2,4-Д в -том же"количестве.

.' Каллус огурца получали'из семядольных эксилантов. стерильных: проросткой,.вырзц;енных уГН Vii.ro; Для получения каллуса: использовали питательную сре,щг М-С с добавлением Iмг/л.ПУК и 1мг/л ■ '•■ кинетина. : ' •• .••<"> - ■ ■' . ; л

Каллусную ткань ежемесячно пассировали на свежие питательные среды того жз состава» Другую часть каллуса пересаживали на безгормональную питательную среду М-С для выявления способности ; каялуса к автономному росту»

Ежемесячно проводили шмунофермектныа анализ эндогенных гормонов в каллуснойткани табака и огурца.

Выделение . очистку гормонов и иммуноферментный анализ про- , вошли по методике Кудояровой /1990/.

Опыты проводили в 10-и биологических и 4-х аналитических повторное ТЯХ.

Статистическая обработка. ; Результаты .анализов представлены в виде средних ар яфетических величин-и средне—квадратичных ошибок этих величин /Доспехов.1985/

; Изменение содержания ауксинов в каллуснай ткани табака в . , пропеппа перехода-к гормояонезависимости.

. ; Переход."листового каллуса табака,к гормононезависимому росту : наблпдался:через 7;месяцев-культивирования на среде Б /с 2.4-П/ * и через 9. месяцев на среду, А /с ИУК/. С этого времени каллусная ткань приобретала способность расти на безгормональной питательной среде М-С-т.е.: становилась автономной но .отношению к ауксинам и цитокининам. • , ; : - • / ^ Определения количестваИУКвкдетках. проведенные через ые: сяц после помещения эксилантов на*питательные среды для каллус о-. образования, показали резкое /в 47 раз на среде А и в16 раз па среде Б/ 'падение содержания гормона по оравнемпо с исходным уров— нем в экспланте./табл.1,рис.1/» ' V * - "* "

Таллина I

Динамика содор-.ашш ондогенной ИУК ис и длительном культивировании дыстоеого каллуса таоаьа и перехода к горгононе а^ислюсти

( нг/г сырого веса )

Вири-нты Время культивирования каллуса (е па с.)

экс- пер-плант енч-нкй кал_лус

среда А 2828,61 эЬ 79 88,27 1^7 74 19э 07 226,03 250 61 207 4 1 334 И 376,!6 125,03 -3.43 ±4.11 1021^11,12 -9,13 -Ь,ь2 ^13,12 ±10.12x14,13

среда Б 2828,61 172.70 224 02 269,47 317,42 346,73 4з7 »7 592,93 ±25,03 ±10,25 ±14,23 ±15.12 ±16,15 хИ.12 ±10.19 ±13,15

Полученные данные свидетельствуют о том, что процесс превращения клеток экспланта е каллуснш, связанный с их дедифферениировкой и переходом к пролиферации является существенны?.! переломным этапом е аизни клеток и требует затраты большого количества ауксинов.После этого критического периода клетки, поЕИднмому,начинает синтезировать собственные ауксины и уге на 2-й месяп культивирования их количество начинало увеличиваться. В дальнейшем наблюдалось постепенное возрастание содержания эндогенной ИУК и к моменту перехода каллусной ткани в "привыкиев" гормононезависимое состояние количество эндогенного ауксина увеличивалось в несколько раз, однако не достигало исходного уровня в экспланте. "ПриЕыкание"наступшю •^и содержании ИУК в каллусе на среде А примерно в 7, а на среде Б в 4,5 раза йолее- низком,чем в клетках экспланта, тем не менее клетки ьктивно пролиферирОЕали е отсутствие экзогенных горюнов.В то же время с одер, лиге ИУК в экспланте чвллется недостаточным для

Время культивирования каллус» . (в месяцах), '

Рис.1. Динамика содержания ^эндогенного. ауксина 8 каллусных . тканях табака ори длительном культивировании на среде А { с И УК ) и на срсдс В (с 2,4 - Д )

Время культявярованяя каллуса

■ ■ (в месяцах) ■

Рис.2, Динамика содержания цитокинина в каллусных. тканях табака при. длнтелыю.ч,- культивировании , на среде А ( с ИУК ) и на • среде В ( с 2,4 - Д ) -. .

