Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование водной растительно-микробной ассоциации в условиях нефтяного загрязнения

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование водной растительно-микробной ассоциации в условиях нефтяного загрязнения"

Д - 5/ГУлг

На правах рукописи

ТУМАЙКИНА Юлия Александровна

ИССЛЕДОВАНИЕ ВОДНОЙ РАСТИТЕЛЬНО-МИКРОБНОЙ АССОЦИАЦИИ В УСЛОВИЯХ НЕФТЯНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ

03.00.07 - микробиология 03.00.04 - биохимия

Автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов - 2005

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН) и Саратовском государственном университете им. Н.Г. Чернышевского.

Научные руководители:

доктор биологических наук, О.В. Турковская доктор биологических наук, профессор В.6. Игнатов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор М.Б. Вайнштейн доктор биологических наук, Л.В. Карпуннна

Ведущая организация:

Институт фундаментальных проблем биологии РАН (г. Пущино, Московская обл.)

Защита диссертации состоится 26 декабря 2005 г. в 13 ч на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН) (410049, г. Саратов, просп. Энтузиастов, 13). Тел / факс (8452)970383.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН.

Автореферат разослан 26 ноября 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета ^

доктор биологических наук В ,Е. Никитина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Существование всех форм жизни связано с потреблением воды, поэтому загрязнение водных источников несет в себе yipo3y самому существованию живой природы и, в первую очередь, человека. Парадокс заключается в том, что основной ущерб окружающей среде наносит именно человек. В настоящее время одним из самых распространенных поллютантов, загрязняющих природные воды, является нефть и ее компоненты.

Основной вклад в загрязнение водных объектов нефтепродуктами вносят залповые поступления нефти в результате аварий на трубопроводах и нефтеналивных судах, сброс нефтесодержащих сточных вод промышленными предприятиями, смыв нефтепродуктов в районах нефтепромыслов, с производственных площадок и улиц. Те водоемы, которые не справляются с поступающим объемом загрязнений, деградируют. Процессы самоочищения в них тормозятся или прекращаются совсем из-за деградации биоты.

Под самоочищением природных вод принято понимать совокупность химико-биологических процессов, направленных на восстановление первоначальных свойств и состава воды (ГОСТ 17403-72). Самоочищение не может устранять любое загрязнение; каждый водоем имеет определенный предел самоочищающей способности, зависящий от ряда физико-химических факторов: режима реки, содержания в воде кислорода, температуры, наличия токсических веществ и их концентрации (Финале и др., 1981), рН, содержания растворенного кислорода и температуры (Столбунов, 1973), межвидовой борьбы между водными организмами (Guelin, Cabioch, 1970; 1972; Guelin, Lamblin, 1966).

Поскольку в самоочищении воды участвуют бактерии, грибы, водоросли, высшие водные растения, простейшие к другие гидробионты, важную роль приобретают исследования каждого компонента в отдельности и их взаимосвязей.

Наиболее активно поллюгганты разрушаются микроорганизмами, в частности перифитонными. Бактериальный перифитон легко адаптируется к особенностям окружающей среды, значительно лучше переносит неблагоприятные условия, в сравнении с другими гидробионтами, обладает потенциально высокой деструктивной активностью.

Участие высших водных растений, в том числе элодеи канадской (Elodea canadensis), в самоочищении водоемов хорошо известно (Морозов, 1974; Тимофеева, Кожова, 1985; Храмиова и др., 1995; Wendt-Rasch et al., 2003). Они поглощают тяжелые металлы и радионуклиды, биогенные элементы, ароматические соединения и др. Основная роль высших водных растений раньше сводилась лишь к поглощению и накоплению токсикантов, а также функции механического и трофического субстрата для микроорганизмов. Затем появились сведения о фитотрансформации ксенобиотиков ферментными системами водных растений (Тимофеева, Беспалова, 1988; Тимофеева и др., 1984, 1985; Кожова, Тимофеева, 1986; Gao et al, 2000). 11а основе литературных данных об участии элодеи канадской в процессах самоочищения, высокой скорости роста и частоты встре-

ЦН5 МСХА фонд научной литературы

чаем ости в водоемах Саратовской области, мы выбрали это растение в качестве объекта исследования.

Таким образом, при установленной ведущей роли водных микроорганизмов и растений в процессах деградации ксенобиотиков имеет место нехватка сведений о реальных механизмах нх взаимоотношений в ходе реализации этих функций. Выявление названных вопросов может иметь как фундаментальное значение, так и явиться теоретической базой для разработки биотехнологичеких процессов очистки и восстановления водоемов.

Цель работы — исследование деструктивного и ассоциативного потенциала водного растительно-микробного сообщества, образованного элодеей канадской, для выявления его роли в процессах самоочищения водоемов от нефти.

В ходе достижения поставленной пели решались следующие задачи:

1. Оценить взаимовлияние элодеи канадской, водных микроорганизмов и углеводородов нефти.

2. Выделить и исследовать перифитонные бактерии.

3. Определить деструктивный потенциал растительно-микробной ассоциации и ее отдельных компонентов по отношению к углеводородам нефти.

4. Определить вклад ферментных систем элодеи в деструкцию поллютан-тов.

5. Исследовать отдельные ассоциативные характеристики компонентов водного растительно-микробного сообщества, образованного элодеей канадской.

Научная новизна работы. Впервые установлено взаимовлияние элодеи канадской, бактериального планктона, перифитона и водорастворимой фракции нефти (ВФН). Показано, что в присутствии поллютанта бактериальный перифи-тон несет защитную функцию, нейтрализуя воздействие токсиканта, в то же время, макрофнт играет стабилизирующую роль в отношении бактериоперифитона, поддерживая высокую численность его популяций.

