Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование условий эффективной экспрессии клонированных генов В Е получение штамма-продуцента дигидрофолатредуктазы ФАГА Т4

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование условий эффективной экспрессии клонированных генов В Е получение штамма-продуцента дигидрофолатредуктазы ФАГА Т4"

о W

...

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи

УДК 577.214.625

ГОРОВИЦ

Рина Львовна

ИССЛЕДОВАНИЕ УСЛОВИЙ ЭФФЕКТИВНОЙ ЭКСПРЕССИИ КЛОНИРОВАННЫХ ГЕНОВ В Е. COLI ПОЛУЧЕНИЕ ШТАММА-ПРОДУЦЕНТА ДИГИДРОФОЛАТРЕДУКТАЗЫ ФАГА Т4

(03.00.03 — Молекулярная биология) (03-00 04 — Биохимия)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1987

Работа выполнена в лаборатории генетической энзимологии Института биохимиии и физиологии 'микрдорганизмов, г. Лущино, и в лаборатории оптимизации экспрессии генов во Всесоюзном на-. учно-1исследовательако,м институте 'генетики и селекции (промышленных (микроорганизмов, г. Москва.

Научные руководители:

академик А. А. Баев,

кандидат биологических «аук,

старший научный сотрудник С. В. Машко.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук JI. С. Чернин, кандидат 'биологических наук И. А. Хмель.

Ведущее учреждение: Институт вирусологии АМН СССР.

Защита состоится « .7 » • 198/ г. в часов

на заседании Специализированного^ совета Д.053.05.70 при Московском государственном университете 'по адресу: 119899, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГУ.

Автореферат разослан

» . . 198^ г.

Ученый секретарь Специализированного совета

В. Н. Каграманов

'■ •'■■:'■ '...A I

vJ Ü j

- '¡..'г::--;,.

''тдэл \

\ - I -.

'Актуальность темы. Основной задачей микробиологического производства продуктов клеточного метаболизма является повышение уровня их синтеза. Один из главных подходов к решении этой задачи - изучение условий эффективной экспрессии клонированных генов в составе рекомбинантных плазмид. Использование модельных систем на основе хорошо охарактеризованных цистронов, например гена cat е. coli , кодирующего хлорамфекиколацетилтрансферазу, позволяет выяснить влияние отдельных этапов экспрессии на уровень синтеза продукта и тем самым обеспечить возможность создания бактериальных штаммов-продуцентов биологически 'активных соединений.

Получение в препаративных количествах такого фермента, как дигидрофолатредуктаза фага Т4, перспективно для исследований белковой структуры, достижения повышенного синтеза предшественников ДНК, экспериментов по белковой инженерии, а также для клинических испытаний большого числа антимикробных и противораковых препаратов, многие из которых специфично подавляют активность именно фо-латредуктаз. Благодаря небольшому размеру, легкости тестирования эктивности, максимальному значении числа оборотов сряди всех известных представителей данного класса ферментов дигидрофолатредуктаза фага Т4 является удобной моделью в этих исследованиях. Однако, выделение препаративного количества соответствующего белкового продукта из клеток е.coli, зараженных бактериофагом, сопряжено с значительными трудностями, поэтому требовалось увеличить выход фермента за счет достижения высокоэффективной экспрессии гена fr а , кодирующего дигидрофолатредуктазу фага Т4, в бактериальной системе с помощью методологии генетической инженерии.

Целью настоящей работы явилось достижение повышенного синтеза дигидрофолатредуктазк фага Т4 в бактериях35, а также изучение условий эффективной экспрессии клонированных цистронов на примере модельного гена cat.

В связи с этим осуществлено физическое'картирование reHafrd на геноме .фага Т4 с последующим молекулярным клонированием соответствующего фрагмента ДНК в составе рёкомбинантной плазмида. После предварительной оценки относительной силы ряда прокариоти-ческих промоторов (ptrp, plac0v5, ptac- е.coli, рь, p.R - ФагаЛ ) для оптимизации экспрессии гена fra был выбран эффективный регулируемый промотор pl.

* В руководстве работой по создании штамма-продуцента принимали участие сотрудники ИБШ АН СССР д.б.н. Таняшин В.И. и к.б.н. Солонин A.C.

Подстановка гена frd под контроль pl привела к получению штамма-продуцента дигидрофолатредуктазы фага Т4, что явилось реализацией конкретной дели работы.