це чнфференцировки и начала пролиферации. Дедиффсренпировка клеток экспланта и переход к каллусноиу росту присходит только ь присутствии экзогенных ауксинов в питательной среде.

Полученные данные гозволяют полагать, что переход к автономному росту связан со снижением чувствительности клеток к экзогенным гормонам, что в свою очередь может быть результатом нарастания клеточной деди£ференпировки.

Тот факт, что на среде Б. включающей 2,4-Д,снижение содержания ауксина в клетках при переходе к каллусообразованию было значительно менее интенсивным» чем на среде А. включающей ИУД. невидимому» можно объяснить более сильным дедифференцирующим действием 2,4-Я по сравнению с ИУК. Доказательством служит и более быстрый переход каллусной ткани к"привыканию" на среде Б. Ь связи с сильным дедифференцирующим эффектом экзогенного ауксина /2.-1-Д/ для цедифферэнцировки клеток экспланта и каллусообразования на среде Б. вероятно» требуется меньше эндогенных гормонов, поэтому снижение их содержания пр переходе клеток к каллусноиу росту менее значительно» чем на среде А.

Полученные результаты по динамике содержания эндогенного ауксина в процессе перехода нормальной каллусной ткани табака в "привыкшее* гормононезависимое состояние позволяют сяелать 2 основных вывода. Согласно первому из них» ответственней, за возникновение этого состояния несет не увеличение содержания гормонов в клетках» а снижение их чувствительности к экзогенным гормонам. Согласно второму выводу» процесс перехода каллусних клеток к "привыканию" не сопровождается каким-либо скачком, а наступает на фоке постепенных изменений в содержании эндогенной ИУК» Другими словами, не существует выраженного иорога» за которым каллусные клетки переходят в гормононезависимое состояние. Лз полученных данных следует, что наиболее существенным изменением в жизни клетки является дедиффе-ренцировка и переход к каллусноиу росту. Переход же к "привыканию" является результатом дальнейшего развития этого процесса и наиболее логичным его завершением.

• Результаты пашей-роботы могут в известной, степени обвдснить имеющиеся в литературе противоречил,относительно изменений коли-;чбствэ эндогенных ауксинов в каллусных клетках при переходе к "приЕыканию".'В.большинстве работ.проводилось сравнение количества эндогенной, ИУК"е гормононезависишх "привыкших" и нормальных гормонозаЕИСИмых каллусных клетках, но не е клетках эксцланта. При этом одни аЕТоры наблюдали увеличение содержания эндогенного ауксина при "привыкании" (Х.улоша и Готре,1948; Ченг, 1972г.; Мейна и Бикс', 1979),. другие не-обнаружили-каких-либо значительных отличий меэду нормальными.каллусными и "привыкшимп"гормононезаЕИ-симими клетками (Леонова и Гамбург, 1975;Шусдаил,1982;Мг;ри-Франс Кумапс.1982). "•■'"■ ■

Согласно: нашигл данник,содержание эндогенной. 1ЕУК начинает постепенно увеличиваться посла образования первичного каллуса и в ткани:катдого последующего'пассажа:количество ауксина больше, чем в ткани прздццугаого; В этой связи результаты сравнений содержания гормона в " приЕш;шмх" тканях с гормонозависишми каллу сними зависят от того, с тканью какого пассажа проводится сравнение.Напри-мер,- по нашим.данным, количество ИУК в "привыкших" клетках табака возросло по сравнению с первичным каллусом на среде А примерно е 6, на.среде. Б в 3 ;раза^ .а но сравнении с пассажами,непосредственно предшествующими "привыканию" содержание гормона почти не менялось ^ По сравнению но с -эксплантом количество ИУК е "привыкших" клетках во всех'.случаях снижалось. _ : ' -

Динамика: содержания ••'эндогенны* питохининов' в аролессе

, культпЕированиялшллусноа ткани табака и перехода к ■ - ; ГОШОИОЧеяЗЕИСГОЛОСТИ' • ' '" ' •__• ' ' . .

