Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменение гормонального статуса клеток при длительном пассировании культуры каллусной ткани табака и переходе к гормононезависимости

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Изменение гормонального статуса клеток при длительном пассировании культуры каллусной ткани табака и переходе к гормононезависимости"

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

£ р д На правах рукописи

. , .. ХАМАНГОДА Тусит Джанака Приякелум

УДК 633.71 : 581.143.6

ИЗМЕНЕНИЕ ГОРМОНАЛЬНОГО СТАТУСА КЛЕТОК ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ ПАССИРОВАНИИ

КУЛЬТУРЫ КАЛЛУСНОЙ ТКАНИ ТАБАКА И ПЕРЕХОДЕ К ГОРМОНОНЕЗАВИСИМОСТИ

Специальность 03.00.23 — Биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1994

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной био технологии Московской сельскохозяйственной академии име ни К. А. Тимирязева.

Научный руководитель — доктор биологических наук академик РАСХН В. С. Шевелуха.

Официальные оппоненты — доктор биологических, наук профессор Н. И. Якушкина, кандидат биологических наук старший научный сотрудник В. А. Высоцкий.

Ведущее учреждение — Институт физиологии растений Российской Академии Наук.

Защита состоится « 9 » июня 1994 г. в « часов ш

заседании специализированного ученого совета Д. 120.35.07 I Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тими рязева.

Адрес: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 49, секто[ защиты диссертаций.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной бнб лиотеке МСХА.

Автореферат разослан <АШЛ_ 1994 г

Ученый секретарь специализированного совг~~

кандидат биологических

Лосев*

Актуальность пгоблеми. Обнаруженное боне о 50 лет fin зад Готре явление, выражающееся е приобретении клетками некоторых пересадочных культур способности расти на среде без гормонов,которое получило название "привыкания", до настоящего времени привлекает Ашоиие исоледоватолей,однако механизм его есУ ещё окончательно но еняснон. ГормононозаЕИСимость может проявляться • по отношению к ауксинам или иитокшшнам,' а также по отношению к обоим этим гормонам.

Возникновение гормональной автономии привлекает внимание в силу нескольких обстоятельств.Преяце Есего "привш(аше"клотки, несмотря на некоторые различия .имеют Сходство с опухолевыми клетками корончатых' галлов и других растительных o:iyхолей,что позволяет использовать их сравнительное изучение для выяснения механизмов различных типов гормононезависимости, а также способствует выяснению проблемы опухолевого роста.

Для" биотехнологии изучение явления "привикания"представляот интерес е се^гзи с тем, что возникновение гормональной автономии и клеточная селекшш чаще всего совладают по времени.Для кле -. точной селекпии используют е осноеном длительно культивируемые клеточные и тканевые пересадочнно культуры, многие из которых е -этих услоеилх .могут переходить к автономному росту на безгормональных питательных средах. Поэтому при клеточной селекшш нельзя не учитывать способности длительно пассируемых культур к "привыканию". .

С практической точки зрения изучение "привыкания"необхоци-ыо, чтобы знать последствия этого явления для клеток, а также для. прогнозирования способности перехода клеточных и тканевых культур к гормононезависиглому "привыкшему"состоянию. В этой ,связи изучение явления "привыкания" приобретает важное значение для успешной разработки биотехнелогических методов селекпии растений.' ...

Цели » задачи исслодованил

Полями работы' било получение дополнительных данных о механизме "привыкания" на остове изучения динамики содержания эндогенних гормонов в процессе перехода каллусной ткани табака к гормоно-' независимости, а так;,ш оценка роли эндогенних гормонов и клеточной де дифферент! ровки в возникновении гормональной автономии. Для достижония этих целой били поставлены следующие задачи:

. I) получить гормононозавйсимую ткань табака, ■2) опродолить динамику содержания эндогенних гормонов (ИУК и зеатина) в процессе перехода каллусной ткани табака я гормононезависимостй, • '

3) для сравнения провести определение динамики содержания эндогенных гормонов в длительно культивируемой каллусной ткани огурпа, но переходящей за период исследования к гогаононезависимости, . . /

4) для выяснения взаимосвязи меящу состоянием клеточной диф^ерошшровки и гормональным статусом клеток определить динамику содержания эндогенных гормонов .при пере- ' ходе каллусной ткани табака и огурца ко Еторичной диф-ферениироьке и морфогенозу. ' !

