Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследования производных 1,2-диазетина и нитронилнитроксида в качестве доноров и акцепторов окиси азота in vitro и in vivo

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследования производных 1,2-диазетина и нитронилнитроксида в качестве доноров и акцепторов окиси азота in vitro и in vivo"

Л ,■ I^ÜÜ

Pr» л

tfa правах рукописи

УТЕПБЕРГЕНОВ Дархан Ирбулатович

ИССЛЕДОВАНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ 1,2-ДИАЗЕТИНА И НИТРОНИЛНИТРОКСИДА В КАЧЕСТВЕ ДОНОРОВ И АКЦЕПТОРОВ ОКИСИ АЗОТА IN VITRO и IN VIVO.

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 1999

Работа выполнена в Институте Химической Кинетики и Горения Сибирского Отделения Академии Наук

Научный руководитель:

д.х.н. Храмцов В В.

Официальные оппоненты:

Академик РАМН д.б.н. В.В. Ляхови*

к.х.н. А.С. Левина

Ведущая организация:

Институт Цитологии и Генетики СО РАН

Защита состоится

«

на заседании

диссертационного совета К 003.52.01 в Новосибирском Институте Биоорганической Химии СО РАН в конференц-зале института по адресу: 630090 Новосибирск, проспект акад. Лаврентьева, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского Института Биоорганической Химии СО РАН

Автореферат разослан "_" _ 1999 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор химических наук

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Благодаря исключительному разнообразию и важности функций, выполняемых окисью азота ("N0) в организме, большое внимание уделяется исследованиям в области биохимии 'N0. Окись азота нестабильна в тканях, поэтому для успешного проведения исследований' в области биохимии "N0 необходимы методические подходы для контроля уровня (стационарной концентрации) 'N0 в биологических системах. Помимо регуляции ферментативной продукции 'N0 для контроля уровня продукции "N0 применяются соединения, специфически реагирующие с "N0 (акцепторы "N0) и вещества, выделяющие ~К0 (доноры "N0). Как акцепторы, так и доноры "N0 являются ценным и незаменимым инструментом в исследованиях биохимии 'N0 и родственных метаболитов. Конкретный тип задачи определяет выбор того или иного донора или акцептора 'N0, причём появление новых доноров и акцепторов 'N0 существенно расширяет возможности исследователей. Различные доноры 'КО применяются в медицине, в особенности для терапии заболеваний кровообращения. Всвязи с вышеизложенным, изучение свойств новых доноров и акцепторов "N0 представляется актуальной задачей.

Активные кислородные метаболиты вовлечены во множество патофизиологических процессов, связанных с окислительными повреждениями таней. Окись азота, являясь свободным радикалом, взаимодействует (реагирует) с активными кислородными метаболитами, образующимися при окислительном стрессе. Реакции 'N0 с активными кислородными метаболитами при окислительном стрессе приводят к изменениям в концентрациях, составе и соотношении активных кислородных метаболитов. За последние несколько лет установлено, что в зависимости от условий окислительного стресса реакции 'N0 с активными кислородными метаболитами могут приводить к усилению окислительных повреждений тканей или наоборот приводить к снижению уровня повреждений. Одной из актуальных задач в области биохимии 'N0 является изучение эффектов 'КО на функции органов и тканей в условиях окислительного стресса. К моменту проведения настоящих исследований эффекты 'N0 на функцию гематоэнцефалического барьера в условиях окислительного стресса не были изучены.

Цель настоящей работы заключалась в исследовании свойств новых акцепторов (нитронилнитроксильных радикалов) и доноров (диазетинов) окиси

азота, а также в исследовании эффектов "N0 на функции гематоэнцефалического барьера в условиях окислительного стресса. В задачи исследования входило:

1) Развитие методических подходов для использования нитронилнитроксильных радикалов в качестве акцепторов окиси азота в биологических образцах.

2) Исследование механизмов продукции "N0 новыми "ЫО-донорами, производными диазетина, роли "N0 в биологической активности диазетинов и изучение цитотоксичности диазетинов.

3) Исследование роли "N0 в повреждениях гематоэнцефалического барьера при окислительном стрессе.

Научная новизна работы состоит в следующем:

1. Для защиты нитронилнитроксильных радикалов от восстановления в биологических образцах, впервые осуществлено заключение радикалов в липосомы с сохранением способности радикалов к спиновому захвату.

2. Показано, что производные диазетина спонтанно распадаются с выделением окиси азота, измерены соответствующие константы скорости.

3. Впервые было обнаружено, что галоген- и нитрозамещённые диазетины реагируют с тиолами с выделением "N0, исследован механизм данной реакции. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что реакция с тиолами, ведущая к выделению "N0 является основой биологической активности галоген-замещёшгых диазетинов. ;

4. Была выявлена потенциальная роль окиси азота как антиоксиданта, защищающего гематоэндефалический барьер при окислительном стрессе, вызванном гипоксией/реоксигенацией.

Научная и практическая значимость. Предложенный в настоящей работе метод защиты нитронилнитроксильных радикалов (ННР) от восстановителей путём заключения ННР во внутренний объём липосом позволяет существенно увеличить стабильность ННР в биологических системах с сохранением способности к спиновому захвату "N0. Заключение ННР в лимпосомы существенно расширяет возможности применения ННР в качестве акцепторов 'КО в биологических системах. Предложенный подход был успешно использован другими авторами [Ака&е апс1 Маес1а, 1996].

Важным результатом является установление роли тиолов в продукции 'N0 галоген-замещёнными производными диазетина. До проведения настоящих

J

исследований считалось, что биологическая активность диазетинов обусловлена исключительно их спонтанным распадом с выделением 'NO. Полученные в данной работе результаты могут применяться для направленного поиска диазетинов с высокой биологической активностью.

Побочные эффекты при операциях на сердце включают в себя расстройства функций центральной нервной системы, связанные, по крайней мере отчасти, с нарушениями целостности гематоэнцефаяического барьера. Результаты данной работы, касающиеся защитных эффектов 'N0 в отношении гематоэнцефаяического барьера, привлекли пристальное внимание специалистов в области хирургии сердца и, возможно, будут использоваться для развития подходов в превентивной терапии осложнений, связанных с нарушениями гематоэнцефалического барьера кислородными радикалами.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ. Результаты исследований были доложены на VII Конгрессе Международного Общества Исследований Свободных Радикалов (Барселона,

1996) и 5-м Международном Семинаре по Биомембранам (Франкфурт-на-Майне,

1997).

Объём и структура работы. Диссертация изложена на 107 страницах машинописного текста, содержит 29 рисунков, 9 таблиц и состоит из введения, трех глав, выводов, списка литературы из 156 наименований и приложения.

Содержание работы Во Введении обоснована актуальность поставленных задач и сформулированы цели работы.

Глава 1 представляет собой обзор литературы. В начале главы кратко изложены современные представления о химии и биохимии "NO. Далее рассматриваются вопросы, связанные с биологическими эффектами взаимодействия окиси азота со свободными радикалами. Являясь свободным радикалом, 'NO реагирует с кислородными радикалами образующимися при окислительном стрессе. В зависимости от условий окислительного стресса 'NO может либо вносить вклад в повреждения органов и тканей активными кислородными метаболитами, либо наоборот защищать органы и ткани от повреждающих эффектов окислительного стресса. На примере функции гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) рассмотрены патологии, связанные с

окислительным стрессом, и сделан вывод о том, что роль "N0 в повреждениях ГЭБ при окислительном стрессе не выяснена.

Во второй части обзора дан сравнительный анализ методов измерения скоростей продукции и стационарных концентраций окиси азота. Подробно рассматриваются методы, основанные на спиновом захвате 'N0, в частности, спиновый захват нитронилнитроксильными радикалами (ННР). ННР реагируют с "¡4О, являясь, таким образом, акцепторами "N0. Продуктами реакции являются иминонитроксильные радикалы (ИНР):

Рис 1. Реакция нитронилнитроксильных радикалов с "N0

Спектры электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) ННР и ИНР различаются, что позволяет использовать ННР для регистрации "N0. Однако, ННР практически не используются для спинового захвата "N0 в биологических системах. Сделан вывод о том, что, вероятно, быстрое восстановление радикалов в соответствующие гидроксиламины восстановителями биологического происхождения ограничивает применение ННР в качестве акцепторов 'КО в биологических системах.

В третьей части обзора охарактеризованы наиболее широко употребляющиеся в экспериментальной биологии доноры "N0, а также исследовавшиеся в данной работе производные 3,4-дигидро-1,2-диазет 1,2 'диоксида (диазетины). Производные диазетина (Рис. 2) распадаются в органических растворителях с образованием окислов азота и соответствующего алкенового производного. Предполагалось, что диазетины разлагаются с образованием двух молекул "N0 [Володарский и Тихонова, 1977].

