Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование взаимодействия цитохрома Р-450 LM2 c NADPH-цитохром Р-450 редуктазой в микросомальной монооксигеназной реконструированной системе печени

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование взаимодействия цитохрома Р-450 LM2 c NADPH-цитохром Р-450 редуктазой в микросомальной монооксигеназной реконструированной системе печени"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСФСР

ВТОРОЙ МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ им. Н. И. ПИРОГОВА

На правах рукописи УДК 577.15.-018.1-35

НИКИТЮК Ольга Владимировна

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЦИТОХРОМА Р-450 Ш2 С ЫАОРН-ЦИТОХРОМ Р-450 РЕДУКТАЗОЙ В МИКРОСОМАЛЬНОЙ МОНООКСИГЕНАЗНОЙ РЕКОНСТРУИРОВАННОЙ СИСТЕМЕ ПЕЧЕНИ

03.00.04 - Биологическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1991

Работа выполнена в Институте биологической и медицинской химии АМН СССР.

Научный руководитель - доктор биологических наук БАЧМАНОВА Г. И.

Официальные оппоненты - доктор биологических наук САВИНА М. И., доктор биологических наук, профессор КУРГАНОВ Б. И.

Ведущая организация - Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова.

Защита диссертации состоится " у1^^ 1991 г. На

заседании специализированного Ученого совета № 6

(К. 084. 14. 05) 2-го МОЛГМИ им. Н. И. Пирогова (117513, Москва, ул. Островитянова, 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке 2-го МОЛГМИ им. Н. И. Пирогова.

Автореферат разослан " " 1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета 'кандидат медицинских наук КЛУШИНА Т. Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. среди всего многообразия дитохром P-450-содеРжаших монооксигеназных систем (АРчаков. 1983; ArchaKov. Bachmanova, 1990) особо можно выделить микросомальную монооксигеназнуго систему печени, стоящую в эволюционном аспекте на самой высокой ступени Развития. Не вызывает сомнений Функциональная значимость системы, как в процессах детоксикашш чужеродных соединений, так и в биосинтетических процессах, протекающих в печени. Поэтому, принципиально важным для понимания основных принципов Регуляции микросомальной монооксигеназы является изучение механизмов белок-белковых взаимодействий, организации каталитически активных комплексов между ее компонентами.

В последнее время для решения этой проблемы широкое использование получили сшивающие реагенты. С помощью водорастворимого кар-бодиимида получены, выделены и охарактеризованы ковалентно сшитые в ФосФолипидных визикулах гетеродимеры NADPH-ФП с цитохромами Ь5 и с (МаиК, Наик, 1989; Nisimoto, 1986; Nlsiraoto, OtsuKa-Huracami, 1988), между цитохромами Ь5 и Р-450 (Nisimoto, OtsuKa-Huracami, 1988, Tamburinl, schenKman, 1987), цитохромами Ь5 и с (HauK, МаиК, 1989, Nisimoto, OtsuKa-Huracami, 1988). Зафиксировать образование комплекса NADPH-ФП с цитохромом Р-450 LH2 со стехиометрией Ферментов 1:1 удалось в присутствии ФосФолипидов после обработ ки белок-ФосФолипидной смеси сшивающим Реагентом, однако содержание комплекса составляло не более 10%, что не позволило выделить его и охарактеризовать (Bernhardt et al. , 1984; Tamburlni et al., 1986). В то же время Nisimoto, OtsuKa-Huracami (1988); SchenKman

et al., (1991) не удалось выявить образование ковалентного комплекса HADPH-ФП и цитохрома Р-450 при обработке белков карбодиимидом в присутствии ФосФолипидов.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось выяснение молекулярных механизмов взаимодействия цитохрома Р-450 LM2 и HADPH-ФП с использованием сшивающих реагентов и кинетических параметров реакции Ы-деметилирования бензФетамина в MPC. В процессе исследования решались следующие конкретные задачи:

1. Выяснение возможности получения бинарного комплекса цитохрома Р-450 LH2 и HADPH-ФП в различных реконструированных системах и агрегатных состоянияхс использованием сшивающих реагентов (ЭЖ, ДМА, дно.

2. Исследование влияния ионной силы среды на скорость окисления бензФетамина в MPC.

3. СпектроФотометрическое исследование взаимодействия цитохрома Р-450 LM2 и HADPH-ФП В НРС.