Выделены и иае1гтифицированы новые пернфитоиные штаммы, изучены их деструктивные характеристики: Acidovorax deiafieldii EU, Pseudomonas fluoresces EI-2.1 и El-2,2, Pseudomonas sp. EI-4.2, Drevvndimonas diminuta El-3.1, Aquasptrülum fasciculus EM. I, Kocuria rosea El-4.3.

Впервые проведено сравнительное исследование деструктивной активности водной растительно-бактериальной ассоциации и ее отдельных компонентов. Показана активная роль каждого участника при существенных преимуществах ассоциации в деструкции поллютантов.

Впервые установлеяо> что наряду с планктонными и перифитонными микроорганизмами как нативная, так и стерилизованная элодея канадская способна подвергать деструкции углеводороды нефти. Эта активность проявляется в отношении сырой нефти, ее водорастворимой фракции и отдельных ароматических углеводородов (фенола, толуола, бензола и нафталина).

Показано, что ферменты, осуществляющие деструкцию исследованных соединений, присутствуют как в клетках растения, так и в его экссудатах. Впервые определена деструктивная активность экстрактов н экссудатов элодеи по отно-

шению к углеводородам нефти. Показано, что ферментные экстракты элодеи обладают высокой тирозиназной, лакказной и пероксидазной активностью.

В деградации многокольцевых ПАУ (фенантрена) и нафтенов (декалина) ведущая роль принадлежит перифитонным микроорганизмам.

Впервые установлено, что элодея канадская обладает избирательной антибактериальной активностью, подавляя рост коллекционных грамположительных штаммов и стимулируя развитие всех перифитонных микроорганизмов. Выявлены отдельные показатели ассоциативных взаимоотношений бактериального пери фнтона с элодей канадской: ИУК-синтезнрующая, азотфиксируюшая и хемотаксическая активность.

Научно-практическая значимость работы. Выделено и исследовано 7 перифитонных штаммов, обладающих высокой деструктивной, И УК-си «тезирующей и азотфиксирующей активностью, которые М01уг явиться ин-тродуцентами для ускорения деградации нефти в водоеме. Выявлен высокий деструктивный потенциал элодеи как нативной, так и стерилизованной. Установлено ингибирование сырой нефтью (1 г/л) ферментативной активности элодеи. Результаты проведенных исследований демонстрируют функциональные значения водных организмов в процессах биодеградации нефтяного загрязнения воды, что необходимо для разработки приемов управления процессами самоочишеиия и для рационального использования биологических и водных ресурсов. Полученные результаты могут служить теоретической основой для создания технологии фиторемедиацни нефтезагрязненных вод.

Результаты, характеризующие экологические взаимоотношения элодеи с пе-рифитонными штаммами пополнили научные данные о выяснении механизмов ассоциативных взаимоотношений между водными растениями и бактериальным лсрифитоном.

Основные положения, ныиоснмые на защиту

1. Выявленные эффекты влияния сырой нефти и се водорастворимой фракции и отдельных углеводородов на водную растительно-микробную ассоциацию и ее компоненты.

2. Культурапьно-морфологические, биохимические и деструктивные характеристики выделенных перифитонных бактерий.

3. Деструктивная активность нативной и стерилизованной элодеи, ее экстрактов и экссудатов по отношению к сырой нефти, ее отдельным фракциям и индивидуальным углеводородам.

4. Ингибируюшая и стимулирующая активность элодеи, ее экзо- и эндо-компоментов по отношению к водным микроорганизмам.

5. Характеристики перифитонных бактерий по ИУК-синтезируюшей, азотфиксирующей и хемотаксической активности.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на I Региональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорга-

жимов с окружающей средой» (Саратов, 2l»02>; на Научной конференции молоды ч ученых, аспирантов it студен son. посвященной 1 15-летню академика Н.Н. Вавилова (Саратов. 201)2); на I Международном конгрессе ^Биотехнология состоятle н перспектив!.! развита» (Москва, 2002); ш отчетных научных конференциях ИБФРМ РАН {Саратов. 2002, 2004): на Международном симпозиуме «HiochemicaS interactions оГ microorganisms ami plants with technogenic environmental pollutants» (Саратов, 2003): на II Г-про пейс кой конференции по бноремедиашш (Seconct European Bioremediation Con Terence) (Chania. Greece.

2003); на Международном симпозиуме «Wast water hygienisation in constructed wetlands, ponds and related systems» (Germany. Leipzig, 2003): на Научной конференции «Постгеномная эра о биологии и проблемы биотехнологии» (Казань,

2004): на 4 Международной конференции «Oils and Environment» (Gdansk, Poland.

2005); на 13 Международном симпозиуме по о но повреждениям и б иоде градации (i'I.Vh liiodeterioration and В rode gradation») (Madrrid, Spain), на Международное конференции «Проблемы биодеструкиии техногенных загрязнителей окружаю-uteil среды.» (Саратов, 2005), Диссертационная работа обе\ждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории экологической биотехнологии ИБФРМ РАН 31 октября 2005 г., протокол .М> 8.

Публикации, По теме диссертации оп\бдикопано 10 работ, и том числе 4 -» зарубежных изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 191 стр. машинописного текста, включает 1S таблиц, 3(> рисунков, состоит из введения, главы литературного обзора. 4-х глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 422 источника, из них 134 -- иностранные.

Работа кышишеиа в лаборатории экологической биотехнологии НБФРМ РАН в рамках планово!'! темы ПИР «Исследованне взаимодействия микроорганизмов и растений с техногенными загрязнителями окружающей среды» (.Na гос. pel. 01.9.90 003293). при поддержке грзнтов РФФИ № 03-04-58913 J ti 05-04586051). Президента РФ № HI J J-1529,2003.4. Фонда «Интеграция».