N0

О-

ИНР

О-

ННР

^ „О

т

+ 2 -N0

Я4 О

Рис. 2 Спонтанный распад диазетинов

Недавно было показано, что ДД проявляют ряд биологических эффектов (например, сосудорасширение, ингибирование агрегации тромбоцитов), типичных для доноров 'N0 [Беуепла а а!., 1993, 1994]. К моменте проведения настоящего исследования считалось, что биологические эффекты опосредуются 'N0, выделяющейся при спонтанном разложении ДД (Рис. 2). ДД были предложены б качестве новых перспективных доноров "N'0, разлагающихся спонтанно, без участия биомолекул. Однако, к моменту проведения данных исследований в литературе не было данных, экспериментально подтверждающих генерацию "N0 диазетинамн, механизмы биологической активности ДЦ не были изучены.

Во второй главе описаны использованные в работе экспериментальные методики.

В третьей главе, состоящей из трех частей, изложены результаты исследований и их обсуждение. Первая часть посвящена исследованию возможностей применения нитронилнитроксильных радикалов для спинового захвата 'N0 в биологических образцах. В качестве источника 'N0 биологического происхождения использовалась "1\'0-сингазная активность цитозоля мозжечка крысы. Структуры ННР и ИНР, использовавшихся в экспериментах показаны в Таблице 1.

Таблица 1. Структуры интроксмльных радикалов, использовавшихся в исследованиях. Положения заместителей соответствуют таковым на Рис. 1.

ННР/ИНР XI Х2 ХЗ

а Метил Метил Фенил

б Метил Метил

в Фенил Метоксил м-пиридин

При добавлении "N0 донора 3-морфолиносиднонимина (БПчМ) к раствору ШРб, наблюдалось количественное превращения спектра ННРа в спектр ИНРб Рис. 3), что согласуется с литературными данными. При сравнении скорости ахвата окиси азота ННРб со скоростью продукции 'N0, измеренной пектрофотометрически с использованием оксигемоглобяна (НЬОг), оказалось, то значительная часть 'N0 захватывается ННРб (Рис. 4). Добавление супероксид :исмутазы (СОД) увеличивает долю захваченной 'N0. По-видимому, в отсутсвии

СОД часть "N0 реагирует с супероксидным радикалом, который образуется при распаде БГЬМ [Раге! апс! Оагку-изтаг, 1996].

Таким образом, ННР могут использоваться в качестве акцепторов "КО. для измерения концентрации "N0 в растворах и для наблюдения скоростей продукции 'N0. Непосредственное сравнение оксигемоглобннового метода с методом спинового захвата ННР выявило, что метод измерения скорости продукции 'N0, основанный на спиновом захвате "N0 ННР, сравним по чувствительности с оксигемоглобиновьм методом, обладая при этом большей специфичностью, поскольку оксигемоглобин самопроизвольно окисляется в водных растворах.

Рисунок 3. Спектр ЭПР раствора ННРб (100 мкМ) до добавления 0.5 мг/мл 5114-1 (А), 25 мин (Б) и 50 мин (В) после добавления вЕЧ-!. Символы О и • обозначают компоненты спектров ННРб и ИНРб, соответственно.

Рисунок 4. Скорости высвобождения 'N0 при распаде 5Ш-1 (0.025 мг/мл), измеренные с помощью

оксигемоглобина (НЬ02) и ННР; эффект супероксид дисмутазы (60 ед./мл).

При попытках измерения 'N0, продуцируемой "ЫО-синтазами цитозоля мозжечка крысы, наблюдалось быстрое и полное исчезновение ЭПР-слектра вследствие восстановления радикалов в соответствующие гидроксиламины восстановителями, присутствующими в биологическом образце, что препятствовало непосредственному применению ННР для спинового захвата 'N0 в биологических образцах [1].

Для того, чтобы защитить ННР от восстановления в биологических образцах, заряженный ННРб был заключён во внутренний объём больших униламеллярныл липосом, приготовленных из фосфатидилхолина. Предполагалось, что 'N0 являясь гидрофобным газом, будет свободно проникать через мембрану липосом

в то время как проникновение веществ, восстанавливающих ННР, в липосоиы и вытекание радикатов из липосом будет ограничено. Приготовленные липосомы отличались низкой проницаемостью для ННРб и ИНРб: скорость вытекания из липосом составила около 5% и 20% в час, соответственно. ННРб и ИНРб, заключённые в липосомы, восстанавливались цитозолем мозжечка крысы со скоростью около 1% и 4% в минуту для ННРб и ИНРб, соответственно. Таким образом, заключение ННРб во внутренний объём липосом позволяет защитить ННРб от восстановления цитозолем мозжечка крысы. Оказалось, что у ННРб, заключенного в липосомы, сохраняется способность в захвату "N0. Значение активности 'КО-синтазы из цитозоля мозжечка крысы, измеренное с помощью ННРб в липосомах, составляло 0.28 мкМ/мин на мг белка и находилось в полном согласии со значением, измеренным спектрофотометркчески с помощью оксигемоглобина (0.25 цМ/мин на мг белка) [1].

Предложенный в настоящей работе метод защиты ННР от восстановителей, путём заключения ННР во внутренний объём липосом позволяет существенно увеличить стабильность ННР в биологических системах с сохранением способности к спиновому захвату 'N0. Апробация метода с использованием цитозоля мозжечка крысы в качестве источника ТТО-синтаз показала принципиальные возможности применения ННР в качестве акцепторов "N0 в биологических системах.

Во второй части излагаются результаты исследований механизмов биологической активности новых "N'0-доноров, производных 3,4-дигидро-1,2-диазет 1,2 диоксида (диазетинов). Структуры ДД, использовавшихся в работе, показаны в Табл. 2. Продукцию "N0 при спонтанном распаде диазетанов в растворах изучали методом спинового захвата с использованием ННР. Оказалось, что ДД спонтанно распадаются в водных растворах с выделением "N0. Однако, константы скорости спонтанного распада ДД в водных растворах оказались слишком малы (около 10"7 с"1), чтобы объяснить ярко выраженные биологические эффекты ДД [2, 3]. Поэтому, нами был сделан вывод о возможном существовании путей продукции "N0 диазетинами в биологических системах, отличных от спонтанного распада.

Таблица 2. Структуры диазетинов, использованных в работе.

ДД1 ДД2 ДДЗ ДД4 ДД5 ДЦб

н о ri-í н ДА \ 0 ас Н 0 Вг О з С Вг О _ / S f—N н „о "ЧУ

ДД7 ДД8 ДД9 ДД10 ДД11 ДЦ12

Н -К, Вг О -V4 Вг О ~т\ N0 0 TW Cl JO CI _о ск

В результате поиска путей метаболизма ДД было обнаружено, что галоген- и нитрозамещенные ДД сравнительно быстро реагируют с тиолами (Рис. 5), а незамещенные ДЦ не реагируют вовсе. Нами было высказано предположение, что одним из продуктов реакции галоген-замещенных ДЦ с тиолами является "N0, объясняя, таким образом, биологическую активность ДЦ.

1000-

О 5 10 15

время элюийи, мин

О 5 10 -15 20 время, мин

Рис. 5. Реакция ДД4 (200 мкМ, пик на 10 мим) с цистеинои (2,чМ). Показаны жидкостные хроматограммы до (А), 2 мин (Б) и 40 мин (В) после добавления цистеина.

Рис. 6. Влияние глутатиона (200 мкМ) и СОД (50 ед./мл) на скорость продукции 'NO диазетином ДД4. Скорость продукции N0

пропорциональна интенсивности

сигнала хемолюминесценции (XJI).

Продукцию "NO в реакции ДД с тиолами изучали методом озон-опосредованной хемолюминесценции. После добавления глутатиона интенсивность сигнала хемолюминесценции сильно возросла, что однозначно указывает на то, что 'NO является одним из продуктов реакции ДД с тиолами

А

(Рис. 6). Как видно из Рис. 6, уровень продукции "N0 в реакции с тиолами многократно превосходит уровень продукции *»0 при спонтанном распаде ДД. Данные результаты позволяют предположить, что реакция с тиолами может являться искомым путем продукции "N0 при метаболизме ДД. Добавление супероксид дисмутазы (СОД) приводило к дальнейшему увеличению сигнала хемолюминесценции в несколько раз, благодаря тому, что СОД инактивирует супероксидный радикал, предотвращая расходование "N0 в прямой реакции с супероксидным радикалом. Эффект СОД указывает на то, что в реакции образуются значительные (сравнимые с количествами *К0) количества супероксидного радикала.

Реакция галоген-замещенных ДД с тиолами была детально изучена [6]. Выяснилось, в частности, что как скорость продукции "N0, так и бимолекулярная константа скорости реакции ДД с тиолами зависят сложным образом от концентраций тиолов (Рис. 7 и Рис. 8 соответственно).

