Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование структуры и механизма функционирования ретиналь-содержащих мембранных белков: кристаллизация и фиксация промежуточных состояний белков в кристаллах
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика
Автореферат диссертации по теме "Исследование структуры и механизма функционирования ретиналь-содержащих мембранных белков: кристаллизация и фиксация промежуточных состояний белков в кристаллах"
на правах рукописи
УДК 533.9
ЕФРЕМОВ РУСЛАН ГЕННАДЬЕВИЧ
Исследование структуры и механизма функционирования ретиналь-содержащих мембранных белков: кристаллизация и фиксация промежуточных состояний белков в кристаллах
03.00.02. - биофизика
автореферат диссертации иа соискание ученой степени кандидата физико-математических наук
Москва 2005
Работа выполнена в Московском физико-техническом институте, Лаборатории нейтронной физики им. И.М. Франка Объединенного института ядерных исследований (г. Дубна) и Институте структурной биологии Исследовательского центра г. Юлиха.
Научный руководитель:
кандидат физико-математических наук
Валентин Иванович Горделий
Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук Марк Александрович Мокульский кандидат физико-математических наук Виктор Борисович Киреев
Ведущая организация:
Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ (г. Москва)
Защита состоится /3, ф, 2005 г. в 10 час. 00 мин. на заседании диссертационного совета K2I2.I56.03 при Московском физико-техническом институте (141700, Московская обл., г. Долгопрудный, Институтский пер. 9, МФТИ).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МФТИ.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат физико-математических наук
В.Е. Брагин
гооб-А
■<5440
Общая характеристика работы
Введение. Актуальность проблемы. Трансмембранные белки выполняют важнейшие функции в составе организма, и в то же время структурная информация об этих белках является относительно бедной. Это связано в первую очередь с трудностями кристаллизации мембранных белков [1]. Один из наиболее исследованных мембранных белков - ретиналь-содержащий белок, бактериородопсин (ВЯ), является простейшим фотозависимым генератором трансмембранного потенциала. Поглощение света ВЯ инициирует фотоцикл, в результате которого протон переносится из цитоплазмы во внеклеточное пространство. Исследование ВЯ является чрезвычайно важным для понимания того, каким образом в природе реализуется активный транспорт ионов.
Гомологичный В Я, сенсорный родопсин II (8ЯН) - фоторецептор синего света, активирующий двухкомпонентный сигнальный каскад, одну из самых распространенных в природе сигнальных цепей [2]. ЗЯ11 образует комплекс с трансмембранным трансдьюсерным белком, НМ1. Поглощение света Б ЯН, как и в случае В Я, инициирует фотоцикл, в результате которого сигнал передается на №г11. Чтобы понять механизмы функционирования данных белков, необходимо знать их молекулярную структуру как в состоянии покоя, так и на различных стадиях транспорта протона или передачи сигнала.
В результате использования липидной кубической фазы, в качестве матрицы для кристаллизации, впервые удалось получить кристаллы В Я, позволившие определить его структуру в основном и промежуточных состояниях фотоцикла с разрешением, достигающим 1.5$ А. Таким образом были определены детали структурных изменений, сопровождающих фотоцикл, как например: переориентация аминокислотных остатков, деформация а-спиралей и движение молекул воды [3;4]. Однако, структуры некоторых из промежуточных состояний ВЯ, полученных разными группами, сильно различаются, что ведет к противоречивым заключениям относительно механизма переноса протона. Причинами этого являются: недостаточно высокое разрешение дифракционных данных, мероэдрическое двойникование кристаллов, (понижающее информативность дифракционных данных) и недостаточно полная характеристика промежуточных состояний при условиях кристаллографических экспериментов [5].
Структура БЯН в комплексе с трансмембранным фрагментом Н&Нц«. (вНН), была определена с помощью реитгеноструктурного анализа, тогда как его структура в сигнальном состоянии остается неизвестной. Определение структурных изменений,
сопровождающих формирование сигнального состояния 5НП, важно для понимания механизмов передачи сигнала между белками.
Цель и задачи исследования заключались в улучшении дифракционного качества белковых кристаллов, выращенных в липидной кубической фазе, исследовании влияния кристаллического окружения белков на их функциональность спектроскопическими методами и определении оптимальных условий фиксирования промежуточных состояний белков в кристаллах при низких температурах.
Научная новизна. В работе впервые применен метод дифракции нейтронов для изучения механизма кристаллизации в кубической фазе. Благодаря этому оказалось возможным исследование эволюции свойств липидной фазы в процессе кристаллизации и роста кристаллов на одних и тех же образцах. В процессе оптимизации кристаллизационных условий было обнаружено, что концентрация детергента является важным кристаллизационным параметром, и ее оптимальный выбор позволяет существенно улучшить дифракционное качество кристаллов и воспроизводимость кристаллизационных экспериментов. В данной работе впервые показано, что двойниковые кристаллы белка могут быть расщеплены на одиночные без нарушения кристаллической структуры. Предложенный подход позволил получить кристалл ВЯ без двойникования, с которого были собраны дифракционные данные с разрешением 1.35 А.
В результате разработки нового экспериментального оборудования впервые удалось провести спектроскопические эксперименты на белковых кристаллах с микросекундным временным разрешением в инфракрасном диапазоне. Это дало возможность установить влияние кристаллического окружения и кристаллической упаковки белков на их функциональность В комбинации с низкотемпературной спектроскопией данный подход позволил наиболее детальную характеристику зафиксированных в кристалле промежуточных состояний.
Практическое значение работы. Работа представляет общий интерес для белковой кристаллографии. В частности, результаты исследования механизма кристаллизации в кубической фазе представляются важными для кристаллизации и развития методики кристаллизации мембранных белков. Новые подходы к решению проблем двойникования могут быть использованы в других лабораториях для устранения данного дефекта белковых кристаллов.
Развитые в работе спектроскопические методы характеристики белковых кристаллов представляют интерес для кристаллографических исследований механизмов
функционирования белков, поскольку позволяют сравнивать химические и структурные изменения, сопровождающие функционирование белков в кристалле, с изменениями, сопровождающими их функционирование в естественном окружении. Кроме того, данные результаты могут найти применение в видимой и инфракрасной микроспектроскопии, в частности, для исследования биологических тканей и отдельных клеток. Также микроспектроскопия в комбинации с проточной юоветой может найти применение в исследовании нециклических биореакций.
Апробация работы. Основные положения работы и ее отдельные результаты докладывались на 28-й международной конференции "Dynamical properties of solids" (Керкраде, Нидерланды, 2001), 11-й международной конференции "Retinal proteins" (фрауэнхимзе, Германия, 2004), 14 международной конференции по росту кристаллов (Гренобль, Франция, 2004).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы. ОбъСм и структура диссертации. Работа состоит из введения, 4 глав, заключения и списка цитируемой литературы. Объем диссертации составляет 121 страниц машинописного текста, включая 61 рисунок, 12 таблиц и 176 библиографических ссылок.
Основное содержание работы
Во введении показана актуальность исследуемой темы, перечислены основные проблемы, стоящие в данной области, сформулированы цели и главные идеи работы, а также кратко описана структура диссертации.
Первая глава посвящена обзору литературных данных. В обзоре рассмотрены основные характеристики археродопсинов, к которым принадлежат BR и SRII: распространенность, функции и отношение к другим ретиналь-содержащим белкам. Подробно описано современное представление о механизме функционирования BR и SRII. Особое внимание уделено использованию спектроскопических методов для получения структурной и кинетической информации о фотоциклах белков. Здесь же критически рассмотрены кристаллографические структуры промежуточных состояний фотоцикла BR. Показано, что вследствие недостаточной точности определения кристаллографических координат в предыдущих работах, невозможно однозначно судить о механизме функционирования белка.
Кроме этого, в обзоре литературы рассмотрены принципы кристаллизации мембранных белков Подробно описана методика кристаллизации в липидной кубической фазе, которая состоит из двух принципиальных шагов: 1) смешивания раствора белка с липидом и последующей гомогенизации, в результате чего образуется кубическая фаза со встроенным в ее бислой белком, и 2) добавления осаждающего вещества (в данном случае, сухой фосфатной соли) инициирующего кристаллизацию. Поскольку для рациональной оптимизации кристаллизационных условий необходимо знать механизм кристаллизации белка в липидной системе, в данной главе описаны эксперименты, в которых исследовалась кристаллизационная система, и предложенные механизмы кристаллизации. Было показано, что добавление соли приводит к уменьшению постоянной решетки кубической фазы, и что рост кристаллов сопровождается локальным появлением ламеллярной фазы. Отсюда сделаны выводы о том, что дестабилизация кубической фазы и упруга* энергия локального изменения кривизны бислоя, вокруг встроенного в него белка, играют важную роль в кристаллизации [6]. Литературный обзор также включает описание явления двойникования в кристаллах, методов его детектирования и характеристики. В заключении суммированы проблемы, стоящие на пути понимания механизмов функционирования археродопсинов, и являющиеся предметом исследования в данной работе. Показано, что рентгеновская кристаллография является наиболее подходящим методом для их решения.
Во второй главе описаны материалы и методы, использованные в работе. Подробно описаны процедуры получения, очистки и кристаллизации белка. Рассмотрены основные принципы дифракции нейтронов на поликристаллических объектах и дано краткое описание экспериментальных установок, на которых выполнялись эксперименты по дифракции нейтронов и рентгеновских лучей. Здесь же описаны методы определения фактора двойникования и, предложенный в данной работе, метод расщепления двойниковых кристаллов.
Особое внимание уделено описанию спектроскопических методов, использованных в работе. Рассмотрены основные принципы измерения спектроскопических данных с временным разрешением, принципы Фурье-спектроскопии, устройство экспериментальной установки, использованной для проведения спектроскопических экспериментов на белковых микрокристаллах и процедуры приготовления образцов. Детально описано устройство созданной в работе установки для импульсного фотолиза.
разработанной специально для микроспектроскопии. В заключении рассмотрены методы обработки спектроскопических данных, измеренных с временным разрешением. Третья глава. Одной из целей работы являлось улучшение качества дифракции кристаллов ВЯ, что требовало оптимизации условий кристаллизации. Основное отличие кристаллизации в кубической фазе от классических методов состоит в том, что белок кристаллизуется не из водного раствора, а из липидной кубической фазы, в бислой которой он встроен. Поскольку данный метод кристаллизации является новым, вопросы о поведении кубической фазы н ее роли в процессе кристаллизации не были детально исследованы. В то же время эта информация представляется критической для формулирования оптимальной стратегии оптимизации кристаллизационных условий.
Процесс кристаллизации в кубической фазе определяется взаимодействием белка с липидно-детергентной составляющей системы, в данном случае моноолеином (МО) и остилглюкозидом (ОГ), и взаимодействием белок-осадитель. Одна из основных составляющих белок-липидного взаимодействия имеет гидрофобный характер и в первом приближении определяется геометрическими параметрами липидной фазы (толщина гидрофобной части и кривизна липидного бислоя). Взаимодействие белка с фосфатной солью имеет электростатический характер. Кроме этого, соль меняет активность воды, меняя таким образом концентрацию воды в липидной фазе и, следовательно, ее состояние Исходя из данной модели оптимизация кристаллизационных условий была разбита на две принципиальных подзадачи:
1. Определение влияния структуры липидной фазы на результаты кристаллизации, то есть определение оптимальной геометрии липидной системы для кристаллизации.
2. Оптимизация параметров осадителя и концентрации белка при постоянных параметрах липидной фазы.
В качестве метода для решения первой подзадачи была выбрана дифракция нейтронов*. Данный метод позволяет с одной стороны определить из каких липидных мезофаз состоит исследуемый образец и структурные параметры данных мезофаз С другой стороны, благодаря высокой проникающей способности нейтронов, он позволил провести эксперименты с реальными кристаллизационными пробами, используемыми при получении кристаллов ВЯ для рентгеноструктурных исследований, что позволило установить соответствие между поведением липидной фазы и кристаллизацией белка
Эксперименты по дифракции нейтронов выполнены совместно с Г.Н. Ширяевой.
