Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование структурной организации и экспресси новых генов антимикробных пептидов злаков
ВАК РФ 03.02.07, Генетика
Автореферат диссертации по теме "Исследование структурной организации и экспресси новых генов антимикробных пептидов злаков"
005004099
Jrtlr^sv■^" — -
Уткина Любовь Леонидовна
ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ^ ЭКСПРЕССИИ НОВЫХ ГЕНОВ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ ЗЛАКОВ
03.02.07 - генетика
- 1 ДЕК 2011
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва-2011
005004099
Работа выполнена в лаборатории генетики растений Учреждения Российской академии наук Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, г. Москва
Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор
Пухальскин Виталий Анатольевич
Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, г. Москва
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор
Карлов Геннадий Ильич
Центр молекулярной биотехнологии РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева, г. Москва
кандидат биологических наук Брускин Сергей Александрович
Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН. г. Москва
Ведущее учреждение: Московский государственный университет
им. М.В. Ломоносова, г. Москва
Зашита диссертации состоится «/5"» ^/ff/Ftfi,? ^СУ/ г. в /Ь ^часов на заседании диссертационного совета Д 002.214.01 при Учреждении Российской академии наук Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН по адресу: 119991, ГСП-!, г. Москва, ул. Губкина, д. 3. Факс: (499) 132-89-62, e-mail: aspirantura@vigg.ru
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.
Автореферат разослан « /4» K Cdipü W/h.
Ученый секретарь
диссертационного совета, , „ , , , i
UiH-ibt-t
кандидат биологических наук ^ 1 .А. Синельщикова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. На фоне стремительного роста населения земного шара проблема повышения урожайности сельскохозяйственных культур становится все более актуальной. Заболевания, вызванные различными патогенами (к которым относятся грибы, бактерии, вирусы, вироиды, а также насекомые и нематоды), наносят существенный урон урожаю, который может составлять от 30 до 70 % (с учетом потерь при хранении) (Oeke et al., 1994). Для защиты от патогенов в сельском хозяйстве применяют три основные стратегии: ротационное земледелие, традиционную селекцию, направленную на получение устойчивых форм, и, наконец, использование химических средств защиты растений. Традиционные методы селекции не всегда эффективны из-за их длительности и отсутствия в ряде случаев источников устойчивости. Использование средств химической защиты растений является дорогостоящим и представляет угрозу экологической безопасности. Кроме этого, возникают формы патогенов, устойчивые к пестицидам, в результате чего снижается их эффективность.
Альтернативной стратегией повышения устойчивости сельскохозяйственных культур к патогенам и насекомым-вредителям, а также к другим стрессовым факторам окружающей среды абиотической природы (засухе, засоленности почвы и пр.) служит генетическая инженерия, которая позволяет встраивать гены, обусловливающие устойчивость, в геномы культурных растений. Важнейшим достижением в этой области было встраивание генов энтомотоксинов бактерии Bacillus thuringiensis в геномы культурных растений, что привело к созданию форм, устойчивых к насекомым-вредителям (Schuler et al., 1998). Еще более перспективным является усиление защитного потенциала самих растений как за счет усиления экспрессии собственных защитных генов, так и за счет встраивания генов защитных соединений из других видов растений, в частности, дикорастущих, которые, в отличие от культурных растений, более устойчивы к патогенным микроорганизмам и практически не изучены.
В ходе эволюции у растений выработалась сложная защитная система, важную роль в которой играют антимикробные пептиды (АМП) (Garcia-Olmedo et al., 1997).
Антимикробные пептиды - это особая группа защитных соединений, которые представлены низкомолекулярными положительно заряженными полипептидами (молекулярная масса менее 10 кДа) амфифильной структуры. По гомологии аминокислотной последовательности, так называемого «цистеинового мотива», и
пространственной структуры выделяют несколько семейств АМП растений (ВгоекасП е1 а\., 1997). АМП обладают широким спектром антимикробного действия, разрушая мембраны патогенов, не вызывают появления устойчивых форм, и их гены могут быть непосредственно встроены в геном чувствительных к патогенам растений. Кроме того, использование для трансформации генов антимикробных пептидов растительного происхождения считается более предпочтительным, чем генов бактерий. Все это делает гены антимикробных пептидов перспективными для трансформации растений с целью повышения их устойчивости. Не менее важный аспект применения АМП состоит в разработке на их основе лекарственных препаратов нового поколения, что требует детального исследования их биологической активности.
Цели и задачи работы. Цель настоящей работы заключалась в исследовании структурной организации и функциональной значимости генов, кодирующих новые антимикробные пептиды злаков.