1 Научная новизна .

Впервые прослежена динамика содержания эндогенных гормонов (ИУК и зеатина) е нроыессо перехода листового каллуса-табака к ; горыононезависимому росту, а так:;;е проведено сравнительное определение динамики содержания гормонов е. семядольном каллусе огурца, но переходящем за период исследования к ищдональной ав-< тоноши. Показано, что при переходе клеток экдпланта к дедиффе-рениировке и калдусообразоЕашш происходит резкое снижение содержания эндогенных гормонов, особенно ИУК, поело чего начина-

ется постепенное увеличение их количества, однако е каллусе табака к моменту' "иривыкания"оно не достигает исходного уровня в экспланте. Несмотря на то, что в каллусе огуриа примерно за тот же период содержание эндогенных гормонов ripe 2 не и ло исходный уровень, он не перехода л к гормононезанисимому росту и гребова-л присутствия экзогенных гормонов в питательной среде. Таким образом, получены убедительные доказательства того, что переход к "прйвикапию" осязан не о увеличением количества эндогенных гормонов, а со снижением чувствительности клеток к эндогенным гормонам, которое, как' предполагается, яйллотся результатом нарастания в процессе'длительного культивирования клеточкой дедифференшЬоЕки.

Проведена тактл определения динамики содержания эндогенных гормоков' при переходе каллусных клеток табака'и огуриа к морфогенезу. Показано, 'что на начальных этапах перехода к морфогенезу, в основе которого' дожит вторична! ди^Ференнировка так же, каК и при дёдиаферениировке, наблюдается снижение'уровня гормонов в клетках, что связьшЬётся с использованием их е процессах синтеза нуКлейноЕЫх кислот й белка.происходящих ари клеточной перестройке.

Практическая значимость.

Предложен метод'прогнозирования способности каллусноп ткани к "привыканию" на осноеэшш резкого стпения содержания эндогенных ауксинов е клотках экспланта при переходе к каллусообразо-Еанию. '

Рекомёндовано учитывать способность к "привыканию" при клеточной селекции.

Предложено использовать снижение содержания эндогенных гормонов при переносе, каллусноп ткани на питательную среду для рёгонэра-. нии как показатель начала морфогенеза.'

Апробация работы. Материалы диссертации доло::;енн на:

1) второй ко!1';1эрвииш1"Рагудятори ¡.оста и развития растений" . в МСХЯ в 19ЭЗ

2) заседании кафедры сельскохозяйственной оиотохнологии ШХА.

Публикации■ Но материалам диссертации опубликована I работа и I работа принята к печати.

Объём и стр.укг.ура диссертации.

Диссертапионнал работа состоит из введения,обзора литературы, экспериментальной части, включающей методический раздел,ре -зультаты и обсуждение, заключения и выводов. Материалы диссертации изложены на 115-и страницах текста, содержат 13 таблиц и II рисунков. Библиография включает 146 источников отечественной и зарубежной литературы. ..... ''..••■••

Объекты и методы исследования. '

Объекта:,'ш исследования являлся листовой каллус табака сорта Висконсин 38 и семядольный каллус огурца сорта Эстафета 17. Для получения каллуса табака использовали фрагменты из оснований молодых листьев I-месячных растений,выращенных в сосудах с почвой в комнатной теплине. Каллусную ткань табака получада на 2-х питательных средах: среде-А, состоящей из минеральных солей и витаминов по Мураеиге и Скугу (М-С) + 2 мг/л ИУК и 0,2 мг/л "• кинетина и среде Б, которая отличалась тем, что вместо ИУК в её состав входила 2,4-Д в том же количестве.

Каллус огурпа получали из семядольных эксалантов стерильных ароросткой, шрзщойних гН чгЬсо. Для получения каллуса, использовали питательную среду М-С с'добавлением I мг/л .ПУК и I ыг/л кинетина. .

' '. ' 'У-М-' л-''.

Каллусную ткань ежемесячно пассировали на свежие питательные среды того *е состава». Другую часть каллуса пересаживали на безгормональную питательную среду М-С доя выявления способности каллуса к автономному росту.