011редеяаш!я"содержсния :эвдогенного зеатина с момента помещения . " зксплантоЕ. на питательные среда:и ь течение всего периода нерехо-да-каллусных тканей .к гормононозависимости'показали,: что наибольшее; его количество- приходится на. клетка экспланта, а.наименьшее . наблюдается через";!;месяц после повешения на питательную,среду.

uri и E тучае ijKC/ноЕ, ііининуч содор ач.ш зє^т.іна отточатся ¡? n~tлипнем камусе осла чого содер -зшіе эчпотыого го *она начало ^гел-іЧі-^атьсі (гаоч.2, рис.2).

Таблл^з 2

Дгнсатма co..ej arm эндогенного іеатана лрл длительно" і^льтпвіі, cE^-iu ■ листового капуса табака и переходе і гор ..олснасаспсн о^ти

( нг/г сьрой гассн )

»

За-іант Bteni культивировали! каллуса (в мес.)

спыта 0 skc- плант I 2 ПерЕИЧ-nuh качпус 3 4 5 6 7 8 9

среда & 238,62 -I O.St 72,14 102 50 »>,30 -И 16 117,00 124,72 142,41 150,28 167,76 183.48 205,83 i 10 41 »9,93 tll,46+i0P0 »9 85 »12 84 tl4 03

среда Б 238,62 ± 10 51 84,00 120,37 i8,31 ±9,32 157,49 187.30 213,25 216.77 231,50 »11,86 »14 02 ±11,06 ±16,05 ±15 (M

Данное по зватину снова показали, что наиболее существенным,цере-лоьінь.і моментом для клетки является переход к каллусообразованию, •прлче • для этого используются не только экзогенные, но и эндогенные гштокшшны. Однако, в отличие от*ИУК, снижение содержания эндогенного зеатина при каляусообразовании оказалось не столь значительным.

После перехода клвток табака к калпусному росту содержание ьитокинина в них начинало постепенно увеличиваться,повидаыоод, за счет их биосинтеза. К моменту возникновения "привыкания" содержание зеатина почти достигало исходного уровня е эксаланте, "' но не превышало его. Поэто-у питоканиноЕая независимость так ге, кс.к и ауксиновая, не может быть объяснена повыоенньм содержанием гормонов в "привыкших" клетках и связана скорее всего со снижением их требовательности к цитокикинам.

-/О—

Различия в уровне эндогенных цмтокининоз на средах А и Б были выражены слабее, чем для ауксинов» однако тенденция к более интенсивному снижению содержания гормонов в клетках при переходе к калл лусному росту на среде А сохранялась и для цитокининов. Полученные данные позволяют предположить, что степень дедиф£еренцнровки клеток оказывает влияние на их прсшитерирующую способность. Результаты работы показывают, что чем сильнее деджЬферецированны клетки, тем меньше цитокининов требуется для их пролиферации, Поэтому на средо Б, обладающей более сильным деди$ферецируюишм действием, клетки затрачивают меньше эндогенных цитокининов для пролиферации и снижение содержания зеатина по сравнению с исходным уровнем выражено у них слабее, чем на среде А,

Изменение содержания зндогвнных гормочоа гои длительном

культивировании семядольного каллуса огурца.

Для выявления особенностей изменений гормонального статуса, характерных тля "привыкших" тканей представляло интерес наряду с определением динамики содержания эндогенных гормонов в процессе перехода к автономному росту псовести подобные определения в длительно культивируемой каллусной ткани, не проявляющей тенденции к "привыканию". В качестве такой ткани мы использовали семядольный каллус огурца сорта Эстафета Т7.

Яшам ива лодиншшз

длительного культивирования кал/усной ткани огурца.

¡ссинов в процессе

Определение количества ИУК в пересадочной культуре семядольного каллуса огурца проводили в течение 12-и месяцев.

Результаты анализов показали, что динамика содержания эндогенных ауксинов в течение длительного культивирования каллусной ткани огурца в целом имеет тот ке характер, что и у каллусной ткани табак&, переходящей к "привыканию": при образовании каллуса наблюдается снижение содержания ауксина, а затем его количество начинает постепенно увеличиваться /табл.3.рис.3/.