Вторым шагом по оптимизации дифракционного качества кристаллов была последовательная вариация кристаллизационных параметров. При этом фиксировались результаты кристаллизации: размеры кристаллов, качество дифракции и фактор двойникования. Необходимо подчеркнуть, что проведенные нейтронографические исследования позволили впервые установить важность концентрации детергента для кристаллизации мембранных белков.
При использовании "стандартных" [7] кристаллизационных условий первые видимые кристаллы (~5-10 мкм) появляются через 2-3 дня после добавления сухой соли Этот промежуток времени был выбран в качестве временного масштаба эксперимента, поскольку одна из основных стадий роста кристалла, зародышеобразование, происходит в пределах данного временного интервала.
Состояние кристаллизационной системы МО/ОГ/ВЯ/буфер (250мМ Ыа/К-Рц рН 5.6), изучалось в следующие моменты кристаллизации: 1) уравновешенная в течение 24 ч. кристаллизационная смесь без соли, 2) после добавления соли каждые 2 ч. в течение 8 ч. и 3) через 2 д. после добавления соли.
Дифракционные измерения показали, что при данных кристаллизационных условиях, система МО/ОГ/ВЯ/буфер образует кубическую фазу симметрии РпЗш, как и система МО/вода, однако постоянная решетки увеличена на 15-17 А благодаря присутствию ~А% ОГ Добавление сухой соли, приводит к уменьшению постоянной решетки кубической фазы на 10-30 А (постоянная решетки уменьшается при увеличении концентрации соли) (см рис 1 а). Все существенные изменения параметров системы завершаются в течение первых двух часов после добавления соли. При этом, во всех исследованных временных точках и при всех концентрациях соли в кристаллизационной системе присутствовала только кубическая фаза симметрии РпЗш.
Процесс уравновешивания кубической фазы, после добавления сухой соли, исследовался на установке малоуглового рассеяния нейтронов ЮМО (Дубна). Сразу после добавления соли система находится в неравновесном состоянии, как следует из уширения дифракционных пиков При этом невозможно однозначно определить симметрию кубической фазы. Однако, принимая во внимание то, что симметрия определена однозначно до и после добавления соли и то, что позиция дифракционного пика имеет монотонную зависимость от времени, можно утверждать, что симметрия кубической фазы сохраняется в течение всего процесса кристаллизации. Причиной уширения пиков, по-видимому, является градиент концентрации соли в образце. Данные
эксперименты показали, что характерное время изменений составляет 1.5-Зч. (см. рис. 1.6), что примерно в 10 раз быстрее появления видимых кристаллов. В данных экспериментах присутствие липидных мезофаз, отличных от кубической фазы симметрии РпЗт, зафиксировано не было, таким образом, данное наблюдение противоречит ранее высказанному предположению о необходимости дестабилизации кубической фазы в направлении ламеллярной фазы для кристаллизации белка [б]. Однако, появление и рост белковых кристаллов может сопровождаться локальным возмущением кубической фазы и появлением ламеллярной фазы вокруг растущего кристалла. Такие микроскопические количества иной фазы были вне пределов чувствительности нейтронных экспериментов.
Анализ кинетики роста кристаллов показал, что видимые кристаллы появляются в течение 2-10 дней с начала кристаллизации, а их рост продолжался в течение одного месяца. С ростом концентрации соли время появления первых кристаллов сокращалось, а средний размер кристаллов уменьшался. Такая зависимость размера кристаллов от концентрации соли имеет характер аналогичный, найденному для кристаллов водорастворимых белков [8].
Исследование кубической фазы в более широком диапазоне кристаллизационных условий показало, что уменьшение концентрации МО в кристаллизационной системе приводит к увеличению размера кристаллов. При данных условиях постоянная решетки кубической фазы после добавления соли превышает 120 А. Предполагая,
Рис.1, а. Зависимость постоянной решетки кубической
фазы от времени, отсчитываемого от момента добавления что ОГ и ВЯ встраиваются в липидный
соли. Точка, помеченная стрелкой 1, измерена до _ ,
добавления соли, стрелкой 2 сопутствует характерному 6ислой кубической фазы И принимая
времени пояшения видимых кристаллов, в. Хартюгерн» ^ внимание то „„ кубическая фаза временная зависимость постоянной решетки кубической ' т
фазы в первые 3 часа после добавления соли. МО симметрии РпЗш может
находиться в равновесии с избытком буфера, параметрами, варьируемыми в данных
сериях экспериментов, являются концентрация ОГ и ВЯ в объеме кубической фазы.
Поэтому влияние каждого из этих факторов в отдельности на результат кристаллизации
было исследовано более детально.
Влияние детергента на результат кристаллизации изначально было неясным. С целью исследования роли детергента были проведены кристаллизационные эксперименты, в которых все параметры, кроме концентрации детергента и фосфатной соли, были фиксированы. Результат, представленный на рис.2, свидетельствует о том, что размер кристаллов существенно зависит от концентрации ОГ. Кристаллы наибольших размеров 250-350 мкм были получены при концентрации ОГ от 10 до 16% и концентрации соли от 0.9 до 1.1 М. При этих условиях кристаллы растут в течение трех месяцев.
Повышение концентрации детергента в растворе белка от 2 до 12-16% позволило увеличить размер кристаллов от 70 до 350 мкм. Встраивание ОГ в кубическую фазу МО модулирует ее свойства. С одной стороны, увеличение концентрации детергента в данном интервале приводит к увеличению постоянной решетки кубической фазы от 100 до 160 А. В результате средняя кривизна бислоя кубической фазы уменьшается, что приводит к уменьшению упругой энергии локальной деформации бислоя кубической фазы, вызванной присутствием белка. С другой стороны, встраивание ОГ приводит к уменьшению толщины гидрофобной составляющей липидного бислоя, поскольку эффективная длина алифатической цепи МО составляет 17.3 А, тогда как для ОГ она не превышает 12.3 А. Мы предполагаем, что данный эффект приводит к уменьшению гидрофобной составляющей свободной энергии ассоциации молекул ВЯ в кристалл, возникающей как результат несоответствия толщины гидрофобной области липидного бислоя кубической фазы (34 А) и белка (-30 А). Поскольку добавление ОГ уменьшает данное несоответствие, это приводит к уменьшению скорости роста и плотности зародышеобразования кристаллов и увеличению их конечного размера. Данные результаты указывают на то, что свободная энергия, возникающая в результате взаимодействия белка с липцдной фазой, вносит существенный вклад в энергетику процесса кристаллизации и может непрерывно
■ 12 16 20 24 28 Концентрация ОГ, %
Рис.2. Контурная карте зависимости среднего размера кристаллов ■ пробе (■ мкм) от концентрации ОГ в распоре белка и концентрации соли в пробе.
модулироваться посредством изменения концентрации детергента в кристаллизационных экспериментах.
На следующем шаге оптимизации кристаллизационных условий было показано, что из нескольких гомологичных липидов: МО, моноваценина и монопальмитолеина, наиболее подходящим для кристаллизации ВЯ является МО. Были оптимизированы концентрация белка и рН кристаллизационной системы. В результате получены кристаллы, дающие наиболее высокое дифракционное разрешение на настоящий момент (см. табл.1).
Литератур ные данные Полученные в данной работе
разрешение, (А) 1.55 1.26
Фактор двойникования % Количество уникальных рефлексов 24 34 002 37 61054
14. (V.) 6.9(38.1) 7.2(34.0)
<1/сг> (для внешней оболочки) 19.9(2.0) 5.5(2.1)
Постоянные решетки, а,Ь,с, (А) 60.6,60.6, 108.2 60.74,60.74, 110.3
Табл.1. Сравнение опубликованных и полученных в данной работе кристаллографических данных наивысшего разрешения кристаллов ВИ.
Двойникование кристаллов ВЦ Кристаллам ВЯ с пространственной группой Рбз, выращенным в кубической фазе, свойственно мероэдрическое двойникование, при котором кристалл состоит из доменов с двумя различными ориентациями, такими, что рефлексы Ш доменов с одной ориентацией накладываются на кИ-1 доменов с другой. Взаимная ориентация
кристаллографических осей доменов,
соответствующая данному типу двой-никования, и предполагаемая ориентация доменов в кристаллах ВЯ показаны на рис.3.
В литературе информация о строении двойниковых белковых кристаллов: размере доменов и их организации достаточно бедная, также как и о методах устранения двойникования.
Для выявления ключевых факторов, влияющих на двойникование, были проведены объемные систематические исследования. При этом была обнаружена корреляция частоты встречаемости кристал-лов с низким фактором двойникования со скоростью роста кристаллов. Уменьшение скорости роста, вне зависимости от других
а б
Рис.3, а. Взаимни ориентация кристаллографических осей двойниковых доменов кристалла ВН. б. Предполагаемая организация двойниковых доменов в кристалле. Схематически показана ориентации молекул ВК на границе доменов.
условий кристаллизации, приводило к увеличению вероятности обнаружения кристалла с низким фактором двойиикования. Распределение фактора двойникования, построенное для 83 кристаллов, дающих дифракцию высокого разрешения, время роста которых не превышало 1.5 месяцев и для 111 кристаллов, которые росли более 3-х месяцев показано на рис.4. При медленном росте количество кристаллов без двойникования (фактор двойникования < 10%) составляет 14%, тогда как при более быстром росте кристаллы без двойникования не были обнаружены, а общее количество кристаллов с фактором двойникования менее 25% составляло 8%. Данный результат впервые демонстрирует, что кинетика роста кристаллов является существенным фактором, определяющим вероятность возникновения двойникования.
Растепление двойниковых кристаллов. Кристаллизационные пробы, как правило, содержат большое количество кристаллов различных размеров и формы. Некоторые кристаллы выглядят, как две слипшиеся гексагональные пластинки. Поскольку взаимная ориентация слипшихся пластинок аналогична
-Л Г>1П-
10 20 30 40 50
фактор двойникования, % Рмс.4. Распределение фактора двойниковаоти для предполагаемой ориентации двойнико-кристаллов, которые росли менее и месяце! (пустые ,
пр»моуголь™га)бол«3-хмесицев(заштрихованные). 8ЫХ Доменов (рис.3), было высказано предположение о том, что данный дефект кристаллов и двойникование имеют одинаковое происхождение. Поэтому были проведены эксперименты по расщеплению кристаллов. Было найдено, что медленное уменьшение концентрации соли от 3 до ~1 М в маточном растворе кристалла приводит к расщеплению слипшихся пластинок. Некоторые расщепленные кристаллы давали дифракцию достаточно высокого разрешения для определения фактора двойникования, который во всех случаях оказался равным 0 с точностью экспериментальной погрешности (5%).
Аналогичная процедура, примененная к кристаллам, у которых отсутствовали явные признаки, указывающие на присутствие двойниковых доменов, позволила расщепить кристаллы вдоль плоскости шестиугольника. Большинство кристаллов расщепилось на две части примерно одинаковой толщины (рис.5а,б) и несколько кристаллов на три и большее количество частей. В случае нескольких кристаллов расщепленные части дифрагировали до того же разрешения, что и исходный кристалл. Как показали тесты,
основанные на статистике Етеса и графике Бритгона, все расщепленные кристаллы, дающие дифракцию, не имели двойникования, в то время как фактор двойникования
Данные эксперименты позволили показать, что двойниковые кристаллы состоят из макроскопических доменов, представляющих из себя гексагональные пластинки, размеры которых в плоскости шестиугольника совпадают с размерами всего кристалла и их толщина сравнима с толщиной исходного кристалла. Во всех случаях, когда отщепленные части давали дифракцию, они не имели двойникования, следовательно, можно предположить, что кристаллы расщепляются вдоль границы контакта двойниковых доменов. Основываясь на этом предположении можно заключить, что большинство кристаллов ВЯ состоит из двух двойниковых доменов. В этом случае расщепление на три и большее количество частей свидетельствует о том, что некоторые кристаллы состоят из большего количества доменов, однако их размер всегда сравним с размером двойникового кристалла.
