Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование зараженности членистоногих переносчиков дельты Волги и Волго-Ахтубинской поймы вирусом Западного Нила и молекулярно-генетическая характеристика штаммов LEIV-Ast00-986-human и LEIV-Vlg99-27889-human ВЗН

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование зараженности членистоногих переносчиков дельты Волги и Волго-Ахтубинской поймы вирусом Западного Нила и молекулярно-генетическая характеристика штаммов LEIV-Ast00-986-human и LEIV-Vlg99-27889-human ВЗН"

На правах рукописи

Воронина Анна Георгиевна

ИССЛЕДОВАНИЕ ЗАРАЖЕННОСТИ ЧЛЕНИСТОНОГИХ ПЕРЕНОСЧИКОВ ДЕЛЬТЫ ВОЛГИ И ВОЛГО-АХТУБИНСКОЙ ПОЙМЫ ВИРУСОМ ЗАПДНОГО НИЛА И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ ЬЕ1У-Ай00- 986-Ьшпап И ЬЕ1У-У^99-27889-Ь ишап ВЗН.

03 00 03 -молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в НИИ Вирусологии имени Д И Ивановского Российской Академии Медицинских наук

Научный руководитель

Кандидат биологических наук Алексей Геннадьевич Прилипов

Официальные оппоненты

Доктор биологических наук, профессор Мансур Мухамедович Гараев Доктор биологических наук, профессор Вадим Викторович Месянжинов

Ведущая организация НИИ эпидемиологии и микробиологии им Н Ф Гамалеи РАМН

Защита состоится « 20 » июня 2005 г в 12 00 часов на заседании Специализированного совета Д 001 020 01 при Институте Вирусологии им Д И Ивановского РАМН по адресу 123987, Москва, ул Гамалеи, д 16

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Вирусологии им Д И Ивановского РАМН

Автореферат разослан «20» мая 2005 г

Ученый секретарь диссертационного совета - д м н Н П Косякова

looGzi 67//

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы.

Эпидемические вспышки лихорадки Западного Нила (JI3H) различного масштаба и интенсивности регистрируются практически каждый год в странах Африки и Ближнего Востока, реже в Европе и Индии, иногда в Средней Азии (Львов, 2000; Murgue et al., 2002).

Обширная эпидемическая вспышка JI3H возникла в июле-октябре 1996 г в Юго-Восточной Румынии в южном течении Дуная. Заболеваемость достигла 12,4 на 100 тыс и охватила 7 областей, включая Бухарест

Вспышки лихорадки Западного Нила описывались в Израиле в период с 1950 по 1970 гг, однако продолжающиеся по сей день серологические и эпидемиологические исследования показывают, что циркуляция вируса в этом регионе продолжается (Hindiyeh, 2001)

Эпидемическая вспышка JI3H совершенно неожиданно возникла в конце июля-сентября 1999г с пиком во второй половине августа в Нью-Йорке и его окрестностях (Lancotti et al., 1999). В общей сложности выявлено 56 случаев (31 подтвержден лабораторно), из которых 7 с летальным исходом (12,5%) Вирус обнаружен в комарах Culex pipiens, отловленных в сентябре-октябре в Нью-Йорке, и округах Нассау и Суффолк, а с помощью ПЦР положительный результат получен с комарами Culex spp и Aedes vexans, собранных в середине сентября в округе Хадсон, Нью-Джерси С помощью ПЦР положительные результаты получены при обследовании мозга погибших птиц из Нью-Йорка (Бронис, Бруклин, Манхэтген, Квинс, о Статен, а также из округов Нассау,Оранж,Рокленд,Саратога,Суффолк и Вестчестер), в штате Нью-Джерси (12 округов), в штате Коннектикут (три округа) (Ebel, 2001) (Lanciotti, 2002)

Начиная с 1999 г существенно обострилась эпидемическая ситуация по лихорадке Западного Нила (JI3H) на юге России (Lvov, 2004).

Возникшие в последние 4 года на юге России вспышки лихорадки Западного Нила, свидетельствуют о приоритетной значимости проблемы новых и возвращающихся инфекций в системе биобезопасности (Львов, 2000).

В связи с широким распространением заболевания возникает необходимость исследования причин Все это обусловило необходимость разработки программы комплексного изучения природных и синантропных очагов инфекции

Инфекция ЛЗН относится к природно-очаговым зоонозам поскольку имеет выраженный очаговый характер (Львов и др, 1989) Природная циркуляция вируса ЗН в очаге происходит в системе «птицы - комары -птицы», при этом комары также эффективно заражают и других теплокровных, в том числе человека. Зараженность вирусом ЗН комаров является важным показателем активности природного очага и позволяет прогнозировать развитие эпидемической ситуации

Молекулярные механизмы патогенеза вируса ЗН остаются малоизученными Для улучшения понимания этих механизмов является необходимой работа по изучению природных вариантов вируса и их сравнению друг с другом, что при наличии данных об инфекционности различных штаммов вируса, позволит предполагать о значимости тех или иных последовательностей в геноме вируса ЗН

Цель и задачи работы.

Целью данной работы явилась разработка молекулярно-биологических подходов к обследованию полевых материалов и оценка эпидемической ситуации распространенности вируса ЗН в дельте Волги и Волго-Ахтубинской пойме

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи Задачи.

- Определение полноразмерной нуклеотидной последовательности штаммов ЬЕ1У-АзЮ0-986-1штап и ЬЕГУ-У1§99-27889-Ьитап вируса ЗН, выделенных во время эпидемических вспышек 1999г и 2000г., с целью использования этих данных при дизайне праймеров для ОТ-ПЦР диагностической тест-системы

- Разработка ОТ-ПЦР системы для чувствительной и специфичной детекции РНК вируса ЗН в биологических образцах

- С использованием разработанной ОТ-ПЦР системы исследовать пробы полевого материала (комары и клещи), собранные в местах вспышки ЛЗН (дельта Волги и Волго-Ахтубинская пойма в 2001-2004гг), на наличие в них РНК вируса Западного Нила, определение процента зараженности переносчиков

- Нуклеотидный анализ фрагментов геномов вируса ЗН из проб полевого материала На основании полученных нуклеотидных последовательностей с целью проведения филогенетического анализа и определения генетических характеристик выделенных штаммов вируса ЗН, циркулирующих в популяциях переносчиков в период вспышек 2001-2004гг

Положения, выносимые на защиту

- Полные нуклеотидные последовательности геномов штаммов вируса ЛЗН ЬЕ1У-АзЮ0-986-Ьитап и ЬЕ1У-У^99-27889-Ьитап.

- Разработка и оптимизация ОТ-ПЦР тест-системы для обнаружения РНК вируса ЗН в полевых образцах.

- Определение общего и видового процента зараженности вирусом ЗН комаров и клещей, обитающих в дельте Волги

- Типирование штаммов ЗН, циркулировавших среди переносчиков в период вспышек 2001-2004г с помощью филогенетического анализа фрагментов РНК

Научная новизна и практическая ценность работы.

В результате проведенной работы были определены полные нуклеотидные последовательности геномов двух штаммов вируса, выделенных на территории Астраханской и Волгоградской областей, предоставленных институтом вирусологии им Д И Ивановского

Созданная в процессе работы ОТ-ПЦР гест-система является высокочувствительной и достаточно проста в применении, что позволит использовать эту систему непосредственно в местах сбора полевого материала Разработанная тест-система способна детектировать РНК вируса ЗН, относящиеся ко всем четырем филогенетическим группам Таким образом это обеспечило максимально возможную, на данный момент, универсальность тест - системы Разработанная тест - система «Способ обнаружения вируса лихорадки Западного Нила» защищена патентом РФ №2199589 от 27 02 2003 (авторы изобретения' Воронина АГ, Прилипов А Г , Львов Д К , Самохвалов Е И , Садыкова Г К , Альховский С В ,)

Впервые в России проведено масштабное исследование зараженности вирусом ЗН членистоногих переносчиков в природных очагах дельты Волги и Волго - Ахтубинской поймы с использованием ПЦР Всего обследовано 284308 комаров и 7303 клещей, собранных как в диких, так и в антропогенных биоценозах за 2001-2004гг Согласно полученным результатам, средний уровень зараженности вирусом ЗН за 2001-2004гг среди комаров - 0,028%, среди клещей - 0,74% Также, в результате филогенетического анализа положительных ПЦР-фрагментов, были сделаны выводы относительно групповой принадлежности обнаруженных штаммов вируса ЗН Нами было определено, что на обследуемой территории

циркулировали 79 штаммов (91,86%) относящихся к 1-му генотипу, 4 штамма (4,65%) - ко II генотипу, ни одного к III, и 3 штамма (3,49%) относятся к IV генотипу

Апробация работы.

Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на совместном заседании отдела молекулярной вирусологии и апробационного совета ГУ НИИ вирусологии им Д И Ивановского РАМН 18 мая 2005 г. в 12 00 часов.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 3 статьи, тезисы 2-х докладов в материалах российских конференций, в йепВапк депонированы полноразмерные нуклеотидные последовательности 2-х штаммов вируса ЗН, получен патент «Способ обнаружения вируса лихорадки Западного Ниша» РФ №2199589 от 27 02 2003 (авторы изобретения Воронина А Г , Прилипов А Г , Львов Д К , Самохвалов Е И , Садыкова Г К , Альховский С В ,)

Структура и объем диссертации.

Материалы диссертации изложены на 113 страницах машинописного текста Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы, включающего в себя 135 источников Работа иллюстрирована 14 таблицами и 13 рисунками

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Исследуемые штаммы АбЮО- 98б-1штап и Г.Е1У-У1е99-27889-Ьитап. выделенные во время эпидемических вспышек 1999г и 2000г, были получены из коллекции института Вирусологии им Д И Ивановского

Полевой материал был собран в летне-осенний период 2001-2004 г г в дельте Волги и Волго-Ахтубинской пойме Сбор комаров осуществлялся с

помощью автоматического заплечного аспиратора и световых ловушек Хранили и транспортировали собранные пробы в жидком азоте Для дальнейшего обследования пулы комаров гомогенизировали в 199 среде с добавлением BSA Затем пробы помещали на -70°С Каждый пул содержал 4-100 комаров.

Исследование зараженности вирусом ЗН собранного полевого материала проводилось с использованием ОТ-ПЦР для выявления вирусной РНК

Подбор праймеров для детекции вируса ЗН методом ОТ-ПЦР проводили с использованием нуклеотидных последовательностей различных изолятов вируса ЗН, доступных в базе DDBJ/EMBL/GenBank К началу проведения работ в доступных нам базах данных были обнаружены четыре полноразмерные нуклеотидные последовательности' Кунджин MRM61C (GenBank #D00246), WN-Wengler (GenBank #M 12294) и два штамма HNY-99 (GenBank #AF260869), NY99-flam (GenBank #AF196835) (Табл 1) Также использовались полноразмерные последовательности штаммов AstOO- 986-human и LEIV-Vlg99-27889-human, полученные нами в ходе работы

Таблица 1. Полноразмерные нуклеотидные последовательности вируса ЗН, опубликованные в базе данных DDBJ/EMBL/GenBank.

Название Год изоляции Материал Место изоляции GenBank Ш

WNFCG 1957 Человек Уганда M12294

KUNMRM61C 1960 Culex annulirostris Австралия D00246

HNY-99 1999 Человек США AF260969

NY99-flam 1999 Phoenicopterus chilensis (Chilean flamingo)_ США AF196835

При амплификации и структурном анализе исследуемых штаммов АэЮО- 986-Ьитап и ЬЕ1У-У^99-27889-1штап мы использовали праймеры,

подобранные на основе анализа полноразмерных нуклеотидных последовательностей, имевшихся в базе данных DDBJ/EMBL/GenBank. Определение нуклеот идной последовательности выделенных фрагментов производили на автоматическом секвенаторе фирмы "Applied Biosystems" согласно инструкциям фирмы - изготовителя При работе с нуклеотидными последовательностями использовали пакет программ "DNASTAR V 3.12", производства "Lasergen Inc."(Madison, WI). Подбор праймеров проводили с использованием программ "Megalign" и "Amplify" Сравнение нуклеотидных последовательностей и построение филогенетических деревьев проводили методом ClustalW с помощью программы "Megalign".

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

1. Определение полноразмерных нуклеотидных последовательностей геномов штаммов вируса ЛЗН AstOO- 986-human и LEIV-Vlg99-27889-human.

Нами были определены полноразмерные нуклеотидные последовательности штаммов вируса AstOO- 986-human и LEIV-Vlg99-27889-human, выделенные во время эпидемических вспышек 1999г и 2000г в Волгоградской и Астраханской областях Для проведения этих исследований необходимым условием явился подбор оптимальных праймеров для амплификации фрагментов генома вируса ЗН С этой целью было проведено сравнение полноразмерных нуклеотидных последовательностей штаммов вируса ЗН, опубликованных в базе данных DDBJ/EMBL/GenBank, с использованием пакета компьютерных программ DNASTAR К началу нашего исследования полноразмерные нуклеотидные последовательности были известны только для четырех изолятов вируса ЗН ■ Кунджин MRM61C (GenBank #D00246), WN-Wengler (GenBank #M 12294) и двух штаммов HNY-99 (GenBank #AF260869), NY99-flam (GenBank #AF196835), выделенных в 1999 г в Нью-Йорке (Табл 1) Также нужно

отметить, что в базе данных не было опубликовано ни одного отечественного изолята.

В результате проведенного анализа были определены участки нуклеотидной последовательности, которые соответствовали сформулированной задаче и отличались значительной степенью гомологии (до 100 %) среди всех четырех штаммов вируса ЗН Выбранные консервативные участки в 3' области генома и в первой трети 5" конца использовали для конструирования праймеров В результате были выбраны праймеры (3594R, 10960R), которые мы использовали для получения кДНК Полученные препараты кДНК хранили на -70°С в отдельных аликвотах Препараты кДНК использовали в реакциях ПЦР с экспериментальными праймерами, комплементарными наиболее консервативным областям генома вируса ЗН Таким образом было получено 11 (для штамма LEIV-Vlg99-27889-human) и 9 (для штамма LEIV-AstOO-986-human) перекрывающихся фрагментов генома вируса ЗН, которые содержали полную нуклеотидную последовательность генома (Рис 1) На рисунке отражена стратегия определения полной нуклеотидной последовательности наших штаммов В центре рисунка - схематичное расположение геномной вирусной РЖ (11 kb) Стрелки указывают расположение на геноме праймеров для получения кДНК В верхней части рисунка расположены фрагменты, полученные для штамма LEIV-AstOO-986-human, в нижней части рисунка расположены фрагменты, полученные для штамма LEIV-Vlg99-27889-human Пунктиром изображены фрагменты, полученные при амплификации кДНК, синтезированной с праймера 3594R Сплошной линией изображены фрагменты, полученные при амплификации кДНК, синтезированной с праймера 10960R Над фрагментами обозначены номера праймеров, использованных при амплификации

В результате этих экспериментов впервые были получены полные нуклеотидные последовательности геномов вирусов, выделенных на территории нашей страны (accession AY277252, AY278441).

Полученные нуклеотидные последовательности мы использовали для определения филогенетического положения этих штаммов С этой целью было построено филогенетическое древо (методом С1шЫ\*/ с помощью программы с известными к тому моменту 13

последовательностями Как следует из представленных данных (Рис.2) оба российских штамма принадлежат к I группе

Таким образом были получены полноразмерные нуклеотидные последовательности штаммов вируса АэЮО- 986-Ьишап и ЬЕ1У-У^99-27889-1штап, и эти данные в дальнейшем были использованы нами для дизайна праймеров для диагностической тест-системы

1Ш-АяЮ0-986-Ьитап

2Р

•Яг

ШШ_______9084Р

4616Р 6086«

2667?_______47071?

1124Р 32721?

2? 169Ш

6739Р

5793Р 68721?

__353«? сСМА369«

£-1-2-2-i-1-$-1-£-I

35361? 3367Я

68161?

5793Р 6872!?

2^________16901?

1124? 32721?

25®!:_______

ШУ-У1д99-27889-Ьштап

673«=

_4797(?

4616Р____60851?

558ЙЕ___________7524В вОЗбР

10 Ш+.

. 10796Г? Д091Ш

СОМА 10940Й

10337й

__________103371?

9084Р 10796Й

Рис. 1. Стратегия определения полной нуклеотидной последовательности штаммов вируса ЗН А.-?Ю0- 98б-1гитап и ЬЕ1У-Ук99-27889-1ттап ( пояснения в тексте )

г- Vlg27889 i-П- Vlg27924 1— RO 97-50 |— Connectici L HNY-1999

_Г Ast901

Ast986 A-1628 A-72 '—• A-1640 Eg101 Hp-94 T-1304 Kunjin M12294 2i

rE

Nucleotide Substitutions (x100)

Рис 2 Сравнительный филогенетический анализ полученных последовательностей между собой, с имеющимися в GenBank данными, а также с другими штаммами вируса ЗН из коллекции института вирусологии Штамм LEIV-Vlg99-27889-human обозначен на рисунке как Vlg27889 и штамм LEIV-AstOO-986-human обозначен как Ast986.