Научная новизна работы заключается в следующем:

1)- проведено предварительное направленное исследование эффективности некоторых часто используемых в практике генетической инженерии промоторов, а также эффективности транскрипции клонирован* ного гена frd в составе фрагмента ДНК фага Т4,

2)- в результате подстановки гена frd под контроль промотора pl фага Л и Р1ас E.coü достигнут высокий уровень синтеза дигидрофолатредуктазы фага Т4 в бактериях; до 3-5$ от суммарного клеточного белка,

3)- предложено использование сконструированных плазмкд с геном frd в качестве векторов инсерционной инактивации, стабильно наследуемых в неселективных условиях роста соответствующих клеток, а также для маркировки штаммов энтеробактерий.

Практическая значимость работы. Созданы бактериальные штаммы-продуценты дигидрофолатредуктазы фага Т4, которые могут служить источником для препаративного выделения целевого продукта.

Получена серия плазмидных векторов инсерционной инактивации устойчивости к Тр, на основе которых проведено молекулярное клонирование ecori -фрагментов ДНК фага Т4.

Маркирован штамм Serratia marcescens BKM R3-D f ИСПОЛЬЗувМЫЙ для выделения рестриктазы smai.

Описанные векторы переданы в ИМГ АН СССР, г.Москва, в Кубанский медицинский институт, г.Краскодар, также они используются в лабораториях ВШИгенетика, г.Москва, ИБВМ АН СССР, г.Пущино.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов исследований и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (160 источников). Работа изложена на 140 стр. машинописного текста, включая 10 таблиц и 30 рисунков.

Апробация работы. Материалы диссертации были изложены на Всесоюзных конференциях "Вирусы микроорганизмов" (Пуадно, 1981), "Рекомбинантные молекулы" (Пущино, 1983), "Перспективы создания лекарственных средств с использованием биотехнологии". (Москва,

1985), "Вирусы микроорганизмов" (Ташкент, 1986), "Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1986), на конференции молодых ученых "Генетика и биохимия микроорганизмов - биотехнология" (Москва,

1986), на семинарах ИВШ АН СССР (Пущино), ВНИИгенетяка (Москва), МГУ (Москва).

- 3 - •

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штамма. В работе использовались штаммы е.coii RRi, с 6 ó о,TGi, к 802, полученные из холлекции ВНИИгенатшса.

БаК^еРИОФаГИ. В работе использовали фаг Т4з56атЕ51д42атс87 denB NB5060aic7, фагимптрп, 130 и 131 из коллекции ИБФМ.

Пяазмиды. В работе использовали векторы pBR322 (Bolivar et al., 1977), pBR325 (Bolivar,1978), pHSG415 (Hashimoto-Gotoh et al., 1981), pKN402 (Uhlin et al.,1979), pUC19 (Messing et al.,1981),

piL203 (Солонин и др.,1979), плазмиды с геном cat из коллекции лаборатории оптимизации экспрессии генов, ВНИИгенетика. Остальные рекомбинантные плазмиды были получены в ходе выполнения настоящей работы.

Выделение плазмидной ДНК проводили по методу (Birnboim,i979).

Препараты Ферментов были любезно предоставлены Ребентишом Б.А. (ВНИИгенетика), Ли Л.И., Кузьминой Н.М., Зиминым А.А.(ИБФМ)

Обработку ДНК ферментами проводили, как описано в методическом руководстве (Маниатис и др.,1984).

Электрофорез фрагментов ДНК проводили в 15» агарозном или 4-1235 полиакриламидном геле в трис-ацетатном или трис-боратном буфере (0стерман,1982). Выделение фрагментов из геля проводили с помощью метода электрозлюции (Чернов и др.,1984).

Анализ клеточных 'белко-q проводили диск-электрофорезом в денатурирухщем 15% ПОЛИакрИЛЗМИДНОМ геле (Langridge,1980) .

Для количественного анализа распределения клеточных белков после электрофореза проводили сканирование геля , прокрашенного В растворе Кумасси R-250 -serva" (ФРГ), на лазерном денситометре "LKB-2202" (Швеция).

Определение копийности плазмид в бактериальных клетка^ проводили, как описано в работе(Projan et al.,1983).

- Импульсное введение метки в мРНК проводили добавлением [н3]-урацила (ВПО "Изотоп", г.Ташкент) в течение 30 с при росте плазмидосодержащих клеток Е.соИсбоо в условиях, обеспечивающих дерепрессию клонированных промоторов. Методика выделения меченой мРНК и еЗ гибридизации с одноцепочечной ДИК ревамбикан-тных фагов, закрепленных на нитроцеллшозннх фильтрах ("мпи-роге'.ОЛб-икм.США), описана в работе (Клячко и др.,1983).

Ррс^ет вторичных структур «РЖ проводили в соответствии с кинетическим алгоритмом (Миронов и др.,1985).