Поверхность раздела двойниковых доменов может быть образована посредством контакта либо цитоплазматических (ЦП), либо внеклеточных (ВК) поверхностей ВЯ (рис.3). Тот факт, что фактор двойникования большинства кристаллов ВЯ превышает 30%, и большинство кристаллов состоит из двух двойниковых доменов, может быть объяснен различием энергий взаимодействия ЦП и ВК поверхностей двумерных кристаллов В Я. ВК поверхность ВЯ практически нейтральна, в то время как ЦП поверхность заряжена отрицательно. Поскольку взаимодействие между двумерными слоями ВЯ в кристалле достаточно слабое, даже слабое электростатическое отталкивание двумерно-кристаллических ЦП поверхностей может вносить существенный вклад в общую энергию межслойного взаимодействия, что подтверждается фактом расщепления доменов при
исходных кристаллов был около 40% (рис.5.б).
1 о
1 < , > ¡. ■ -44,.'*. Г , ( .
«с.
52050405
¡.^—^»¡ш,»^ «актор г
Эи5-'":.. двойникования
Рыс5. а. Фотография кристалла ВК до и 6. после расщепления. ■. Распределение Етеса и г. граффик Бритгона до и после растепления кристалла.
понижении концентрации соли. Таким образом, процесс роста кристалла представляется нам следующим образом. Первый двойниковый домен появляется вскоре после зародышеобразования кристалла или даже в процессе зародышеобразования. Данные домены взаимодействуют ВК поверхностями. У получившегося двойникового кристалла внешние гексагональные поверхности - ЦП поверхности, вероятность образования двойников на которых существенно меньше, из-за электростатического отталкивания. Следовательно, с высокой вероятностью кристалл продолжает расти без образования новых двойниковых доменов. Основные выводы третьей главы:
1. Симметрия кубической фазы сохраняется в течение всего процесса кристаллизации. Присутствие мезофаз, отличных от РпЗт кубической фазы, не обнаружено, следовательно не является необходимым условием кристаллизации.
2. Структурные изменения липидной фазы, сопровождающие инициацию кристаллизации намного быстрее самого процесса кристаллизации, следовательно только равновесное состояние кубической фазы после добавления осадителя определяет процесс роста и свойства кристаллов.
3 Концентрация детергента является важным кристаллизационным параметром. Ее оптимальный выбор позволяет существенно улучшить дифракционное разрешение кристаллов.
4. Двойниковые кристаллы ВЯ могут быть расщеплены на одиночные домены с сохранением их дифракционных свойств.
Четвёртая глава посвящена характеристике белков в кристаллах и поиску оптимальных условий фиксирования низкотемпературных промежуточных состояний для рентгеноструктурного анализа. В качестве экспериментальных методов были использованы спектроскопия в видимом и инфракрасном диапазонах. Тогда как первый метод позволяет определить состав и концентрации промежуточных состояний, разностная инфракрасная спектроскопия позволяет получить качественную информацию о характере структурных изменений, сопровождающих формирование промежуточных состояний. Для характеристики основного и промежуточных состояний белков в кристаллах эксперименты выполнялись с белком, встроенным в липидные мембраны, и кристаллами при одинаковых условиях.
Характеристика функиионалъности BR в кристаллах. Сравнение спектров поглощения пурпурных мембран (ПМ) и кристалла BR в видимом диапазоне показало, что они одинаковы. Более того, разностные ИК спектры BR адаптированного к темноте по отношению к адаптированному к свету также одинаковы для ПМ и кристалла. Отсюда следует, что кристаллическая упаковка не изменяет способности ретиналя к термической изомеризации в BR, также как и структурные изменения, сопровождающие ее. Как спектр поглощения, так и термическая изомеризация чувствительны к непосредственному окружению ретиналя, поэтому данные наблюдение указывает на то, что структура активного центра BR одинакова в кристалле и ПМ.
Исследование функциональности BR в кристаллах уже проводилось с помошью ИК-Фурье спектроскопии с миллисекундным временным разрешением и спектроскопии комбинационного рассеяния Однако, условия экспериментов не позволили выполнить сравнение кинетики фотоцикла в кристалле с фотоциклом в ПМ Кроме того, информация о микросекундной части фотоцикла в кристалле, включающей К, L и M состояния, полностью отсутствовала.
В данной работе были впервые проведены спектроскопические эксперименты на
кристаллах BR в видимом и ИК диапазонах с микросекундным временным разрешением.
В результате показано, что кинетика фотоцикла в ПМ и кристалле различается. В
кристалле,время жизни L состояния в I.S
раза меньше, a M состояния в ~3 раза
больше, чем в ПМ. Кроме того, в кристалле
не наблюдается временное накопление О
состояния в течении фотоцикла (см. рис 6)
Для детального сравнения структурных
изменений, соответствующих промежуточ-
10"° 10"* 10"' 10° ным состояниям в ПМ и кристалле была время, с
Рис.«. Зависимость фото индуцированного юмеие- использована ИК-Фурье спектроскопия с ния поглощения от времени на 415, 575 и 655нм для
ПМ (пунктир) и кристалла (сплошная линия). микросекундным временным разрешением
Спектры промежуточных состояний, полученные с помощью глобального экспоненциального анализа и последовательной однонаправленной модели фотоцикла без разветвлений, показаны на рис. 7. Спектры L и M состояний (рис. 7.а,б) одинаковы для ПМ и кристалла. Исключение составляет небольшой сдвиг частоты валентного колебания карбоксильной группы Асп-85, которая в кристалле на 2 см'1 ниже, чем в ПМ. Спектры,
описывающие миллисекуидную часть фотоцикла, существенно отличаются (рис.7.в). В ПМ данный временной интервал фотоцикла характеризуется накоплением О состояния, тогда как в кристалле - N состояния.
Из инфракрасных спектров можно заключить, что как и в ПМ, в кристалле, формирование М состояния характеризуется депрото-нированием шиффова основания (ШО) и протонированием Асп-85. При переходе из М в N состояние ШО репротонируется и Асп-96 депротонируется, откуда следует, что ШО репротонируется со стороны ЦП канала. Отсюда можно заключить, что ВЯ в кристалле осуществляет направленный транспорт протонов.
Низкотемпературные промежуточные состояния В качестве исходной точки для фиксирования промежуточных состояний в кристалле были использованы методы получения стабильных низкотемпературных состояний, оптимизированные для ПМ [9]. Показано, что данные методы могут быть использованы без модификаций для фиксирования К и М состояний в кристалле. Процедуры фиксации Ь и N состояний были модифицированы. Показано, что стабильное I, состояние, без примеси М, в кристалле может быть получено при температурах, не превышающих 155°К, тогда как в ПМ - 170°К. Данное отличие, вероятно, возникает, как следствие уменьшенного в кристалле потенциального барьера для протонирования Асп-85, как следует из различия в кинетике распада Ь состояния в кристалле (рис 6 а) Накопление N состояния в ПМ осуществляется при высоких значениях рН. Однако, повышение рН в кристаллах невозможно без ухудшения дифракционного качества. Поэтому, для фиксирования N состояния оптимальной является процедура быстрого замораживания кристалла при постоянном интенсивном освещении. Поскольку в кристалле N состояние долгоживущее, при постоянном освещении оно присутствует в достаточно высоких концентрациях. Поэтому быстрое замораживание позволяет получить ~30% N состояния с примесью 30-40% М.
" 1 ■ ■ ■ ■ 1 ■ 1990 > . ■ • ■ 1 ■ • ■ а
\?40 1760 V-^73« 'N«39 И Ц1525 1201/ Х"6»
1745 * 1564 И ' ; 1
- 1760 Ч^ 175« 1652 А I/ / Л ^1506 V в-
1670 | ....... _<_1
1600 1600 1400 1200 1000
волновое число, см"1
Рис.7. Разностные ИК спектры промежуточных состояний ВЯ при 20°С Пунктиром показаны спектры ПМ, временные константы которых (тш): бОмкс (а), 2 1мс (б) и !1мс (в) Сплошной линией - спектры кристалла с 21 мкс(а), 3 8мс (б) и 76мс (с)
Исследование низкотемпературных промежуточных состояний с помощью ИК спектроскопии показало, что разностные спектры промежуточных состояний одинаковы в ПМ и кристалле. Исключение, как и в случае ИК спектроскопии с временным разрешением составила частота валентного колебания карбоксильной группы Асп-85, которая при низких температурах в кристалле на 4 см"' ниже, чем в ПМ.
Идентичность частот ИК линий разностных спектров, относящихся к основному состоянию, как при комнатных, так и при низких температурах указывает на то, что структура основного состояния в кристаллах не возмущена. Прецизионное сравнение интенсивностей линий разностных спектров промежуточных состояний в амид 1 и II областях невозможно, поскольку кинетика фотоцикла ПМ и кристалла существенно различается, однако, спектры кристалла не содержат явных указаний на то, что амплитуда или характер структурных изменений в кристалле отличается от ПМ.
Кинетика фотоцикла ВЯ в кристалле характеризуется ускоренным формированием М состояния и его замедленным распадом Среди известных факторов, оказывающих аналогичный эффект на кинетику фотоцикла ВЯ: 1) степень гидратации, 2) липидный состав ПМ и 3) рН. Повышенный, внутри кристалла рН наиболее хорошо согласуется с экспериментальными наблюдениями: ускоренным формированием М состояния, его замедленным распадом, наблюдаемым сдвигом частоты колебания карбоксильной группы Асп-85 и накоплением N состояния. Для того, чтобы проверить данное заключение, была проанализирована кристаллическая упаковка молекул ВЯ. Кристалл образован стопкой двумерных кристаллических слоев, расстояние между поверхностями которых не превосходит 7-9 А. Поэтому в межслойном пространстве большая часть молекул воды является связанной с белком и липидами. Данная особенность кристаллической упаковки молекул может приводить к тому, что эффективный рН внутри кристалла выше, чем рН буффа, окружающего кристалл. Однако, частичная дегидратация и несколько измененный липидный состав также могут вносить вклад в изменение кинетики фотоцикла в кристалле.
Характеристика кристаллов 5НП. Сравнение спектров поглощения БНЧ в кристалле и мембранах показало, что они одинаковы, следовательно кристаллическая упаковка не отражается на непосредственном окружении ретиналя. Функциональность ЭНН в кристаллах была изучена посредством сравнения кинетики фотоцикла в видимом диапазоне с кинетикой вНН в мембранах полярных липидов. Зависимость фотоиндуцкрованного изменения поглощения, характеризующего эволюцию М и О
состояний фотоцикла ЭЯИ, показана на рис.8. Кинетика фотоцикла в кристалле отличается от кинетики в липидиых мембранах, однако отличие в характерных временных константах фотоцикла не превышает 50% и не сказывается существенным образом на эволюции промежуточных состояний. Данные результаты также свидетельствуют о том, что окружение ретиналя в 81111 не возмущено кристаллической упаковкой.
Исследование низкотемпературного К состояния ЭНН показало, что его спектры в видимом и ИК диапазонах идентичны в кристалле и мембранах, откуда можно заключить, что структурные изменения, сопровождающие формирование К состояния
V\ 395HM
■ V
Vv
■ / J iff % \
■rf J / 555мм ffLl.. \ \\ -
лМЫ \ >
не искажены и не ограничены
Ю"1 104 10* 10" 10" „ „
время, с кристаллической упаковкой. Показано, что
Р«Л. Зависимость фотоиндуцироваиного освещение кристалла светом с длиной волны изменения поглощения от времени для SHII на г
длинах аолн 390 и 555 им показана пунктиром 472 нм тж Ю0°К приводит к накоплению для SHII в мембранах, сплошной линией - в
кристалле. -55% К состояния, что согласуется с
результатом, полученным для SRII в мембранах.
