Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Штаммы вируса Западного Нила, циркулирующие на территории дельты Волги

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Штаммы вируса Западного Нила, циркулирующие на территории дельты Волги"

На правах рукописи

Альховский Сергей Владимирович

ШТАММЫ ВИРУСА ЗАПАДНОГО НИЛА, ЦИРКУЛИРУЮЩИЕ НА ТЕРРИТОРИИ ДЕЛЬТЫ ВОЛГИ

03.00.03.-молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2004

Работа выполнена в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: Кандидат биологических наук

Самохвалов Евгений Иванович

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: Доктор медицинских наук,

чл. - корр. РАМН, профессор Урываев Леонид Викторович Доктор биологических наук, профессор

Новиков Виктор Владимирович

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова

РАМН, Москва.

Защита состоится «17»_мая_2004 г. в_12-00_часов

на заседании диссертационного Совета Д.001.20.01 при ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (адрес: 123098 Москва, ул. Гамалеи, 16).

С диссертацией можно ознакомиться в в библиотеке ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

Автореферат разослан «!"?■» 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета Доктор медицинских наук

Н.П. Косякова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Вирус Западного Нила (ЗН), являющийся этиологическим агентом лихорадки Западного Нила (ЛЗН), широко распространен практически по всем частям света. Ареал его распространения охватывает практически весь африканский континент, Юго-Западную и Южную Азию, Южную и некоторые центральные части Европы (Львов, 2000; Hublek, 1999). Начиная с 1999 г. вирус ЗН выявляется также на территории североамериканского континента (Lancotti et al., 1999). Для Австралийского континента топотипным является вирус Кунджин, который изначально рассматривался как самостоятельная нозологическая единица. Однако данные генетических и антигенных исследований позволяют рассматривать штаммы вируса Кунджин как топотипные, характерные для Австралии изоляты вируса ЗН, отнесенные к 1-ой филогенетической группе (Scherret et al., 2001; 2002; Hall et al., 2001).

Эпидемические вспышки ЛЗН различного масштаба и интенсивности регистрируются практически каждый год в странах Африки и Ближнего Востока, реже в Европе и Индии, иногда в Средней Азии (Львов, 2000; Murgue et al., 2002). Особую актуальность для здравоохранения вирус ЗН приобрел после ряда крупных, сопровождающихся высокой смертностью эпидемий ЛЗН, прошедших в конце 1990-х гг. в Румынии (1996), России и США (1999), Израиле (2000). Необычной, нехарактерной для ЛЗН особенностью данных вспышек явилось большое (до 30-40 %) число случаев с поражениями ЦНС в виде менингита и энцефалита, а также высокая смертность (в среднем 10 %). В Израиле и России заболеваемость ЛЗН фиксировалась и в последующие годы, но в меньшем масштабе (Петров и др., 2001; Ковтунов и др., 2003; Bin et al., 2001). В США в 2003 г. зарегистрировано более 9000 случаев заболеваний ЛЗН, из которых около 30 % с поражениями ЦНС (www.cdc.gov). Вследствие этих событий ЛЗН была причислена к проблемам новых и вновь возвращающихся

инфекций, актуальность которых для

/тт иплт i Гос. Национальная

оставаться на высоком уровне (Львов, 2000).

Вирус ЗН принадлежит роду Flavivirus (семейство Flaviviridae) и является арбовирусом. Резервуаром вируса в природе являются птицы, а основными переносчиками служат комары, преимущественно рода Culex. Инфекция ЛЗН относится к природно-очаговым зоонозам поскольку имеет выраженный очаговый характер (Львов и др., 1989). Природная циркуляция вируса ЗН в очаге происходит в системе птицы - комары - птицы, при этом комары также эффективно заражают и других теплокровных, в том числе человека. Зараженность вирусом ЗН птиц является важным показателем активности природного очага и позволяет прогнозировать развитие эпидемической ситуации. Особенно важную роль при этом отводят синантропным птицам, массово заселяющих населенные пункты и их окрестности.

В нашей стране активные очаги ЛЗН, сохраняющиеся на протяжении десятилетий, расположены в Астраханской области, на территории дельты Волги. Здесь почти ежегодно фиксируется спорадическая заболеваемость ЛЗН, иногда эпидемические вспышки. Институтом вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН на территории Астраханской области проводится мониторинг циркуляции ЛЗН, который включает в себя наблюдения за вирусной активностью во всех звеньях экологической системы вирус — переносчики - позвоночные хозяева - переносчики - люди. Настоящая работа выполнена в рамках данного мониторинга и посвящена исследованию вовлеченности в циркуляцию вируса ЗН птиц в дельте Волги и Волго -Ахтубинской пойме.

Цель и задачи работы.

Цель настоящей работы заключалась в обследовании птиц дельты Волги и Волго - Ахтубинской поймы относительно зараженности вирусом ЗН и изучении генетических свойств циркулирующих здесь штаммов вируса Западного Нила. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Разработать тест - систему на основе ОТ-ПЦР для чувствительной и специфичной детекции вируса ЗН в биологических образцах.

2. С использованием разработанной ОТ-ПЦР тест - системы определить уровни зараженности вирусом ЗН птиц дельты Волги и Волго - Ахтубинской поймы в 2001 и 2002 гг.

3. Определить нуклеотидную последовательность структурной области генома штаммов вируса ЗН, выделенных от птиц дельты Волги и Волго - Ахтубинской поймы в 2001 и 2002 гг.

4. На основании полученных нуклеотидных последовательностей провести филогенетический анализ и определить генетические характеристики выделенных штаммов вируса ЗН.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработана чувствительная и высокоспецифичная ОТ-ПЦР тест -система для детекции вируса ЗН в биологических образцах.

2. Определены показатели зараженности вирусом ЗН птиц в дельте Волги и Волго - Ахтубинской поймы в 2001 и 2002 гг.

3. Определены молекулярно - генетические характеристики штаммов вируса ЗН, выделенных от птиц в дельте Волги в 2001 и 2002 гг.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Разработана ОТ-ПЦР тест - система для специфичной детекции вируса ЗН в биологических образцах с чувствительностью до 50 БОЕ/мл. При разработке системы использовались нуклеотидные последовательности штаммов вируса ЗН, принадлежащие ко всем известным филогенетическим группам, что обеспечило максимально возможную, на данный момент, универсальность тест - системы. Использование разработанной системы целесообразно при проведении исследований, посвященных вирусу ЗН, в которых необходима быстрая и надежная детекция вируса в биологических образцах, в том числе и с

диагностическими целями. Разработанная тест - система защищена патентом РФ №2199589 от 27.02.2003.

Впервые в России проведено масштабное исследование зараженности вирусом ЗН птиц в природных очагах дельты Волги и Волго - Ахтубинской поймы с использованием ПЦР. Всего обследовано более 1000 птиц, принадлежащих к 20 различным семействам, собранных как в диких, так и в антропогенных биоценозах. Согласно полученным результатам уровень зараженности вирусом ЗН птиц в дельте Волги составил 13,3 % и 9,6 % в 2001 и 2002 гг. соответственно. Зараженность птиц Волго - Ахтубинской поймы в 2002 г. не превысила 3,3 %. Зараженность вирусом ЗН синантропных птиц составила в 2002 г. в дельте Волги 16,9%, а на территории Волго -Ахтубинской поймы 4,1 %.

В результате вирусологического обследования, от птиц дельты Волги и Волго - Ахтубинской поймы было выделено 12 штаммов вируса ЗН. При этом два штамма вируса были выделены в 2001 г. и 10 штаммов в 2002 г. Для изучения их молекулярно - генетических характеристик, у 11 выделенных штаммов были определены нуклеотидные последовательности 5'-концевой области генома, включающей в себя 5'-нетранслируемый регион и гены всех структурных белков. На основе сравнения полученных нуклеотидных последовательностей было показано, что выделенные штаммы вируса ЗН практически идентичны штамму LEГV-Ast986, выделенному здесь в 1999 г. от больного во время крупной вспышки ЛЗН, и несут в рассматриваемой области (по сравнению с ним) от 4 до 8 нуклеотидных и до 3 аминокислотных замен. Полученные результаты свидетельствует о тесной связи вирусной популяции, циркулирующей среди птиц, с эпидемическими штаммами вируса.

Показано, что сайт потенциального гликозилирования оболочечного белка Е у штаммов, выделенных в дельте Волги от птиц, представлен в четырех формах, при этом у двух штаммов, вследствие замены А8П(154)->8ег, функциональная активность сайта элиминирована.

Апробация работы.

Отдельные положения работы представлялись на Ш-ей конференции молодых ученых России с международным участием "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины" (20 - 24 января 2004 г. Москва). В завершенном виде результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на совместном заседании отдела молекулярной вирусологии и апробационного совета ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН 25 марта 2004 г.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 5 статей и тезисы 2 докладов в материалах российских конференций.

Структура и объем диссертации.