В процессе работы были решены следующие конкретные задачи:
1. Установление структуры кДНК и предшественников 4-СуБ антимикробных пептидов пшеницы Тпйсит кИгагае.
2. Изучение экспрессии генов 4-Суэ пептидов пшеницы в ответ на биотический и абиотический стресс.
3. Выделение и определение структуры Ю-Суэ антимикробных пептидов колосняка Ъеутш агепапш.
4. Установление структуры кДНК и предшественников Ю-Суэ антимикробных пептидов колосняка.
5. Установление структуры генов, кодирующих 4-Сув и 10-Суэ пептиды пшеницы и колосняка.
6. Изучение межвидового полиморфизма генов антимикробных 4-Сув и Ю-Суэ пептидов у представителей семейства злаковых.
7. Разработка системы гетерологичной экспрессии 4-Сув и 10-СуБ антимикробных пептидов пшеницы и колосняка.
8. Исследование антимутагенного действия тионина пшеницы на клетки человека.
Научная новизна. Впервые получена полноразмерная кДНК, кодирующая 4-
Суэ антимикробные пептиды пшеницы ТгШсит кНаагае и впервые выявлена
уникальная модульная структура предшественников этих пептидов. Впервые
2
исследовано влияние стрессовых факторов биотической и абиотической природы на уровень экспрессии генов 4-Суз антимикробных пептидов пшеницы и показана индукция экспрессии этих генов в ответ на заражение патогенами, а также тепловой и солевой стресс. Из семян колосняка песчаного выделен новый антимикробный Ю-Суэ пептид, и определена его аминокислотная последовательность. Впервые показана гомология пептида колосняка с Ю-Суэ пептидом пшеницы. Впервые установлена структура геномной ДНК, кодирующей Ю-Суэ АМП пшеницы Т. кШагае. Впервые исследован межвидовой полиморфизм генов антимикробных пептидов у разных представителей семейства злаковых на примере двух семейств генов, кодирующих 4-СуБ и Ю-СуБ антимикробные пептиды. Впервые разработана система гетерологичной экспрессии генов 4-СуБ и Ю-Суэ антимикробных пептидов растений. Впервые показано антимутагенное действие тионина пшеницы на клетки человека.
Практическая и теоретическая значимость. Установленные в настоящей работе структуры генов антимикробных пептидов пшеницы могут быть использованы для создания генетических конструкций для трансформации растений с целью получения форм сельскохозяйственных культур, обладающих повышенной устойчивостью к фитопатогенам. Сами пептиды могут быть использованы в качестве прототипов для разработки новых антимикотиков, консервантов пищевых продуктов и антимутагенов.
Разработанные в настоящем исследовании системы гетерологичной экспрессии цистеин-содержащих пептидов в клетках прокариот могут быть использованы для создания технологии получения антимикробных и других цистеин-содержащих пептидов растений.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Гены 4-Суз антимикробных пептидов пшеницы кодируют длинные модульные предшественники, состоящие из пяти-семи пептидных доменов.
2. Экспрессия генов 4-Сув антимикробных пептидов пшеницы активируется в ответ на биотический и абиотический стресс.
3. Гены Ю-Суэ антимикробных пептидов злаковых кодируются предшественниками, состоящими из сигнального пептида, зрелого пептида и С-концевого продомена.
4. Гены 4-Суз и Ю-Суэ пептидов пшеницы присутствуют у разных представителей семейства злаковых, относящихся к родам Ле^г/о/лу, Ьеутш и ТгШсит.
Апробация работы. Результаты исследования представлены на 5-ом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009), V съезде ВОГИС (Москва, 2009), IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), 9-ой конференции молодых ученых «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2009), 14-ой Путинской международной школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2010), III Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2010» (Нижний Новгород, 2010), Международной научной конференции, посвященной 45-летию основания Института генетики и цитологии Национальной АН Беларуси «Генетика и биотехнология на рубеже тысячелетий» (Минск, 2010), XXIII Международной зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2011), 15-ой Пущинской международной школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2011), V Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 2011). Результаты диссертации были доложены на отчетных сессиях (март, 2010; март, 2011) и межлабораторном семинаре «Генетика растений» (октябрь, 2011) ИОГен РАН.
Декларация личного участия автора. Автор самостоятельно получила образцы кДНК и ДНК исследуемых видов злаковых, установила структуру генов антимикробных пептидов пшеницы и колосняка, провела анализ распространения исследуемых генов у разных видов злаковых, выделила пептид LAMP из семян колосняка, разработала систему гетерологичной экспрессии цистеин-богатых пептидов растений. Суммарное личное участие автора составило восемьдесят процентов.