Фиксация и характеристика М состояния SHII. Особенности кинетики М состояния SHII (формирование в течение 100 мке и распад с характерным временем -0.5 с) предполагают, что данное состояние может быть накоплено с высокой концентрацией при комнатной температуре при стационарном освещении светом с длиной волны в области близкой к 500 нм. Действительно, из спектра поглощения кристалла комплекса при постоянном освещении лазерным излучением с длиной волны 488 нм, было определено, что при данных условиях накапливается -50% М состояния и -15% О. Если размеры кристалла не превышают 200 мкм, то как следует из теоретических оценок, время его охлаждения потоком газообразного азота не превышает 200 мс, что в 2.5 раза меньше времени полураспада М состояния. Это означает, что распределение промежуточных состояний, накопленных при постоянном освещении, не изменяется существенным образом при таком охлаждении кристалла. Поэтому для фиксации М состояния кристалл замораживался при постоянном освещении. Показано, что данная процедура позволяет зафиксировать 60% М с примесью !5% О состояния (см. рис9.а) в кристалле.
Поскольку распределение промежуточных состояний не меняется при охлаждении, ИК спектр М состояния в кристалле, измеренный при постоянном освещении и комнатной
температуре, характеризует структурные изменения, зафиксированные в кристалле при
а о
Рис.9, а. Спектры поглощения кристалла SHII в основном состоянии (сплошная линия) и в зафиксированном М состоянии (пунктир) при 100°К б. Разностные спектры М по отношению к основному состоянию при 294°К. Пунктиром показан спектр SH1I в мембранах, сплошной линией - в кристалле
Разностные спектры М состояния по отношению к основному для SHII в мембранах
и кристалле представлены на рис.9.б. Линии спектра М состояния комплекса в кристалле
и в мембранах имеют одинаковые частоты, следовательно, структурные изменения,
сопровождающие формирование этого состояния имеют одинаковый характер в
мембранах и кристалле. Из спектров можно заключить, что изомеризация ретиналя и
перенос протона с ШО на Асп-75 происходят одинаково в мембране и кристалле. Однако,
амид I и II линии, отражающие структурные изменения белка, имеют существенно
меньшую интенсивность в кристалле, чем в мембранах. Следует отметить, что с помощью
ЭПР спектроскопии было показано, что SRII и Htrll i !4, встроенные в мембраны полярных
липидов, образуют функциональный комплекс, таким образом сравнение амплитуд
инфракрасных спектров является корректным. Более того, эксперименты, выполненные с
использованием поляризованного света и ориентированными мембранами со встроенным
SHII, показали, что разница в интенсивности амид I и II линий не может быть объяснена
дихроизмом. Таким образом, можно заключить, что амплитуда структурных изменений
белка в кристалле значительно меньше, чем в мембранах.
Чтобы понять причины уменьшения амплитуды структурных изменений, была проанализирована упаковка молекул SHII в кристалле. Кристаллы SHII также, как и BR имеют слоистую структуру (см рис.3). В плоскости бислоя молекулы образуют контакт посредством взаимодействия В и D спиралей рецептора, тогда как остальные спирали
посредством взаимодействия В и D спиралей рецептора, тогда как остальные спирали находятся в контакте с липидами и, возможно, незафиксированной частью трансдьюсера Htrlli2.n4, которые разупорядочены. Следовательно, окружение этих спиралей ближе к естественному, и их движение не ограничено кристаллическим взаимодействием в плоскости бислоя. Межслойный контакт между двумерно-кристаллическими слоями осуществляется посредством взаимодействия петель SRII: ВС с одной и EF с другой стороны слоя. Причем, данное взаимодействие включает три водородные связи и, следовательно, несмотря на относительную гибкость петель, может ограничивать структурные изменения в данной области. В то же время, результаты ЭПР экспериментов указывают на то, что именно спираль F и петля EF претерпевают структурные изменения в М состоянии также, как в BR. Отсюда можно заключить, что именно межслойное взаимодействие молекул, ограничивает амплитуду структурных изменений, сопровождающих образование М состояния в кристалле.
Основные выводы четвертой главы:
1. Показано, что BR функционален в кристаллах. Кристаллическое окружение BR существенно изменяет кинетику фотоцикла, что отнесено на счет измененных свойств воды внутри кристалла и липидного окружения. Структурные изменения, сопровождающие промежуточные состояния одинаковы в ПМ и кристалле.
2. SRI! в кристаллах комплекса SHII способен совершать фотоцикл. Кинетика фотоцикла в кристалле и в липидных мембранах не различается существенно. Показано, что кристаллическое взаимодействие молекул SR1I приводит к уменьшению амплитуды структурных изменений, сопровождающих формирование М состояния, однако, не изменяет их характер.
3. Оптимизированы процедуры фиксирования низкотемпературных промежуточных состояний фотоцикла для BR и SHII в кристаллах. Данные процедуры были использованы для кристаллографических исследований структурных изменений этих белков в процессе их функционирования.
Основные результаты и выводы работы
' В результате исследования поведения липидной кубической фазы в процессе кристаллизации ВЯ с помощью дифракции нейтронов показано:
а) кубическая фаза сохраняет симметрию в течение всего процесса кристаллизации;
б) структурные изменения липидной фазы, сопровождающие инициацию кристаллизации, намного быстрее самого процесса кристаллизации.
2. Установлено, что концентрация детергента является важным кристаллизационным параметром. Ее оптимальный выбор позволил получить кристаллы ВЯ, дающие дифракцию до разрешения 1.2 А. V» 3. В результате систематических исследований двойникования кристаллов ВЯ
обнаружена корреляция фактора двойникования со скоростью роста кристаллов. Показано, что при замедлении роста, количество кристаллов без двойникования увеличивается.
4. Впервые показано, что двойниковые домены могут быть разделены без потери дифракционного качества, что позволило определить устройство двойниковых кристаллов и получить кристаллы ВЯ без двойникования, дающие дифракцию до разрешения 1.35 А.
5. Развиты спектроскопические методики для характеристики кристаллов белков, позволяющие проведение экспериментов в видимом и ИК диапазонах с микросекундным временным разрешением на образцах с размером ~100 мкм
6 Исследование кристаллов ВЯ и комплекса 5КН с №г11 спектроскопическими методами в видимом и ИК диапазонах продемонстрировало-
а ВЯ функционален в кристаллах, однако кристаллическое окружение существенно изменяет кинетику фотоцикла. При этом структурные изменения, сопровождающие промежуточные состояния, одинаковы в ПМ и кристалле.
б. Кристаллическое окружение комплекса БЯН/Ни-П приводит к уменьшению амплитуды структурных изменений, сопровождающих формирование М состояния, однако не изменяет их характер. 7. Сформулированы процедуры фиксирования низкотемпературных промежуточных состояний фотоцикла ВЯ и комплекса вЯН/ШгН в кристаллах, которые были использованы для получения структуры К и М состояний комплекса, что впервые позволило получить структурную информацию о передаче сигнала между трансмембранными белками.
Список публикаций
1. Gordeliy V.I., Labahn J., Moukhametzianov R., Efremov R., Granzin J., Schlesinger R., Buldt G., Savopol Т., Scheidig A.J., Klare J.P., Engelhard M, Molecular basis of transmembrane signalling by sensory rhodopsin U-transducer complex, Nature. 2002 Oct 3; 419:484-7.
2. Gordeliy V.I., Schlesinger R„ Efremov R., Buldt G., Heberle J., Crystallization in lipidic cubic phases: a case study with bacteriorhodopsin. Methods Mol Biol. 2003; 228:305-16.
3. Efremov, R., Moukhametzianov R., Buldt G., Gordeliy V., Physical detwinning of hemihedrally twinned hexagonal crystals of bacteriorhodopsin, Biophys J. 2004. 87(5): 3608-13.
4. Efremov, R., G. Shiryaeva, G. Bueldt, A. Islamov, A. Kuklin, L.Yaguzhinsky.G. Fragneto-Cusani and V. Gordeliy, SANS investigations of the lipidic cubic phase behaviour in course of bacteriorhodopsin crystallization, J. Cryst. Growth. 2005. 275: e!453-el459.
Цитируемая литература:
1. Michel H: Crystallization of Membrane Proteins. Edited by Michel H. Boca Raton: CRC Press; 1991.
2. Engelhard M, Schmies G, Wegener AA: Arhebacterial phototaxis. Edited by Batschauer A. Cambridge, UK: The Royal Society of Chemistry; 2003:2-39.
3. Lanyi JK, Schobert B: Local-global conformational coupling in a heptahelical membrane protein: Transport mechanism from crystal structures of the nine states in the bacteriorfiodopsin photocycle. Biochemistry 2004,43-3-8.
4. Sass HJ, BOIdt G, Gessenich R, Hehn D, NeffD, Schlesinger R, Berendzen J, Ormos P: Structural alterations for proton translocation in the M state of wild-type bacteriorfiodopsin. Nature 2000,406:649-653.
5. Lanyi JK: What is the real crystallographic structure of the L photointermediate of bacteriorhodopsin? Biochim Biophys Acta 2004, 1658:14-22.
6 Nollert P, Qiu H, Caflrey M, Rosenbusch JP, Landau EM: Molecular mechanism for the crystallization of bacteriorhodopsin in lipidic cubic phases. FEBS Lett 2001, 504:179186.
7 Landau EM, Rosenbusch JP: Lipidic cubic phases: a novel concept for the crystallization of membrane proteins. Proc Natl Acad Sci USA 1996,93:14532-14535.
8. McPherson A: Crystallization of Biological Macromolecules. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998.
9. Balashov SP, Ebrey TG: Trapping and spectroscopic identification of the photointermediates of bacteriorhodopsin at low temperatures. Photochem Photobiol 2001, 73:453-462.
Ефремов Руслан Геннадьевич
Исследование структуры и механизма функционирования ретиналь-содержащих мембранных белков : кристаллизация и фиксация промежуточных состояний белков в кристаллах
Автореферат
Подписано в печать 15.05.05.Формат 60*901/16. Уел. печать, л. 1.2 тираж 70 экз. Заказ Ф.417
Московский физико-технический институт (государственный университет). 141700, г. Долгопрудный, Институтский пер. 9.
»159 18
РНБ Русский фонд
2006-4 15990
Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Ефремов, Руслан Геннадьевич
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1.1. Ретиналь содержащие белки галофильных архебактерий.
1.1.1. Функции и биологическое место.
1.1.2. Общая характеристика и свойства ретиналевых белков Н. salinarum.
1.2. Бактериородопсин.
1.2.1. Исторический обзор и общая характеристика.
1.2.2. Фотоцикл бактериородопсина.
1.2.3. Стабилизация промежуточных состояний.
1.2.4. Кристаллографические структуры основного и промежуточных состояний BR
1.2.5. Модели транспорта протона.
1.3. Сенсорный родопсин II из Natronobacterium pharaonis.
1.3.1. Структура и фотоцикл SRII.
1.3.2. Взаимодействие с трансдьюсерным белком и передача сигнала.
1.4. Кристаллизация мембранных белков в липидной кубической фазе.
1.4.1. Особенности кристаллизации мембранных белков.
1.4.2. Липидная кубическая фаза.
1.4.3. Методика кристаллизации в липидной кубической фазе.
1.4.4. Механизм кристаллизации в кубической фазе.
1.5. Мероэдрическое двойниковапие белковых кристаллов.