Определение активности хдорамФеникодапетидтрансФеразн т. т\л (См-ацетилазы) проводили ПО методу (Foster 1 Shaw,1973); ДИТИ-ПРО^ОЛПТРАДУУГаЗЦ fera Т4 (ДГ»Р) - (Erlksoa et al.,1971).

- 4 -

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ I. Исследование эффективности клонированных промоторов е.соп и Фага Д. синтеза См-аиетилазы под контролем этих промоторов, Для анализа условий эффективной экспрессии клонированных генов использовали серию рекомбинантных плазмид с геном cat, кодирующим См-ацетилазу, стабильный, легко тестируемый белок.

В исходный "беспромоторный" вектор рмь4 (рис.1) последовательно были встроены такие часто используемые в практике генетической ИНКенерИИ ПрОМОТОрЫ, как PxacUV5~<pML2,1) ' Ptrp"(pMT12)' ptrp-lacuv5:tac~(pp,n4)" E-coli' PR-(pPR2),PL"(рРЬ518)фага Л (СМ. рис.1). Также использовали вектор pbr325 , в котором ген cat транскрибировался с собственного промотора. Для предотвращения интерференции между репликацией плазмидной ДНК и высокоэффективной транскрипцией гена cat в условиях дерепрессии клонированных промоторов (Deuschie,1986) в з'-концевую область гена cat был встроен тандем ^-независимых терминаторов транскрипции фага fd.

II

pML4 . PBR325 pML2.1 рМТ12

pPL518

PPL521

PaQl

«К <¡¡24

bla

Ыа

Рис Л Физико-генетические карты рекомбинантных плазмид (1-вари-абельные, 11-константные участки ДНК). Стрелками обозначены: промоторы - черные, кодирующие части - белые, терминаторы транскрипции - белые на заштрихованном фоне.

Таблица I. Исследование относительной эффективности экспрессии плазшдных генов Ыа, cat, frd.

Эффективность инн- Ферментативная Ген 1 ПромежШлазмида!^^ траНскртщии1 активность белка

I I ! плазмиддах генов Кнмоль/мин/мг)

Ыа Pbla все 1 не определялась

cat - pML4 0 , 2±0,1 10 + 5

cat Pcat pBR325 2,7+0,2 500±50

cat PlacUV5 pML2.1 2,5+0,2 230150

cat Plac 5,7+0,5 Deuschle et al.,1986

cat Ptrp pMT12 6,0±1 ,0 13001250

cat p tac pPT14 15 + 3 15001300

cat PR pPR2 12 + 3 800+100

cat . PL ' pPLSl8 10 ± 3 1300+200

cat * PL pPL521 5,0+1,0 не определялась

cat Pl*(A-T) 37 ± 7 Deuschle et al.,1986

frd Pfrd pFRDIO 1,0+0,2 14 + 3

я Данный промотор содержал нативный А-Т богатый блок с координатами (-100 . . . -75).

Сравнительную оценку эффективности функционирования клонированных промоторов в составе рекомбинантных плазмид проводили с помощью метода гибридизации импульсно меченой in vivo мРНК с комплементарной ДНК. Помимо гена cat все описанные плазмида содержали ген Ыа (apr) , транскрибирующийся под контролем собственного промотора. Наличие "внутреннего стандарта" для нормирования результатов измерений уровней гибридизации, в роли которого выступал транскрипт гена Ыа , обеспечивало возможность соотнесения силы каждого из исследуемых промоторов с эффективностью работы промотора Ыа и,соответственно, сравнение их друг с другом. Для получения большого количества комплементарной одноце-почечной ДНК, необходимого в гибридизационных экспериментах, фрагменты генов cat и ыа были клонированы в составе бактериофагов MI3 серии mpi i. Закрепленная на нитроцеллюлозных фильтрах рекомбинантная ДНК гнбридазовалась с импульсно меченой иРНК

плазмидосодержащих клеток. Так как время импульса (30 с) меньше времени ЖИЗНИ MPHKcat, Ыа Е.coli (Nilsson et al, 1984), ТО ОП-'ределяемое отношение уровней гибридизации отражает истинную эффективность транскрипции о промотора. Результаты измеренной таким образом силы промоторов представлены в таблице I.

Эффективность промотора PlacUV5 была в 2,5 раз выше, чем РЬ1а-Это, по-видимому, обгонялось более оптимальной последовательностью Placüv5 в участке "-I0", практически совпадающей с каноническим блоком Прибнова промоторов e.qoií (рис.2). Эффективность промотора гена cat рвкз25 совпадала с таковой для PlacUV5 , традиционно считающимся одним из достаточно сильных промоторов е. coi i. Вероятно, зарегистрированная сила Р . обу-

СЗ. t

словлена участием в инициации транскрипции белка-активатора катаболитных генов (Le Grice et al.,1981).