Публикации. По результатам диссертации опубликовано 3 работы, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, и 11 тезисов докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 139 страницах и содержит следующие разделы: благодарности, список сокращений, введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы и список литературы. Работа включает 34 рисунка, 14 таблиц. В списке литературы 209 источников, в том числе 198 на иностранном языке.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
В обзоре литературы подробно рассмотрены основные семейства антимикробных пептидов растений, указаны характерные структурные особенности и функции пептидов этих семейств, описано строение кодирующих их генов. Также в этом разделе систематизированы данные о сайтах протеолитического расщепления белков-предшественников у растений; кратко описана систематика рода Triticum L. и происхождение полиплоидных пшениц.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе были использованы семена и проростки Aegilops speltoides, Aegilops tauschii, Leymus arenarius, Triticum aestivum, Triticum boeoticum, Triticum kiharae, Triticum monococcum, Triticum timopheevii, Triticum urartu. Bee образцы получены из коллекции Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.
Тотальную РНК выделяли из растительного материала с помощью набора реагентов Trizol RNA Prep 100 (Изоген, Россия). Для синтеза первой цепи кДНК использовался набор Mint (Евроген, Россия). Определение структуры полноразмерной кДНК предшественников пептидов проводили сочетанием методов 3'- и 5'-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends). Секвенирование интересующих последовательностей ДНК проводили в Межинститутском Центре коллективного пользования «ГЕНОМ» ИМБ РАН (www.genome-centre.narod.ru).
Определение изменения уровня экспрессии генов 4-Cys пептидов под действием биотических и абиотических стрессовых факторов проводили методом ОТ-ПЦР. Антимикробные свойства отдельного пептида определяли по степени ингибирования прорастания спор нескольких видов фитопатогенных грибов раствором пептида.
Экспрессию рекомбинантных полипептидов осуществляли в составе гибридного белка с тиоредоксином в клетках Escherichia coli. Чистоту целевого
5
полипептида подтверждали МАЛДИ-времяпролетной масс-спектрометрией и N-концевым секвенированием по Эдману.
Поиск гомологов исследуемых генов 4-Cys и 10-Cys пептидов пшеницы у представителей родов Triticum, Aegilops и Leymus проводили путем амплификации кодирующей части генов со специфичных праймеров на матрице геномной ДНК. Геномную ДНК выделяли из пятидневных проростков исследуемых видов с помощью набора реактивов для выделения ДНК Genomic DNA Purification Kit (Fermentas, Литва).
Процедуру выравнивания последовательностей и построение филогенетических деревьев проводили с помощью программы, доступной на сервере genebee.msu.su (АИВее - Multiple Alignment). Поиск гомологичных последовательностей генов и предшественников проводили на сервере ncbi.nlm.nih.gov (BLASTP, BLASTN) и cerealsdb.uk.net. Определение сигнальной последовательности предшественника проводили с помощью программы SignalP 3.0 с сервера expasy.org.
Выделение пептидов проводили сочетанием разных видов высокоэффективной жидкостной хроматографии: аффинной, эксклюзионной и обращенно-фазовой.
Определение антимутагенной активности пуротионина Тк-АМР-ВР и водных экстрактов растений определяли по количеству разрывов ДНК в обработанных и не обработанных антимутагеном клетках человека (перевиваемая линия ЕЮ).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Гены 4-Cys пептидов
Ранее в нашей лаборатории из семян Т. kiharae были выделены два новых пептида Tk-AMP-Xl и Тк-АМР-Х2. Они высокогомологичны, имеют характерный цистеиновый мотив (четыре остатка цистеина, образующих два повтора СХХХС) и различаются только двумя аминокислотными заменами и
наличием трех дополнительных аминокислотных остатков у Тк-АМР-Х1 на С-конце (рис. 1). Эти пептиды обладали высокой антимикробной активностью, ингибируя рост ряда фитопатогенных грибов в микромолярных концентрациях, что делает перспективным их применение против фитопатогенов.
Tk-AMP-xi: tddrGerm'c'qhyhdrrekkqcmkgorygesd
мн и и
Tk-AMP-X2: ADDRCERMCQRY Н DRREKKQCMKGjGRYG Мотив: СХХХС-----------СХХХС
Рис. 1. Аминокислотные последовательности пептидов Тк-АМР-Х1 и Тк-АМР-Х2. Остатки цистеина выделены серым, вариабельные остатки выделены полужирным шрифтом.
Клонирование кДНК, кодирующей 4-Cys пептиды, и установление структуры их предшественников
Были получены два класса последовательностей кДНК, различающихся по длине, структура которых была установлена. Последовательности первого класса представлены двумя формами и кодируют семь цистеин-содержащих пептидов. Последовательности второго класса представлены четырьмя формами и кодируют пять цистеин-содержащих пептидов.