Ежемесячно проводили иммуноферментный анализ эндогенных гормонов в каллусной ткани табака и огурца.

Выделение , очистку гормонов и иммуноферментный анализ проводили по методике Кудояровой /1990/.

Опыты проводили в 10-и биологических и 4-х аналитических повторноетях.

Статистическая обработка.

Результаты анализов представлены в виде средних арифметических величин и средне-квадратичных ошибок этих величин /Доспехов,1985/

г

Результаты а обсуждение.

Изменение содержания ауксинов в каллуенвй тка1Ш табака в процессе перехода к гормононазависимости.

Переход листового каллуса табака к гормононезависимому росту наблюдался через 7 месяцев культивирования на среде Б /с 2,4-Ц/ и через 9 месяцев на среду А /с ПУК/. С этого времени каллусная ткань приобретала способность расти на безгормоналыюй питательной среде М-С ,• т.е. становилась автономной по отношению к ауксинам и цитокининам.

Определения количества ИУК в клетках, проведенные через месяц после помещения экс плантов на"питательные среды лая каллус о-образоваяия, показали резкое /в 47 раз на среде А и в1б раз на среде Б/ падение содержания гормона по сравнению с исходным уровнем в экспланте./тзбл.Т,рис.1/., ^ . 1 . -

Таблииа I

Динамика содержания эндогенной ИУК при длительном культивировании листового каллуса табака и переходе к гормононезависимости

( нг/г сырого Ееса ) •

Варианты Время культивирования каллуса (е мес.). опыта

О I экс- пер-плант вич— ный кал' лус

среда Л2828 6] 58 79 88 27 157,79 195,07 226,03 250.61 297,41 .'334,11 376,16 х25,03 х5,43 i4.ll ±10.21 х11,12 -9,13 1.15,62 ±13,12 ±10,12 ±14,13

среда Б 2828,61 172,70 224,02 269,47 317,42 346,73 457.87 592,93

' ±25,03 ±10,25 ±14,23 ±15,12 ±16,15 ±11,12 ±10.19 ±13,15 .

Полученные данные свидетельствуют о том, что процесс превращения клеток экспланта в каллусные, связанный с их дедифферениировкой и'переходом к пролиферации является существенным переломным этапом в кизни клеток и требует затраты большого количества ауксинов.После этого критического периода клетки, поЕидимому,начинают синтезвро- ■. рать собственные ауксины и ул;е на 2-й месяп культивирования их количество начинало увеличиваться. В дальнейшем наблюдалось постепенное возрастание содержания.эндогенной ИУК и к моменту.перехода каллусной ткани в "привыкшее" гормононезаЕисимое состояние количество эндогенного ауксина увеличивалось.е несколько раз, однако не достигало исходного уровня е экспланте. "ПриЕыкание"наступало при содержании ИУК е каллусе на среде А примерно е. 7, а на среде Б е 4,5 раза более- низком,чем в клетках экспланта, тем не менее клет ки активно пролиферироЕали е отсутствие экзогенных гормонов.В то же Ереш содержание ИУК е экспланте является недостаточным для

^3000 '2500 вг/г го»» сырой 1500 МАССЫ 100)

500

—в среде А

-»— в среде Б

2 4 ( В 10 Время культивирования каллуса (в месяцах)

Рис.1. Динамика содержания эндогенного ауксина в каллусных тканях табака при длительном культивировании ва среде А(с IIУК ) и на среде Б ( с 2,4 - Д )

0 -------—-■

0 2.4 i 8 10 Время культивирования каллуса (в месяцах)

Рис.2. Динамика содержания цитокинина в кнллусных тканях табака при длительно.« культивировании на ср<до А ( с ПУК ) и на среде В ( с 2,4 - Д )

-f-

дедг4ференцировки и начала пролиферации. Деднфференцировка клеток экспланта и переход к каллусноиу росту присходит только в присутствии экзогенных ауксинов в питательной среде.

Полученные данные позволяют полагать, что переход к автономному росту связан со снижением чувствительности клеток к экзогенным гормонам» что в свою очередь может быть результатом нарастания клеточной дедифференцировки.