2. Создание ОТ-ПЦР тест системы для обнаружения РНК вируса ЗН в клинических образцах и пробах полевого материала

Учитывая вариабельность генома вируса ЗН, при его обнаружении необходимо использовать праймеры, соответствующие наиболее консервативным участкам вирусного генома, которые совпадают по нуклеотидной последовательности в штаммах вируса ЗН, принадлежащих к различным филогенетическим группам В связи с этим, для поиска консервативных областей были использованы нуклеотидные последовательности по всей длине генома для вируса ЗН, EMBL accession AF196835, D00246, М12294, NC_001563, AF206518, AF202541, а также последовательности российских изолятов, включая штаммы LEIV-AstOO-986-human и LEIV-Vlg99-27889-human, ранее депонированные нами в базу данных GenBank. Анализ консервативных областей проводился на компьютере с помощью программы Megalign (DNASTAR) В результате было установлено, что наиболее консервативные участки локализованы в 5'-

нетранслируемой области, а также области генов core и pre-М (Рис 3) Поиск гтраймернных последовательностей, проведенный с помощью программ "Megalign" и "Amplify" позволил отобрать четыре последовательности, пригодных для синтеза соответствующих праймеров Структуры праймеров приведены в табл 2

Таблица 2 Праймеры, подобранные для детекции вируса ЗН методом ОТ-ГТЦР (полу-гнездовой способ)

Праймер Нуклеотидная последовательность 5'—>3 * Длина (но) Место посадки (позиция на геноме) Расчетная температура отжига (°Г)

IF AGTAGTTCGCCTGTGTGAGCTGA 23 1 -23 (5'НТР) "73Д

26F AACTTAGTAGTGTTTGTGAGGA 22 26-47 (5'НТР) 65,8

518R TCAGTAGCATTTACCGTCATCAT 23 496-518 (ргеМ) 68,7

626R GGGCA TTC A TAAG TGA TAGTATC 23 604-626 (ргеМ) 68,7

Подобранные праймеры были использованы для постановки ОТ-ПЦР в полугнездовом варианте На первом этапе с помощью праймера 626R получали кДНК, затем проводили I раунд амплификации с помощью праймеров 518R и 1F, при этом образовывался фрагмент размером 518 но На втором этапе проводили II раунд ПЦР с использованием праймеров 26F и 518R В результате получался ампликон длиной около 500 н о Продукты ПЦР идентифицировались в агарозном геле

Для определения чувствительности обнаружения генома вируса ЗН с помощью отобранных праймеров использовали препараты вируса ЗН LEIV-Ast989 С этой целью препарат вируса ЗН LEIV-Ast989 раститровывали в ростовой среде и использовали для одновременной идентификации вируса предложенным методом ОТ-ПЦР и определением БОЕ препарата на культуре клеток Vero Е6

Анализ ампликонов проводили как после первого, так и после второго раунда ГТЦР Результаты анализа представлены на рисунке Зб-в Как следует из приведенных данных, после первого раунда ПЦР чувствительность системы составила 104 БОЕ/мл исходной вирусной суспензии или 2*103 БОЕ в ПЦР пробирке После второго раунда амплификации чувствительность ПЦР повысилась на три порядка, что составляет 50 БОЕ/мл исходной вирусной суспензии или 10 БОЕ в ПЦР пробирке Таким образом, чувствительность системы составила 50 БОЕ/мл

Специфичность разработанной ОТ-ПЦР была определена с использованием различных вирусов, хранящихся в государственной коллекции вирусов ГУ НИИ вирусологии им Д И Ивановского РАМН Среди них были представители флавивирусов (вирусы желтой лихорадки (ЖЛ), японского энцефалита (ЯЭ), клещевого энцефалита (КЭ), денге (Ден )), альфавирусов (вирус Синдбис (Син)) и буньявирусов (вирусы Тягиня (Тяг), Крымско - Конго гемморагической лихорадки (ККГЛ)) На рис За представлены результаты тестирования ОТ-ПЦР тест - системы с перечисленными вирусов Ни в одном случае использования в качестве матрицы РНК вирусов, отличных от вируса ЗН, специфического продукта амплификации не наблюдали

М ЗН ЖЛ КЭ ЯЭ Ден. Син.КГЛ Тяг М

Ш0ШтШяШжшй

500 н о

БОЕ/мл

М 107 10' 10* Ю'вМО'ЯЮ 50 5 М

БОЕ/мл

М Ю7 Ю6 Ю5 104 5*103 500 50 5 М

В.

500 н о

Рисунок 3 Определение специфичности и чувствительности разработанной ОТ-ПЦР тест - системы (полу-гнездовой метод) а Результаты тестирования ОТ-ПЦР системы с различными вирусами (объяснения в тексте) б, в Результаты тестирования в ОТ-ПЦР разведений штамма А$1986 после 1-го (б) и Н-го (в) раунда ПЦР Над лунками указан соответствующий титр вируса

Представляло интерес также проверить разработанную тест-систему на способность выявлять РЖ вируса ЗН всех четырех известных к настоящему моменту генотипов вируса ЗН (Рис 4) Реакция ПЦР проводили с музейными штаммами, представляющими все четыре генотипа Для проведения эксперимента использовали в качестве представителя первой группы вируса ЗН ЬЕ1У-У^99-27889-1штап; второй группы вируса ЗН. ЬЕ1У-Цкг80-3266-гоок ; третьей группы вируса ЗН ^2266, четвертой группы вируса ЗН' ЬЕ1У-Кгпс188-190-йск5, титр 50 БОЕ/мл Как следует из представленных данных, все четыре группы эффективно амплифицировались в разработанной нами ОТ-ПЦР тест-системе

1 2 3 4 К- К-

■

Рис 4 Проверка тест-системы с четырьмя различными генотипами ВЛЗН 1 - ЬЕ1У-У^99-27889-1штап; 2 - ЬЕ1У-Цкг80-3266-гоок 3 -\g2266; 4 - ЬЕ1У-Кгпс188-190-й'ск5.

Таким образом, на данном этапе работы была разработана высокоспецифичная и чувствительная ОТ-ПЦР тест-система для для детекции всех известных генотипов вируса Западного Нила Определенная нами чувствительность системы как 50 БОЕ/мл является достаточной для исследований, связанных с детекцией вируса ЗН в биологических образцах

Вместе с этим, высокая специфичность и универсальность позволяют рассматривать разработанную тест-систему как методический инструмент, который может использоваться и в диагностических целях

Лабораторная модификация тест-системы

В связи с тем, что работы проводились с такими биологическим и объектами, как комары (малая биомасса, низкая концентрация РНК в пробах), при использовании вышеописанной системы мы получали большое количество неспецифических продуктов амплификации (рис 5). Для устранения подобного рода артефактов возникла необходимость адаптации тест-системы к объекту исследования Нами были использованы два приема, типичные для подобных случаев' переход от полу-гнездовой системы к гнездовой; сдвиг кДНК-праймера дистальнее от 5'-конца на 30 н.о

Мы подобрали праймеры, несколько отличные от используемых ранее (Табл 3)

Таблица 3 Праймеры, подобранные для детекции вируса ЗН методом ОТ-

ПЦР (гнездовой способ)

Праймер Нуклеотидная последовательность 5'->3' Длина Место посадки (позиция на геноме) Расчетная температура отжига (°С)

Ш АвТАвТТСвССТвТвТвАвСТвА 23 1 -23 (5'НТР) 73,1

ш ААСТТАвТАвТвТТТвТвАввА 22 26-47 (5'НТР) 65,8

326¥ вСТвТТТвТТТвТТСАСАССТСТССА 26 326-352 77

51811 ТСАвТАвСАТТТАССвТСАТСАТ 23 496-518 (ргеМ) 68,7

65011 вввСАТТСАТААвТвАТАвТАТС 23 627-650 (ргеМ) 68,7

Полученная тест-система была апробирована на полевом материале (комары и клещи) Результаты сравнительного опыта приведены на рисунке 5 Как

следует из приведенных данных, мы видим, что , при использовании модифицированной системы (Рис 5а) значительно сокращается количество неспецифических продуктов амплификации

б)

Рис 5 Сравнение гнездовой (а) и полу-гнездовой (б) ПЦР тест-систем в типичном опыте На наличие РНК вируса ЗН тестировались пулы комаров

Таким образом, в результате проведенных исследований созданы два варианта тест-системы, позволяющие достоверно детектировать РНК вируса ЗН как в теплокровных, так и в членистоногих.

3. Исследование комаров и клещей дельты Волги и Волго-Ахтубинской поймы на наличие вируса ЗН при помощи ОТ-ПЦР системы.

Для определения наличия РНК вируса Западного Нила в пробах полевого материала, мы использовали ОТ-ПЦР тест систему, гнездовой вариант (лабораторная модификация) Так как для амплификации

использовали пулы комаров, содержащих 4-100 особей, то, при получении положительного результата, мы считали, что в данном пуле находится по крайней мере одна особь, инфицированная вирусом ЗН Всего были обследованы 289782 комаров, собранных в период с 2001 по 2004гг, и 7303 клещей, собранных в 2002-2003 гг Суммарные результаты анализа представлены в таблице 4 и на рисунке 6

Таблица 4 Анализ зараженности членистоногих переносчиков вирусом ЗН в период 2001-2004гг

Год сбора материала/ анализа материала Кол-во особей Кол-во «+» особей Процент зараженности

2001/2002 19425 комаров 5 комаров 0,026%

2002/2003 77419 комаров 4563 клещей 34 комаров 49 клещей 0,043% 1,073%

2003/2004 113082 комары 2740 клещей 18 комаров 5 клещей 0,015% 0,18%

2004/2004 (перезимовавшие) 76647 комаров 36 комара 0,047%

ИТОГО. 289782 комаров 7303 клещей 93 комаров 54 клещи 0,032% 0,740%

Сопоставляя полученные данные (табл 4, рис 6) о зараженности комаров в дельте Волги и Волго-Ахтубинской пойме с аналогичными данными для других регионов земного шара, можно сделать вывод о высокой активности циркуляции вируса ЛЗН среди членистоногих, обитающих в этом регионе Итого процент зараженности членистоногих переносчиков (комаров) за 2001 г - 0,025%, за 2002 г - 0,043%, за 2003 г. - 0,015%, за 2004 г -0,047, (рис 6) клещей за 2002 г - 1,073%, за 2003г. - 0,18%. Средняя величина процента зараженности за весь изучаемый период 2001-2004 гг. составила для комаров-0,018%, клещей-0,74%.