1.6. Текущие проблемы и противоречия в исследовании BR и SRII.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование структуры и механизма функционирования ретиналь-содержащих мембранных белков: кристаллизация и фиксация промежуточных состояний белков в кристаллах"
3.2. Изучение эволюции параметров липидной фазы в процессе кристаллизации с помощью дифракции нейтронов.59
3.2.1. Идентификация фазы.59
3.2.2. Медленная кинетика.60
3.2.3. Быстрая кинетика.62
3.3. Поведение кристаллизационной системы при изменении соотношения раствор/липид.63
3.4. Влияние моноглицерида: кристаллизация в МО, MB и MP.66
3.5. Влияние октилглюкозида.67
3.6. Влияние концентрации белка и рН.68
3.7. Обсуждение.68
3.8. Двойникование и скорость роста кристаллов.70
3.9. Расщепление двойниковых кристаллов на одиночные.71
3.10. Структура двойниковых кристаллов и модель возникновения двойникования . 74
3.11. Основные результаты и выводы.75
ГЛАВА 4. ХАРАКТЕРИСТИКА КРИСТАЛЛОВ СПЕКТРОСКОПИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ И ФИКСАЦИЯ ПРОМЕЖУТОЧНЫХ СОСТОЯНИЙ В КРИСТАЛЛЕ ДЛЯ РЕНТГЕНОСТРУКТУРНОГО АНАЛИЗА
4.1. Введение.78
4.2. Спектроскопия кристаллов BR.78
4.2.1. Характеристика основного состояния в кристалле.78
4.2.2. Характеристика фотоцикла BR в кристалле с помощью видимой и ИК-Фурье спектроскопии с разрешением по времени.80
4.3. Фиксация и характеристика промежуточных низкотемпературных состояний в кристаллах BR.85
4.3.1. К состояние.85
4.3.2. L и М состояния.86
4.3.3. N состояние.89
4.4. Обсуждение.91
4.5. Рентгеноструктурные данные основного и промежуточных состояний кристаллов BR.94
4.6. Спектроскопия кристаллов SRII в комплексе с Htrll.95
4.6.1. Спектр поглощения и фотоцикл.95
4.6.2. Фиксация и характеристика К состояния.97
4.6.3. Фиксация и характеристика М состояния.98
4.7. Кристаллографические структуры К и М состояний комплекса SRII/Htrll.102
4.8. Основные результаты.104
4.9. Основные выводы.105
ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ РАБОТЫ.107
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.109
ВВЕДЕНИЕ
Способность живых организмов эффективно преобразовывать энергию из одного вида в другой, является одним из условий, обеспечивающих сохранение и распространение жизни. Синтез наиболее распространенного переносчика энергии в живых системах - афденозин-трифосфата (АТФ) требует наличия градиента электрохимического потенциала на мембранах клеток или органелл, синтезирующих АТФ. Градиент электрохимического потенциала создается посредством контролируемых ферментами окислительно-восстановительных и фотохимических реакций [1]. Простейшим и наиболее исследованным ферментом, преобразующим энергию света в электрохимический потенциал является бактериородопин (BR). Этот трансмембранный белок археи Halobacterium salinarum, поглощая свет, переносит протоны из цитоплазмы во внеклеточное пространство. BR благодаря ряду свойств: доступности в больших количествах, простоте очистки и стабильности; в течение последних 30 лет был одним из самых интенсивно изучаемых мембранных белков [2].
Гомологичный BR сенсорный родопсин II (SRII) является фоторецептором синего света, активирующим двухкомпонентный сигнальный каскад, который является одним из самых распространенных в природе. Данная сигнальная цепь регулирует работу флагеллярного мотора и позволяет археи избегать интенсивного синего и УФ освещения, вызывающего фотоокисление и разрушение организма [3]. Актуальность. Детальные механизмы транспорта протона BR и передачи сигнала SRII остаются непонятым до конца и противоречивыми [4;5]. Причиной этого является недостаточная точность и неполнота структурной информации, поскольку для понимания молекулярных механизмов функционирования белков необходимо знать какие структурные изменения, вызванные поглощением света ретиналем, сопровождают рабочий цикл белков и приводят к направленному транспорту протона или передачи сигнала. Одно из возможных решений данной проблемы состоит в получении молекулярных структур основного и промежуточных состояний рабочего цикла BR и SRII, причем, структуры BR должны включать атомы водорода. Данная задача может быть решена с помощью рентгеновской кристаллографии при наличии высокоупорядочепных трехмерных кристаллов белка с одной стороны и методов его фиксирования в промежуточных состояниях, с другой.
Цель работы заключалась в улучшении дифракционного качества белковых кристаллов, выращенных в липидной кубической фазе, исследовании влияния кристаллического окружения белков на их функциональность спектроскопическими методами и определении условий фиксирования промежуточных состояний белков в кристаллах при низких температурах.
Состояние исследуемых проблем. Кристаллы BR, позволившие определить структуру белка на молекулярном уровне, были получены в результате нового подхода, заключающегося в использовании липидной кубической фазы для кристаллизации мембранных белков. Свойства кубической фазы, определяющие успех кристаллизации, в настоящее время активно изучаются с целью определения механизма кристаллизации белков в этой системе и оценки потенциала данного подхода для кристаллизации мембранных белков [6].
Кристаллизация в кубической фазе позволила получить структуру основного и промежуточных состояний BR с разрешением, достигающим 1.55 А. В результате были определены детали структурных изменений, сопровождающих фотоцикл, как, например, переориентация аминокислотных остатков и движение молекул воды [7]. Однако, структуры некоторых из промежуточных состояний, полученных разными группами, сильно различаются, что ведет к противоречивым заключениям относительно механизмам переноса протона [8]. Причинами этого являются: недостаточно высокое разрешение дифракционных данных, мероэдрическое двойникование кристаллов, понижающее информативность дифракционных данных, и недостаточно полная характеристика промежуточных состояний при условиях сбора дифракционных данных с белковых кристаллов.
Структура SRII, а также его комплекса с трансдюсерным белком, были определены с помощью рентгеноструктурного анализа, однако, их структура в сигнальном состоянии остается неизвестной.
Научная новизна работы. В работе впервые применен метод дифракции нейтронов для изучения механизма кристаллизации в кубической фазе. Благодаря этому оказалось возможным исследование эволюции свойств липидной фазы в процессе кристаллизации и роста кристаллов на одних и тех же образцах.
В процессе оптимизации кристаллизационных условий было обнаружено, что концентрация детргента является важным кристаллизационным параметром, и ее оптимальный выбор позволяет существенно улучшить дифракционное качество кристаллов и воспроизводимость кристаллизационных экспериментов.
В данной работе впервые продемонстрировано, что двойниковые кристаллы белка могут быть расщеплены на одиночные без нарушения кристаллической структуры. Предложенный подход позволил получить кристалл BR без двойпикования, с которого были собраны дифракционные данные с разрешением 1.35А.
В результате разработки нового экспериментального оборудования впервые удалось провести спектроскопические эксперименты с микросекундным временным разрешением в инфракрасном диапазоне на белковых микрокристаллах. Это дало возможность установить влияние кристаллического окружения и упаковки белков на их функциональность. В комбинации с низкотемпературной спектроскопией данный подход позволил наиболее детальную характеристику зафиксированных в кристалле промежуточных состояний.
Практическая ценность работы. Работа представляет общий интерес для белковой кристаллографии. В частности, результаты исследования механизма кристаллизации в кубической фазе представляются важными для кристаллизации и развития методики кристаллизации мембранных белков. Новые подходы к решению проблем двойникования могут быть использованы в других лабораториях для устранения двойникования белковых кристаллов.
Развитые в работе методики характеристики белковых кристаллов спектроскопическими методами представляют интерес для кристаллографических исследований механизмов функционирования белков, поскольку позволяют сравнивать химические и структурные изменения, сопровождающие функционирование белков в кристалле, с изменениями, сопровождающими их функции в естественном окружении. Кроме того, данные результаты могут найти применение в видимой и инфракрасной микроспектроскопии, в частности, для исследования биологических тканей и отдельных клеток. Также микроспектроскопия в комбинации с проточной кюветой может найти применение в исследованиях нециклических биореакций.
Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав и заключения. Первая глава представляет литературный обзор, в котором показано, какое место исследуемые в работе белки, археродопсипы, занимают в биологическом пространстве. Детально рассмотрено современное представление о механизмах функционирования
Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Ефремов, Руслан Геннадьевич
ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ РАБОТЫ
1. В результате исследования поведения липидной кубической фазы в процессе кристаллизации BR с помощью дифракции нейтронов показано: а) кубическая фаза сохраняет симметрию в течение всего процесса кристаллизации; б) структурные изменения липидной фазы, сопровождающие инициацию кристаллизации намного быстрее самого процесса кристаллизации.
2. Установлено, что концентрация детергента является важным кристаллизационным параметром. Ее оптимальный выбор позволил получить кристаллы BR, дающие дифракцию до разрешения 1.2 А.
3. В результате систематических исследований двойникования кристаллов BR, обнаружена корреляция фактора двойникования со скоростью роста кристаллов. Показано, что при замедлении роста, количество кристаллов без двойникования увеличивается.
4. Впервые показано, что двойниковые домены могут быть разделены без потери дифракционного качества, что позволило определить устройство двойниковых кристаллов и получить кристаллы BR без двойникования, дающие дифракцию до разрешения 1.35 А.
5. Развиты спектроскопические методики для характеристики кристаллов белков, позволяющие проведение экспериментов в видимом и ИК диапазонах с микросекундным временным разрешением на образцах с размером -100 мкм.
6. Исследование кристаллов BR и комплекса SRII с Htrll спектроскопическими методами в видимом и ИК диапазонах продемонстрировало: а. BR функционален в кристаллах, однако кристаллическое окружение существенно изменяет кинетику фотоцикла. При этом структурные изменения, сопровождающие промежуточные состояния, одинаковы в ПМ и кристалле. б. Кристаллическое окружение комплекса SRII/Htrll приводит к уменьшению амплитуды структурных изменений, сопровождающих формирование М состояния, однако не изменяет их характер.
7. Сформулированы процедуры фиксирования низкотемпературных промежуточных состояний фотоцикла BR и комплекса SRII/Htrll в кристаллах, которые были использованы для получения структуры К и М состояний комплекса, что впервые позволило получить структурную информацию о передаче сигнала между трансмембранными белками.
Благодарности
В заключение мне бы хотелось поблагодарить моего научного руководителя Горделия Валентина Ивановича, за постановку научных задач и предоставленную свободу для их решения. Я искренне благодарен Георгу Бюлдту за предоставленную возможность выполнить работу в Институте структурной биологии Исследовательского центра г.Юлиха, за постоянную поддержку и продуктивные научные дискуссии. Также выражаю свою признательность Иохиму Хеберле за консультации и помощь в проведении спектроскопических экспериментов на белковых кристаллах. Мне приятно поблагодарить сотрудников Лаборатории нейтронной физики ОИЯИ: Ширяеву Гею Николаевну, Исламова Ахмеда Хусаиновича и Куклина Александра Ивановича, совместно с которыми были выполнены эксперименты по изучению механизма кристаллизации в кубической фазе. За техническую поддержку я благодарен Кристиану Бекену и Саше Неману. За неизменную поддержку в течение обучения в МФТИ хочется поблагодарить кафедру Молекулярной биологии и деканат ФМБФ. Выражаю признательность Льву Сергеевичу Ягужинскому, за ценные научные дискуссии и моральную поддержку. Я сердечно благодарен Diane Barrier за вдохновение, а также моим родителям.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Ефремов, Руслан Геннадьевич, Москва
1. Nelson,D.L. Сох,М.М. (2000) Lehninger Principles of Biochemistry. Worth Publishers, New York.
2. Lanyi,J.K. (2000) Bacteriorhodopsin Biochim Biophys Acta 1460,1-3.
3. Engelhard,M., Schmies,G. Wegener,A.A. (2003) Arhebacterial phototaxis (Batschauer,A., ed.), pp. 2-39. The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK.
4. Lanyi,J.K. Schobert,B. (2004) Local-global conformational coupling in a heptahelical membrane protein: Transport mechanism from crystal structures of the nine states in the bacteriorhodopsin photocycle Biochemistry 43,3-8.
