Исследование токсического действия алюминия на нейроны и тимоциты мышей

Тунева, Елена Олеговна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование токсического действия алюминия на нейроны и тимоциты мышей
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование токсического действия алюминия на нейроны и тимоциты мышей"

На правах рукописи

ТУНЕВА Елена Олеговна

Исследование токсического действия алюминия на нейроны и тимоциты мышей

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005 г.

Работа выполнена в ГУ НИИ неврологии РАМН (Россия).

Научный руководитель:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор БОЛДЫРЕВ Александр Александрович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор КОДЕНЦОВА Вера Митрофановна

доктор биологических наук,

профессор КОБЛЯКОВ Валерий Александрович

Ведущее учреждение:

ГУ НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН

Защита состоится «_»_2005 г. в «_» часов на заседании

диссертационного совета Д 212.203.13 при Российском университете дружбы народов по адресу: 117198 ГСП, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы по адресу: 117198 ГСП, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8

Автореферат разослан «_»_2005 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета

кандидат фармацевтических наук, доцент ЛАГУТКИНА Т. П.

c>0t>6 - *

22209

Z11G63S

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Алюминий является одним из самих распространенных металлов на земле. Алюминий широко представлен в окружающей среде, и все живые существа поглощают его с пищей При этом зачастую наблюдается накопление алюминия в тканях, поскольку в живых клетках не выработалось специфических систем, способных к его экскреции.

Проблема безопасности употребления алюминия с пищей или водой давно беспокоит людей Накопление алюминия в организме интенсивно изучается, и существующие факты свидетельствуют о том, что этот процесс в мозге может сопровождать возникновение и развитие таких нейродегенеративных заболеваний, как болезнь Альцгеймера и паркинсонизм (Crapper et al, 1976; Trapp et al, 1978; Graves et al, 1990).

В то же время, представления о токсичности алюминия для организма человека до сих пор неоднозначны Для людей, живущих в областях с повышенным содержанием алюминия в окружающей среде, обнаружена корреляция между содержанием алюминия в воде и частотой проявления болезни Альцгеймера (БА) (Martyn et al. 1989; Forbes et al. 1992).

Однако известны и примеры, отмечающие отсутствие у пациентов с нейродегенеративными заболеваниями накопления алюминия в тканях мозга по сравнению со здоровыми людьми. Расхождения в экспериментальных данных происходят, вероятно, из-за отсутствия достаточной информации о его локализации в пораженных участках мозга, а также и о механизмах его действия на возбудимые ткани

Так или иначе, увеличивающееся производство алюминия для нужд промышленности и расширяющееся применение алюминиевых изделий в быту делают необходимым количественную оценку его токсического влияния на живые системы.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы явилось количественное исследование токсического действия хлорисюго алюминия на клетки нервной и иммунной систем в условиях in vitro.

Для выполнения этой цели нами были поставлены следующие задачи: 1) Описать свойства нейронов и тимоцитов с помощью проточной цигометрии; 2) Охарактеризовать действие алюминия на нейроны и тимоциты грызунов; 3) Оценить токсический эффект хлористого алюминия на мембраны клеток и внутриклеточный уровень активных форм кислорода (АФК); 4) Охарактеризовать вид клеточной смерти, индуцируемой хлористым алюминием; 5) Сопоставить чувствительность тимоцитов и нейронов к токсическому действию хлористого алюминия; 6) Провести оценку взаимного влияния на нейроны алюминия и агониста глутамата М-метил-О-асгтартата (NMDA), вызывающего экзайтотоксическое действие на глутаматергические сгруктуры.

Научная новизна и практическая ценность работы

В работе впервые продемонстрирован токсический эффект низких концентраций алюминия (100 мкМ и ниже) на гранулярные клетки мозжечка и тимоциты 10 15 дневных мышей линии ICR. Методом проточной цитометрии прямо

рос. национальная] библиотека ]

продемонстрировано изменение гранулярности и размеров клеток, а также повышение внутриклеточного уровня активных форм кислорода и деполяризация клеточной мембраны под влиянием хлористого алюминия. Эти эффекты развиваются весьма быстро и коррелируют с концентрацией алюминия, добавленного в инкубационную среду.

Выяснено, что тимоциты более чувствительны к токсическому действию алюминия, чем гранулярные клетки мозжечка. Пороговой концентрацией Л101, для тимоцитов является 25 мкМ, а для нейронов - 50 мкМ. Показано, что генерация АФК внутри клеток под воздействием алюминия подавляется антиоксидантом N-ацетилцистеином (NAC), при этом NAC не защищает клетки от гибели, следовательно, АФК не являются непосредственной причиной клеточной смерти Мы обнаружили, что токсический эффект алюминия заключается в нарушении целостности клеточных мембран и массовой гибели клеток по пути некроза.

Нами также продемонстрировано увеличение флуоресцентного сигнала Fluo-3 AM, пропорциональное концентрации А1С13, но не подавляемое внутриклеточным кальциевым буфером ВАРТА Флуоресцентный сигнал, измеряемый внутри клетки с помощью Fluo-3 AM в присутствии Са-комплексона ВАРТА, отражает накопление алюминия внутри клеток и может использоваться для ei о количественного определения во внутриклеточном пространстве.

Таким образом, мы показали что, алюминий проникает через клеточную мембрану и аккумулируется внутри клетки, приводя к ее гибели. Впервые было выявлено, что клеточная смерть под влиянием алюминия в условиях острого опыта происходит по пути некроза.

Результаты диссертации важны для исследования молекулярных механизмов нарушения метаболизма у организмов, живущих в среде с повышенным содержанием алюминия.

Положения, выносимые на защиту

В работе продемонстрирован токсический эффект хлористого алюминия на тимоцигы и нейроны мозжечка мышей. Инкубация клеток с А1С13 вызывает осмотический эффект, выражающийся в увеличении размеров и гранулярности клеток. Одновременно наблюдается падение мембранного потенциала и клеточной с мер i и по пути некроза

При инкубации клеток с хлористым алюминием наблюдается усиление внутриклеточной продукции свободных радикалов, хотя проникающий в клетки природный антиоксидант N-ацетилцистеин вызывает снижение стационарного уровня АФК, но не защищает клетки о г действия А1С1; Одновременно продемонстрировано усиление алюминием экзайтотоксического эффекта NMDA на нейроны головного

мозга. Это позволяет считать алюминий фактором риска нейродегенеративных процессов.

Апробация работы

Апробация работы состоялась на межлабораторном семинаре ГУ НИИ неврологии РАМН 14 июля 2005 г. Материалы диссертации были доложены на II ежегодной конференции "High turbidity events: chemical intrusion and potential public health consequences" (2nd Annual New York City watershed science and technical Conference, Нью-Йорк, США, 21-23 сентября 2004) и на международной академической конференции в МГУ (Москва, Россия, 26-28 октября 2004).

Публикации

Материалы диссертации отражены в 9 печатных работах (6 статей и 3 тезисов докладов).

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты исследования и их обсуждение»,

«Заключение», «Выводы» я «Список литера1уры». Работа изложена на_стр.

печатного текста, содержит_рисунков и_таблиц. Список литературы включает

_наименований.

ОБЩЕЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные В экспериментах использовали 10-15 дневных мышей линии ICR, содержащихся в стандартных условиях вивария. В работе использовано 155 животных.

Вы деление гранулярных клеток из мозжечка мышей. Метод выделения клеток подробно описан в литературе (Oyama et al, 1996; Boldyrev et al, 1999). Животных декапитировали, и мозжечок помещали в охлажденный раствор Тироде (148 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ СаС12, 1 мМ MgCl2, 10 мМ глюкозы, 10 мМ HEPES, pH 7,4). Для получения индивидуальных гранулярных клеток мозжечка кусочки ткани инкубировали при 34°С в присутствии диспазы (2 мг/мл раствора Тироде, 400 ед активности) в течение 45 мин. После инкубации нейроны получали взмучиванием и фильтровали через нейлоновый фильтр с размером ячеек 50 мкм. Концентрацию клеток в суспензии определяли в камере Горяева. Перед загрузкой лнгандами клетки инкубировали 60 мин при 37°С

Выделение тимоцитов проводили, используя мышей того же возраста (Okada et al, 2000) Животных декапитировали, извлекали тимус, промывали холодным раствором Тироде и измельчали. Для получения свободных тимоцитов кусочки ткани суспендировали пастеровской пипеткой. Полученную суспензию пропускали через нейлоновый фильтр (50 мкм). Количество выделенных клеток в суспензии определяли с помощью камеры Горяева. Перед загрузкой лигандами тимоциты (так же как и нейроны) инкубировали 60 мин при 37°С.

Подготовка клеток к эксперименту. Суспензию клеток нагружали соответствующими флуоресцентными красителями в течение 10-45 мин в зависимости от природы красителя (см. таблицу 1).