Рис 6 Зараженность вирусом ЗН комаров в дельте Волги и Волго-Ахтубинской пойме за 2001 - 2004гг По оси абсцисс - зараженность комаров (%), по оси ординат - годы.

Как следует из представленного графика (рис.6), наблюдается существенное колебание в значении инфицированности по годам Однако причины, приводящие к этим изменеиям, остаются неясными

4. Анализ зараженности видового состава комаров

Среди обследованных 289782 комаров было обнаружено 9 видов, собранных как в диких, так и в антропогенных биоценозах, в то время как все собранные и проанализированные пулы клещей были представлены только одним видом - Hyalomma marginatum.

Таблица 5 Видовой состав и зараженность комаров за 2001-2004 гг.

1 Собрано особей

Вид 2001 2002 2003 2004 веете за период 2Ш1* 2Шт.

Aedes caspius 0 0 320 -*) 1/600 -*) 1/920 ... -*)

Aedes ßavescens 0 0 0 38 -*) - 38 -*)

Aedes vexans 0 0 100 -*) 600 -*) WO'

Anopheles hyrcanus 2450 -*) 8/27135 (0,026%) 8/21813 (0,037%) 2/11700 (0,017%) 18/63098 (0,028%)

Anopheles messeae 395 -*) 13/29460 (0,044%) 3/32089 (0,010%) 11/28183 (0,052%) 27/88127 (0,031%)

CoquiUettidia richiardii 4/4880 (0,080%) 2/6700 (0,030%) 7/46907 (0,015%) 13/21300 (0,061%) 26/79787 (0,033%)

Culex modestus 1/11200 (0,009%) 3/8596 (0,035%) 1683 -*) 600 -*) 4/22079 (0,018%)

Culex pipiens 500 -*) 8/21585 (0,046%) 9850 (<0,01) 8/13622 (0,058%) 16/45457 (0,035%)

Culiseta annulata 0 0 0 1/4 -*) 1/4 -*) 1

9 видов 5/19425 (0,026%) 34/93476 (0,036) Шиш (0,016%) МПШ7 (0,047%) 93/289782 (0,032%)

*) - процент зараженности не подсчитывался в связи с незначимостью выборки

Суммированные данные по видовому составу и зараженности комаров представлены в таблице 5

Анализ полученных данных (Табл 5, рис.7) показал, что уровень зараженности комаров различных видов является сравнимым (от 0,018% до 0,035%) и мы не можем утверждать о предпочтительности заражения вирусом ЗН какого-либо вида

Необходимо отметить, что, из-за крайне небольшой выборки комаров видов Aedes vexans, Aedesßavescens и Aedes caspius, мы не можем сделать достоверный вывод о реальной зараженности комаров этих видов Тем не менее, в отношении комаров вида Aedes caspius можно предположить, что

они, по-видимому, способны являться переносчиками вируса ЗН, так как при анализе пулов комаров этого вида были обнаружены инфицированные особи (табл.5)

Ьугсапиэ тезБез псЫагсМ тобезШз рф1ВП5

Рис 7 Зараженность вирусом ЗН различных видов комаров за период 2001 -2004 гг.

5. Нуклеотидный и филогенетический анализ 5'-концевой области генома вируса ЗН у полевых изолятов .

Для 86 проб из 147, дававших положительный сигнал в ОТ-ПЦР, была определена частичная нуклеотидная последовательность Сопоставление этих последовательностей с данными литературы позволило установить, что во-первых все положительные ПЦР - пробы содержали действительно фрагмент последовательности вируса ЗН и не являлись ложно-положительными результатами ПЦР-анализа, во-вторых практически все последовательности хотя бы минимально отличаются друг от друга, что указывает на их независимый первичный источник и отсутствие контаминации при проведении молекулярно-биологических манипуляций с материалом, В-третьих впервые показано на пробах полевого материала (пулы комаров и клещей) возможность разработанной ранее ОТ-ПЦР тест-системы выявлять наличие РНК вариантов вируса ЗН, относящихся ко второй и четвертой группам

При обработке данных нуклеотидных последовательностей пакетом программ ОЫАЯТА!^ было установлено, что циркулирующий в дельте Волги и Волго-Ахтубинской пойме вирус ЗН относится к первому, второму и четвертому генотипам При этом основная масса образцов была отнесена к I генотипу (91,86%), штаммы И и IV генотипов встречались значительно реже (4,65% и 3,49% соответственно), а также мы не обнаружили ни одного штамма вируса ЗН, относящегося к III генотипу

04 J! 372

- 04_2_508

ыл_аа

04_2 '37 04.2.7S2

- 04_2_7E4

E 04.2.832 04.J 204

03 1 1268

04 2 569 02 2 23

- 02^.2342

- 04_1 24

- 04.2.767 [— 02-2.571

02_2_344

- 02 2.59: 04JÎJ06 04.2_Й24

Í02.2 179 02-2.2341 02.2.33» 04.2.682 i- 02-1 73 I1- 02-2.506

- 02 2 28

- 02-2.S81

- 04.2.93 ' 04 2.845

02J 113

02 2 2341 02-3_в1"<а, 04.2_.o83

- 02-3.Ï59

03 1-397

04 2 492 04.2.871 AstSQg 02 3.480 02 2 215 03.1.770 04.2 393 04.3.181

г 02 J. 278 f- 03 1 352 -4 03.1 1025

- 04 2 738

- 04 2 350

- 02 2 «76

- 02-2.355 j 03 1-883 1 03_1 683

- ¡W-Î-M1

|03 1 1498Í I 03-1-1170 1 03-1-20S8 02_2_355 02.2.353 02 2-1820 02-2.1038 02-2 2111 02 3 459 г| 02 3 619 H 02-3 683«) 02 3 44013 02 3-73SA I— 02.2 848 J— 02.2.366 V)g27889

-02 1 93(65)

---02-2.1

--- 02 2 2303

' - 02-2.2305 " - 03.1.146

- 04.1.110

-04.1.148

-- 04 2.47

-04.2.510

И- 04.2.544

J— 02-2.Î Л—03-1 1

I- 02 2_!

I--32B8

03.1 784

02-2.917

03-1 167 02 2.560

A

1 группа WNV

■ 192268

П— 03.1 B34 1

I_I 02-2.570 >-

1 02 2 £74 J

2 группа WNV

4 группа WNV

Рис 9 Филогенетическое древо, отражающее родство штаммов, выделенных из биологического материала В качестве стандартных последовательностей для сравнения были использованы аналогичные участки штаммов из коллекции Института вирусологии им Д И Ивановского РАМН Штаммы первой группы вируса JT3H AstOO-986-human и LEIV-Vlg99-27889-human; второй группы вируса JI3H LEIV-Ukr80-3266-rook , третьей группы вируса JI3H' Ig2266, четвертой группы вируса JI3H LEIV-Kind88-190-ticks .

ВЫВОДЫ

1. Определена полная нуклеотидная последовательность двух штаммов вируса Западного Нила, выделенных от человека (AstOO- 986-human и LElV-Vlg99-27889-human), и установлено, что эти штаммы относятся к I генотипу

2. Разработан и апробирован оригинальный метод, основанный на использовании специфических праймеров и условий реакции, позволяющий детектировать РНК вируса Западного Нила биопробах комаров и клещей с высокой чувствительностью и специфичностью

3. По результатам обследования биопроб (289782 комаров, 7303 клещей) методом ОТ-ПЦР, зараженность комаров, собранных в дельте Волги и Волго - Ахтубинской пойме составила за 2001-2004гг 0,032%, клещей (2002-2003гг) - 0,74%, что свидетельствует о высоком уровне напряженности природных очагов вируса Западного Нила в дельте Волги и Волго - Ахтубинской пойме.

4. На основании определения первичной структуры учасков генома вируса Западного Нила ( 5'-НТР -core) в 86 образцах ВЗН, установлено, что в дельте Волги и Волго - Ахтубинской пойме циркулируют вирусы ЗН, относящиеся к I, II и IV генотипу Показано, что наибольшее распространение имеют штаммы первого генотипа (91,86%), штаммы

второго и четвертого генотипа встречаются значительно реже (4,65% и 3,49% соответственно)

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1 Прилипов А Г , Кинни P.M., Самохвалов Е И ,Сэведж Г М , Альховский С В ,Тсучия Р , ГромашевскийВЛ,СадыковаГ К , Шаталов АГ, Вышемирский Ой,Усачев Е В , Мохонов В В , Воронина А.Г , Бутенко А М , Ларичев В Ф , Жуков А Н , Ковтунов А И ,Гублер Д Дж , Львов Д К Анализ новых вариантов вируса Лихорадки Западного Нила //Вопросы вирусологии 2002 N5 С 36-44.