Все полученные гены имеют одинаковую структуру: 5'-нетранслируемая область —* область, кодирующая сигнальный пептид —► область, кодирующая 4-Cys пептиды —> З'-нетранслируемая область.
Анализ полипептидных последовательностей, выведенных по последовательностям кДНК, показал, что их можно разделить на два класса:
1. Полипептидные последовательности длиной 247-266 остатков, образующие в процессе посттрансляционного процессинга пять цистеин-содержащих пептидов. Последовательности этого класса были названы S-последовательностями (от «short» - короткие).
2. Полипептидные последовательности длиной 346-362 остатка, образующие в процессе посттрансляционного процессинга семь цистеин-содержащих пептидов. Последовательности этого класса были названы L-последовательностями (от «long» - длинные).
При анализе полученных последовательностей предшественников были обнаружены несколько пептидов, ранее выделенных из тотального экстракта семян Т. kiharae, но их полная структура установлена не была. Полученные нами данные позволили установить первичную структуру этих пептидов.
Клонирование геномной ДНК, кодирующей 4-Cys пептиды
Анализ геномной ДНК, кодирующей 4-Cys пептиды, выявил, что последовательности ДНК идентичны последовательностям кДНК. Эти данные свидетельствуют о том, что в кодирующей части генов 4-Cys пептидов нет интронов.
При амплификации с геномной ДНК Т. kiharae, кроме генов предшественников S- и L-типов, была получена последовательность ДНК, кодирующая предшественник, содержащий шесть пептидов. Эту последовательность по аналогии с предшественниками других типов назвали М-последовательностью (от «medium» - средний). Надо отметить, что предшественник этого типа не был получен при амплификации с кДНК зачатков семян и проростков. Это может быть связано с тем, что полипептиды такого типа не экспрессируются на этих стадиях развития растений.
Как видно из рис. 2, все предшественники имеют одинаковую структуру: на N-конце каждого предшественника расположен сигнальный пептид длиной 25 аминокислотных остатков, за которым следуют несколько (пять-семь) цистеин-содержащих пептидов, разделенных сайтами специфического протеолиза, и С-концевой продомен. Все пептиды, образующиеся в результате расщепления предшественника, имеют цистеиновый мотив СХХХС(11-14Х)СХХХС, за исключением одного пептидного домена, содержащего пять остатков цистеина.
Сигнальный пептид
Гомолог Тк-АМР-Х1 и Тк-АМР-Х2
Вариабельная область
С-концевой продомен
1 2 3 4 5 б 7 ........,.„,,,,,.„т.......
1
5-7 4-Су5 пептидов
Рис. 2. Схема структуры предшественников 4-Суз пептидов, выведенных из нуклеотидных последовательностей.
В целом, можно сказать, что предшественники Ь-типа отличаются от Б-типа наличием в составе двух дополнительных пептидных доменов (пятого и шестого), а от М-типа - наличием дополнительного шестого пептидного домена.
Установление сайтов специфического протеолитическогорасщепления предшественников 4-Су.ч пептидов
Анализ последовательностей предшественников и предсказание структур зрелых 4-СуБ пептидов проводили на основании:
1. Известных структур пептидов Тк-АМР-Х1 и Тк-АМР-Х2.
2. Известных М-концевых последовательностей пептидов, выделенных ранее из тотального экстракта семян пшеницы.
3. Гомологии последовательностей выведенных пептидов.
4. Данных масс-спектрометрического анализа тотального экстракта из семян пшеницы.
5. Описанных в литературе сайтов специфического протеолиза.
По гомологии аминокислотных последовательностей 4-Суз пептиды можно объединить в семь групп, при этом гомология внутри групп очень высокая (70-100 %), а между группами практически отсутствует (рис. 3). На основании анализа последовательностей пептидов можно предположить, какие аминокислотные остатки являются важными для сохранения структуры пептида или выполнения им своих функций. Например, пептиды пяти групп имеют остаток аспарагиновой кислоты в положении -2 к первому остатку
9
цистеина. Можно предположить, что этот остаток важен для функционирования пептида.