Оптическая (флуоресцентная) метке Время инкубации, мня Параметр

Светопропускамие/светорассеяние 30-210 Гранулярность и размеры клеток

DiBAC4ß) 10 Мембранный потенциал

FIuo-3 AM 45 Внутриклеточные ноны кальция и/или алюминия

C.DCF 45 Активные формы кислорода (АФК)

Иодид прогшдш 5 Некроз

Аннексии V 30 Апогггоз

Протокол эксперимента. Нагруженные клетки отмывали от избытка красителя и инкубировали с хлористым алюминием (0,025-5 мМ) в течение 30-210 мин. По завершении инкубации в пробы вносили иодистый пропидий (PI) и проводили анализ образцов на проточном цитометре (Beckman Coulter, EPICS ALTRA), измеряя их оптические свойства, а также флуоресценцию соответствующих красителей. Все процедуры с клетками, нагруженными светочувствительными зондами, для предотвращения засветки проводили при рассеянном освещении. В каждой индивидуальной пробе подсчитывали 10 000 событий. Каждое измерение проводили не менее 3 раз, повторяя экспериментальные серии 4-5 раз, используя животных разных пометов.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью компьютерной программы "Biostatistica", используя критерий t Стьюдента. Достоверными считали различия при значении р<005.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ I. Влияние AICIj на осмотическую активность и жизнеспособность клеток При инкубации нейронов с хлористым алюминием наблюдается изменение расположения нейронов в координатах прямого и обратного рассеяния («FS» против «SS», рис. 1). Этот эффект алюмийия имеет отчетливую временную и концентрационную зависимость.

SS SS SS

Контроль 100 чкМ AICI, 500 мкМ AICI,

Рис. 1. Влияние алюминия на распределение гранулярных клеток мыши в координатах FS/SS (инкубация 60 мин, температура 37*С)

При добавлении в пробы нарастающих концентраций А1С13 (50 мкМ - 5 мМ) клетки «перемещаются» вверх по ординате, то есть увеличиваются в размере, что

соответствует их набуханию. Одновременно наблюдается перемещение клеток вдоль оси абсцисс, что соответствует росту клеточной гранулярности (Наупев, 1988) Аналогичные результаты были получены с тимоцитами (рис. 2), причем выяснилось, что эти клетки оказались более чувствительны к токсическому эффекту алюминия.

Контроль

50 чкМ акт.

1ГМ) МК'М АЮ1,

Рис. 2 Эффект алюминия на распределение тимоцнтов в координатах FS/SS (инкубация 60 мин, температура 37°С)

Для выяснения того, какую роль играют внеклеточные ионы кальция и натрия в осмотическом феномене алюминия, мы провели аналогичные эксперименты с удалением из среды этих ионов. Для создания бескальциевой среды СаСЬ в расгворе Тироде был заменен на 1 мМ ЭГТА, а для создания безнатриевой среды той же осмотичности ЫаС1 заменяли на удвоенную концентрацию сахарозы.

Как видно из рис. 3, как в бескальциевой, так и в безнатриевой среде эффект алюминия не претерпевает заметных изменений. Это позволило нам заключить, что обнаруженный осмотический эффект алюминия не опосредован внеклеточными ионами кальция или натрия, а развивается независимо от их присутствия.

В процессе выполнения описанных экспериментов мы проводили измерение мертвых клеток, выявляемых по окраске с Р1. Обнаружилось, что инкубация клеток с А1С13 увеличивает окрашиваемость клеток иодистым пропидием. При этом вновь оказалось, что тимоциты более чувствительны к действию алюминия, чем нейроны - ответ первых проявляется с 25 мкМ, а вторых - со 100 мкМ А1С13.

При инкубации нейронов с хлористым алюминием обнаруживается рост внутриклеточной флуоресценции СЕ)СР и Р1ио-3 АМ, которые считаются маркерами на АФК и свободные ионы кальция соответственно. Этот эффект алюминия имеет отчетливую временную и концентрационную зависимость.

При добавлении в пробы нарастающей концентрации алюминия А1С13 (50 мкМ - 5 мМ) флуоресценция СЕ>СР и Р1ио-3 АМ увеличивалась, что должно было соответствовать возрастанию в клетках уровня АФК и внугриклеточного кальция Одновременно в пробах выявлялось уменьшение количества живых клеток Аналогичные результаты были получены и с тимоцитами, причем и по этому параметру они были более чувствительны к токсическому эффекту алюминия.

Рис. 3. Влияние кальция и натрия во внеклеточной среде на эффект алюминия на гранулярные клетки мощечка. Слева - в отсутствие алюминия, справа через 30 мин

инкубации в присутствии 100 ц.М А1СЬ. А - в нормальном растворе Тироде, К - в отсутствие ионов кальция, В - в отсутствие ионов натрия. Инкубация 3 ч при 37"С. По оси ординат - прямое рассеяние (Т8), по оси абсцисс - боковое рассеяние (ЙЯ)

Контроль 50 мкМ 100 мкМ 200 л[кМ Кониешриня А1С I (

Рис. 4. Эффект алюминия на смертность нейронов (серые столбики) и тимоцитов (черные столбики). Инкубация 60 мин, температура 37*С. Знак «*» соответствует достоверному отличню результатов от соответствующего контроля (р<0,05)

//. Влияние хлористого алюминия на уровень внутриклеточного кальция и АФК в нейронах и тимоцитах мышей

Для выяснения роли внеклеточного кальция в токсическом эффекте хлорисгою алюминия мы измеряли внутриклеточную флуоресценцию клеток, нагруженных СОСР и Р1ио-3 АМ, в бескальциевой среде, как было описано ранее. Из рис. 5 следует, что как в нормальных условиях, так и в бескальциевой среде эффект алюминия на измеряемые параметры не претерпевает заметных изменений. Это позволяет заключить, что обнаруженное нами токсическое действие хлористого алюминия развивается независимо от внеклеточного кальция.

Дня выяснения того, какую роль играет внутриклеточный кальций в токсическом феномене алюминия, мы провели аналогичные эксперименты с внутриклеточным кальциевым буфером ВАРТА, способным хелатировать ионы кальция в цитоплазме. Индуцируя рост внутриклеточного кальция хлористым алюминием в клетках, предварительно нагруженных этим хелатором, мы предполагали выяснить, связана ли смерть клеток, индуцированная алюминием, с внутриклеточным фондом кальция.

Для выяснения того, какую роль играет уровень АФК в токсическом действии алюминия, мы провели эксперименты с М-ацетилцистеином, известным ангиоксидантом, способным проникать через клеточную мембрану и снижать внутриклеточный уровень АФК.

Рис. 5. Алюминий вызывает рост флуоресценции СОСК и Пио-З АМ в нормальных условиях и в бескальциевой среде. А и В - флуоресценция СБСР, Б и Г - флуоресценция Пио-З АМ. 1 - контроль, 2 - в присутствии 100 мкМ А!С13. А и Б - нормальная среда, В и Г - в отсутствие кальция во внешней среде

Рис. 6. Влияние хлористого алюминия на флуоресценцию Пио-З АМ (слева) и

Р1 (справа) в нейронах, инкубированных в течение 60 мин с разными концентрациями А1С13. Белые столбики - инкубация в нормальных условиях; черные столбики - в присутствии 10 мкМ ВАРТА

70 ■] 60 ■ 50 • гЬ * гЬ *

40 - 30 ■

20 ■ —ЭЕ—!

10 • 0 ■ Г гП

Контроль «1

Рис. 7. Уровень флуоресценции СТКТ (отн. ед., белые столбики) и процент мертвых клеток (отн. ед., серые столбики) в суспензии нейронов в контроле и после 30 мии инкубации с 1Ч-ацетилцистеином (НАС, 5 мМ) и хлористым алюминием (А1С1}, 100 цМ) (по отдельности или совместно, как указано).

Инкубация 30 мин при 37°С. Знак «*» соответствует достоверному отличию результатов от контроля (р<0,05)

Для выяснения того, не возникают ли во фракции живых клеток условий для индукции апоптоза, мы проводили одновременное окрашивание клеток флуоресцентными красителями на апоптоз (аннексии V) и некроз (Р1). Для оценки возможности развития апоптоза был использован тест, позволяющий выявить клетки на стадии индукции программируемой клеточной смерти (Болдырев, 2000; Самуилов и др., 2000). Как следует из рис. 9, где ордината соответствует интенсивности окраски клеток иодистым пропидием (некроз), абсцисса -интенсивности окраски клеток аннексином V (ранние стадии апоптоза), под влиянием инкубации с хлористым алюминием клетки перемещаются «вверх» по оси мечения иодистым пропидием. При этом при низкой концентрации А1С13 (50 мкМ) некротические клетки концентрируются в квадранте 01, а при высокой концентрации А1С13 (100 мкМ) - в квадранте 02, что соответствует развитию легкого или тяжелого некроза соответственно (Болдырев, 2000).

Таблица 2. Влияния хлористого алюминия на измеряемые параметры ______(инкубация 60 мин, яри 3?С).__

Коцентрация АЮз Флуоресценция Флуоресценция Флуоресценция

01ВАС,(3) Р1иоЗ АМ С1КК

0 9 4 ±0 47 40*02 11 ±055

ЮОмкМ 13±0 65 46*023 151-0 75

200 мкМ 20 ± 1 0 6 4 ± 0 32 32 ± I 6

500 мкМ 38 ±19 18 3 ±092 57 ±2 85

В процессе выполнения описанных экспериментов мы измеряли долю мертвых клеток, выявляемую по окраске с Р1. Обнаружилось, что инкубация клеток с А1С13 увеличивает их окрашиваемость иодистым пропидием пропорционально времени инкубации, причем флуоресценция СЕО живых клеток снижается (рис 8). Это позволяло заключить, что даже незначительные накопления алюминия внутри клетки приводят к подавлению ее жизнедеятельности В этих условиях нам казалось важным установить путь, по которому осуществлялась смерть клеток.