2 Прилипов А Г , Кинней Р М , Самохвалов Е И ,Сэвадж X М , Альховский С В ,Цучай Р , Громашевский В Л, Садыкова Г К , Шаталов А Г , ВышемирскийОИ, Усачев Е В , Мохонов В В , Воронина А.Г., Бутенко А М , Ларичев В Ф . Гублер Д Дж , Львов Д К Филогенетический анализ новых вариантов вируса Западного Нила // Тезисы П-ой Конференции по проблемам инфекционной патологии в Сибири, Дальнем Востоке и северных регионах азиатской части России (Новосибирск), 29-31 Мая, 2002 - С 175.

3 Прилипов А Г , Кинней Р М , Самохвалов Е И , Сэвадж X М , Альховский С В , Цучай Р , Громашевский В Л, Садыкова Г К , Шаталов А Г Вышемирский О И, Усачев Е В , Мохонов В В , Воронина А.Г , Бутенко А М , Ларичев В Ф , Ковтунов А И , Жуков А Н , Гублер Д Дж , Львов Д К Генетический анализ вируса Западного Нила в Волгограде и Астрахани за 1999-2000 эпидемические сезоны Н Тезисы Н-ой Конференции по проблемам инфекционной патологии в Сибири, Дальнем Востоке и северных регионах азиатской части России (Новосибирск), 29-31 Мая, 2002 - С 175.

4 Львов Д К .Ковтунов А И ,Яшкулов К Б .Громашевский ВЛДжаркенов А Ф ,Щелканов М Ю ,Куликова Н ,Сэвидж Г.,Чимидова Н М ,Михаляева Л Б .Васильев А В .Галкина И В .Прилипов А Г.Кимми Р .Самохвалов Е И .Бушкиева Б Ц ,Гублер Д .Альховский С К .Аристова В А .Дерябин П Г ,

Бутенко А М ,Москвина Т М ,Львов Д.Н.,Злобина Л.В„Ляпина О В .Садыкова Г К,Шаталов А Г ,Усачев Е В ,Воронина А.Г ,Лунева Л И Особенности циркуляции вируса Западного Нила (F1aviviridae,Flavi virus) и некоторых других арбовирусов в экосистемах дельты Волги, Волго-Ахтубинской поймы и сопредельных аридных ландшафтах (2000-2002 гг)// Вопросы вирусологии №3,2004гт , С 45-51

5 Львов Д К ,Бутенко А М .Громашевский В Л ,Ковтунов А И ,Прилипов А Г ,Кинни Р .Аристова В А ,Джаркенов А Ф ,Самохвалов Е.И ,Сэвидж Г М ,Щелканов М Ю ,Галкина И В.,Дерябин П.Г ,Гублер Дж .Куликова Л Н ,Альховский С К .Москвина Т М ,Злобина Л В ,Садыкова Г К ,Шаталов А Г.,Львов Д Н ,Усачев Е В ,Воронина А Г West Nile virus and other zoonotic viruses in Russia: examples of emerging-reemerging situations// Archives of Virology, 2004,C 85-96

6 Прилипов А Г , Львов Д К , Самохвалов Е И , Садыкова Г К , Альховский С В, Воронина А Г Способ обнаружения вируса лихорадки Западного Нила// Патент РФ № 2199589 от 27 02 2003

7 Prilipov,A.GKinney,R.M., Samokhvalov,E.I., Savage,HM, Alkhovsky,S.V., Tsychia,R.,Gromashevsky,V.L.,Sadykova,G.K.,Shatalov,A.GUsachev,E.V.Mokho nov,V Woronina,A.G.,Butenko,A.M Larichev,V.FGubler,D.J. and Lvov,D.K. Полные нуклеотидные последовательности штаммов ЛЗН Vlg27889 и Ast986, депонированные в GenBank// accession АУ277252, AY278441.

Принято к исполнению 19/05/2005 Исполнено 19/05/2005

Заказ № 885 Тираж: 75 экз .

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 www autoreferat ru

РНБ Русский фонд

2006-4 6711

Р-99 14

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Воронина, Анна Георгиевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Общая характеристика флавивирусов.

1.1.1 Общий план строения и трансляции генома флавивирусов.

1.1.1.2 Структура генома.

1.1.1.3 Репликация РНК.

1.1.1.4 Трансляция и процессинг.

1.1.1.5 Стратегия вирусного генома.

1.1.2 Белки флавивирусов и их функции.

1.1.2.1 Структурные белки флавивирусов.

1.1.2.2 Неструктурные белки флавивирусов.

1.2 Филогения различных изолятов вируса

Западного Нила.

1.3 Исследования ВЗН, проведенные в лаборатории Молекулярной генетики института Вирусологии РАМН.

1.4 Этиология и эпидемиология.

1.5 Клиника заболевания.

1.6 Резервуар вируса среди позвоночных.

1.7 Переносчики вирусной инфекции.

1.8 Сохранение вирусной популяции в межэпизоотический период.

1.9 Ареал распространения заболевания за рубежом.

1.10 Ареал распространения заболевания в России и странах СНГ.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Место сбора и объем полевого материала.

2.2 Методы сбора, транспортировки, хранения и подготовки полевых материалов.

2.3 Методы молекулярно-биологических исследований.

2.3.1. Выделение тотальной РНК из осветленной клеточной или тканевой суспензии.

2.3.2 Реакция обратной транскрипции.

2.3.3 Проведение полимеразной цепной реакции.

2.3.4. Электрофорез ДНК.

2.3.5. Секвенирование ДНК.

2.4 Компьютерная обработка данных.

Глава 3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1.Определение полноразмерных нуклеотидных последовательностей геномов штаммов вируса ЗН LEIV-AstOO-986-human и LEIV-Vlg99-27889-human.

3.2. Создание ОТ-ПЦР тест системы для обнаружения РНК вируса JI3H в клинических образцах и пробах полевого материала

3.3 Определение специфичности и чувствительности ОТ-ПЦР тест - системы, лабораторная модификация системы.

3.4 Исследование комаров и клещей Астраханской области на наличие вируса ЗН при помощи ОТ-ПЦР системы.

3.4.1. Анализ зараженности видового состава комаров.

3.5. Нуклеотидный и филогенетический анализ 5'-концевой области генома вируса ЗН из полевых изолятов.

3.6. Обсуждение.

ВЫВОДЫ.

Благодарности.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование зараженности членистоногих переносчиков дельты Волги и Волго-Ахтубинской поймы вирусом Западного Нила и молекулярно-генетическая характеристика штаммов LEIV-Ast00-986-human и LEIV-Vlg99-27889-human ВЗН"

Вирус ЗН принадлежит к семейству флавивирусов {Flaviviridae ) p. Flavivirus. Семейство флавивирусов ( Flaviviridae ) включает в себя ряд инфекционных вирусов, вызывающих опасные заболевания у человека и животных.

Актуальность проблемы.

Эпидемические вспышки лихорадки Западного Нила (JT3H) различного масштаба и интенсивности регистрируются практически каждый год в странах Африки и Ближнего Востока, реже в Европе и Индии, иногда в Средней Азии (Львов, 2000; Murgue et al., 2002).

Обширная эпидемическая вспышка JT3H возникла в июле-октябре 1996 г. в Юго-Восточной Румынии в южном течении Дуная. Заболеваемость достигла 12,4 на 100 тыс. и охватила 7 областей, включая Бухарест.

Вспышки лихорадки Западного Нила описывались в Израиле в период с 1950 по 1970 гг., однако продолжающиеся по сей день серологические и эпидемиологические исследования показывают, что циркуляция вируса в этом регионе продолжается. (Hindiyeh, 2001)

Эпидемическая вспышка J13H совершенно неожиданно возникла в конце июля-сентября 1999г. с пиком во второй половине августа в Нью-Йорке и его окрестностях. (Lancotti et al., 1999). В общей сложности выявлено 56 случаев (31 подтвержден лабораторно), из которых 7 с летальным исходом (12,5%). Вирус ЗН обнаружен в комарах Culex pipiens, отловленных в сентябре-октябре в Нью-Йорке, и округах Нассау и Суффолк, а с помощью ПЦР положительный результат получен с комарами Culex spp. и Aedes vexans, собранных в середине сентября в округе Хадсон, Нью

Джерси. С помощью ПЦР положительные результаты получены при обследовании мозга погибших птиц из Нью-Йорка (Бронис, Бруклин, Манхэттен, Квинс, о.Статен, а также из округов Нассау,Оранж,Рокленд,Саратога,Суффолк и Вестчестер), в штате Нью-Джерси (12 округов), в штате Коннектикут (три округа). (Ebel, 2001) (Lanciotti, 2002)

Начиная с 1999 г. существенно обострилась эпидемическая ситуация по лихорадке Западного Нила на юге России (Lvov, 2004). Возникшие в последние 4 года на юге России вспышки лихорадки Западного Нила (ЛЗН), свидетельствуют о приоритетной значимости проблемы новых и возвращающихся инфекций в системе биобезопасности. (Львов, 2000).