- аппроксимация

(1+Ьс+аГ)

а=2 26xl(J-

ьчхо

c=1.5xl(f

ю' «Г кг3 -icr'

Концентрация цистеина, М

7 6

4

3|

I*?

1

О

0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05

-■ аппроксимация

^ Ь

t а = 0.01

\ Ь » 3.39

с'3.03

Рис. 7. Зависимость скорости продукции "NO в реакции ДД4 (150 мкМ) с цистеином от концентрации цистеина. Измерения проводились люминесцентным (О) и оксигемоглобиновыми (•) методами. Данные аппроксимированы

уравнением, полученным из схемы на Рис. 9 в приближении квазистационарного равновесия.

-1 01234567 Концентрация N-ацетипцистеамина, мМ

Рис. 8. Зависимость бимолекулярной константы скорости реакции ДД4 (25 мкМ) с ¡Ч-ацетилцистеамииом от концентрации К-ацетилцнстеамина. Данные аппроксимированы

уравнением, полученным из схемы на Рис. 9 в приближении квазистационарного равновесия.

Наиболее вероятное объяснение этих экспериментальных фактов заключается в том, что реакция с тиолами протекает по более, чем одному пути (один из которых приводит к образованию 'N0), которые различаются по скоростям превращения ДД и что вклад определенного пути зависит от концентрации тиола.

Методом спинового захвата с использованием спиновой ловушки 5,5-диметилпирро.тин-К-оксида обнаружено, что тиильный радикал является интермедиатом реакции галоген-замещенных ДД с тиолами.

Были выделены и идентифицированы продукты реакции ДД с тиолами. Оказалось, что при высоких (болееЮ мМ) концентрациях тиола в реакционной смеси, наблюдается образование гидроксиламина (структура 3 на Рис. 9), в то время как при меньших концентрациях тиола, помимо гидроксиламина, наблюдается образование гидроксиоксима (структура 6 на Рис. 9). На основе структур и количественного соотношения выделенных продуктов, зависимостей констант скорости и скоростей продукции 'КО от концентрации тиола в реакции ДД с тиолами и некоторых других данных предлагается механизм реакции ДД с тиолами, схематически изображенный на Рис. 9 [6]. Присоединение тиола к кислородному атому ДД приводит к образованию интермедиата 1. При высоких концентрациях тиолов (10 мМ и более) в основном происходит восстановление 1 в гидроксиламинооксим 3. При низких концентрациях тиолов, происходит спонтанное разложение интермедиата 1, с выделением окиси азота и тиильного радикала, приводя к образованию гидроксиоксима 6.

Лс

ТЗо7' -КБ'

¡Рис. 9. Предполагаемый механизм реакции галоген-замещенных ДД с тиолами]

Отметим, что на основе предполагаемой схемы в приближении квазистационарного равновесия были получены выражения, описывающие зависимости скорости продукции "N0 (Рис. 7) и бимолекулярной константы скорости реакции ДД с тиолами (Рис. 8) от концентрации тиолов. Численные коэффициенты в обоих выражениях удалось подобрать так, что экспериментальные данные хорошо аппроксимируются теоретическими кривыми.

В дальнейших исследованиях изучалась роль реакции с тиолами в биологических эффектах диазетинов. Для изучения вклада реакции ДД с тиолами в продукцию 'N0 при метаболизме диазетинов в тканях, тиолы цитозоля мозга крысы инахтивировали прединкубацией с йодацетамидом перед добавлением ДД. Как видно из Рис.10, инактивация гиолов приводит к сильному снижению уровня продукции 'N0 диазетинами, добавленными к цитозолю. Эти данные свидетельствуют о том, что реакция с тиолами является основным путем продукции 'N0 диазетинами в биологических образцах.

На выделенных сегментах мезентериальных артерий крыс были систематически исследованы сосудорасширяющие свойства ряда галоген-замешенных ДД с целью сопоставления сосудорасширяющих активностей ДД со скоростями продукции "N0 в реакции с тиолами. Обнаружилась высокая степень корреляции между сосудорасширяющими свойствами ДД и скоростью генерации "N0 диазетинами при реакции с глутатионом (Рис. 11).

-я 6.5 о

1б.О

¡5.0

СО

I 4.5

а £

§4.0 а

I 3.5-1

50 100 150 200 250 300 350 Время, сек

- Регрессия (у=а + Ьх): а=2.69б

Ъ=0.ЭТ8 /

11=0.903 /

ДД4

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 логарифм скорости продукции N0 (отн. ед.)

Рис. 10. Продукция 'N0 при добавлении ДД4 (100 мкМ )к 2 мл образца цитозоля мозжечка крысы (7 мг бека в мл), не инкубированного (А) и инкубированного (Б) с йодацетамидом (20 мМ, 30 мин).

Рис. 11. Корреляция между сосудорасширяющими активностями ДД и скоростями выделения 'N0 в реакции ДД с глутатионом (2 мМ). Данные представлены в двойных логарифмических координатах.

Представленные данные согласуются с предположением о том, что реакция с тиолами, ведущая к продукции окиси азота, является основным механизмом биологической активности галоген-замещенных ДЦ.

В дальнейших исследованиях для более полной характеристики ДД как доноров "N0 изучались некоторые аспекты токсичности ДД на культурах эндотелиальных клеток аорты быка. Оказалось, что цитотоксичность галоген-

замещённых ДД коррелирует с соответствующими константами скорости реакции с тволами. Добавление супероксид дисмутазы снижало токсичность ДД, что свидетельствует об участии супероксидного радикала в токсичности ДД. Добавление акцептора 'N0, оксигемоглобина, повышало токсичность ДД, в то время как добавление донора "N0, БЕТА/МО, снижало токсичность ДД. Результаты данных экспериментов свидетельствуют о том, что *К0, образующаяся при взаимодействии ДД с клетками, не только не является токсичной для клеток, но и уменьшает токсичность ДД в отношении клеток.

Таким образом, на основании полученных данных, можно предположить, что основным путём продукции 1\'0 из галоген-замещённых диазетинов является реакция с клеточными тиолами, причём выделяющаяся в реакции 'N0 опосредует сосудорасширяющие эффекты ДД. Полученные данные указывают на то, что токсичность галоген-замещённых ДД отчасти опосредована супероксидным радикалом, образующимся при реакции ДД с тиолами

В третьей части излагаются результаты исследований эффектов "N0 на функцию гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) в условиях окислительного стресса, индуцированного гипоксией/реоксигенацией. _В работе использовалась клеточная модель ГЭБ, состоящая из эндотелиальных клеток мозга, растущих на проницаемых основах в присутствии астроцитов. В качестве функционального параметра ГЭБ использовалась проницаемость флуоресцеина натрия через монослой эндотелия. В качестве биохимического маркера окислительного стресса в клетках ГЭБ использовалось содержание малонового диальдегида -продукта перекисного окисления липидов.

После гипоксии-реоксигенации проницаемость ГЭБ и содержание малонового диальдегида в эндотелиальных клетках значительно возросли (Рис. 12 и 13). Эти данные свидетельствуют о повреждении барьера на функциональном и молекулярном уровнях в результате гнпоксии/реоксигенадаи. Добавление супероксид дисмутазы (СОД) предотвращало увеличение проницаемости барьера (Рис. 12) , поэтому нами был сделан вывод о вкладе кислородных радикалов в функциональные повреждения ГЭБ 6 данной модели окислительного стресса. Добавление растворов химически синтезированной 'N0 и донора "N0 Б-нитрозопеницилламина (Б^Р) позволяло предотвратить увеличение проницаемости ГЭБ (Рис. 12).

Защитный эффект "N0 по отношению к функции ГЭБ вероятно обусловлен инактивацией свободных радикалов, поскольку известно, что "N0 может

выступать в роли антиоксиданта в некоторых моделях окислительного стресса [Rubbo, et al, 1996]. Для того, чтобы тестировать антиоксидантные свойства "МО в данных условиях окислительного стресса, нами были изучены эффекты "NO на перекисное окисление липидов. Оказалось, что добавление как "МО-донора SNAP, так и растворов "NO полностью ингибировало процессы перекисного окисления липидов, индуцированные гипоксией/реоксигенацией (Рис. 13).

нормоксия

1гипокскя-sреоксигенаиня

_ 1.0 «

1 о-э f 0.8.

2 0.7

I °-6

£0.5

<04

5

0

1 0.2

S о.1

ч

о U

| |нормоксия ВЯГИПОКСИЯ-

Вх реоксигенация

А

Контроль

SNAP, ЗОмхМ

lb

SNAP. бОмкМ

МО, бмкМ

Рис. 12. Эффект СОД и SNAP на увеличение проницаемости гемато-энцефалического барьера, вызванное гипоксией (60 мин) и реоксигнацией (30 мин).