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЗОР ЛИТКРАТУРЫ

В обзоре литературы, состоящем из 3 разделов, проанализировано участие высших водных растении и микроорганизмов в процессах самоочищения водоемов от различных по.тдкггантов. Дана качественная и количественная характеристика перифнтоиа. згапы ею формирования. Наиболее подробно изложены вопросы, касаюшиеся механизмов взаимодействии макрофнтов с микроорган in-

мамы. Приведены данные о составе водорастворимой фракции нефти и ее токсичности по отношению к гидробионтам.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектами исследований являлись элодея канадская (Elodea canadensis) в на-тивном и стерилизованном виде и 7 штаммов бактерий, выделенных с ее поверхности и идентифицированных стандартными методами. Кроме того, в работе использовано штаммы из коллекция ИБФРМ РАН: Bacillus licheniformis 36, Micrococcus luteus B-109, Pseudomonas putida B-145S, Escherih'ta coli K-12 и Mycobacterium sp.t P. aeruginosa 50.3. В главе также описаны: состав питательных срсд и условия культивирования бактерий; методы выделения перифитопных микроорганизмов и определение их хемотаксической, деструктивной, эмульгирующей, ИУК-синтезирующей, азотфиксирутощей активности; методы анализа содержания нефтепродуктов и их фракционного состава. Даны приемы изучения взаимовлияния углеводородов нефти на рост и развитие микроорганизмов и элодеи. Описано получение стерилизованной элодеи, ее экстрактов и экссудатов, определение их деструктивной активности по отношению к углеводородам нефти, исследование антибактериальной активности элодеи.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Влияние нефти на водную растительно-микробную ассоциацию

Немногочисленные исследования, посвященные воздействию нефти на высшие водные растения, отмечали стимулирующее влияние нефти (1 г/л), выраженное в повышении яркости окраски и тургора (Морозов, 1974). При этом отмечалось разложение нефти в опытах с речной водой и погруженными растениями на 10-13 сутки. В наших исследованиях получены иные данные.

Показано, что присутствие сырой нефти в концентрации 0,5; 1 и 10 г/л незначительно влияет на развитие натнвной злодеи. Во всех случаях наблюдалось разрушение хлорофилла, более быстрое в случае стерилизованного растения и высоких концентраций нефти. В случае непосредственного контакта побега с нефтью происходил быстрый локальный хлороз. В отличие от абиогенного контроля во всех вариантах опыта наблюдались изменения структуры и цвета нефтяной пленки, однако полного или частичного ее исчезновения не происходило.

Признано, что состав и структура микробного сообщества в значительной мере определяет его функционирование в качестве деструкторов органического вещества (Белова, 1992), что обусловило необходимость изучения влияния нефти на рост микроорганизмов различных экологических групп. Нами показано, что сырая нефгь и элодея существенно влияли на рост водного бактериопланктона. Присутствие элодеи замедляло увеличение численности микроорганизмов. На наш взгляд, это может быть связано как с растительным ингибированием их размножения, так и частичной сорбцией микробных клеток на поверхности макро-

фита. На численность псрнфитонных микроорганизмов присутствие нефти влияло несущественно (от 2,4 х 107 до 6,8 х 107 кл./г сырого веса), что указывает на стабилизирующую роль элодеи. "Увеличение численности микроорганизмов является косвенным показателем их деструктивной деятельности.

Известно, что эффект самоочищения воды от нефти обусловлен тем, что в случае загрязнения именно углеводороде к исляющие микроорганизмы (УОМ) получают преимущество, бурно размножаясь. В наших экспериментах наличие загрязнения стимулировало развитие УОМ как в толще воды, так и в перифитоне злодеи (рис. 1). Перифитонные УОМ достигали максимального развития (9,7 х 10' кл./г сырого веса) на 13-е сутки. Популяция УОМ перифитона элодеи более стабильна по сравнению с планктоном и значительно превышает его по численности, что можно о&ьяснить своеобразием экологических условий, в частности, поступлением большого количества легко окисляемого органического вещества с экссудатами и по мере отмирания водных растений.

При растекании нефти по поверхности воды происходит переход нефгепро-

Сутки

—л— Перифитон в чистой среде —о— Перифитон в мгрязненкой среде

—*—Планктон в чистой среде с элвлеей —Планктон в загрязненной сред*

—м— Планктон в загрязненной среде с алодеей

Рис. I. Влияние водорастворимой фракции нефти на численность планктонных и пернфн-тонных УОМ

дуктов в водную фазу. В наших исследованиях количественные характеристики ВФН менялись с течением времени от 1 до 21 мг в зависимости от количества добавленной к воде сырой нефти, при этом максимальная концентрация ВФН наблюдалась при добавлении 200 г/л сырой нефти.

Элодея канадская является погруженным водным растением, поэтому при нефтяном загрязнении в непосредственное взаимодействие она вступает нменпо с во/юрист вор» мой фракцией нефти, которая ио полученным нами данным более токсична по сравнсшио с сырой пефтыо. Уже при концентрации 17 мг/л растение было угнетено и погибало на 20-е с\ г. Замечено, что побеги, содержащие одну и более точек роста в отличие от побегов без таковых, лучше адаптировались к загрязненной воде и до конца опыта оставались в нативном состоянии. Вероятно, активные биохимические процессы, протекающие в молодых побегах, выполняют также защитную роль.