4. Исследование кинетических параметров взаимодействия цитохрома Р-450 LM2 и HADPH-ФП в реакциях HADPH-зависимого Н-деметилирова -ния бензФетамина в НРС.

Научная новизна и практическая значимость работы. В результате проведенных исследований показано, что цитохром Р-450 LM2 и HADPH-ФП в различных реконструированных системах и агрегатных состояниях не образуют эквимолярных комплексов после обработки их сшивающими реагентами ЭДК, ДНА, дне. Образование комплекса белков в НРС не было зарегистрировано и спектрофотомет-рически. В тоже время установлено, что с увеличением ионной силы среды наблюдается снижение скорости окисления бензФетамина, что указывает на определенную роль электростатических сил во взаимо -

действии NADPH-ФП и LM2.

Рассчитана константа диссоциации комплекса гемо- и Флавопротеинов из кинетических характеристик реакций NADFH-зависимого N-деметилирования бензФетамина в MFC, составляющая 1. 5+0,5 мкй.

Обнаружено Формирование эквимолярных комплексов цитохрома Ь5 -NADFH-ФП и цитохромов Р-450 LM2-b5 при обработке белков эдк в МРС и рассчитана из спектров связывания константа диссоциации комплекса цитохромов Р-450 LH2-b5, составляющая 1,2±0, 5 'мкМ.

Апробация диссертации. Результаты исследований были доложены на конференции молодых ученых НИИ Физико-химической медицины (Москва, 1989), Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и модификация макромолекул" (Ялта, 1989), а также на совместном заседании учебно-научного комплекса каФедры биохимиии МВФ 2-го МОЛГМИ им. Н. И. пирогова и института биологической и медицинской химии АМН СССР (26 июня 1991).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 печатные работы.

структура и объем работы, диссертация изложена на 163 страницах машинописного текста, включая 21 рисунок и 14 таблиц. Состоит из введения, обзора литературы, глав, содержащих описание материалов и методов исследования, экспериментальной части с результатами исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Выделение цитохрома Р-450 LM2 из микросом печени кроликов,

индуцированных Фенобарбиталом проводили по методу Imai et al., (i960).

выделение цитохрома Ь5 из микросом печени кроликов проводили по модифицированному методу Spatz. Strittmatter (1971).

Выделение NADPH-ФП из микросом печени кроликов, индуцированных Фенобарбиталом проводили по модифицированному методу Dignam, strobel (1975).

Препараты цитохрома Р-450, Ь5, NADPH-ФП были любезно предоставлены препаративной группой лаборатории энзимологии и биоэнергетики при каФедре биохимии НБФ 2 молгми им. Н. И. Пирогова.

Содержание цитохрома Р-450 измеряли на спектрофотометре "Hltachl-557" (Япония) путем регистрации дифференциального спектра поглощения со-восстановленного комплекса гемопротеина, используя коэффициент молярной экстиндии 91 мН-1 см-1 для а450-490 (Sato, Omura, 197Ö).

Содержание NADPH-ФП определяли на спектрофотометре , "Hewlett

i

PacKard" (США) путем регистрации абсолютного спектра поглощения в в диапазоне 300-600 нм, используя коэффициент молярной зкстинции 21,4 мИ-1*см-1 для А45б (Dignam, Strobel. 1977).

Активность NADPH-цитохром с редуктазы определяли на спектрофотометре "Hewlett PacKard" (CIA) при 550 нм. Для расчета использовали программу "KlnetlK Softwear" Фирмы "Hewlett PacKard".

Содержание цитохрома Ь5 определяли на спектрофотометре "Hltachl-557"(Япония) по дифференциальной схеме. Коэффициент молярной экстинции для А424-408 восстановленной Формы гемопротеина 165 мН_1*см_1 (Omura, Sato, 1964).

Мономеризацию гемо- и Флавопротеинов проводили как описано Скоцеляс и др. (1987).

4 {

Методы химической модификации белков бифункциональными реагентами (ЭДК, ДНА. ДМС):

Мономеризованные 5 мкм растворы NADPH-ФП и LM2 в 100 (10 мМ) На-ФосФатном буфере с 0,25 г/л эмульгена, pH 6,75 (6,5, т,о, 7,5), смешивали в равных объемах, инкубировали в течение i часа при комнатной температуре и затем при встряхивании добавляли по каплям 100 мм ЭДК до конечной концентрации 10 (20 мМ). Смесь инкубировали в течение 2 (4) часов при комнатной температуре при перемешивании, Такие же условия обработки были и в случае смеси цитохрома Ь5 с NADPH-ФП или LM2. В аналогичных условиях обрабатывались переносчики в олигомерном состоянии.