Сила дерепрессированного промотора Ptrp в 2-3 раза превышала силу Р и составляла 5-6 отн.ед. (см.табл.1), что, возможно, бЫлосисвязано с более оптимальной структурой области "-35", расположенной через 17 п.н. от "-I0" (см.рис.2).

Неудивительно, что сочетание двух канонических участков

acc.t.gttGTTGAcATTTtt. ...ttggcGGTTATATTg. ..cCAT

р Ыа TTCTAAATACATTCAAATATGTA TCCGCTCATGAGACAATAA CCCTGA

PlacUV5 GCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATAATGT GTGGAA

Pcat TTGATCGGCACGTAAGAGGTTCC AACTTTCACCATAATGAAATAAGA

Ptrp GAAATGAGCTGTTGACAATTAAT CATCGAACTAGTTAACTAGTACGTAA

Ptac GAAATGAGCTGTTGACAATTAAT CATC GGCTCGTATAATGT GTGGAA

PR CACCGTGCGTGTTGACTATTTTA CCTCTGGCGGTGATAATGG TTGCAT

PL CTCTGGCGGTGTTGACATAAATA CCACTGGCGGTGATACTGA GCACAT

* PL CTCTGGCGGTGTTGACATAAATA CCACTGGCGGTGATACTGA GCCGGA

Pfrd TGATTGGAAAATTGTGAAAAAGT TTTGAGGAAAATATTATGT TGTCAT -24 1

Pfrd TATGTATGTCATTGAAATTATCC AAGCATTCGTTTTCAATTA AATAGG -282

ttgaca татаат -

"-35" "-10"

Рис.2 Нуклеотидные последовательности среднестатистического промотора е . coi i и исследованных в работе регуляторных элементов. Внизу показана каноническая последовательность областей "-35" и "-I0".

"-35" из Р и "-I0" из Р lacüV5 в гибридном промоторе Ptac привело к его повышенной эффективности, равной 15 i 3 отн.ед.

Эффективности промоторов фага Л Рт и Р„ незначительно

ь к

уступали Ptac и составляли 10-12 ед. Практически одинаковые силы этих двух промоторов при наличии С в "-8" у PL вместо канонического А, как у Р R, при идентичной области "-35" (см. рис.2) можно объяснить влиянием близлежащих к центральному району участков регуляторного элемента на эффективность его взаимодействия с РНК-полимеразой: относительно слабого промотора Р^ , локализованного в непосредственной близости от Рс на плазмиде рШ2 , отсутствия на pplsis А-Т богатого блока, расположенного выше от Рьна природном фаговом геноме.

Исследования также показали, что на эффективность транскрипции существенное влияние оказывает нуклеотидная последовательность в участке инициации. Как видно из рис.2, промоторы PL и PL отличались лишь в области, непосредственно примыкающей к старту мРНК. Пониженная примерно в 2 раза эффективность PL объяснялась или неоптимальной структурой в положении "+1", или изменением расстояния от точки "+I" до блока Прибнова.

В то же время, из таблицы I видно, что уровень синтеза См— ацетилазы часто не коррелировал с силой использованных для транскрипции гена cat 'промоторов. Проведенный расчет вторичной структуры соотвеЬтвующгос мРНК позволил в 'большинстве случаев объяснить неэффективную трансляции матрицы вовлечением нуклео-тидов sd-последовательности и/или инициирующего кодона в ксп-плементационные взаимодействия.

Анализ представленных в работе и литературных данных позволяет заключить, что по первичной структуре промоторного участка (от "-40 до +1) регуляторные элементы Ptac , PL , PR уже близки к наиболее эффективным. Возможное изменение силы промотора при изменении областей вне этого участка позволяет объяснить, почему даже более эффективные in vivoпромоторы могут иметь первичную структуру, значительно отличающуюся от канонической. Также очевидно, что сила часто используемых высокоэффективных промоторов отличается на величину в пределах одного порядка. Поэтому при конструировании векторных систем для экспрессии генов более существенным является не выбор самого сильного, а использование достаточно эффективного, регулируемого промотора и обеспечение оптимальных условий для инициация трансляции чужеродного белкового продукта.

Предложенный метод анализа экспрессии модельного гена Cat

под конролем различных регуляторных элементов дает возможность подбора условий оптимизации экспрессии reHafrd фага Т4 в бактериальных клетках.

2. Исследование экспрессии генд frd Фага Т4 в составу рекомби-нантных плазмид Е. coi i.