5. Facciotti,M.T., Rouhani,S. Glaeser,R.M. (2004) Crystal structures of bR(D85S) favor a model of bacteriorhodopsin as a hydroxyl-ion pump FEBSLett. 564,301-306.
6. Caffrey,M. (2003) Membrane protein crystallization Journal of Structural Biology 142, 108-132.
7. Sass,H.J. et al. (2000) Structural alterations for proton translocation in the M state of wild-type bacteriorhodopsin Nature 406,649-653.
8. LanyijJ.K. (2004) What is the real crystallographic structure of the L photointermediate of bacteriorhodopsin? Biochim Biophys Acta 1658, 14-22.
9. Oesterhelt,D. Stoeckenius,W. (1971) Rhodopsin-like protein from the purple membrane of Halobacterium halobium Nat New Biol 233, 149-152.
10. Falke,J.J. Hazelbauer,G.L. (2001) Transmembrane signaling in bacterial chemoreceptors Trends Biochem Set 26,257-265.
11. Spudich,J.L., Yang,C.S., Jung,K.H. Spudich,E.N. (2000) Retinyldene Proteins: Structure and function from Archea to Humans лим. Rev. CellDev. Biol. 16,365-392.
12. Beja,0. et al. (2000) Bacterial rhodopsin: evidence for a new type of phototrophy in the SQdi Science Ш% 1902-1906.
13. Bieszke,J.A., Spudich,E.N., Scott,K.L., Borkovich,K.A. Spudich,J.L. (1999) A eukaryotic protein, NOP-1, binds retinal to form an archaeal rhodopsin-like photochemically reactive pigment Biochemistry 38,14138-14145.
14. Venter, J.C. et al. (2004) Environmental genome shotgun sequencing of the Sargasso Sea Science 304,66-74.
15. Brown,L.S. (2004) Fungal rhodopsins and opsin-related proteins: eukaryotic homologues of bacteriorhodopsin with unknown functions Photochem. Photobiol. Sci. 3, 555-565.
16. Waschuk,S.A., Bezerra,A.G., Jr., Shi,L. Brown,L.S. (2005) From the Cover: Leptosphaeria rhodopsin: Bacteriorhodopsin-like proton pump from a eukaryote Proc. Natl. Acad. Sci. U. S A 102,6879-6883.
17. Ihara,K. et al. (1999) Evolution of the archaeal rhodopsins: evolution rate changes by gene duplication and functional differentiation J M»/ Biol 285,163-174.
18. Luecke,H., Schobert,B., Richter,H-T., Cartailler,J.P. Lanyi,J.K. (1999) Structure of bacteriorhodopsin at 1.55 A resolution J Mol Biol 291,899-911.
19. Hayashi,S. et al. (2001) Structural determinants of spectral tuning in retinal proteinsbacteriorhodopsin vs sensory rhodopsin II Journal of Physical Chemistry В 105,1012410131.
20. Henderson,R. (1975) The structure of the риф1е membrane from Halobacterium hallobium: analysis of the X-ray diffraction pattern J Mo/. Biol. 93,123-138.
21. Oesterhelt,D. Stoeckenius,W. (1973) Functions of a new photoreceptor membrane Proc Natl AcadSci USA 70,2853-2857.
22. Krebs,M.P. Isenbarger,T.A. (2000) Structural determinants of purple membrane assembly Вiochim Вiophys Acta 1460,15-26.
23. Birge,R.R. (1990) Nature of the primary photochemical events in rhodopsin and bacteriorhodopsin Biochim Biophys Acta 1016,293-327.
24. Hamm,?., Zurek,M., Roschinger,T., Patzelt,H., Oesterhelt,D.S. Zinth.W. (1997) Subpicosecond infrared spectroscopy on the photoisomerisation of the protonated Schiff base of all-trans retinal Chemical Physics Letters 268,180-186.
25. Dioumaev,A.K. Braiman,M.S. (1997) Two Bathointermediates of the Bacteriorhodopsin Photocycle, Distinguished by Nanosecond Time-Resolved FTIR Spectroscopy at Room Temperature J. Phys. Chem. В 101,1655-1662.
26. Balashov,S.P. Ebrey,T.G. (2001) Trapping and spectroscopic identification of the photointermediates of bacteriorhodopsin at low temperatures Photochem Photobiol 73, 453-462.
27. Chizhov,!., Chemavskii,D.S., Engelhard,M., Mueller,K.H., Zubov,B.V. Hess,B. (1996) Spectrally silent transitions in the bacteriorhodopsin photocycle Biophys JlI, 2329-2345.
28. Zimanyi,L. LanyiJ.K. (1993) Deriving the intermediate spectra and photocycle kinetics from time- resolved difference spectra of bacteriorhodopsin. The simpler case of the recombinant D96N protein Biophys J 64,240-251.
29. Xie,A-H., NagleJ.F. Lozier,R.H. (1987) Flash spectroscopy of риф1е membrane Biophys J Sly 627-635.
30. Fitter,J., Verclas,S.A., Lechner,R.E., Seelert,H. Dencher,N.A. (1998) Function and picosecond dynamics of bacteriorhodopsin in purple membrane at different lipidation and hydration FEBSLett 433, 321-325.
31. Dracheva,S., Bose,S. Hendler,R.W. (1996) Chemical and functional studies on the importance of риф1е membrane lipids in bacteriorhodopsin photocycle behavior £"55 le//382,209-212.
32. Zscherp.C, Schlesinger,R., TittorJ., Oesterhelt,D. HeberleJ. (1999) In situ determination of transient pKa changes of internal amino acids of bacteriorhodopsin by using time-resolved attenuated total reflection Fourier-transform infrared spectroscopy Proc Natl Acad Sci USA 96, 5498-5503.
33. Souvignier,G. Gerwert,K. (1992) Proton uptake mechanism of bacteriorhodopsin as determined by time-resolved stroboscopic-FTIR -spectroscopy: Proton Uptake Mechanism of Bacteriorhodopsin 5/о/7/гу5. J. 63,1393-1405.
34. Aton,B., Doukas,A.G., Callender,R.H., Becher,B. Ebrey,T.G. (1977) Resonance Raman studies of the purple membrane Biochemistry 16,2995-2999.
35. Barth,A. Zscherp,C. (2002) What vibrations tell us about proteins Q. Rev Biophys 35, 369-430.
36. Maeda,A. et al. (1992) Structures of aspartic acid-96 in the L and N intermediates of bacteriorhodopsin: analysis by Fourier transform infrared spectroscopy Biochemistry 31,4684-4690.
37. Lewis,A., SpoonhowerJ., Bogomolni,R.A., Lozier,R.H. Stoeckenius,W. (1974) Tunable laser resonance raman spectroscopy of bacteriorhodopsin Proc Natl Acad Sci U S A 11,4462-4466.
38. Braiman,M.S., Mogi,T., Marti,T., Stem,L.J., Khorana,H.G. Rothschild,K.J. (1988) Vibrational spectroscopy of bacteriorhodopsin mutants: light-driven proton transport involves protonation changes of aspartic acid residues 85, 96, and 212 Biochemistry 27, 8516-8520.
39. Maeda,A. (1995) Application of FTIR spectroscopy to the structural study on the function of bacteriorhodopsin Isr. J. Chem. 35,387-400.
40. Heberle,J. Dencher,N.A. (1992) Surface-bound optical probes monitor proton translocation and surface potential changes during the bacteriorhodopsin photocycle Proc Natl Acad Sci USAS% 5996-6000.
41. Xiao,Y., Hutson,M.S., Belenky,M., Herzfeld,J. Braiman,M.S. (2004) Role of arginine-82 in fast proton release during the bacteriorhodopsin photocycle: a timeresolved FT-IR study of purple membranes containing 15N-labeled arginine Biochemistry 43,12809-12818.
42. Garczarek,F., Wang, J., El Sayed,M.A. Gerwert,K. (2004) The assignment of the different infrared continuum absorbance changes observed in the 3000-1800-cm(-l) region during the bacteriorhodopsin photocycle Biophys J 87,2676-2682.
43. Garczarek,F., Brown,L.S., Lanyi,J.K. Gerwert,K. (2005) Proton binding within a membrane protein by a protonated water cluster Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 102, 3633-3638.
44. Pfefferle,J.M., Maeda,A., Sasaki,J. Yoshizawa,T. (1991) Fourier transform infrared study of the N intermediate of bacteriorhodopsin Biochemistry 30, 6548-6556.
45. Vonck,J. (1996) A three-dimensional difference map of the N intermediate in the bacteriorhodopsin photocycle: part of the F helix tilts in the M to N transition Biochemistry 35,5870-5878.
46. Sass,H.J. et al. (1997) The tertiary structural changes in bacteriorhodopsin occur between M states: X-ray diffraction and Fourier transform infrared spectroscopy EMBO 716,1484-1491.
47. Zscherp,C. Heberle,J. (1997) Infrared difference spectra of the intermediates L, M, N, and О of the bacteriorhodopsin photoreaction obtained by time-resolved attenuated total reflection spectroscopy У P/?;; Chem В 101,10542-10547.
48. HeberieJ., Fitter,!., Sass,H.J. Buldt,G. (2000) Bacteriorhodopsin: the functional details of a molecular machine are being resolved Biophys Chem 85,229-248.
49. Zscherp,C., Schlesinger,R. Heberle,J. (2001) Time-Resolved FT-IR Spectroscopic Investigation of the pH-Dependent Proton Transfer Reactions in the E194Q Mutant of Bacteriorhodopsin Biochem Biophys Res Commun 283, 57-63.
50. Balashov,S.P. Litvin,F.F. (1976) Primary photochemical reactions of bacteriorhodopsin in the purple membrane of Halobacteria at AYiBioorg. Khim. 2, 565566.
51. Sasaki,J., Shichida,Y., Lanyi,J.K. Maeda,A. (1992) Protein changes associated with reprotonation of the Schiffbase in the photocycle of Asp96>Asn bacteriorhodopsin. The MN intermediate with unprotonated Schiffbase but N-like protein structure J Biol Chem 267,20782-20786.
52. Chen,W.G. Braiman,M.S. (1991) Kinetic-Analysis of Time-Resolved Infrared Difference Spectra of the L-Intermediates and M-lntermediates of Bacteriorhodopsin Photochemistry and Photohiology 54,905-910.
53. Balashov,S.P. (2005) Photoreactions of the photointermediates of bacteriorhodopsin Isr. У.С/гет. 35,415-428.
54. Pebay-Peyroula,E., Rummel,G., Rosenbusch,J.P. Landau,E.M. (1997) X-ray structure of bacteriorhodopsin at 2.5 angstroms from microcrystals grown in lipidic cubic phases Science 111, 1676-1681.
55. Grudinin,S., Buldt,G., Gordeliy,V. Baumgaertner,A. (2005) Water molecules and hydrogen-bonded networks in bacteriorhodopsin-molecular dynamics simulations of the ground state and the m-intermediate Biophys J 8S, 3252-3261.
56. Edman,K. et al. (1999) High-resolution X-ray structure of an early intermediate in the bacteriorhodopsin photocycle Nature 401, 822-826.
57. Schobert,B., Cupp-Vickery,J., Homak,V., Smith,S. Lanyi,J. (2002) Crystallographic structure of the К intermediate of bacteriorhodopsin: conservation of free energy after photoisomerization of the retinal У. Mol. Biol. 321,715-726.
58. Royant,A., Edman,K., Ursby,T., PebayPeyroula,E., Landau,E.M. Neutze,R. (2000) Helix deformation is coupled to vectorial proton transport in the photocycle of bacteriorhodopsin Nature 406,645-648.
59. Edman,K. et al. (2004) Deformation of helix С in the low temperature L-intermediate of bacteriorhodopsin Journal of Biological Chemistry 279,2147-2158.