Материалы диссертации изложены на 125 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы, включающего в себя 135 источников. Работа иллюстрирована 11 таблицами и 19 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследуемый полевой материал был собран в дельты Волги в июле -августе 2001 и 2002 гг. Кроме того, в 2002 г. материал собирался и в Волго -Ахтубинской пойме. Птиц отстреливали из охотничьего оружия, от каждой птицы для исследования брался смешанный пул тканей мозга и селезенки.

В 2001 г. отстрел птиц производился в двух районах Астраханской области: Икрянинском и Лиманском. Было охвачено две природные зоны дельты Волги: авандельта и средняя дельта. Всего был собран материал от 315 птиц, из которых 44 относились к синантропному комплексу, а 271 к дикому (в основном водный и околоводный комплексы).

Материал 2002 г. собирался в Икрянинском, Лиманском, Приволжском, Нариманском, Красноярском, Енотаевском и Черноярском районах Астраханской области. Были охвачены все три природные зоны дельты Волги (авандельта, средняя дельта, верхняя дельта). Отдельно отмстим, что материал также был собран от птиц, отстреленных непосредственно в населенных пунктах и их окрестностях: г. Астрахань, г. Ахтубинска, крупных поселков Красный Яр, Харабали. Всего был собран материал от 808 птиц, из которых 187 были отстрелены в Волго -Ахтубинской пойме и 621 в дельте Волги. Из птиц, добытых в дельте Волги 255 принадлежали синантропному комплексу, а 366 к дикому. В Волго - Ахтубинско пойме 97 птиц относились к синантропному комплексу и 90 птиц принадлежали дикому комплексу.

Исследование зараженности вирусом ЗН собранного полевого материала проводилось с использованием двух методов. При вирусологическом обследовании использовалась культура клеток Vero E6. Параллельно материал тестировался в ОТ-ПЦР на предмет выявления вирусной РНК.

Подбор праймеров для детекции вируса ЗН методом ОТ-ПЦР проводился с использованием нуклеотидных последовательностей различных изолятов вируса ЗН, доступных в базе DDBJ/EMBL/GenBank. Из них отдельно выделим четыре полноразмерных нуклеотидных последовательности опубликованных к началу настоящей работы: №М12294, №D00246, №AF202541, №196836. Также использовались нуклеотидные последовательности штаммов вируса ЗН, хранящихся в государственной коллекции вирусов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (Табл.1). При амплификации и определении нуклеотидных последовательностей структурной области генома выделенных штаммов использовались ранее разработанные праймеры (Прилипов и др., 2001; 2002). Нуклеотидные последовательности определялись на автоматическом секвенаторе (ABI PRISM 3100, USA). При работе с нуклеотидными последовательностями использовался пакет программ DNAstar v 3.12 (Lasergene, USA).

Использованные в работе штаммы вируса ЗН, хранящиеся в государственной коллекции вирусов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН представлены в таблице 1. Также использовались музейные штаммы вирусов желтой лихорадки, японского энцефалита, клещевого энцефалита, денге, Синдбис, Тягиня, Крымско - Конго гемморагической лихорадки, Бхаи.

Таблица 1. Музейные штаммы вируса ЗН, использованные в работе

Штамм Источник выделения Место сбора материала и год выделения Нуклеотидная последовательность

АзербА-72 Клеши (ОпЛосклтк сареп51з) Азербайджан (1970) Прилипов А.Г. (личное сообщение)

Egl01 Кровь больного Египет(1951) АР260968

Нр-94 Клещи (Нуа1отта р1. Р1итЪеит) Россия (1963) Прилипов А.Г. (личное сообщение)

Влг27889 (У1к27889) Человек секционный матер. Россия(1999) АУ277252

Аст986 ^986) Кровь больного Россия (1999) Прилипов А.Г. (личное сообщение)

Аст901 (Ав1901) Кровь больного Россия (2000) АУ278441

Т-1304 Малая крачка Таджикистан (1977) Прилипов А.Г'. (личное сообщение)

3266 Грач (С. йч^к^) Украина (1980) Прилипов А.Г. (личное сообщение)

Крсн88-190 (КГ5П88-190) Оегтас^ег Маг^пашв Россия (1988) АУ277251

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Разработка ОТ-ПЦР системы для детекции вируса ЗН.

В работе по подбору праймеров мы использовали нуклеотидные последовательности, опубликованные в базе данных GenBank. К началу данной работы было опубликовано значительное количество коротких частичных последовательностей генома вируса ЗН. И только четыре полноразмерные первичные структуры, принадлежащие штаммам 1-ой (№D00246, №AF202541,

№196836) и II-ой (№М 12294) филогенетическим группам. Вместе с тем, результаты работы по изучению вируса ЗН, ведущейся в Институте вирусологии им. Д.И. Ивановского (Львов и др., 2000; 2001; Прилипов и др., 2001; 2002) предоставили в наше распоряжение нуклеотидные последовательности 5'- концевой области генома 11 музейных штаммов вируса ЗН. Среди них были представители всех трех филогенетических групп, а также изолят LEIV-Krsnl90, отнесенный к новой, впервые показанной IV -ой группе вируса ЗН (Прилипов и др., 2002). На основании сравнения всех доступных нуклеотидных последовательностей с использованием пакета программ Megaline (Lasergen, USA) было подобрано несколько праймеров, лежащих в 5' -концевой области вирусного генома (Табл. 2, Рис. 1).

Специфичность разработанной ОТ-ПЦР была определена с использованием различных вирусов, хранящихся в государственной коллекции вирусов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского. Среди них были представители флавивирусов (вирусы желтой лихорадки (ЖЛ), японского энцефалита (ЯЭ), клещевого энцефалита (КЭ), денге (Ден.)), альфавирусов (вирус Синдбис (Син.)) и буньявирусов (вирусы Тягиня (Тяг.), Крымско - Конго гемморагической лихорадки (ККГЛ)). На рисунке 2а представлены результаты тестирования подобранных праймеров с перечисленными вирусами. Ни в одном случае использования в качестве матрицы РНК вирусов, отличных от вируса ЗН, специфического продукта амплификации не наблюдалось.

Таблица 2. Праймеры подобранные для детекции вируса ЗН методом ОТ-ПЦР

Праймер Нуклеотидная последовательность 5'-»3' Длина (и.о.) Позиция на геноме

1F AGTAGTTCGCCTGTGTGAGCTGA 23 1-23 (5'НТР)

26F AACTTAGTAGTGTTTGTGAGGA 22 26 - 47 (5'НТР)

518R TCAGTAG CATTTACCGTCАТСАТ 23 496-518 (ргеМ)

626R GGGCATTCATAAGTGATAGTATC 23 604-626 (ргеМ)

Для определения чувствительности разработанной тест - системы было проведено титрование штамма вируса ЗН LEIV-Ast989 в культуре клеток Vero Е6 и параллельное тестирование разведений вируса в ОТ-ПЦР. Титрование вируса проводилось методом бляшек под агаровым покрытием. Результаты этого эксперимента представлены на рисунках 26 и 2в. Как видно на электрофореграмме (Рис. 26) после первого раунда ПЦР специфический сигнал регистрируется до разведения вируса соответствующего 104 БОЕ/мл. После второго раунда ПЦР положительный сигнал регистрируется до разведения, соответствующего 50 БОЕ/мл. (Рис. 2в).

5'-НТР Г~—I .,.--,. ' "' 'и .1 I

5' | с<лте *" - V| -/tirelVí^

..................................................ÍÍ26R

IF ......................................518R

26F ...............................518R

Рисунок 1. Схематичное изображение расположения на геноме праймеров, подобранных для детекции вируса ЗН методом ОТ-ПЦР.

Таким образом, на данном этапе работы была разработана высокоспецифичная и чувствительная ОТ-ПЦР тест - система для детекции вируса Западного Нила. Определенная нами чувствительность тест-системы как 50 БОЕ/мл является достаточной для исследований связанных с детекцией вируса ЗН в биологических образцах. Вместе с этим, высокая специфичность и универсальность позволяют рассматривать разработанную тест - систему как надежный методический инструмент, который может использоваться и в диагностических целях.

кДНК

1-й раунд ПЦР

П-й раунд ПЦР

Рисунок 2. Определение специфичности и чувствительности разработанной ОТ-ПЦР тест -системы. А. Результаты тестирования ОТ-ПЦР системы с различными вирусами (объяснения в тексте). Б, в. Результаты тестирования в ОТ-ПЦР разведений штамма Ай986 после 1-го (б.) и И-го (в.) раунда ПЦР. Над лунками указан соответствующий титр вируса.

2. Зараженность вирусом ЗН птиц дельты Волги и Волго -Ахтубинской поймы.

С использованием разработанной ОТ-ПЦР тест - системы нами были обследованы птицы дельты Волги и Волго - Ахтубинской поймы относительно зараженности вирусом ЗН. Всего были обследованы пробы от 1123 птиц, из которых 315 были добыты в 2001 г. и 808 в 2002 г.

