Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование влияния структуры липополисахаридов на функциональные ответы клеток миелоидного ряда

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование влияния структуры липополисахаридов на функциональные ответы клеток миелоидного ряда"

На правах рукописи

ВОЛОШИНА ЕВГЕНИЯ ВАЛЕРЬЕВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ СТРУКТУРЫ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ НА ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОТВЕТЫ КЛЕТОК МИЕЛОИДНОГО РЯДА

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2010

004601036

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии Наук Институте фундаментальных проблем биологии РАН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Прохоренко Изабелла Рувимовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Новоселова Елена Григорьевна

доктор биологических наук, профессор Мошков Дмитрий Алексеевич

Ведущая организация:

Филиал института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится 23 апреля 2010 г. в /2Г часов на заседании диссертационного совета Д 002.066.01 при ИФПБ РАН.

по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская 2, ИФПБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИФПБ РАН г. Пущино

Автореферат разослан « /9» аа1/?ъ<си- 201 о 1

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Г.Н. Назарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Липополисахариды (ЛПС) - эндотоксины являются потентными активаторами клеток врождённого иммунитета. Активность ЛПС столь велика, что в пикограммовых концентрациях в крови они могут вызвать эндотоксиновый шок. Эндотоксин является главной составляющей внешней мембраны грамотрицательных бактерий. Ответ организма на грамотрицательные бактерии обусловлен распознаванием эндотоксина и ответом клеток хозяина на него [Weckesser et al., 1995]. ЛПС распознаётся разными путями. В одном пути (гуморальном) участвуют собственные антитела [Reid et al., 1997], липопротеины [Wurfel and Wright, 1995; Hailman et al., 1996; Vreugdenhil et al., 2001] и катионные белки крови [Munford et al., 2005], которые нейтрализуют и очищают кровь от ЛПС. В другом пути (рецепторном) участвуют связывающий ЛПС белок (LBP), рецептор CD14, передающий ЛПС комплексу TLR4/MD-2, который, в свою очередь, передаёт сигнал в клетку, что приводит к мощному воспалительному ответу [Diks et al., 2001]. Известны нетоксичные ЛПС, в частности ЛПС из фототрофных бактерий семейства Rhodobacter, которые способны конкурентно связываться с рецептором на поверхности клетки, проявляя антагонистическую активность в отношении эндотоксинов [Schramm et al., 2000]. Структуры ЛПС определяют набор дополнительных белков, которые вовлекаются в специализированные участки мембраны, формируя разные рецепторные кластеры. Состав такого кластера и стереохимия вовлеченных в него рецепторов определяют запускаемый сигнал от ЛПС и специфичный ответ клетки [Triantafilou et al->

2004].

На биологическую активность ЛПС не только из разных бактерий, но и из разных хемотипов одной и той же бактерии, влияют состав как гидрофобного фрагмента молекулы - липида А, так и состав гидрофильного фрагмента - кора и полисахаридного остатка ЛПС. В работах Teghanemt et al. (2005) на клетках миелоидного ряда показано, что максимальной биологической активностью обладают ЛПС, в состав которых входит липид А, содержащий 6 жирных кислот и 2 фосфатные группы. Любое изменение количества жирных кислот снижает эндотоксическую активность ЛПС [Rossignol & Lynn,

2005]. Гидрофильная составляющая молекулы (полисахаридный фрагмент) может усиливать как у эндотоксина из S. typhimurium [Muroi & Tanamoto, 2002] или ослаблять как у К coli [Raetz et ai., 2006] действие ЛПС, оцениваемое по индукции провоспалительного цитокина TNF-a в макрофагах. Усечение структуры кора в последовательности от Ra- до Re- ЛПС снижает высвобождение TNF-a нейтрофилами [Lentschat et al., 1999]. Интенсивность ответов клеток на эндотоксин зависит не только от

структуры ЛПС, но и от состояния, в котором находятся клетки - предакгивированы они или находятся в состояния покоя [Agarwal et al., 1995]. Поскольку результат взаимоотношения клетка-эндотоксин неоднозначен, весьма актуальным является исследование влияния разных факторов для предсказания ответа клетки на стимул.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение влияния состава липополисахаридов на разные функциональные ответы клеток, в их числе дыхательный взрыв, экспрессия рецепторов на поверхности клеток и секреция провоспалительных цитокинов.

Были поставлены следующие задачи:

1. - Оценить степень праймирования нейтрофилов липополисахаридами из Е. coli или из фотосинтезирующей бактерии Rhodobacter capsulatus по интенсивности генерации активных форм кислорода в ответ на различные вторичные стимулы - бактерии или fMLP;

- исследовать влияние подавления полимеризации актина на праймирование нейтрофилов.

2. - Оценить активацию моноцитоподобных клеток ТНР-1 и мононуклеаров крови человека липополисахаридами из R- и S-хемотипов энтеробактерий Е coli и S. typhimurium и из бактерии Rb. capsulatus по следующим характеристикам:

- по уровню экспрессии рецепторов CDllb, CD14 и TLR4 на поверхности ТНР-1 клеток и моноцитов;

- по уровню секреции провоспалительных цитокинов TNF-a и IL-6 ТНР-1 клетками и мононуклеарами.

3. - Оценить влияние разных ЛПС на индуцированную синтетическую активность лимфоцитов при активации мононуклеаров.

Научная новизна работы. В работе впервые в единой серии экспериментов проведена оценка влияния структуры липополисахаридов на различные функциональные ответы клеток врожденного иммунитета. Показана значимость структуры липида А в степени праймирования нейтрофилов, оцениваемой по уровню дыхательного взрыва в ответ на разные вторичные стимулы. Установлено, что ЛПС из Rb. capsulatus обладает слабой праймирующей активностью и проявляет свойства антагониста в отношении токсичного ЛПС из Е coli. Показано, что подавление образования псевдоподий цитохалазином D не отменяет праймирования клеток эндотоксинами.

Обнаружена корреляция между исходной экспрессией TLR4 на поверхности моноцитов и уровнем синтеза првоспалительного цитокина TNF-a в ответ на эндотоксин из Е. coli.

На мононуклсарах выявлена способность JIIIC из Rb. capsulatus блокировать синтетическую активность лимфоцитов, индуцируемую ЛПС из S. typhimurium.

Научно-практическая значимость. Оценка исходного уровня экспрессии TLR4 на поверхности моноцитов позволяет прогнозировать дальнейший ответ клеток на липополисахарид по синтезу провоспалительного цитокина, и в связи с этим корректировать терапию в ходе лечения сепсиса. Полученные данные позволяют рекомендовать ЛПС из Rb. capsulatus в качестве инструмента для изучения механизмов действия антагонистов эндотоксинов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на I Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2004), Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина» (С-Петербург, 2005), 9-ой международной Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2005), V симпозиуме с международным участием «Физиология иммунной системы. Перспективные подходы к диагностике и терапии иммунопатологии и аллергических заболеваний» (Москва, 2006), VIII Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2007), Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2007), I Всероссийской научно-практической конференции «Питательные среды и методы культивирования клеток для биологии, медицины и биоиндустрии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Пущино, 2007), Международной научной конференции «Проблемы биоэкологии и пути их решения (Вторые Ржавитинские чтения)» (Саранск, 2008), VI Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасностъ» (Москва, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе Ъ статьи в реферируемых Российских журналах.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 126 страницах, иллюстрирована 27 рисунками и 7 таблицами. Список литературы включает 266 цитируемых литературных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Настоящая работа выполнена.на клетках крови здоровых доноров (нейтрофилы, мононуклеары) и на промоноцитарной линии опухолевых клеток ТНР-1 (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург).

ЛПС из Rb. capsulatus PG получали по методике Вестфаля [Westphal et al., 1952] в модификации Кульшииа [Кульшин и др., 1987]. Использованные в работе ЛПС из S. typhimurium (ЛПС5 №ытипит), из К coli (ЛПС£ „/,) и из Rb. capsulatus (ЛПСм. сарз) бьши предварительно охарактеризованы спектроскопическими методами (определение содержания липида A [Janda & Work, 1971] и КДО - кетодезоксиоктолузоновая кислота [Karkhanis et al., 1978]). Хемотипы липополисахаридов подтверждали методом электрофореза [Rrauss et al., 1988].

Клетки Е. coli К-12 культивировали в аэробных условиях на среде LB (Luria-Bertrani) при 37°С в течение ночи. Клетки осаждали, отмывали раствором PBS, инактивировали при 120°С в течение 15 мин и лиофильно высушивали. Перед экспериментом клетки трижды отмывали раствором PBS. Содержание бактерий в пробе определяли спектрофотометрическим методом. FITC-меченые бактерии Е. coli К-12 получали по методике [Oda & Maeda, 1986].

Мононуклеары или нейтрофилы выделяли из периферической крови здоровых доноров методом дифференциального центрифугирования в градиенте плотности фиколл/урографин (d-1,077 г/мл и 1,119 г/мл) [Новиков и Новикова, 1979]. Клетки перед использованием выдерживали 1 час при 4°С. Жизнеспособность клеток определяли по окрашиванию трипановым синим.

Клетки ТНР-1 культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 10% инактивированной эмбриональной сыворотки телят, 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 ммоль/л L-глутамина, 10"6 M меркаптоэтанола, при 37°С в СОг-камере «Joan». Дифференциацию ТНР-1 клеток (2,5x105 кл/мл) проводили в среде RPMI в 24 луночных планшетах, добавляя Ю^М форбол-12-миристат-13-ацетата (РМА) или 1а,25-дигидроксивитамина D3 (VD3), с последующим культивированием 48 и 72 часа, соответственно. После дифференцировки РМА клетки адгезировали к поверхности планшета. Лунки с адгезивными клетками однократно промывали свежей средой RPMI без сыворотки и антибиотиков и добавляли раствор ЛПС. Дифференцированные VD3 клетки слабо адгезировали к поверхности планшета. Клетки отбирали, однократно отмывали свежей культуральной средой и добавляли раствор ЛПС. Жизнеспособность клеток определяли по окрашиванию трипановым синим.

Продукцию активных форм кислорода (АФК) нейтрофиламй оценивали по интенсивности люминол-зависимой хемилюминесценции. Регистрацию образования АФК в условиях подавленной цитохалазином D (5 мкм) полимеризации актина проводили аналогично. Клетки (1х10б кл/мл) ресуспендировали в среде Хенкса, содержащей ионы Са^+ и Mg2+, 2% аутологической сыворотки, люминол (3,5x10 М) и помещали в

термостатируемую ячейку люминометра «ХЕМШПОМ-12» [Санталов, 2010] и инкубировали 30 мин. при 37°С в присутствии или отсутствии ЛПС£ со!1 или ЛПСщ. етр1 (10 нг/мл). В качестве вторичного стимула (активатор генерации АФК) использовали лиофильно высушенные опсонизированные бактерии Е. coli К-12 или MLP (IxlO^M). Поглощенные нейтрофилами FITC-меченые клетки Е. coli К-12 регистрировали методом конфокальной микроскопии на приборе «LSM 510 NLO» Karl Zeiss (Германия).

Для праймирования клеток использовали ЛПС£ тц или ЛПС/». caps. О 00 нг/мл). В качестве вторичного стимула использовали лиофильно высушенные опсонизированные бактерии Е. coli К-12 (клепжбактерии = 1:10) или fMLP (lxlO'^M).

Для определения цитокинов дифференцированные ТНР-1 клетки (2,5x105 кл/мл) инкубировали в планшетах (Nunc) 24 часа при 37°С в присутствии 100 нг/мл ЛПС S. typhimurium (S-хемотип) или Е. coli 055:В5 (S-хемотип), либо 50 нг/мл S. typhimurium SL1181 (Re-мутант) или К coli JM103 (Re-мутант) и 75 нг/мл Rb. capsulatus в среде для культивирования (без антибиотиков), содержащей 2% инактивированной эмбриональной сыворотки телят. Для выявления защитного эффекта клетки инкубировали предварительно 30 минут с 500 нг/мл ЛПС/». а затем - с токсичными ЛПС в течение суток. Супернатант отбирали, замораживали и хранили при -20°С до измерения цитокинов. Концентрацию TNF-a и IL-б определяли методом ELISE с использованием коммерческих наборов антител по методике, предложенной производителем (ООО «Цитокин» С-Петербург).

Для определения уровня экспрессированных на поверхности моноцитов и ТНР-1 клеток рецепторов образцы анализировали на проточном цитофлуориметре «Вескшап Coulter» (США) с использованием FITC-коньюгированных моноклональных антител к рецепторам CD14, к CD1 lb или к TLR4. В каждом образце проводили сбор не менее 20000 событий.

Синтетическую активности лимфоцитов определяли методом микроспектрального флуоресцентного анализа на двухволновом микрофлюориметре «Радикал ДМФ-2». Мононуклеары (2x104 кл/мл) инкубировали с ЛПСх typhimurium ИЛИ С ЛПСи. caps. (200 нг/мл), либо для проверки защитного эффекта - сначала с ЛПС/а. caps., а затем с ЛПС* typhimurium В течение 3-х часов при 37°С в среде RPMI-1640, содержащей 5% ЭТС. Клетки наносили на предметные стекла и анализировали мазки, окрашенные акридиновым оранжевым. В каждом образце регистрировали спектры люминесценции не менее 100 клеток.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Исследование влияния структуры эндотоксинов ва праймироваиие нейтрофилов по оцепке уровня дыхательного взрыва

Одной из важнейших биологических активностей липополисахаридов (ЛПС) является их способность к праймированию фагоцитов, которое сопровождается увеличением продукции активных форм кислорода (АФК) в ответ на вторичный стимул. Нейтрофилы в большей степени способны продуцировать активные формы кислорода в ответ на стимул, чем моноциты или макрофаги. По этой причине нейтрофилы являются удобной моделью для изучения эффектов праймирования разными ЛПС. ЛПС праймируют и активируют клетки через TLR4/MD-2 рецептор, который экспрессируется на фагоцитарных клетках и обеспечивает трансдукцию сигнала в клетку [Akira, 2006]. Для эффективного праймирования нейтрофилов необходимо присутствие белков сыворотки, обеспечивающих доставку ЛПС к рецепторным комплексам. Нами была подобрана оптимальная концентрация сыворотки (2%), позволяющая минимизировать ее собственный активирующий эффект, но при этом обеспечить присутствие белков, необходимых для взаимодействия ЛПС с нейтрофилами по CD14/TLR4/MD2 -зависимому механизму. Нетоксичные ЛПС, в частности, некоторые ЛПС из фототрофных бактерий семейства Rhodobacter проявляют антагонистическую активность в отношении эндотоксинов [Schromm et al., 2000]. Антагонисты подавляют индуцированный эндотоксинами синтез провоспалительных цитокинов моноцитами [Loppaow et al., 1990] и дыхательный взрыв нейтрофилов в ответ на вторичный стимул - fMLP [Винокуров и др., 2006]. В литературе отсутствуют данные о влиянии антагонистов эндотоксинов на дыхательный взрыв праймированных нейтрофилов, индуцированный бактериями. В связи с этим, нами исследовалась способность нетоксичного ЛПС из Rb. capsulatus проявлять антагонистические свойства по оценке уровня дыхательного взрыва в ответ на вторичный стимул.