Реакцию сшивания белков в мономерном (олигомерном) состоянии с ДМА, ДМС проводили как описано BasKln, Yang, (1980).

ЭлектроФоретический анализ белков в юи SDS-ПААГ проводили по методу Laemmli (1970). Денситометрировали гели на сканере "QulcK-Scan" Фирмы "Неlena-France".

Расчет молекулярного веса полипептидных цепей белков проводили по методу Weber, Osborn (1969), используя программу " Harward grafic".

определение NADPH-питохром с редуктазной активности при обработке HADFH-ФП ЭДК: 5 мкм раствор мономера NADPH-ФП смешивали с 10 ( 20 мМ) ЭДК (конечные концентрации) в 100 (10 мМ) Na-ФосФатном буфере, pH 6,75 (6,5, 7,0, 7,5) при комнатной температуре. NADPH-цитохром с редуктазную активность измеряли через 1/2, 1, 2, 3 часа, инкубации HADPH-ФП с ЭДК на спектрофотометре " Hewlett PacKard" (США) при 550 нм, 30° с. Контролем служил Флавопротеин, инкубировавшийся без эдк.

определение содержания цитохрома р-450 LM2 при обработке белка

ЭДК:

5 мкИ раствор мономера LM2 смешивали с ю (го мН) ЭДК (конечные концентрации) в юо (Ю мМ) Na-ФосФатный буфер, рН 6,75 ( 6,5, 7, о, 7, 5 ) при комнатной температуре. Определение содержания LM2 проводили через 1/г, 1, 2, 4, 6 часов инкубации с ЭДК на спектрофотометре "Hewlett FacKard" (США) по дифференциальной схеме (Sato, omura, 1978). Контролем служил гемопротеин, инкубировавшийся без эдк.

Для регистрации спектров связывания LM2 с NADPH-ФП и цитохромом Ь5 в мономерном состоянии использовали дифференциальную схему для четырехкюветной тандемной системы на спектрофотометре " Hewlett PacKard" (США). Регистрацию проводили в диапозоне от 350 до 450 нм при 30° С в юо мМ К-ФосФатном буфере, рн 7,5, содержащим 0,25 г/л эмульгена 913; концентрация LM2 составляла 1 мкН. При титровании одинаковые количества раствора NADPH-ФП (Ь5) добавляли в кювету образца, содержащую LM2, и в кювету сравнения, содержащую буфер. Одновременно эквивалентное количество буфера добавляли в кювету сравнения с LH2. Расчет K¿ проводили с использованием программы "Spec Ks/K¿. "

При определении скорости NADPH-зависимого окисления бензФетамина в MPC инкубационная смесь объемом 0,5 мл содержала 100 мм К-фосфатный буФер, рн 7,5, различные концентрации субстрата и NADPH, 1 мкм растворы мономеров LM2 и NADPH-ФП. Инкубацию проводили при 30° в течение 4 минут при постоянном встряхивании. Реакцию инициировали добавлением NADPH-ФП, останавливали добавлением ТХУ в конечной концентрации 5Х. пробы центрифугировали в течение ю минут при sooo об\мин. Цветную

реакцию для определения продуктов проводили как описано Kanaeva et al.. (1991).

kd комплекса nadph-фп и lh2 рассчитывали, определяя скорость hadph-зависимого N-деметилирования бензФетамина в mpc, при четырех Фиксированных концентрациях lm2 и различных концентрациях nadph-фп, а также при различном соотношении этих белков при их постоянной суммарной концентрации (Hiwa et al., 1979).

Принятые сокращения: ДНА - диметиладипиндиимидат, ДМС - диме-тилсуберимидат, НРС - мономерная реконструированная система, ПААГ полиакриламидный гель, ЭДК-1-этил-3-(3 диметиламинопрпил) карбодиимид, LH2 - Форма цитохрома Р-450 микросом печени, индуцируемая Фенобарбиталом, NADPH-ФП - NADPH-специфичный Флаво-протеин.

основные результаты исследования.