Результаты обследования птиц представлены на рисунке 3. В дельте Волги РНК вируса Западного Нила выявлена у 13,3 % и 9,6 % птиц, добытых в 2001 и 2002 гг. соответственно (Рис.3а). В Волго — Ахтубинской пойме этот показатель составил 3,2 %. На рисунке 3б представлен анализ зараженности вирусом ЗН птиц различных природных зон дельты Волги. Отмечено, что уровень зараженности птиц авандельты и в 2001 и в 2002 гг. был меньше, чем в верхних частях дельты, при этом соотношение зараженности птиц авандельты и средней части дельты сохраняется приблизительно на одном уровне. В 2002 г. самый высокий уровень зараженности определен для птиц верхней зоны дельты -13 %. Таким образом, согласно полученным нами данным, наиболее активная циркуляция вируса ЗН происходит в средней и верхней зонах дельты.

Этот результат согласуется с эпидемиологическими данными. Основная заболеваемость людей приходится именно на эту область дельты Волги (Львов, 2000). Здесь расположено множество крупных населенных пунктов, в том числе город Астрахань. С эпидемической точки зрения наибольший интерес представляют данные о зараженности вирусом ЗН синантропных птиц, которые массово заселяют населенные пункты и окрестности. Полученные нами данные о зараженности в 2002 г. вирусом ЗН синантропных птиц отражены на рисунке 4. Зараженность синантропных птиц в населенных пунктах и их окрестностях в дельте Волги в 2002 г. составила 16,9 %, а в Волго - Ахтубинской пойме 4,1 % (Рис.4а).

Среди птиц синантропного комплекса особое внимание отводится Воробьинообразным (Ра8зеп1о>гте8), и в частности представителям семейства Врановых (Согабае). Согласно данным по их экспериментальному заражению,

Рисунок 3. А. Зараженность вирусом ЗН птиц в дельте Волги и Волго -Ахтубинской пойме в 2001 и 2002 гг. Б Зараженность вирусом ЗН птиц различных природных зоан дельты Волги и Волго -Ахтубинской поймы. они наиболее восприимчивы к вирусу ЗН. После заражения вирусом ЗН у них развиваются наиболее высокие титры виремии в крови, которая держится наиболее продолжительное время (Кошаг й а1., 2003). Кроме того, во время последних эпидемических вспышек ЛЗН в США и Волгограде отмечалась

Рисунок 4. Зараженность вирусом ЗН синантропных птиц в дельте Волги и Волго - Ахтубинской пойме в 2002 г.

высокая смертность среди ворон (С. согопе). На основании этого предлагается использовать ворон в качестве маркеров приближения неблагоприятных эпидемических ситуаций. Согласно нашим результатам зараженность ворон на обследованной территории составила в 2002 г. 14,8%. При этом, вместе с воронами анализировалась зараженность грачей (С. йи^е^из), также как и вороны принадлежащих роду согуш. Их зараженность вирусом ЗН составила здесь в 2002 г. 18,2 % (Рис.4б).

При вирусологическом обследовании от птиц дельты Волги и Волго -Ахтубинской поймы было выделено 12 штаммов вируса Западного Нила. Два штамма вируса ЗН выделены от материала 2001 г. и 10 штаммов выделено в 2002 г. (Табл.3.). Большинство штаммов было выделено от грачей и ворон в средней и верхней зонах дельты Волги. Три штамма выделены от бакланов (Ph. carbo) и по одному штамму изолировано от голубя (С. livia) и сороки (P. pica).

Таблица 3. Штаммы вируса ЗН, выделенные от птиц в дельте Волги в 2001 и

2002 гг.

Зона дельты Штамм Год Источник выделения Итого

Авапделыпа LEIV-Ast02-3 -717 2002 б. баклан (Ph.carbo) 1

а S £ LEIV-AstO 1-187 2001 ворона (С. corone)

LEIV-AstOl-66 2001 б. баклан (Ph.carbo)

LEIV-Ast02-3-146 2002 голубь (Col. Livia) 5

'б ÜJ LEIV-Ast02-3-165 2002 б. баклан (Ph.carbo)

с- LEIV-Ast02-3-570 2002 сорока (Р. Pica)

LEIV-Ast02-2-25 2002 ворона (С. corone)

LEIV-Ast02-2-31 2002 ворона (С. corone)

§ ■о LEIV-Ast02-2-205 2002 грач (С. frugilegus) 6

I LEIV-Ast02-2-208 2002 грач (С. frugilegus)

1 03 LEIV-Ast02-2-298 2002 грач (С. frugilegus)

LEIV-Ast02-2-2044 2002 грач (С. frugilegus)

3. Генетический анализ штаммов вируса ЗН выделенных от птиц в дельте Волги в 2001 и 2002 гг.

Для изучения генетических характеристик выделенных штаммов ЗН нами были определены нуклеотидные последовательности 5'- концевой области их генома, в которую вошли 5'-НТР и гены всех структурных белков. Результаты анализа полученных нуклеотидных последовательностей показал, что выделенные штаммы чрезвычайно близки между собой, четыре из них з рассматриваемой области генома идентичны, остальные несут по сравнению друг с другом от 1 до 3 нуклеотидных замен.

Ранее в дельте Волги во время крупной вспышки ЛЗН в 1999 г. от больного был выделен штамм вируса ЗН ЬЕ1У-А5й-986. Большой интерес для нас представляло сравнение выделенных штаммов именно с ним. Сравнение нуклеотидных последовательностей показало, что выделенные нами штаммы в рассматриваемой области генома обнаруживают с А^г986 крайне низкое расхождение. У них обнаруживаются (по сравнению с ним) от четырех до восьми нуклеотидных замен. Минимальное число замен - четыре найдено у штамма ЬЕ1У-АзШ1-66, который был выделен в 2001 г. У всех штаммов выделенных в 2002 г. число нуклеотидных замен не менее 5. Был проведен ретроспективный анализ накопления нуклеотидных замен среди штаммов, выделенных в дельте Волги с 1999 г. по 2002 г. При этом мы также использовали штамм ЬЕ1У-Аз1901, который был здесь выделен от больного в 2000 г. Как видно из рисунка 5, штамм ЬЕ1У-А&901 (2000 г.) отличается от ЬЕ1У-Акй-986 (1999 г.) в рассматриваемой области генома двумя заменами в позициях 702 и 1432. Эти же замены встречаются и у штаммов выделенных нами в 2001 и 2002 гг. У штамма ЬЕ1У-АзШ1-66 (2001 г.) появляется еще две замены. Одна в позиции 606, а другая, в позиции 2361. Причем последняя встречается у всех штаммов выделенных в 2002 г. Также у всех штаммов 2002 г. появляются две общие замены в позициях 528 и 2319. Таким образом, показано, что накопление нуклеотидных замен в

Рисунок 5. Схематичное изображение накопления нуклеотидных замен в структурной области генома, штаммов вируса ЗН, выделенных в Дельте волги в 1999 - 2002 г. Замены выделены в кодонах жирным. Замены, приводящие к замене аминокислоты подчеркнуты.

рассматриваемой области генома происходило постепенно, от 2 до 5 в год (Рис.5).

На основе полученных нуклеотидных последовательностей были предсказаны аминокислотные последовательности соответствующие структурным белкам выделенных нами штаммов вируса ЗН. Их сравнение с аналогичными последовательностями штамма LEIV-Ast986 показало, что они отличаются от него максимум в трех позициях (Табл.4). Максимальное число аминокислотных замен (три) обнаружено у штамма LEIV-Ast02-3-165. У штамма LEIV-Ast02-2-25 аминокислотных замен не обнаружено (хотя у него найдено 5 нуклеотидных замен). В основном аминокислотные замены встречаются в оболочечном белке Е. Замена в нуклеокапсидном белке (core) отмечена только у штамма LEIV-Ast02-2-165, и одна замена в белке ргеМ найдена у штамма LEIV-Ast02-3-146.

Таблица 4. Аминокислотные замены в структурных белках штаммов вируса ЗН, выделенных в 2001 и 2002 гг. в дельте Волги. По сравнению со штаммом

Astr986-99

Аминокислотные замены

Штамм (позиция от N-конца белка) Число замен

Ast02-3-165 Met -» Lys (21 core) Met -> Val (48 E) Pro-> Тут (156 E) 3

Ast01-66 Pro Ser (156 E) 1

Ast02-2-25 -

Ast02-2-205 Ast02-2-208 Ast02-3-570 Ast02-2-31 Pro -> Ser (156 E) 1

Ast02-2-2044 Ast02-2-298 Asn-> Ser (154 E) Pro-»Ser (156 E) 2

Ast02-3-717 Asn-> Ser (277 E) Pro Ser (156 E) 2

Ast02-3-146 Ser-» Asn (28 preM) Pro -> Ser (156 E 2

154 H G N Y H G N Y

157 P T Q I S T Q I

H M H G

Y S T Q I

Y S T Q I

Y P T Q I

Y Y T Q I

Y S T Q I

Y s T Q I

Y s T Q I

Y s T Q I

Y s T Q I

Y s T Q I

Y s T Q I

í 1> 1 и i

Y s T Q I

Y s T Q I

Y s T Q V

Y s T Q V

Y s T Q V

Y s T Q M

Y F T Q T T

- - - - 1 I

- - - - I

- - - - I

- s A Q N

Y s T Q Q

Ast986 Ast901 Ast02-2-298 Ast02-2-2044 Ast02-2-25 Ast02-3-165 AstC2-2-31 Ast02-3-570 Ast02-2-205 Ast02-2-208 Ast02-3-146 Ast02-3-717 Ast01-66

Kg'IÜI-

Hp-94

RO-97

ISR-98

NY99-Fla

NY00-crow3356

Vlg99

KUNMRM61C

WNVFCG

3266

UGA-Ent63134 SEN-ArD78016 Krsn88-190 Ig2266

Л

II

п/г IV

ra

Рисунок 6. Сайт потенциального гликозилирования белка Е у различных штаммов вируса ЗН. Справа указана групповая принадлежность представленных штаммов. Рамкой обозначены штаммы, выделенные в настоящей работе.