Таблица З

Динамика содержания МУК в каллусной ткани огурца . при длительном культиЕироЕанли

( Е нг/г сырого Беса) ,

Время культивирования Содержание ЮК а

каллуса (в мео.) __(в ■ нг/г сырого-веса)-

0 - эксплант. 3610,17^25,14

1 - первичный каллус 780,24-10,58

2 ' 1083,56^15,12

3 ■ 1287,93^14,13 ...

4 . . 1773,75-12,18 . ■ •

5 2002,14-19,25

6 2730,42^20,18 ' Ч ,

7 ' ' 3029,13^21,24 . ''

8 ; 3414,94 ±20,18 .' ■' ■

9 .* 4142,21±26Д2 .

10 . 4589,1в±28,14

11 , :' 4802,56±27.11 ' -

12 5020,40^20,18

ПоЕидимому, такой.характер изменений является общей закономерно-■ стью для культивируемых тканей, независимо от ихспособности к; "привыканию". Однако имеются и существенные различия между изменениями гормонального статуса; происходящими при культивирования' каллусной ткани табака и огурца. ..... >.

Во-порных, при переходе к каллусноиу типу роста содержание ИУК' '. е клетках'огурца снизилось,только е 4.5 раза,.тогда как в клетках, табока - в 47 раз на среде А. и е 16 раз на среде Б. Таким образом, оказалось, что клетки, не склонные к "привыканию". затрачивают... : на дедифференцироЕку в переход к каллусноиу росту значительно ., - - . ' меньше эндогенного ауксина, чем клетки, переходящие;Е процессе.',' ... культивирования к "привыканию".Скорее Есего:это связано с мень- ■. шей степенью дедифференцироЕанности клеток каллуса огурца;,.что,,. возможно и является причиной их неспособности ¡переходить к ґорло-^

«сек

5000

нг/г <»«« сырой 3000 м*ссы 2900 100«

| -,-,-,-,-,-,

О 2 4 ft 1« 12

Время культнвироыния мляус» ( в месявах)

Рис 3. Динамика содержания эндогенного ауксина а халлусных тканях огурца при длительном культивировании.

1200 1000 вг/г »0® сырой t00

Ы4ССЫ 4Qa 200 0

0 2 4 ( S 10 12

Время кулынвнроыння каллус«. ( в месяцах)

Рнс.4. Динамика содержания эндогенного Ьеатина в каллусных тканях огурца при длительном культивировании.

нонезавасимостя. На основании различий в трате эндогенного ауксина при переходе клеток экспланта ккаллусному росту можно, повидимому, прогнозировать способность культивируемых.клегок и тканей к?при- ' рыканию". • Л.. Л •'."/■ ' — . . :■ '.,- ,.■

Во-вторых, несмотря на возрастание в процессе культивирования со-:' держания ИУК в каллусе табака,\ к моменту "прйвыкания?она намного^---не достигало и сходного , уроЕНЯ в . экслланте." В каллусе огурца к ■ ' 9-му мосяиу количество, гормона уже.превышало исходный уровень, • продолжая увеличиваться при дальнейшем культивировании.* Таким образом,' клетки,; не склонные к "привыканию" не только синтезировали собственный ауксин^- но делали это более интенсивно< чем лерехо-' дящио к "привыканию".' Эти результаты достаточно убедительно1 под-у тверждают сделанный ранее'вывод о том, что не повышенное количест-, во эндогенного ауксина несет ответственность за переход клеток к -•,' гормононезависимому'.росту."'О - - ."',' • При образовании первичного, каллуса огурца /содержание зеатина сни-' зилось в клетках по сравнению с исходным уровнем в 3,5 раза,' т.е. примерно так же как и: при образовании каллусной ткани табака (табл.4," рис.4)»" Основные' различия'между; этими .типами квллусных : клеток связаны, с~ изменением., содержания эндогенной' ИУК* и," следова- ; 7 тельно, глубина, клеточной дедифференцировки,' индуцируемой ауксина-! , МИ, определяет СКЛОННОСТЬ КлеТОК К,пПр2К1Жа1ШЮ". . , *

' ' : * . .•■'.-"• ; . Таблица 4

■Изменение содержания зеатина в каллусной ткани огуриапри- /.