Рис. 13. Эффект SNAP и "NO на накопление малонового днальдегида в эидотелиальных клетках, вызванное гипоксией (120 мин) и реоксигенацией (60 мин)._

Поскольку процессы перекисного окисления липидов, вызванные гипоксией/реоксигенацией, опосредуются активными кислородными метаболитами, ингибируюшие эффекты "N0 в отношении перекисного окисления липидов указывают на способность 'N0 выступать в качестве антиоксиданта в данных условиях окислительного стресса. Поэтому, вероятно, что защитные эффекты 'N0 в отношении функции гематоэнцефалического барьера также связаны с антиоксидантными эффектами "N0.

В Приложении описаны процедуры аппроксимации экспериментальных данных функциями, включая вывод уравнений, описывающих зависимости скорости продукции "N0 и бимолекулярной константы скорости реакции ДД с тиолами от концентраций тиолов в приближении квазистационарного равновесия.

Выводы

1. Заключение нитрошшштроксильных радикалов в липосомы защищает радикалы от восстановления в биологических образцах с сохранением способности к спиновому захвату окиси азота. Это позволяет применять нитронилнитроксильные радикалы в качестве акцепторов окиси азота в биологических системах. г

2. С помощью спинового захвата нитронилнитроксильными радикалами показано, что производные 3,4-дигидро-1,2-диазет 1,2 диоксида (диазетины) распадаются с выделением окиси азота, измерены соответствующие константы скорости.

3. Обнаружено, что галоген- и нитрозамещённые диазетины реагируют с тиолами. Окись азота, тиильный и супероксидный радикалы являются продуктами реакции. Исследованы кинетические особенности реакции диазетинов с тиолами. Предложен кинетический механизм этой реакции.

4. Были получены экспериментальные данные свидетельствующие о том, что реакция с тиолами служит основным источником окиси азота при метаболизме галоген-замегцённых диазетинов в биологических системах и является основой механизма расширения сосудов диазетинами.

5. На клеточной модели гематоэшефалического барьера показано, что окись азота ингйбирует как перекисное окисление липидов, так и увеличение проницаемости гематоэнцефалического барьера в условиях гипоксии/реоксигенации, то есть защищает барьер от повреждающих эффектов окислительного стресса на молекулярном и функциональном уровне.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Woldman, Ya.Yu., Khramtsov, V.V., Grigor'ev, I.A., Kiriljuk, I.A. and Utepbergenov, D.I. (1994). Spin trapping of nitric oxide by nitronylnitroxides: measurement of the activity of no synthase from rat cerebellum. Biochem. Biophys. Res. Commun., 202(1), 195-203.

2. Utepbergenov, D.I., Khramtsov, V.V., Vlassenko, L.P., Markel, A.L., Mazhukin, D.G., Tikhonov, A. Ya. and Volodarsky, L.B. (1995). Kinetics of nitric oxide liberation by 3,4-dihydro-l,2-diazete ],2-dioxides and their vasodilatory properties in vitro and in vivo. Biochem. Biophys. Res. Commun., 214(3), 1023-32.

IS -

3. Храмцов, В.В., Утепбергенов, Д.И., Вольдман, Я.Ю., Власенко, Л.П., Маркель, А.Л. Киршпок, И.А., Григорьев, И.А., Мажукин, Д.Г., Тихонов, А.Я. и Володарский, Л.Б. (1996). Изучение 1,2-диазетинов и нитронилнитроксидов в качестве доноров и акцепторов окиси азота in vitro и in vivo. Биохимия, 61(10), 1731-42.

4. Khlestidn, V.K., Mazhukin, D.G., Tikhonov, A.Ya., Bagiyanskaya, I.Yu., Gatilov, Yu.V., Utepbergenov, D.I., Khramtsov, V.V., Volodarsky, L.B. (1996). Unexpected transformation of l,2-bis(N-methoxy-N-nitrosamino)cycloalkanes: first synthesis of 4,5-dihydro-l,2,3-triazole 2-oxides. Tetrahedron Lett., 37(33), 5997-6000.

5. Kirilyuk, I.A., Utepbergenov, D.I., Mazhukin, D.G., Fechner, K., Mertsch, K. and Khramtsov, V.V., Blasig, I.E. and Haseloff, R.F. (1998). Thiol-induced nitric oxide release from 3-halogeno-3,4-dihydrodiazete 1,2-dioxides. J. Med. Chem., 41(7), 1027-33.

6. Blasig, I.E. Sporbert, A. Utepbergenov, D.I., Schroeter, M.L., Mertsch, K. and Haseloff, R.F. (1998). Cytokine- and hypoxia-induced lipid peroxidation in astrocytes. Int. J. Clin. Pharmacol. Ther., 36(2), 112-3.

7. Utepbergenov, D.I. Mertsch, K. Sporbert, A. Tenz, K. Paul, M. Haseloff, R.F. and Blasig, I.E. (1998). Nitric oxide protects blood-brain barrier in vitro from hypoxia/reoxygenation-mediated injury. FEBS-Lett., 424(3), 197-20.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Утепбергенов, Дархан Ирбулатович

Список принятых сокращений.

Введение.

Глава 1. Биохимия окиси азота (обзор литературы). В

1.1. Некоторые вопросы химии и биохимии окиси азота.

1.1.1. Номенклатура активных кислородных метаболитов. В

1.1.2. Физикохимические и биохимические свойства окиси азота.

1.1.3. Метаболизм окиси азота.

1.1.4. Биологические функции и механизмы действия окиси азота.

1.1.5. Роль активных кислородных метаблитов в повреждении тканей при ишемии/реперфузии на примере мозга.

1.1.6. Регуляция уровня окислительных повреждений тканей окисью азота.

1.2. Методы измерения скорости продукции и стационарных концентраций окиси азота

1.3. Доноры окиси азота.

Глава 2. Методы исследований.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Применение нитронилнитроксильных радикалов для спинового захвата "N0 в цитозоле мозжечка крысы.

3.2. Исследования механизмов биологической активности производных

3,4-дигидро -1,2-диазет 1,2 диоксида (диазетинов). 53 3.2. Исследования эффектов окиси азота на функцию гематоэнцефалического барьера в условиях окислительного стресса.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследования производных 1,2-диазетина и нитронилнитроксида в качестве доноров и акцепторов окиси азота in vitro и in vivo"

Благодаря исключительному разнообразию и важности функций, выполняемых окисью азота ('N0) в организме, большое внимание уделяется исследованиям в области биохимии 'N0. Окись азота характеризуется коротким (несколько секунд) временем полупревращения в тканях. Для успешного проведения исследований в области биохимии 'N0 необходимы методические подходы для контроля уровня (стационарной концентрации) 'N0 в биологических системах. Помимо регуляции ферментативной продукции "N0, для этой цели могут применяться соединения, специфически реагирующие с "N0 (акцепторы "N0) и вещества, выделяющие 'N0 (доноры "N0). Как акцепторы, так и доноры 'N0 являются ценным и незаменимым инструментом в исследованиях биохимии "N0 и родственных метаболитов. Конкретный тип задачи определяет выбор того или иного донора или акцептора 'N0, причём появление новых доноров и акцепторов "N0 существенно расширяет возможности исследователей. Различные доноры "N0 применяются в медицине, в особенности для терапии заболеваний кровообращения. Всвязи с вышеизложенным, изучение свойств новых доноров и акцепторов 'N0 представляется актуальной задачей.

Нитронилнитроксильные радикалы (НИР) специфически реагируют с 'N0, являясь, таким образом, акцепторами 'N0. Продуктами реакции являются иминонитроксильные радикалы (ИНР). Спектры электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) нитронилнитроксильных и иминонитроксильных радикалов отличаются, что позволяет применять ННР для чувствительного и специфического измерения продукции 'N0 в водных растворах, например, для изучения продукции окиси азота 'МО-донорами. Однако, ННР практически не используются в качестве акцепторов "N0 в биологических системах. Вероятно, ННР, как и другие нитроксильные радикалы, быстро восстанавливаются в соответствующие гидроксиламины восстановителями биологического происхождения, что ограничивает их использование в экспериментальной биологии.

Производные 3,4-дигидро-1,2-диазет 1,2 диоксида (диазетины) распадаются в органических растворителях с образованием окислов азота и соответствующего алкенового производного. Предполагалось, что диазетины разлагаются с выделением двух молекул ТЧО, являясь, таким образом, донорами 'N0. Недавно было показано, что диазетины проявляют ряд биологических эффектов (например, расширение сосудов, ингибирование агрегации тромбоцитов), типичных для доноров "N0. Было высказано предположение, что биологические эффекты диазетинов опосредуются 'N0, выделяющейся при спонтанном разложении диазетинов. Диазетины были предложены в качестве новых перспективных доноров *1\Ю, разлагающихся спонтанно, без участия биомолекул. Однако, до проведения данных исследований механизмы биологической активности диазетинов были изучены недостаточно. В литературе отсутствовали какие-либо экспериментальные данные о продукции 'N0 диазетинами.