Все выделенные нами штаммы (кроме штамма LEIV-Ast02-2-25) несут отличную от LEIV-Ast986 аминокислоту в позиции 156 от N - конца белка Е. В основном здесь встречается замена PrO(i56> -> Ser, а у штамма LEIV-Ast02-3-165 Pro(i56) -> Туг. Еще два штамма (LEIV-Ast02-2-298 и LEIV-Ast02-2-2044) отличаются от LEIV-Ast986 заменой в позиции 154 белка Е (Asn^isí) Ser). Здесь нужно отметить, что что в данной позиции 154-157 а/к расположен единственный в белке Е сайт потенциального гликозилирования. У различных изолятов вируса ЗН структура данного сайта может быть разной (Рис.6). Наиболее часто он встречается в виде (j54)NYST(i57), при этом сайт является

функционально активным, оболочечный белок Е гликозилируется. При форме сайта функциональная активность сайта сохраняется и белок

также гликозилируется. Однако, при структуре сайта как

например у индийского изолята Ig2266, или у выделенных нами штаммов LEIV-Ast02-2-298 и LEIV-Ast02-2-2044, функциональная активность сайта утрачивается и гликозилирования белка Е не происходит (Berther et al., 1998). Кроме того, у некоторых штаммов второй и четвертой группы данный сайт может быть делегирован (Рис.6). Значение гликозилирования белка Е в настоящее время не до конца выяснено. Предполагается, что гликозилирование белка оказывает определенное влияние на патогенные свойства штаммов. Причем, это связывают как с рецепторной функцией белка Е, так и с его иммуногенными свойствами, поскольку он является основным посредником во взаимоотношениях вируса с иммунной системой хозяина. Среди штаммов, выделенных в нашей работе (на Рис.6 обозначены рамкой) структура данного сайта обнаружена в четырех формах. У 7 штаммов этот сайт представлен часто встречающейся формой У двух штаммов здесь расположена

последовательность с утратой гликозилирования. У одного

штамма здесь сайт (ij4)NYPT(U7), как и у штамма LEIV-Ast986. И еще один штамм LEIV-Ast02-3-165 несет сайт (i54)NYYT(i57). Такая форма сайта среди известных нам изолятов вируса ЗН больше не встречается. Поскольку изучаемые штаммы обладают практически идентичными аминокислотными последовательностями в остальных областях структурных белков, вариабельность именно в данном сайте указывает на его большое, в настоящее время не выясненное, значение в биологии вируса ЗН.

На рисунке 7. представлена дендрограмма построенная на основе сравнения нуклеотидных последовательностей структурной области генома. Как видно из рисунка, все штаммы, выделенные в настоящей работе от птиц в дельте Волги, отнесены к первой филогенетической группе. Данный результат не является неожиданным. Занос на данную территорию штаммов других групп представляется маловероятным, поскольку птицы, живущие или мигрирующие

через дельту Волги, зимуют в массе своей на территориях эндемичных именно

для штаммов первой группы (Львов, 2000)

Рисунок 7. Дендрограмма, построенная на основе сравнения нуклеотидных последовательностей структурной области генома штаммов вируса Западного Нила. Справа указана групповая принадлежность представленных изолятов. Рамкой выделены штаммы выделенные в Астраханской области в 1999 - 2002 гг.

На рисунке 8. представлена дендрограмма объединяющая штаммы первой филогенетической группы. В данном случае дендрограмма строилась на основе сравнения не всей структурной области, а только части гена оболочечного белка Е, что широко применяется в мировой практике (Berther et al., 1998; Burt et al., 2002; Scherret et. al., 2001, 2002). Как видно из рисунка, штаммы, выделенные в дельты Волги образуют обособленный "Астраханский" кластер.

Рисунок 8. Дендрограмма, построенная на основе сравнения части гена Е, штаммов вируса ЗН первой филогенетической группы. Рамкой обозначены штаммы, выделенные в Астраханской области в 1999-2002 г.

22

ВЫВОДЫ

1. Разработана высокоспецифичная ОТ-ПЦР тест - система для детекции вируса Западного Нила в биологических образцах с чувствительностью до 50 БОЕ/мл. Разработанная тест - система защищена патентом РФ №2199589 от 27.02.2003 г.

2. Определены уровни зараженности вирусом Западного Нила птиц в дельте Волги и Волго - Ахтубинской пойме. По результатам обследования методом ОТ-ПЦР, зараженность птиц в дельте Волги составила 13,3 % и 9,6 % в 2001 и 2002 гг. соответственно. Зараженность птиц Волго — Ахтубинской поймы составила в 2002 г. 3,3 %. Полученные результаты отражают высокий уровень напряженности природных очагов вируса Западного Нила в дельте Волги и могут быть использованы для комплексной эпидемиологической оценки активности вируса Западного Нила в регионе.

3. Определена первичная структура 5'-концевой области (протяженностью 2400 н.о.) генома 11 штаммов вируса Западного Нила, выделенных в дельте Волги от птиц в 2001 и 2002 гг. Результаты сравнения первичной структуры 5'-нетранслируемого региона и генов белков вириона (core, ргеМ, Е) с аналогичными последовательностями изолятов вируса Западного Нила различного географического происхождения позволили отнести изученные штаммы к первой филогенетической группе.

4. Генетический анализ 11 штаммов вируса Западного Нила, выделенных в дельте Волги от птиц в 2001 и 2002 гт. показал их практически полную идентичность со штаммами LEIV-Ast986 и LEIV-Ast901, выделенными здесь в 1999 и 2000 гг. от больных во время вспышки лихорадки Западного Нила. Полученные данные свидетельствуют о тесной связи вирусной популяции, циркулирующей среди птиц, с эпидемическими штаммами вируса.

5. Структура сайта потенциального гликозилирования обол очечного белка Е (позиция 154 - 157 а.о.) у изученных штаммов вируса Западного Нила представлена в четырех формах. У 7 штаммов сайт представлен последовательностью 154NYST157. Два штамма несут здесь замену Ser(i56)—>Рго и Ser(ij6)~>Tyr соответственно. У двух штаммов (LEIV-Ast02-2-2044 и LEIV-Ast02-2-298), вследствие замены Asn^is^—»Ser, функциональная активность сайта элиминирована.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Прилипов А.Г., Самохвалов Е.И., Львов Д.К., Громашевский В.Л., Бутенко A.M., Вышемирский О.И., Ларичев В.Ф., Гайдамович С.Я, Хуторецкая Н.В., Воронина А.Г., Новиков Д.В., Мохонов В.В. Альховский СВ. Генетический анализ вирусов лихорадки Западного Нила, выделенных на юге Русской равнины // Вопр. вирусол.-2001.-№1.-С.8-12.

2. Прилипов А.Г., Кинни P.M., Самохвалов Е.И., Сэведж Г., Альховский С.В., Тсучия Р., Громашевский В.Л., Садыкова Г.К., Шаталов А., Вышемирский О., Усачев Е., Мохонов В., Воронина А., Бутенко A.M., Ларичев В.Ф., Жуков А., Ковтунов А., Гублер Д., Львов Д.К. Анализ новых вариантов вируса лихорадки Западного Нила // Вопр. вирусол.-2002.-№4.-С.36-41.

3. Львов Д.К., Джаркенов А.Ф., Львов Д.Н., Аристова В.А., Ковтунов А.И., Громашевский В.Л., Вышемирский О.И., Галкина И.В., Альховский С.В., Самохвалов Е.И., Прилипов А.Г., Дерябин П.Г., Одолевский Е.И., Ибрагимов P.M. Изоляция вируса лихорадки Западного Нила от большого баклана Phalacrocorax carbo, вороны Corvus corone и собранных с нее клещей Hyalomma marginatum в природных и синантропных биоценозах в дельте Волги (Астраханская область, 2001) // Вопр. вирусол.-2002.-№5.-С.7-12.