длительном культивирований .(' в цг/г сырого веса);" /;.:;

Время культивирования; каллуса (в мес.X Содержание зеатина -

. . • . (в нг/г сырого Евса)

' . О - эксплант . V. ': ■ - л,- ; 857,71 £ 10,11 '

• I - первичный каллус - ^ ' 244,81 ± 9,81

2 - 317,87 ± 9,88

3 394,89 ± 8,11 " ,

4 477,20 ± 9,89

5 . 515,35 ± 10,16

6 . ' 607,30 * 9,86

-н-

Продолжение таблицы 1

Время КулЬТИЕИрОЕ 1НИЯ каллуса ( е мес.) Содер^н/е асаплп (в лг/г слрого Еес)

7 679, ^¿10,15

8 756,20^11,9

9 831,17£

10 897,241 в,34

II 975,691 7,5Ь

12 1028,50-10,1

После образования каллуса содержание зеагина в клетках кал!уснод ткани огурца начинало увеличиваться и к концу 9 "ее ша культивирования превышало исходный уровень гормона в экспланте. В то -а время в каллусе табака содержание зэатиьа аа этот гериод лиль приблихсалооь к исходному уровню, но не ¡гревышало его. Вместо с тем каллусная ткань огурца не проявляла способности к ро^ту на безгормональной питательной среде, а каллусна! ткань габака,несмотря на более низкое содержание цитокинина,такой "Шоол'остью обладала. Это еще раз указывает на отсутствие лряиой евии • «ч^у количеством эндогенного гормона и "привыканием".

Изучение динамики содержания ИУК и зеатина е сеш^очьном каллусе огурца при его длительном культивировании помогло уточ-

нить и подтвердить еыеоды, сделанные динамики содержания эндогенных горло "привыканию" каллусной ткани табака.

на основании о неделания юв в процессе шреходз к

Изменение содержания эндогенных Гормонов в лро^ессе леуехода каллуеннх клеток тлоака к мо^гогене IV_

Наряду с определением изменения гормонального статуса каллугннх илеток лри длительном культивировании и переходе к "прйЕьканлю", связанному .Еероятно, с нарастанием клеточной цедифференпирои'и, лредставляло интерес проследить динамику содержания андогешшх го1ыоноЕ гри обратном процессе: превращении каллусних плеток I

-Л5"-

нормальные, лежащем в осноеэ морфогенеза. Мы хотели выяснить ' изменения, которые происходят в кадлусных клетках в начальный период действия на них стимула морфогенеза до появления перЕых' внешних признаков регенерации. Такие СЕедения, как мы полагали,'. могли бы быть использованы и дляп;югнозиро£ания"способности-тех или иных каллусных тканей к морфогенезу. , .

Для индукции морфогенеза каллусную ткань табака через 8 месяцев культиЕйровали на среде А, переносила в чашки Петри на среду М-С с добавлением 2 мг/л кинетика. Через 18 дней на по- • верхности каллуса появлялись зелёные меристематическве участки. -

■ Определение содержания эндогенных гормонов проводили • перед перенесением каллусной ткани на среду для регенерации и ■ через каждые•3 дня е течение 18 дней, К этому времени на поверхности каллусной ткани появлялись отчётливо видимые.зелёные1 мери-стоматические участки, т.е.наблюдалось начало.регенерации.,

Можно было ожидать увеличения синтеза гормонов клетк2гли , ; образующихся меристематических очагов и соответственно возрастания количества эндогенных гормонов в процессе перехода каллусной /. ткани к морфогенезу; Однако измерения, проведенные е течение скрытого периода морфогенеза показали; что содержание эндогенных . гормонов е этот период последовательно снижается (табл;5) л; • За 10 дней.количество эндогенной ИУК снизилось примерно в 6 раз.'

. " '• Таблиса.5 . ;'Д.'.