60. Lanyi,J.K. Schobert,B. (2003) Mechanism of proton transport in bacteriorhodopsin from crystallographic structures of the K, L, M-1, M-2, and M-2 intermediates of the photocycle J Mo/ Biol 328,439-450.
61. Lanyi,J. Schobert,B. (2002) Crystallographic structure of the retinal and the protein after deprotonation of the schiff base: the switch in the bacteriorhodopsin photocycle У Mol Biol 321,727-737.
62. Facciotti,M.T. et al. (2001) Structure of an early intermediate in the M-state phase of the bacteriorhodopsin photocycle Biophys J 81,3442-3455.
63. Luecke,H., Schobert,B., Richter,HT., CartaillerJ.P. &Lanyi,J.K. (1999) Structural Changes in Bacteriorhodopsin During Ion Transport at 2 Angstrom Resolution Science 286,255-261.
64. Schobert,B., Brown,L.S. Lanyi,J.K. (2003) Crystallographic structures of the M and N intermediates of bacteriorhodopsin: assembly of a hydrogen-bonded chain of water molecules between Asp-96 and the retinal Schiff base У Л/о/ Biol 330,553-570.
65. Rouhani,S. et al. (2001) Crystal Structure of the D85S Mutant of Bacteriorhodopsin: Model of an 0-like Photocycle Intermediate У Mo/5/o/313,615-628.
66. Haupts,U., Tittor,J., Bamberg,E. Oesterhelt,D. (1997) General concept for ion translocation by halobacterial retinal proteins: the isomerization/switch/transfer (1ST) model Biochemistry 36,2-7.
67. Brown,LS., Dioumaev,A.K., Needleman,R. LanyiJ.K. (1998) Local-access model for proton transfer in bacteriorhodopsin Biochemistry 37, 3982-3993.
68. Facciotti,M.T., Rouhani-Manshadi,S. Glaeser,R.M. (2004) Energy transduction in transmembrane ion pumps Trends Biochem. Sci. 29,445-451.
69. Herzfeld,J. Lansing,J.C. (2002) Magnetic resonance studies of the bacteriorhodopsin pump cycXtAnnu. Rev. Biophys Biomol. Struct. 31,73-95.
70. HohenfeldJ.P., Wegener,A-A. Engelhard,M. (1999) Purification of histidine tagged bacteriorhodopsin, pharaonis halorhodopsin and pharaonis sensory rhodopsin II functionally expressed in Escherichia coli FEBSLett 442,198-202.
71. Luecke,H., Schobert,B., LanyiJ.K., Spudich,E.N. Spudich,J.L. (2001) Crystal Structure of Sensory Rhodopsin И at 2.4 A: Insights into Color Tuning and Transducer Interaction Science 293, 1499-1503.
72. Royant,A. et al. (2001) X-ray structure of sensory rhodopsin II at 2.1 -A resolution Proc Natl Acad Sci t 5 A 98:10131-6
73. ChizhovJ., Schmies,G., Seidel,R., Sydor,J.R., Luttenberg,B. Engelhard,M. (1998) The photophobic receptor from Natronobacterium pharaonis: temperature and pH dependencies of the photocycle of sensory rhodopsin II BiophysJlS, 999-1009.
74. Imamoto,Y., Shichida,Y., HirayamaJ., Tomioka,H., Kamo,N. Yoshizawa,T. (1992) Nanosecond laser photolysis of phoborhodopsin: from Natronobacterium pharaonis appearance of KL and L intermediates in the photocycle at room temperature Potochem. Photobiol. 56,1129-1134.
75. HirayamaJ., Imamoto,Y., Shichida,Y., Kamo,N., Tomioka,H. Yoshizawa,T. (1992) Photocycle of phoborhodopsin from haloalkaliphilic bacterium (Natronobacterium pharaonis) studied by low-temperature spectrophotometry Biochemistry 31,2093-2098.
76. Kandori,H., Shimono,K., Sudo,Y., Iwamoto,M., Shichida.Y. Kamo,N. (2001) Structural Changes of pharaonis Phoborhodopsin upon Photoisomerization of the Retinal Chromophore: Infrared Spectral Comparison with Bacteriorhodopsin Biochemistry 40,9238-9246.
77. Engelhard.M., Scharf,B. Siebert,F. (1996) Protonation changes during the photocycle of sensory rhodopsin II from Natronobacterium pharaonis FEBSLett 395,195-198.
78. Hein,M., Wegener,A.A., Engelhard,M. Siebert,F. (2003) Time-Resolved FTIR Studies of Sensory Rhodopsin II (NpSRIl) from Natronobacterium pharaonis: Implications for Proton Transport and Receptor Activation BiophysJ. 84,1208-1217.
79. Furutani,Y., Iwamoto,M., Shimono,K., Kamo,N. Kandori,H. (2002) FTIR Spectroscopy of the M Photointermediate in pharaonis Phoborhodopsin BiophysJ. 83, 3482-3489.
80. Balashov.S.P., Sumi,M. Kamo,N. (2000) The M Intermediate of Pharaonis Phoborhodopsin Is Photoactive Biophys J 78,3150-3159.
81. Furutani,Y. et al. (2004) FTIR Spectroscopy of the О Photointermediate in pharaonis Phoborhodopsin Biochemistry 43, 5204-5212.
82. Wegener,A.A., Chizhov,!., Engelhard,M. Steinhoff,H.J. (2000) Time-resolved detection of transient movement of helix F in spin-labelled pharaonis sensory rhodopsin IIУ Mo/5/0/301,881-891.
83. Sudo,Y., Iwamoto,M., Shimono,K., Sumi,M. Kamo,N. (2001) Photo-induced proton transport of pharaonis phoborhodopsin (sensory rhodopsin II) is ceased by association with the transducer Biophys J 80, 916-922.
84. Furutani,Y., Sudo,Y., Kamo,N. Kandori,H. (2003) FTIR spectroscopy of the complex between pharaonis phoborhodopsin and its transducer protein Biochemistry 42,48374842.
85. Furutani,Y., Kamada,K., Sudo,Y., Shimono,K., Kamo,N. Kandori,H. (2005) Structural changes of the complex between pharaonis phoborhodopsin and its cognate transducer upon formation of the M photointermediate Biochemistry 44,2909-2915.
86. Hippler-Mreyen,S. et al. (2003) Probing the sensory rhodopsin II binding domain of its cognate transducer by calorimetry and electrophysiology J M Biol 330, 1203-1213.
87. Gordeliy,V.I. et al. (2002) Molecular basis of transmembrane signalling by sensory rhodopsin Il-transducer complex Nature 419,484-487. 88. McPherson,A. (1998) Crystallization of Biological Macromolecules. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
88. Michel,H. (1991) Crystallization of Membrane Proteins. CRC Press, Boca Raton.
89. Faham,S. Bowie,J.U. (2002) Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure У Mo/5/o/ 316,1-6.
90. Takeda,K. et al. (1998) A novel three-dimensional crystal of bacteriorhodopsin obtained by successive fusion of the vesicular assemblies J Mol Biol 283, А6ЪА1А.
91. Lindblom,G. Rilfors,L. (1989) Cubic Phases and Isotropic Structures Formed by Membrane-Lipids Possible Biological Relevance Biochimica et Biophysica Acta 988, 221-256.
92. Engblom,J., Miezis,Y., Nylander,T., Razumas,V. Larsson,K. (2000) On the swelling ofmonoolein liquid-crystalline aqueous phases in the presence of distearoylphosphatidylglycerol. Progr. Colloid Polym. Sci. 2000, 116, 9-15
93. Anderson,S. (1988) Minimal surfaces and structures Chem. Rew. 88,221-242.
94. Schwarz,U.S. Gompper,G. (1999) Systematic approach to bicontinuous cubic phases in ternary amphiphilic systems Phys. Rev. E Stat. Phys. Plasmas. Fluids Relat Interdiscip. Topics. 59, 5528-5541.
95. Qiu,H. Caffrey,M. (2000) The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects Biomaterials 21,223-234.
96. Misquitta,Y. et al. (2004) Rational design of lipid for membrane protein crystallization J. Struct. Biol. 148,169-175.
97. Misquitta,Y. Caffrey,M. (2003) Detergents destabilize the cubic phase ofmonoolein: implications for membrane protein crystallization Biophys. J. 85,3084-3096.
98. Landau,E.M. Rosenbusch,J.P. (1996) Lipidic cubic phases: a novel concept for the crystallization of membrane proteins Proc Natl Acad Sci USA 93,14532-14535.
99. Caffrey,M. (2003) Membrane protein crystallization Journal of Structural Biology 142, 108-132.
100. Nollert,P., Qiu,H., Caffrey,M., Rosenbusch,J.P. Landau,E.M. (2001) Molecular mechanism for the crystallization of bacteriorhodopsin in lipidic cubic phases FEBS Z,e//504, 179-186.
101. Grabe,M., Neu,J., Oster,G. Nollert,P. (2003) Protein interactions and membrane geometry Biophys. J. 84, 854-868.
102. Qutub,Y., Reviakine,!., Maxwell,C., Navarro,J., Landau,E.M. Vekilov,P.G. (2004) Crystallization of transmembrane proteins in cubo: mechanisms of crystal growth and defect formation УМ?/. Biol. 343,1243-1254.
103. Parsons,S. (2003) Introduction to twinning Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 59, 1995-2003.
104. Dauter,Z. (2003) Twinned crystals and anomalous phasing Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 59,2004-2016.
105. Terwisscha van Scheltinga,A.C., Valegard,K., Hajdu,J. Andersson,!. (2003) MIR phasing using merohedrally twinned crystals Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 59, 2017-2022.
106. Yeates,T.O. (1997) Detecting and overcoming crystal twinning Methods Enzymol. 276, 344-358.
107. Luecke,H., Richter,H.T. Lanyi,J.K. (1998) Proton transfer pathways in bacteriorhodopsin at 2.3 angstrom resolution Science 280,1934-1937.
108. Qiu,H. Caffrey,M. (1998) Lyotropic and thermotropic phase behavior of hydrated monoacylglycerols: Structure characterization of monowaccenin Journal of Physical Chemistry В 102,4819-4829.
109. Lorber,B., Bishop,J.B. DeLucas,L.J. (1990) Purification of octyl beta-Dglucopyranoside and re-estimation of its micellar size Biochim Biophys Acta 1023,254265.
110. Oesterhelt,D. 8L Stoeckenius,W. (1974) Isolation of the cell membrane of Halobacterium halobium and its fractionation into red and purple membrane Methods Enzymol 31, 667-678.
111. Rehorek,M. Heyn,M.P. (1979) Binding of all-trans-retinal to the риф1е membrane. Evidence for cooperativity and determination of the extinction coefficient Biochemistry 18,4977-4983.
112. Dencher,N.A. Heyn,M.P. (1978) Formation and properties of bacteriorhodopsin monomers in the non-ionic detergents octyl-beta-D-glucoside and Triton X-100 FEBS Lett 96,322-326.
113. Tatulian,S-A. (2003) Attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy: a method of choice for studying membrane proteins and lipids Biochemistry 42,11898-11907.
114. Goormaghtigh,E., Raussens,V. Ruysschaert,J.M. (1999) Attenuated total reflection infrared spectroscopy of proteins and lipids in biological membranes Biochim Biophys cto 1422,105-185. 116. daCosta,C.J. BaenzigerJ.E. (2003) A rapid method for assessing lipid:protein and detergent:protein ratios in membrane-protein crystallization Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 59,77-83.
115. СвергунД.И., Фейгин,Л.A. (1986) Рентгеновское и нейтронное малоугловое рассеяние. "Наука", Москва.
116. Липсон,Г-, Стипл,Г- (1972) Интерпретация порошковых рентгенограмм. "МИР", Москва.
117. Исламов, А. X. (2003) Сравнительное исследование структуры и свойств липидных мембран с помощью рассеяния нейтронов и рентгеновских лучей. Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова.
118. Wilson, А. J.C. (1949) The Probability Distribution of X-ray Intensities Acta Cryst. 2, 318-321.
119. Britton,D. (1972) Estimation of twinning parameter for twins with exactly superimposed reciprocal lattices Acta Cryst. A 28,296-297.
120. Fisher,R.G. Sweet,R.M. (1980) Treatment of diffraction data from protein crystals twinned by merohedry Acta Cryst. A 36, 755-760.
121. Yeates,T.O. (1988) Simple Statistics for Intensity Data from Twinned Specimens Acta Crystallographica Section A 44, 142-144.
122. Stanley,E. (1972) Identification of Twins from Intensity Statistics Journal of Applied Crystallography 5,191
123. Stanley,E. (1972) Identification of Twins from Intensity Statistics Journal of Applied Crystallography S 191-&.
124. Collaborative Computational Project,No.4. (1994) The CCP4 suite: programs for protein crystallography c/a Crystallogr D SQ, 1вО-1ЬЪ.
125. Efremov,R., Moukhametzianov,R., Buldt,G. Gordeliy,V. (2004) Physical detwinning of hemihedrally twinned hexagonal crystals of bacteriorhodopsin 5/орЛу5. J. 87, 36083613.
126. Griffiths,?.R. de Haseth,J.A. (1986) Fourier transforme infrared spectrometry. John Wiley Sons Inc., New York.
127. Hehn, D. Untersuchung der Struktur und Dynamik von BacteriorhodopsinIntermediaten mit hochaufloesenden Methoden. 2
129. Bolwien, С Zeitauflosende Schwingungsspektroskopie an Bacteriorhodopsin und Halorhodopsin. 2
130. Institut fiir biologische Informationsverarbeitung 2, FZ-Jiilich.
131. Malinowski,E.R. Howery,D.G. (1989) Factor analysis in chemistry. Robert E. Krieger Publishing Co., Inc., Malabar, Florida.
132. Ruckebusch,C., DuponcheI,L., Sombret,B., Huvenne,J.P. Saurina,J. (2003) Timeresolved step-scan FT-IR spectroscopy: focus on multivariate curve resolution J. Chem. Inf Comput. Sci. 43,1966-1973. 133. HeBling,B., Souvignier,G. Gerwert,K. (1993) A model-independent approach to assigning bacteriorhodopsins intramolecular reactions to photocycle intermediates Л/ор/2у5 У 65,1929-1941.
133. Nagle,J.F. (1991) Solving complex photocycle kinetics. Theory and direct method BiophysJ5%Aie-A.
134. Onsager,L. (1931) Reciprocal relations in irreversible processes Phys. Rev. 37,405-426.
135. Lozier,R.H., Xie,A., Hofrichter,J. Clore,G.M. (1992) Reversible steps in the bacteriorhodopsin photocycle Proc Natl Acad Sci USA 89,3610-3614.
136. Zimanyi,L., Varo,G., Chang,M., Ni,B., Needleman,R. Lanyi,J.K. (1992) Pathways of proton release in the bacteriorhodopsin photocycle Biochemistry 31, 8535-8543.
137. Varo,G. Lanyi,J.K. (1991) Thermodynamics and energy coupling in the bacteriorhodopsin photocycle Biochemistry 30, 5016-5022.
138. Nagle,J.F., Zimanyi,L. Lanyi,J.K. (1995) Testing BR photocycle kinetics Biophys J 68,1490-1499.
139. Mueller,K.H. Plesser,T. (1991) Variance reduction by simultaneous multiexponential analysis of data sets from different experiments Eur. Biophys. J. 19,231240.
140. Kuntsevich, A. Kappel,F. (1997) SolvOpt: The Solver for Local Nonlinear Optimization Problems, http://www.unigraz.at/imawww/kuntsevich/solvopt/index.html.
141. Misquitta,Y. Caffrey,M. (2003) Detergents destabilize the cubic phase of monoolein: implications for membrane protein crystallization Biophys J S5,3084-3096.
142. Landau,E.M. (2003) In Cubo Crystallization of Membrane Proteins In: Membrane Protein Purification and Crystallization (Hunte,C., von Jagow,G. Schaegger,H., eds.), pp. 285-
144. Gmelin, V. Strukturelle und functionelle Untersuchungen an der lichtgetribenen Anionenpumpe Halorhodopsin aus Halobacterium salinarum. 2
145. Fakultat ftir Chemie und Pharmazie der Ludwig-Maximilians-Universitaet, Muenchen.
146. Nollert,P., Qiu,H., Caffrey,M., Rosenbusch,J.P. Landau,E.M. (2001) Molecular mechanism for the crystallization of bacteriorhodopsin in lipidic cubic phases FEBS Lett. 504, 179-186.
147. Caffrey,M. (2000) A lipids eye view of membrane protein crystallization in mesophases Curr Opin Struct Biol 10,486-497.
148. Mozzarelli,A. Rossi,G.L. (1996) Protein function in the crystal Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 25,343-365.
149. Fischer,U. Oesterhelt,D. (1979) Chromophore equilibria in bacteriorhodopsin Biophys. J. 2%,2\\-2Ъ0.
150. Metz,G., Siebert,F. Engelhard,M. (1992) Asp85 is the only internal aspartic acid that gets protonated in the M intermediate and the purple-to-blue transition of bacteriorhodopsin. A solid-state 13C CP-MAS NMR investigation FEBS Lett 303,237241.
151. Hildebrandt,P. Stockburger,M. (1984) Role of water in bacteriorhodopsins chromophore: resonance Raman study Biochemistry 23,5548.
152. Schenkl,S. et al. (2003) Compositional heterogeneity reflects partial dehydration in three-dimensional crystals of bacteriorhodopsin J. Mol. Biol. 329, 711-719.
153. Royant,A., Edman,K., Ursby,T., Pebay-Peyroula,E., Landau,E.M. Neutze,R. (2001) Spectroscopic characterization of bacteriorhodopsins L-intermediate in 3D crystals cooled to 170 К Photochem Photobiol 74, 794-804.
154. Scherrer,P., Mathew,M.K., Sperling,W. Stoeckenius,W. (1989) Retinal isomer ratio in dark-adapted purple membrane and bacteriorhodopsin monomers Biochemistry 28, 829-834.
155. Mogi,T., Stern,L.J., Marti,T., Chao,B.H. Khorana,H.G. (1988) Aspartic acid substitutions affect proton translocation by bacteriorhodopsin Proc Natl Acad Sci USA 85,4148-4152.
156. Tittor,J., Paula,S., Subramaniam,S., Heberle.J., Henderson,R. Oesterhelt,D. (2002) Proton translocation by bacteriorhodopsin in the absence of substantial conformational changes JM?/. Biol. 319, 555-565.
157. Bagley,K., Dollinger,G., Eisenstein,L., Singh,A.K. Zimanyi,L. (1982) Fourier transform infrared difference spectroscopy of bacteriorhodopsin and its photoproducts Proc Natl Acad Sci USA79,4972-4976.
158. HeberleJ., Buldt,G., Koglin,E., RosenbuschJ.P. Landau,E.M. (1998) Assessing the functionality of a membrane protein in a three-dimensional crystalJ Mol Biol 281, 587592.
159. HofrichterJ., Henry,E.R. Lozier,R.H. (1989) Photocycles of bacteriorhodopsin in light- and dark-adapted риф1е membrane studied by time-resolved absoфtion spectroscopy Biophys J 56,693-706.
161. Rothschild,K.J. (1991) Protein dynamics in the bacteriorhodopsin photocycle: submilHsecond Fourier transform infrared spectra of the L, M, and N photointermediates Proc Natl Acad Sci US ASS, 2388-2392.
162. Gerwert,K., Hess,B., SoppaJ. Oesterhelt,D. (1989) Role of aspartate-96 in proton translocation by bacteriorhodopsin Proc Natl Acad Sci USA 86,4943-4947.
163. Sasaki,J., Lanyi,J.K., Needleman,R., Yoshizawa,T. Maeda,A. (1994) Complete identification of С О stretching vibrational bands of protonated aspartic acid residues in the difference infrared spectra of M and N intermediates versus bacteriorhodopsin Biochemistry 33,3178-3184.
164. Takei,H., Gat,Y., Rothman,Z., Lewis,A. Sheves,M. (1994) Active site lysine backbone undergoes conformational changes in the bacteriorhodopsin photocycle Journal, of Biological Chemistry. 269, 7387-7389.
165. Xie,A.H. (1990) Quantum efficiencies of bacteriorhodopsin photochemical reactions Biophys J 58,1127-1132.
166. Smith,S.O., Lugtenburg,J. Mathies,R.A. (1985) Determination of retinal chromophore structure in bacteriorhodopsin with resonance Raman spectroscopy J Membr Biol S5,95-109.
167. Rothschild,K.J., Roepe,P., Lugtenburg,J. Pardoen,J.A. (1984) Fourier transform infrared evidence for Schiff base alteration in the first step of the bacteriorhodopsin photocycle Biochemistry 23,6103-6109.
168. Balashov,S.P., Imasheva,E.S., Litvin,F.F. Lozier,R.H. (1990) The N intermediate of bacteriorhodopsin at low temperatures: stabilization and photoconversion FEBS Lett 271, 93-96.
169. Mitsuoka,K. et al. (1999) The Structure of Bacteriorhodopsin at 3.0 Resolution Based on Electron Crystallography: Implication of the Charge Distribution У M?/5/o/286, 861-882.
170. Subramaniam,S. Henderson,R. (2000) Molecular mechanism of vectorial proton translocation by bacteriorhodopsin Nature 406,653-657.
171. Balashov, S. P., Lu, M., Imasheva, E. S., Govindjee, R., Ebrey, T. G., Othersen, В., Chen, Y. M., Crouch, R. K., and Menick, D. R. (1999) The proton release group of bacteriorhodopsin controls the rate of the final step of its photocycle at low pH. Biochemistry Usa 38, 2026-2039.
172. Braiman,M.S., Ahl,P.L. Rothschild,K.J. (1987) Millisecond Fourier-transform infrared difference spectra of bacteriorhodopsins M412 photoproduct Proc Natl Acad Sci US AS4, 5221-5225.
173. Hildebrandt,V., FendIer,K., Heberie,J., Hoffmann,A., Bamberg,E. BuIdt,G. (1993) Bacteriorhodopsin expressed in Schizosaccharomyces pombe pumps protons through the plasma membrane Proc Natl Acad Sci USA 90,3578-3582.
174. Belrhali,H. et al. (1999) Protein, lipid and water organization in bacteriorhodopsin crystals: a molecular view of the риф1е membrane at 1.9 A resolution Structure Fold Des 1,909-9X1.
175. Zaccai,G. (1987) Structure and hydration of purple membranes in different conditions J Mol Biol 194,569-512.
176. Edman,K. et al. (2002) Early structural rearrangements in the photocycle of an integral membrane sensory receptor Structure 10,473-482.
177. FurutanijY., Sudo,Y., Kamo,N. Kandori,H. (2003) FTIR spectroscopy of the complex between pharaonis phoborhodopsin and its transducer protein Biochemistry 42,48374842.
178. Kriminski,S., Kazmierczak,M. Thome,R.E. (2003) Heat transfer from protein crystals: implications for flash-cooling and X-ray beam heating Acta Crystallogr D Biol Сгу5? 59,697-708.
-
Ефремов, Руслан Геннадьевич
-
кандидата физико-математических наук
-
Москва, 2005
-
ВАК 03.00.02
- Исследование взаимодействия полностью транс-ретиналя с компонентами фоторецепторной мембраны и ретиналь-переносящими белками
- Кристаллизация мембранных белков методом in meso
- Функции ретиналя - хромофора зрительного пигмента родопсина, в норме и при патологии
- Фотоиндуцированные процессы и их роль в функционировании бактериородопсина
- Действие физических факторов - видимого света и ионизирующей радиации - на сетчатку глаза