1. Исследование влияния условий обработки ЭДК на цитохром с редуктазную активность nadph-фп и содержание цитохрома

Р-450 LM2 В НРС.

В последнее время для выяснения структурно-Функциональных особенностей микросомальных монооксигеназ, увеличения степени их активности и стабильности, а также исследования белок-белковых взаимодействий широко используются химерные молекулы, полученные методом химических сшивок. ЭДК нашел широкое применение для ковалентного связывания электростатических пар белков в бинарные комплексы со стехиометрией 1:1 ШаиК, МаиК 1989). Поэтому, представляло интерес исследовать возможность Формирования

комплекса мономеров цитохрома Р-450 LM2 и NADPH-ФП с помощью бифункционального сшивающего реагента.

Предварительно было проведено исследование влияния условий обрабротки сшивающим реагентом (ЭДК) на стабильность цитохрома Р-450 LM2 и цитохром с редуктазную активность NADPH-ФП в мрс. инкубацию белков с ЭДК проводили при варьировании значений рН среды (6,5, 6,75, 7,0, 7,5), концентрации сшиваюшего реагента (10 и 20 мШ, ионной силы среды (10 и 100 мм Ыа-ФосФатного буфера), времени инкубации (от 30 минут до 4 часов). Проведенное исследование свидетельствовало о сохранении NADPH-цитохром с редуктазной активности Флавопротеина и стабильности цитохрома Р-450 LM2 при обработке их ЭДК (табл. 1), что позволило приступить к экспериментам по выявлению ковалентного комплекса данных белков в MPC.

Таблица 1

Исследование влияния условий обработки ЭДК на цитохром с редуктазную активность NADPH-ФП и содержание цитохрома Р-450.

Активность, Содержание,

мкмоль цит с * мин"1 * мл-1 нмоль * мл'1

условия ------- 0 2 час 0 2 час

10 ММ ЭДК+100 МИ На-ФосФатный буфер, рН 6,75 3,49 3,19 4,98 4,83

—//— 6,5 3,34 3.1 4,99 4,61

—//— 7,0 3,52 3,25 4.97 4,85

—//— 7,5 3,39 3,1 4,98 4.72

10 ММ ЭДК+10 мМ Ыа-ФосФатный бУФер, рН 6,75 3,47 3,12 4,97 4,75

20 ММ ЭДК+100 ММ Ыа-ФосФатный бУФер, рн 6,75 3,53 3,21 4,96 4,78

2. Исследование возможности Формирования бинарного комплекса LM2 -NADPH-ФП в различных агрегатных состояниях в присутствии ЭДК.

В результате обработки ЭЖ мономеров LH2 и NADPH-ФП, проводимой при различных условиях: концентрации сшивающего реагента 10 и 20 ми, концентрации белков 5 и 10 мкМ, рН среды 6,5, б,75, 7,25, времени инкубации от 30 минут до 4 часов, изменении последовательности добавления компонентов с последующим Эф-анализом в SDS-ПААГ, обнаружена дополнительная полоса в области 156 кДа (рис. 1, полоса 3) в образце, содержащем NADFH-ФП с ЭЖ. Исходя из величины молекулярной массы мономера Флавопротеина (78 кДа) можно предположить, что в присутствии ЭЖ происходит Формирование гомодимера редуктазы, в то время как LM2 не образует гомоолигомеров (рис. 1, полоса 5). в образце, содержащем смесь Флаво- и гемопротеинов с ЭЖ обнаружена полоса в области 205 кДа, с выходом не более iOv. (рис. 1, полоса 7). Исходя из величин молекулярных масс можно предположить, что данная полоса соответствует перешиванию гомодимера NADPH-ФП (156 кДа) и мономера LM2 (48 кДа), но не эквимолярному комплексу белков с молекулярной массой около 130 кДа. Отсутствие бинарного комплекса NADPH-ФП и LM2 в MPC могло обусловливаться присутствием детергента. Видимо плошадки белков, ответственные за их связывание, блокируются молекулами детергента и

электростатические пары становятся недоступными сшивающему реагенту. Поэтому, с целью исключения влияния детергента (0,25 г/л) в MPC на взаимодействие LM2 и NADPH-ФП исследовалась возможность выявления с помощью ЭЖ бинарных комплексов белков в исходном олигомерном сотоянии, в составе эквимолярных смешанных

комплексов (Скоцеляс и др. ■ 1987) (концентрация эмульгена 0,05 г/л) и реконструированной по Hilller-Enoch et ai., (1985) системе (без эмульгена). Однако и в этом случае несмотря на варьирование условий обработки белков сшивающим реагентом ковалентный комплекс Флаво- и гемопротеинов со стехиометрией 1:1 не был обнаружен.