4. Прилипов А.Г., Кинни P.M., Самохвалов Е.И., Сэведж Г., Альховский С.В., Тсучия Р., Громашевский В.Л., Садыкова Г.К., Шаталов А.,

Вышемирский О., Усачев Е., Мохонов В., Воронина А., Бутенко A.M., Ларичев В.Ф., Гублер Д., Львов Д.К. Филогенетический анализ новых вариантов вируса Западного Нила // тезисы докл. П-й научн. конф. "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера" 29-31 мая 2002 г. -Новосибирск.-СЛ75.

5. Альховский С.В., Львов Д.Н., Самохвалов Е.И., Прилипов А.Г., Львов Д.К., Аристова В.А., Грамашевский В.Д., Джаркенов А.Ф., Ковтунов А.И., Дерябин П.Г., Одолевский Е.И., Ибрагимов P.M. Обследование птиц дельты Волги (Астраханская область, 2001 г.) на наличие вируса лихорадки Западного Нила методом обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции // Вопр. вирусол.-2003.-№1.-С.14-17.

6. Щелканов М.Ю., Альховский С.В. Арбовирусные инфекции в экосистемах Волга - Ахтубы и верхней дельты Волги // тезисы докл. Ш-й конф. молодых ученых России "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины" 20-24 января 2004 г.-Москва.-с.460.

7. Lvov D.K., Butenko A.M., Gromashevsky V.L., Kovtunov A.I., Prilipov A.G., Kinney R., Aristova V.A., Dzharkenov A.F., Samokhvalov E.I., Savage H., Shchelkanov M.Y., Galkina I.V., Deryabin P.G., Gubler D., Kulikova L., Alkhovsky S., Moskvina T.M., Zlobina L., Sadykova G.K., Shatalov A.G., Lvov D.N., Usachev E., Voronina A.G. West Nile virus and other zoonotic viruses in Russia: examples of emerging - reemerging situation // Arch. Virol.-2004.-Suppl.№18.-pp.85-96.

8. Прилипов А.Г., Львов Д.К., Самохвалов Е.И., Садыкова Г.К., Альховский С.В., Воронина А.Г. Способ обнаружения вируса лихорадки Западного Нила // Патент РФ №2199589 от 27 февраля 2003 г.

Принято к исполнению 15/04/2004 Исполнено 16/04/2004

Заказ № 139 Тираж:80экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095)318-40-68 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Альховский, Сергей Владимирович

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Экология вируса Западного Нила (ЗН) и его значение в инфекционной патологии человека.

1.1.1 Географическое распространение вируса

Западного Нила.

1.1.2 Филогенетические взаимоотношения различных изолятов вируса Западного Нила.

1.1.3 Значение членистоногих в экологии вируса Западого Нила.

1.1.4 Значение позвоночных в экологии вируса Западного Нила.

1.1.5 Клинические проявления лихорадки Западного Нила.

1.2 Молекулярно - генетическая организация вируса

Западного Нила.

Собственные исследования

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Место сбора и объем полевого материала.

2.2 Методы сбора, транспортировки, хранения и подготовки полевых материалов.

2.3 Вирусологическое обследование.

2.4 Штаммы и нуклеотидные последовательности вируса Западного Нила, использованные в работе.

2.5 Выделение тотальной РНК из осветленной клеточной или тканевой суспензии.

2.6 Реакция обратной транскрипции.

2.7 Проведение полимеразной цепной реакции.

2.8 Электрофорез ДНК.

2.9 Секвенирование ДНК.

2.10 Компьютерная обработка данных.

Глава 3. ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1 Разработка ОТ-ПЦР тест - системы для детекции вируса ЗН.

3.1.1 Подбор праймеров.

3.1.2 Определение специфичности ОТ-ПЦР тест-системы.

3.1.3. Определение чувствительности ОТ-ПЦР тест - системы.

3.2 Зараженность вирусом Западного Нила птиц дельты Волги и

Волго - Ахтубинской поймы.

3.2.1 Выявление РНК вируса Западного Нила у птиц методом ОТ-ПЦР.

3.2.1.1 Зараженность вирусом ЗНптиц в различных природных зонах дельты Волги.

3.2.1.2 Зараженность вирусом ЗН диких и синантропных птиц дельты Волги.

3.2.1.3 Выявление РНК вируса ЗН у мелких позвоночных, в дельте Волги.

3.2.2. Вирусологическое обследование птиц дельты Волги.

3.3 Генетический анализ штаммов вируса ЗН, выделенных в дельте Волги от птиц в 2001 и 2002 гг.

3.3.1 Анализ нуклеотидных последовательностей.

3.3.2 Анализ предсказанных аминокислотных последовательностей.

3.3.3 Филогенетический анализ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Штаммы вируса Западного Нила, циркулирующие на территории дельты Волги"

Актуальность проблемы

Вирус Западного Нила (ЗН), являющийся этиологическим агентом лихорадки Западного Нила (ЛЗН), широко распространен практически по всем частям света. Ареал его распространения охватывает практически весь африканский континент, Юго-Западную и Южную Азию, Южную и некоторые центральные части Европы (Львов, 2000; Hublek, 1999). Начиная с 1999 г. вирус ЗН выявляется также на территории североамериканского континента (Lancotti et al., 1999). Для Австралийского континента топотипным является вирус Кунджин, который изначально рассматривался как самостоятельная нозологическая единица. Однако данные генетических и антигенных исследований позволяют рассматривать штаммы вируса Кунджин как топотипные, характерные для Австралии изоляты вируса ЗН, отнесенные к 1-ой филогенетической группе (Scherret et al., 2001; 2002; Hall et al., 2001).

Эпидемические вспышки JI3H различного масштаба и интенсивности регистрируются практически каждый год в странах Африки и Ближнего Востока, реже в Европе и Индии, иногда в Средней Азии (Львов, 2000; Murgue et al., 2002). Особую актуальность для здравоохранения вирус ЗН приобрел после ряда крупных, сопровождающихся высокой смертностью эпидемий ЛЗН, прошедших в конце 1990-х гг. в Румынии (1996), России и США (1999), Израиле (2000). Необычной, нехарактерной для ЛЗН особенностью данных вспышек явилось большое (до 30-40 %) число случаев с поражениями ЦНС в виде менингита и энцефалита, а также высокая смертность (в среднем 10 %). В Израиле и России заболеваемость ЛЗН фиксировалась и в последующие годы, но в меньшем масштабе (Петров и др., 2001; Ковтунов и др., 2003; Bin et al., 2001). В США в 2003 г. зарегистрировано более 9000 случаев заболеваний ЛЗН, из которых около 30 % с поражениями ЦНС (www.cdc.gov). Вследствие этих событий ЛЗН была причислена к проблемам новых и вновь возвращающихся инфекций, актуальность которых для мирового здравоохранения продолжает оставаться на высоком уровне (Львов, 2000).

Вирус ЗН принадлежит роду Flavivirus (семейство Flaviviridae) и является арбовирусом. Резервуаром вируса в природе являются птицы, а основными переносчиками служат комары, преимущественно рода Culex. Инфекция JI3H относится к природно-очаговым зоонозам поскольку имеет выраженный очаговый характер (Львов и др., 1989). Природная циркуляция вируса ЗН в очаге происходит в системе птицы - комары - птицы, при этом комары также эффективно заражают и других теплокровных, в том числе человека. Зараженность вирусом ЗН птиц является важным показателем активности природного очага и позволяет прогнозировать развитие эпидемической ситуации. Особенно важную роль при этом отводят синантропным птицам, массово заселяющих населенные пункты и их окрестности.

В нашей стране активные очаги ЛЗН, сохраняющиеся на протяжении десятилетий, расположены в Астраханской области, на территории дельты Волги. Здесь почти ежегодно фиксируется спорадическая заболеваемость ЛЗН, иногда эпидемические вспышки. Институтом вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН на территории Астраханской области проводится мониторинг циркуляции ЛЗН, который включает в себя наблюдения за вирусной активностью во всех звеньях экологической системы вирус -переносчики — позвоночные хозяева - переносчики - люди. Настоящая работа выполнена в рамках данного мониторинга и посвящена исследованию вовлеченности в циркуляцию вируса ЗН птиц в дельте Волги и Волго -Ахтубинской пойме.

Цель и задачи работы.

Цель настоящей работы заключалась в обследовании птиц дельты Волги и Волго - Ахтубинской поймы относительно зараженности вирусом ЗН и изучении генетических свойств циркулирующих здесь штаммов вируса

Западного Нила. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Разработать тест - систему на основе ОТ-ПЦР для чувствительной и специфичной детекции вируса ЗН в биологических образцах.

2. С использованием разработанной ОТ-ПЦР тест - системы определить уровни зараженности вирусом ЗН птиц дельты Волги и Волго - Ахтубинской поймы в 2001 и 2002 гг.

3. Определить нуклеотидную последовательность структурной области генома штаммов вируса ЗН, выделенных от птиц дельты Волги и Волго - Ахтубинской поймы в 2001 и 2002 гг.

4. На основании полученных нуклеотидных последовательностей провести филогенетический анализ и определить генетические характеристики выделенных штаммов вируса ЗН.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработана чувствительная и высокоспецифичная ОТ-ПЦР тест - система для детекции вируса ЗН в биологических образцах.