г; о ¡а

7 и '

М -|

> и ]

40 ^

I -!

1П -

'1 -

контроль бОмин 180мпн

Время инкубации

Рис. 8. Влияние хлористого алюминия на генерацию АФК и окрашивание клеток йодистым пропидием при разных временах инкубации (черные столбики - флуоресценция ОХЖ белые - флуоресценция Р1, усл. ед.)

Таким образом, даже кратковременная инкубация клеток в среде с А1С13 вызывает у них некротические изменения. Это указывает на высокую токсичность А1С13 для живых организмов, опасность которой будет неуклонно возрастать при длительной инкубации даже с низкими концентрациями А1С13 или при длительном времени экспозиции.

IV. Экзайтотоксическое действие алюминия

При активации нейронов ЫМБА происходит генерация АФК, и клетки выходят на новый стационарный уровень функционирования. ЫМПА является медиатором глутаматных рецепторов, которые играют важную роль в выполнении когнитивных функций мозга (>Ые^ааг<1 е1 а1, 2002). Известно, что «перегрузка» ЫМЭА рецепторов медиатором приводит к так называемому экзайтотоксическому эффекту - возникают условия окислительного стресса, приводящего к гибели нейронов и повреждению функций мозга. Мы обнаружили, что алюминий усиливает токсичность КМЭА, и совместное присутствие в среде обоих факторов вызывает кумулятивное возрастание уровня АФК, приводящее к клеточной смерти (рис 10 и таблица 3).

«у

мз

«2

J1"

W TO* itP TV

»1 02

0$ 04

П.1ЦЮ Копроль

R.1LOQ aisohxm «Ома

to»

■В4

FLtLOQ

АПООмй! CO МП

в1®"! S

-¡«S

aiun JUSOmkU 90 mb

wii— <1 а

if •■■чи-1 4 |Г"Тв»"Ч

FL1LOQ

AIIOOmcM »Ома

Рис. 9. Определение типа гибели нейрональных клеток с помощью двойного мечення - иодидом пропидия (FL3 LOG) н аннексином V (FL1 LOG)

Способность алюминия усиливать ответ нейронов на ЫМБА означает, что накопление алюминия в тканях мозга будет представлять собой постоянный фактор риска, создающий угрозу нормальному функционированию нейронов.

3 5,

jlxXm—,

Контроль AIÍ33 -1533 - t.r IDA

T i

Рис. 10. Токсическое действие алюминия на нейроны, стимулированные NMDA. Концентрации NMDA 500 мкМ, концентрация А1С13 - 500 мкМ (инкубация 60 мин при 37х)

Наши данные объясняют описанную в литературе корреляцию между уровнем алюминия в окружающей среде и риском нейродегенеративных заболеваний (Gupta, 2005).

Таблица 3.Смертность клеток в присутствии хлористого алюминия и NUDA (инкубация 60 мин при

____згд._

Концентрация AlClj и NMDA Смертность клеток, % Достоверность отлнчнй 4 отЗ

1 Контроль 0

2 500 мкМ NMDA 3

3 5OOmkMAICIj 35

4 А1П, 4 NMDA 53 р<0.05

Таким образом, из представленных данных вытекает, что токсическое действие алюминия будет наиболее опасно для активно функционирующих нейронов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Инкубация клеток с хлористым алюминием приводит к его быстрому накоплению во внутреннем пространстве клеток. В результате этого при инкубации нейронов и тимоцитов с хлористым алюминием наблюдается изменение расположения клеток в координатах прямого и обратного рассеивания при анализе на проточном цитометре. Этот эффект алюминия имеет отчетливую временную и

концентрационную зависимость, причем тимоциты более чувствительны к алюминию.

Как в бескальциевой, так и в безнатриевой среде токсическое действие алюминия не претерпевает заметных изменений. Это позволяло заключить, что обнаруженный нами осмотический эффект алюминия не опосредован внеклеточными ионами кальция или натрия, а развивается независимо. В процессе выполнения описанных экспериментов мы проводили измерение доли мертвых клеток, выявляемых по окраске с Р1 и обнаружили, что инкубация клеток с А1С13 увеличивает их окрашиваемость иодистым пропидием, что отражает создание в клетках условий для некротической смерти.

При инкубации нейронов с хлористым алюминием выявляется рост внутриклеточной флуоресценции СЕКТ и Р1ио-3 АМ, которые считаются маркерами на АФК и свободные ионы кальция. При добавлении в пробы нарастающей концентрации алюминия А1С1ч (50 мкМ - 5 мМ) флуоресценция СОСР и Р1ио-3 АМ увеличивалась, что должно было соответствовать увеличению количества АФК и внутриклеточного кальция. Одновременно наблюдалась некротическая гибель клеток. Для выяснения роли внеклеточного кальция в токсическом эффекте хлористого алюминия мы провели аналогичные эксперименты в среде с удалением ионов кальция из инкубационной среды. Эти опыты показали, что как в нормальных условиях, так и в бескальциевой среде эффект алюминия не претерпевает заметных изменений. Мы заключили, что обнаруженный нами токсический эффект хлористого алюминия развивается независимо от внеклеточного кальция.

Для выяснения того, какую роль играет внутриклеточный кальций в токсическом феномене алюминия, мы провели аналогичные эксперименты с внутриклеточным кальциевым буфером ВАРТА. Обнаружилось, что клетки, выдержанные 30 мин с 10 мкМ ВАРТА и использованные вслед за этим в опытах с А1СЬ, продолжают генерировать флуоресцентный сигнал Р1ио-3 АМ. Это привело нас к выводу, что наблюдаемый нами сигнал отражает увеличение концентрации в клетках алюминия, а не ионов кальция.

В ходе выполнения описанных экспериментов мы проводили измерения мертвых клеток, выявляя их по окраске Р1. Обнаружилось, что инкубация клеток с А1С13 увеличивает окрашивание клеток йодистым пропидием. При этом доля мертвых клеток не зависела от присутствия ВАРТА, позволяя заключить, что этот эффект алюминия не опосредован уровнем внутриклеточного кальция, а отражает его собственное юксическое действие.

Для выяснения того, какую роль играет уровень АФК в токсическом действии алюминия, мы провели эксперименты с Ы-ацетилцистеином. В клетках, предварительно нагруженных ЫАС, сигнал СЕКТ действительно уменьшался, демоне грируя, что он определяется внутриклеточным уровнем АФК. Однако на смершостм клеток присутствие антиоксиданта не отражалось Это свидетельствует, что хотя клетки при инкубации с алюминием генерируют повышенный уровень АФК, свободные радикалы не являются основной причиной

клеточной смерти. При инкубации клеток с хлористым алюминием наблюдаете« рост внутриклеточного уровня АФК и деполяризация клеточной мембраны. При этом одновременно наблюдается увеличение процента мертвых клеток. Флуоресценция Fluo-3 AM, DiBAC4(3) и CDCF нарастает примерно одинаковыми темпами, это демонстрирует наличие общей причины, вызывающей эти процессы -накопления алюминия внутри клеток.

По-видимому, даже незначительное накопление алюминия внутри клетки способно вызывать резкую деполяризацию мембраны и вызывать изменения, которые способствуют клеточной смерти. Для выяснения того, не создает ли алюминий в живых клетках условий для индукции программированной клеточной смерти (апоптоза), мы применили метод двойного окрашивания клеток флуоресцентными красителями - на апоптоз (аннексии V) и некроз (PI). Под влиянием инкубации с хлористым алюминием клетки перемещаются «вверх» по оси PI (что соответствует развитию некроза), хотя не метятся аннексиноч V. Это привело нас к заключению, что прямое токсическое действие алюминия на клетки вызывает их смерть по пути некроза, а не апоптоза.

Известно, что активация нейронов NMDA вызывает в них генерацию АФК. Мы обнаружили, что алюминий усиливает токсичность NMDA. Способность алюминия усиливать ответ нейронов на NMDA означает, что накопление алюминия в тканях мозга будет представлять собой постоянный фактор риска, создающий угрозу нормальному функционированию нейронов.

Накопление алюминия внутри клетки вызывает некротическую гибель клеток При этом тимоциты более чувствительны к алюминию, чем нейроны, что может отражать большую опасность примесей алюминия для развивающихся организмов, поскольку за период эволюции живые организмы не выработали систем выведения алюминия из организма.