Нейтрофилы инкубировали в течение 30 минут с ЛПСе соц или ЛПС/». caps или последовательно сначала с Л ПС/а. caps, и затем с ЛПС/г соц. Во всех пробах концентрация ЛПС была 10 нг/мл. Стимуляция нейтрофилов эндотоксинами не вызывала усиления образования АФК без дополнительной активации вторичным стимулом. В качестве вторичного стимула в работе использовались либо бактерии Е. coli К-12, либо fMLP. Предварительно бактерии Е. coli опсонизировали 20% сывороткой для приближения условий эксперимента к физиологическим. Наличие рецепторов на фагоцитах к

опсонинам способствует поглощению олсонизированных бактерий. Праймирование нейтрофилов токсичным ЛПС (агонистом) сопровождается усилением фагоцитоза и киллинга бактерий [Aida & Pabst, 1990]. Нами было проверено - влияет ли праймирование нейтрофилов нетоксичным ЛПС®. œps, на поглощение бактерий. Для визуализации поглощённых бактерий использовали FITC-меченые бактерии. Праймирование иейтрофилов различными ЛПС не подавляло поглотительную активность нейтрофилов независимо от того, является липополисахарид агонистом - ЛПС^. coi, или антагонистом -ЛПСд, caps. (рис. 1).

Рис. 1. FITC-меченые бактерии £ coli, поглощенные нейтрофилами через 30 минут после их добавления. Контрольные нейтрофилы (А); нейтрофилы, предварительно инкубированные с ЛПСг. сац (Б); ЛПСы, caps.(B)', последовательно ЛПС/ц, caps., ЛПС£

Добавление бактерий к праймированным посредством различных ЛПС нейтрофилам приводило к усиленной генерации активных форм кислорода (рис. 2А). При праймировании нейтрофилов ЛПСе. са/, интенсивность дыхательного взрыва была значительно выше контрольного уровня. Праймирование нейтрофилов ЛПСяй. caps, усиливало интенсивность дыхательного взрыва, но эффект был значительно менее выраженным, чем при использовании ЛПСд. соц Последовательное воздействие на клетки сначала ЛПСм,. mps., а затем ЛПСе СоИ приводило к снижению уровня АФК практически до контрольного значения (рис. 2Б).

IS

а

О 1260 2500 3750 5000 8250 7500 6750 10000 Время, с

Рис. 2. (А) Влияние праймирования ЛПС& тц и ЛПСя,. caps. на генерацию АФК нейтрофилами периферической крови человека при фагоцитозе бактерий Е. coli. Контроль (1), клетки, праймированные ЛПСд соц (2), ЛПС®. a,ps, (3), последовательно ЛПСм. caps_ и ЛПСе.соН (4) в концентрации 10 нг/мл.

(Б) Влияние ЛПС на суммарную продукцию АФК нейтрофилами после добавления бактерий Е. coli. Суммарную продукцию АФК оценивали как площадь под кривой зависимости интенсивности хемилюминесценции от времени за первые 50 мин ответа на Е. coli. Контроль, принятый за 100 % (1), ЛПСя. ы, (2), ЛПСт, caps. (3), последовательно ЛПСда. ^. и ЛПСе coli (4). Приведены средние значения эффектов и средняя квадратичная ошибка по результатам 7 независимых экспериментов. Достоверное отличие от эффекта JinCExoil (столбец 2): *р<0.05 и *'р<0.01.

Скорости развития и спада ответов нейтрофилов также отличались. Праймирование нейтрофилов посредством ЛПСя. сон ускоряло как нарастание, так и спад дыхательного взрыва. Нетоксичный ЛПС/». C4pj замедлял нарастание, но несколько ускорял спад дыхательного взрыва (табл. 1). Скорости рассчитывали по максимальному тангенсу угла наклона касательной к кривой зависимости интенсивности хемилюминесценции от времени. Изменения скорости нарастания и спада ответа представлены как отношение соответствующих скоростей к параметру контрольных клеток.

Таблица 1

Динамические характеристики дыхательного взрыва, вызванного добавлением бактерий Е. coli к нейтрофилам, праймированным различными ЛПС

Параметр ЛПСя. сои ЛПСД4. caps. ЛПСи. сар1, + ЛПС£тЛ

Изменение скорости нарастания, отн. ед. 1,03 ±0,16 0,87 ± 0,09 0,93 ±0,11

Изменение скорости спада, отн. ед. 1,39 ±0,24 1,15± 0,17 1,15 ±0,19

Примечание. Представлены средние значения скорости нарастания и спада и средняя квадратичная ошибка по результатам 8 независимых экспериментов.

Различия в интенсивностях высвобождаемых АФК отражают влияние структуры липида А обоих ЛПС на их стимулирующую активность. ЛПС®. cofM. проявлял антагонистическое действие по отношению к ЛПСе соц, вероятно, по механизму конкурентного связывания с рецепторным комплексом нейтрофилов - CD14/TLR4/MD2. Различия в скоростях нарастания и спада дыхательного взрыва обусловлены слабой активацией сигнальных путей в ответ на ЛПСяь. caps.

Далее нами исследовалось влияние праймирования на продукцию АФК, активированную fMLP - стимулом, который не влияет на перестройку цитоскелета, как это происходит при поглощении бактерий. fMLP является продуктом деградации бактериальных белков и одним из самых сильных хемотаксических агентов, привлекающих нейтрофилы в очаг воспаления [Romaschin et al., 1998]. Ответ праймироваяных нейтрофилов на 1 мкМ fMLP, как и при фагоцитозе Е. coli, зависел от структуры ЛПС, использованного для праймирования клеток. Продукция АФК при респираторном взрыве была значительно выше в клетках, предварительно

обработанных ЛПСя сЫ/, чем ЛПС®. сару. При последовательном действии ЛПС® сг1р1 и ЛПС£ соц эффект праймировавия был практически таким же, как при использовании

ТОЛЬКО ЛПСи ар,,, (рис. 3).

Рис. 3. (А) Влияние ЛПС£. соц и ЛПСда,. caps, на респираторньш взрыв, активированный хемотаксическим пептидом fMLP. Контрольные клетки (1), клетки, праймированные ЛПСв. соц (2), ЛПС№. caps. (3), последовательно ЛПС®. caps, и ЛПСг. СоН (4) в концентрации 10 нг/мл. Приведены записи одного из 4 экспериментов, каждая кривая представляет собой усредненный ответ от двух идентичных проб.

(Б) Влияние липополисахаридов на суммарную продукцию АФК нейтрофилами при активации респираторного взрыва 1 мкМ fMLP. Контроль, принятый за 100% (1), клетки, праймированные ЛПСя свц (2), ЛПСи,. CapS. (3), последовательно ЛПС®,. caps. и ЛПСя. сон (4) в концентрации 10 нг/мл. Приведены средние значения эффектов и средняя квадратичная ошибка по результатам 4 независимых экспериментов. Достоверное отличие от эффекта 10 нг/мл ЛПСе. сои (столбец 2), *р<0.05.

Кинетики нарастания и спада интенсивности флуоресценции люминола, отражающие уровни АФК, также значительно зависели от структуры ЛПС. Это может быть связано с разными кинетиками фосфорилирования семейства МАР-киназ, среди которых р38, ERK 1/2, N-концевая киназа c-Jun (JNK), участвующих в процессе фосфорилирования и транслокации к плазматической мембране цитозольного компонента NADPH-оксидазы - p41phox [Ward et ai., 2000]. Активация этих киназ связана с сигнальными путями, активируемыми через комплекс TLR4/MD2 [Yan et al., 2002], который является рецептором ЛПС. Предварительная обработка клеток токсичным ЛПСг. сон при последующей стимуляции fMLP способствует увеличению количества экспрессируемых рецепторов к fMLP на поверхности нейтрофилов [Howard et al., 1990]. Что, также может быть одной из причин значительного усиления респираторного взрыва в ответ на fMLP.

Полученные в работе результаты показали зависимость степени праймирования нейтрофилов от структуры ЛПС, что нашло отражение в характеристиках дыхательного

Б

Время, с

2

3

4

взрыва в ответах па разные стимулы, ЛПСи,. сар!., обладая собственной слабой праймирующей способностью, подавлял праймирующую активность ЛПСг. соп.

2. Влияние цитохалазина на дыхательный взрыв праймированных нейтрофилов

Праймирование фагоцитов посредством ЛПС, помимо активации белков семейства МАРК и перераспределения компонентов NADPH-оксидазы, сопровождается изменением цитоскелета клеток. Целый ряд сигналов сходится для локальной перестройки актинового цитоскелета в фагосоме. В литературе широко исследована роль киназ в праймировании фагоцитов посредством ЛПС до реализации дыхательного взрыва, однако, практически отсутствуют данные о роли цитоскелета в этом процессе. Для того чтобы выявить, сохраняется ли эффект праймирования, о котором судили по уровню образования АФК при нарушении полимеризации актина, нами исследовались две модели: в модели фагоцитоза исследовался внутриклеточный дыхательный взрыв, а в модели ответа на вторичный стимул fMLP исследовался внешний дыхательный взрыв. Образование псевдоподий - обязательная фаза фагоцитоза, необходимая для захвата бактерий, формирования фагосомы и последующего уничтожения бактерий активиыми формами кислорода в дополнение к переваривающим ферментам. Использование цитохалазина в качестве ингибитора полимеризации актина позволило выявить роль ингибирования при образовании псевдоподий в дыхательном взрыве. Предварительно была подобрана концентрация цитохалазина D - 5мкм, при которой происходило полное подавление образования АФК в ответ на бактерии К coli (рис. 4).

Рис. 4. Хемилюминесценция нейтрофилов, обработанных

цитохалазином D, в ответ на бактерии Е. coli. Контрольный фагоцитоз (1); концентрация цитохалазина 0,01 мкм (2); концентрация цитохалазина 1 мкм (3); концентрация цитохалазина 5 мкм (4).

!!!« 3100 »01 врем я, сек.

С увеличением концентрации цитохалазина резко снижалась способность нейтрофилов поглощать БИС-меченые бактерии. При концентрации 5 мкм поглощения бактерий не происходило, что регистрировали методом флуоресцентной конфокальной микроскопии (рис 5). Предварительное праймирование нейтрофилов ЛПС&

сои или ЛПСи,. caps. (100 нг/мл) не отменяло эффекта цитохалазина на блокирование поглотительной способности клеток (рис. 5В и 5Г).

Рис. 5. Поглощение

праймированными нейтрофилами FITC-меченых Е. coli после инкубации с цитохалазином D (через 30 мин после добавления бактерий). Нейтрофилы, праймированные ЛПС £ coli (А), ЛПСи,. caps. (Б), нейтрофилы, праймированные ЛПС е сои (В) или caps. (Г) с последующим добавлением цитохалазина D.

При добавлении бактерий к нейтрофилам с нарушенной после воздействия цитохалазина

способностью формировать псевдоподии, несмотря на очень низкую продукцию АФК эффект праймирования токсичным ЛПС^ соц сохранялся. Усиление респираторного взрыва при праймировании токсичным ЛПС£. СоН связано с тем, что данный липополисахарид, активируя МАРК, усиливает полимеризацию актина [Nick et al., 1999; Arndt et al., 2005], тем самым способствуя сборке NADPH-оксидазы. Липополисахарид из Rb. caps, не влиял, либо слабо влиял на полимеризацию актина. При использовании в качестве вторичного стимула fMLP продукция АФК в присутствии цитохалазина была значительно выше для праймированных ЛПС е. coli нейтрофилов; кроме того, отмечалось более быстрое нарастание и затяжной характер спада дыхательного взрыва в отличие от контрольных клеток и клеток, праймированных ЛПСи,. caps. (рис. 6).

Рис. 6. Хемилюминесценция праймированных нейтрофилов,

обработанных цитохалазином D, в ответ на fMLP. Контрольные нейтрофилы (1); нейтрофилы, праймированные ЛПСг. тн (2); нейтрофилы, праймированные ЛПСи,. caps. (3), нейтрофилы, праймированные последовательно

ЛПСи, . caps. и ЛПСд сои (4).

Т.о. можно заключить, что независимо от природы вторичного стимула эффект праймирования при нарушении цитоскелета сохранялся. Полученные результаты

100 .

фай|4фующив

а-еты UHT.D fMLP \ \ \ \

0 1 00 200 300 400 5СЮ 600 700 800 900 100011001200130014001500

зремя, с

указывают на то, что механизм праймирования нейтрофилов эндотоксинами не связан с процессом образования псевдоподий.

3. Исследование функциональных ответов дифференцированных ТНР-1 клеток на ЛПС разной структуры

3.1. Исследование уровня экспрессии рецепторов к ЛПС на поверхности ТНР-1 клеток

Исследование влияния структуры ЛПС на экспрессию рецепторов CD1 lb и CD 14 на поверхности клеток проводилось на промоноцитарной линии клеток ТНР-1 (Коллекция культур Института цитологии РАН, Санкт-Петербург). Линии клеток являются генетически гомогенными и отвечают на воспалительные стимулы, такие как ЛПС, единообразно. В связи с этим линии опухолевых клеток рассматриваются как удобные объекты для исследования влияния ЛПС на функциональные ответы клеток [Remer et al., 2006]. ТНР-1 клетки дифференцировали с помощью РМА в макрофагоподобные клетки, и с помощью VD3 - в моноцитоподобные клетки.