Активные кислородные метаболиты вовлечены во множество патофизиологических процессов. Окись азота, являясь свободным радикалом, взаимодействует (реагирует) с активными кислородными метаболитами, образующимися при окислительном стрессе. Реакции 'N0 с активными кислородными метаболитами при окислительном стрессе приводят к изменениям в концентрациях, составе и соотношении активных кислородных метаболитов. За последние несколько лет установлено, что, в зависимости от условий, "N0 может вносить вклад в повреждения тканей при окислительном стрессе, или наоборот, защищать ткани от повреждения радикалами. Одной из актуальных задач в области биохимии "N0 является изучение эффектов 'N0 на функции органов и тканей в условиях окислительного стресса. К моменту проведения настоящих исследований эффекты "N0 на функцию гематоэнцефалического барьера в условиях окислительного стресса не были изучены.

Цель настоящей работы заключалась в исследовании свойств новых акцепторов (нитронилнитроксильных радикалов) и доноров (диазетинов) окиси азота, а также в исследовании эффектов 'N0 на функции гематоэнцефалического барьера в условиях окислительного стресса. В задачи исследования входило:

1) Развитие методических подходов для использования нитронилнитроксильных радикалов в качестве акцепторов окиси азота в биологических образцах.

2) Исследование механизмов продукции 'N0 диазетинами, роли 'N0 в биологической активности диазетинов и изучение цитотоксичности диазетинов.

3) Исследование роли 'N0 в повреждениях гематоэнцефалического барьера при окислительном стрессе.

Первая часть работы посвящена исследованию возможностей применения нитронилнитроксильных радикалов в качестве акцепторов "N0 в биологических образцах. При попытках измерения 'N0, продуцируемой "ТМО-синтазами цитозоля мозжечка крысы, наблюдалось быстрое и полное исчезновение ЭПР-спектра, вследствие восстановления радикалов в соответствующие гидроксиламины восстановителями, присутствующими в биологическом образце. Для того, чтобы защитить НИР от восстановления в биологических образцах, НИР несущий положительный заряд, был заключён во внутренний объём больших униламеллярных липосом, приготовленных из фосфатидилхолина. Приготовленные ННР и ИНР в липосомах отличались существенной стабильностью в присутствии цитозоля мозжечка крысы с сохраненеием способности к захвату "N0. С помощью ННР в липосомах было измерено значение активности 'ЫО-синтазы из цитозоля мозжечка крысы. Таким образом, заключение ННР во внутренний объём липосом продемонстрировало принципиальные возможности применения ННР в качестве акцепторов 'N0 в биологических системах.

Вторая часть работы была посвящена исследованиям механизмов биологической активности новых *1\Ю-доноров, производных диазетина (ДД). Оказалось, что ДД спонтанно распадаются в водных растворах с выделением 'N0. Однако, скорости продукции 'N0 при спонтанном распаде ДД в водных растворах оказались слишком малы, чтобы объяснить ярко выраженные биологические эффекты ДД. Нами было обнаружено, что галоген- и нитрозамещенные ДД сравнительно быстро реагируют с тиолами, а незамещенные ДД не реагируют вовсе. Оказалось, что "N0 является одним из продуктов реакции ДД с тиолами. Было установлено, что уровень продукции 'N0 в реакции с тиолами многократно превосходит уровень продукции "N0 при спонтанном распаде ДД. Обнаружилась высокая степень корреляции между сосудорасширяющими свойствами ДД и скоростью генерации "N0 диазетинами при реакции с глутатионом. Полученные данные согласуются с предположением о том, что реакция с тиолами, ведущая к продукции окиси азота, является основным механизмом биологической активности галоген-замещенных ДД.

Третья часть работы посвящена исследованию эффектов "N0 на функцию гематоэнцефалического барьера в условиях окислительного стресса, индуцированного гипоксией/реоксигенацией. После гипоксии/реоксигенации наблюдалось увеличение проницаемости гематоэнцефалического барьера и индукция процессов перекисного окисления липидов. Эти данные указывают на повреждение барьера на функциональном и молекулярном уровнях окислительным стрессом. Добавление супероксид дисмутазы предотвращало увеличение проницаемости барьера, что свидетельствует об участии кислородных радикалов в функциональных повреждениях барьера. Добавление растворов химически синтезированной "N0 и донора 'N0, Б-нитрозопенициламина, во время гипоксии/реоксигенации позволяло предотвратить увеличение проницаемости барьера и ингибировало перекисное окисление липидов. Таким образом, 'N0 является эффективным антиоксидантом и предотвращает повреждения гематоэнцефалического барьера при окислительном стрессе. Полученные данные могут использоваться для развития подходов в превентивной терапии осложнений связанных с нарушениями гематоэнцефалического барьера кислородными радикалами.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Утепбергенов, Дархан Ирбулатович

Выводы

1. Заключение нитронилнитроксильных радикалов в липосомы защищает радикалы от восстановления в биологических образцах с сохранением способности к спиновому захвату окиси азота. Это позволяет применять нитронилнитроксильные радикалы в качестве акцепторов окиси азота в биологических системах.

2. С помощью спинового захвата нитронилнитроксильными радикалами показано, что производные 3,4-дигидро-1,2-диазет 1,2 диоксида (диазетины) распадаются с выделением окиси азота, измерены соответствующие константы скорости.

3. Обнаружено, что галоген- и нитрозамещённые диазетины реагируют с тиолами. Окись азота, тиильный и супероксидный радикалы являются продуктами реакции. Исследованы кинетические особенности реакции диазетинов с тиолами. Предложен кинетический механизм этой реакции.

4. Были получены экспериментальные данные свидетельствующие о том, что реакция с тиолами служит основным источником окиси азота при метаболизме галоген-замещённых диазетинов в биологических системах и является основой механизма расширения сосудов диазетинами.

5. На клеточной модели гематоэнцефалического барьера показано, что окись азота ингибирует как перекисное окисление липидов, так и увеличение проницаемости гематоэнцефалического барьера в условиях гипоксии/реоксигенации, то есть защищает барьер от повреждающих эффектов окислительного стресса на молекулярном и функциональном уровне.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Утепбергенов, Дархан Ирбулатович, Новосибирск

1. Белушкина, Н.Н., Григорьев, Н.Б. Северина, И.С. (1994). Ингибирование агрегации тромбоцитов человека новым классом активаторов растворимой гуанилат-циклаы генерирующих оксид азота. Биохимия, 59, 1689-97.

2. Володарский, Л.Б. и Тихонова, Л.А. (1975). Образование фуроксанов и 1,2-диазетидин-1,2-диоксидов при окислении а-гидроксиламинов. Изв. Сиб. Отд. Акад. Наук СССР, сер. Хим., 1, 103-6.

3. Володарский, Л.Б. и Тихонова, Л.А. (1977). Свойства 3-бромо-1,2-диазетидин-1,2-диоксидов. Хим. Гетероцикл. Соед., 6, 748-52.

4. Ряпосова, И.К. Григорьев, Н.Б. Северина, И.С. (1994). Новый класс активаторов растворимой гуанилат-циклаы генерирующих оксид азота. Биохимия, 59, 537-42.

5. Akaike, Т. and Maeda. Н. (1996). Quantitation of nitric oxide using 2-phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-l-oxyl 3-oxide (PTIO). Methods Enzymol., 268, 211-21.

6. Ames, B.N. (1989). Endogenous oxidative DNA damage, aging, and cancer. Free Radic. Res. Commun., 7, 121-8.

7. Anggard, E. (1994) Nitric oxide: mediator, murderer, and medicine. Lancet. 343, 1199206.

8. Aurell, A., Rosengren, L.E., Karlsson, В., Olsson, J.E., Zbornikova, V., and Haglid, K.G. (1991). Determination of S-100 and glial fibrillary acidic protein concentrations in cerebrospinal fluid after brain infarction. Stroke. 22, 1254-8.

9. Beckman, J.S., Beckman, T.W., Chen, J., Marshall, P.A. and Freeman, B.A. (1990). Apparent hydroxyl radical production by peroxynitrite: implications for endothelial injury from nitric oxide and superoxide. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87, 1620-4.

10. Betz, A.L. (1993). Oxygen free radicals and the brain microvasculature. In: Blood-brain barrier, Ed. Pardridge, W.M. pp. 302-21. New-York: Raven Press Ltd.