2. Определены показатели зараженности вирусом ЗН птиц в дельте Волги и Волго - Ахтубинской поймы в 2001 и 2002 гг.

3. Определены молекулярно - генетические характеристики штаммов вируса ЗН, выделенных от птиц в дельте Волги в 2001 и 2002 гг.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Разработана ОТ-ПЦР тест - система для специфичной детекции вируса ЗН в биологических образцах с чувствительностью до 50 БОЕ/мл. При разработке системы использовались нуклеотидные последовательности штаммов вируса ЗН, принадлежащие ко всем известным филогенетическим группам, что обеспечило максимально возможную, на данный момент, универсальность тест - системы. Использование разработанной системы целесообразно при проведении исследований, посвященных вирусу ЗН, в которых необходима быстрая и надежная детекция вируса в биологических образцах, в том числе и с диагностическими целями. Разработанная тест -система защищена патентом РФ №2199589 от 27.02.2003.

Впервые в России проведено масштабное исследование зараженности вирусом ЗН птиц в природных очагах дельты Волги и Волго - Ахтубинской поймы с использованием ПЦР. Всего обследовано более 1000 птиц, принадлежащих к 20 различным семействам, собранных как в диких, так и в антропогенных биоценозах. Согласно полученным результатам уровень зараженности вирусом ЗН птиц в дельте Волги составил 13,3 % и 9,6 % в 2001 и 2002 гг. соответственно. Зараженность птиц Волго - Ахтубинской поймы в 2002 г. не превысила 3,3 %. Зараженность вирусом ЗН синантропных птиц составила в 2002 г. в дельте Волги 16,9 %, а на территории Волго - Ахтубинской поймы 4,1 %.

В результате вирусологического обследования, от птиц дельты Волги и Волго - Ахтубинской поймы было выделено 12 штаммов вируса ЗН. При этом два штамма вируса были выделены в 2001 г. и 10 штаммов в 2002 г. Для изучения их молекулярно - генетических характеристик, у 11 выделенных штаммов были определены нуклеотидные последовательности 5'-концевой области генома, включающей в себя 5'-нетранслируемый регион и гены всех структурных белков. На основе сравнения полученных нуклеотидных последовательностей было показано, что выделенные штаммы вируса ЗН практически идентичны штамму Ast986, выделенному здесь в 1999 г. от больного во время крупной вспышки J13H, и несут в рассматриваемой области (по сравнению с ним) от 4 до 8 нуклеотидных и до 3 аминокислотных замен. Полученные результаты свидетельствует о тесной связи вирусной популяции, циркулирующей среди птиц, с эпидемическими штаммами вируса.

Показано, что сайт потенциального гликозилирования оболочечного белка Е у штаммов, выделенных в дельте Волги от птиц, представлен в четырех формах, при этом у двух штаммов, вследствие замены Asn(154)—»Ser, функциональная активность сайта элиминирована.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Альховский, Сергей Владимирович

выводы

1. Разработана высокоспецифичная ОТ-ПЦР тест - система для детекции вируса Западного Нила в биологических образцах с чувствительностью до 50 БОЕ/мл. Разработанная тест — система защищена патентом РФ №2199589 от 27.02.2003 г.

2. Определены уровни зараженности вирусом Западного Нила птиц в дельте Волги и Волго - Ахтубинской пойме. По результатам обследования методом ОТ-ПЦР, зараженность птиц в дельте Волги составила 13,3% и 9,6% в 2001 и 2002 гг. соответственно. Зараженность птиц Волго - Ахтубинской поймы составила в 2002 г. 3,3 %. Полученные результаты отражают высокий уровень напряженности природных очагов вируса Западного Нила в дельте Волги и могут быть использованы для комплексной эпидемиологической оценки активности вируса Западного Нила в регионе.

3. Определена первичная структура 5'-концевой области (протяженностью 2400 н.о.) генома 11 штаммов вируса Западного Нила, выделенных в дельте Волги от птиц в 2001 и 2002 гг. Результаты сравнения первичной структуры 5'-нетранслируемого региона и генов белков вириона (core, ргеМ, Е) с аналогичными последовательностями изолятов вируса Западного Нила различного географического происхождения позволили отнести изученные штаммы к первой филогенетической группе.

4. Генетический анализ 11 штаммов вируса Западного Нила, выделенных в дельте Волги от птиц в 2001 и 2002 гг. показал их практически полную идентичность со штаммами Ast986 и Ast901, выделенными здесь в 1999 и 2000 гг. от больных во время вспышки лихорадки Западного Нила. Полученные данные свидетельствуют о тесной связи вирусной популяции, циркулирующей среди птиц, с эпидемическими штаммами вируса.

5. Структура сайта потенциального гликозилирования обол очечного белка Е (позиция 154 - 157 а.о.) у изученных штаммов вируса Западного Нила представлена в четырех формах. У 7 штаммов сайт представлен последовательностью 154NYST157. Два штамма несут здесь замену Ser(i56)—»Рго и Ser(i56)—»Туг соответственно. У двух штаммов (LEIV-Ast02-2-2044 и LEIV-Ast02-2-298), вследствие замены Asn(i54)—»Ser, функциональная активность сайта элиминирована.

Благодарности

Считаю своим приятным долгом выразить глубочайшую признательность директору Института вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН академику Д.К. Львову, оказавшего большую честь, предоставив возможность выполнения данной работы. Отдельно хотелось поблагодарить В. Л. Громашевского, М.Ю. Щелканова, В.А. Аристову и весь коллектив лаборатории экологии вирусов, за неоценимую помощь в выполнении работы и доброжелательное отношение. Также выражаю благодарность А.Г. Прилипову за ценные советы и помощь в работе с нуклеотидными последовательностями. Хотелось поблагодарить A.M. Бутенко, В.Ф. Ларичева, а также всех сотрудников Института вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН с кем мне посчастливилось общаться в ходе выполнения работы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Альховский, Сергей Владимирович, Москва

1. Березин В.В., Решетников И.А. Вирус лихорадки Западного Нила у диких птиц (эксперементальные данные) // в кн.: Вирусы, экологически связанные с птицами. Омск. инст. проиродноочаг. инф.-Омск.-1971.-С.93-94.

2. Булычев В.П., Данияров А., Гордеева З.Е. Выделение вируса Западного Нила от комаров Culex pipiens в Таджикистане //в кн.: Арбовирусы.Инст.виросологии им.Д.И.Ивановского АМН СССР.-М.-1981,-с.95-96.

3. Бутенко A.M.,Чумаков М.П., Беляева А.П. Серологическая идентификация астраханского вируса из клещей //В кн.: Клещевой энцефалит, кемеровская клещевая лихорадка и другие арбовирусные инфекции / Под ред.М.П.Чумакова.-М.-1964.-С.7-9.

4. Бтенко A.M.,Чумаков М.П., Башкирцев В.Н. Новые данные об изучении инфекции Западного Нила в СССР // Материалы 15-й научн. сессии ИГТВЭ АМН СССР.-М,-1968.-Вып.3.-С. 175-176.

5. Бутенко A.M.,Чу маков М.П., Башкирцев В.Н. Выделение штамма вируса Западного Нила в Астраханской области из комаров и вороны // в кн.: Этиология, эпидемиология и клиника КГЛ и лихорадки Западного Нила / под ред. М.П. Чумакова.-Астрахань.-1969.- С.39-40.

6. Виноград И.А., Белетская Г.В., Чумаченко С.С., Ардаматская Т.Н., Рогочий Е.Г. Изоляция вируса Западного Нила в южной Украине // Вопр. вирус.-1982.-№5.-С.55-57.

7. Войнов И.Н., Рытик П.Г., Григорьев А.И. Арбовирусные инфекции в Белоруссии / Вирусы и вирусные инфекции человека.-М.-1981.-С.86-87.

8. B.Р. Обухова.-Новосибирск.:Наука.-1972.-С.229-313.

9. Жданов В.М., Львов Д.К. Эволюция возбудителей инфекционных болезней.-М. Медицина.-1984.-270 с.

10. Львов Д.К. Лихорадка Западного Нила // Вопр.вирусол.-2000.- №2. С.24-34.

11. Львов Д.К., Клименко С.М., Гайдамович С.Я. Арбовирусы и арбовирусные инфекции.-М. :Медицина.-1986.-336 с.

12. Львов Д.К., Лебедев А.Д. Экология арбовирусов.-М.:Медицина.-1974.-184 с.

13. Сиденко Б.Ф., Думина А.Л., Грекова B.C. Циркуляция вируса Западного Нила среди птиц Украинского Причерноморья // в кн.: Экология вирусов, вып I.-M.-1973.- с.164-169.

14. Ставицкий А.В. Изучение восприимчивости диких уток к вирусу Западного Нила // в кн.: Вирусы, экологически связанные с птицами. Омск. инст. проиродноочаг. инф.-Омск.-1971 .-с. 18-19.