К началу работы было известно, что ген frd входит в состав единого кластера ранних генов бактериофага Т4:frd,td,nrdA,nrdB (Wilson et al,1977). Результаты генетического анализа показали сцеплешюсть генов frd и td , но соответствующие цистроны не были точно локализованы на физической карте фага. Из коллекции лаборатории генетической энзимологии ИБФМ АН СССР нами были отобраны 4 рекомбинантных фага Л-Т4, ДНК которых гибридизовалась с меченым фрагментом smai-ii длиной 16 т.п.н., содержащим перечисленные гены (Ли Л.И.и др.,1981). С помощью рестрикционного анализа ДНК рекомбинантов и фрагмента smai-ii удалось построить физическую карту клонированных фрагментов фага Т4, представленную на рисунке 3, а также предположить наличие гена frd в составе ДНК .рекомбинантного фага 761-4.

Для того, чтобы выделить.ген frd в составе участка ДНК меньшего размера, было осуществлено клонирование Hind Ш-фрагаентов 761-4 в составе вектора рвкзгг.Плазмидная ДНК, выделенная из устойчивых к Тр, антифолиевому агенту, бактерий имела размер 5,4 т.п.н. и содержала единственный дополнительный фрагаент Hindll длиной 1,1 т.п.н., идентичный таковому в ДНК 761-4. Схема полученной рекомбинантной плазмида pfrdio представлена на рисунке 4.

- 32 frd td nrdA, В denA

145

140

135

ггтт

PI XI BII KI

>,9 Lei 3~

SI

1,1

TTT

si

647-8, 596-24,-31 761-4

Рис.3 Физическая карта области генов frd.td.nrdA,в фага Т4. Верхняя линия - генетическая карта Бта1 -фрагмента ДНК фага Т4,

НИЖНЯЯ - реСТрИКЦИОННЭЯ ДЛЯ Хрп1-К1, Х1ю1-Х1, ВдШ-ВП, 5та1-

Б1. В нижней части рисунка представлены есом -( г ) % Н1п<зш-( ? ) фрагменты ДНК Т4, клонированные в составе Л-векторов.

í

HindIII

Таким образом, физическое картирование клонированных в Ли плазмидных векторах фрагментов ДНК фага Т4 позволило с высокой точностью локализовать ген frd на карте бактериофага.

После выделения фагового гена в составен1п<зш-фрашента вставал вопрос об особенностях его экспрессии в бактериальной системе.

Среда устойчивых к Тр клеток были найдены такие, которые содержали плазмидную ДНК (pfrd4 8) со встроенным шпащ-фратентом в ориентации, противоположной p^rd 10 (рис.4). То, что ген frd фе-нотипически проявлялся при встраивании в плазмвде в 2х ориентаци-ях при отсутствии близлежащих плазмидных промоторов, давало возможность предположить наличие участка ДНК, который может быть потенциальным промотором гена frd на клонированном фрагменте.

С помощью метода гибридизации меченой m vivo мРНК с ДНК было осуществлено прямое определение эффективности транскрипции гена frd в составе плазмидыргкшо.

Уровень этой транскрипции был сравним с таковым для плазмвдного гена ыа , что также косвенно свидетельствовало о существовании дополнительного регуляторного элемента на ншаШ-фрагменте -ДНК. Т4.

В.1984 г. была опубликована полная нуклеотидная последовательность описанного н1пйш-фрашанта, однако, наличие на нем функционального промотора гена frd доказано не было (Purohit et а1,'1984)3нание этой последовательности позволило нам провести компьютерный анализ промотороподобных структур в составе исследуемого фрагаента.Наиболее вероятным кандидатом в промоторы гена ' frd был участок ДНК, локализованный около 240-го нуклвотида, который содержал гексамер "-I0", близкий к каноническому и расположенный на оптимальном расстоянии от области ДНК, которая могла-служить гексамером "-35" (см.рис.2). Одновременно было показано,

Рис.4 Физико-генетическая' карта рекомбннантных плаз-

МИД pFRD1 О И pFRD4 8.

что на стыке соединенных фрагментов промотсроподобной структуры не возникло.

Таким образом, доказано, что генгга в составе клонированного фрагмента ДНК фага Т4 мог выражаться автономно вне зависимости от расположения дополнительных плазмидных промоторов. Обнаружен также вероятный кандидат на роль этого промотора. Однако, строгая идентификация точки инициации транскрипции гена ^сз и определение роли соответствующего промоторного участка в экспрессии гена в составе фагового генома могли бы явиться предметом дальнейших исследований.

Об эффективности экспрессии гена г га в составе рпшю судили по устойчивости плазмидосодержащих клеток к Тр и по уровню ферментативной активности Д№Р фага Т4, измеренной спектрофото-метрически (см.табл.1). Учитывая удельную активность гомогенно- , го препарата ДГФР фага Т4, можно было предположить, что синтезированный фаговый фермент в клетках е.сои ерпшю составлял не более 0,01% от суммарного клеточного белка, что было явно недостаточно для его препаративного выделения.