Тот факт, что на среде Б, включающей 2,4-Д,снижение содержания ауксина в клетках при переходе к каллусообразованию было значительно менее интенсивным» чем на среде А, включающей ИУК, поводимому, можно объяснить более сильным дедайербнцирующш действием 2,4-Д по сравнению с ИУК» Доказательством служит и более быстрый переход каллу.сной ткани к"цривыканию" на среде Б. в связи с сильным дедифференцируюсцим эффектом экзогенного ауксина /2,4-Д/ для дедифферэнцировки клеток экспланта и каллу сообразовался на среде Б, вероятно» требуется меньше эндогенных гормонов, поэтому снижение их содержания пр переходе клеток к каллусноиу'росту ые- . нее значительно, чем на среде А.

Полученные результаты по динамике содержания эндогенного ауксина в процессе перехода нормальной каллусной ткани табака в "привыкшее1* гормононезависимое состояние позволяют сделать 2 основных вывода. Согласно первому из них, ответственнсть за возникновение этого состояния несет не увеличение содержания гормонов в клетках, а снижение их чувствительное®« к экзогенным гормонам. Согласно второму выводу» процесс перехода каллусних клеток к "привыканию" не сопровождается каким-либо скачком, а наступает на фоне постепенных изменений в содержании эндогенной ИУК» Другими словами, не существует выраженного порога» за которым каллусные клетки переходят в гормононезависимое состояние. Из полученных данных следует, что наиболее существенным изменением в жизни клетки является дедиффе-ренцировка и переход к каллусному росту. Переход же к "привыканию" является результатом дальнейшего развития этого процесса и наиболее логичным его завершением.

Результаты нашей работы могут в известной степени обменить имеющиеся в литературе противоречил относительно изменений количества эндогенных ауксинов в каллусных клетках при переходе к "привыканию". В оолыаинстЕе работ проводилось сравнение количества эндогенной ИУК в гормононезаЕИсимых "привыкших" и нормальных гормонозависишх каллусных клетках, но ¡ю в клетках экенланта. При этом одни авторы наблюдали увеличение содержания эндогенного ауксина при "привыкании" (Х.улеша и Готре,1948; Чонг, 1972г.; Мойнс и Бикс,1079), другие не обнаружили каких-либо значительных отличий между. нормальными каллу енши и "привыкшиш"гормононепави-симами клетками (Леонова и Гамбург, 1&75;Маусдацл,1382;Мари-Франс Куманс,1982).

Согласно нашим данным,содержание эндогенной ПУК начинает постепенно увеличиваться поело образования первичного каллуса и в ткани каждого последующего пассата количество ауксина больше, чем е ткани предыдущего. В этой связи результаты сравнении содержания гормона в "привнкших"тканях с гормонозависимими каллусними зависят от того, с тканью какого пассата проводится сравнение.Например, по нашим данным, количество ИУК в "привыкших" клетках табака возросло по сравнению с первичным каллусом на среде А примерно в 6, на среде Б в 3 раза, а по сравнению с пассаками,непосредственно предисствундаш "привыканию" оодер.т.ание гормона почти не менялось. По сравнению не с экегтлантш количество ПУК е "привыкших" клетках во всех случаях снижалось.

Динамика содержания эндогенных питокшшное е пронес :е культивирования каллусной ткани табака и перехода к гощоиочезависпиости__________

Определения содержания.эндогенного зеатина с момента помещения эксплантов на питательные среды и в течение Есего периода перехода каллусных тканей к гормоноисзавнсимостп показали, что наибольшее ого количество приходится на клетки экспланта, а наименьшее наблюдаотсл че1.оз I месяц после помещения" на питательную среду.

лак и е случае оуксиноЕ, минимум содержания зеатина отмечался с первичном каллусе после чего содержание эндогенного го. лона начало увеличиваться (табл.2, рис.2).

Таблица 2

Динамика содержания эндогенного зеатина при длительном культиЕирОЕании листового каллуса табака и переходе к • • Г0р:.101юнезаЕИси:.:0сти

( нг/г скрой массы )

*

Вагиант Время культивирования каллуса (е мес.)

опыта 0 зке-плант I 2 3456 7 -8 9 первичный , -каллус •

среда А238,62 -10,51 72,34 102,50 117,90 129,72 142,41 150,28 167,76 183,48 205,83 ±5,30 -11,16 ±10,91 -9,95 ±11,96 ±10,99 -9,85 +12,89 ±14,05

среда Б 238,62 110,51 84,00 120,37 157,49 187.30 213,25 216,77 231,50 ' ±8,31 ±9;32 ±11,86 -14,02 ±11,06 ¿16,05 ±15,04 ; .