Деструктивная активность »одной растите.!ьно-мнкробион ассоциации по от ношению к угле иол о родам нефти

Деструкшш сырой нефти. С поверхности злодеи в чистых условиях были выделены и идентифицированы 1 штаммов микроорганизмов, идентифицированных нами как: Аск1оуот\ <.Ш(фсЬШ £1-1, Гхет^отопах /¡иогсхсет Е1-2.1 н 2.2: Вге\11тИ»н>т1х Л пиша а ГН1-З.К Ащи кртНнт /ачскчг!м Е1-4.1, Р.чеиЛотопах л/л 111-4.2 и Косипа гохса К1-4.3. Была исследована способность нернфитонпых бактерий расти на агарнзованной среде с сырой нефтью в качестве единственного источника углерода н энергии, Псе исследуемые штаммы росли на предлагаемых субстратах, но с различной интенсивностью. Среди них было отобрано 2 штамма Р. //кштагл'нл- К!-2.1 и Вг. (ЛпипнГа Е1-3.1, которые активно использовали для роста нефтепродукты.

При исследовании штаммов Р. Аиогеясепв Е1-2.1 и Р>г. (Иттта Е1-3.1 обнаружено, что они обладают довольно высокой деструктивной активностью но отношению к сырой нефти (0,5 г'л): 35,8 и 44.3 % соответственно (рис. 2).

(»недоступность нефти может быть повышена за счет продукции н выделения бактериями-деструкторами поверхностно-активных веществ (НЛО) и биоэмуль-1 а торов (John5.cn. КагЬоп. 2004: СЬгШоП. НзЫпа. 2002). При изучении эмульгирующей и новермкостной активности штаммов Р. /¡иогс^сст Ш-2,1 и Вг. IИт'тииг О-?.! было установлено, что оба микроорганизма не прод\ пировали бноПЛВ. но были способны синтезировать -эмульгирующий агент, приводящий к образованию эмульсии типа «шоколадный мусс» в первом случае и нефтяных комочков во втором. Наличие такой способности у исследуемых деструкторов расширяет их во 1МОЖПОСТИ по утилизации гидрофобных пол л юта иго в.

Фракционный анализ остаточных нефтепродуктов после биоаеструкнии показал (рис, 3), что гшамм Вг, ¿(¡пинии! Е 1-3.1 принимал участие в разрушении всех фракций, за исключением спнрто-бензольных смол, в то время как Р. ртптьсан В-2,1 разрушал парафиновую, нафтеновую фракции н ПАУ, Содержание снир-то-бенюльных смол в прнсутсимш Вг Лпитня Е1-3.1 увеличивалось по сравне-ппю с контролем, что. вероч г но. свидетельствует о накоплении продуктов окисления других фракций >глсволородо».

3.1 стерилизованная 2.1 контроль

Рис. 2. Деструкция сырой нефти (0,5 г/л) водными организмами за 10 сут.

Рис.3. Фракционный состав остаточных нефтепродуктов после биодеструкции (10 сут.): МБА - моно- и бициклическая ароматика, ПАУ — пол и циклическая арома-тика, СБС - спнрто-бензодьные смолы

Ферментные системы растений так же способны воздействовать на поллю-тангы (Заалишвили и др., 2000; Угрехелидзе, Дурмишидзе, 1984). Установлено, что стерилизованная элодея обладает довольно высокой деструктивной активно* стьго по отношению к сырой нефти. Показано (рис. 4), что снижение концентрации углеводородов особенно активно происходило в первые трое суток - на 37,8 достигая 39,2 % к концу эксперимента (10 сут.). Сравнение результатов деструктивной активности стерилизованной элодеи с ее перифптонными микроорганизмами позволяет говорить о равнозначном вкладе исследованных организмов в окислительные процессы нефти.

Злодея ст«рчпмэоея**ная -«-Абиатчестй контроль

Рис. 4. Динамика деструкции сырой нефти (0,5 г/л) стерилизованной элодеей

Ряд авторов указывает, что роль высших водных растений в самоочищении водоемов от нефти сводится к адсорбции нефтяной пленки и стимуляции УОМ веществами, входящими в состав растительных экссудатов (Морозов, Телитчек-ко, 1977). Нами показано, что эндсь и экзоферменты элодеи способны окислять углеводороды нефти. Максимальная убыль нефти при инкубировании с экстрактом элодеи составляла 60,2 % за 3 ч при pH оптимуме 6,5 (рис. 5). Экзоферменты элодеи оказались индуцибельными: они синтезировались в ответ на присутствие нефти. Однако степень разрушения поллютанта в этом случае была ниже - 25,8 % в сравнении с эндоферментами.

Оценку деградации ксенобиотика чистыми культурами бактерий н стерилизованным растением было бы не совсем корректно переносить на оценку деструктивной активности всего растительно-микробного сообщества, где имеют место многообразные взаимоотношения между организмами. Поэтому нами была определена способность разрушать сырую нефть (0,5 и I г/л) сообществом

элодеи с перифитонными микроорганизмами. Деструктивная активность растительно-микробной ассоциации оказалась максимальной (55,6 %) по сравнению с ее отдельными участниками. При этом разрушались все фракции нефти (рис. 3).

?

# а

I

1 £

в V X

л

1 >

рН4,7 рН6.5 рН8Л

О Ферменгый экстракт ■ Кипяченый ферментый экстракт' о Абиотический контроль

Рис. 5. Деструкция сырой нефти (0,5 г/л) ферментным экстрактами элодеи за 3 ч

Па активность сообщества значительно влияли аэрация и температура среда: отсутствие аэрации приводило к уменьшению активности на 25%, а снижение температуры до 15е С- к уровню абиотического контроля. Показано, что нефть в концентрации 1 г/л ингибировала деструктивную активность как ферментов, участвую и (их в окислении нефти, так и нативного растения, однако не подавляла рост и развитие последнего.

Все исследованные группы организмов принимали участие в разрушении па-рафино-нафтеновой фракции. Однако сообщество элодеи с перифитонными микроорганизмами оказалось более активным в этом процессе (67 %), чем стерилизованное растение (31,7 %) и чистые культуры выделенных микроорганизмов (20,3-22,5 %), Эффект синергизма наблюдался при разрушении смол, парафиновой и ароматической фракций, когда активность сообщества в 2-3 раза превышала таковую стерилизованного растения и чистых культур перифитонных микроорганизмов.