В связи с широким распространением заболевания возникает необходимость исследования причин. Все это обусловило необходимость разработки программы комплексного изучения природных и синантропных очагов инфекции.

Инфекция JT3H относится к природно-очаговым зоонозам поскольку имеет выраженный очаговый характер (Львов и др., 1989). Природная циркуляция вируса ЗН в очаге происходит в системе «птицы - комары - птицы», при этом комары также эффективно заражают и других теплокровных, в том числе человека. Зараженность вирусом ЗН комаров является важным показателем активности природного очага и позволяет прогнозировать развитие эпидемической ситуации.

В связи с широким распространением заболевания возникает необходимость исследования причин. Все это обусловило необходимость разработки программы комплексного изучения природных и синантропных очагов инфекции.

Цель и задачи работы.

Целью данной работы явилась разработка молекулярно-биологических подходов к обследованию полевых материалов и оценка эпидемической ситуации распространенности вируса ЗН в дельте Волги и Волго-Ахтубинской пойме

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи: Задачи:

Определение полноразмерной нуклеотидной последовательности штаммов LEIV-AstOO-986-human и LEIV-Vlg99-27889-human вируса ЗН, выделенных во время эпидемических вспышек 1999г. и 2000г., с целью использования этих данных при дизайне праймеров для ОТ-ПЦР диагностической тест-системы.

- Разработка ОТ-ПЦР системы для чувствительной и специфичной детекции РНК вируса ЗН в биологических образцах.

- С использованием разработанной ОТ-ПЦР системы исследовать пробы полевого материала (комары и клещи), собранные в местах вспышки J13H (дельта Волги и Волго-Ахтубинская пойма в 20012004гг.), на наличие в них РНК вируса Западного Нила, определение процента зараженности переносчиков.

- Нуклеотидный анализ фрагментов геномов вируса ЗН из проб полевого материала. На основании полученных нуклеотидных последовательностей с целью проведения филогенетического анализа и определения генетических характеристик выделенных штаммов вируса ЗН, циркулирующих в популяциях переносчиков в период вспышек 2001-2004гг.

Положения, выносимые на защиту

- Полные нуклеотидные последовательности геномов штаммов вируса ЗН, полученных от человека LEIV-AstOO-986-human и LEIV-Vlg99-27889-human.

- Разработка и оптимизация ОТ-ПЦР тест-системы для обнаружения РНК вируса ЗН в полевых образцах.

- Определение общего и видового процента зараженности вирусом ЗН комаров и клещей, обитающих в дельте Волги

- Типирование штаммов ЗН, циркулировавших среди переносчиков в период вспышек 2001-2004г. с помощью филогенетического анализа фрагментов РНК.

Практическое значение.

В результате проведенной работы были определены полные нуклеотидные последовательности геномов двух штаммов вируса, выделенных на территории Астраханской и Волгоградской областей, предоставленных институтом вирусологии им. Д. И. Ивановского.

Созданная в процессе работы ОТ-ПЦР тест-система является высокочувствительной и достаточно проста в применении, что позволит использовать эту систему непосредственно в местах сбора полевого материала. Разработанная тест-система способна детектировать РНК вируса ЗН, относящиеся ко всем четырем филогенетическим группам. Таким образом это обеспечило максимально возможную, на данный момент, универсальность тест -системы. Разработанная тест - система «Способ обнаружения вируса лихорадки Западного Нила» защищена патентом РФ №2199589 от

27.02.2003. (авторы изобретения: Воронина А.Г., Прилипов А.Г., Львов Д.К., Самохвалов Е.И., Садыкова Г.К., Альховский С.В.,)

Впервые в России проведено масштабное исследование зараженности вирусом ЗН членистоногих переносчиков в природных очагах дельты Волги и Волго - Ахтубинской поймы с использованием ПНР. Всего обследовано 284308 комаров и 7303 клещей, собранных как в диких, так и в антропогенных биоценозах за 2001-2004гг. Согласно полученным результатам, средний уровень зараженности вирусом ЗН за 2001-2004гг. среди комаров -0,028%, среди клещей - 0,74%. Также, в результате филогенетического анализа положительных ПЦР-фрагментов, были сделаны выводы относительно групповой принадлежности обнаруженных штаммов вируса ЗН. Нами было определено, что на обследуемой территории циркулировали 79 штаммов (91,86%) относящихся к 1-му генотипу, 4 штамма (4,65%) - ко II генотипу, ни одного к III, и 3 штамма (3,49%) относятся к IV генотипу.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Воронина, Анна Георгиевна

ВЫВОДЫ

1. Определена полная нуклеотидная последовательность двух штаммов вируса Западного Нила, выделенных от человека (LEIV-AstOO-986-human и LEIV-Vlg99-27889-human), и установлено, что эти штаммы относятся к I генотипу.

2. Разработан и апробирован оригинальный метод, основанный на использовании специфических праймеров и условий реакции, позволяющий детектировать РНК вируса Западного Нила в биопробах комаров и клещей с высокой чувствительностью и специфичностью.

3. По результатам обследования биопроб (289782 комаров, 7303 клещей) методом ОТ-ПЦР, зараженность комаров, собранных в дельте Волги и Волго - Ахтубинской пойме составила за 2001-2004гг. 0,032%, клещей (2002-2003гг.) - 0,74%, что свидетельствует о высоком уровне напряженности природных очагов вируса Западного Нила в дельте Волги и Волго - Ахтубинской пойме.

4. На основании определения первичной структуры участков генома вируса Западного Нила ( 5-НТР -core) в 86 образцах ВЗН, установлено, что в дельте Волги и Волго - Ахтубинской пойме циркулируют вирусы ЗН, относящиеся к I, II и IV генотипу. Показано, что наибольшее распространение имеют штаммы первого генотипа (91,86%), штаммы второго и четвертого генотипа встречаются значительно реже (4,65% и 3,49% соответственно).

Благодарности

Считаю необходимым выразить глубочайшую признательность директору Института вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН академику Д.К. Львову, предоставившему возможность выполнения данной работы. Отдельную благодарность хочу выразить всему коллективу лаборатории молекулярной генетики за помощь в выполнении работы и доброжелательное отношение. Благодарю вед. научн. сотр., к.б.н. В.Л. Громашевского, ст. науч. сотрудника, к.б.н. Е.И. Самохвалова и весь коллектив лаборатории экологии вирусов. Также выражаю благодарность руководителю лаборатории биотехнологии д.б.н. профессору М.М. Гараеву за внимательное отношение и неоценимую помощь в подготовке диссертации, а также всех сотрудников Института вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН с кем мне посчастливилось общаться в ходе выполнения работы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Воронина, Анна Георгиевна, Москва

1. Березин В.В., Решетников И.А. Вирус лихорадки Западного Нила у диких птиц (экспериментальные данные) // в кн.: Вирусы, экологически связанные с птицами.Омск. инст. природноочаг. инф.-Омск.-1971.-С.93-94.

2. Булычев В.П., Данияров А., Гордеева З.Е. Выделение вируса Западного Нила от комаров Culex pipiens в Таджикистане //в кн.: Арбовирусы.Инст.виросологии им.Д.И.Ивановского АМН СССР.-М.-1981.-с.95-96.

3. Бутенко A.M.,Чумаков М.П., Беляева А.П. Серологическая идентификация астраханского вируса из клещей //В кн.: Клещевой энцефалит, кемеровская клещевая лихорадка и другие арбовирусные инфекции / Под ред.М.П.Чумакова.-М.-1964.-С.7-9.

4. Бтенко A.M.,Чумаков М.П., Башкирцев В.Н. Новые данные об изучении инфекции Западного Нила в СССР // Материалы 15-й научн. сессии ИПВЭ АМН СССР.-М.-1968.-Вып.З .-С .175-176.

5. Бутенко A.M.,Чумаков М.П., Башкирцев В.Н. Выделение штамма вируса Западного Нила в Астраханской области из комаров и вороны // в кн.: Этиология, эпидемиология и клиника КГЛ и лихорадки Западного Нила / под ред. М.П. Чумакова.-Астрахань.-1969.- С.39-40.

6. Виноград И.А., Белетская Г.В., Чумаченко С.С., Ардаматская Т.Б., Рогочий Е.Г. Изоляция вируса Западного Нила в южной Украине // Вопр. вирус.-1982.-№5.-С.55-57.

7. Войнов И.Н., Рытик П.Г., Григорьев А.И. Арбовирусные инфекции в Белоруссии / Вирусы и вирусные инфекции человека.-М.-1981.-С.86-87.

8. B.Р. Обухова.-Новосибирск.:Наука.-1972.-С.229-313.

9. Жданов В.М., Львов Д.К. Эволюция возбудителей инфекционных болезней.-М. Медицина.-1984.-270 с.