Предварительно на недифференцированных (нТНР-1) и дифференцированных (дТНР-1) клетках был исследован уровень экспрессии TLR4-, CD 14- и CD1 lb-рецепторов с использованием FITC-меченых моноклональных антител. На поверхности нТНР-1 клеток регистрировали только 1-2% TLR4. Рецепторы CD14 и CDllb отсутствовали. После дифференциации ТНР-1 клеток с помощью РМА уровень экспрессированных рецепторов TLR4 и CDllb не изменялся, и экспрессировалось до 3% CD14. При дифференциации клеток с помощью VD3 наблюдалось значительное изменение в уровнях CDllb до 15-20% и CD14 до 70-80%. Уровень экспрессии основного рецептора к ЛПС оставался неизменным и составлял 1-2% TLR4. Полученные результаты по экспрессии рецепторов на РМА- и УОз-дифференцированных ТНР-1 клетках отличаются от описанных ранее в литературе [Schwende et al., 1996]. Это может быть связано с особенностями исследуемого нами субклона клеток, что подтверждается имеющимися в литературе указаниями [Eperon & Jungi, 1996].

Поскольку все рецепторы, участвующие в узнавании и в транедукции сигнала от ЛПС, были обнаружены только на УОз-дифференцированных ТНР-1 клетках, исследование по влиянию структуры ЛПС на поверхностную экспрессию CD1 lb и CD14 рецепторов было выполнено на этих клетках. Клетки культивировали 24 часа в присутствии или в отсутствии ЛПСд coli 055:В5 (S-хемотип), ЛПСе «,/, JM103 (Re-хемотип), ЛПС.5 fyVhmurwm (S-хемотип), ЛПС$ wьшигш (Re-хемотип) и ЛПС®. caps. (R-

хемотип). Результаты исследования показали практически отсутствие влияния эндотоксина на дополнительную экспрессию рецепторов CDllb и CD14 (табл.2). Полученные результаты могут указывать на особенность данного субклона ТНР-1 клеток.

Таблица 2

Экспрессия рецепторов на дифференцированых 1а,25-дигидроксивитамином Эз клетках ТНР-1 под воздействием ЛПС различной структуры

ЛПС, хемотип CDllb CD14

Экспрессия, % Стандартная ошибка Экспрессия, % Стандартная ошибка

Контроль 14,7 ±3,2 77,7 ±4,9

Е. coli S- 15,0 ±3,1 69,0 ±5,7

Е. coli Re- 15,7 ±3,2 70,7 ±6,0

s'. typhimurium S- 15,3 ±3,3 71,7 ±6,0

S. typhimurium Re- 15,3 ±3,8 69,7 ±5,0

Rb. capsulatus R- 17,0 ±3,2 72,7 ±5,9

Rb. caps., E. coli S- 16,0 ±3,2 71,0 ±5,6

Примечание. Приведены данные 3-х независимых экспериментов.

3.2. Исследование влияния ЛПС на синтез провоспалителъных цитокинов TNF-a и IL-6 дифференцированными ТНР-1 клетками

Помимо липида А в состав молекулы эндотоксина входят кор и полисахарид, которые влияют на биологическую активность эндотоксинов [Brandenburg et al., 2001]. Нами была исследована зависимость биологической активности ЛПС, различающихся по составу липида А и гликофрагменту молекулы. Критерием активности служил уровень синтеза провоспалителъных цитокинов TNF-a и IL-6 дифференцированными ТНР-1 клетками. На дифференцированных витамином D3 клетках все исследованные типы ЛПС не вызывали индукции TNF-a. Индукция IL-6 наблюдалась в следовых количествах. Несмотря на присутствие на этих клетках CD14 и CD11- рецепторов, значимых для узнавания и доставки ЛПС к TLR4, низкий уровень экспрессии TLR4 на данном субклоне ТНР-1 клеток явился причиной слабого ответа этих клеток на ЛПС.

Ответы клеток на ЛПС были более выраженными после их дифференциации РМА, хотя ниже, чем описанные в литературе для других субклонов ТНР-1 [Zughaier et al., 2005]. Дифференциация ТНР-1 клеток РМА сопровождается накоплением транскрипционного фактора NF-кВ в цитоплазме, его транслокацией в ядро [Takashiba et al., 1999] и взаимодействием с сайтами генов, кодирующих TNF-a [Takashiba et al., 1993]. Т.о. эти клетки становятся праймированными, и ЛПС в данном случае выступает, по-видимому, как дополнительный стимул к синтезу цитокинов. Наибольшей активностью в индукции синтеза исследуемых цитокинов обладала S-структура ЛПС Salmonella.

Значительно менее активной была Re-структура ЛПС Salmonella, что согласуется с особенностями биологичексой активности ЛПС данной бактерии, описанными ранее [Muroi et al., 2002с]. Активность S-структуры ЛПС Е. coli в индукции TNF-a, как и в случае с индукцией IL-6, была ниже по сравнению с ЛПС Salmonella, (рис. 7).

te.caps. Salm.Re-Salm.S-E.œiRa-E.raf S-temptwib

J—

0 60 100 1s0 200 250 300 3s0 400 450 500 пг/мл

Рис. 7. Спонтанная и стимулированная эндотоксинами продукция цитокинов IL-6 (А) и TNF-a (Б) ТНР-1 клетками, дифференцированными РМА (приведены средние значения из 3-х экспериментов, выполненных в 2-х повторах).

Т.о. для проявления биологической активности ЛПС из Е. coli существенна структура липид АЖДО, поскольку полисахаридная составляющая фактически не влияла на уровень TNF-a и IL-6 при активации клеток разными хемотипами ЛПС. Наоборот, для S-формы ЛПС из Salmonella снижение молярной доли липида А/КДО и повышение доли полисахаридного фрагмента значительно увеличивали экспрессию цитокинов. Полученные нами данные позволяют заключить, что полисахаридный фрагмент усиливает биологическую активность липида А из Salmonella.

4. Исследование функциональных ответов фагоцитов на ЛПС разной структуры

4.1. Исследование уровня экспрессии рецепторов к ЛПС на поверхности моноцитов крови человека

Из-за низкой экспрессии рецепторов и слабого ответа ТНР-1 клеток дальнейшие исследования по влиянию разных ЛПС на экспрессию TLR4, CD14, CD11Ь проводили на мононуклеарах периферической крови человека. Исходные уровни экспрессии рецепторов на моноцитах, изолированных из периферической крови различных доноров, варьировали (табл. 3). Влияние ЛПС разной структуры на экспрессию исследуемых рецепторов на мононуклеарах оценивали после культивирования клеток в присутствии ЛПС Е. coli 055.В5 (S-хемотип) или ЛПС Rb. capsulatus (R-хемотип). Из данных табл. 3 видно, что

через 24 часа инкубации контрольных клеток в среде, содержащей аутоиммунную сыворотку, наблюдается значительное снижение уровня ТШ4-рецепторов на поверхности моноцитов в сравнении с исходными клетками. Это обусловлено, по-видимому, влиянием эндогенных стимулов [Brunn & Platt, 2006; Johnson et al., 2003]. Инкубация мононуклеаров с ЛПСг cd, или ЛГ1С/«. caps, в течение суток сопровождалась дополнительным снижением уровня экспрессии TLR4 (табл. 3), т.е. наблюдался аддитивный эффект различных факторов. Возможно, наблюдаемое нами снижение уровня экспрессированного TLR4 под действием ЛПС связано с его интернализацией в клетку [Thieblemont & Wright, 1999]. Инкубация мононуклеаров с токсичным ЛПСе. соц приводила к снижению уровня экспрессированного CD1 lb в большей степени, чем инкубация с ЛПС®. caps. (табл. 3).

Уровень экспрессии CD14 после инкубации с ЛПС^ соц снижался за счет слущивания мембранного CD 14 с поверхности активированной клетки в среду. Нетоксичный ЛПСщ. capS. либо не влиял на экспрессию CD14, либо несколько снижал ее (табл. 3).

Таблица 3

Экспрессия рецепторов на моноцитах человека под воздействием ЛПС различной структуры

Доноры Условия Экспрессия, %

эксперимента TLR4 CDllb CD14

1 контроль 33.0 85.0 90.0

через 24 ч 40.0 72.0 80.0

+ ЛПС Е. coli S- 23.0 60.0 75.0

+ ЛПС Rb. caps. 23.0 61.0 80.0

2 контроль 21.0 50.0 30.0

через 24 ч 4.6 54.0 59.0

+ ЛПС Е. coli S- 7.0 26.0 49.0

+ ЛПС Rb. caps. 4.7 41.0 48.0

3 контроль 14.0 70.0 68.0

через 24 ч 4.0 73.0 70.0

+ ЛПС£ coli S- 1.0 63.0 62.0

+ ЖС Rb. caps. 1.6 68.0 70.0

4 контроль 38.0 87.0 88.0

через 24 ч 2.0 29.0 32.0

+ ЖС Е. coli S- 1.0 8.0 22.0

+ ЛПС Rb. caps. 1.0 17.0 25.0

5 контроль 15.0 90.0 90.0

через 24 ч 10.0 82.0 80.0

+ ЛПС Е. coli S- 0.0 44.0 77.0

+ ЛПС Rb. caps. 1.0 70.0 74.0

4.2. Исследование влияния ЛПС на синтез провоспалителъпых щтокинов ТИЕ-а, /1-6 мононукпеарами крови человека

Параллельно на этих же клетках оценивали влияние разных хемотипов ЛПС на

синтез провоспалительного цитокина ЮТ-а. Клетки культивировали в присутствии или отсутствии ЛПС£ соП 055:В5 (8-хемотип), ЛПС£ ти Ш103 (Яе-хемотип) и ЛПСЯ4. сар!, (Я-хемотип). Для вьшвления защитного эффекта ЛПСи. С(?м. мононуклеары предварительно инкубировали с этим ЛПС в течение 30 мин, а затем с разными агонистами (соотношение антагонист/агонист = 10:1). На фоне резкого снижения уровня ТЫ14 эффект хемотипа практически не наблюдался (табл. 4).

Таблица 4

Спонтанная и стимулированная эндотоксинами продукция ТОР-а мононуклеарами условно здоровых доноров

ЛПС, хемотип TNF-a, пг/мл

Доноры

1 2 3 4

Контроль 1510 746 82 50

Е. coli S-, 100 нг 2982 2406 1654 194

Е. coli Re-, 50 нг 3334 2074 1524 180

Rb. capsulatus, 75 нг 2710 758 21 20

Rb. capsulatus, 500 нг 2036 560 462 55

Rb. caps. + E. coli S- 3260 833 488 108

Rb. caps. + E. coli Re- 2780 1694 1062 232

Нетоксичный ЛПСи,. caps. как в концентрации 75 нг/мл, так и в концентрации 500 нг/мл, используемой нами для выявления антагонистического эффекта, либо не влиял на синтез мононуклеарами TNF-a, либо приводил к слабой активации мононуклеаров. Более выражено свойства антагониста ЛПС®. caps, проявлял в отношений S-структуры токсичного ЛПС (табл. 4). Обобщая результаты по экспрессии рецептора TLR4 на исходных моноцитах и по синтезу TNF-a мононуклеарами можно заключить, что имеется прямая взаимосвязь между исходным уровнем TLR4 на поверхности клеток и их ответом на экзогенный стимул (табл.- 5).

Таблица 5

Корреляция между уровнем TLR4 на поверхности моноцитов и уровнем TNF-a

-------Уровень TLR4, % TNF-a, пг/мл "" 38 33 21 14

Контроль 1510 746 82 50

+ ЛПС E. coli, S- 2982 2406 1654 194

+ ЛПС Rb. caps. 2710 758 21 20

5. Влияние структуры ЛПС на синтетическую активность лимфоцитов человека

ЛПС индуцируют пролиферацию лимфоцитов в присутствии моноцитов [Ulmer et al., 2000]. Начальной стадией пролиферации является повышение синтетической активности клетки, характеризуемое изменением соотношения нуклеиновых кислот РНК и ДНК, описываемое параметром альфа (а). В настоящей работе этот параметр определялся методом Rigler [1966]. Нами исследовалось влияние токсичного ЛПС из S. typhimurium и нетоксичного ЛПС из Rb. capsulatus на синтетическую активность лимфоцитов.

У здоровых лиц величина параметра а для лимфоцитов варьирует в диапозоне 0,ОБОД. После инкубации мононуклеаров с ЛПСх ¡урШипит отмечалось выраженное увеличение параметра а до величины 1,23 в сравнении с контрольными клетками, проведенными через условия эксперимента (а = 0,72) (рис. 8).

О • 11 2) 36 45 Я 63 72 Л 90° 0 1 18 27 36 45 54 61 72 «1 SO0

SO 40

30 20 10 0

0 0.16 0.32 0.51 0L73 1 14 2 3.1 6.1 0 0.16 0.Э2 0.31 0J3 1 U I 1.1 6.3

Рис. 8. Распределение параметра альфа лимфоцитов. Контрольные клетки, проведенные через условия эксперимента (А); клетки, инкубированные с ЛПС.у ^рытигыт (Б). Приведены типичные гистограммы одного из экспериментов (п=5).

Для клеток, инкубированных с ЛПС®. сар,_, значение параметра а практически оставалось в пределах контроля (а = 0,75). В связи с этим мы проверили способность ЛПСщ. caps, блокировать синтетическую активность лимфоцитов, индуцированную эндотоксином. Клетки, инкубированные предварительно с ЛПСи>. caps.j практически не активировались при последующем добавлении ЛПСх typhimurium, что отражалось в величине параметра а, равной 0,79 (рис. 9).

Ill -40 30 2) to 0

О ИВ 132 0.51 0.73 1 14 t 3.1 1.« 0 0.18 0.12 1S1 0.73 1 14 J 9.1 19

Рис 9. Распределение параметра альфа лимфоцитов. Клетки, инкубированные с ЛПСм. сар!, (А); клетки, инкубированные с ЛПСи. caps., с последующи»« добавлением ЛПС^ typft ¡murium (Б).

Т.о. нетоксичный ЛПСда. caps, способен отменять индуцированную ЛПС.Х typhimurium биосинтетическую активность мононуклеаров по механизму конкурентного связывания с рецепторными молекулами на поверхности моноцитов. Полученные результаты показывают один из механизмов взаимодействия между клетками врожденного и приобретенного иммунитета в ответе организма на эндотоксин.