11. Blasig I.E., Mertsch, K., Ladhoff, A. and Grune, T. (1994). Lipid peroxidation and lipofuscin granula in brain endothelial cell cultures during reoxygenation. Ann. N. Y. Acad. Sci., 738, 374-7.

12. Bonner, F.T. and Stedman, G. (1996). The chemistry of nitric oxide and redox-related species. In: Methods in nitric oxide research, eds. Feelisch, M. and Stamler, J.S. pp. 310. Chichester: John Willey & Sons Ltd.

13. Boswell, G.A. (1968). Reaction of nitrosyl fluoride and selected steroid enes. A new synthesis of 85-keto steroids. J. Org.Chem., 33, 3699-3713

14. Brenman, J.E. and Bredt, D.S. (1996). Nitric oxide signaling in the nervous system. Methods Enzymol., 269, 119-29.

15. Brien, J.F., McLaughlin, B.E., Nakatsu, K. and Marks, G.S. (1996). Chemiluminescence headspace-gas analysis for determination of nitric oxide formation in biological systems. Methods Enzymol., 268, 83-92.

16. Brune, B. Messmer, U.K. and Sandau, K. (1995). The role of nitric oxide in cell injury. Toxicol. Lett., 82-83, 233-7.

17. Buettner, G.R. (1987). Spin trapping: ESR parameters of spin adducts. Free Radic. Biol. Med., 3, 259-303.

18. Bunag, R.D. (1984). In: Handbook of Hypertension. Vol.4, ed. de Jong, W. pp. 1-12, Elsevier Scietific Publishers.

19. Butler, A.R. and Rhodes, P. (1997). Chemistry, analysis, and biological roles of S-nitrosothiols. Anal. Biochem., 249, 1-9.

20. Chi, O.Z., Wei, H.M., Sinha, A.K. and Weiss, H.R. (1994). Effects of inhibition of nitric oxide synthase on blood-brain barrier transport in focal cerebral ischemia. Pharmacology, 48, 367-73.

21. Christodoulou, D., Kudo, S., Cook, J.A., Krishna, M.C., Miles, A., Grisham, M.B. Murugesan, M., Ford, P.C. and Wink, D.A. (1996). Electrochemical methods for detection of nitric oxide. Methods Enzymol., 268, 69-83.

22. Clough-Helfman, C. Phillis, J.W. (1991). The free radical trapping agent N-tert.-butyl-alpha-phenylnitrone (PBN) attenuates cerebral ischaemic injury in gerbils. Free Radic. Res. Commun., 15, 177-86.

23. Dalkara, T., Yoshida, T., Irikura, K. and Moskowitz, M.A. (1994). Dual role of nitric oxide in focal cerebral ischemia. Neuropharmacology, 33, 1447-52.

24. Darley-Usmar, V. and Halliwell, B. (1996). Blood radicals: reactive nitrogen species, reactive oxygen species, transition metal ions, and the vascular system. Pharm. Res., 13, 649-62.

25. Darley-Usmar, V., Wiseman, H. and Halliwell, B. (1995). Nitric oxide and oxygen radicals: a question of balance. FEBS Lett., 369, 131-5.

26. Dawson, V.L. and Dawson, T.M. (1996). Nitric oxide neurotoxicity. J Chem Neuroanat., 10, 179-90.

27. Dehouck, M.-P., Dehouck, P., Schluep, C., Lemair, M. and Cecchelli, R. (1995). Drag transport to the brain: comparison between in vitro and in vivo models of the blood-brain barrier. Eur. J. Pharm. Sci., 3, 357-65.

28. Doyle, M.P. and Hoekstra, J.W. (1981). Oxidation of nitrogen oxides by bound dioxygen in hemoproteins. J. Inorg. Biochem., 14, 351-8.

29. Drapier, J.C., Pellat, C. and Henry, Y. (1991). Generation of EPR-detectable nitrosyl-iron complexes in tumor target cells cocultured with activated macrophages. J. Biol. Chem. 266, 10162-7.

30. Feelisch, M., Ostrowski, J. and Noack, E. (1989). On the mechanism of NO release from sydnonimines. J. Cardiovasc. Pharmacol., 14 (Suppl 11), S13-22.

31. Feelisch, M., te-Poel, M., Zamora, R., Deussen, A. and Moncada, S. (1994). Understanding the controversy over the identity of EDRF. Nature, 368, 62-5.

32. Feelisch, M. and Stamler, J.S. (1996). Donors of nitrogen oxides. In: Methods in nitric oxide research, eds. Feelisch, M. and Stamler, J.S. pp. 71-115. Chichester: John Willey & Sons Ltd.

33. Flavahan, N.A. (1992). Atherosclerosis or lipoprotein-induced endothelial dysfunction. Potential mechanisms underlying reduction in EDRF/nitric oxide activity. Circulation, 85, 1927-38.

34. Fukuto, J.M. and Mayer, J.S. (1996). The enzymology of notric oxide synthase. In: Methods in nitric oxide research, eds. Feelisch, M. and Stamler, J.S. pp. 147-60. Chichester: John Willey & Sons Ltd.

35. Fukuyama, S., Hirasawa, Y., Cox, D., Koda, S. and Kita, Y. (1995). Acceleration of nitric oxide (NO) release from FK409, a spontaneous NO releaser, in the presence of sulfhydryl-bearing compounds. Pharm. Res., 12, 1948-52.

36. Furchgott, R.F. and Zawadzki, J.V. (1980). The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature, 288, 373-6.

37. Gardner, P.R. and Fridovich, I. (1991). Superoxide sensitivity of the Escherichia coli aconitase J. Biol Chem., 266, 19328-33.

38. Gatti, R.M., Radi, R. and Augusto, O. (1994). Peroxynitrite-mediated oxidation of albumin to the protein-thiyl free radical. FEBSLett., 348, 287-90.

39. Giese, H., Mertsch, K., Blasig, I.E. (1995). Effect of MK-801 and U83836E on a porcine brain capillary endothelial cell barrier during hypoxia. Neurosci. Lett, 191, 16972.

40. Goss, S.P., Hogg, N. and Kalyanaraman, B. (1995). The antioxidant effect of spermine NONOate in human low-density lipoprotein. Chem. Res. Toxicol., 8, 800-6.

41. Granger, D.N. and Korthuis, R.J. (1995). Physiologic mechanisms of postischemic tissue injury. Annu. Rev. Physiol., 57, 311-32.

42. Granger, D.N., Rutili, G. and McCord, J.M. (1981). Superoxide radicals in feline intestinal ischemia. Gastroenterology, 81, 22-9.

43. Haddad, I.Y., Ischiropoulos, H., Holm, B.A., Beckman, J.S., Baker, J.R. and Matalon, S. (1993). Mechanisms of peroxynitrite-induced injury to pulmonary surfactants. Am. J. Physiol., 265, L555-64.

44. Hanson, S.R., Hutsell, T.C., Keefer, L.K., Mooradian, D.L. and Smith, D.J. (1995). Nitric oxide donors: a continuing opportunity in drug design. Adv. Pharmacol., 34, 38398.

45. Hayashi, K., Noguchi, N. and Niki, E. (1995). Action of nitric oxide as an antioxidant against oxidation of soybean phosphatidylcholine liposomal membranes. FEBS Lett., 370, 37-40.

46. Hibbs, J.B. Taintor, R.R., Vavrin, Z. and Rachlin, E.M. (1988). Nitric oxide: a cytotoxic activated macrophage effector molecule. Biochem. Biophys. Res. Commun., 157, 87-94.

47. Hogg, N., Kalyanaraman, B., Joseph, J., Struck, A. and Parthasarathy, S. (1993). Inhibition of low-density lipoprotein oxidation by nitric oxide. Potential role in atherogenesis. FEBS Lett., 334, 170-4.

48. Hogg, N., Singh, R.J., Joseph, J., Neese, F. and Kalyanaraman B. (1995a). Reactions of nitric oxide with nitronyl nitroxides and oxygen: prediction of nitrite and nitrate formation by kinetic simulation. Free Radic. Res., 22, 47-56.

49. Hogg, N., Struck, A., Goss, S.P., Santanam, N., Joseph, J., Parthasarathy, S. and Kalyanaraman, B. (1995b). Inhibition of macrophage-dependent low density lipoprotein oxidation by nitric-oxide donors. J. Lipid. Res., 36, 1756-62.

50. Holscher, C. (1997). Nitric oxide, the enigmatic neuronal messenger: its role in synaptic plasticity. Trends Neurosci., 20, 298-303.

51. Huang, P.L., Huang, Z., Mashimo, H., Bloch, K.D., Moskowitz, M.A., Bevan, J.A. and Fishman, M.C. (1995). Hypertension in mice lacking the gene for endothelial nitric oxide synthase. Nature, 377, 239-42.