10. Львов Д.К. Лихорадка Западного Нила // Вопр.вирусол.-2000 №2. - С.24-34.

11. Львов Д.К., Клименко С.М., Гайдамович С.Я. Арбовирусы и арбовирусные инфекции.-М.Медицина.-1986.-336 с.

12. Львов Д.К., Лебедев А.Д. Экология арбовирусов.-М. Медицина.-1974.-184 с.

13. Сиденко Б.Ф., Думина А.Л., Грекова B.C. Циркуляция вируса Западного Нила среди птиц Украинского Причерноморья // в кн.: Экология вирусов, вып I.-M.-1973.- с.164-169.

14. Ставицкий А.В. Изучение восприимчивости диких уток к вирусу Западного Нила // в кн.: Вирусы, экологически связанные с птицами. Омск. инст. проиродноочаг. инф.-Омск.-1971 .-с. 18-19.

15. Федотова Т.Н., Ставский А.В., Федоров В.Г. Лихорадка Западного Нила у эксперементально инифицированных грачей // в кн.: Вирусы, экологически связанные с птицами. Омск. инст. проиродноочаг. инф.-Омск.-1971.-С.19-22.

16. Чумаков М.П., Беляева А.П., Бутенко A.M., Мартьянова Л.И. Вирус Западного Нила в СССР // Эпидемиология вирусных инфекций.-1968.-Т. 12.-С.365-373.

17. Чумаков М.П., Бутенко A.M., Башкирцев В.Н. Выделение вируса Западного Нила от больных людей в Астраханской области // Этиология, эпидемиология и клиника крымской геморрагической лихорадки и лихорадки Западного Нила.-Астрахань.-1969.-С.36-38.

18. Шишкина Е. О. автореф. дисс. на соискание степени канд. биол. наук.-М.-2003.

19. Adams S., Broom A., Sammels L., Harnett A., Howard M., Coelen R., Mackenzi J., Hall R. Glycosylation and antigenic variation among Kunjin virus isolates // Virology.-1995 .-№206.-pp.49-56.

20. Anderson J.F., Andreadis T.G., Vossbrink C.R. Tirrel S., Wakem E.M., French R.A., Garmendia A.E., Van Kruiningen H.J. Isolation West Nile virus from mosquitoes, crow, and cooper's hawk in Conecticut // Science.-1999.-Vol.286.-pp.2331-2333.

21. Bernkopf H., Levine S., Nerson R. Isolation of West Nile virus in Israel // J. Infect. Dis.-1953.-№93.-pp.207-218.

22. Berthet F.X., Zeller H.G., Drouet M.T., Rauzier J., Digoutte J.P., Deubel V., Extensive nucleotide change and deletions within the elnvelope glycoprotein gene of Euro-African West Nile viruses // J.of General Virology.- 1997.-Vol.78.-pp.2293-2297.

23. Besselaar T. G. and Blackburn N. K. Antigenic analysis of West Nile virus strains using monoclonal antibodies // Arch. Virol.-1988.-№99.-pp.75-88.

24. Blackwell J.L., Brinton M.A. Translation elongation factor-1 alpha nteracts with the 3' stem-loop region of West Nile virus genomic RNA // J. Virol.-1997.-Vol.71.-№9.-pp.6433-6444.

25. Blackwell J.L., Brinton M.A. BHK cell proteins that bind to the 3' stem-loop structure of the West Nile virus genom RNA // J. Virol.-1995.-Vol.69.-№9.-pp.5650-5658.

26. Brinton M.A., Dispoto J.H. Sequence and secondary structure analysis of the 5'-terminal region of flavivirus genome RNA // Virology.-1988.-Vol.l62.-№2.-pp.290-299.

27. Brinton M.A., Fernandez A.V., Dispoto J.H. The 3'-nucleotides of flavivirus genomic RNA form a conserved secondary structure // Virology.-1986.-Vol. 151.-№l.-pp.l 13-121.

28. Briese Т., Jia X.Y., Huang C.,Grudy L.J., Lipkin W. Identification of Kunjin-West Nile like flavivirus in brains of patients with New York encephalitis (letter)// Lancet.-1999.-Vol.354.-pp. 1261-1262.

29. Burt F.G., Grobbelaar A., Leman P., Anthony F., Gibson G., Swanepoel R. Phylogenetic relationships of Southern African West Nile virus isolates // Emerg. Infect. Dis.-2002.-Vol.8.-№8.-pp.820-826.

30. Campbell G., Marfin A., Lanciotti R., Gubler D. West Nile virus // Lancet.-2002.-Vol.2.-pp.519-529.

31. Chambers J., Halevy M., Nestorowicz A., Rice Ch., Lustig S. West Nile virus envelope proteins: nucleotide sequence analysis of strains differing in mouse neuroinvasiveness //J. of General Virology.-1998.-Vol.79.-pp.2375-2380.

32. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal. Biochem.-1987.-Vol. 162.-№ 1 .-pp. 156-159.

33. Coia G., Parker M.D., Speighe G., Byrne M.E., Westaway E.G. Nucleotid and complete amino acid sequences of Kunjin virus: definitive gene order and characteristics of the virus specified proteins // J. of General Virology.-1988.-Vol.69.-№ 1 .-pp. 1-21.

34. Darwish M. and Ibrahim A. Prevalence of antibodies to arboviruses in Egypt // Am. J. Trop. Med. Hyg.-1975.-№24.-pp.981-985.

35. Eidson M., Komar N., Sorhage F., Nelson R., Talbot Т., Mostoshari F. Crow deaths as a sentinel surveillance system for West Nile virus in the northeastern United States, 1999 // Emerg. Infect. Dis.-2001.-№7.-pp.615-620.

36. Filipe A.R. and Pinto M.R. Survey for antibodies to arboviruses in serum of animals from Southern Portugal // Am. J. Trop. Med. Hyg.-1969.-№18.-pp.423-426.

37. Filipe A.R., Isolation in Portugal of West Nile virus from Anopheles Maculipennis // Acta Virol.-1972.-№ 16.-pp.361.

38. Filipe A.R., de Andrade H.R. Arboviruses in the Iberian Peninsula // Acta Virol.-1990.-Vol.34.-pp. 1057-1063.

39. Gonzales M.T. and Filipe A.R. Antibodies to arboviruses in Northwestern Spain // Am. J. Trop. Med. Hyg.-1977.-№26.-pp.792-797.

40. Hall R.A., Scherret J.H., Mackenzi J.S. Kunjin virus: an Australian variant of West Nile? // Ann. N Y Acad. Sci.-2001 .-Dec.-№951 .-pp. 153-60.

41. Hammam H. M., Clark D. H., Price W.H. Antigenic variations of West Nile virus in relation to geography // Am. J. Epid.-1965.-№82.-pp.40-55.

42. Hammam H. M. and Price W.H. Further observation on geographic variation in the antigenic character of West Nile and Japanese В encephalitis viruses // Am. J. Epid.-1966.-№83 .-p. 113.

43. Hannoun C., Panthier R., Mouchet J. Isolation in France of the West Nile virus fron patients and from the vector Culex modestus ficalbi // C. R. Acad. Sci. Paris.-1964.-№259.-pp.4170-4172.

44. Hayes C.G. West Nile fever // в кн.: The arboviruses epidemiology and ecology / под ред. Monath T.P.-CRC press.-1989.-pp.59-88.

45. Hubalek Z. West Nile fever a reemerging mosquito-borne viral disease in Europe // Emerging Infection Disease.-1999.-Vol.5.-№ 5.-pp.643-650.

46. Jia X.Y., Briese Т., Jordan I., Rambaut A., Chi H.C., Mackenzie J.S., Hall R.A., Scherret J., Lipkin W.I. Genetic analisis of West Nile New York 1999 encephalitis virus // Lancet.-1999.-Dec 4.,-№354.,-pp.l971-1972.

47. Jupp P.G., Mcintosh B.M. Qantitative experiments on the vector capability of Culex (Culex) pipiens Univittatus Theobald with West Nile and Sindbis virus // J. Med. Entomol.-1970.-№7.-pp.371 -373

48. Juricova Z and Hubalek Z. Arbovirological examination of free-living dirds in thej

49. Czech Republic // Proc. 2 European Conf. Avian medicine and Surgery.-Utrecht.-1993.-PP.507-521.

50. Juricova Z., Pinowski J., Literak I., Hahm K., Romanowski J. Antibodies to alphavirus, flavivirus and bunyavirus in house sparrows (Passer domesticus) and tree sparrows (P. montanus) in Poland // Avian Dis.-1998.-№42.-pp.l82-185

51. Goddard L., Roth A.E., Reisen W., Scott T.W. Vector competence of California mosquitoes for West Nile virus // Emerg. Infect. Dis.-2002.-№8.-pp.l385-1391.

52. Goldblum N., Jasinka-Klingberg W., Klingberg M.A., Marberg K., Sterk V.V. The natural history of West Nile Fever. I. Clinical observations during an epidemic in Israel // Am. J. Hyg.-1956.-Nov.-Vol.64.-№3.-pp.259-69.