330 ,

220

1 2 . 3 4 5 6 7

Рис. 1. электроФоретический анализ мономеров ьиг (2,5 мкм) и ШШРН-ФП (2,5 мкм) до и после обработки ю мм эдк в юо мм ыа-ФосФатном бУФере, РН 6, 75 в течение 2 часов. 1 - Белки-маркеры; 2 - ШШРН-ФП; з - ШШРН-ФП + ЭДК; 4 - ЬМ2; 5 - ЬН2 + ЭДК; б - ШШРН-ФП + ЬН2! 7 - ШШРН-ФП + ЬН2 + ЭДК.

1. Получение бинарных комплексов мономеров цитохромов b5-LM2 и цитохрома Ь5-ЫАОРН-ФП с помощью эдк.

i следующем этапе работы была предпринята попытка выявить с 1ью ЭДК бинарные комплексы в парах ЫМ>РН-ФП-Ь5 и LM2-b5 в MPC :ловиях аналогичных обработки сшивающим реагентом пары NADPH-[2. В связи с тем, что на ЭФ-граммах исследуемых образцов ■ужены полосы, соответствующие ковалентно сшитым i : 1 ексам цитохрома Ь5 (18 кДа) и LM2 (48 кДа) с молекулярной й 66 кДа (рис. 2, полоса 7), а также цитохрома Ь5 (18 кДа) и -ФП (78 кДа) с молекулярной массой 96 кДа (рис. 3, полоса 7) ствие комплекса между парой ЫАБРН-ФП-Ш2 могло овливаться, видимо, стерическими затруднениями, в силу ых с помощью эдк не удается зафиксировать электростатическое одействие между карбоксильными группами NADPH-ФП и группами LM2.

94

67 ^ Г

/

43.

30 ~

21 ~

1 2 3 4 5 6 7 i

Рис. 2. электрофоретический анализ мономеров LH2 (2.5 мкШ и Ь5 (2,5 мкШ до и после обработки 10 мН ЭДК в ши мп STthoh5 буфере, рН 6,75 в течение 2 часо* i- Белки-иаРкеРЫ, цитохром ь5; 3 - цитохром Ь5 + ЭДК; 4 - lm2 , 5 LM2 здь цитохром Ь5 + LH2; 7 - цитохром Ь5 + LM2 + ЭДК.

330 220

67 , ^ 60 (

36 Цг

I

18.5

94 67 43

30 21

12 345 6 7 8

Рис. 3:. электрофоретический анализ мономеров МОРН-ФП (2,5 мкш и цитохрома Ь5 (2,5 мкМ) до и после обработки ю мм эж в 100 мы Иа-ФосФатном буфере, РН 6,75 в течение 2 часов. 1 и 8 - Белки маркеры; 2 - цитохром Ь5; 3 - питохром ь5 + эдк; 4 -ЫАБРН-ФЦ; 5 - ЫАЛРН-ФП + ЭЖ; 6 - цитохром Ь5 + ШШРН-ФП; 7 -цитохром Ь5 + НАБРН-ФП + ЭЖ.

2. 2. Исследование возможности Формирования комплексов между 3Н-ФП, цитохромами Ь5 и ЬМ2 в различных агрегатных состояниях в присутствии ДМА, ДНС.

с целью проверки правильности предположения о том, что кование бинарного комплекса КА0РН-ФП-ЬН2 с помощью ЭДК «уднено вследствие стерических Факторов в работе шьзовались сшивающие реагенты с различной длиной спейсорной •и: ДНА (8,6 А) и ДНС (10,8 А), связывающие белки по :огруппам. Однако и в этом случае обработка ЫАОРН-ФП и ЬН2 в мерном и олигомерном состоянии бифункциональными реагентами сопровождалась образованием эквимолярных комплексов (табл. 2, Бинарные комплексы не обнаружены и в парах НАБРН-ФП-Ь5 и М2. Увеличение концентрации сшивающих реагентов от 2 до ю концентрации белков от 5 до ю мкн, времени инкубации от 1 до минут сопровождалась увеличением количества гомопродуктов Ш2 Р4) и ЫАБРН-ФП (Ф1-ФЗ), но не образованием гетеродимеров. ботка белков в различных агрегатных сотояниях (мономерном, омерном) сшивающими реагентами показала, что детергент влияет гепень сшивания (процентный выход образующихся гомоолигомеров ЫАОРН-ФП, так и ЬН2 в случае обработки белков в олигомерном эянии выше, по сравнению с их обработкой в мономерном эянии). Однако детергент не влияет на состав образующихся гктов ( см. табл. 2, 3).