В экспериментальных условиях увеличение концентрации алюминия в питьевой воде с 0,15 мг/л до 0,40 мг/л приводит к значительной смертности животных в популяции. Для человека известно, что возрастание примеси алюминия с 0,02 мг/л до 0,11 мг/л увеличивает частоту возникновения болезни Альцгеймера. По стандартам «The USA Environmental Protection Agency» (US EPA) максимальная концентрация алюминия в питьевой воде не должна превышать 0,05 мг/л. Всемирная организация здравоохранения считает верхним пределом содержание алюминия в питьевой воде в дозе 0,2 мг/л. Эксперименты на животных показали, что употребление алюминия в дозе 2-10 мг на кг в день приводит к неполноценному росту потомства, ухудшению обучаемости, уменьшению размера животных и увеличению хрупкости их костей (Ferro et al, 1990).

Сопоставление дозовых зависимостей токсикантов in vivo с их концентрациями, применяемыми in vitro всегда вызывает затруднения, однако, имея в виду способность алюминия концентрироваться в тканях почти со 100-кратным превышением (Ferro et al, 1990), можно полагай., что накопление алюминия в организме в экстремальных условиях может создавать в тканях мозга концентрации, достигающие 200 мкМ, что по нашим данным является опасным

даже в условиях острого опыта Систематическое действие алюминия в условиях его накопления в тканях мозга безусловно может прямо вызывать нейродегенеративные изменения, а также демонстрировать токсическое действие на NMDA-рецепторы. Все это делает необходимым как выработку новых чувствительных подходов к оценке токсичности алюминия, так и исследование способов защиты организма от его повреждающего действия на клетки нервной и иммунной систем.

ВЫВОДЫ

1. Охарактеризованы свойства нейронов и тимоцитов грызунов с помощью проточной цитометрии.

2. Показано токсическое действие алюминия на нейроны и тимоциты мышей, заключающееся в увеличении осмотической активности клеток (увеличение размеров клеток и возрастание их гранулярности).

3. Эффект А1С13 сопровождается ростом АФК, изменением деполяризации мембранного потенциала и увеличением окраски клеток иодистым пропидием.

4. В используемых экспериментальных условиях смерть клеток, индуцируемая алюминием, является по своей природе некротической, а не апоптозной.

5. Тимоциты более чувствительны к токсическому действию алюминия, чем нейроны.

6. Алюминий увеличивает нейротоксический эффект NMDA, создавая предпосылки для нейродегенеративных заболеваний.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Тунева Е., Давыдова О., Болдырев А. // Влияние NMDA на генерацию активных форм кислорода лимфоцитами человека.- Бюлл. Эксп. Биол. Мед.- 2003.- Т. 136. С.184-186.

2. Boldyrev A., Kazey V., Leinsoo Т., Mashkina A., Tyulina О., Johnson P., Tuneva J., Chittur Sh., Carpenter D. // Rodent lymphocytes express functionally active glutamate receptors.- Biochem. Biophys. Res. Commun. -2004,-V. 324. P. 133-139.

3. Болдырев A.A., Тунева E.O. // >(-Метюй)-аспартат стимулирует генерацию активных форм кислорода и активирует каспазу-3 в лимфоцитах мышей.- Биол. мембраны.- 2005,- Т. 22, С. 142-145.

4. Kazey V., Tuneva Е., Boldyrev A. Production of reactive oxygen species by ' cerebellum granule cells isolated from senescence accclcrated mice. In1 The

Senescence-Accelerated Mouse (SAM): an animal model of senescence (Nomura Y., Ed.), Elsevier, 2004, c. 245-249.

5. Тунева Е., Бирман И., Карпентер Д., Болдырев А. // Токсический эффект алюминия на гранулярные клетки мозжечка и тимоциты мышей.-Нейрохимм. -2005.- Т. 22, С. 1-6.

6. 6. Tuneva J., Chittur Sh., Boldyrev A., Binnan I., Carpenter D. Cerebellar granule cell death induced by aluminum. Neurotox. Res.-2005-. (submitted).

7. Boldyrev A., Tuneva E., Johnson P., Caipenter O. // Effect of NMDA on generation of reactive oxygen species in human leucocytes. J. Neurochem.-2004.- V. 90. P. 123.

8. Birman I., Tuneva J. // High turbidity events: chemical intrusion and potential public health consequences. 2nd Annual New York City watershed science and technical Conference, N-Y, USA (2004).

9. Tuneva J., Carpenter D., Birman I., Boldyrev A. // Effect of aluminum on neurons and thymocytes in mice determined by the cytometry approach. Int. Academic and practical SUNY - MSU Conference "People and environment", Moscow, Russia (2004).

Тунева Елена Олеговия «Исследование токсического действии алюминия на нейроны и тимоциты мышей»

В работе исследован нейротоксический эффект алюминия на гранулярные клетки мозжечка и тимоциты мышей С помощью проточной цитометрии В клетках было измерены стационарные уровни активных форм кислорода и ионизированного кальция, а также величины мембранного потенциала. Инкубация гранулярных клеток мозжечка и тимоцктов с 25-500 мкМ А1С13 вызывает дозо-мвисиыый осмотический эффект, проявляющийся в увеличении размеров и гранулярности клеток Осмотический эффект не связан с внеклеточным фондом ионов натрия или кальция Действие алюминия сопровождается ростом АФК внутри клеток и клеточной смертью, которая не снижается М-ацетилцнстеином. Основной причиной вызываемой алюминием некротической гибели клеток является дестабилизация мембранного потенциала. Алюминий увеличивает токсическое действие М-мстил-Озслартата при инкубации нейронов с обоими лигандами Тимоциты более чувствительны к токсическому действию алюминия.

Elena О. Tuneva «Toifc effects of aluminum ions on nrix and neurons thymocytes»

Neurotoxic effect of aluminum on cerebellum granule cells and thymocytes of mice was studied using flow cytometry approach Stationary levels of reactive oxygen species and ionized calcium as well as membrane potential weir measure in the cells after incubation with 25-500 мкМ AlClj. Aluminum was found to induce dose-dependent effect of osmotic activation resulted in increase in celt size and granularity. This effect was not related to extracellular sodium or calcium pools but was accompanied with rise in the levels of reactive oxygen species At the same time, aluminum induced cellular death which was not prevented by N-acetylcysteine The main reason of Al-induced necrotic cellular death was destabilization of membrane potential. Addition of aluminum to the medium containing excitotoxic ligand N-tnethyl-D-aspartic acid increased its toxic action on the neurons. In all experiments, thymocytes were more sensitive to aluminum than neurons.

Подписано в печать 3, Х(. Формат 60x84/16. Тираж 400 экз. Усл. печ. л. .Заказ

Типография Издательства РУДН 117923, ГСП-1, г. Москва, ул. Орджоникидзе, д. 3

P2064I

РНБ Русский фонд

2006-4 22309

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тунева, Елена Олеговна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Цель и задачи исследования.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Положения, выносимые на защиту.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Химия алюминия.

Глава 2. Источники алюминия.

Глава 3. Содержание алюминия в пищевых продуктах.

Глава 4. Токсические эффекты алюминия.

Токсический эффект алюминия на растения.

Токсический эффект алюминия на рыб.

Влияние алюминия на другие водные организмы.

Влияние алюминия на млекопитающих.

Токсический эффект алюминия на человека.

Глава 5. Предполагаемые заболевания, вызываемые алюминием.

Глава 6. Модели исследования действия алюминия на живые системы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 1. Получение клеточных препаратов.

Глава 2. Проточная цитометрия.

Распределение клеток по размерам и гранулярности.

Определение количества мертвых клеток.

Определение внутриклеточного уровня АФК.

Определение уровня цитоплазматического калымя.

Определение мембранного потенциала.

Протокол эксперимента. ф

Глава 3. Обработка экспериментальных результатов.

4 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 1. Характеристика клеток с помощью проточной цитометрии.

Глава 2. Влияние АЮз на размеры и гранулярность нейронов и тимоцитов.

Глава 3. Влияние хлористого алюминия на уровень внутриклеточного кальция и

АФК в нейронах и тимоцитах.

Глава 4. Мембранный потенциал и смертность клеток.

Глава 5. Экзайтотоксическое действие алюминия.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование токсического действия алюминия на нейроны и тимоциты мышей"

Алюминий является одним из самих распространенных металлов на земле. Алюминий широко представлен в окружающей среде, и все живые существа поглощают его с пищей. При этом зачастую наблюдается накопление алюминия в тканях, поскольку в живых клетках не выработалось специфических систем, способных к его экскреции.

Проблема безопасности употребления алюминия с пищей или водой давно беспокоит людей. Накопление алюминия в организме интенсивно изучается, и существующие факты свидетельствуют о том, что этот процесс в мозге может сопровождать возникновение и развитие таких нейродегенеративных заболеваний, как болезнь Альцгеймера и паркинсонизм (Crapper et al, 1976; Trapp et al, 1978; Graves et al, 1990).

В то же время, представления о токсичности алюминия для организма человека до сих пор неоднозначны. Для людей, живущих в областях с повышенным содержанием алюминия в окружающей среде, обнаружена корреляция между содержанием алюминия в воде и частотой проявления болезни Альцгеймера (БА) (Martyn et al. 1989; Forbes et al. 1992).

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы явилось количественное исследование токсического действия хлористого алюминия на клетки нервной и иммунной систем в условиях in vitro.