3.Получение бактериального штамма-продуцента ДР?Р Фага Т4.

Для повышения выхода целевого продукта на первом этапе нами был использован метод амплификации рекомбинантной плазмиды, содержащей ген с этой целью было проведено конструирование серии плазмид с геном , копийность которых регулировалась условиями выращивания соответствующих клеток (табл.11).

Таблица II. определенный уровень активности ДШР фага Т4 в плазмидосодеркащих бактериях.

Рекомбинантная tкyльтивиpo- Число Активность ЖФР фага Т4 плазмида вания ( С) копий (шлоль/мин/мг)

рПШ20 30 7+1 е + 1

рР1Ш40 30 10 ± 1 8 + 1

ргиэго 37 14 ± 1 11 + 1

рГИЛО 37 . 20 ± 2 ■ 14 ± 2

рпиэго 42 23 ± 3 20 + 3

рПи>15 37 50 ± 3 ' 40 + 5

рПФ40 42 200 + 10 180 ± 20

рГИОЗО 30 не опред. 40 + 5

рПФЗО 42 не опред. 5000 ± 500

Как видно из представленной таблицы, урове;г& активности

- II -

ДГФР возрастал пропорционально дозе клонированного гена frd. Однако, даже в случае pfrd4o , полученной на основе мультикопий-ной плазмида pkn4 02, число копий которой при 42°С достигало 200 на хромосомный эквивалент, уровень синтеза редуктазы не превышал 0,1$ от суммарного белка клетки.

Интересно, что если увеличение дозы генаfrd в составе ре-комбинантной плазмида приводило к пропорциональному возрастанию активности фермента, то уровень устойчивости к- Тр плазмидосодер-жащих бактерий оставался неизменным (в случае pfrd40 он не был измерен из-за нестабильности плазмида). Это позволяло предполагать возможность использования сконструированных -плазг.шд для маркировки штаммов энтеробактерий и создания векторов инсерционной инактивации TpR. Так например, с помощью pfrdio (см.рис.4) отбирали и контролировали чистоту культуры при ферментации штамма

Serratia marcescens ВКМ R3,продуцента реСТриКТЭЗЫ Smal (Беляева и др.,1983). После модификации плазмид pfrdio hpfrd2o были получены векторы инсерционной инактивации, стабильно наследующиеся в условиях выращивания без селективного давления"в течение 100 генераций. С помощью этих векторов была создана коллекции ecori-фрагментов ДНК фага Т4.

Для достижения более эффективной экспрессии ДР5Р Т4 в бактериях ген frd был клонирован в составе вектора р1ь*оз под контроль промотора фага Л Рь(рис.5), транскрипция с которого могла осуществляться в результате тепловой инактивации продукта гена cits8 5^ плазмидосодержащих клетках. Наличие АТ-богатого блока, расположенного в непосредственной близости от % нар^гоз ( позволяло надеяться на то, что сила этого промотора может быть в 2-3 раза выше, чем экспериментально установленная для Рь в случае ______DPL518 (см.табл.1). Титр клеток, содержащих плазмиду pfrd30, после Зх часового выращивания при 42°С на среде с Ар или Тр, падал на 4 порядка. В этих же условиях наблюдалось стабильное наследование PIL203. Интенсивное накопление бес-плазмвдных клеток, по-видимому, было связано с токсичны:,! действи-

Рис.5 Схема плазмидаргкозо. ем образованной ДГФР фага Т4, так

как выращивание бактерий сргмэзо прИ 42°С привело к общему понижению, выживаемости даже на среде без антибиотика. После встраивания

фрагментов чужеродной ДНК в структурную часть гена.fxй ргм>зо образовывались рекомбинантные плазмиды,стабильно наследующиеся даже в условиях дерепрессии промотора ^. Обнаруженный эффект мог свидетельствовать о повышенном уровне синтеза ДР&Р фага Т4 клетках е.сои ши/ргшэзо, выращенных при 42°С. Как видно из таблицы II, значение этого уровня действительно достигало 3-5% от суммарного белка клетки,что подтверждалось данными электрофо-ретического разделения кодируемых плазмидой белков (рис.6а).

Однако, эффективность промотора Рь превышала Р£г(3 не более, чем в 20-30 раз, и поэтому 300-кратное увеличение синтеза фермента в клетках с рпшзо относительно контрольного штамма сргиэю нельзя было объяснить только оптимизацией транскрипции гена в составе рГюзо.Если транскрипция генагга инициирована с промотора, расположенного вне нтаШ-фраплента ДНК Т4, например, с Рь в ргиэзо, то возможна модификация ранее неоптимальной области инициации трансляции соответствующей матрицы.