1 т-п-1-1 < 1 Г"" А 1 1 1 | Ч 1 1 1 1 1 г, 7 п 1 г т-

1—»BflfH V'LM

1 1 1 1 1 1 1 1 II 1 ltfl.il» , 1,11,, i I,

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 M 1 1 1 1 1 1 1 1 1 M 1 г п 1 1 В

n*oM«iia»L1t »ЧИ

, , 1 , , Г . , ill l.»-J«l, ........ , .

Выводы

1. Структурные особенности липида А ЛПС Rhodobacter capsulatus и Escherichia coli определяют степень праймирования фагоцитов.

2. На нейтрофилах ЛПС Rhodobacter capsulatus модулирует праймирующий эффект ЛПС Escherichia coli в ответ на fMLP и отменяет эффект праймирования в ответ на бактерии при дыхательном взрыве.

3. Подавление формирования псевдоподий цитохалазином не отменяет праймирование нейтрофилов липополисахаридами.

4. Количество цитокина TNF-a, секретируемого мононуклеарами в ответ на ЛПС, коррелирует с уровнем TLR4 на моноцитах.

5. ЛПС Rhodobacter capsulatus блокирует индуцированную ЛПС Salmonella typhimurium синтетическую активность лимфоцитов

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи:

1. Prokhorenko I.R., Zolotushchenko E.V.. Tarasevich N.Yu., Avkhachcva N.V., Safronova V.G., Grachev S.V. Respiratory Burst Activated by Escherichia coli in Human Neutrophils Primed with Different Lipopolysaccharides. Biochemistry (Moscow) Series A: Membrane and Cell Biolog.; 1 (4), 310-317 (2007)

2. Волошина E.B.. Прасол E.A., Грачев C.B., Прохоренко И.Р. Влияние цитохалазина D на дыхательный взрыв-праймированных нейтрофилов в ответ на вторичный стимул. Доклады Академии наук, 424 (2), 258-260 (2009).

3. Волошина Е.В.. Зубова C.B., Прохоренко C.B., Косякова Н.И., Прохоренко И.Р. Сравнение эффектов разных хемотипов липополисахаридов из К coli и Salmonella на синтез TNF-a и IL-6 макрофагоподобными клетками ТНР-1. Медицинская иммунология, 11 (6), 509-514 (2009).

Тезисы:

1. Кабанов Д.С., Волошина Е.В.. Иванов А.Ю. Влияние встраивания липополисахаридов на электрофоретическую подвижность эритроцитов и их теней. IX Всероссийская научно-практическая конференция "Молодые ученые в медицине". Сборник тезисов, 38 (2004).

2. Прохоренко И.Р., Винокуров М.Г., Юринская М.М., Кабанов Д.С., Гражданкин Е.Б., Кустанова Г.А., Зубова C.B., Прохоренко C.B., Волошина Е.В., Грачев C.B. Изучение защитного действия нетоксичных ЛПС от эффектов эндотоксинов в экспериментах in vivo и in vitro. I Международная конференция "Молекулярная медицина и биобезопасность". Москва 2004. Сборник тезисов, 159 (2004).

3. Волошина Е.В.. Карнаухова H.A., Косякова Н.И., Прохоренко И.Р. Активация лимфоцитов различными липополисахаридами. Всероссийская конференция молодых исследователей "Физиология и медицина". Вестник молодых ученых, 143 (2005).

4. Журавлев В.Е., Волошина Е.В.. Виканов И.Н., Прохоренко И.Р. Изучение влияния токсичного из Salmonella typhimurium и нетоксичного Rhodobacter capsulatus липополисахаридов на фагоцитарную активность нейтрофилов человека. Всероссийская конференция молодых исследователей "Физиология и медицина". Вестник молодых ученых, 144 (2005).

5. Волошина Е.В.. Карнаухова H.A., Косякова Н.И., Прохоренко И.Р. Влияние структуры различных липополисахаридов (LPS) на синтетическую активность лимфоцитов. 9-ая международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология-наука XXI века". Сборник тезисов, 137 (2005).

6. Прохоренко И.Р., Золотущенко Е.В.. Косякова Н.И., Оснач A.A. Защитные эффекты липополисахарида из Rb. capsulatus в отношении продукции цитокинов. V симпозиум с международным участием «Физиология иммунной системы. Перспективные подходы к диагностике и терапии иммунопатологии и аллергических заболеваний». Сборник материалов, 52 (2006).

7. Прохоренко И.Р., Золотущенко Е.В.. Косякова Н.И., Оснач A.A. Защитные эффекты липополисахарида из Rb. capsulatus в отношении продукции цитокинов. V симпозиум с международным участием «Физиология иммунной системы. Перспективные подходы к диагностике и терапии иммунопатологии и аллергических заболеваний». Сборник материалов, 52 (2006).

8. Золотущенко Е.В.. Зубова C.B., Косякова Н.И., Прохоренко И.Р. Влияние различных типов сывороток на спонтанную продукцию провоспалительных цитокинов мононуклеарами крови человека. VIII Конгресс «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии». Труды конгресса, Российский аллергологический журнал №3, приложение 1,53 (2007).

9. Золотущенко Е.В.. Карнаухова Н.А., Косякова Н.И., Прохоренко И.Р. Структура липополисахаридов влияет на респонеивноеть мононуклеаров периферической крови реконвалесцентных доноров. Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Материалы конференции, 258-260 (2007).

10. Золотущенко Е.В. Влияние условий культивирования Rhodobacter capsulatus на состав и биологическую активность липополисахаридов клеточной стенки. Материалы I Всероссийской научно-практической конференции «Питательные среды и методы культивирования клеток для биологии, медицины и биоиндустрии: фундаментальные и прикладные аспекты». Сборник материалов, 35-37 (2007).

11. Прохоренко И.Р., Зубова C.B., Кабанов Д.С., Волошина Е.В.. Прасол Е.А., Грачев C.B. Эндотоксины окружающей среды и здоровье человека. Международная научная конференция «Проблемы биоэкологи и пути их решения (Вторые Ржавитинские чтения)». Материалы конференции, 322-323 (2008).

12. Прохоренко И.Р., Зубова C.B., Волошина Е.В.. Прохоренко C.B., Грачев C.B. «Оценка антагонистической активности ЛПС из Rhodobacter capsulatus в отношении эндотоксинов из S- и R-хемотипов кишечных бактерий». VI Международная конференция «Молекулярная медицина и биобезопасность». Материалы конференции, 188-190 (2009).

Заказ N 296. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палиха 2а. тел.250-92-06 www.postator.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Волошина, Евгения Валерьевна

Список условных сокращений.

Введение.

1. Обзор литературы

1 Л.Липополисахариды, структура и биологическая активность.

1.2.Рецепторы, участвующие в доставке ЛПС и передаче сигнала в клетку.

1.3.ЛПС-зависимое праймирование нейтрофилов.

1.3.1. Изменение цитоскелета клетки.

1.3.2. Реорганизация микрофиламентов цитоскелета.

1.3.3. TLR4-onocpedoeaHHbm фагоцитоз.

1 ANADPH-оксидазный комплекс и роль праймирования в его сборке.

1.4.1. Сборка NADPH-оксидазного комплекса.

1.4.2. Рецептор-опосредуемая продукция АФК.

1.5.Влияние структуры ЛПС на активацию внутриклеточных сигнальных путей и синтез цитокинов.

1.6. Активация клеток приобретенного иммунитета ЛПС.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование влияния структуры липополисахаридов на функциональные ответы клеток миелоидного ряда"

Актуальность работы

Липополисахариды (ЛПС) - эндотоксины являются потентными активаторами клеток врождённого иммунитета. Активность ЛПС столь велика, что в пикограммовых концентрациях в крови они могут вызвать эндотоксиновый шок. Эндотоксин является главной составляющей внешней мембраны грамотрицательных бактерий. Ответ организма на грамотрицательные бактерии обусловлен распознаванием и ответом клеток хозяина на него [Weckesser et al, 1995]. ЛПС распознаётся разными путями.В одном пути (гуморальном) участвуют собственные антитела [Reid et al., 1997] липопротеины [Wurfel & Wright, 1995; Hailman et al, 1996; Vreugdenhil et al., 2001] и катионные белки крови [Munford et al., 2005], которые нейтрализуют и очищают кровь от ЛПС. В другом пути (рецепторном) участвуют связывающий ЛПС (LBP) белок, рецептор CD 14, передающий ЛПС комплексу TLR4/MD-2, который, в свою очередь передаёт сигнал, в клетку, что приводит к мощному воспалительному ответу [Diks et al., 2001]. Известны нетоксичные ЛПС, в частности ЛПС из фототрофных бактерий семейства Rhodobacter, которые способны конкурентно связываться с рецептором на поверхности клетки, проявляя антагонистическую активность в отношении эндотоксинов [Schramm et al., 2000]. Структуры ЛПС определяют набор дополнительных белков, которые вовлекаются в специализированные участки мембраны, формируя разные рецепторные кластеры. Состав такого кластера и стереохимия вовлеченных в него рецепторов, определяют запускаемый сигнал от ЛПС и специфичный ответ клетки [Triantafilou et al., 2004].

На биологическую активность ЛПС не только из разных бактерий, но и из разных хемотипов одной и той же бактерии, влияют состав как гидрофобного фрагмента молекулы — липида А, так и состав гидрофильного фрагмента — кора и полисахаридного остатка ЛПС. В работах Teghanemt et al.

2005) на клетках миелоидного ряда показано, что максимальной биологической активностью обладают ЛПС, в состав которых входит липид А, содержащий 6 жирных кислот и 2 фосфатные группы. Любое изменение количества жирных кислот снижает эндотоксическую активность ЛПС [Rossignol & Lynn, 2005]. Гидрофильная составляющая молекулы (полисахаридный фрагмент) может усиливать как у эндотоксина из S. typhimurium [Muroi & Tanamoto, 2002], или ослаблять как у Е. coli [Raetz et al., 2006] действие ЛПС, оцениваемое по индукции провоспалительного цитокина TNF-a в макрофагах. Усечение структуры кора в последовательности от Ra- до Re- ЛПС снижает высвобождение TNF-a нейтрофилами [Lentschat et al., 1999]. Интенсивность ответов клеток на эндотоксин, зависит не только от структуры ЛПС, но и от состояния, в котором находятся клетки - предактивированы они или находятся в состоянии покоя [Agarwal et al., 1995]. Поскольку результат взаимоотношения клетка-эндотоксин неоднозначен, весьма актуальным является иследование влияния разных факторов для предсказания ответа клетки на стимул.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы явилось изучение влияния состава липополисахаридов на разные функциональные ответы клеток, в их числе дыхательный взрыв, экспрессия рецепторов на поверхности клеток и секреция провоспалительных цитокинов.

Были поставлены следующие задачи:

1.- Оценить степень праймирования нейтрофилов липополисахаридами из Е. coli или из фототрофной бактерии Rhodobacter capsulatus по интенсивности генерации активных форм кислорода в ответ на различные вторичные стимулы — бактерии или fMLP;

- исследовать влияние подавления полимеризации актина на праймирование нейтрофилов.

2.- Оценить активацию моноцитоподобных клеток ТНР-1 и мононуклеаров крови человека липополисахаридами из R- и S-хемотипов энтеробактерий Е. coli и S. typhimurium и из бактерии Rb. capsulatus по следующим характеристикам;

- по уровню экспрессии рецепторов CDllb, CD14 и TLR4 на поверхности ТНР-1 клеток и моноцитов ;

- по уровню секреции провоспалительных цитокинов TNF-a и IL-6 ТНР-1 клетками и мононуклеарами.

3.- Оценить влияние разных ЛПС на индуцированную синтетическую активность лимфоцитов при активации мононуклеаров.

Научная новизна

В работе впервые в единой серии экспериментов проведена оценка влияния структуры липополисхаридов на разные функциональные ответы клеток врожденного и приобретенного иммунитета. Показана значимость структуры липида А в степени праймирования нейтрофилов, оцениваемой по уровню дыхательного взрыва в ответ на разные вторичные стимулы. Установлено, что ЛПС из Rb. capsulatus обладает слабой праймирующей активностью и проявляет свойства антагониста в отношение токсичного ЛПС из Е. coli. Показано, что подавление образования псевдоподий цитохалазином D не отменяет праймирования клеток эндотоксинами.

Обнаружена корреляция между исходной экспрессией TLR4 на поверхности моноцитов и уровнем синтеза провоспалительного цитокина TNF-a в ответ на эндотоксин из Е. coli.

На мононуклеарах выявлена способность ЛПС из Rb. capsulatus блокировать синтетическую активность лимфоцитов, индуцируемую ЛПС из S. typhimurium.

Научно-практическая значимость.

Оценка исходного уровня экспрессии TLR4 на поверхности моноцитов позволяет прогнозировать дальнейший ответ клеток на липополисахарид по синтезу провоспалительного цитокина, и в связи с этим корректировать терапию в ходе лечения сепсиса. Полученные данные позволяют рекомендовать ЛПС из Rb. capsulatus в качестве инструмента для изучения механизмов действия антагонистов эндотоксинов.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на I Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2004), Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина» (С-Петербург, 2005), 9-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2005), V симпозиуме с международным участием «Физиология иммунной системы. Перспективные подходы к диагностике и терапии иммунопатологии и аллергических заболеваний» (Москва, 2006), VIII Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2007), Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2007), I Всероссийской научно-практической конференции «Питательные среды и методы культивирования клеток для биологии, медицины и биоиндустрии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Пущино, 2007), Международной научной конференции «Проблемы биоэкологии и пути их решения (Вторые Ржавитинские чтения)» (Саранск, 2008), VI Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2009).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 3 статьи в реферируемых Российских журналах.

1. Обзор литературы

1.1. Липополисахариды, структура и биологическая активность

ЛПС всех грамотрицательных бактерий имеют общий принцип строения. Они состоят из трех основных частей: разветвленной или линейной полисахаридной цепи — О-специфического антигена, центрального олигосахарида — кора и специфического гликолипидного компонента—липида А (рис. 1). л urn щ А внутренний кор внешний кор гетерополисахарид

Рис. 1. Химическая структура S- и R-формы ЛПС [по Rietschel et al., 1994]; Р — фосфатный остаток, PEtn - этаноламинфосфат, GlcN - глюкозамин, KDO — 2-кето-З-дезокси-О-машю-октулозоновая кислота, Hep — гептоза, Glc — глюкоза, Gal — галактоза, GlcNAc - N-ацетилглюкозамин, GalNAc - N-ацетилгалактозамин.