Таблица г

Молекулярные массы мономеров цитохрома р-450 lm2, hadph-фп и продук tob, полученных после обработки дна.

компо поло Концентрации дна, •

ненты сы г мн 5 МН 10 ММ

Н. Н, ВЫХОД, н. м. Выход. И. M. ВЫХОД,

кда В У. кДа в г кда в г

LH2 р 48 74, 5 46 68, 4 48 63. 3

PI 96 15, 1 96 16, г 96 16. 9

Р2 144 6,4 144 7, 3 144 7, 8

РЗ - - 192 4, 1 192 4. 9

Р4 - - - 240 3, 1

ФП ф те 79. 9 78 74, 9 78 70. 9

Ф1 156 10, 1 156 11 156 11. 5

Ф2 - - 234 4, 1 234 4, 5

ФЗ - - - 312 3, 1

Ш2+ФП Р 48 37 48 35, 8 48 33, 4

Ф 78 39. 8 78 37 78 36, 5

PI 96 9.2 96 9. 7 96 10, 1

Р2 144 4,8 144 5, 2 144 5, 5

Ф1 156 9.2 156 9. 3 156 9.5

РЗ - - 192 1. 8 192 1, 9

Ф2 - - 234 1. 2 234 1.4

Р4 - - - т 240 1, 3

ФЗ - - - - 312 0. 6

Таблица 3

Нолекулярные массы олигомеров цитохрома р-450 ьнг, кабрн-фп и продуктов, полученных после обработки дне,

Компо Поло Концентрации дне,

ненты сы г мм 10 ИИ

н. м. Выход. Н. М, Выход,

кда в г кДа в ■/■

LH2 Р 48 64. 5 48 58, 4

PI 96 17.0 96 17, 5

Р2 144 8, 5 144 9, г

РЗ 192 6.0 192 6, 5

F4 - * 240 4,4

ФП Ф 78 71.7 78 66, 4

Ф1 156 13.0 156 13,4

Ф2 234 5, 3 234 5. 9

ФЗ - - 312 4. 3

LMH+ФП Р 48 34, 2 48 30, 6

Ф 78 37. 1 78 32, 4

PI 96 ю. г 96 10, 6

Р2 144 5. 8 144 6, 5

Ф1 156 9,4 156 10, 0

РЗ 192 2. 1 192 2, 8

* Ф2 234 1, 2 234 2, 5

Р4 - - 240 2,4

ФЗ - 312 2. 0

t

3. спектроФотометрическое исследование взаимодействия мономеров LM2 и NADPH-ФП.

В связи с тем, что обнаружить Формирование эквимолярного шлекса NADPH-ФП и LH2 в присутствии бифункциональных сшивающих агентов ЭДК, ДНА, ДНС не удалось предпринята попытка »ктроФотометрически зарегистрировать образование комплекса в однако в экспериментах по регистрации дифференциальных жтров связывания гемопротеина при титровании его [Вопротеином ( в концентрации от о. 2 до 3 мкН) не наблюдали ;вления спектральных изменений в области 380-440 нм, ■актерных при образовании комплекса НАБРН-ФП-ЬН2 в олигомерном тоянии (ArchaKov, Uvarov, 1985). Добавление в систему зФетамина также не приводило к Формированию комплекса белков в В то же время, при исследовании взаимодействия мономеров охромов Ь5 и LH2, проводимых в аналогичных условиях были егистрированы типичные спектры связывания 1 типа, константа социании комплекса цитохромов b5-LM2, рассчитанная из ктральных изменений составила 1,2+0,5 мкМ ( рис. 4). цовательно, LM2 в MPC способен Формировать комплекс с эхромом Ь5, что было зарегистрировано как ктроФотометрически (рис. 4), так и с помошью сшивающего ^ента ЭДК (рис. 2). Однако использование двух разных эдических подходов не позволило обнаружить комплекса мономеров и NADPH-ФП.