Перед структурным геном £пз последовательно расположены 2 открытые рамки считывания (ОРС),которые все вместе образуют своеобразный оперон. При этом участки инициации и терминации трансляции Зх генбв оперона частично перекрываются. Подобная организация межцистронных областей позволяет предполагать наличие трансляционного сопряжения, когда зоэ субчастица рибосомы после термшгацки проксимального к промотору гена не диссоциирует от матрицы и может взаимодействовать с участками инициации дисталь-ного оперона (0ррепЬе1п & Уапо£Бку, 1980). Вероятно,эффективная трансляция 2х ОРС в случае рпшзо способствовала формированию оп- ■ тимальной вторичной структуры глР1Ж£га для связывания со свободными рибосомами, так как с помощью компьютерного анализа было установлено, что при транскрипции гена с промотора, расположенного на ншаШ-фрагаенте, Б0 -последовательность и аий-кодон мРНК гена гга локализованы частично в спирализованном участке (рис.66), неоптимальном для инициации трансляции. Предположение •о трансляционном сопряжении и "расплетании" вторичной структуры области инициации трансляции мРНК позволило бы объяснить вы- • сокий уровень синтеза ДГФР фага Т4 в плазмидосодеркащих. клетках лишь при достаточно высокой эффективности трансляции первого гена оперона - 0РС1. Так как в случае р^козо прямой расчет вторичной структуры мРНК в области взаимодействия рибосом с матрицей 0РС1 не представлялся возможным из-за большой протяженности не-транслируемой последовательности между геном N рхьгоз и АТС~ кодоно:.: 0РС1, для проверки предположения было предпринято прямое

I 2 3 45 67 8 9-Рис.6а Электрофореграыма белков, синтезируемых плаз-мидосодержащима клетками: 1-маркерные белки ЕсоШГ (27000), с«.С (12000), рШЛО (30°)-2, (42°)-3, ррк1)зо (зо°)-4, (42°)-5, рриог -6, (+1иа)-7, рвазгг (30°)-8, (42°)-9.

бируемого под контролем собственного промотора.

< тр 1 *maPlac -Г ЛР >

- frd -- СТА - SDfrd-- AGTofrii-- OFRII - СТА -- SDQFR1I-----

-- AGTOFRI " 0FRI " ^ - SDOFRl" GTAlacZ SDlacz' " plac" .

Рис.7 Схема плазмиды pfrd2 и образованного гибридного оперена.

конструирование гибридного оперона с частично перекрывающимися генами. Такая конструкция (pfrd2 ) была получена после клонирования н indli -фрагмента с геном fra в составе вектора рис 19 (рис. 7). В pfrd2 под контролем лактозного промотора образовался новый гибридный оцерон: Plac-iacz' -OPCI-OPCII-frd , Б котором области инициации и тершнацш трансляции генов частично перекрывались (см.рис.7). Расчет кинетики формирования вторичной структуры 5-концевого фрагмента этой полищютронной мРЖ показал, что эффективность инициации трансляции проксимального гена (lacZ' ) .вероятно, не отличалась от таковой в исходной плазмвде p°ci э . Поэтому можно было ожидать эффективную инициации трансляции и дисталь-но расположенного гена fra.

Титр клеток E.coii TGi/pFRD2, выращенных в условиях дере-прессии лактозного промотора на среде.с Ар или Тр'в течение 3-5ч, падал на 3-4 порядка, как в случае pfrdso. Уровень ферментативной активности ДГФР фага Т4, зарегистрированный для этого плазмидного штамма,, был сравним с таковым для рпшзои достигал 3-5% от сум- . марного'белка клетки (см.рис.6).

Необходимо отметить, что полученные в работе штаммн-прсдо-центы обеспечивали практически одинаковый выход целевого продукта, несмотря на пониженную в 4-5 раз силу Р1ас относительно Р . Данные результаты можно, по-видамому, объяснить повышенной эвдек-Ъшностью инициации трансляции mPHK-frdb случае pfrd2.

.Не.исключено, что наличие ОРС перед структурным геном frd свидетельствует о регуляции трансляции соответствующей матрицы и в составе природного фагового генома.

Достигнутый уровень продукции ДРЙ? фага Т4 в клетках, содержащих сконструированные рекомбинанткые шгазыидыргиозо epfrd2, позволяет использовать их в качестве источника препаративного выделения необходимого белка.

ВЫВОДЫ

1. На основе анализа фрагментов ДНК фага Т4,клонированных в составе Л-Т4 рекомбинантов 596-24 , 596-31, 647-8 и 761-4, плаз-миды pFRDiQHa геноме бактериофага локализован reHfrd , кодирующий ДИР. Показана возможность экспрессии этого гена в е. сои в составе Hind Ш-фраплента длиной 1,1 т.п.н. вне зависимости от расположения последнего относительно плазмидных промоторов.