Все части молекулы ЛПС соединены между собой ковалентными связями. Молекулы ЛПС, содержащие О-антиген, обозначают как S-ЛПС, а без О-антигена R-ЛПС. Молекула ЛПС закреплена в мембране бактерии липидом А, тогда как углеводный фрагмент, особенно его боковые цепи, обращен наружу клетки. При делении или гибели клеток ЛПС высвобождаются из мембраны бактерий и в свободном состоянии, взаимодействуя с различными клетками-мишенями организма, проявляют свои эндотоксические свойства [Rietschel et al., 1987].

О-специфическая цепь (О-антиген). О-антиген представляет собой гетерополисахаридную цепь, состоящую из повторяющихся олигосахаридных единиц (Рис. 1). Наиболее распространенными сахарами, входящими в состав О-антигена, являются глюкоза, галактоза, рамноза, акофриоза. В некоторых случаях повторяющиеся единицы могут содержать олигомер из молекул Сахаров одного типа. В отличие от структуры корового полисахарида, который схож у всех грамотрицательных бактерий, химический состав О-антигена отличается от штамма к штамму, определяя серотип бактерий. В одном только роде Enterobacteriaceae существуют сотни серотипов. Часть О-антигена, обращенная к мембране, представляет собой более короткую полисахаридную цепочку и не обладает большим разнообразием.

Состав и структура кора. Кор - центральная часть молекулы ЛПС, соединяющая О-антиген и липид А. Он представляет собой кислый гетерополисахарид, условно подразделяющийся на внутренний кор, непосредственно связанный с липидом А, и внешний кор (рис. 1). Наиболее распространенными компонентами внешнего кора являются D-глюкоза (Glc), D-галактоза (Gal), №ацетил-Б-глюкозамин (GlcNAc). В состав внутреннего кора, непосредственно связанного с липидом А, обычно входят остатки двух высших моносахаридов - Ь-глицеро-О-манно-гептозы (Hep) и 2-кето-З-дезокси-Б-манно-октулозоновой кислоты (KDO). Остатки гептозы и КДО могут нести заряженные неуглеводные заместители: неорганический фосфат (Р), пирофосфат (РР), 2-аминоэтилфосфат (PEtn) и 2-аминоэтилпирофосфат (PPEtn), которые обусловливают заряд данной области молекулы ЛПС.

Некоторые микроорганизмы, дающие колонии шероховатой формы и являющиеся природными или искусственно полученными R-мутантами, продуцируют ЛПС, для которого типично полное отсутствие полисахаридной цепи О-антигена (R-структура ЛПС). В соответствии с особенностями биосинтеза R-штаммы Escherichia coli и соответствующие им структуры кора классифицированы от Ra- до Re-структур (рис. 2).

PPEA липид A ♦

- KDO «2 t4 5

I 2

KDO i t

KDO Re—

-Hep l y з

Rd,

-Hep

MI

Hep Rd,

Glc -«з M

Gal Rc—

-Gal «l 2

Rb

- Glc -GlcNAc

Rbi

Rbn

Ra

Рис. 2. Химические структуры R-форм ЛПС из различных штаммов Е. coli [адаптировано по Reeves, 1994]. РРЕА - аминоэтилпирофосфат, KDO — 2-кето-З-дезокси-D-манно-октулозоновая кислота, Hep - гептоза, Glc - глюкоза, Gal - галактоза, GlcNAc -N-ацетилглюкозамин.

Мутанты с более усеченной, чем Ra- структурой ЛПС имеют не полностью достроенный кор. Например, у Rb-мутантов в гексозной области отсутствует остаток N-ацетилглюкозамина; кор Rc- представлен внутренней областью с присоединенным к ней одним остатком глюкозы, а кор Rd - одной внутренней областью, у Re-мутантов кор построен только из остатков КДО [Книрель и Кочетков, 1993].

Липид А. Липид А — это структурный компонент ЛПС, присущий любому эндотоксину [Rietschel et al., 1987]. По своему химическому составу липид А представляет фосфогликолипид (рис. 3 и 4). Все эндотоксически активные липиды А содержат пиранозный остаток гексозамина в D-глюко-конфигурации [Rietschel et al., 1998] или 2,3-диамино-2,3-дидезокси-D-глюкозу, которые представлены как (3(1 -6)-связанные гомо- или гетеродимеры [Weckesser & Mayer, 1988]. Химические структуры липида А разных грамотрицательных бактерий различаются типом углеводной основы, степенью ее фосфорилирования, присутствием заместителей остатков фосфорной кислоты, природой, количеством, распределением, длиной жирных кислот, хотя общий структурный принцип построения одинаков. В частности, липид А из ЛПС& сои образован диглюкозамином (Glcl и GlcII) (рис. 3). В положениях С-1 и С-4' Glcl и GlcII располагаются остатки фосфорной кислоты. К положениям 3, 3' и аминогруппам обоих глюкозаминов присоединена 3-гидроксимиристиновая кислота, которая, в свою очередь, ацилирована миристиновой кислотой при С-31 GlcII и лауриновой кислотой при С-2' Glcl. Гидроксильная группа положения С-4 восстанавливающего глюкозамина не замещена [Rietschel et al., 1994]. Липид А связан гликозидной связью через ОН-группу при С-6' GlcII с остатками КДО и полисахаридным фрагментом [Rietschel et al., 1983]. Такая структура проявляет максимальную эндотоксическую активность у многих видов млекопитающих. В случае клеток человека наибольший ответ наблюдается на ЛПС, в структуре которых содержится две фосфатные группы в составе липида А, а также миристиновые и лауриновые остатки, например, как у ЛПС из Escherichia coli (ЛПС£ co!i) [Raetz et al., 1991].

Рис. 3. Химическая структура липида А из ЛПС& со/, [по Rietschel et al., 1994].

Основные отличия ЛПС фототрофной грамотрицательной бактерии Rhodobacter capsulatus от ЛПС семейства Enterobacteriacea наблюдаются в гидрофобной и гидрофильной областях липида А (рис. 4). В положении С-1 GlcNI липида ARb. caps. расположен дифосфорилэтаноламин, а в положении С-4' Gldl-фосфорилэтаноламин, атомы водорода аминогрупп глюкозаминов замещены 3-окситетрадекановой кислотой (Си), а в положениях С-3 и С-3' дисахарида расположена 3-гидроксидекановая кислота (Сю), присоединенная

О — Антиген 6

Си С12 сложноэфирной связью. 3-гидроксидекановая кислота положения С-3' невосстанавливающего сахарида ацелирована додекановой кислотой (Ci2:i). Гидроксильные группы при С-4 и С-6 не замещены [Krauss et al., 1989].

О — Антнген

6" О О . . П »

NH О—Р —0--Р —ОН

Ан

Рис. 4. Химическая структуры липида А из ЛПС^ caps [по Krauss et al., 1989].

От количества и состава жирных кислот зависит токсичность ЛПС. Кроме того, биологическая активность различных ЛПС зависит от конформации молекул, образующих липид А. Так, липид А с четырьмя жирными кислотами, которые обусловливают формирование цилиндрической формы, абсолютно нетоксичен и проявляет антагонистические свойства, в то время как шесть жирных кислот, формирующих коническую структуру липида А, обеспечивают его максимальную токсичность. Наибольшей активностью обладает ЛПС^ соц, имеющий коническую форму липида А, тогда как ЛПС Rb. spheroides, имеющий цилиндрическую форму, обладает антагонистическими свойствами [Netea et al., 2002].

Длина и число ацильных цепей, асимметрия распределения ацильных групп, число и распределение заряда — факторы, определяющие пространственную конформацию липида А, влияют на надмолекулярную структуру ЛПС [Netea et al., 2002]. От этого зависит и характер связывания с рецепторным комплексом, и встраивание в мембрану. Предполагается, что антагонистический эффект обусловлен одинаковой плотностью упаковки жирных кислот между двумя остатками глюкозамина [Schramm et al., 2000].

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Волошина, Евгения Валерьевна

Выводы

1. Структурные особенности липида А ЛПС Rhodobacter capsulatus и Escherichia coli определяют степень праймирования фагоцитов.

2. На нейтрофилах ЛПС Rhodobacter capsulatus модулирует праймирующий эффект ЛПС Escherichia coli в ответ на fMLP и отменяет эффект праймирования в ответ на бактерии при дыхательном взрыве.

3. Подавление формирования псевдоподий цитохалазином не отменяет праймирование нейтрофилов липополисахаридами.

4. Количество цитокина TNF-a, секретируемого мононуклеарами в ответ на ЛПС, коррелирует с уровнем TLR4 на моноцитах.

5. ЛПС Rhodobacter capsulatus блокирует, индуцированную ЛПС Salmonella typhimurium синтетическую активность лимфоцитов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Волошина, Евгения Валерьевна, Пущино

1. Винокуров М.Г., Юринская М.М., Прохоренко И.Р., Грачев С.В. Липополисахарид Rb. capsulatus нейтрализует эндотоксин-индуцированный ответ нейтрофилов и моноцитов периферической крови человека // Молекулярная медицина. 2006. № 4. С. 56-62.

2. Карнаухов В.Н. Люминесцентный спектральный анализ клетки. // М., Наука. 1978. С. 207.

3. Книрель Ю.А. и Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. I. Общая характеристика липополисахаридов и структура липида А. // Биохимия. 1993. Т. 58. Вып. 2. С. 166-181.

4. Кольман Я. и Рём К.-Г. Наглядная биохимия. М.: Мир. 2004. 469 с.

5. Косякова Н.И. Клинико-иммунологические и метаболические показатели активности лимфоцитов при сальмонеллезе и дизентерии. // Дис. . канд. мед. наук. М.: ММА им. И.М. Сеченова, 1983. 140 с.

6. Кульшин В.А., Яковлев А.П., Аваева С.Н., Дмитриев Б.А. Улучшенный метод выделения липополисахаридов из грамотрицательных бактерий. // Мол. генетика. 1987. № 5. С. 44-46.

7. Новиков Д.К. и Новикова В.И. Клеточные методы иммунодиагностики. Минск: Беларусь, 1979. С. 20-31.

8. Санталов Б.Ф. Сборник прикладных разработок научных организаций ПНЦРАН. 2010. Пущино. С. 32.

9. Agarwal S., Piesco N.P., Johns L.P., Riccelli A.E. Differential expression of IL-lp, TNF-a, IL-6 and IL-8 in human monocytes in response to lipopolysaccharides from different microbes. // J. Dent. Res. 1995. V. 74. № 4. P. 1057-1065.

10. Aida Y. & Pabst M.J. Priming of neutrophils by lipopolysaccharide for enhanced release of superoxide. // J. Immunol. 1990. V. 145. № 9. P.3017-3025.

11. Akira S. TLR signaling. // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2006. V. 311. P. 116.

12. Akira S. Toll-like receptor signaling. // J. Biol. Chem. 2003. Y. 278. P. 3810538108.

13. Akira S., Takeda K., Kaisho T. Toll-like receptors: critical proteins linking innate and acquired immunity. // Nat. Immunol. 2001. V. 2. P. 675-680.

14. Allen J.N., Moore, S.A., Liao, Z., Wewers, M.D. Changes in mononuclear phagocyte microtubules after endotoxin stimulation. I. Changes in microtubule stability // Amer. J. Respir. Cell and Mol. Biol. 1997. V. 16. P. 119-126.

15. Allen L.-A.H. Mechanisms of pathogenesis: evasion of killing by polymorphonuclear leukocytes. // Microbes and Infection. 2003. V. 5. P. 13291335.

16. Almkvist J., Faldt J., Dalhren C., Leffler H., Karlsson A. Lipopolysaccharide-induced gelatinase granule mobilization primes neutrophils for activation by calectin-3 and Formylmethionyl-Leu-Phe. // Infect. Immun. 2001. V. 69. P. 832-837.

17. Arndt P.G., Young S., Lieber J., Fessler M.B., Nick J.A., Worthen G.S. Inhibition of c-Jun N-terminal kinase limits lipopolysaccharide-induced pulmonary neutrophil influx. // Am. J. Respirator. Critic. Care Med. 2005. V. 171. P. 978-986.

18. Araki N., Johnson M.T., Swanson J.A. A role for phosphoinositide 3-kinase in the completion of macropinocytosis and phagocytosis by macrophages. // J. Cell. Biol. 1996. V. 135. P. 1249-1260.

19. Arroyo-Espliguero R., Avanzas P., Jeffery S., Kaski J.C. CD14 and Toll-like receptor 4: a link between infection and acute coronary events? // J. Heart. 2004. V. 90. P. 983-988.

20. Astiz M., Saha D., Lustbader D., Lin R., Rackopw E. Monocyte response to bacterial toxins, expression of cell surface receptors, and release of antiinflammatory cytokines during sepsis. // J. Lab. Clin. Med. 1996. V. 128. P. 594-600.

21. Aurell С.A. & Wistrom A.O. Critical aggregation concentrations of Gram negative bacterial lipopolysaccharides. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. V. 253. P. 119-123.

22. Auwerx J. The human leukemia cell line, THP-1: multifaceted model for the study of monocyte-macrophage differentiation. // Experientia. 1991. V. 47. P. 22-31.

23. Babior B.M. NADPH oxidase: an update. // Blood. 1999. V. 93. № 5. P. 14641476.

24. Barton G.M. & Medzhitov R. Toll-like receptor signaling pathways. // Science. 2003. V. 300. P. 1524-1525.

25. Bazil V. & Strominger J.L. Shedding as a mechanism of downmodulation of CD 14 on stimulated human monocytes. // J. Immunol. 1991. V. 147. P. 15671574.

26. Beaty C.D, Franklin T.L, Uehara Y, Wilson C.B. Lipopolysaccharide-induced cytokine production in human monocytes: role of tyrosine phosphorylation in transmembrane signal transduction. // Eur. J. Immunol. 1994. V. 24. P. 12781284.

27. Bell J.K., Botos I., Hall P.R., Askins J., Shiloach J., Segal D.M., Davies D.R. The molecular structure of the Toll-like receptor 4 ligand-binding domain. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. P. 10976-10980.

28. Benna J.E., Han J., Park J.W., Schmid E., Ulevitch R.J., Babior B.M. Activation of p38 in stimulated human neutrophils: phosphorylation of the oxidase component р47рЛо* by p38 and ERK but not by INK. // Arch. Biochem. Biophys. 1996. V. 334. P. 395-400.