Деструкция водорастворимой фракции нефти. Для сообщества погруженных макрофитов биодеградация пленочной нефти ограничена ее биодоступностью. Вероятно, более существенное влияние погруженные макрофиты и их пе-рнфитонные микроорганизмы оказывали на ВФН. Однако из-за многокомпонентное™ состава ВФН трудно оценить вклад сообщества в ее разрушение. В связи с этим были проведены исследования ло деструкции отдельных соедине-

ний, входящих в состав ВФН: фенола, толуола, бензола, нафталина, фенантрена и декалина.

По полученным данным, фенол оказался наиболее доступным субстратом для исследуемых водных организмов, что, вероятно, связано с ею относительно высокой растворимостью в воде (0,82 %) (Основные свойства..., 19S7). Все организмы, кроме Br. diminuta Е1-3.1, чья активность составила 81,8 %, полностью разрушили фенол (0,2 г/л) за 10 сут. При этом отмечено, что за трое суток пери-фитон снизил содержание фенола до 62-67 мг/л, стерилизованная элодея - до 70 мг/л, в то время как нативное растение, быстро адаптировавшись к измененным условиям среды, полностью разрушило внесенный ксенобиотик (рис. 6). Полученные результаты позволяют прийти к выводу, что при деструкции фенола сообществом наблюдался отчетливый эффект синергизма.

На возможность участия элодеи в деструкции фенольных соединений указывали некоторые авторы (Тимофеевой и др.,1977; Стом и др., 1978; Тимофеева, Бейм, 1992; Суслов и др., 1977; Кожова, Тимофеева, 1986). Согласно полученным этими авторами результатам фенолы активно поглощались и полностью исчезали в присутствии элодеи канадской за 15-20 суток. Однако механизм этого процесса не был выяснен и не исключался вклад в него микробного окисления. Участие стерилизованной злодеи в окислении фенола показано нами впервые.

О

- Р. fluorescenj 61-2.1

— Стерилизованная элодея

Вг. diminuta EI-3. t

Натианая элодея Абиотический контроль

■I

0

2

4

в

8

10

Сутки

Рис. 6. Динамика разрушения фенола (0,2 г/л) водными организмами

Разрушение фенола элодеей подтверждается его деструкцией экстрактами и экссудатами элодеи (53,2 и 10,9 % соответственно). Их высокая активность мо-

жет быть объяснена сродством субстрата к соединениям фенольной природы, выделяемым самой элодеей. Авторы, исследовавшие пути детокснкации чужеродных фенолов растениями (РпЛЬат, 1964), пришли к выводу, что у водных растений преобладает окислительная деградация этих веществ, в отличие от реакции гликозилирования с последующим депонированием, характерной для сухопутных растений.

Бензолы и алкилбензолы составляют около 80 % ВФН, концентрация толуола при этом может достигать 1,96 - 3,57 мг/л (Эаеес!, АЬМШат, 2000). При исследовании деструкции толуола нами было установлено, что микроорганизмы менее активны, чем растение.

Толуол подвергался деструкции всеми исследованными организмами, но наиболее активной оказалась растительно-микробная ассоциация и стерилизованная элодея (83 %) (рис. 7). Для штамма Р. Аиогезсепх Е1-2.1 толуол являлся более жестким субстратом по сравнению с фенолом. Деструктивная активность штамма составила лишь 40,8 %; штамм Вг. кШтаа Е1-3.1 показал промежуточные значения - 69,2 %. При добавлении к пернфитонным микроорганизмам стерилизованной элодеи, а также ее эндо- и экзокомпонентов происходило увеличение разрушения толуола на 14-35 %. Однако во всех случаях добавления пери-фитонных микроорганизмов ожидаемого эффекта синергизма не наблюдалось, и деструктивная активность не превышала таковую для стерилизованной элодеи. Это может быть связано, во-первых, с конкуренцией между организмами за суб-

Сврипоовгкная элодея Годная элодей ЕМ. 1+экстракт Элодеи

В-2.1+э*стрв1СГ элодеи

В-гЛ+счрмгюованая алэдея Б-31+5кссудагсы злодеи В-3.1+С1^июованиач аледея Вг. 1+шосудэ!ы элодеи Вт. >1(Г1пиаВ-3.1

Р. (иогевсетв ЕМ.1

0 10 20 30 40 50 60 70 0090 ££СФУТ№&наА аомвчость, %

-1---:-'-—^

1 , . : 1

Рис, 7. Биодеструкция толуола (0,1 гУл) водными организмами за 10 сут>

страт; во-вторых, с ингибированием ферментных систем стерилизованной элодеи промежуточными продуктами метаболизма толуола, в результате деятельности штаммов.

Бензол (0,1 г/л) оказался самым токсичным для водных организмов из всех исследованных субстратов. Его внесение приводило к резкому ухудшению состояния стерилизованной элодеи в течение 5 дней. Деструктивная активность перифитонных микроорганизмов была невысока: 27,8 - 36,4 %, Растительно-микробная ассоциация имела лучший показатель • 77,7 %, хотя в сравнении с другими моноароматическими соединениями он был наименьшим. Таким образом, и при деструкции бензола наблюдался эффект синергизма.