If'

r-l

<3'

У1 СЧ о

350 380-4 80 } 418-430

"1----1---T---T

LM2+b5.

-----^яькы

fW

550

Рис. 4. Дифференциальные спектры связывания uhtoxpomob Ь5 и LM2 В МРС..

Инкубационная смесь объемом 1.5 мл содержала 100 мМ К-ФосФатныя бУФер. РН 7.5. о, 25 г/л эмульгена 913. 1 мм бензФетамин. 1 мкМ LM2. В кювету добавляли по ю-зо мкл ю мкм цитохрома Ь5. Регистрацию спектров проводили на спектрофотометре "Hewlett PacKard" в диапозоне от 350 до 450 нм при 30°С.

4. Исследование влияния ионной силы среды на скорость реакции N-деметилирования бензФетамина в MFC.

SchenKman et al. (1991) также не удалось выявить ковалентно ззанный ЭДК комплекс гемо- и Флавопротеинов в присутствии ;Фолипида. Сделанное предположение о том, что »ктростатические взаимодействия не играют определяющей роли в >мировании комплекса данных белков было подтверждено в их >оте по данным об отсутствии влияния изменения ионной силы !ды (от 5 до 500 мН К-ФосФатного буфера) на скорость NADFH-!Нсимого восстановления, т. е. на редуктазную реакцию. В нашей ¡оте при исследовании влияния ионной силы среды на скорость кции Н-деметилирования бензФетамина в MPC (табл. 4) ановленно, что при увеличении концентрации К-ФосФатного буфера 350-500 мН имеет место, понижение скорости образования дукта, в то время как при концентрации 50-200 мм скорость авалась неизменной.

Из приведенных данных можно заключить, что электростатические имодействия играют определенную роль в механизме реакций, ализируемых цитохромом Р-450, по крайней мере на стадиях, цуюпшх после реакций переноса 1-го электрона. В тоже время, зо предположить, что в Формировании комплекса NADPH-q>n-LM2 зимают участия и гидрофобные силы, в связи с тем, что при 1ботке белков ЭДК в MPC и в других реконструированных системах slmoto, OtsuKa-Muracaml, 1988, SchenKman et al., 1991) не ;тся выявить их ковалентных комплексов, в отличие от пар <0в НАВРН-ФП-Ь5 и LM2-b5.

Таблица 4

Влияние ионной силы среды на скорость Ы-деметилирования бензФетамина в мономерной реконструированной системе.

Концентрация К-ФосФатного буфера рн 7, 5, ми v0. нмоль Формальдегида мин * нмоль Р-450

50 22, 9+1, 48

100 21, 1 + 1, 41

200 20,9+2,6

350 12, 8±0, 83

500 12, 6+0,76

Инкубационная смесь объемом 0, 5 мл содержала К-ФосФатный буфер (50, юо, 200, 350, 500) мм, pH 7,5, 1 мн бензФетамин, 2 ми NADPH, О, 5 МКН NADPH-ФП и О, 5 мкН цитохрома Р-450 LH2 в MFC. Инкубация проводилась в течение з мин при зо°с.

5. Расчет константы диссоциации комплекса ЫАОРН-ФП-ЬМг из кинетических характеристик реакции NADPH-зависимого N-деметилирования бензФетамина в MFC.

При исследовании зависимости скорости nadph-зависимого

нкй

Рис. 5. зависимость скорости КАИРН-зависимого окисления бензФетамина от соотношения наорн-фп и ьмг при их постоянной обшей концентрации: по оси абцисс указаны концентрации иаорн-фп (верхняя строка) и ьиг (нижняя строка!.

инкубационная смесь содержала 100 мМ К-ФосФатный буфер, рн 7,5. 0,25 Г/Л ЭМУЛЬГена 913, 1 МКМ ЫАСРН-фП, 1 МКМ ьмг, г ММ ИАПРН и г мМ бензФетамин, Т=30°с.