29. Bennett T.A., Lynam E.B., Sklar L.A., Rogelj S. Hydroxamatebased metalloprotease inhibitor blocks shedding of L-selectin adhesion molecule from leukocytes: functional consequences for neutrophil aggregation. // J. Immunol. 1996. V. 156. P. 3093-3097.

30. Beutler B. TLRs and innate immunity. // Blood. 2009. V. 113. P. 1399-1407.

31. Beutler В., Jiang Z.F., Georgel P., Crozat K., Croker В., Rutschmann S., Du X., Hoebe K. Genetic analysis of host resistance: Toll-like receptor signalling and immunity at large. // Ann. Rev. Immunol. 2006. V. 24. P. 353-389.

32. Blander J.M. & Medzhitov R. Regulation of phagosome maturation by signals from Toll-like receptors. // Science. 2004. V. 304. P. 1014-1018.

33. Bokoch G.M. & Knaus U.G. NADPH oxidases: not just for leukocytes anymore! //Trends Biochem. Sci. 2003. V. 28. P. 502-508.

34. Borregaard N., Kjeldsen L., Rygaard K., Bastholm L., Nielsen M. H., Sengelov H., Bjerrum O.W., Johnsen A.H. Stimulus-dependent secretion of plasma proteins from human neutrophils. // J. Clin. Invest. 1992. V. 90. P. 86-96.

35. Borregaard N., Lollike K., Kjeldsen L., Sengelov H., Bastholm L., Nielsen M. H., Bainton D.F. 1993. Human neutrophil granules and secretory vesicles. // Eur. J. Haematol. 1993. V. 51. P. 187-198.

36. Bortolussi R., Rajaraman, K., Quing, G., Rajaraman, R. Fibronectin enhances in vitro lipopolysaccharide priming of polymorfonuclear leukocytes. // Blood. 1997. V. 89. P. 4182-4189.

37. Brandenburg K., Jurgens G., Muller M., Fukuoka S., Koch M.H.J. Biophysical characterization of lipopolysaccharide and lipid A inactivation by lactofeirin. // Biol. Chem. 2001. V. 382. P. 1215-1225.

38. Brint E.K., Xu D., Liu H., Dunne A., McKenzie A.N., O'Neill L.A., Liew. F.Y. ST2 is an inhibitor of interleukin 1 receptor and Toll-like receptor 4signaling and maintains endotoxin tolerance. // Nat. Immunol. 2004. V. 5. P. 373-379.

39. Brunn G. J. & Piatt J. The etiology of sepsis: turned inside out. // Trends in Molecular Medicine. 2006. V. 12. № 1. P. 10-16.

40. Calafat J., Kuijpers, T.W., Janssen H., Borregaard, N., Verhoeven A J., Roos D. Evidence for small intracellular vesicles in human blood phagocytes containing cytochrome b558 and the adhesion molecule CD lib/CD 18. // Blood. 1993. V. 81. P. 3122-3129.

41. Caron E. & Hall A. Identification of two distinct mechanisms of phagocytosis controlled by different Rho GTPases. // Science. 1998. V. 282. P. 1717-1721.

42. Choe J., Kelker M.S., Wilson I.A. Crystal structure of human Toll-like receptor 3 (TLR3) ectodomain. // Science. 2005. V. 309. P. 581-585.

43. Collins S. The HL-60 promyelocyte leukemia cell line: proliferation, differentiation, and cellular oncogene expression. // Blood. 1987. V. 70. P. 1233-1244.

44. Condliffe A.M., Kitchen E., Chilvers E.R. Neutrophil priming: pathophysiological consequences and underlying mechanisms. // Clin. Sci. Lond.. 1998. V. 94. P. 461-471.

45. Cox D., Chang P., Zhang Q., Reddy P.G., Bokoch G.M., Greenberg S. Requirements for both Racl and Cdc42 in membrane ruffling and phagocytosis in leukocytes. // J Exp. Med. 1997. V. 186. P. 1487-1494.

46. Cramer E.B. Development and distribution of mononuclear phagocytes. In: Inflammation. 1992. Callin J.I., Goldstein I.M., Snyderman R., eds. New. York: Raven Press. P. 325.

47. Dahlgren C. & Karlsson A. Respiratory burst in human neutrophils. // J. Immunol. Methods. 1999. V 232. P. 3-14.

48. DeLeo F.R., Allen L.-A.N., Apicella M., Nauseef W.M. NADPH oxidase activation and assembly during phagocytosis. // J. Immunol. 1999. V. 163. P. 6732-6740.

49. DeLeo F.R., Renee J., McCormick S., Nakamura M., Apicella M., Weiss J.P., Nauseef W.M. Neutrophils exposed to bacterial lipopolysaccharide upregulate NADPH oxidase assembly. // J. Clin. Investig. 1998. V. 101. P. 455-463.

50. Diks S.H., van Deventer S.J.H., Peppelenbosch M.P. Lipopolysaccharide recognition, intemalisation, signalling and other cellular effects. // Journal of Endotoxin Research. 2001. V. 7. № 5. P. 335-349.

51. Downey G.P., Butler J.R., Tapper H. et al. Importance of MEK in neutrophil microbicidal responsiveness. // J. Immunol. 1998. V. 160. P. 434-443.

52. Doyle S.E., O'Connell R.M., Miranda G.A. et al. Toll-like receptors induce a phagocytic gene program through p38. // J. Exp. Med. 2004. V. 199. P. 81-90.

53. Dziarski R. Recognition of bacterial peptidoglycan by the innate immune system. // Cell. Mol. Life Sci. 2003. V. 60. P. 1793-1804.

54. El Benna J., Dang P.M., Gaudry M. et al. Phosphorylation of respiratory burst oxidase subunit p67phox during human neutrophil activation-regulation by protein kinase C-dependant and independent pathways. // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 17204-17208.

55. Ellner J.J. & Spagnuolo P.J. Suppression of antigen and mitogen induced human T lymphocyte DNA by bacterial lipopolysaccharide: mediation by monocyte activation and production of prostaglandins. // J. Immunol. 1979. V. 123. P. 2689-2695.

56. English D. & Gabig T.G. Differentiation of cellular processes involved in the induction and maintenance of stimulated neutrophil adherence. // Blood. 1986. V. 67. P. 1314-1322.

57. Eperon S. & Jungi T.W. The use of human monocytoid lines as indicators of endotoxin. //J. Immunol. Methods. 1996. V. 194. P. 121-129.

58. Fauci A. & Pratt K. Activation of human В lymphocytes. Direct plaque-forming assay for the measurement of polyclonal activation and antigenic stimulation of human В lymphocytes. // J. Exp. Med. 1976. V. 144. P. 674-684.

59. Faurschou M. & Borregaard N. 2003. Neutrophil granules and secretory vesicles in inflammation. //Microbes Infect. 2003. V. 5. P. 1317-1327.

60. Fitzgerald K.A., Rowe D.C., Barnes B.J., Caffrey D.R., Visintin A., Latz E., Monks В., Pitha P. M., Golenbock D.T. LPS-TLR4 signaling to IRF-3/7 and NF-kappaB involves the toll adapters TRAM and TRIF. // J. Exp. Med. 2003. V. 198. P. 1043-1055.

61. Fitzgerald K.A., Rowe D.C., Golenbock D.T. Endotoxin recognition and signal transduction by the TLR4/MD2-complex. // Microbes Infect. 2004. V. 6. P. 1361-1367.

62. Fukao T. & Koyasu S. PI3K and negative regulation of TLR signaling. // Trends Immunol. 2003. V. 24. P. 358-363.

63. Geng Y., Zhang В., Lotz M. Protein tyrosine kinase activation is required for lipopolysaccharide induction of cytokines in human blood monocytes. // J. Immunol. 1993. V. 151. P. 6692-6700.

64. Ginsel L.A., Onderwater J.J., Fransen J.A., Verhoeven A.J., Roos D. Localization of the low-Mr subunit of cytochrome b558 in human blood phagocytes by immunoelectron microscopy. // Blood. 1990. V. 76. P. 21052116.

65. Gioannini T.L., Teghanemt A., Zhang D., Levis E.N., Weiss J.P. Monomeric endotoxiniprotein complexes are essential for TLR4-dependent cell activation. // J. Endotoxin Res. 2005. V. 11. P. 117-123.

66. Golenbock D.T., Hampton R.Y., Qureshi N., Takayama K., Raetz C.R. Lipid A-like molecules that antagonize the effects of endotoxins on human monocytes //J. Biol. Chem. 1991. V. 266. №. 29. P. 19490-19498.

67. Greenberg S. & Grinstein S. Phagocytosis and innate immunity. // Curr. Opin. Immunol. 2002. V. 14. P. 136-145.

68. Grogan A., Reeves E., Keep N., Wientjes F., Totty N.F., Burlingame A.L., Hsuan J.J., Segal AW. Cytosolic phox proteins interact with and regulate the assembly of coronin in neutrophils. // J. Cell Sci. 1997. V. 110. Pt. 24. P. 30713081.

69. Gruber A., Mancek M., Wagner H., Kirschning C.J., Jerala R. Structural model of MD-2 and functional role of its basic amino acid clusters involved in cellular lipopolysaccharide recognition. // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 2847528482.

70. Guthrie L. A., McPhail L.C., Henson P.M., Johnston R.B. Priming of neutrophils for enhanced release of oxygen metabolites by bacterial lipopolysaccharides. // J. Exp. Med. 1984. V. 160. P. 1656-1671.

71. Hall A. Rho GTPases and the actin cytoskeleton. // Science. 1998. V. 279. P. 509-514.

72. Haribabu В., Richardson R., Verghese M., Barr A., Zhelev D. and Snyderman R. Functuon and regulation of chemoattractant receptors. // Immunol. Res. 2000. V. 12. P. 593-633.

73. Hartwig J.H. & Shevlin P. The architecture of actin filaments and the ultrastructural location of actin-binding protein in the periphery of lung macrophages. // J. Cell Biol. 1986. V. 103. № 3. P. 1007-1020.

74. Haziot A., Chen S., Ferrero E., Low M.G., Silber R., Goyert S.M. The monocyte differentiation antigen, CD 14, is anchored to the cell membrane by a phosphatidylinositol // J. Immunol. 1988. V. 141. P. 547-552.

75. Howard Т.Н., Wang D., Berkow R.L. Lipopolysaccharide modulates chemotactic peptide-induced actin polymerization in neutrophils. // J. Leukoc. Biol. 1990. V. 47. P. 13-24.

76. Huang J., Hitt N.D., Kleinberg M.E. Stoichometry of pTl-phox and gp-91 phox in phagocyte cytochrome b558. //Biochemistry. 1995. V. 34. P. 16753-16757.

77. Huang Q., Yang J., Lin Y., Walker C., Cheng J., Liu Z.G., Su B. Differential regulation of interleukin 1 receptor and Toll-like receptor signaling by MEKK3. // Nat. Immunol. 2004. V. 5. P. 98-103.

78. Inohara N., Ogura Y., Chen F.F., Muto A., Nunez G. Human Nodi confers responsiveness to bacterial lipopolysaccharides. // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. N. 4. P. 2551-2554.

79. Iovine N., Eastvold J., Elsbach P., Weiss J.P., Gioannini T.L. The carboxyl-terminal domain of closely related endotoxin-binding proteins determines the target of protein-lipopolysaccharide complexes. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P.7970-7978.

80. Jamal S. & Jesaitis A.J. Reorganization of the human neutrophil plasma membrane is associated with functional priming: implications for neutrophil preparations. //J. Leukoc. Biol. 2007. V. 81. P. 672-685.

81. Janda J. & Work E. A colorimetric estimation of lipopolysaccharides. // FEBS Letters. 1971. V. 16. № 4. P. 343-345.

82. Jerala R. 2007. Structural biology of the LPS recognition. // International Journal of Medical Microbiology. 2007. V. 297. P. 353-363.

83. Jiang Z., Georgel P., Du X., Shamel L., Sovath S., Mudd S., Huber M., Kalis C., Keck S., Galanos C., Freudenberg M., Beutler B. CD14 is required for MyD88-independent LPS signaling. //Nat. Immunol. 2005. V. 6. № 6. P. 565570.

84. Johnson G.B. Activation of mammalian Toll-like receptors by endogenous agonists. // Crit. Rev. Immunol. 2003. V. 23. P. 15-44.

85. Karkhanis Y.D., Zeltner J.Y., Jackson J.J., Carlo D.J. A new and improved microassay to determine 2-Keto-3-deoxyoctonate in lipopolysaccharide of gram-negative bacteria. // Analytical Biochemistry. 1978. V. 85. P. 595-601.

86. Keber M.M., Gradisar H., Jerala R. MD-2 and Der p 2 a tale of two cousins or distant relatives? // J. Endotoxin Res. 2005. V. 11, P. 186-192.

87. Kim J.I., Lee C.J., Jin M.S., Lee C.H., Paik S.G., Lee H., Lee J.O. Crystal structure of CD 14 and its implications for lipopolysaccharide signaling. // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 11347-11351.

88. Kitchens R.L. & Munford R.S. Enzymatically deacylated lipopolysaccharide (LPS) can antagonize LPS at multiple sites in the LPS recognition pathway. // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 9904-9910.

89. Koeffler H.P. Human acute myeloid leukemia lines: models of leukemogenesis. // Semin Hematol. 1986. V. 23. P. 223-236.

90. Kohara J., Tsuneyoshi N., Gauchat J.F., Kimoto M., Fukudome K. Preparation and characterization of truncated human lipopolysaccharide-binding protein in Escherichia coli. II Protein Express. Purif. 2006. V. 49. P. 276-283.

91. Kong L. & Ge B.-X. MyD 88-independent activation of a novel actin-Cdc42/Rac pathway is required for Toll-like receptor-stimulated phagocytosis. // Cell Research. 2008. V. 18. P. 745-755.

92. Krauss J.H., Seydel U., Weckesser J., Mayer H. Structural analysis of the nontoxic lipid A of Rhodobacter capsulatus 37b4. II Eur. J. Biochem. 1989. V. 180. P. 519-526.

93. Krauss J.H., Weckesser J., Mayer H. Electrophoretic analysis of lipopolysaccharides of purple nonsulfur bacteria. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1988. V. 38. P. 157-163.