15. Федотова Т.Н., Ставский А.В., Федоров В.Г. Лихорадка Западного Нила у эксперементально инифицированных грачей // в кн.: Вирусы, экологически связанные с птицами. Омск. инст. проиродноочаг. инф.-Омск.-1971.-С. 19-22.

16. Чумаков М.П., Беляева А.П., Бутенко A.M., Мартьянова Л.И. Вирус Западного Нила в СССР // Эпидемиология вирусных инфекций.-1968.-Т. 12.-С.365-373.

17. Чумаков М.П., Бутенко A.M., Башкирцев В.Н. Выделение вируса Западного Нила от больных людей в Астраханской области // Этиология, эпидемиология и клиника крымской геморрагической лихорадки и лихорадки Западного Нила.-Астрахань.-1969.-С.36-3 8.

18. Шишкина Е. О. автореф. дисс. на соискание степени канд. биол. наук.-М.-2003.

19. Adams S., Broom A., Sammels L., Harnett A., Howard M., Coelen R., Mackenzi J., Hall R. Glycosylation and antigenic variation among Kunjin virus isolates // Virology.-1995.-№206.-pp.49-56.

20. Anderson J.F., Andreadis T.G., Vossbrink C.R. Tirrel S., Wakem E.M., French R.A., Garmendia A.E., Van Kruiningen H.J. Isolation West Nile virus from mosquitoes, crow, and cooper's hawk in Conecticut // Science.-1999.-Vol.286.-pp.2331-2333.

21. Bernkopf H., Levine S., Nerson R. Isolation of West Nile virus in Israel // J. Infect. Dis.-1953 .-№93 .-pp.207-218.

22. Berthet F.X., Zeller H.G., Drouet M.T., Rauzier J., Digoutte J.P., Deubel V., Extensive nucleotide change and deletions within the elnvelope glycoprotein gene of Euro-African West Nile viruses // J.of General Virology.- 1997.-Vol.78.-pp.2293-2297.

23. Besselaar Т. G. and Blackburn N. K. Antigenic analysis of West Nile virus strains using monoclonal antibodies // Arch. Virol.-1988.-№99.-pp.75-88.

24. Blackwell J.L., Brinton M.A. Translation elongation factor-1 alpha nteracts with the 3' stem-loop region of West Nile virus genomic RNA // J. Virol.-1997.-Vol.71.-№9.-pp.6433-6444.

25. Blackwell J.L., Brinton M.A. BHK cell proteins that bind to the 3' stem-loop structure of the West Nile virus genom RNA // J. Virol.-1995.-Vol.69.-№9.-pp.5650-5658.

26. Brinton M.A., Dispoto J.H. Sequence and secondary structure analysis of the 5'-terminal region of flavivirus genome RNA // Virology.- 1988.-VoI.l62.-№2.-pp.290-299.

27. Brinton M.A., Fernandez A.V., Dispoto J.H. The 3'-nucleotides of flavivirus genomic RNA form a conserved secondary structure // Virology.-1986.-Vol. 151.-№l.-pp.l 13-121.

28. Briese Т., Jia X.Y., Huang C.,Grudy L.J., Lipkin W. Identification of Kunjin-West Nile like flavivirus in brains of patients with New York encephalitis (letter)// Lancet.-1999.-Vol.354.-pp. 1261 -1262.

29. Burt F.G., Grobbelaar A., Leman P., Anthony F., Gibson G., Swanepoel R. Phylogenetic relationships of Southern African West Nile virus isolates // Emerg. Infect. Dis.-2002.-Vol.8.-№8.-pp.820-826.

30. Campbell G., Marfin A., Lanciotti R., Gubler D. West Nile virus // Lancet.-2002.-Vol.2.-pp.519-529.

31. Chambers J., Halevy M., Nestorowicz A., Rice Ch., Lustig S. West Nile virus envelope proteins: nucleotide sequence analysis of strains differing in mouse neuroinvasiveness //J. of General Virology.-1998.-Vol.79.-pp.2375-2380.

32. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal. Biochem.-1987.-Vol. 162.-№ 1 .-pp. 156-159.

33. Coia G., Parker M.D., Speighe G., Byrne M.E., Westaway E.G. Nucleotid and complete amino acid sequences of Kunjin virus: definitive gene order and characteristics of the virus specified proteins // J. of General Virology.-1988.-Vol.69.-№ 1 .-pp. 1-21.

34. Darwish M. and Ibrahim A. Prevalence of antibodies to arboviruses in Egypt // Am. J. Trop. Med. Hyg.-1975.-№24.-pp.981-985.

35. Eidson M., Komar N., Sorhage F., Nelson R., Talbot Т., Mostoshari F. Crow deaths as a sentinel surveillance system for West Nile virus in the northeastern United States, 1999//Emerg. Infect. Dis.-2001.-№7.-pp.615-620.

36. Eidson M., Kramer L., Stone W., Hagiwara Y., Schmit K. Dead bird surveillance as an early warning system for West Nile virus // Emerg. Infect. Dis.-2001.-№7.-pp.631-635.

37. Filipe A.R. and Pinto M.R. Survey for antibodies to arboviruses in serum of animals from Southern Portugal // Am. J. Trop. Med. Hyg.-1969.-№18.-pp.423-426.

38. Filipe A.R., Isolation in Portugal of West Nile virus from Anopheles Maculipennis II Acta Virol.-1972.-№16.-pp.361.

39. Filipe A.R., de Andrade H.R. Arboviruses in the Iberian Peninsula // Acta Virol.-1990.-Vol.34.-pp. 1057-1063.

40. Gonzales M.T. and Filipe A.R. Antibodies to arboviruses in Northwestern Spain // Am. J. Trop. Med. Hyg.-1977.-№26.-pp.792-797.

41. Hall R.A., Scherret J.H., Mackenzi J.S. Kunjin virus: an Australian variant of West Nile? // Ann. N Y Acad. Sci.-2001.-Dec.-№951.-pp. 153-60.

42. Hammam H. M., Clark D. H., Price W.H. Antigenic variations of West Nile virus in relation to geography // Am. J. Epid.-1965.-№82.-pp.40-55.

43. Hammam H. M. and Price W.H. Further observation on geographic variation in the antigenic character of West Nile and Japanese В encephalitis viruses // Am. J. Epid.-1966.-№83 .-p. 113.

44. Hannoun C., Panthier R., Mouchet J. Isolation in France of the West Nile virus fron patients and from the vector Culex modestus ficalbi // C. R. Acad. Sci. Paris.-1964.-№259.-pp.4170-4172.

45. Hayes C.G. West Nile fever // в кн.: The arboviruses epidemiology and ecology / под ред. Monath T.P.-CRC press.-1989.-pp.59-88.

46. Hubalek Z. West Nile fever a reemerging mosquito-borne viral disease in Europe //Emerging Infection Disease.-1999.-Vol.5.-№ 5.-pp.643-650.

47. Jia X.Y., Briese Т., Jordan I., Rambaut A., Chi H.C., Mackenzie J.S., Hall R.A., Scherret J., Lipkin W.I. Genetic analisis of West Nile New York 1999 encephalitis virus // Lancet.- 1999.-Dec 4.,-№354.,-pp. 1971-1972.

48. Jupp P.G., Mcintosh B.M. Qantitative experiments on the vector capability of Culex (Culex) pipiens Univittatus Theobald with West Nile and Sindbis virus // J. Med. Entomol.-1970.-№7.-pp.371 -373

49. Juricova Z and Hubalek Z. Arbovirological examination of free-living dirds in the Czech Republic // Proc. 2nd European Conf. Avian medicine and Surgery.-Utrecht.-1993.-pp.507-521.

50. Juricova Z., Pinowski J., Literak I., Hahm K., Romanowski J. Antibodies to alphavirus, flavivirus and bunyavirus in house sparrows (Passer domesticus) and tree sparrows (P. montanus) in Poland // Avian Dis.-1998.-№42.-pp.182-185

51. Goddard L., Roth A.E., Reisen W., Scott T.W. Vector competence of California mosquitoes for West Nile virus // Emerg. Infect Dis.-2002.-№8.-pp.l385-1391.

52. Goldblum N., Jasinka-Klingberg W., Klingberg M.A., Marberg K., Sterk V.V. The natural history of West Nile Fever. I. Clinical observations during an epidemic in Israel // Am. J. Hyg.-1956.-Nov.-Vol.64.-№3.-pp.259-69.

53. Katz G., Rannon L., Nili E., Danon Y.L. West Nile fever occurrence in a new endemic site in the Negev // Isr. J. Med. Sci.-1989.-№25.-pp.39-41.

54. Komar N., Langevin S., Hinten S., Nemeth N., Edwards E., Hettler D., Davis В., Bowen R., Bunning M. Experimental infection of North American birds with the Ney York 1999 strain of West Nile virus // Emerg. Infect. Dis.-2003.-Vol.9.-№3.-pp.311-322.

55. Kramer L., Bernard K. West Nile virus infection in birds and mammals // Ann. N. Y. Acad. Sci.-2001 .-№951 .-pp.84-93.