53. Katz G., Rannon L., Nili E., Danon Y.L. West Nile fever occurrence in a new endemic site in the Negev // Isr. J. Med. Sci.-1989.-№25.-pp.39-41.

54. Komar N., Langevin S., Hinten S., Nemeth N., Edwards E., Hettler D., Davis В., Bowen R., Bunning M. Experimental infection of North American birds with the

55. Ney York 1999 strain of West Nile virus // Emerg. Infect. Dis.-2003.-Vol.9.-№3.-pp.311-322.

56. Lanciotti R.S., Kerst A.J. Nucleic acid sequence-based amplification assays for rapid detection of West Nile and St. Louis encephalitis viruses // J. Clin. Microbiol. 2001 .-Vol.39.-№ 12.-pp.4506-4513.

57. Le Guenno В., Bougermouth A., Azzam Т., Bouakaz R. West Nile: a deadly virus? // Lancet.-1995 .-№348 .-p. 1315.

58. Malkinson M, Banet C. The role of birds in the ecology of West Nile virus in Europe and Africa // Curr. Top. Microbiol. Immunol.-2002.-№267.-pp.309-322.

59. Mathiot C.C., Georges A.J., Deubel V. Comparative analysis of West Nile strains isolated from human beings and animal hosts using monoclonal antibodies and cDNA restriction profiles // Res. Virol.-1990.-№141 .-pp.533-543.

60. Mcintosh B.M., McGilivray G., Dicknson D., Taljaard J.J. Ecological studies on Sindbis and West Nile viruses in South Africa. IV. Infection in a wild avian population// S. Afr. J. Med. Sci.-1968.-№33.-pp.l05-l 12.

61. Mcintosh B.M., Jupp P.G., Dos Santos, Meenehan G.E. Epidemics of West Nile and Sindbis viruses in south Africa with Culex (Culex) univittatus Theobald as vector// S. Afr. J. Sci.-1976.-№72.-pp.295-300.

62. McMinn P.C. The molecular basis of virulence of the encephalitogenic flaviviruses // J. of General Virology.-1997.-Vol.78.- pp.2711-2722.

63. Murgue В., Zeller H., Deubel V. The ecology and epidemiology of West Nile virus in Africa, Europe and Asia // Curr. Top. Microbiol. Immunol.-2002.-№267.-pp. 195221.

64. Naficy K. and Saidi S. Serological survey on viral antibodies in Iran // Trop. Geogr. Med.-1970.-№22.-pp. 183-188.

65. Nir Y., Goldwasser R., Lasowski Y., Avivi A. Isolation of arboviruses from wild birds in Israel // Am. J. Epidem.-1967.-№86.-pp.372-378.

66. Nir Y., Avivi A., Lasowski Y., Margalit J., Goldwasser R. Arbovirus activity in Israel //1st. J. Med. Sci.-1972.-№8.-pp 1695-1701.

67. Panella NA, Kerst AJ, Lanciotti RS, Bryant P, Wolf B, Komar N. Comparative West Nile virus detection in organs of naturally infected American Crows (Corvus brachyrhynchos) //Emerg. Infect. Dis.-2001. Vol.7.-№4.-pp.754-755.

68. Porter K.R., Summers P., Dubois D., Puri В., Nelson W., Henchal E., Oprandy J.J., Hayes C.G. Detection of West Nile virus by the polymerase chain reaction and analysis of nucleotide sequence variation // Am. J. Trop. Med. Hyg.-1993.-№48.-pp.440-446.

69. Perelman A. and Stern J. Acute pancreatitis in West Nile fever // Am. J. Trop. Med. Hyg.-1974.-№23 .-pp. 1150-1152.

70. Pierre V., Drouet M.T., Deubel V. Identification of mosquito-borne flavivirus sequences using universal primers and reverse transcription / polymerase chain reaction // Res. Virol.-1994.-№l45.-pp.93-104.

71. Rice C.M., Strauss E.G., Strauss J.H. Structure of the flavivirus genome // В кн.: The Togaviridae and Flaviviridae / Под ред. M.J. Shlesinger.-New York.:Plenum.-1986.-pp.279

72. Rice C.M., Lenches E.M., Eddy S.R., Shin J., Sheets R.L., Strauss J.H. Nucleotide sequence of yellow fever virus: implications for flavivirus gene expression and evolution // Sciens.-1985.-№299.-pp.726-733.

73. Ryan M.D., Monaghan S., Flint M. Virus-encoded proteinases of the Flaviviridae // J.of General Virology.-1998.-Vol.79.-pp.947-959.

74. Sardelis M.R., Turell M.J., Dohm D.J., O'Guinn M. Vector competence of select North American Culex and Coquillettidia mosquitoes for West Nile virus // Emerg. Infect. Dis.-2001 .-№7-pp. 1018-1022.

75. Savage H.M., Ceianu С., Nicolescu G., Karabatsos N., Lanciotti R., Vladimirescu A., Laiv L., Ungureanu A., Romanca C., Tsai Т.Е.//Am. J. Trop. Med. Hyg.-1999.-Vol.61.-№.4.-pp.600-611.

76. Scherret J.H., Poidinger M., Mackenzie J.S., Broom A.K., Deubel V., Lipkin W.I., Briese Т., Gould E.A., Hall R.A. The relationships between West Nile and Kunjin viruses // Emerg. Infect. Dis.-2001.-Vol.7.-№4.-pp.697-705.

77. Scherret J.H., Mackenzie J.S., Hall R.A., Deubel V., Gould E.A. Phylogeny and molecular epidemiology of West Nile and Kunjin viruses // Curr. Top. Microbiol. Immunol.-2002.-№267.-pp.373-90.

78. Shi P.Y., Brinton M.A., Veal J.M., Zhong Y.Y., Wilson W.D. Evidence for the existence pseudoknot structure at the 3' terminus of the flavivirus genomic RNA // Biochemestry.-1996.-Vol.35.-№13.-pp.4222-4230.

79. Shi P.Y., Li W., Brinton M.A. Cell proteins bind specificalli to West Nile virus minus-strand 3' stem-loop RNA // J. Virol.-1996.-Vol.70.-№9.-pp.6278-6287.

80. Smithburn K.C., Hughes T.P., Burke A.W., Paul J.H. A neurotropic virus isolated from the blood of a native of Uganda // Am. J. Trop. Med.-1940.-№20.-pp.471-92.

81. Smithburn K.C. Differentiation of West Nile virus from the virus of St. Louis and Japanese В encephalitis // J. Immunol.-1942.-№44.-pp.25-31.

82. Taylor R.M., Work Т.Н., Hurlbut H.S., Rizk F. A study of the ecology of West Nile virus in Egypt // Am. J. Trop. Med.-1956.-№5.-pp.579-620.

83. Triki H., Murri S., Le Gueno В., Bouattours S., Bahri O., Hili K., Sidhom M., Dellagi K. West Nile viral meningo-encephalitis in Tunisia // Med. Trop. (French).-2001.-Vol.61.-№6.-pp.487-90.

84. Tsai T.F. Factors changing epidemiology of Japanese encephalitis and West Nile fever // Factors in the emergence of Arbovirus disease / под ред. J. Saluzzo, B. Dodet.-Elsevier, Paris.-1997.-pp. 179-189.

85. Tsai T.F., Popovici F., Cernescu C. West Nile encephalitis epidemic in southeastern Romania // Lancet.-1998.-Vol.352.-pp.767-771.

86. Turell M.J., O'Guinn M., Oliver J. Potential for New York mosquitoes to transmit West Nile virus // Am. J. Trop. Med. Hyg.-2000.-№62.-pp.413-414.

87. Wengler G., Castle E., Leidner U., Nowak T. Sequence analysis of the membrane protein V3 of the flavivirus and of its gene // Virology.-1985.-№147.-pp.264-274.

88. Work Т.Н., Hurlbut H., Taylor R. Isolation of the West Nile virus from hooded crow and rock pigeons in the Nile Delta // Proc. Soc. Expt. Biol. Med.-1953.-№84.-pp719-722.

89. Work Т.Н., Hurlbut H., Taylor R. Indigenous wild birds of the Nile delta as potential West Nile virus circulating reservoirs // Am. J. Trop. Med.-1955.-№4.-pp.872-888.

90. Victor T.J., Malathi M., ravi V., Palani G., Appavoo N.C. First outbreak of Japanese encephalitis in two villages of Dharmapuri district in Tamil Nadu // Indian. J. Med. Res.-2000.-№l 12.-pp.l93-197.

91. Yamshchikov V.F., Compans R.W. Regulation of the late events in the flavivirus protein processing and maturation // Virology.-1993.-Vol.193.-№1.-pp.38-51.

92. Yamshchikov V.F., Trent D.W., Compans R.W. Upregulation of signalase processing and induction of prM-E secretion by the flavivirus NS2b-NS3 protease: roles of protease components // J. Virol.-1997.-Vol.71.-№6.-pp.4364-4371.