94. Kustermans G., El Benna J., Piette J., Legrand-Poels S. Pertrubation of actin dynamics induces NF-кВ activation in myelomonocytic cells through an NADPH oxidase-dependent pathway. // Biochem. J. 2005. V. 387. P. 531-540.

95. Lambeth J.D. Nox/Duox family of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate. oxidases. // Curr. Opin. Hematol. 2002. V. 9. P. 11-17.

96. Landmann R., Knopf H.-P., Link S., Sansano S., Schuman R., Zimmerli W. Human monocyte CD 14 is upregulated by lipopolysaccharide. // Infection and Immunity. 1996. V. 64. № 5. P. 1762-1769.

97. Lapouge K., Smith S.J., Groemping Y., Rittinger K. Architecture of the p40-p47-p67 phox complex in the resting state of the NADPH oxidase. A central role for p67phox. II J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 10121-10128.

98. Le Y., Oppenheim J., Wang J. Formyl-peptide receptors revisited. // Trends Immunol. 2002. V. 23. P. 541-548.

99. Leusen J.H., Verhoeven A.J., Roos D. Interactions between the components of the human NADPH oxidase: are view about the intrigues in the phox family. // Front. Biosci. 1996. V. 1. P. d 72-d 90.

100. Liu F.T., Hsu D.K., Zuberi R.I., Kuwabara I., Chi E.Y., Henderson W.R. Expression and function of galectin-3, a beta-galactoside-binding lectin, in human monocytes and macrophages. // Am. J. Pathol. 1995. V. 147. P. 1016— 1028.

101. Loppnow H., Libby P., Freudenberg M., Krauss J.H., Weckesser J., Mayer H. Cytokine induction by lipopolysaccharide (ЛПС) corresponds to lethaltoxicity and is inhibited by nontoxic Rhodobacter capsulatus ЛПС // Infect. Immun. 1990. V. 58. P. 3743-3750.

102. Loppnow H., Stelter F., Schonbeck U., Schluter C., Ernst M., Schutt C., Flad H.D. Endotoxin activates human vascular smooth muscle cells despite lack of expression of CD14 mRNA or endogenous membrane CD 14. // Infect. Immun. 1995. V. 63. P. 1020-1026.

103. Mancek M., Pristovsek P., Jerala R. Identification of LPS-binding peptide fragment of MD-2, a Toll-receptor accessory protein. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. V. 292. P. 880-885.

104. Mandal P., Novotny M., Hamilton T.A. Lipopolysaccharide induces formyl peptide receptor 1 gene expression in macrophages and neutrophils via trnscriptional and posttranscriptional mechanisms. // J. Immunol. 2005. V. 175. P. 6085-6091.

105. Marcinkowska E., Wiedlocha A., Radzikowski C. 1,25-dihidroxyvitamin D3-induced activation and subsequent nuclear translocation of МАРК is upstream regulated by PKC in HL-60 cells. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. V. 241. P.419-426.

106. Marsik C., Mayr F., Cardona F., Derhaschnig U., Wagner O.F., Jilma B. Endotoxaemia modulates Toll-like receptors on leucocytes in humans. // Br. J. Haematol. 2003. V. 121. P. 653-656.

107. Matsuura M., Kiso M., Hasegawa A. Activity of monosaccharide lipid A analogues in human monocytic cells as agonists or antagonists of bacterial lipopolysaccharide. // Infection and Immunity. 1999. V. 67. P. 6286-6292.

108. Mattern Т., Flad H-D., Brade L., Rietschel E.T., Ulmer A.J. Stimulation of human T lymphocytes by ЛПС is MNC unrestricted, but strongly dependent on B7 interactions. // The Journal of Immunology. 1998. V. 160. P. 3412-3418.

109. May R.C. & Machesky L.M. Phagocytosis and the actin cytoskeleton. // Journal of Cell Science. 2001. V. 114. P. 1061-1077.

110. McLeish K.M., Klein J.B., Coxon P.Y., Head K.Z., Ward R.A. Bacterial phagocytosis activates extracellular signal-regulated kinase and p38 mitogen-activated protein kinase cascades in human neutrophils. // J. Leukocyte Biol. 1998. V. 64. P. 835-844.

111. McLeish K.M., Klein J.B., Lederer E.D., Head K.Z., Ward R.A. Azothemia, TNF alpha, and LPS prime the neutrophil oxidative burst by distinct mechanisms. // Kidney Int. 1996. V. 50. P. 407-416.

112. McPhail L.C., Clayton C.C., Snyderman R. The NADPH oxidase of human polymorphonuclear leukocytes. Evidence for regulation by multiple signals. // J. Biol. Chem. 1984. V. 259. P. 5768-5775.

113. Medzhitov R., Preston-Hurlburt P., Janeway C.A. A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity. // Nature. 1997. V. 388. P. 394-397.

114. Middelhoven P.J., Ager A., Roos D., Verhoeven A.J. Involvement of a metalloprotease in the shedding of human neutrophil Fcg RIIIB. // FEBS Lett. 1997. V. 414. P.14-18.

115. Miyasaki K. Phagocytes-Neutrophils. // PIC Homepage. 1998. http://www.dent. ucla.edu/pic/members/neutrophils/neutrophils.html#top.

116. Morimatsu Т., Kawagoshi A., Yoshida K., Tamura M. Actin enhances the activation of human neutrophil NADPH oxidase in a cell-free system. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. V. 230. P. 206-210.

117. Mullen G.E., Kennedy M.N., Visintin A., Mazzoni A., Leifer C.A., Davies D.R., Segal D.M. The role of disulfide bonds in the assembly and function of MD-2. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V.100. P. 3919-3924.

118. Muller Kobold A.C., Tulleken J.E., Zijlstra J.G., Sluiter W., Hermans J., Kallenberg C.G., Tervaert J.W. Leukocyte activation in sepsis; correlations with disease state and mortality. // Intensive Care Med. 2000. V. 26. P. 883892.

119. Muroi M., Ohnishi Т., Tanamoto K.-i. MD-2, a novel accessory molecule, is involved in MD-2, a novel accessory molecule, is involved in species-specific actions of Salmonella lipid A. // Infection and Immunity. 2002a. V. 70. № 7. P. 3546-3550.

120. Muroi M., Ohnishi Т., Tanamoto K.-i. Regions of the mouse CD14 molecule required for Toll-like receptor 2-and 4-mediated activation of NF-kappa B. // J. Biol. Chem. 2002b. V. 277. P. 42372-42379.

121. Muroi M. & Tanamoto K.-i. The polysaccharide portion plays an indispensable role in Salmonella lipopolysaccharide-induced activation of NF-{kappa}B through human Toll-like receptor 4. // Infect. Immun. 2002c. V. 70. № 11. P. 6043-6047.

122. Nauseef W.M. The NADPH-dependent oxidase of phagocytes. // Proc. Assoc. Am. Physicians. 1999. V. 111. P. 373-382.

123. Netea M.G., van Deuren M., Kullberg B.J., Cavaillon J.-M., Van der Meer J.W.M. Does the shape of lipid A determine the interaction of ЛПС with Tolllike receptors? // J. Immunol. 2002. V. 23. P. 135-139.

124. Nick J.A., Avdi N.J., Gerwins P., Johnson G.L., Worthen G.S. Activation of a p38 mitogen activated protein kinase in human neutrophils by lipopolysaccharide. //J. Immunol. 1996. V. 156. P. 4867-4875.

125. Oda T. & Maeda H. A new simple fluorometric assay for phagocytosis. // J. Immunol. Methods. 1986. V. 88. P. 175-183.

126. Omann G.M., Allen R.A., Bokoch G.M., Painter R.G., Traynor A.E., Sklar L.A. Signal transduction and cytoskeleton activation in the neutrophil. // Physiol. Rev. 1987. V. 67. P. 285-322.

127. O'Neill L.A.J. The role of MyD88-like adapters in Toll-like receptor signal transduction. // Biochem. Soc. Trans. 2003. V. 31. P. 643-647.

128. Oshiumi H., Sasai M., Shida K., Fujita Т., Matsumoto M., Seya T. TIR-containing adapter molecule (TICAM)-2, a bringing adapter recruiting to Tolllike receptor 4 TIC AM-1 that induces interferon-beta. // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 49751-49762.

129. Paclet M.H., Coleman A.W., Vergnaud S., Morel F. P-67-p/zo.x-mediated NADPH oxidase assembly: imaging of cytochrome b558 liposomes by atomic force microscopy. // Biochem. 2000. V. 39. P. 9302-9310.

130. Park J.-B. Phagocytosis induces superoxide formation and apoptosis in macrophages. // Exp. Mol. Med. 2003. V. 35. № 5. P. 325-335.

131. Parker P., Kour G., Marais R., Mitchel F., Pears C., Stabel S., Webster C. Protein kinase С a family affair. // Mol. Cell. Endocrinol. 1989. V. 65. P. 1-11.

132. Poltorak A., Ricciardi-Castagnoli P., Citterio S., Beutler B. Physical contact between lipopolysaccharide and Toll-like receptor 4 revealed by genetic complementation. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. P. 2163-2167.

133. Pristovsek P., Simcic S., Wraber В., Urleb U. Structure of a synthetic fragment of the lipopolysaccharide (LPS) binding protein when bound to LPS and design of apeptidic LPS inhibitor. // J. Med. Chem. 2005. V. 48. P. 79117914.

134. Pugin J., Heumann I.D., Tomasz A., Kravchenko V.V., Akamatsu Y., Nishijima M., Glauser M.P., Tobias P.S., Ulevitch RJ. CD14 is a pattern recognition receptor. // Immunity. 1994. V. 1. P. 509-516.

135. Quinn M.T. & Gauss K.A. Structure and regulation of the neutrophil respiratory burst oxidase: comparison with nonphagocyte oxidases. // J. Leukoc. Biol. 2004. V. 76. P. 760-781.

136. Quinn M.T., Parkos C.A., Jesaitis A.J. The lateral organization of components of the mambrane skeleton and superoxide generation in the plasma membrane of stimulated human neutropils. // J. Biochim. Biophys. Acta. 1989. V. 987. P. 83-94.

137. Qureshi S.T. & Medzhitov R. Toll-like receptors and their role in experimental models of microbial infection. // Genes Immun. 2003. V. 4. P. 8794.

138. Raetz C.R.H., Ulevitch R.J., Wright S.D., Sibley C.H., Ding A., Nathan C.F. Gram-negative endotoxin: an extraordinary lipid with profound effects on eukaryotic signal transduction. // FASEB J. 1991. V. 5. P. 2652-2660.

139. Re F. & Strominger J.L. Monomeric recombinant MD-2 binds toll-like receptor 4 tightly and confers lipopolysaccharide responsiveness. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 23427-23432.

140. Re F. & Strominger J.L. Separate functional domains of human MD-2 mediate Toll-like receptor 4-binding and lipopolysaccharide responsiveness. // J. Immunol. 2003. V. 171. P. 5272-5276.

141. Reeves P. Biosynthesis and assembly of lipopolysaccharide. 1994. In Bacterial Cell Wall. Chapter 13. P. 281-317.

142. Remer K.A., Brcic M., Sauter K.S., Jungi T.W. 2006. Human monocytoid cells as a model to study Toll-like receptor-mediated activation. // J. Immunol. Methods. 2006. V. 313. P. 1-10.

143. Remer K.A., Reimer Т., Brcic M., Jungi T.W. Evidence for involvement of peptidoglycan in the triggering of an oxidative burst by Listeria monocytogenes in phagocytes. // Clin. Exp. Immunol. 2005. V. 140. P. 73-80.

144. Rietschel E.T., Brade H., Brade L., Brandenburg K. et al. Lipid A, the endotoxic center of bacterial lipopolysaccharides: relation of chemical structure to biological activity. // Prog. Clin. Biol. Res. 1987. V. 231. P. 25-53.

145. Rietschel E.T., Brade L., Shade U. Surface structures of microorganisms and their interactions with the mammalian hosts. // Weinheim: Verlag chemie. 1998. P. 1-41.

146. Rietschel E.T., Sidorczyk Z., Zahringer U., Wollenweber H.-W., Luderitz O. Analysis of the primary structure of lipid A. // ACS Symp. Ser. 1983. V. 231. 214 p.

147. Rigler R. Microfluorimetrie characterization of intracellular nuclei acids and nucleoproteins by acridine orange. // Acta Phisiol. Scand. 1966. V. 67. Suppl. 267. P. 1-123.

148. Ringden O. Activation of human lymphocyte subpopulations by rabbit anti-human p2-microglobulin and by lipopolysaccharide. // Scand. J. Immunol. 1976. V. 5. P. 891-900.

149. Romaschin A.D., Foster D.M., Walker P.M., Marshall J.C. Let the cells speak: neutrophils as biologic markers of the inflammatory response. // Sepsis. 1998. V. 2. P. 119-125.

150. Rosengart M. R., Arbabi S., Bauer G.J., Garcia I., Jelacic S., Maier R.V. The actin cytoskeleton: an essential component for enhanced TNF alpha production by adherent monocytes. // Shock. 2002. V. 17. № 2. P. 109-113.

151. Rossi F., Delia Bianca V., Grzeskowiak M., Bazzoni F. Studies on molecular regulation of phagocytosis in neutrophils. // The Journal of Immunology. 1989. V. 142. P. 1652-1660.

152. Rossignol D.P. & Lynn M. TLR4 antagonists for endotoxemia and beyond. // Curr. Opin. Investig. Drugs. 2005. V. 6. № 5. P. 496-502.

153. Ryan K.A., Smith M.F., Sanders, M.K., Ernst P.B. Reactive oxygen and nitrogen species differentially regulate Toll-like receptor 4-mediated activation of NF-кВ and interleukin-8 expression. // Infect. Immun. 2004. V. 72. P. 21232130.

154. Sadallah S., Hess C., Miot S., Spertini O., Lutz H., Schifferli J.A. Elastase and metalloproteinase activities regulate soluble complement receptor 1 release. // Eur. J. Immunol. 1999. V. 29. P. 3754-3761.

155. Schindler R. & Dinarello C.A. Ultrafiltration to remove endotoxins and other cytokine-inducing materials from tissue culture media and parenteral fluids. // Biotechniques. 1990. V. 8. № 4. P. 408-413.

156. Schletter J., Heine H., Ulmer A.J., Rietschel E.T. Molecular mechanisms of endotoxin activity. // Arch. Microbiol. 1995. V. 164. P. 383-389.