Данные по зеатину снова показали, что наиболее существенным.переломным моментом для клетки является переход к каллусообразованию, . •причем для этого используются не только экзогенные, но и эндогенные иитокишшы. Однако, Е отличие от'ИУК, снижение содержания эндогенного зеатина при каллусообразовании оказалось на столь значительным. ' ;

После перехода клеток табака к каллусному росту содержание иитокинина е них начинало постепенно увеличиЕаться.поЕидимоцу, за счет их биосинтеза. К моменту возникновения "привыкания" со. д&ржание зеатина почти достигало исходного уровня е эксаланте, , С но не превышало его. Поэтому питокининоеэя-независимость также, как и ауксиноЕая, не может быть объяснена повышенным .содержанием . гормонов е "приеыкших" клетках к СЕЯзана скорее Есего со снижением их требовательности к цитокининам.

■ . " ' ■ -ю~ ■ ■ "

Различия в урсшне эндогенных цитокининов на средах А и Б били выражены слабее, чем для ауксинов» однако тенденция к более интен-

• сивному снижению содержания гормонов в клетках при переходе к калл лусному росту на среде А сохранялась и для цитокининов. Полученные данные позволяют предположить, что степень децифференцировки клеток оказывает влияние на их прсшиферирующуп способность. Результата работы показывают, что чем сильнее дедифферецированны клетки, тем меньше цитокининов требуется для их пролиферации. Поэтому на среце Б, обладающей белее сильным децифферецируклции действием, клетки затрачивают меньше эндогенных цитокининов для пролиферации и снижение содержания зеатина по сравнению с исходным уровнем выражено у них слабее, чем на среде А.

Изменение содержания аняогвнных гормонов при длительном культивировании семядольного каллуса огурца.

' Для выявления особенностей изменений гормонального статуса, харак-

• терннх доя "привыкших" тканей представляло интерес наряду с определением динамики содержания эндогенных гормонов в процессе перехода к автономному росту провести подобные, определения в длительно культивируемой каллусной ткани, не проявляющей тенденции к "привыканию". В качестве такой ткани мы использовали семядольный каллус огурца сорта Эстафета 17,

Динамика содержания эндогенных

длительного культивирования калл

ауксинов в процессе

усной ткани огурца.

Определение количества ИУК в пересадочной культуре семядольного каллуса огурца проводили в течение 12-и месяцев.

Результаты анализов показали, что динамика содержания эндогенных ауксинов в течение длительного культивирования каллусной ткани огурца в целом имеет тот же характер, что и у каллусной ткани табак£, переходящей к "привыканию": при образовании каллуса наблюдается снижение содержания ауксина, а.затем его количество начинает постепенно увеличиваться /табл.3,рис.3/.

Таблица 3

Динамика содержания ПУК в каллусной ткани огурца при длительном культяыфОЕагаи

( е яг/г сырого Беса)

Время культивирования каллуса (в мес.) Содержание ИУК а (в нг/г сырого Еес.а)

0 - эксплант 3610,17^25,14

I - первичный каллус 788,24^10,98

2 1083,56^15,12

3 1287,93^14,13

4 1773,75^12,18

5 2002,14-19,25

6 2730,42*20,18

7 3029,13*21,24

8 3414,94 ¿20,18

9 4142,21*26,12

10 4589,16*28,14

II 4802.56i27.II

12 5020,40*20,18

Помнимому, такой характер изменений является общей закономерностью для культивируемых тканей, независимо от их способности к "привыканию". Однако имеются и существенные различия между изменениями гормонального статуса, происходящими при культивировании каллусной ткани табака л огурпа.