Динамика содержания гормонов в каллусной ткани . • табака при переходе к моррогёнезу: { 'нг/г сырой массы)

Гормоны Время культ 'ивирОЕания»каллуса' на среде для - регенерации, ( в да.) ■ .'-.> '

. 0 з 6 ' 9 -12 ' 15 • ':

ИУК 490,35 : 436,82 110,18 ± 9,75 366,80 309,57 261,23 162,94. ' £ 7,78 ± 8,54 • ¿6,38'^ 9;1Г 72,69 :•• •."¿4,56;./.

зеатин 188,71 168,90 +10,50 +11,87; 162,18 138,98 106,68 43,69 ,+12,86 + 9,12 Г-+9, +7ДГ * 37,84 ■; +5дз.;'•'V

Трата-эндогенных гормонов при переходе каллусних клоток к морфогенезу^ невидимому , связана с образованием специфических белков. Работами Бутенко, Володарского и Моисеевой (1975), показано,что .морфогенез в культуре каллусной ткани табака характеризуется включением.и-выключением синтеза": определенных белков-маркёров. Клетки ме^истем^тических.очагов отличаются интенсивным синтезом ,

исс и як.' : . ; .'-Л"; "'/"

.-Переход к наллусног.!у типу роста'также срязан с "усилением синтеза ■ РШ я появлением белков,спешфичных для делящихся каллусных кле-'' ток • (бутенко, 1987). • •. '. ' • • .' ■'.'':•""■'■■' ■

Как е том; так;и в другом случае усиленный синтез макромолекул • • необходим для1интенсивной пролиферации клеток. В этой связи становится объяснимым снижение содержания-эндогенной.ИУК при переходе каллусних клеток к морфогенезу, которые в виде гор»лонореиептор-ных Ко!^1лексоЕмогут затрачиваться на синтез РНК ;и новых белкоЕ.

:0ет:сошвш)я'в>'том|'..что''цвр11стематачдсквв очаги, дающие начало стеблеЕым апексам, е дальнейшем становятся местами актаЁ-. ного синтеза гормонов, происходящем на более позднем этапе, но 5 этому'; предшествует снижение содержания ауксина в' перестраивавщих-ся клетках. . . . . .'•; : • _ • -• " . - . .. ;,■'.•

V -За";18'..дав4'куяьмварования' »"моменту, появления визуально '.'■. ; .¡различных признаков регенерации количество зеатина в каллусных . клетках■ табакаг снизилось примерно в 6 раз,т.е.в равной степени'

г. клетки ¿возЕрашашиеся на значительно больше пвтоки—'■ грисутстгупдих в питательной

Высокий уроЕень.расходования цитокининов при. переходе каллусных клеток к морфогенезу, связан с. интенсивным использованием их в .- процессах^йролафераоди; •'

. с ауксинамиОднако ё целом каллу'сны : нормальный путь развития,затрачивгдаг нинов с учетом /экзогенных гормонов,л . среде для регенерации.;: --.' ... л • :-.;, '- '

Изменение содержания эндогенных гормонов . ' ПРИ переходе каллусных клеток огуша к мотхГюгекезу.' -

Представляло интерес сравнить динамику содержания эндогенных гормонов при переходе к морфогенезу каллусной ткани,способной.' к."привиканню", с измененилш. при переходе к морфргенэзу е'каллусной ткани, не проявляющей тенденции к;"привыканию".С этой целью бил .. индуцирован морфогенез в каллусной ткани огурца. Для этого-семя-; дольный каллус переносили на питательную среду М-С с добавлением'

2 мг/л кянетлна. Через 3 недели на поверхности каллусной ткани появлялись зелёные меристематические • зоны; ' .', . . , >ч:: •. - ' - «•': ; Измерения содержания эндогенного зеатина проводили через каздые

3 дня в течение 3-х недель* Результаты измерений представлены в' " табл.6. л •'...■"'■ ; 'V-'»'\

'•:" г •".'■.•-■* ' '■ Таблица 6 .

Динамика содеряания гормонов в каллусной ткани.. . огурца'при переходе к морфогенезу (Ё нг/г сырого Ееса) '

Гормоны ""* 0 '3 ""б-'* 9 . 12 ".15" "їв ; • " 2І ." :

' эксплант

ИУК 1297,90 1162,19 1061,69 964,93 836,44 492.99 403,17 : 385,13

±25,03 ±15,18; ±12,88 ±9.69 ±8,79 ±9,44 _±3,8б_ '. .±3,1?-.