В качестве представителей ПАУ исследовали нафталин и фенантрсн. Фенан-трен не подвергался разрушению изучаемыми организмами. Нафталин (0,1 г/л) окислялся перифитонными штаммами с высокой скоростью: до 3-7 мг/л за трое суток (рис, 8). Деструктивная активность нативной элодеи, где количество перифитонных микроорганизмов значительно уступает используемой в эксперименте суспензии, тем не менее, высока - 89,9 %. Стерилизованная элодея оказалась наименее активна по отношению к нафталину, концентрация которого снизилась лишь на 27,7 %, Доступность нафталина для сообщества водных растений можно объяснить достаточно высокой растворимостью ксенобиотика в воде - 0,0344 г/л, по сравнению с 0,0012 г/л для фенантрена. Наиболее активным оказался штамм Вг. (ИтаШа Е1-3.1 (97%).

Бензол, нафталин и декалин проявили высокотоксические свойства по отношению к стерилизованной элодее: у растения, лишенного защитного слоя пери*

0123456789 10

Сутки

Рис. 8. Динамика разрушения нафталина (0,1 г/л) перифитонными микроорганизмами

100

-•- Вг. сИгппШа В-3.1 Р. Аиоге$сети В-2.1 Абиотический контроль

0

фнтонныл микроорганизмов. но визуальным наш юлениям хлорофилл разрушился почти полностью уже на 5-е сутки (рис. У). Как следствие такого воздействия -деструктивная активность стерилизованного растения снизилась ло уровня 7,927.8 "о tin отношению к ним иоллютаиэзм. Это иллюстрирует олну из возможных ролей бактерий и фиторемедиации - снижение фитотоксичностн загрязнителя до уровня, при котором растение может произрастать в нефтезагрязненноИ воле (Siciliano и Germida. 1998).

■ - \ ■ ■ ■...,■ * ■" ■ . ; , . _

. ~ -Vi. ^¿Л

A lí

Рне, 9. Токсичное иозде навис бензола на: Л - стерилизованную: В - нативную элодею

В случае „мекалниз максимальную активное п. обнаружил штамм Г. //штодаи ¡ (57.2 "г») и натлвная vi о лея {53,9 %). Штамм fír с Нтшши П-3.1 В б иоде градации декалши участия не принимал. Инкубация декалина со сюрилнзоваиныч растением практически не меняла концентрацию внесенного cyóctpava. Полученные результаты свидетельствуют, что в случае оиодефадашш декалина ¡t ПДУ в воле (нафталина й частности') доминирующую роль играют микроорганизмы.

Нами показано, что элодея обладает ферментными системами, нриннмаюшн-мн участие н деструкции ароматических ксеиобиотнков (рис. 10). Значительную деструктивную активность по отношению к толуолу. оензоду и нафталину показал -экстракт злодеи (МЛ: 24,1 и 22,1 % соответственно). рМ оптимум которой лежал в области S.2 (рис, 11), Па деструктивную активность экс су лат о в элодеи (за то же время на 35.1: и 10,7 % соответственно), как и в случае с фенолом, повлияла предварительная индукция.

Рис. 10. Деструктивная активность экстракта (pH 8,2) и экссудатов элодеи

Активность ферментов элодеи, ответственных за окисленне ароматических соединений. Экстракт элодеи продемонстрировал значительные лакказную (0,068 мкмоль/мин/мг белка), тирозиназную (0,12-0,78 мкмоль/мин/мг белка) и пероксидазную активности (1,02-4,11 по окислению ABTS и 0,467 мкмоль/мин/мг бел ка-по сирингальдазину). pH оптимум лакказы и лероксидазы был 5,0 - 6,0, тирозиназы - 9,0. Кроме того, показано, что элодея обладает как окидазным, так и пероксидазным механизмами окисления пирокатехина.

Таким образом, в естественных условиях элодея и ее перифитон являются активными деструкторами поллютантов и способны обеспечивать процессы самоочищения водоема от ряда углеводородов ароматической и неароматической природы и, вероятно, многих других компонентов нефти.

Экологические взаимодействия элодеи и микроорганизмов

На примере деструкции углеводородов нефти показано, что сообщество высших водных растений с перифитонными микроорганизмами является сложно организованной системой с взаимоотношениями ассоциативного характера, которые могут определять устойчивость сообщества к действию поллютантов. Критерием таких отношений может служить появление новых свойств ассоциа-

ции, не проявляющихся у партнеров в чистых культурах. Схема трофического взаимодействия периф«тонных бактерий и водных растений имеет общие черты со структурной организацией как альгобактериального консорциума, так и ризосферы высших растений. Для каждого из этих сообществ характерно высокая плотность бактериальной популяции, обмен органическим веществом и биологически активными молекулами, стимулирующими как микробиологическую, так и биохимическую активность в окружающей среде {Günther et al., 1996; Ра-тушняк, Андреева, 1998).

Однако механизм взаимодействия между растениями и бактериями, обеспечивающий благоприятный результат самоочищения загрязненных вод, пока не вполне понятен. Одним из аспектов таких взаимодействий может являться способность бактерий-деструкторов синтезировать и экскретировэть в окружающую среду фитогормоны, например ИУК. Нами была изучена способность к синтезу ИУК перифитоиными штаммами, а также влияние на этот процесс различных органических соединений (табл. 1). Высокой ИУК-синтезирующей активностью обладали штаммы P. fluoresces EI-2.2, Br. diminuta Е1-3.1 и К. rosea El-4.3 (1,8; 2,4-6,5 и 1,6-28 мг/г сухой биомассы соответственно).