Во-порвых, при переходе к каллусноиу типу роста содержание ИУК е клетках'017рца снизилось только е 4,5 раза, тогда как в клетках табака - е 47 раз на среде А и е 16 раз на среде Б. Таким образом, оказалось, что клетки, ве склонные к "привыканию" затрачивают: на дедифферешироЕку я переход к каллусноиу росту значительно . . ■ меньше эндогенного ауксина, чем клетки,' переходящие■ в процессе , ■ культивирования к "привыкании".Скорее Есего это связано с мень-' шей степенью дедайеренциронанности клеток'каллуса огурца,, что, возможно и является причиной их неспособности переходить к гормо-

0 2 4 I Г II 12

Время культхввровгняя кджяуи ( в месяшх)

Рис.3. Динамика содержания эндогенного ауксква > халлусиых тканях огурца при длительном культиввроважнж.

0 2 4 ( « II 12

Время культявнромкяя ыжяуп ( в месяцах)

Рис.4. Динамика содержания эндогенного аежгква в каллусных тканях огурца при длительном культившхмалгк.

-КЗ-

нонезависимости. На основании различий е трате эндогенного ауксина при переходе клеток экспланта к каллусному росту можно, невидимому, прогнозировать способность культивируемых клеток и тканей к "?при- • рыканию".

Во-вторых, несмотря на возрастание в процессе культивирования содержания ИУК в каллусе табака, к моменту "иривикания"оно намного не достигало исходного уровня в экспланте. В каллусе огурца к 9-му месяцу количество гормона уже превышало исходный уровонь, продолжая увеличиваться при дальнейшем культивировании. Таким образом, клетки, не склонные к "привыканию" не только синтезировали собственный ауксин, но делали это более интенсивно, чем переходящие к "привыканию". Эти результаты достаточно убедительно подтверждают сделанный ранее еыеод о том, что не повышенное количество эндогенного ауксина несет ответственность за переход клеток к гормононезависимому росту.

При образовании первичного каллуса огуриа содержание зеатина снизилось в клетках по сраЕнению с исходным уровнем в 3,5 раза, т.е. примерно так же, как и при образовании каллусной ткани табака (табл.4, рис.4). Основные'различия"между этими типами каллусных клеток связаны с изменением содержания эндогенной ИУК'и,'следовательно, глубина клеточной дедифферениировки, индуцируемой ауксинами, определяет склонность клеток к."привыканию".

- ■ ' , Таблица 4

Изменение содержания зеатина в каллусной ткани огуриа при длительном культивировании ( в нг/г сырого веса)

Время культивирования каллуса (е мес.) Содерл:ание зеатина

• • (в нг/г сырого Ееса) ,

, 0 - эксплант 857,71 - 10,11

■ I - первичный каллус 244,81 ± 9,81

2 " • 317,87 ± 3,88

3 • 394,89 ± 8,11 . '

4 477,20 ± 9,89

5 515,35 ±10,16; "

6 ■ ' 607,30 ± 9,86

Продолжение таблицы 4

Время культивирования каллуса ( в мес.) Содер:кзние зеатина (в иг/г сырого веса

7 679,93*10,15

8 756,20*11,9

9 031,17* 5,13

10 897,24* 8,34

II 975,69* 7,55

12 1028,50*10,1

После образования каллуса содержание зеатина в клетках каллусной ткани огурца начинало увеличиваться и к кониу 9 месяца культивирования превышало исходный уровень гормона в экспланте. В то же время в каллусе табака содержание зеатина за этот период лишь приближалось к исходному уровню, но не превышало его. Вместо с тем каллусная ткань огурпа не проявляла способности к росту на ,'безгормональной питательной среде, а каллусная ткань табака,несмотря на более низкое содержание нитокинина,такой способностью ■обладала. Это ещё раз указывает на отсутствие прямой связи между количеством эндогенного гормона и "привыканием".

• Изучение динамики содержания ИУК и зеатина в семядольном каллусе огурца при его длительном культивировании помогло уточнить и подтвердить выводы, сделанные на основании определения .динамики содержания эндогенных горшлоЕ в процессе перехода к '"привыканию" каллусной ткани табака.

. Изменение содержания эндогенных Гормонов в процессе

.' перехода каллусных клоток табака к моногенезу_

Наряду с определением изменения гормонального статуса каллусных клеток при длительном культивировании и переходе к "привыканию", • связанному,вероятно, с нарастанием клеточной дедифферониировки, представляло интерес: проследить-динамику содержания эндогенных гормонов при обратном процессе: превращении каллусных клеток в

норналыше,лежащем в основе морфогенеза. Мы хотели выяснить изменения, которые происходят в камусных клетках в начальный период действия на них стимула морфогенеза до появления первых внешних признаков регенерации. Такие сведения, как мы полагали, могли бы быть использованы и для прогнозирования способности тех или иных каллусных тканей к морфогенезу.