сления бензФетамина от соотношения NADFH-ФП и LM2 при их тоянной обшей концентрации обнаружено, что максимальные альные скорости образования продукта реакции соответствуют гношению молярных концентраций белков равному 1 (рис. 5). эдя из полученных результатов можно заключить, что MPC кционирует, следуя закону действующих масс для бимолекулярных кций со стехиометрией реагирующих'компонентов 1:1. Обнаруженная выше закономерность позволила оценить величину к^ 1лекса КАБРН-ФП-ЬМ2 по уравнению К^-(г-х)*(р-х) (1), где г и р зяальные концентрации Флаво- и гемопротеинов, соответственно, - концентрация комплекса [ФП*Ш2]. Для расчета х по уравнению <ат*х (2) определили величину Кках равную 57±14 мин-1 при 1едовании зависимости скорости N-деметилирования бензФетамина концентрации Флавопротеина при четырех Фиксированных шнтрациях LH2 (рис. б), подставив значение Ккат в уравнение 2 :читали х для каждого соотношения NADPH-ФП и LH2 (рис. 5), и ¡льзовали ее для расчета К^ по уравнению 1. Величина Кд 'авила 1,5+0,5 мкн.

лиг). мкН

Рис б. зависимость скорости HADPH-зависимого окисления бензФетамина от концентрации hadfh-ФП при различных концентрациях

LH2.

Инкубационная смесь содержала юо ми к-фос«атный буфер, рН 7,5,

0.25 г/л эмульгена 913 и различные концентрации NADPH-ФП.

1, 2, 3, 4 - 0,25, 0,5, 1,0, 1,5 мкН растворы мономеров LM2, соответственно.

19

I

выводы

í. Показано, что несмотря на то. что электростатические силы играют определенную роль во взаимодействии NADPH-ФП и цитохрома Р-450 LM2 обработка изолированных Флаво - и геморотеинов ЭДК, связывающим белки по карбоксильным и аминогруппам, не сопровождается выявлением ковалентных комплексов этих белков. Комплексы не обнаружены при обработке белков карбодиимидом в Различных условиях (при изменении ионной силы, РН среды, концентрации Ферментов и сшивающего реагента, времени инкубации, агрегатного состояния белков: олигомеры, мономеры, смешанные комплексы).

2. В то же время, после обработки.ЭДК смеси мономеров цитохрома Ь5 с NADPH-ФП и цитохрома Ь5 с LH2 обнаружено Формирование ковалентных комплесов данных пар белков со стехиометрией 1:1.

3. При использовании ДМА. и ДМС, связывавших белки по аминогруппам. образования эквимолярных комплексов между мономерами NADPH-ФП и LH2, NADPH-ФП и цитохромом Ь5, цитохромом Ь5 и LM2 не наблюдали. На ЭФ-граммах обнаружены полосы, соответствующие высокомолекулярным гомоолигомерам как NADPH-ФП, так и LM2.

4. Показано, что цитохром Р-450 LH2 в мономерном состоянии образует типичные спектры связывания 1 типа с питохромом Ь5 (K¿-1. 2 мкМ), но не с NADPH-ФП.

5. Определение скорости NADPH-зависимого ы-деметилирования бензФетамина в MPC при различном соотношении Флаво- и гемопротеинов позволило Рассчитать константу диссоциации комплекса NADPH-ФП и LM2, равную 1,5 мкм.

Список публикаций по теме диссертации:

1. G. Bachmanova, I. Kanaeva, I. DedinsKil, О. NiKltyuK, A. lacov. interaction of NADPH-cytochrome P-450 reductase and ^chrome P-450 LM2 monomers m reconstituted monooxygenase Lem. // Drug metabolizing enzymes: Genetics, regulation and Lcology (ingelman-Sundberg M. et. al., edc. ) - StocKholm. -). - P. 121.

I. Канаева И. П. , Севрюкова И. ф. , Никитюк О. В., Скоцеляс Е. Д. , 1анова Г. И. Кинетические параметры NADPH-зависимых реакций в юсомах и мономерной реконструированной системе. // Тезисы I. Всесоюз. конФер. "Цитохром Р-450 и модификация 'омолекул". - Ялта, 1989. - С. 225-226.

!. G. Bachmanova, I. Kanaeva, D. Davydov, О. NiKltyuK, I. .nsKii. Liver microsomal monomeric reconstituted .em: Structure and properties. //Abstracts of 7-th internation 'erence " Biochemistry & biophysics of cytochrome P-450; icture s Function, Biotechnological & Ecological Aspects" -:ow. - 1991. - P. 13.