52. Huang, Z, Huang, P.L., Panahian, N., Dalkara, T., Fishman, M.C. and Moskowitz, M.A. (1994). Effects of cerebral ischemia in mice deficient in neuronal nitric oxide synthase. Science, 265, 1883-5.

53. Ignarro, L.J., Byrns, R.E., Buga, G.M. and Wood, K.S. (1987). Endothelium-derived relaxing factor from pulmonary artery and vein possesses pharmacologic and chemical properties identical to those of nitric oxide radical. Circ. Res., 866-79.

54. Ischiropoulos, H., Zhu, L., Chen, J., Tsai, M., Martin, J.C., Smith, C.D. and Beckman, J.S. (1992). Peroxynitrite-mediated tyrosine nitration catalyzed by superoxide dismutase. Arch. Biochem. Biophys., 298, 431-7.

55. Janigro, D., West, G.A., Nguyen, T.S.and Winn, H.R. (1994). Regulation of blood-brain barrier endothelial cells by nitric oxide. Circ. Res., 75, 528-38.

56. Joseph, J., Kalyanaraman, B. and Hyde, J.S. (1993). Trapping of nitric oxide by nitronyl nitroxides: an electron spin resonance investigation. Biochem. Biophys. Res. Commun., 192, 926-34.

57. Kalyanaraman, B. (1996). Detection of nitric oxide by electron spin resonance in chemical, photochemical, cellular, physiological, and pathophysiological systems. Methods Enzymol., 268, 168-87.

58. Keefer, L.K., Nims, R.W., Davies, K.M. and Wink, D A. (1996). "NONOates" (1-substituted diazen-l-ium-l,2-diolates) as nitric oxide donors: convenient nitric oxide dosage forms. Methods Enzymol., 268, 281-93.

59. Kimelberg, H.K. (1995). Current concepts of brain edema. Review of laboratory investigations. J. Neurosurg., 83, 1051-9.

60. Kinouchi, H., Epstein. C,J., Mizui, T., Carlson, E., Chen, S.F. and Chan, P.H. (1991). Attenuation of focal cerebral ischemic injury in transgenic mice overexpressing CuZn superoxide dismutase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88, 11158-62.

61. Kishnani, N.S. and Fung, H.L. (1996). Nitric oxide generation from pharmacological nitric oxide donors. Methods Enzymol., 268, 259-65.

62. Kissner, R., Nauser, T., Bugnon, P. Lye, P.G. and Koppenol, W.H. (1997). Formation and properties of peroxynitrite as studied by laser flash photolysis, high-pressure stopped-flow technique, and pulse radiolysis. Chem. Res. Toxicol., 10, 1285-92.

63. Kohno, M. Masumizu, T. and Mori. A. (1995). ESR demonstration of nitric oxide production from nitroglycerin and sodium nitrite in the blood of rats. Free Radic. Biol. Med., 18, 451-7.

64. Koppenol, W.H. and Traynham, J.G. (1996). Say NO to nitric oxide: nomenclature for nitrogen- and oxygen-containing compounds. Methods Enzymol., 268, 3-7.

65. Kosaka, H., Watanabe, M., Yoshihara, H., Harada, N. and Shiga, T. (1992). Detection of nitric oxide production in lipopolysaccharide-treated rats by ESR using carbon monoxide hemoglobin. Biochem. Biophys. Res. Commun., 184, 1119-24.

66. Lancaster, J.R. and Hibbs, J.B. (1990) EPR demonstration of iron-nitrosyl complex formation by cytotoxic activated macrophages. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87, 1223-7

67. Lowry, O.H., Rosenbrough, N.J. Farr, A.L. and Randall, R.J. (1951). Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 193, 265-75.

68. Lincoln, T.M., Cornwell, T.L., Komalavilas, P. and Boerth, N. (1996). Cyclic GMP-dependent protein kinase in nitric oxide signaling. Methods Enzymol., 269, 149-66.

69. Lindberg, L., Olsson, A.K., Anderson, K. and Jogi, P. (1998). Serum S-100 protein levels after pediatric cardiac operations: a possible new marker for postperfusion cerebral injury. J. Thorac. Cardiovasc Surg., 116, 281-5.

70. Liochev, S.L. (1996). The role of iron-sulfur clusters in in vivo hydroxyl radical production. Free Radic.,Res., 25, 369-84.

71. Liu, T.H., Beckman, J.S., Freeman, B.A., Hogan, E.L. and Hsu, C.Y. (1989). Polyethylene glycol-conjugated superoxide dismutase and catalase reduce ischemic brain injury. Am. J. Physiol., 256, H589-93.

72. Lum, H., Barr, D.A., Shaffer, J.R., Gordon, J., Ezrin, A.M., Malik, A.B. (1992). Reoxygenation of endothelial cells increases permeability by oxidant-dependent mechanisms. Circ. Res, 70, 991-8.

73. Malinski, T., Mesaros, S. Tomboulian, P. (1996). Nitric oxide measurement using electrochemical methods. Methods Enzymol., 268, 58-69.

74. Marietta, M.A. (1994). Nitric oxide synthase: aspects concerning structure and catalysis. Cell, 78, 927-30.

75. Marietta, M.A., Hurshman, A.R. and Rusche, K.M. (1998). Catalysis by nitric oxide synthase. Curr. Opin. Chem. Biol., 2, 656-63.

76. X). Markel, A.L. (1992). In: Genetic Hypertension, ed., Sassard J. pp. 218-405, Colloque INSERM/John Libbey Eurotext Ltd.

77. Matheis. G., Sherman, M.P., Buckberg, G.D., Haybron, D.M., Young, H.H. and Ignarro, L.J. (1992). Role of L-arginine-nitric oxide pathway in myocardial reoxygenation injury. Am. J. Physiol, 262, H616-20.

78. Mayer, B. and Hemmens B. (1997). Biosynthesis and action of nitric oxide in mammalian cells. TiBS., 22, 477-81.

79. Mayhan, W.G. (1995). Role of nitric oxide in disruption of the blood-brain barrier during acute hypertension. Brain Res., 686, 99-103.

80. U. McCarthy, K.D. and deVellis, J. (1980). Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J.Cell.Biol., 85, 890-902.

81. Meister, A. and Anderson, M.E. (1983). Glutathione. Annu. Rev. Biochem., 52, 711-60.

82. Mertsch K., Grune, T., Siems, W,G., Ladhoff, A., Saupe, N. and Blasig, I.E. (1995). Hypoxia and reoxygenation of brain endothelial cells in vitro: a comparison of biochemical and morphological response. Cell. Mol. Biol., 41, 243-53.

83. Mertsch, K.,. Haseloff, R.F. and Blasig I.E. (1997). Investigation of radical scavengers using an in vitro model of blood-brain barrier. Dev. Anim. Vet. Sci., 27, 881-6.

84. Miles, A.M., Bohle, D.S., Glassbrenner, P.A., Hansert, B., Wink, D.A. and Grisham, M.B. (1996). Modulation of superoxide-dependent oxidation and hydroxylation reactions by nitric oxide. J. Biol. Chem., 271, 40-7.

85. Miller, R.A. and Britigan, B.E. (1995). The formation and biologic significance of phagocyte-derived oxidants. J. Investig. Med., 43, 39-49.

86. Mittal, C.K. (1993). Nitric oxide synthase: involvement of oxygen radicals in conversion of L-arginine to nitric oxide. Biochem. Biophys. Res. Commun., 193, 126-32.

87. Mulsch, A., Mordvintcev, P.I., Vanin, A.F. and Busse, R. (1993). Formation and release of dinitrosyl iron complexes by endothelial cells. Biochem. Biophys. Res. Commun., 196, 1303-8.

88. Murphy, M.E. and Noack, E. (1994). Nitric oxide assay using hemoglobin method. Method in Enzymol., 233, 240-6.

89. Papapetroulos, A., Marczin, N., Mora, G., Milici, A., Murad, F., and Catravas, J.D. (1995). Regulation of vascular smooth muscle soluble guanylate cyclase activity, mRNA, and protein levels by cAMP-elevating agents. Hypertension, 26, 696-704.

90. Pacelli, R., Wink, D.A., Cook, J.A., Krishna, M.C., DeGraff, W., Friedman, N., Tsokos, M., Samuni A., Mitchell, J.B. (1995). Nitric oxide potentiates hydrogen peroxide-induced killing of Escherichia coli. J. Exp. Med, 182, 1469-79.

91. Padmaja, S. and Huie, R.E. (1993). The reaction of nitric oxide with organic peroxyl radicals. Biochem. Biophys. Res. Commun., 195, 539-44.

92. Palluy, O., Bonne, C., Modat, G. (1991). Hypoxia/reoxygenation alters endothelial prostacyclin synthesis protection by superoxide dismutase. Free Rad. Biol. Med., 11, 269-75.