Для индукиии морфогенеза каллусную ткань табака через 8 месяцев культивировали на среде А, переносила в чашки Петри на среду М-С с добавлением 2 мг/л кинетина. Через 18 дней на поверхности каллуса появлялись зелёные меристематические участки.

Определение содержания эндогенных гормонов проводили перед перенесением каллусной ткани на среду для регенерации и через каждые 3 дня е течение 18 дней. К этому времени на поверхности каллусной ткани появлялись отчётливо видимые зелёные меристематические участки, т.е.наблюдалось начало регенерации.

Можно было ожидать увеличения синтеза гормонов клетками образуицихся меристематических очагов и соответственно возрастания количества эндогенных гормонов в процессе перехода каллусной ткани к морфогенезу. Однако измерения, проЕеденнае в течение скрытого периода морфогенеза показали, что содержание эндогенных гормонов е этот период последовательно снижается (табл.5) За 10 дней количество эндогенной ИУК снизилось примерно в 6 раз.

Таблица 5

Динамика содержания гормонов в каллусной ткани табака при переходе к морпогенезу ( нг/г сырой массы)

Гормоны Время культивирования каллуса на среде для регенерации, ( е дн.)

- 0 3 б 9 12 15 18

иге 490,35 '436,82 366,80 309,57 261,23 162,94 110,18 ± 9,75 ± 7,78 ± 8,54 ±6,38 ± 9,11 72,69 ¿4,56- .

зеатин 188,71 168,90 162,18138,98 106,68 43,69 +10,50 +11,87 +12,86 + 9,12 ^9,10. ^7,Д 37,84 +5,13

-/6-

Трата эндогенных гормонов при переходе каллусных клоток к морфогенезу, понидимому, ОЕЯзана с образованием специфических болков. • Работами Бутенко, Володарского и Моисеевой (1975), показано,что морфогенез е культуре каллусной ткани табака характеризуется включением и выключением синтеза определенных белков-маркёров. Клетки нематематических очагов отличаются интенсивным синтезом РЖ и ДНК.

Переход к каллусному типу .роста также связан с усилением синтеза РНК и появлением белков,специфичных для делящихся каллусных клеток (бутенко, 1987).

Как в том, так и в другом случае усиленный синтез макромолекул необходим для интенсивной пролиферации клеток. В этой связи становится объяснимым снижение содержания эндогенной ПУК при переходе каллусных клеток к моногенезу, которые в виде гормонореиептор-ных комплексов могут затрачиваться на синтез РНК и новых белков.

Нет сомнения е том, что меристематическпа очаги, дащпе начало стеблевым апексам, в дальнейшем становятся местами актив, ного синтеза гормонов, происходящем на более позднем этапе, но этому предшествует снижение содержания ауксина в перестраивающихся клетках.

За 18 дней культивирования к моменту появления визуально различных признаков регенерации количество зеатина е каллусных клетках табака снизилось примерно в 6-раз,т.е.в равной степени с ауксинами. Однако е целом каллусныё клетки.возвращащиеся на нормальный путь развития,затрачивают значительно больше цитоки-ниное с учетом экзогенных гормоноЕ, присутствующих в питательной среде для регенерации.

Высокий уровень расходования идтокининов при переходе каллусных клеток к мор.рогенезу,. связан с интенсивным использованием их в процессах пролиферации.

Изменение содержания эндогенных гормонов при переходе каллусных клеток огурца к нотхТюгекезу.

Представляло интерес сравнить динамику содержания эндогенных гор-моное при переходе к морфогенезу каллусной ткани ¡способной, к "привыканию", с изменениями при переходе к морфогенезу в каллусной ! ткани, не проявляющей тенденции к "приЕыканию'ЧС этой целью был индуилроЕан морфогенез'в каллусной ткани огурца. Для этого семядольный каллус переносили на питательную среду М-С с добавлением

2 мг/л кинетина. Через 3 недели на поверхности каллусной ткани ' появлялись зелёные меристематическиё зоны.