Для выполнения этой цели нами были поставлены следующие задачи: 1) Описать свойства нейронов и тимоцитов с помощью проточной цитометрии; 2) Охарактеризовать действие алюминия на нейроны и тимоциты грызунов; 3) Оценить токсический эффект хлористого алюминия на мембраны клеток и внутриклеточный уровень активных форм кислорода (АФК); 4) Охарактеризовать вид клеточной смерти, индуцируемой хлористым алюминием; 5) Сопоставить чувствительность тимоцитов и нейронов к токсическому действию хлористого алюминия; 6) Провести оценку взаимного влияния на нейроны алюминия и агониста глутамата N-метил-Э-аспартата (NMDA), вызывающего экзайтотоксическое действие на глутаматергические структуры

Научная новизна и практическая ценность работы

В работе впервые продемонстрирован токсический эффект низких концентраций алюминия (100 мкМ и ниже) на гранулярные клетки мозжечка и тимоциты 10-15 дневных мышей линии ICR. Методом проточной цитометрии прямо продемонстрировано изменение гранулярности и размеров клеток, а также повышение внутриклеточного уровня активных форм кислорода и деполяризация клеточной мембраны под влиянием хлористого алюминия. Эти эффекты развиваются весьма быстро и кореллируют с концентрацией алюминия, добавленного в инкубационную среду.

Выяснено, что тимоциты более чувствительны к токсическому действию алюминия, чем гранулярные клетки мозжечка. Пороговой концентрацией А1С1з для тимоцитов является 25 мкМ, а для нейронов - 50 мкМ. Показано, что генерация АФК внутри клеток под воздействием алюминия подавляется антиоксидантом N-ацетилцистеином (NAC), при этом NAC не защищает клетки от гибели, следовательно, АФК не являются непосредственной причиной клеточной смерти. Мы обнаружили, что токсический эффект алюминия заключается в нарушении целостности клеточных мембран и массовой гибели клеток по пути некроза.

Нами также продемонстрировано увеличение флуоресцентного сигнала Fluo-3 AM, пропорциональное концентрации А1С13, но не подавляемое внутриклеточным кальциевым буфером ВАРТА. Флуоресцентный сигнал, измеряемый внутри клетки с помощью Fluo-3 AM в присутствии Са-комплексона ВАРТА, отражает накопление алюминия внутри клеток и может использоваться для его количественного определения в внутриклеточном пространстве.

В работе продемонстрировано усиление алюминием токсического действия NMDA. Это подтверждает представления о способности алюминия индуцировать или усиливать нейродегенеративные заболевания, в основе которых лежат экзайтотоксические процессы, вызываемые нарушениями функционирования глутаматергической щ» системы. Результаты диссертации важны для исследования молекулярных механизмов нарушения метаболизма у организмов, живущих в среде с повышенным содержанием алюминия.

Положения, выносимые на защиту

В работе продемонстрирован токсический эффект хлористого алюминия на тимоциты и нейроны мозжечка мышей в условиях острого опыта. Кратковременная инкубация клеток с AICI3 вызывает осмотический эффект, выражающийся в увеличении размеров и гранулярности клеток, а также приводящий к падению мембранного потенциала и клеточной смерти по пути некроза.

При инкубации клеток с хлористым алюминием наблюдается усиление внутриклеточной продукции свободных радикалов, хотя проникающий в клетки природный антиоксидант N-ацетилцистеин вызывает снижение стационарного уровня АФК, но не защищает клетки от действия AICI3. Одновременно продемонстрировано усиление алюминием экзайтотоксического эффекта NMDA на нейроны головного мозга. Это позволяет считать алюминий фактором риска нейродегенеративных процессов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Тунева, Елена Олеговна

выводы

1. Охарактеризованы свойства нейронов и тимоцитов грызунов с помощью проточной цитометрии.

5. Тимоциты более чувствительны к токсическому действию алюминия, чем нейроны.

БЛАГОДАРНОСТИ

Я глубоко признательна своему научному руководителю Александру Александровичу БОЛДЫРЕВУ за внимание и чуткое отношение на протяжении всего процесса моего формирования в качестве самостоятельного исследователя.

Я благодарна сотрудникам лаборатории клинической нейрохимии Института неврологии РАМН Сергею Львовичу СТВОЛИНСКОМУ, Татьяне Николаевне ФЕДОРОВОЙ за ценные советы при постановке эксперимента и обсуждении их результатов и, конечно, Людмиле Тихоновне ПУЧКОВОЙ за помощь и моральную поддержку.

Спасибо моим преподавателям за профессиональную подготовку.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Инкубация клеток с хлористым алюминием приводит к его быстрому накоплению во внутреннем пространстве клеток. В результате этого при инкубации нейронов и тимоцитов с хлористым алюминием наблюдается изменение расположения клеток в координатах прямого и обратного рассеивания. Осмотический эффект алюминия имеет отчетливую временную и концентрационную зависимость, причем тимоциты более чувствительны к алюминию, чем нейроны.

Как в бескальциевой, так и в безнатриевой среде эффект алюминия не претерпевает заметных изменений. Это позволяет заключить, что обнаруженный нами осмотический эффект алюминия не опосредован внеклеточными ионами кальция или натрия, а развивается независимо. В процессе выполнения описанных экспериментов мы проводили измерение доли мертвых клеток, выявляемых по окраске с PI. Обнаружилось, что инкубация клеток с AICI3 увеличивает окрашиваемость клеток иодистым пропидием, что означает проявление условий для развития некроза.

При инкубации нейронов с хлористым алюминием обнаруживается рост внутриклеточной флуоресценции CDCF и Fluo-3 AM, которые считаются маркерами на АФК и свободные ионы кальция. При добавлении в пробы нарастающей концентрации алюминия А1С1з (50 мкМ - 5 мМ) флуоресценция CDCF и Fluo-3 AM увеличивалась, что должно было соответствовать увеличению количества АФК и внутриклеточного кальция. Одновременно наблюдалась некротическая гибель клеток. Для выяснения роли внеклеточного кальция в токсическом эффекте хлористого алюминия мы провели аналогичные эксперименты в среде с удалением ионов кальция из инкубационной среды и выяснили, что как в нормальных условиях, так и в бескальциевой среде эффект алюминия не претерпевает заметных изменений. Эти опыты позволили заключить, что обнаруженный нами токсический эффект хлористого алюминия развивается независимо от внеклеточного кальция.

Для выяснения того, какую роль играет внутриклеточный кальций в токсическом феномене алюминия, мы провели аналогичные эксперименты с внутриклеточным кальциевым буфером ВАРТА. Обнаружилось, что клетки, выдержанные 30 мин с 10 мкМ ВАРТА и использованные вслед за этим в опытах с AlCl3i продолжают генерировать флуоресцентный сигнал Fluo-3 AM. Это привело нас к заключению, что наблюдаемый нами сигнал отражает увеличение концентрации в клетках алюминия, а не ионов кальция.

В ходе выполнения описанных экспериментов мы проводили измерения мертвых клеток, выявляя их по окраске PI. Обнаружилось, что инкубация клеток с AICI3 увеличивает окрашивание клеток йодистым пропидием. При этом доля мертвых клеток не зависела от присутствия ВАРТА, что позволило заключить, что обнаруженный нами эффект алюминия не опосредован уровнем внутриклеточного кальция, а отражает его собственное токсическое действие.

Для выяснения того, какую роль играет уровень АФК в токсическом действии алюминия, мы провели эксперименты с N-ацетилцистеином. В клетках, предварительно нагруженных N-ацетилцистеином, сигнал CDCF действительно уменьшался, демонстрируя, что он определяется внутриклеточным уровнем АФК. Однако на смертности клеток присутствие антиоксиданта не отражалось. Это свидетельствует, что хотя клетки при инкубации с алюминием генерируют повышенный уровень АФК, свободные радикалы в наших условиях не являются основной причиной клеточной смерти.

При инкубации клеток с хлористым алюминием наблюдается не только рост внутриклеточного уровня АФК, но и деполяризация клеточной мембраны. При этом одновременно наблюдается увеличение процента мертвых клеток. Флуоресценция Fluo-3 AM, DiBAC4(3) и CDCF нарастает примерно одинаковыми темпами, это демонстрирует наличие общей причины, вызывающей эти процессы - накопления алюминия внутри клеток.

По-видимому, даже незначительное накопление алюминия внутри клетки способны вызывать генерацию АФК и резкую деполяризацию мембраны. Все эти изменения и способствуют клеточной смерти. Для выяснения того, по какому пути осуществляется гибель клеток, мы одновременно применили 2 флуоресцентных красителя - на апоптоз (аннексии V) и некроз (PI). Под влиянием инкубации с хлористым алюминием клетки перемещаются по оси PI, а не по оси аннексина V, что соответствует развитию некроза, а не апоптоза.

Накопление алюминия внутри клетки вызывает некротическую гибель клеток. При этом тимоциты более чувствительны к алюминию, чем нейроны, что может отражать большую опасность примесей алюминия для развивающихся организмов, поскольку за период эволюции живые организмы не выработали систем выведения алюминия из организма.