93. Papapetropoulos, A., Marczin, N., Mora, G., Milici, A., Murad, F. and Catravas, J.D. (1995). Regulation of vascular smooth muscle soluble guanylate cyclase activity, mRNA, and protein levels by cAMP-elevating agents Hypertension. 26, 696-704.

94. Parks, D.A. and Granger, D.N. (1986). Contributions of ischemia and reperfusion to mucosal lesion formation. Am. J. Physiol., 250, G749-53.

95. Patel, R.P. and Darley-Usmar, V.M. (1996). Using peroxynitrite as oxidant with low-density lipoprotein. Methods Enzymol., 269 375-84.

96. Plateel, M., Dehouck, M.P., Torpier, G., Cecchelli, R., Teissier, E. (1995). Hypoxia increases the susceptibility to oxidant stress and the permeability of the blood-brain barrier endothelial cell monolayer. JNeurochem., 65, 2138-45.

97. Pua, H.L. and Bissonnette, B. (1998). Cerebral physiology in paediatric cardiopulmonary bypass. Can. J.Anaesth., 45, 960-78.

98. Raabe, A., Menon, D.K., Gupta, S., Czosnyka, M. and Pickard, J.D. (1998). Jugular venous and arterial concentrations of serum S-100B protein in patients with severe head injury: a pilot study. J.Neurol. Neurosurg, Psychiatry., 65, 930-2.

99. Radi, R., Beckman, J.S., Bush, K.M. and Freeman, B.A. (1991). Peroxynitrite-induced membrane lipid peroxidation: the cytotoxic potential of superoxide and nitric oxide. Arch. Biochem. Biophys., 288, 481-7.

100. Radomski, M.W., Rees, D.D., Dutra, A. and Moncada, S. (1992) S-nitroso-glutathione inhibits platelet activation in vitro and in vivo. Br. J. Pharmacol., 745-9.

101. Radomski, M.W., Zakar, T. and Salas, E. (1996) Nitric oxide in platelets. Methods Enzymol., 269, 88-107.

102. Raff, T. van der Giet, M., Endemann, D., Wiederholt, T. and Paul, M. (1997). Design and testing of beta-actin primers for RT-PCR that do not co-amplify processed pseudogenes. Biotechniques. 23, 456-60.

103. Rees, D.D. Palmer, R.M. and Moncada, S. (1989). Role of endothelium-derived nitric oxide in the regulation of blood pressure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86, 3375-8.

104. Reese, T.S. and Karnovski, M.J. (1967). Fine structural localization of a blood-brain barrier exogenous peroxidase. J.Cell. Biol., 34, 207-17.

105. Rossaint, R., Gerlach, H. and Falke, K.J. (1994). Inhalation of nitric oxide~a new approach in severe ARDS. Eur J Anaesthesiol., 11, 43-51.

106. Rubbo, H., Darley-Usmar, V. and Freeman, B.A. (1996). Nitric oxide regulation of tissue free radical injury. Chem. Res. Toxicol., 9, 809-20.

107. Rubbo, H. and Freeman, B.A. (1996). Nitric oxide regulation of lipid oxidation reactions: formation and analysis of nitrogen-containing oxidized lipid derivatives. Methods Enzymol., 269, 385-94.

108. Rubin, L.L. Hall, D.E. Porter, S., Barbu, K., Cannon, C., Horner, H.C. Janatpour, M., Liaw, C.W., Manning, K., Morales, J. (1991). A cell culture model of the blood-brain barrier. J. Cell. Biol., 115, 1725-35.

109. Schleien, C.L., Eberle, B., Shaffiier, D.H., Koehler, R.C. and Traystman, R.J. (1994). Reduced blood-brain barrier permeability after cardiac arrest by conjugated superoxide dismutase and catalase in piglets. Stroke, 25, 1830-4, discussion 1834-5.

110. Schlueter, K.D., Weber, M., Schraven, E. and Piper, H.M. (1994). NO donor SIN-1 protects against reoxygenation-induced cardiomyocyte injury by a dual action. Am. J. Physiol., 267, H1461-6.

111. Severina, I.S., Belushkina, N.N. and Grigoryev, N.B. (1994). Inhibition of ADP-induced human platelet aggregation by a new class of soluble guanylate cyclase activators capable of nitric oxide generation. Biochem. Mol. Biol. Int., 33, 957-67.

112. Siegfried, M.R., Carey, C., Ma, X.L. and Lefer, A.M. (1992). Beneficial effects of SPM-5185, a cysteine-containing NO donor in myocardial ischemia-reperfusion. Am. J. Physiol., 263, H771-7.

113. Singel, D,J. and Lancaster, J.R. (1996). Electron Paramagnetic resonance spectroscopy and nitric oxide biology. In: Methods in nitric oxide research, eds. Feelisch, M. and Stamler, J.S. pp. 341-56. Chichester: John Willey & Sons Ltd.

114. Smith, J.K. Carden, D.L. and Korthuis, R.J. (1989). Role of xanthine oxidase in postischemic microvascular injury in skeletal muscle. Am. J. Physiol., 257, H1782-9.

115. Siesjo, B.K. (1992). Pathophysiology and treatment of focal cerebral ischemia. Part II: Mechanisms of damage and treatment. J. Neurosurg. 77, 337-54.

116. Sundaresan, M., Yu, Z.X., Ferrans, V.J., Irani, K. and Finkel, T. (1995). Requirement for generation of H202 for platelet-derived growth factor signal transduction. Science, 270, 296-9.

117. Suzuki, Y.J., Forman, H.J. and Sevanian, A. (1997). Oxidants as stimulators of signal transduction. Free Radic. Biol. Med., 22, 269-85.

118. Szoka, F. Jr. and Papahadjopoulos, D. (1978). Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75, 4194-8.

119. Takakura, Y., Audus, K.L. and Borchardt, R.T. (1991). Blood-brain barrier: transport studies in isolated brain capillaries and in cultured brain endothelial cells. Adv. Pharmacol., 22, 137-65.

120. Tao-Cheng, J.H., Nagy, Z. and Brightman, M.W. (1987). Tight junctions of brain endothelium in vitro are enhanced by astroglia. J. Neurosci., 7, 3293-9.

121. Terada, L.S. (1996). Hypoxia-reoxygenation increases 02~' efflux which injures endothelial cells by an extracellular mechanism. Am. J. Physiol., 270, H945-50.

122. Ullman, E. F. and Singh, P. (1972). 3,3,4,4-Tetramethyl-l,2-diazetine 1,2,-dioxyde, a useful low-energy triplet quencher. J. Amer. Chem. Soc., 94, 5077-8.

123. Uyama, O., Shiratsuki, N., Matsuyama, T., Nakanishi, T., Matsumoto, Y., Yamada, T., Narita, M., and Sugita, M. (1990). Protective effects of superoxide dismutase on acute reperfusion injury of gerbil brain. Free Radic. Biol. Med., 8, 265-8.

124. Waaben, J. Sorensen, H.R., Andersen, U.L., Gefke, K., Lund, J., Aggestrup, S., Laursen, H. and Gjedde, A. (1994). Brain damage following low flow cardiopulmonary bypass in pigs. Eur. J. Cardiothorac. Surg., 8, 91-6.

125. Wang, X. and Robinson, P.J. (1997). Cyclic GMP-dependent protein kinase and cellular signaling in the nervous system. J. Neurochem., 68, 443-56.

126. Wink, D.A., Cook, J.A., Pacelli, R., Liebmann, J., Krishna, M.C. and Mitchell, J.B. (1995b). Nitric oxide (NO) protects against cellular damage by reactive oxygen species. Toxicol. Lett., 82-83, 221-6.

127. Wink, D.A., Grisham, M.B., Mitchell, J.B. and Ford, P.C. (1996). Direct and indirect effects of nitric oxide in chemical reactions relevant to biology. Methods Enzymol., 268, 12-31.

128. Winterbourn, C.C. and Metodiewa, D. (1995). Reaction of superoxide with glutathione and other thiols. Methods Enzymol., 251, 81-6.

129. Wong, S.H., Knight, J.A., Hopfer, S.M., Zaharia, O., Leach, C.N., Jr. and Sunderman, F.W. Jr. (1987). Lipoperoxides in plasma as measured by liquid-chromatographic separation of malondialdehyde-thiobarbituric acid adduct. Clin. Chem., 33, 214-20.

130. Yu, B,P, (1994). Cellular defenses against damage from reactive oxygen species. Physiol. Rev., 74, 139-62.

131. Zweier, J.L., Broderick, R., Kuppusamy, P., Thompson-Gorman, S. and Lutty, G.A. (1994). Determination of the mechanism of free radical generation in human aortic endothelial cells exposed to anoxia and reoxygenation. J. Biol. Chem., 269, 24156-62.