Измерения содержания эндогенного зеатина проводили через каздые

3 дня в течение 3-х недель * Результаты измерений представлены е табл.6.

Таблица 6

Динамика содержания гормонов е каллусной ткани огурца ири: йёреходё к морфогенезу (в нг/г сырого Ееса)

Гормоны 0 3 эксплант 6 9 12 15 '18 21 '

ЮТ 1297,90 ±25,03 1162,19 '±15,18 1061,69 964,93 836.44 492.99 ±12,88 ±9,69 ±8,79 !±9,44 403,17 _±3,86_ 385,13 ±3,|2. '

зеатин 1358,76 ±12,89 1097,19 ±10,98 887,45 706,10 523,68 372,98 ±8,13 ±9,85 ±7,63 ±4,56 •• 309,88 . ±4,89 255,80 ±4,12

Так же, как и е каллусе табака, индукция морфогенеза вызывала в каллусной ткани огурца последовательное снижение количества эндогенных гормонов. За 21 содержание ЙУК снизилось е каллусе огуриа е 3,3 раза, тогда как у табака за 18 дней - в 6 раз.Следовательно, на перестройку более глубоко дедифференоироЕанных клеток ,способных к "дриЕыкашш"заграчиЕается и большее количество ауксина. ■ .

Содержание эеатина в течение скрытого периода морфогенеза в каллусе огурца снизилось в 5,5 раза.

• Таким образом, при■ переходе к морфогенезу каллусная ткань огурца, не проявляющая тенденции к "привыканию" расходовала меньшее количество эндогенных гормонов, чем "привыкающая" каллусная ткань табака, прчем'наибольшие различия наблюдались в отношении ауксина. Снижение содержания гормрнов и »прежде всего, ауксина в каллусной ткани, помещенной на среду для регенерации может служить показателем перехода клеток к морфогенезу и использоваться для определения морфогенной способности каллуса.

ВЫВОДЫ.

Т."Привыкание" к ауксинам и цитокининам наступает в пересадочной

культуре листового каллуса табакаВисконсин 38 через 7 месяцев

ку льтивирования на среде М-С, содержащей 2,4-Д я через 9месяцев

культивирования на среде М-С, содержащей ИУК, . ч

2» Содержание эндогенных гормонов /1УК и зеатинв/ резко снижается

при переходе экспланта к каллусному росту, после чего начинает

постоянно увеличиваться , однако к моменту "привыкаяия"клеток

не достигает исходного уровня в экспланта.

3. Способность каллусной ткани табака расти на безгормоналыюй

. питательной среде при уровне эндогенных гормонов в несколько раз более низком по сравнению с эксплантом свидетельствует о том, что ответственность за "привыкание" несет не увеличение синтеза эндогенных гормонов,, а снижение чувствительности клеток к экзогенным гормонам,- • ,

4. Наиболее значительные изменения в клетках , связанные с гормональным статусом, происходят при их дедифференцмровке и превращении в каялусные.

Переход же каллусных клеток к "привыканию" является постепенным ; нарастанием этого процесса и наиболее логичным его завершением.

5. Динамика содержанки гормонов в каллусе огурца» не переходящем за период исследования к гормононезависимости, носит тот же характер» что и в переходящем к "привыканию" каллусе табака, но изменения гормонального статуса по сравнению с аксплантом выражены в каллусе огурца слабее.

6. На основании различай в трате эндогенных гормонов и, особенно ауксинов при переходе эксппанта к каллусоодразованию можно прогнозировать способность культивируемых тканей к "привыканию".•

7. При переходе каллусной ткани табака и огурца к морфогенезу на первом этапе / до появления внешних прзнаков' регенерации / происходит постепенное снижение содержания эндогенных гормонов, что, вероятно, связано с усилениям синтезом РНК и белка, происходящем при перестройке каллусных клеток. *

8. Снижение содержания эндогенных гормонов при перенесении каллусной ткани на среду для регенерации можно использовать пая прогнозирования перехода к морфогенезу.

1

Работы» опубликованные по теме диссертации:

1. Хамангода ТЛ.П. Динамика содержания эндогенных цитокининов и ауксинов в каллусной ткани табака при длительном пассировании и переходе к автономному росту»

Тезисы докладов второй конференции "Регуляторы роста и развития растений", Москва» 1993,