В экспериментальных условиях увеличение концентрации алюминия в питьевой воде с 0,15 мг/л до 0,40 мг/л приводит к значительной смертности животных в популяции. Для человека известно, что возрастание примеси алюминия с 0,02 мг/л до 0,11 мг/л увеличивает количество заболевших болезнью Альцгеймера (Good, 1992; Gauthier, 2000). По стандартам «The USA Environmental Protection Agency» (US EPA) максимальная концентрация в питьевой воде не должна превышать 0,05 мг/л. Всемирная организация здравоохранения считает верхним пределом содержания алюминия в питьевой воде 0,2 мг/л. Эксперименты на животных показали, что употребление алюминия в дозе 2-20 мг/кг в день приводит к появлению неполноценного потомства, уменьшению размера и увеличению хрупкости костей, а также вызывает проблемы с обучением (Ferro et al, 1990; Forbes, 1998; Flaten, 2001, Abd-Elghaffar 2005).

Сопоставление дозовых зависимостей in vivo с применяемыми концентрациями in vitro всегда вызывает затруднения, однако, имея в виду способность алюминия концентрироваться в тканях почти со 100-кратным превышением, можно полагать, что накопление алюминия в организме в экстремальных условиях может создавать в тканях мозга концентрации, достигающие 200 мкМ, что по нашим данным является опасным даже в условиях острого опыта. Систематическое действие алюминия в условиях его накопления в тканях мозга, безусловно, может вызывать токсическое действие на NMDA-рецепторы, а также прямо вызывать нейродегенеративные изменения. Все это делает необходимым как выработку новых чувствительных подходов к оценке токсичности алюминия, так и исследование способов защиты организма от его повреждающего действия на клетки нервной и иммунной систем.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тунева, Елена Олеговна, Москва

1. Болдырев А.А., 2000, Дискриминация между апоптозом и некрозом нейронов под влиянием окислительного стресса. Биохимия, 65: 981-990.

2. Болдырев А.А., Тунева Е.О., 2005, N-Метил-О-аспартат стимулирует генерацию активных форм кислорода и активирует каспазу-3 в лимфоцитах мышей. Биол. мембраны, 22": 142-145.

3. Самуилов В.Д., Олескин А.В., Лагунова Е.М., 2000, Программируемая клеточная смерть. Биохимия, 65: 1029-1046.

4. Скулачев В.П., 2001, Явления запрограммированной смерти. Митохондрии, клетки и органы: Роль активных форм кислорода. Сор. Обр. Ж-л, 7, 6:4-11.

5. Abd-Elghaffar S.K., El-Sokkary G.H. and Sharkawy A.A., 2005, Aluminum-induced neurotoxicity and oxidative damage in rabbits: Protective effect of melaonin. J. Alzheimers Dis. 7(4):273-84.

6. Abreo K., Glass J., and Sella M.L., 1990, Aluminum inhibits haemoglobin synthesis but enhances iron uptake in Friend erythroleukemia cells. Kidney Int., 37:677-681.

7. Ahn H.W., Fulton В., Moxon D., and Jeffery E.H., 1995, Interactive effect of fluoride and aluminum uptake and accumulation in bones of rabbits administred both agents in their drinking water. J. Toxicol. Environ. Health, 44: 337-350.

8. Akeson M.A., and Munns D.N., 1990, Uptake of Aluminum into root cytoplasm: predicted rates for important solution complexes. J. Plant Nutr., 13: 467-484.

9. Alfrey A.C., LeGendre G.R., and Kachny W.D., 1976, The dialysis encephalopathy syndrome: possible aluminum intoxication. N. Engl. J. Med., 294: 184-188.

10. Alshuaib W.B., Cherian S.P., Hasan M.Y., and Fahim M.A., 2003, Drug effects on calcium homeostatsis in mouse CA1 hippocampal neurons. Intern. J. Neuroscience, 113: 1317-1332.

11. Baker J.P., Schofield C.L., 1982, Aluminum toxicity to fish in acidic waters. Water air Soil Pollut., 18: 289.

12. Batra K., Taneja O.P., and Khemali L.D., 1994, Acute oral toxicity of aluminum phosphide in male albino rats (Wistar). Bull. Environ. Contam. Toxicol., 52: 662-666.

13. Beisinger K.E., and Christensen G.M., 1972, Effects of various metals on survival, growth, reproduction and metabolism of Daphnia magna. J. Fish. Res. Bd. Canada, 29: 1691-1700.

14. Bertholf R.L., Nicholson J.R.P., Wills M.R., and Savory J., 1987, Measurement of lipid peroxidation products in rabbit brain and organs (response to aluminum exposure). Ann. Clin. Lab. Sci., 17: 418-423.

15. Boldyrev A.A., Song R., Dyatlov V.A., and Lawrence A.D., 1999, Neuronal Cell Death and Reactive Oxygen Species. Cellular and Molecular Neurobiolology, 20: 433-449.

16. Bondy S.C., Ali S.F., and Guo-Ross S., 1998, Aluminum but not iron treatment induces pro-oxidant events in the rat brain. Mol. Chem. Neuropathol., 34: 219-232.

17. Buergel P.M., and Soltero R.A., 1983, The distribution and accumulation of aluminum in rainbow trout following a whole lake treatment. J. Freshwater ЕсоЦ2: 37-44.

18. Burton T.M., and Allan J.W., 1986, Influence of pH, aluminum, and organic matter on stream inverterbrates. Can. J. Fish. Aquat. Sci., 43: 276-282.

19. Campbell A., and Bondy, S.C., 2000, Aluminum induced oxidative events and its relation to inflammation: a role for the metal in Alzheimer's disease, Cell Mol. Biol., 46: 721-730.

20. Campbell A., Smith M.A., Sayre L.M., Bondy S.C., and Perry G., 2001, Mechanisms by which metals promote events connected to neurodegenerative diseases. Brain Res. Bull., 55: 125-132.

21. Candy J.M., Oakley A.E., Klinowski J., Carpenter T.A., Perry R.H., Atack J.R., Perry E.K., Blessed G., Fairbairn A., and Edwardson J.A., 1986, Aluminosilicates and senile plaque formation in Alzheimer's disease. Lancet. 1: 354-357.

22. Carpenter D.O., Stoner C.R.T., and Lawrence D.A., 1997, Flow Cytomertric Measurement of Neuronal Death Triggered by PCBs. Neurorotox., 18: 507-514.

23. Carpenter D., Johnson P., and Boldyrev A., 2002, NMDA receptors and the molecular mechanisms of excitotoxicity, in Oxidative Stress at Molecular, Cellular and Organ Levels. Eds. Research Signpost. Trivandrum. pp. 77-88.

24. Carpenter D., Stoner C.R., and Lawrence D., 1997, Flow cytometry measurements of neuronal cell death triggered by PCBs. Neurotoxicol., 18: 507514.

25. Cherroret G., Desor D., and Leht P.R., 1994, In vitro effect of aluminum chloride on cholline acetyltrasferase activityof the rat brain during postnatal growth. Bull. Environ. Contam. Toxicol., 52: 487-491.

26. Chmienicka J., Nasiadek M., and Lewandowska-Zyndul E., 1994a, The effect of aluminum chloride on some steps of heme biosnthesis in rats after oral exposure. Boil. Trace Elem. Res., 40: 127-136.

27. Clarkson D.T., 1965, The affect of aluminum and some other trivalent metal cations on cell division in the root apices of Allium сера. Ann. Bot. N. S., 29:309-315.

28. Clarkson E.M., and Sanderson J., 1971, Inhibition of the uptake and longdistance transport of calcium by aluminum and other polyvalent cations. J. Exp. Bot., 22: 837-851.

29. Cochran M., Chawtur V., Jones M. E., and Marshall E. A., 1991, Iron uptake by human reticulocytes at physiologic and sub-physiologic concentration of iron transferrin: the effect of interaction with aluminum transferring. Blood, 77: 2347-2353.

30. Cochran M., Elliott D.C., Brennan P., and Chawtur V., 1990, Inhibition of protein kinase С activation by low concentrations of aluminum. Clin. Chim. Acta, 194: 167-172.

31. Cochran M., Goddard G., and Ludwigson N., 1990, Aluminum absorption by rat duodenum: further evidence of energy-dependent uptake. Toxicol. Lett., 51:287-94.

32. Cramer G.R., and Lauchli A., 1986, Ion activites in solutioninrelation to Na-Ca interaction at the plasmalemma. J. Expt. Bot., 37: 176, 321-330.

33. Crapper D.R., Krishnan S.S., and Quittkat S., 1976, Aluminum,neurofibrillary degeneration and Alzheimer's disease. Brain, 99: 6780.

34. Deloncle R., Guillard O., Clanet F., Courtois P. and Piriou A., 1990, Aluminum transfer through the blood brain barrier as glutamate complex. Possible implication in dialysis encephalopathy. Biol. Elem. Res., 25 39-45.

35. Esparza J.L., Gomez M., Romeu M., Mulero M., Sanchez D.J., Mollol J., and Domingo J.L., 2003, Aluminum-induced pro-oxidant effects in rats : protective role of exogenous melatonin. J. Pineal. Res., 35; 32-39.

36. Exley C., Chappell J.S., and Birchall J.D., 1991, A mechanism of acute aluminum toxicity in fish. J. Theor. Biol., 151: 417-428.