2. При увеличении дозы клонированного фрагмента уровень синтеза ДГФР фага Т4 достигал 0,1% от суммарного клеточного белка.

3. С помощью метода гибридизации ишульсно меченой in vivo мРНК с комплементарной ДНК определена относительная эффективность некоторых прокаркотических регуляторных- элементов и показано, что наиболее сильными являются промоторы е. coi i Ptac и фагаЛ PL и PR , которые в 2-6 раз превосходят Pcat, Ptrp и PlacUV5 •

Эффективность транскрипции гена frd в составешпа Ш-фраг-мента фага Т4 сравнима с таковой генаыа. ,

4. Сконструированы бактериальные итамш-продетентн ДОР фага Т4, в которых при использовании промотора фага Л PL, а таютек.сои Р1ас выход целевого продукта увеличен до 3-5% от суммарного белка клетки.

5. Показана возможность использования полученных рекокбинантных шазмид с геном-frd в качестве векторов инсерционной инактивации TpR и для маркировки штаммов энтеробактерий.

0<?нрврчв материалы дисеерташш. опубликованы в работав.

1. Ли Л.И., Горовиц Р.Л., Крутизна А.И,, Ворожейкина Д.П., Таня-шин В.И. "Структурно-функциональное исследование области генов 31-38 бактериофага Т4", - Тезисы докл.конф."Вирусы микроорганизмов", Пущино, 1981, с.42.

2. Беляева Р.Х., Ли Л.И., Горовиц Р.Л., Солонин A.C., Таняшин В.И Крюкова Е.И., Лузина Й.Е., Ежов В.А., Баев A.A. "Штамм Serratia raarcescens BKM КЗ-П-цродуцеНТ ЭВДОНуКЛеаЗЫ рестрикции Smal",— Заявка на авт.свид. й 3576395/13, решение о выдаче а.с. от 27 сект. 1983 г. (приоритет ИЛУ. 1983).

3. Belyaeva R.Ch., Li L.I., Gorovitz R.L., Solonin A.S., Tanyashln V.l."Cloning and expression of dihydrofoíate reductase gene of

T4 phage in Escherichia coli and Serratia marcescens",- Abstracts of communications of Fourth symposium on DNA (Praque,1983).

Подковыров C.M., Горовиц P.Л., Лебедева М.И., Трухан М.Э., Кашгев М.В., Лапидус А.Л., Ребентшп Б.А., Машко С.В. "Констру-

ирование векторов длят регуляции экспрессии гетерологичных генов в Е.сои"» - Тезисы докл. Всесоюзной конф."Перспективы создания лекарственных средств с использованием биотехнологии" Москва, 1985, с.24.

5. Мапко C.B., Подковыров С.М., Трухан М.Э., Горовиц Р.Л., Лебедева М.И., Кашлев М.В., Складнев Д.А., Ребентии Б.А., Козлов Ю.И., Дебабов В.Г. "Экспрессия гена хлорамфениколацетилтранс-феразы под контролем некоторых промоторов е.сони бактериофага Л - Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1986, Jê 4, с.9-16.

6. Магако C.B., Горовиц Р.Л,, Трухан Н.Э., Демчук Е.Я., Лебедева М.И., Лапидус А.Л., Подковыров С.М., Козлов Ю.И., Дебабов В.Г. "Изучение относительной эффективности некоторых промоторов е. coli и фага Л ", -Доклады АН СССР, 1986, т.291, с.1510-1513.

7. Горовщ Р.Л., Трухан М.Э. "Изучение относительной силы промоторов PL и PR фага Л и Р cat е. сои -Тезисы докл.конф. "Генетика и биохимия микроорганизмов - биотехнологии", Москва, 1986, с.67.

8. Машко C.B., Подковыров С.М., Трухан М.Э., Лебедева М.И., Лапидус А.Л., Горовиц Р.Л., Кашлев М.В., Лебедев А.Н., Мочуль-ский A.B., Ребентиш Б.А., Козлов Ю.И.,"Исследование эффективности экспрессии хлорамфениколацетилтрансферазы под контрой ЛеМ ЧужерОДНЫХ реГуЛЯТОрНЫХ Элементов В КЛеТКаХ Escherichia

соц. il. Молекулярное клонирование промоторов",- Молекулярная биология, 1987, т.21, с.73-86.

э. Горовиц Р.Л., Солонин A.C. "Векторы инсерционной инактивации маркера резистентности к Тр", - Генетика, 1987, ХХШ, Уе 3, с. 397-404.