157. Schramm A.B., Brandenburg K., Loppnow H., Moran A.P., Koch M.H.J., Rietshel E.T., Seydel U. Biological activities of lipopolysaccharides are determined by the shape of their lipid A portion. // Eur. J. Biochem. 2000. V. 267. P. 2008-2013.

158. Schramm A.B., Brandenburg K., Rietschel E.Th. Lipopolysaccharide-binding protein mediates CD14-independent intercalation of LPS into phospholipid membranes. //FEBS Letters. 1996. V. 399. P. 267-271.

159. Schwende H., Fitzke E., Ambs P., Dieter P. Differences in the state of differentiation of THP-1 cells induced by phorbol ester and 1,25-dihydroxyvitamin D3. // J. Leukoc. Biol. 1996. V. 59. P. 555-561.

160. Seely A.J., Pascual J.L., Christou N.V. Science review: cell membrane expression connectivity. regulates neutrophil delivery, function and clearance. // Crit. Care. 2003 V. 7. P. 291-307.

161. Segal A.W. How neutrophils kill microbes. // Annu. Rev. Immunol. 2005. V. 23. P. 197-223.

162. Sengelov H., Boulay F., Kjeldsen L., Borregaard N. Subcellular localization and translocation of the receptor for N-formylmethionylleucyl-phenylalanine in human neutrophils. // Biochem. J. 1994. V. 299. P. 473-479.

163. Sengelov H., Kjeldsen L., Borregaard N. Control of exocytosis in early neutrophil activation. //J. Immunol. 1993a. V. 150. P. 1535-1543.

164. Sengelov H., Kjeldsen L., Diamond M.S., Springer T.A., Borregaard N. Subcellular localization and dynamics of Mac-1 alpha m beta 2. in human neutrophils. //J. Clin. Invest. 1993b. V. 92. P. 1467-1476.

165. Sheppard F.R., Kelher M.R., Moore E.E. et al. Structural organization of the neutrophil NADPH oxidase: phosphorylation and translocation during priming and activation. //J. Leukoc. Biol. 2005. V. 78. P. 1025-1042.

166. Shiba Т., Kusumoto S., Inage M., Chaki H., Shimamoto T. Recent developments in the organic synthesis of lipid A in relation to biologic activities. // Res. Infect. Dis. 1984. V. 6. P. 478-482.

167. Shimazu R., Akashi S., Ogata H., Nagai Y., Fukudome K., Miyake K., Kimoto M. MD-2, a molecule that confers lipopolysaccharide responsiveness on Toll-like receptor 4. // J. Exp. Med. 1999. V. 189. P. 1777-1782.

168. Steinmetz M.O., Goldie K.N., Aebi U. A correlative analysis of actin filament assembly, structure, and dynamics. // The Journal of Cell Biology. 1997. V. 138. № 3. p. 1997 559-574.

169. Stossel T.P. In Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates (Gallin, J. I., Goldstein, I. M., and Snyderman, R., eds). Raven Press, New York. 1988. P. 325-342.

170. Surette M.E., Dallaire N., Jean N., Picard S., Borgeat P. Mechanisms of the priming effect of lipopolysaccharides on the biosynthesis of leukotriene B4 in chemotactic peptide-stimulated human neutrophils. // FASEB J. 1998. V. 12. P. 1521-1531.

171. Suzuki Т., Hashimoto S., Toyoda N., Nagai N., Yamazaki H., Dong Y., Sakai J., Yamashita Т., Nukiwa Т., Matsushima K. Comprehensive gene expression profile of ЛПС-stimulated human monocytes by SAGE. // Blood. 2000. V. 95. P. 2584-2591.

172. Takashiba S., Shapira L., Amar S., Van Dyke Т.Е. Cloning and characterization of human TNF alpha promoter region. // Gene. 1993. V. 131. P. 307-308.

173. Takeda K. & Akira S. TLR signaling pathways. // Semin. Immunol. 2004. V. 16. P. 3-9.

174. Tamai R., Asai Y., Hashimoto M., Fukase K., Kusumoto S., Ishida H., Kiso M., Ogawa T. Cell activation by monosaccharide lipid A analogues utilizing Toll-like receptor 4. // Immunology. 2003. V. 110. P. 66-72.

175. Tamura M., Kanno M, Endo Y. Deactivation of neutrophil NADPH oxidase by actin-depolymerizing agents in a cell-free system. // Biochem. J. 2000. V. 349. Pt. l.P. 369-375.

176. Tanamoto K.-i. & Azumi S. Salmonella-type heptaacylated lipid A is inactive and acts as an antagonist of lipopolysaccharide action on human line cells. //J. Immunol. 2000. V. 164. P. 3149-3156.

177. Tapping R.I., Akashi S., Miyake K., Godowski P.J., Tobias P.S. Toll-like receptor 4, but not Toll-like receptor 2, is a signaling receptor for Escherichiaand Salmonella lipopolysaccharides. // J. Immunol. 2000. V. 165. P. 57805787.

178. Teghanemt A., Zhang D., Levis E.N., Weiss J.P., Gioannini T.L. 2005. Molecular basis of reduced potency of underacylated endotoxins. // The Journal of Immunology. 2005. V. 175. P. 4669-4676.

179. Test S.T. & Weisst S.J. Quantitative and temporal characterization of the extracellular H2O2 pool generated by human neutrophils. // J. Biol. Chem. 1984. V. 259. № l.P. 399-405.

180. Thieblemont N. & Wright S.D. Transport of bacterial lipopolysaccharide to the Golgi apparatus. // J. Exp. Med. 1999. V. 190. P. 523-534.

181. Ting-Beall H.P., Lee A.S., Hochmuth R.M. Effect of cytochalasin D on the mechanical properties and morphology of passive human neutrophils. // Annals of Biomedical Engineering. 1995. V. 23. P. 666-671.

182. Tirsoaga A., Novikov A., Adib-Conquy M., Werts C., Fitting C., Cavaillon J., Caroff M. Simple method for repurification of endotoxins for biological use. // Applied and Environmental Microbiology. 2007. V. 73. No. 6. P. 1803-1808.

183. Triantafilou K., Triantafilou M., Dedrick R.L. Interactions of bacterial lipopolysaccharide and peptidoglycan with a 70 kDa and an 80 kDa protein on the cell surface of CD14+ and CD 14" cells. // Human Immunology. 2001. V. 62. P. 50-63.

184. Tsai C.M. & Frasch C.E. A sensitive silver stain for detecting lipopolysaccharides in polyacrylamide gels. // Anal. Biochem. 1982. V. 119. P. 115-119.

185. Tsuchiya S., Yamabe M., Yamaguchi Y., Kobayashi Y., Konno Т., Tada K. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). // Int. J. Cancer. 1980. V. 26. P. 171-176.

186. Ulmer A.J., Flad H.-D., Rietschel Т., Mattern T. Induction of proliferation and cytokine production in human T lymphocytes by lipopolysaccharide (LPS). // Toxicology. 2000. V. 152. P. 37-45.

187. Ulmer A.J., Rietschel E. Т., Zahringer U., Heine H. Lipopolysaccharide: structure, bioactivity, receptors and signal transduction. // Trends in glycoscience and glycotechnology. 2002. V. 14. P. 53-68.

188. Underhill D.M. & Ozinsky A. Phagocytosis of microbes: complexity in action. // Annu. Rev. Immunol. 2002. V. 20. P. 825-852.

189. Urbanic E. & Ware B.R. Actin filament capping and cleaving activity of cytochalasing B, D, E and H. // J. Arch. Bioch. Bioph. 1989. V. 269. P. 181187.

190. Vasselon Т., Hailman E., Thieringer R., Detmers P.A. Internalization of monomeric lipopolysaccharide occurs after transfer out of cell surface CD 14. // Journal of Experimental Medicine. 1999. V. 190. P. 509-522.

191. Vesy C.J., Kitchens R.L., Wolfbauer G., Albers J.J., Munford R.S. Lipopolysaccharide-binding protein and phospholipids transfer protein release lipopolysaccharides from Gram-negative bacterial membranes. // Infect. Immun. 2000. V. 68. P. 2410-2417.

192. Visintin A., Halmen K.A., Latz E., Monks B.G., Golenbock D.T. Pharmacological inhibition of endotoxin responses is achieved by targeting the TLR4 coreceptor, MD-2. // J. Immunol. 2005. V. 175. P. 6465-6472.

193. Visintin A., Latz E., Monks B.G., Espevik Т., Golenbock D.T. Lysines 128 and 132 enable lipopolysaccharide binding to MD-2, leading to toll-like receptor-4 aggregation and signal transduction. // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 48313^48320.

194. Visintin A., Mazzoni A., Spitzer J.A., Segal D.M. Secreted MD-2 is a large polymeric protein that efficiently confers lipopolysaccharide sensitivity to Tolllike receptor 4. //PNAS. 2001. V. 98. P. 12156-12161.

195. Wallace P.J., Packman C.H., Wersto R.P., Lichtman M.A. The effects of sulfhydryl inhibitors and cytochalasin on the cytoplasmic and cytoskeletal actin of human neutrophils. // J. Cell Physiol. 1987. V. 132. P. 325-330.

196. Ward R.A., Nakamura M., McLeish K.R. Priming of the neutrophil respiratory burst involves p38 mitogen-activated protein kinase-dependentexocytosis of flavocytochrome b558-containing granules. // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 36713-36719.

197. Watson F. & Edwards S.W. Stimulation of primed neutrophils by soluble immune complexes: priming leads to enhanced intracellular Ca2+ elevations, activation of phospholipase D, and activation of the NADPH oxidase. // BBRC. 1998. V. 29. P. 819-826.

198. Weckesser J., Mayer H. Different lipid A types in lipopolysaccharides of phototrophic and related non-phototrophic bacteria. // FEMS Microbiology.1988. V. 54. P. 143-154.

199. Weckesser J., Mayer H., Schulz G. Anoxygenic phototrophic bacteria: model organisms for studies on cell wall macromolecules, Kluwer Academic Publishers. 1995. 207 p.

200. Westphal O., Luderitz O., Bister F. Uber die extraktion von bakterien mit phenol. // Wasser. Z. Naturforsch. 1952. V. 7B. P. 148-155.

201. Wiles M.E., Dyken J.A., Wright C.D. Human neutrophil (PMN) oxygen radical production and cytoskeleton. // Life Sci. 1995. V. 57. P. 1533-1546.

202. Wright S.D., Detmers P.A., Aida Y., Adamowski R., Anderson D.C., Chad Z., Kabbash L.G., Pabst M.J. CD18-deficient cells respond to lipopolysaccharide in vitro. II The Journal of Immunology. 1990. V. 144. №. 7. P. 2566-2571.

203. Wright S.D., Levin S.M., Jong M.T.C., Chad Z., Kabbash L.G. CR3(CDlib/CD 18) expresses one binding site for Arg-Gly-Asp-containing peptides and a second site for bacterial lipopolysaccharide. // J. Exp. Med.1989. V. 169. P. 175-183.

204. Wright S.D., Ramos R.A., Hermanowsky-Vosatka A., Rockwell P., Detmers P.A Activation of the adhesive capacity of CR3 on neutrophils by endotoxin:dependence on lipopolysaccharide binding protein and CD14. // J. Exp. Med. 1991. V. 173. P. 1281-1286.

205. Wurfel M.M. & Wright S.D. Lipopolysaccharide (LPS) binding protein catalyzes binding of LPS to lipoproteins. // Prog. Clin. Biol. Res. 1995. V. 392. P. 287-295.

206. Wyckoff T.J.O., Raetz C.R.H., Jackman J.E. Antibacterial and antiinflammatory agents that target endotoxin. // Trends in Microbiology. 1998. V. 6. №4. P. 154-159.

207. Yamamori Т., Inanami O., Nagahata H., Kuwabara M. Phosphoinositide 3-kinase regulates the phosphorilation of NADPH oxidase component p47(phox) by controlling PKC/PKCdelta but not akt. // BBRC. 2004. V. 316. P. 720-730.

208. Yates R.M. & Russell D.G. Phagosome maturation proceeds independently of stimulation of Toll-like receptors 2 and 4. // Immunity. 2005. V. 23. P. 409417.

209. Yoshizaki H., Fukuda N., Sato K., Oikawa M., Fukase K., Suda Y., Kusumoto S. First total synthesis of the re-type lipopolysaccharide. // Angew. Chem. Int. Ed. 2001. V. 40. P. 1475-1480.

210. Yu B. & Wright S.D. Catalytic properties of lipopolysaccharide (LPS) binding protein. Transfer of LPS to soluble CD 14. // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P.4100-4105.

211. Zahringer U., Lindner В., Rietschel E.T. Molecular structure of lipid A, the endotoxic center of bacterial lipopolysaccharides. // Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 1994. V. 50. P. 211-276.

212. Zhan Y., He D., Newburger P.E., Zhou G.W. pAlphox PX domain of NADPH oxidase targets cell membrane via moesin-mediated association with the actin cytoskeleton. // J. Cell. Biochem. 2004. V. 92. P. 795-809.

213. Zhang D.E., Hetherington C.J., Tan S., Dziennis S.E., Gonzales D.A., Chen H.M., Tenen D.G. Spl is a critical factor for the monocytic specific expression of human CD14. // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 11425-11434.

214. Zhang G.-H., Mann D.M., Tsai C.-M. Neutralization of endotoxin in vitro and in vivo by a human lactoferrin-derived peptide. // Infect. Immun. 1999. V. 67. №3. P. 1353-1358.

215. Zhang Y., Gaekwad J., Wolfert M.A., Boons G.-J. Synthetic tetra-acylated derivatives of lipid A from Porphyromonas gingivalis are antagonists of human TLR4. // Org. Biomol. Chem. 2008. V. 6. P. 3371-3381.

216. Zughaier S.M., Tzeng Y.L., Zimmer S.M., Datta A., Carlson R.W., Stephens D.S. Neisseria meningitidis lipooligosaccharide structure-dependent activationof the macrophage CD14/Toll-like receptor 4 pathway // Infect. Immun. 2004. V. 72. P. 371-380.

217. Zughaier S.M., Zimmer S.M., Datta A., Carlson R.W., Stephens D.S. Differential induction of the Toll-like receptor 4-MyD88-dependent and independent signaling pathways by endotoxins. // Infect. Immun. 2005. V. 73. № 5. P. 2940-2950.