зеатин. і358,76 Тб97;І9" 887,45 706,10 523,68 372,98 . 309,88 255,80"

±12,89 ±10,98 ±8,13 ±9.85 ±7,63 ±4.56 ±4,89 . ±4,12 .

-- - - ,.- ' - -

Так же, как и в каллусетабака, индукция морфогенеза вызывала в каллусной ткани огурца последовательное' снижение количества .' .-' Ч эндогенных гормонов! За 21 содержание ИУК снизилось в каллусе : огуриа в 3,3 раза, тогда как у габака;за 18 даей - в 6 раз.Следовательно, на перестройку более глубоко дедифферешшроввнных клеток, способных к "привыканию"затрачивается 'и большее количество ауксина. ■■ ^

Содержание зеатина в течение скрытого периода морфогенеза в каллус е огурца снизилось е 5.5 раза.

Таким образом, при переходе к морфогенезу каллусная ткань огурца, не проявляющая тенденции к "цривыканшо"' расходовала меньшее количество эндогенных гормонов, чем "привикаючая" каллусная ткань табака, прчем наибольшие различия наблюдались в отношении ауксина. Снижение содержания гормрнов и .прежде всего, ауксина в коглусной ткани, помещенной на среду для регенерации, может служить показателем перехода клеток к морфогенезу и использоваться для определения морфогенной способности каллуса,

выводы.

Т."Привыкание" к ауксинам и цитокииинак наступает в пересадочной культуре листового каллуса табака Висконсин 38 через 7 месяцев ку льтивирования на среде М-С, содержащей 2.4-Л и через 9месяцев культивирования на среде М-С, содержащей ИУК.

2. Содержание эндогенных гормонов к зеатина/ резко снижается при переходе экспланта к каллусному росту, после чего начинает постоянно увеличиваться , однако к моменту "привыкаяия"клеток не достигает исходного уровня в экспяантв.

3. Способность калдусной ткани табака рвет« на безгормональной

питательной среде при уровне эндогенных гормонов в несколько раз более низком по сравнению с акедпантом свидетельствует о том, что ответственность за "привыкшие™ несет не увеличение синтеза эндогенных гормонов,, а снижение чувствительности клеток к экзогенным гормонам.

4. Наиболее значительные изменения в клетках » связанные с гормональным статусом, происходят при их децифференцировке и превращении в каллусные.

Переход же каллусных клеток к "привыкании" является постепенным нарастанием этого процесса и наиболее: логичным его завершением.

5. Динамика содержания гормонов в каляусе огурца» не переходящем ■ за период исследования к гормононейависидасти. носит тот. же характер» что и в переходящем к "привыканию" каллусе,табака»

но изменения гормонального статуса по сравнению с эксплантом выражены в каллусе огурца слабее., . . ..

6. На основании различий в трате эндогенных гормонов и» .особенно . ауксинов при перехода эксвданта к каллурообразованию можно прогнозировать способность (Культивируемых тканей к "привыканию"

7. При перехоле каллусной тесани табакаи огурца-к.морфогенезу¡ на......

первом этапе до появления внешних прзнаков'г регенерации / про-исхояит постепенно« снижение содержания:эндогенных гормонов; что. вероятно» связано с усиленным синтезом РНК и белка» происходатем

, при перестроЛср^иаллусных клеток».. - ч.; " " . .. . г

8. Снижение содервавю эндогенных гормонов при перенесении, каллус-. ной ткани на ореду. для- регенерации можно использовать для прогнозирования перехода к морфогенезу. -и

Работы» опубликованные по .теме диссертации:

Т. Хамангода ТЛ.П» л Динамика содержания эндогенных цитокининов -и ауксинов в каллусной ткани табака при длительном пассировании И переходе К автономному росту. , ; ; . .

Тезисы докладов второй конференции "Регуляторы роста ж развития растений*.. Москва» 1993» .

Объем 1У4 п л

Тираж 100

Заказ 676

Типография Московской с -х академии им К А Тимирязева 127550, Москва И 550 Тимирязевская ул, 44