37. Exley C., and Birchall J.D., 1992, The cellular toxicity of aluminium, J. Theoret. Biol., 159: 83-98.

38. Ferro E. F., John R., Orndorff P.E., Kenneth В., and Hiro N., 1990, An evaluation of the levels and toxicity of aluminum in drinking water. Bureau of Public Water Supply Protection Bureau of Toxic Substance Assessment NY state department of Health.

39. Flaten T.P., 2001, Aluminum as a risk factor in Alzheimer's disease, with emphasis on drinking water. Brain Res. Bull., 55: 187-196.

40. Fleming A.L. and Foy C.D., 1968, Root structure reflects differential aluminum tolerance in wheat varieties. Argon. J., 60: 172-176.

41. Forbes W.F., and Hill G.B., 1998, Is exposure to aluminum a risk factor for the development of Alzheimer Disease?—Yes. Arch. Neurol., 55: 740-741.

42. Forbes W.F., Hay ward L.M. and Agwani N., 1992, Geochemical risk factor for mental functioning, based on the Ontario longitudinal study of aging (LSA) I. Results from a preliminary investigation. Canad. J. Aging ,11: 269-289.

43. Garruto R.M., 1991, Pacific paradigms of environmentally-induce neurological disorders: clinical epidemiological and molecular perspectives. Neurotoxicol., 12: 347-378.

44. Gauthier E., Fortier I., Courchesne F., Pepin P., Mortimer J., and Gauvreau

45. D., 2000, Aluminum forms in drinking water and risk of Alzheimer's Disease. Environ. Res., 84: 234-246.

46. Ghribi O., Herman M., and Savory J., 2002, The endoplasmic reticulum is the main site for caspase-3 activation following aluminum-induced neurotoxicity in rabbit hippocampus. Neurosci. Lett., 324: 217-221.

47. Good P.F., Perl D.P., Bierer L.M., and Schmeidler J., 1992, Selective accumulation of aluminum and iron in the neurofibrillary tangles of Alzheimer's disease: a laser microprobe (LAMMA) study. Ann. Neurol., 31: 286-292.

48. Goransson A., and Eldhuset T.D., 1987, Effect of aluminum on growth and nutrient uptake of Betula epndula seedlings. Physiol. Plantarum., 69: 193-199.

49. Graves A.B., White E., Koepsell T.D., Reifler B.V., van Belle G., Larson

50. E.B., and Raskind M., 1990, A case-control study of Alzheimer's disease. Ann. Neurol., 28: 766-774.

51. Greger J.L., 1985, Aluminum content of the American diet. Food Technology, 39: 73-80.

52. Guo G.W., and Liang Y.X., 2001, Aluminum-induced apoptosis in cultured astrocytes and its effect on calcium homeostasis. Brain Res., 888: 221226.

53. Gupta V.B., Anitha S., Hegde M.L., Zecca L., Barruto R.M., Ravid R., Shankar S.K., Stein R., Shanmugavelu P., and Rao K.S.J., 2005, Aluminum in Alzheimer's disease: are we still at a crossroad? Cell Mol. Life Sci., 62: 143-158.

54. Hall R.J., and Likens G.E., 1981, Chemical flux in an acid-stressed stream. Nature, 292: 329-331.

55. Hall R.J., Driscoll C.T., Likens G.E., and Pratt J.M., 1985, Physical, chemical and biological consequences of episodic aluminum additions to a stream. Limnol. Oceanogr., 30: 212-220.

56. Hartwell B.L., and Pember F.R., 1918, The presence of aluminum as a reason for the difference in effect of so-called acid soil on barley and rye. Soil Sci., 6: 259-281.

57. Haugland R.P., 2002, Handbook of fluorescent probes and research products. 9th Edition. Oregon, Molecular Probes, Inc., 965 p.

58. Haynes J., 1988, Principles of Flow Cytometry. Cytometry Suppl., 3: 7-17.

59. Hem S.L., and White J.L., 1989, Pharmaceutical uses of aluminum. In Aluminum and Health, Ed. H.J. Getelman ,. New York: Marcel Decker, pp. 257282.

60. Hong-Jun Fu, Qian-Sheng Hu, Zhong-NingLin, Tie-Ling Ren, Hong Song, Cheng-Keng Cai, and Sheng-Zhang Dong, 2003, Aluminum induced apoptosis in cultured cortical neurons and its effect on SAPK/JNK signal transduction pathway. Brain Res., 980: 11-23.

61. Jagoe C., Haines Т., and Buckler D., 1987, Abnormal gill development in Atlantic salmon (Salmo salar) fry exposed to aluminum of low pH. Annls. Soc. R. Zool. Belg., 117, Suppl. 1: 375-386.

62. Johnson G.V.W., Cogkill K.W., and Jope R.S., 1990, Oral aluminum alters in vitro protein phosphorylation and kinase activities in rat brain. Neurobiol. Aging, 11:209-216.

63. Johnson G.V.W. and Jope R.S., 1990, Oral aluminum alters in vivo protein phosphorylation and kinase activities in rat brain. Neurobiol. Aging, 11:217-226.

64. Johnson V.J., Tsunoda M., Murray T.F., and Sharma R.P., 2005, Decreased membrane fluidity and hyperpolarization in aluminum-treated PC-12 cells correlates with increased production of cellular oxidants. Environ. Toxicol. Pharmacol., 19: 221-230.

65. Kaneko N., Yasui H., Takada J., Suzuki K., and Sakurai H., 2004, Orally administrated aluminum-maltolate complex enhances oxidative stress in the organs of mice. J. Inorg. Biochem., 98: 2022-2031.

66. Khasawnech F.E., 1971, Solution ion activity and plant growth. Soil Sci. Soc. Am. Proc., 35: 426-436.

67. Kinraide T.B., Arnold R.C., and Baligan V.C., 1985, A rapid assay for aluminum phototoxicity at submicromolar concentration. Physiol. Plant, 65: 245250.

68. Kinraide T.B., Parker D.R., 1987, Cation amelioration of aluminum toxicity in wheat. Plant Phys., 83: 546-441.

69. Klein G.L., Berquist W.E., Ament M.E., Coburn J.W., Miller N.L., and Alfrey A.C., 1984, Hepatic aluminum accumulation in children on total parenteral nutrition. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr., 3(5): 740-743.

70. Krasznai Z., Marian Т., Balkay L., Emri M. F., and Tron L., 1995, Flow cytometric determination of absolute membrane potential of cells. J. Photochem. Photobiol., 28: 93-99.

71. Landsberg J.P., McDonald В., and Watt F., 1992, Absence of aluminum in neuritic plaque cores in Alzheimer's Disease. Nature, 360: 65-67.

72. Leivestad H., Jensen E., Kjartansson H., and Xingfu L., 1987, Aqueous speciation о aluminum and toxic effects on Atlantic salmon. Annls. Soc. R. Zool. Belg., 117, Suppl. 1: 387-398.

73. Malte H., 1986, Effects of aluminum in hard, acid water on metabolic rate, blood gas tensions and ionic status in rainbow trout. J. Fish Biol., 29: 187-198.

74. Markesbery W.R., Ehmann W.D., Hossain T.I.M., Alauddi M., and Goodin D.T., 1981, Instrumental neutron activation analysis of brain aluminum in Alzheimer disease and againg. Ann. Neurol., 10: 511-516.

75. Martyn C.N., Coggon D.N., Inskip H., Lacey R.F., Young W.F., 1997, Aluminum concentrations in drinking water and risk of Alzheimer's disease. Epidemiology, 8(3): 281-286.

76. Martyn C.N., Osmond C., Edwardson J.A., Barker D.J.P., Harris E.C., Lacey R.F., 1989, Geographical relation between Alzheimer's Disease and aluminum in drinking water. Lancet, 1: 60-62.

77. McCormic L.H., and Borden F.Y., 1974, The occurrence of aluminumphosphate precipitate in plant roots. Soil Sci., 38: 931-934.

78. McDermott J.R., Smith A.I., Iqbal K., Wisniewski H.M., 1977, Aluminum and Alzheimer's disease. Lancet, 2: 710-711.

79. McDermott J.R., Smith A.I., Iqbal K., Wisniewski H.M., 1979, Brain aluminum in aging and Alzheimer disease. Neurology, 29(6): 809-814.

80. McGregor S.J., Naves M.L., Oria R., Vass J.K., and Brock J.H., 1990, Effect of aluminum on iron uptake and transferring-receptor expression by human erothroleukaemia K562 cells. Biochem. J., 272: 377-382.

81. McLean F.T. and Glbert B.E., 1927, The relative aluminum tolerance of crop plants. Soil Sci., 24: 163-175.

82. Moumen R., Ait-Oukhatar N., Bureau F., Fleury C., Bougie D., Arhan P., Neuville D., and Viader F., 2001, Aluminum increases xanthine oxidase activity and disturbs antioxidant status in the rat. J. Trace Elem. Med. Biol., 15: 89-93.

83. Mundy W.R., Freudenrich Th., and Kodavanti P., 1997, Aluminum potentiates glutamate-induced calcium accumulation and iron-induced oxygen free radical formation in primary neuronal cultures. Molec. Chem. Neuropathol., 32:41-57.