Таблица I

Влияние различных компонентов на продукцию ИУК (мг/г сухой биомассы) пе-рифитоннымк микроорганизмами на среде М9 с триптофаном (0,4 г/л)

Штаммы Малат (1 г/л) Сукцинат (0,2 г/л) Глюкоза (1 г/л)

Ac. deiafieldii ЕМ - - -

P. fluorescens El-2.1 - - -

Р. fluorescens El-2.2 - 1,8 ±0,009 -

Br. diminuta El-3.1 - 6,5 ± 0,032 2,4 ±0,012

Aq. fasciculus El-4.1 - - *

Pseudomona sp. El- 4.2 - - *

K. rosea El-4.3 12,8 ±0,064 28,0 ± 0,112 1,6 ±0,010

• * ИУК была обнаружена, однако чувствительность метода не позволила определить ее концентрацию

• - ИУК не обнаружена

Наибольший стимулирующий эффект оказал сукцннат (0,2 г/л), Aq. fasciculus Е1-4.1 и Pseudomonas sp. El-4.2 продуцировали фитогормон в присутствии глюкозы (1 г/л) в меньших количествах, и чувствительность метода не позволила определить его концентрацию. Из литературы известно, что физиологически ак* тивная концентрация ИУК для водных автотрофов составляет 1,8 х 10* мг/г сухой биомассы (Назаренко, Акыев, Семененко, 1994). Высокие ИУК-синетзирующие характеристики перифитона свидетельствует об их активном взаимодействии с растением.

Одним кт основных источников азотных соединений в водоемах является усвоение молекулярного а1.ю га с míe зелеными водорослями и разными вилами бактерий, Фиксировать азот непдуха были способны все иссдел>емые штаммы, кроме К. rasen til-4.3. Однако интенсивное) >, роста на безазотистой с реле у шпшмов была различной, наиболее активно росли .(с, <h>fofh'hlii 1*11-1 и /', /htt»\'.wm Hl-2.1. Лзотфиксаиия свободно* lmívuiiim и микроорганизмами ограничена нехваткой других биогенных элементов в среде. Псрнфитониые бакгернн имеют в пом плане преимущества, находясь на поверхност и раздела фаз. где копнетрнруетс» органическое вещество, и имея доет\ и к экссудатам водного растения. Для функционирования сообщестна водных растений наличие мерифитонных азот-фиксаторов имеет экологическое значение, так как существует пищевая конкуренция за азог с нитчатыми водорослями (Цаплииа, 2002).

Для выживания на поверхности элодеи бактерии должны адаптироваться к специфическим .услопням этой эколо! »ческой пиши. В частности, они должны быть резистентны к губительным для них ферментам (нерокендазы, протеазы) или токсичным соединениям (фемольные соединения растений). Биотическим фактором, влияющим на выживание бактерпоперпфнтоиа. является наличие конкурентов.

Установлено, что элодея обладает антибактериальной активностью по отношению к ряду водных микроорганизмов Li. lictienifarmis. 36 и Л/, hile lis П-109 (рис. !1). Только молодые побеги, содержащие одну и более точек роста, подавляли рост Л pulida В-1458. На Е. coli К-12, а также иерпфпюнных микроорганизмах присутствие сгернднэопанкого растения никак не отразилось. Рос г н развитие последних стимулировали экссудаты (н случае имамма A.', rasca 1:1-1.3J н экстракт элодеи (осе остальные нпаммы). Иероятио. элодея, регулирует колонизацию своей поверхности конкурентными бактериями, выделяя фитонциды, активные по от ношению к некоторым водным микроорганизмам.

Рис, 11. Антибактериальная активност ь элодеи

Важное значение в колонизации поверхности растения и взаимодействии с загрязнителями играет хемотаксис бактерий. Нами было показано, что хемотак-сическую активность по отношению к экстракту элодеи проявили штаммы Р. fluoresceins Е1-2.1 и Dr. diminuta Е1-3.1. последний полностью переместился к ат-трактанту (рис, 12). Штамм К. rosea Е1-4.3 подвижностью не обладал. Ни экссудаты элодеи, ни сырая нефть, ни ВФН не являлись аттрактантами по отношению к исследуемым культурам.

P. fluorescens E1-2.I

Br. diminuta El-3.1

Рис. 12. Хемотаксис перифнтонных микроорганизмов: 1 3 - экссудаты элодеи; 4 — экстракт элодеи; 5 - суспензия

К. rosea ЕМ.З

— сырая нефть; 2 — ВФН; м и кроорган измов

Итак, водная растительно-микробная ассоциация имеет важные преимущества перед чистыми культурами. Нативная злодея представляет собой экологически устойчивую систему, реализующую свой деструктивный потенциал в условиях нефтяного загрязнения. При этом растение способно регулировать численность и состав бактериального перифитона за счет выделения экссудатов, обладающих антибактериальными свойствами. Псрифитонные микроорганизмы снижают фитотоксичность поллютантов до уровня, при котором элодея может произрастать в нефтезагрязненной воде.

ВЫВОДЫ

1. Водное растительно-микробное сообщество на основе элодеи канадской обладает высоким деструктивным потенциалом в отношении сырой нефти, раз* рушая все фракции, а также все исследованные тестовые углеводороды (фенол, толуол, бензол, нафталин и декалин). Это позволяет говорить об активном участии этого объекта в процессах самоочищения водоемов и служит основой для разработки экологических биотехнологий очистки и восстановления загрязненных экосистем.

2. Сырая нефть в концентрации до 10 г/л оказывала комбинированное воздействие на элодею, сначала стимулируя се рост, а затем приводя к хлорозу и лизису тканей. Более токсичной оказалась водорастворимая фракция нефти; при се содержании в воде 17 мг/л элодея погибала в течение 20 сут. Молодые побеги были более устойчивы к токсическому воздействию этой фракции.

3. На развитие бактериопланктона существенно влияли как присутствие элодеи, так и загрязнителя; при этом нефть значительно стимулировала развитие микроорганизмов. Численность популяции бактериоперифитона менее подвержена колебаниям, что может объясняться стабилизирующей функцией растения. Численность перифитонных углеводородокисляющих микроорганизмов превосходила таковую планктонных, что указывает на существенную роль этой группы бактерий в деструкции углеводородов нефти.

4. Из перифитона элодеи выделены и идентифицированы штаммы: Acido-vorax delafieldii EI-1, Pseudomonas flúorescens El-2.1 и EI-2,2, Pseudomonas sp. El-4.2, Brevundimonas diminuta El-3.1, Aquaspirillum fasciculus Et-4.1, Koairia rosea El-4.3. При этом P. fluoresceins El-2.1 к Br. diminuta El-3.1 обладали эмульгирующей и деструктивной активностью по отношению ко всем исследуемым углеводородам, играли доминирующую роль в деградации ПАУ (нафталин) и нафтелов (декалин): 94-97 и 57,2 % соответственно. Наибольшей деструкции подвергались парафино-нафтеновая фракция и ПАУ. P. fluorescens El-2.2, Br. diminuta El-3.1, Ад. fasciculus El-4.1, Pseudomomas sp. El-4.2 и К. rosea El-4.3 обладали способностью к синтезу ИУК. Все перифитонные штаммы, кроме К. rosea El-4.3, были способны расти на безазотистой среде Эшбн.

5. Впервые выявлена способность стерилизованной элодеи подвергать деструкции нефть (39,2 % за 10 сут. от исходной концентрации 0,5 г/л). Особенно активно разрушалась параф и но- нафтеновая фракиия и ПАУ. Растение было способно окислять фенол, толуол, бензол и нафталин. При исследовании ферментативной активности элодеи по отношению к фенолу, толуолу и нафталину большую активность проявили эндоферменты экстракта (за 3 ч на 53,2; 61,2 и 22,1 % соответственно). В случае бензола (0,1 г/л) эндо- и экзоферменты работали почти одинаково 29,1 и 24,9 % за то же время. pH оптимум процессов находился в области 8,2.

6. В экссудатах и экстракте элодеи обнаружена высокая деструктивная активность. При этом экзоферменты являлись нндуцибельными и осуществляли деструкцию сырой нефти на 25,6 % за 3 ч при исходной концентрации 0,5 г/л. Активность грубого ферментного экстракта при pH оптимуме 6,5 составила 60,2 % при тех же условиях. Нефть в концентрации 1 г/л нигибировала нефтеокис-ляющую активность элодеи, не влияя на ее рост. В ферментных экстрактах обнаружена высокая активность лакказы, тирозиназы и пероксидазы.

7. Элодея обладала антибактериальной активностью в отношении ряда водных коллекционных микроорганизмов: Bacillus licheniformis 36, Micrococcus luteus B-109, P. putida B-1458, стимулируя при этом рост собственных перифитонных штаммов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Тумайкина ЮЛ„ Турковская О.В. Роль злодеи канадской (Elodea canadensis) в деструкции углеводородов нефти // Матер, первой региональн. конф. молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой». Саратов, 26-27 марта 2002г. - Саратов: Изд-во СГУ, 2002. - С. 56-57.

2. Тумайкина Ю.А. Возможность интродукции элодеи канадской (Elodea canadensis) в сточные воды, содержащие нефтепродукты I! Тез, докл. научн. конф, молодых ученых, аспирантов и студентов, посвященной 115-летию академика Н.И. Вавилова. Саратов, 25-30 ноября 2002г. - Саратов, 2002, - С. 129-130.

3. Тумайкина Ю.Л.. Турковская О.В., Шпатов В.В. Участие элодеи канадской (Elodea canadensis) а очищении воды от нефти и нефтепродуктов И Биотехнология - состояние и перспективы развития: Матер, 1-го Международного конгресса. Москва, 14-18 октября, 2002. - М.: ЗАО «ПИК «Максама», РХТУ им Д.И. Менделеева, 2002. - С. 279.

4. Tumaikina Ум. A., Turkovskaya О. К, ignatov V.V. Study of Elodea (Elodea Canadensis) for «se in the phytoremediation of oil-polluted water // Proceedings of the Second European Bioremediation Conference. Chania, Greece, June 30 - July 4,2003.

- P. 271.

5. Tumaikina J., Turkovskaya O., Ignatov V. Role of the Elodea canadensis bacterial periphyton in the oil-containing wastewater // Wastewater hygienisation in constructed wetlands, ponds and related systems: Proceedings of the International Workshop. Leipzig, 6-7 November, 2003. - Leipzig, 2003. - P. 41.

6. Тумайкина Ю. А., Турковская О.В. Деградация отдельных соединений нефти растительно-микробной ассоциацией на примере элодеи канадской И Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии: Тез. докл. конф. Казань, 17-18 июня,2004. -М,: МаксПресс, 2004.-С. 80-81.

7. Тумайкина Ю.А,, Турковская О.В., Игнатов В.В. Биодеструкция ароматических углеводородов элодеей канадской (Elodea canadensis) Н Вестник Саратовского Госагроуниверситета. -2005. -Ха 1. - С. 21 - 23.

8. Tumaikina J., Turkovskaya О., Ignatov V. Oxidation of crude oil by fresh water hydrobionts // Oils and Environment: Proceedings of 4lh International Conference, Gdansk, Poland, June 20-23,2005. - P. 407-411.

9. Тумайкина Ю.А., Турковская O.B., Игнатов В.В. Роль водных расти-тель-микробных ассоциаций в процессах самоочищения воды от нефтепродуктов И Проблемы биодеструкиии техногенных загрязнителей окружающей среды: Мат. междунар. конф. Саратов, 14-16 сентября, 2005. - С. 100-101.

10. Tumaikina J., Turkovskaya О., Ignatov V. Role of periphyton in bioremediation of oil contaminated water II Proceedings of 13rt International Biodeterioration and Biodégradation Symposium (IBBS-13). Madrid, 4-9 September, 2005. - Madrid, 2005.

- P. 252.