56. Lanciotti R.S., Kerst A.J. Nucleic acid sequence-based amplification assays for rapid detection of West Nile and St. Louis encephalitis viruses // J. Clin. Microbiol. 2001Vol.39.-№ 12.-pp.4506-4513.

57. Le Guenno В., Bougermouth A., Azzam Т., Bouakaz R. West Nile: a deadly virus? // Lancet.-1995 .-№348.-p. 1315.

58. Malkinson M., Bannet C., Weisman Y., Pokamunski S., King R., Drouet M. Introduction of West Nile virus in Middle east by migrating White Storks // Emerg. Infect. Dis. 2002.-№8.-pp.392-397.

59. Malkinson M, Banet C. The role of birds in the ecology of West Nile virus in Europe and Africa // Curr. Top. Microbiol. Immunol.-2002.-№267.-pp.309-322.

60. Mathiot C.C., Georges A.J., Deubel V. Comparative analysis of West Nile strains isolated from human beings and animal hosts using monoclonal antibodies and cDNA restriction profiles // Res. Virol.-1990.-№141.-pp.533-543.

61. Mcintosh B.M., McGilivray G., Dicknson D., Taljaard J.J. Ecological studies on Sindbis and West Nile viruses in South Africa. IV. Infection in a wild avian population // S. Afr. J. Med. Sci.-1968.-№33.-pp.l05-l 12.

62. Mcintosh B.M., Jupp P.G., Dos Santos, Meenehan G.E. Epidemics of West Nile and Sindbis viruses in south Africa with Culex (Culex) univittatus Theobald as vector // S. Afr. J. Sci.-1976.-№72.-pp.295-300.

63. McMinn P.C. The molecular basis of virulence of the encephalitogenic flaviviruses // J. of General Virology.-1997.-Vol.78.- pp.2711-2722.

64. Murgue В., Zeller H., Deubel V. The ecology and epidemiology of West Nile virus in Africa, Europe and Asia // Curr. Top. Microbiol. Immunol.-2002.-№267.-pp. 195-221.

65. Naficy K. and Saidi S. Serological survey on viral antibodies in Iran // Trop. Geogr. Med.-1970.-№22.-pp. 183-188.

66. Nir Y., Goldwasser R., Lasowski Y., Avivi A. Isolation of arboviruses from wild birds in Israel // Am. J. Epidem.-1967.-№86.-pp.372-378.

67. Nir Y., Avivi A., Lasowski Y., Margalit J., Goldwasser R. Arbovirus activity in Israel // Isr. J. Med. Sci.-1972.-№8.-pp 1695-1701.

68. Panella NA, Kerst AJ, Lanciotti RS, Bryant P, Wolf B, Komar N. Comparative West Nile virus detection in organs of naturally infected American Crows (Corvus brachyrhynchos) //Emerg. Infect. Dis.-2001. Vol.7.-№4.-pp.754-755.

69. Porter K.R., Summers P., Dubois D., Puri В., Nelson W., Henchal E., Oprandy J.J., Hayes C.G. Detection of West Nile virus by the polymerase chain reaction and analysis of nucleotide sequence variation // Am. J. Trop. Med. Hyg.-1993.-№48.~ pp.440-446.

70. Perelman A. and Stern J. Acute pancreatitis in West Nile fever // Am. J. Trop. Med. Hyg.-1974.-№23.-pp. 1150-1152.

71. Pierre V., Drouet M.T., Deubel V. Identification of mosquito-borne flavivirus sequences using universal primers and reverse transcription / polymerase chain reaction // Res. Virol.-1994.-№ 145.-pp.93-104.

72. Rice C.M., Strauss E.G., Strauss J.H. Structure of the flavivirus genome // В кн.: The Togaviridae and Flaviviridae / Под ред. M.J. Shlesinger.-New York.:Plenum.-1986.-pp.279

73. Rice C.M., Lenches E.M., Eddy S.R., Shin J., Sheets R.L., Strauss J.H. Nucleotide sequence of yellow fever vims: implications for flavivirus gene expression and evolution // Sciens.-1985.-№299.-pp.726-733.

74. Ryan M.D., Monaghan S., Flint M. Virus-encoded proteinases of the Flaviviridae // J.of General Virology.-1998.-Vol.79.-pp.947-959.

75. Sardelis M.R., Turell M.J., Dohm D.J., O'Guinn M. Vector competence of select North American Culex and Coquillettidia mosquitoes for West Nile virus // Emerg. Infect. Dis.-2001 .-№7-pp. 1018-1022.

76. Savage H.M., Ceianu C., Nicolescu G., Karabatsos N., Lanciotti R., Vladimirescu A., Laiv L., Ungureanu A., Romanca C., Tsai Т.Е.//Am. J. Trop. Med. Hyg.-1999.-Vol.61.-№.4.-pp.600-611.

77. Scherret J.H., Poidinger M., Mackenzie J.S., Broom A.K., Deubel V., Lipkin W.I., Briese Т., Gould E.A., Hall R.A. The relationships between West Nile and Kunjin viruses // Emerg. Infect. Dis.-2001.-Vol.7.-№4.-pp.697-705.

78. Scherret J.H., Mackenzie J.S., Hall R.A., Deubel V., Gould E.A. Phylogeny and molecular epidemiology of West Nile and Kunjin viruses // Curr. Top. Microbiol. Immunol.-2002.-№267.-pp.373-90.

79. Shi P.Y., Brinton M.A., Veal J.M., Zhong Y.Y., Wilson W.D. Evidence for the existence pseudoknot structure at the 3' terminus of the flavivirus genomic RNA // Biochemestry.-1996.-Vol.35.-№13.-pp.4222-4230.

80. Shi P.Y., Li W., Brinton M.A. Cell proteins bind specificalli to West Nile virus minus-strand 3' stem-loop RNA // J. Virol.- 1996.-Vol.70.-№9.-pp.6278-6287.

81. Smithburn K.C., Hughes T.P., Burke A.W., Paul J.H. A neurotropic virus isolated from the blood of a native of Uganda // Am. J. Trop. Med.- 1940.-№20.-pp.471-92.

82. Smithburn K.C. Differentiation of West Nile virus from the virus of St. Louis and Japanese В encephalitis // J. Immunol.-1942.-№44.-pp.25-31.

83. Steele K., Linn M., Schoepp R., Komar N., Geisbert Т., Manduca R. Pathology of fatal West Nile virus infection in native and exotic birds during the 1999 outbreak in New York sity, New York. // Vet. Pathol.-2000.-№37.-pp.208-224.

84. Taylor R.M., Work Т.Н., Hurlbut H.S., Rizk F. A study of the ecology of West Nile virus in Egypt// Am. J. Trop. Med.-1956.-№5.-pp.579-620.

85. Triki H., Murri S., Le Gueno В., Bouattours S., Bahri O., Hili K., Sidhom M., Dellagi K. West Nile viral meningo-encephalitis in Tunisia // Med. Trop. (French).-2001.-Vol.6 l.-№6.-pp.487-90.

86. Tsai T.F. Factors changing epidemiology of Japanese encephalitis and West Nile fever // Factors in the emergence of Arbovirus disease / под ред. J. Saluzzo, B. Dodet.-Elsevier, Paris.-1997.-pp. 179-189.

87. Tsai T.F., Popovici F., Cernescu C. West Nile encephalitis epidemic in southeastern Romania// Lancet.-1998.-Vol.352.-pp.767-771.

88. Turell M.J., O'Guinn M., Oliver J. Potential for New York mosquitoes to transmit West Nile virus // Am. J. Trop. Med. Hyg.-2000.-№62.-pp.413-414.

89. Wengler G., Castle E., Leidner U., Nowak T. Sequence analysis of the membrane protein V3 of the flavivirus and of its gene // Virology.-1985.-№147.-pp.264-274.

90. Work Т.Н., Hurlbut H., Taylor R. Isolation of the West Nile virus from hooded crow and rock pigeons in the Nile Delta // Proc. Soc. Expt. Biol. Med.-1953.-№84.-pp719-722.

91. Work Т.Н., Hurlbut H., Taylor R. Indigenous wild birds of the Nile delta as potential West Nile virus circulating reservoirs // Am. J. Trop. Med.-1955.-№4.-pp.872-888.

92. Victor T.J., Malathi M., ravi V., Palani G., Appavoo N.C. First outbreak of Japanese encephalitis in two villages of Dharmapuri district in Tamil Nadu // Indian. J. Med. Res.-2000.-№l 12.-pp.l93-197.

93. Yamshchikov V.F., Compans R.W. Regulation of the late events in the flavivirus protein processing and maturation // Virology.-1993.-Vol. 193.-№1.-pp.38-51.

94. Yamshchikov V.F., Trent D.W., Compans R.W. Upregulation of signalase processing and induction of prM-E secretion by the flavivirus NS2b-NS3 protease: roles of protease components // J. Virol.-1997.-Vol.7 l.-№6.-pp.4364-4371.