84. Muniz I.P., and Leivestad H., 1980, Acidification effects on freshwater fish. In In Ecological Impact of Acid Precipitation, Ed. Drablos D., and Tollan A., Oslo-As: SNSF, pp. 84-92.

85. Muniz I.P., and Leivestad H., 1980, Toxic effects of aluminum on the brown trout. (Salmo trutta L.). In Ecological Impact of Acid Precipitation, Ed. Drablos, D., and Tollan A., 320-321, SNSF-project.

86. Munoz D.G., 1998, Is exposure to aluminum a risk factor for the development of Alzheimer Disease? Arch. Neurol., 55: 737-739.

87. Nayak P., 2002, Aluminum: impacts and disease. Environ. Res. (Sect. A), 89: 101-115.

88. Nedergaard M., Takano Т., and Hansen A.J., 2002, Beyond the role of glutamate as a neurotransmitter. Nat. Rev. Neurosci., 3: 748-755.

89. Neville C.M., 1985, Physiological response of juvenile rainbow trout, Salmo gairdneri to acid and aluminum — prediction of field responses from laboratory data. Can. J. Fish. Aquat. Sci., 42: 2004-2019.

90. Ohyashiki Т., Satoh E., Okada M., Takadera Т., and Sahara M., 2002, Nerve growth factor protects against aluminum-mediated cell death. Toxicology, 176: 195-207.

91. Okada Y., Oyama Y., Chikahisa L., Satoh M., Kanemaru K., Sakai H., and Noda K., 2000, Tri-n-butyltin-induced change in cellular level of glutathione in rat thymocytes: a flow cytometric study. Toxicol. Lett., 117: 123-128.

92. Ormerod S., Weatherley N., French P., Blake S., and Jones W., 1987, The physiological response of brown trout, Salmo trutta to induced episodes of low pH and elevated aluminum in Welsh hill streem. Annls. Soc. R. Sool. Belg., 117: soppl. 1; 435-447.

93. Oteiza, P., Mackenzie G., and Verstraeten S.V., 2004, Metals in neurodegeneration: involvement of oxidants and oxidant-sensitive transcription factors. Mol. Asp. Med., 25: 103-115.

94. Oteize P.I., Frage C.G., and Keen C.L., 1993, Aluminum has both oxidant and antioxidant effects in mouse brain membranes. Arch. Biochem. Biophys., 300:517-521.

95. Oyama О., Carpenter D.O., Chikahisa L., and Okazaki E., 1996, Flow-cytometric estimation on glutamate- and kainate-induced increases inIintracellular Ca of brain neurons: a technical aspect. Brain Res., 728: 121-124.

96. Perl D.P., 1980, Alzheimer's disease. Science, 208: 297-299.

97. Perl D.P., and Brody A.R., 1980, Alzheimer's Disease: X-ray spectrometric evidence of aluminum accumulation in neurofibrillary tangle-bearing neurons. Science, 208: 297-299.

98. Reite O.B., and Staurnet M., 1987, Acidified water: effect on physiological mechanisms in the gills of salminides. Surface Water acidification Program, Midterm Review Conference, Bergen 22-26; pp. 298-304.

99. Rhue R.D., and Grogan C.O., 1977, Screening corn for Al tolerance of soybean varieties in relation to calcium nutrition. Argron. J., 69: 755-760.

100. Rorison I.H., 1960, Some experiment aspects of the calcicole-calcifuge problem I. The effect of competition and mineral nutrition upon seedling growth in the field. J. Ecol., 48: 585-599.

101. Rorison I.H., 1965, The effect of aluminum on the uptake and inconporation of phosphate by excised sanfoin roots. New phytol., 63: 23-27.

102. Rosseland В., О., 1980, Effects of acid water on metabolism and gill ventilation in brow trout, Salmo trutta L., and brook trout, Salvelinus fontinalis

103. Mitchill. In Ecological impacts of acid precipitation, Ed. Drablos D., and Tollan A., SNSF project.

104. Savory J., Herman M., and Ghribi O., 2003, Intracellular mechanisms underlying aluminum-induced apoptosis in rabbit brain. J. Inorg. Biochem., 97: 151-154.

105. Scholtz C.L., Swash M., Gray A., Kogeorgos J., and Marsh F., 1987, Neurofibrillary neuronal degeneration in dialysis dementia: a feature of aluminum toxicity. Clin. Neuropath., 6: 93-97.

106. Shin K.J., Bae S.S., Hwang Y.A., Seo J.K., Ryu S.H., and Suh P.G., 2000, 2,2',4,6,6'-Pentachlorobiphenyl induces apoptosis in human monocytic cells. Toxicol. Appl. Pharmacol., 169: 1-7.

107. Shin R.W., Lee V.M.Y., and Trojanowski J.Q., 1994, Aluminum modifies the properties of Alzheimer's Disease PHFx proteins in vivo and in vitro. J. Neurosci., 14: 7221-7233.

108. Siegel N., and Haug A., 1983, Calmodulin-independent formation of membrane potential in barley root plasma membrane vesicles: A biochemical model of aluminum toxicity in plants. Physiol. Plant., 59: 285-291.

109. Slanina P., Falkeborn Y., Freeh W., and Cedergren A., 1984, Aluminium concentrations in the brain and bone of rats fed citric acid, aluminum citrate or aluminium hydroxide. Food Chem. Toxicol., 22: 391-397.

110. Staurnes M., Sigholt Т., and Reite O.B., 1984, Reduced carbonic anhydrase and Na-K-ATPase activity in gills of salmonides exposed to aluminum containing acid water. Experientia, 40: 226-227.

111. Tokutake S., Nagase H., Morisaki Sh., and Oyanagi Sh., 1995, Aluminium detected in senile plaques and neurofibrillary tangles is contained in lipofuscin granules with silicon, probably as aluminosilicate. Neurosci. Lett., 185: 99-102.

112. Touam M., Martinez F., Locour В., Bourdon R., Zingraff J., DiGiulio S., and Drueke Т., 1983, Aluminium-induced, reversible microcytic anemia in chronic renal failure: clinical and experimental studies. Clin. Nephrol., 19: 295298.

113. Trapp B.D., Moench M. Т., Pulley E., Barbosa G. Т., and. Griffin J. W., 1987, Spatial segregation of mRNA encoding myelin-specific proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7773-7777.

114. Trapp G.A., 1983, Plasma aluminum is bound to transferrin. Life Sci, 33(4): 311-6.

115. Trapp G.A., 1985, Aluminum binding to organic acids and plasma proteins. Implications for dialysis encephalopathy. J. Environ. Pathol. Toxicol. Oncol., 6(1): 15-20.

116. Trapp G.A., Miner G.D., Zimmerman R.L., Mastri A.R., Heston L.L., 1978, Aluminum levels in brain in Alzheimer's disease. Biol. Psychiatry, 13(6): 709-718.

117. Ulrich В., Mayer R., and Khanna P.K., 1980, Chemical changes due to acid precipitation in a loess derived soil in Central Europe. Soil Sci., 130: 193199.

118. Verkhratsky A., and Toescu E.C., 2003, Endoplasmic reticulum Ca2+ homeastasis and neuronal death. J. Cell. Mol. Med., 7: 351-361.

119. Vierstra R., and Haug A., 1978, The effect of A13+ on the physical properties of membrane lipids in Thermoplasma acidophilum. Biochem. Biophys. Res. Commun., 84(1): 138-143.

120. WHO (World Health Organization). Environmental Health Criteria. Aluminum. Geneva: 1997, 194 p.

121. Witters H., Vangenechten J., Van Puymreoeck S., and Vanderborght O.L.J., 1987, Ionoregulatory and haemotological responses of rainbow trot, Salmo gairdneri to chronic acid and aluminum stress. Annales. Soc. R. Zool. Belg., 117. Suppl. 1:411-420.

122. Wood C.M., and McDonald D., 1987, The physiology of acid aluminum stressing trout. Annls. Soc. R. Zool. Being., 117. Supp. 1: 399-410.

123. Wyllie A.H., and Morris R.G., 1982, Hormone-induced cell death. Purification ad properties of thymocytes undergoing apoptosis after glucocorticoid treatment. Am. J. Pathol., 109(1): 78-87.

124. Yamamoto Y., Kobayashi Y., Devi S.R., Rikiishiu S., and Matsumoto H., 2002, Aluminum toxicity is associated with mitochondrial dysfunction and the production of reactive oxygen species in plant cells. Plant Physiol., 128: 63-72.

125. Zatta P., Luccihini R., Rensburg S. J., and Taylor A., 2003, The role of metals in neurodegenerative processes: aluminum, manganese, and zinc. Brain Res. Bull., 62: 15-28.

126. Zhang Y., 1995, Effects of aluminum chloride on the nucleus and nucleolus in root tip cell of Hordeum vulgare. Mutation Research, 335; 137-142.

127. Zhao X.J., Sucoff E., and Stadelmann E.J., 1987, Al3+and Ca2+alteration of membrane permeability of Quercus rubra root and cortex cells. Plant Physiol., 83: 159-162.

Информация о работе

Тунева, Елена Олеговна
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.04

Диссертация

Исследование токсического действия алюминия на нейроны и тимоциты мышей - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы