Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование структуры и функции гена LEG-ARISTA-WING COMPLEX (LAWC) у DROSOPHILA MELANOGASTER

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Исследование структуры и функции гена LEG-ARISTA-WING COMPLEX (LAWC) у DROSOPHILA MELANOGASTER"

&

л

На правах рукописи УДК 577.21 : 595.773.4

ДЖАГАЕВА Инна Валерьевна

ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИИ ГЕНА ЬЕО-АЮБТА-МУШС СОМРЬЕХ (ЬА\УС) У 0К050РН!ЬА ¡\\ELANOGASTER

Специальность 03.00.26 — молекулярная генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1998

Работа выполнена в лаборатории нейрогенеТики к генетики:' развития Института биологии гена РАН.

Научные руководители:

член.-корр«спондеат РАН,, доктор медицинских наук, профессор Л. И. Корочкин,

кандидат биологических наук (1. Б-Симонова.

О ф и ц I Га л ы 1 ьг е о Н'ио и е н т ы:

доктор биологических наук Б. А. Кузин кандидат бийлогических наук Е. ЬГ. Набир'очкина

В е д у щ а я о р га ни з а ц и я:

Институт молекулярной биологии им. В. А, Энг.ельгардта' РАН..

Защита диссертации состоится «^-г2:». . . 1998 го-

да в «. 4 ( .» часов на заседании Диссертационного совета' Д.200.30.01 При Институте биологии гена РАН по- адресу:: 117334, Москва, ул, Вавилона, 34/5,

С Диссертацией мбжно Ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В: А. Энгельгардта' РАН по» адресу 1Л7984, Москва,,ул. Вавилова, 32,

Автореферат разослан < £.4. » .. . .. 1998 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета'

канд. фарм. наук Грабовская Л. С.

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность задачи.

Ранее была получена мутация в новом гене, названном

leg-arista-wing complex (lawc) (Симонова О.Б. и др.,

pi

1992). Эта мутация, lawc , обладает широким плеиотропным эффектом, указывающим на вероятную транс-регуляторную функцию гена, и проявляется наличием у мутантных особей: 1) гомеозисной трансформации дистальных сегментов аристы в соответствующие элементы тарзуса; 2) нарушения сегментации члеников торакальных ног; 3) обрезанных, расставленных крыльев; 4) дополнительных щетинок двух видов: удвоенных (или утроенных) исходных и независимо возникших. Картирование показало, что новый ген расположен в области 21.0 морганиды Х-хромосомы, что соответствует 7ЕЗ-4 - 7Е10 району цитологической карты. Было установлено, что исходная lawc мутация, полученная в системе продленной нестабильности (Georgiev P. G. et al., 1990) на фоне Р-М гибридного дисгенеза, вызвана инсерцией двух копий Р-элемента. Генетический анализ новой мутации показал, что она, изменяя экспрессию пронейральных генов Achaete-Scute комплекса, приводит к формированию дополнительных механо-сенсорных органов (Симонова О.Б. и др., 1996). Было также показано совместное участие продуктов гена lawc и zeste в

регуляции экспрессии гена white. Мы предположили, что продукт гена lawc играет важную роль в контроле экспрессии многих генов.

Цель и задачи исследования.

Основная цель данной работы состояла в более подробном исследовании строения и функции нового регуляторного гена lawc.

В работе были поставлены следующие задачи:

1) с помощью генетического анализа исследовать взаимодействие гена lawc и ряда пронейральных и нейрогенных локусов;

2) исследовать особенности ольфакторной и вкусовой чувствительности мутантов гена lawc;

3) молекулярно и генетически охарактеризовать новые аллели локуса lawc;

4) определить нуклеотидную последовательность клона кДНК гена.

Научная новизна и практическое значение работы.

С помощью генетических методов выявлено взаимодействие открытого в лаборатории нового гомеозисного гена lawc с целым рядом других локусов, в

1 Pdel

том числе нейрогенных. Показано, что мутация lawc

значительно усиливает фенотип аллелей гена Serrate (вырезки на крыльях) и полностью супрессирует мутантное проявление аллелей Delta. Слабая крыловая мутация пронейрального локуса cut существенно увеличивает пенетрантность и размер вырезок на крыльях мутации lawc. Показано, что это взаимодействие полностью

супрессируется мутацией Л1 гена Hairless. Впервые исследованы особенности ольфакторной и вкусовой чувствительности мутантов гена lawc. Получены и молекулярно-генетически проанализированы новые аллели. Обнаружена и генетически охарактеризована летальная на эмбриональной стадии развития мутация гена lawc. Была определена нуклеотидная последовательность части кДНК, гомологии среди последовательностей, имеющихся в различных базах данных не обнаружено.

Предварительные данные по секвенированию гена lawc демонстрируют, что это - новый, ранее неизвестный гомеозисный ген. Детальное исследование его функционирования позволит решить ряд спорных вопросов, касающихся взаимодействия пронейральных и нейрогенных локусов в процессе развития нервной системы. Учитывая наличие гомологичных генов у позвоночных, включая млекопитающих и человека, можно предположить, что соответствующие данные будут иметь универсальное

t

значение, касающееся всеобщих закономерностей развития и эволюции нервной ткани. Выделение летальной 1аыс мутации сделает возможным клональный анализ (получение соматических клонов, имеющих гомозиготный летальный генотип), на основе которого выясняется истинная функция гена.

Апробация работа.

Основные научные результаты диссертационной работы бьши представлены: на летней школе Европейского биохимического общества (Спецаи, Греция, 1996), на 38-й Ежегодной конференции по исследованию на дрозофиле (Чикаго, США, 1997), Третьей франко-американской летней школе по нейрогенетике и генетике поведения {Орлеан, Франция, 1997), Первой ежегодной конференции европейского общества нейрогенетики и генетики поведения (Орлеан, Франция, 1997) и на 39-й на Ежегодной конференции по исследованию на дрозофиле (Вашингтон, США, 1998) .

Публикации.

По теме диссертации опубликовано три печатные работы.

Объем я структура диссертации.

Диссертация изложена на ......... страницах

машинописного текста, включая ........ таблиц, .......

рисунка и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, выводов, а также списка литературы, включающего .........источников.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Краткая характеристика различных аллелей гена 1&\*с.

В целях дестабилизации исходной мутации 1аыср1 было проведено скрещивание между линией 1а^ср1 и линией, несущей конструкцию Р(гу+, [ 2-3]}[99В]. В потомстве от этого скрещивания была отмечена высокая частота реверсий (около 40%) и получены новые аллели гена 1акгс, из которых для дальнейшей работы были взяты 1аыс?2г ,

-га^с?5, ХаисР^, 1а^ср1, 1аысРя, 1аь/с35а, 1акс", 1аъгси3 и 1аысрс1е1. Все производные, за исключением 1аыср5, 1аысР1, 1аж?в и 1амс35а, имели сильный мутантный фенотип и не комплементировали с мутацией 1аыс?1. По признаку доминирования их можно расположить следующим образом: 1а(/сЕк1е1 > 2а^ссг > 1аи/сиЭ > 1аыср2, 1а^сР3 > 1а^ср1 > 1а«ср6 > ¿аыс*17, 1аь?с?8, 1а^сЭ5а > 1аис?5. Большинство аллелей имели фенотип, сходный с 1а^ср1 (основные особенности

*

Рис.1 Фенотип мутации 1аь/<?1: 1) ариста а) дикий тип; б)1аыс?1; 2)нога: а)дикий тип; б)1аи/ср1; 3)торакс: а)дикий тип; б)Ла&/ср1 (дополнительные щетинки указаны стрелками).

фенотипа показаны на рисунке 1, характерные вырезки на крыльях - рис. 36), исключение составляли аллели 1аыссг -смятые крылья, частичное исчезновение 2-ой продольной жилки крыла (рис. 2а), _1<эмси3 - стерильность гомозиготных самок и Хаы^'1"1 - дефекты развития крыла (пенетрантность -1%) и торакса (-0.5%), замедленное развитие, полулетальность (одна из форм дефектного торакса показана на рис. 26) . Кроме этого, данные аллели с низкой пенетрантностью проявляли также и особенности фенотипа 1а^ср1.

Рис.2 а) крыло мутантного аллеля 1аюс" (стрелкой показана 2-я продольная жилка) б) торакс особи 1а^ср'"1.

Независимо было получено несколько эмбриональных деталей, одна из которых - 1(1)EF520 - не комплементировала с мутацией lawd31. У линии iawc131 наблюдается низкая (около 1%) пенетрантность вырезок на крыльях, а у гетерозиготных особей lawcP1/!(1)EF520 обнаруживается почти 100% проявление крыловых вырезок, а также других характерных признаков мутации lawc?1 гомеозисной трансформации аристы и наличие лишних щетинок.

Анализ взаимодействия генов lawc и cut.

Продукт пронейрального гомеобокс-содержащего гена cut участвует в формировании центральной и периферической нервной системы дрозофилы, в частности, в формировании экстрасенсорных нейронов. В работе

п

использовался слабый аллель - сt , фенотипически

проявляющийся в наличии небольших вырезок на крыльях pi

(рис.3, в). У lawc мутантов признак крыловых вырезок

имеет обычно слабое проявление (рис.3, б) и низкую

n pi

пенетрантность. Однако, у сt lawc компаундов крыловые вырезки резко усиливаются (рис.3, г) и проявляются у 100% особей. Этот эффект полностью супрессируется мутацией Н1 гена Hairless (фенотипическое проявление -

Г)

Рис. 3. Фенотип крыла: а) дикий тип; б) lawcf1 (пенетрантность ~1%) и гетерозиготные особи lawcpl/l(1)EF520 (пенетрантность почти 100%); в) ct"; г) особи ct'lawd'1; д) D15- один из аллелей гена Delta, стрелками указаны расширения продольных жилок; е) компаунды lawcpd,1/Y; Dls/+; ж) аллель гена Serrate - Ser"'1; з) особи lawc""'1 /Y; Ser8""1 / +

отсутствие отдельных волосков и щетинок), и

** n i i п гетерозиготные особи ct lawc /У; Н/+ имеют фенотип ct .

По данным Хауза (House С., 1959) Я1 мутация аналогично

супрессирует крыловые вырезки у мутантов нейрогенных

локусов Notch (продукт которого является трансмембранным

рецептором) и Serrate (лиганда продукта гена Notch) . Эти

данные указывают на возможное взаимодействие гена lawc с

генами Notch-пути.

Исследование взаимодействия генов lawc и Celta.

Мы протестировали взаимодействие гена lawc с геном Delta, который является нейрогенным и относится к генам Notch-пути, выполняя функцию трансмембранного лиганда. Его экспрессия наблюдается в клетках вентрального компартмента крыла (Doherty D. et al., 1996). Фенотипическим проявлением мутации Delta являются доминантные дельтообразные расширения продольных жилок на дистальном конце крыла (рис 3, д) . Для скрещивания использовались разные аллели локуса Delta - с более сильно (D15 ) и слабо (D112 ) выраженным фенотипом.

pdel

Показано, что мутация lawc полностью восстанавливает мутантный фенотип крыльев у компаундов до дикого типа (рис.3, е) .

Взаимодействие генов lawc и Serrate.

Продукт гена Serrate также, как и Delta является лигандом для трансмембранного рецептора Notch, но он экспрессируется в дорзальном компартменте крылового имагинального диска (Kim J. et al., 1995). Для анализа взаимодействия с геном lawc брали два аллеля гена Serrate: SerBd"1 и Bcf3. Фенотипическим проявлением мутации являются доминантные вырезки, нарушающие до 30% края

pdel

крыла (рис.3, ж) . Для скрещивания были взяты lawc мутанты, не имеющие вырезок на крыльях. В компаундах вырезки увеличиваются и затрагивают 90% края крыла, площадь крыла уменьшается приблизительно в два раза (рис.3, з) . Выживаемость таких особей резко снижается. При температуре 17°С мутантные компаунды детальны. Вышеперечисленные данные позволяют предположить синергизм во взаимодействии генов lawc и Serrate.

Изучение вкусовой и ольфакторной чувствительности.

Для изучения чувствительности к вкусовым раздражителям использовались гетерозиготные особи lawc?1/!(1)EF520, в качестве контроля была взята дикая линия Oregon R. Проверялась чувствительность мух к глюкозе (концентрация раствора - 1М) . Анализировали по 50 особей каждого генотипа. Раствор глюкозы наносился

капилляром на участки, содержащие вкусовые рецепторы: верхнюю губу, элементы тарзуса первой пары ног. Положительной реакцией на раздражитель служило вытягивание хоботка (хоботковый эффект). В этом эксперименте мутантные и дикие особи проявили одинаковую чувствительность. В связи с тем, что у lawcPl/l (1) EF520 мутантов ариста частично трансформирована в тарзус, предполагалось, что элементы тарзуса, находящиеся на аристе, также могут проявлять чувствительность к вкусовым раздражителям. В качестве контроля проверяли реакцию на раздражение нормальной аристы диких особей. Обнаружено, что элементы дополнительной ноги, появляющиеся при гомеозисной трансформации аристы, обладают чувствительностью к вкусовым раздражителям, в отличие от аристы особей контрольной линии.

Для изучения чувствительности мутантов к запахам использовалась линия lawcP1, в качестве контроля - линия Oregon R. Отдельно тестировалось по 100 самцов и самок каждого генотипа, брали 5-7 дневных особей. Проверяли реакцию на различные привлекающие запахи: яблочный уксус, масло фенхеля и масло гвоздики. Рецепторы для восприятия запахов у дрозофилы расположены в антенне. Гомеозисная трансформация аристы (5-й элемент антенны) у lawcP1 особей фенотипически проявляется довольно редко (~0,1%). Несмотря на это, оказалось, что. в среднем

мутанты примерно в два раза менее чувствительны к использованным одорантам.

Молекулярный анализ новых аллелей гена 1акс.

Ранее было показано, что мутация 1аи?ср1 вызвана инсерцией двойной копии неполноразмерного Р-элемента.

Все новые аллели были проанализированы методом блот-гибридизации по Саузерну. Рестриктная карта локуса и исследованных аллелей представлена на рис 4. У мутантов 1аыс?2, 1а^ср3, 1аыс?6 вставка увеличилась по сравнению с 1акср1 на 1,3 т.п.н., . что соответствует величине неполноразмерного Р-элемента исходной линии 1аысрг и позволяет предположить встраивание дополнительного Р-элемента. Линии 1аь?ср2 и 1аыс?ъ отличаются от линии ориентацией крайних встроенных копий, ориентацию предполагаемой средней копии Р-элемента с помощью метода блот-гибридизации по Саузерну определить нельзя. У мутантных аллелей 1алгс35а, 1аыс?1 и 1а^ср8 произошло полное вырезание одной из двух копий Р-элемента. У мутанта lawcp5 оставшаяся копия Р-элемента имеет меньший размер и другую ориентацию. Таким образом, инсерция двойной копии неполноразмерного Р-элемента в одной ориентации у мутанта Лаьгс91 дает сильный мутантный фенотип. Еще одна копия (третья) усиливает его в линиях

1 т.п.н.

Н-НМШ Р-Руи11 К-ЕсоК1 Х-ХЬо1

рде1 сг

рЗ.З

р0.9

р2.2

р7.2

Рис. 4. Рестриктная карта различных аллелей гена 1амс. Делеции обозначены сплошными черными прямоугольниками, вставки - треугольниками. Стрелками указана ориентация встроенных Р-элементов. Область, гибридизующаяся с зондом кДНК обозначена серой линией.

1аигсрг, 1аыср3. Сходство в ориентации вставок у мутантов дает одинаковый фенотип. Аллель 1а^ср6 тоже имеет три копии Р-элемента. Однако, другая их ориентация даёт более слабый мутантный эффект по сравнению с фенотипом 1аы<?2 и 1аыс?ъ. Вырезание одной из двух копий Р-элемента у 1аыс2Ъа, 1а«ср7, 1аысРа и 1а мс*35 приводит к слабому проявлению данных мутаций, причём

противоположная ориентация оставшейся копии у 1аыср5 практически восстанавливает мутантный фенотип до дикого типа. Итак, данные блог-анализа свидетельствуют о том, что эффект, вызванный влиянием инсерций Р-элементов, зависит не только от их размера и места встраивания, но и от числа и ориентации его копий.

У мутанта 1аысРае1 происходит вырезание Р-элементов с захватом части гена размером приблизительно 1 т.п.н. Делеция снизила выживаемость и увеличила время развития особей, которые часто имеют сильные дефекты развития крыла и торакса вплоть до полной их деградации.

Вырезание приблизительно такого же по размеру участка ДНК произошло и у мутанта 1а[/сег. Делеция затронула почти тот же район (содержащий Р-элементы в исходной мутации), но несколько сдвинута по сравнению с мутантами 1аыс?6е1, полностью отсутствует район ЕсоК1-ЕсоКI, соответствующий плазмиде рО.9. Кроме этого,

произошло встраивание участка ДНК неизвестной природы (не имеющего сайтов узнавания для использованных рестриктаэ), размером не менее 1 т.п.н. в соседний район гена, соответствующий плазмиде р3,3. Гибридизация с 3Н-меченными зондами Р-элемента и Stalker in situ на политенных хромосомах слюнных желез личинок lawccr не обнаружила сайтов гибридизации в районе локализации мутации.

У мутантов lawcи3 структурные перестройки произошли в двух районах гена. Обнаружена небольшая инсерция в районе рЗ. 3 гена, приводящая к появлению дополнительного сайта Xhol. В районе р0.9 гена также имеется вставка размером около 2 т.п.н. Природа данных инсерций пока не выяснена. По данным гибридизации in situ район локализации мутации не содержит Р-элемента.

Для эмбриональной летали не удалось пока обнаружить

/

/

район, где произошли изменения. Данная линия была получена при помощи этиленметансульфоната, что позволяет предположить точечную природу этой мутации.

В заключение отметим, что наличие двойной копии Р-элемента у исходного аллеля служит хорошим источником получения нехваток, так как дестабилизация такой инсерции повышает вероятность её неправильного вырезания. В результате могут появиться аллели с неожиданными фенотипическими признаками, как в случае с

делецией 1аисрйе1. Более крупные нехватки, возможно, будут приводить к возникновению леталей, изучение которых позволит точнее охарактеризовать функцию данного гена.

Определение нуклеотидной последовательности гена.

Ранее в лаборатории было получено несколько клонов кДНК гена 1аыс. Наибольший из них имеет вставку размером около 3.5 т.п.н. и гибридизуется с указаными на рис.4 участками гена. Данный клон использовался в дальнейшей работе по определению нуклеотидной последовательности гена. Его рестриктная карта приведена на рисунке 5. Участок Есо&1-ЕсоК.1 р1,1 соответствует району р0,9 геномной карты (рис.4). Для дальнейшей работы часть фрагментов была переклонирована в отдельные плазмиды. Первичную нуклеотидную последовательность определяли по обеим цепям ДНК по методу Сэнгера.

1._

рО.6 I

р11 р1 Лгеу

я

в-»«! Х-.Ш1

|т.п.н

И

5

Рис.5 Рестриктная карта вставки клона кДНК гена 1аыс. Тонкими линиями обозначены участки, переклонированные в отдельные плазмиды.

Была определена последовательность более 1,5 т.п.н., находящихся ближе к 5'-концу мРНК. К сожалению, данный клон кДНК не является полноразмерным. Это пока не позволяет достоверно исследовать экзон-интронную организацию изучаемого гена и, соответственно, проанализировать возможную аминокислотную

последовательность. Поиск в базах данных EMBL, GENBANK, SWISSPROT и GENE пока не обнаружил существенной гомологии с уже известными генами.

Полученные данные являются основой для дальнейшего изучения функции этого гена, а также представляют определенный интерес в исследованиях, связанных с изучением генов, участвующих в нейрогенезе и эмбриогенезе дрозофилы.

Выводы:

1. Впервые показано, что ген lawc взаимодействует с пронейральным локусом cut. Это взаимодействие опосредовано участием продукта гена Hairless.

2. Генетический анализ выявил связь между геном lawc и двумя нейрогенными локусами - Delta и Serrate.

3. Обнаружено, что мутация lawc изменяет чувствительность особей к различным одорантам. Показано, что трансформированная ариста обладает способностью воспринимать вкусовые раздражители.

4. Получены и охарактеризованы новые аллели гена lawc, имеющие различное фенотипическое проявление. Показано, что два из них вызваны делениями. Найдена эмбриональная летальная мутация гена lawc.

5. Впервые определена нуклеотидная последовательность части кДНК гена lawc, найдена открытая рамка считывания. Гомологии с известными последовательностями, имеющимися в базах данных, не обнаружено.

Автор выражает благодарность д.б.н. П.Г.Георгиеву за консультации и обсуждение полученных результатов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Симонова О.Б., Петрук С.Ф., Джагаева И.В.,

локуса white у дрозофилы. II Генетика, 1998, т.34, №3, с.349-354

2. Петрук С.Ф., Джагаева И.В., Солдатов А.В., Симонова О.Б. Клонирование гена leg-arista-wing complex и анализ его мутантных производных у дрозофилы. // Генетика, 1998, т.34, №3, с. 446-448

3. I.Jagaeva, S.Petruk, O.Simonova. Cloning and characterization of the leg-arista-wing-complex(lawc) gene of Drosophila melanogaster. // 39th Annual Drosophila Research Conference, Washington, USA, 1998, p.332

Корочкин Л.И. Роль мутации lawc?1 в регуляции экспрессии