L-X-1 IRW ; КЕ
L-2-1 (М- 1-1) IRX С КЮ
S-1-1 IRW с ЕЕ
S-2-1 IRW С КЕ
S-3-1 IRW с КЕ
S-4-1 IRX Z КЮ
L-1-2 (S- 3-2) GRRHGHEPQDEDGGIPDR KR
s-4-2
l-2-2 s-1-2 s-2-2
l-1-3 l-2-3 s-1-3 s-3-3 s-4-3
l-1-4 s-1-4 s-3-4 s-4-4
L-1-5 L-1-6 М-1-5
l-1-7 М-1-6 s-1-5 s-2-5
ggipd:
(М-1-(Х3)
(М-1-(S-2-
2)
GDSFDSjCjVSCjORGHGGWWGKERWDRORRII RGHGGWWGKERWER RGHGGWWGKERWER
gdsfds gdsfds
(Х2) (xi)
(l-2-4, м-1-4) (s-2-4)
(l-2-5) (G7) HHGGGGHGHGDR (l-2-6) (G6) HHGGGDQAHGDR HHGGGGHGHGDR
(L-2-7)
(s-4-5) (s-3-5)
3ewkagqdtgkare-
;dwkagedtgkare
;dwkagqdtgkare-
:dwkagqdtgkare-
:ewkagqdtgkare-
:dwkagedtgkare-
icjeshedmdsklr---
ceshedmdsklr---
HHGGGGHGHGGSS HHGGGGHGHESSS HHGGGGHGHGGSS
HHGGSSQEQK
2hyhdrrekkq--qryhdrrekkq--2hyhdrrekkq--rhyhdrrekkq— 2hyhdrrekkp—
krfirpgsydrqq-krlrpgsydrqq-krfäpgsydrqq-krlrpgsydrqq-
krfprgsydrwq-kryprgsydrwq-krfprgsydrwq-
qryrheyekeq-qrhrheydrqq-¡qryrheydkqq-qryrheyekeq-
1jshqqd -3shqqd isHQQD
ovrddksgghgga
VRE vre VRCC
ksggggga cksggggga ksgghggaggrgre
Рис. 3. Выравнивание выведенных аминокислотных последовательностей 4-Суя пептидов пшеницы Т. ИИагае. Замены аминокислотных остатков в группах выделены полужирным шрифтом.
Влияние биотических и абиотических стрессовых факторов на уровень экспрессии генов 4-Cys пептидов
Влияние биотического стресса на уровень экспрессии генов 4-Cys пептидов изучали на примере четырех фитопатогенных грибов: Aspergillus niger, Helminthosporium sativum, Fusarium graminearum и Fusarium oxysporum. Показано, что экспрессия изучаемых генов изменяется в зависимости от вида гриба. Наибольшее увеличение экспрессии наблюдается при заражении F. oxysporum - в среднем в 5,8 раза, индуцирование A. niger и Н. sativum также
10
приводит к достоверному увеличению уровня экспрессии (в 2,7 и 2,2 раза соответственно). Заражение F.graminearum не приводит к достоверному увеличению уровня экспрессии (рис. 4). Можно предположить, что F. graminearum, который является специфическим патогеном злаковых, в процессе эволюции выработал механизмы, подавляющие индукцию защитных пептидов, в то время как заражение неспецифическими патогенами вызывает усиление экспрессии генов 4-Cys пептидов.
К A.n. F.g. H.s. F.о. М
А.
Б«» . /¡gtwxfc
bp -500 -250
В. 800
700
ВПП
V
с 500
а.
£ 400
*
300
200
100
**
............... ' т
**
**
ш.......-.....J ш и
A.n.
F.g.
H. s.
F. о.
Рис. 4. Изменение уровня экспрессии генов 4-Cys пептидов пшеницы Т. kiharae при заражении грибными патогенами. А. Уровень мРНК[¡-актина. Б. Уровень мРНК генов 4-Cys пептидов. В. Результаты оценки уровня мРНК 4-Cys пептидов по отношению к контролю, данные приведены в % к среднему контролю ± стандартное отклонение (п=6). Достоверность отличий от контроля определяли тестом t-Стьюдента. Статистически достоверные отличия отмечены ** - р<0,01. К- контроль, А.п. - Aspergillus niger, F.g. -Fusarium graminearum, H.s. - Helminthosporium sativum, F.o - Fusarium oxysporum, M -ДНК-маркер.
Для изучения воздействия абиотического стресса на экспрессию генов 4-
Суэ пептидов были выбраны температурный и солевой стрессы разной
интенсивности. Для исследования температурного стресса растения
выращивали на холоде (+4 °С), при комнатной температуре (+22 °С - контроль)
и при повышенной температуре (+37 °С). Исследование действия солевого
стресса проводили на проростках, выращенных в солевом растворе (100 мМ
№С1, 200 мМ ЫаС1, контроль - вода). В результате проведенных исследований
оказалось, что повышение уровня экспрессии исследуемых генов индуцируется
повышенной температурой (+37 °С) - в 2,8 раза (рис. 5А), а также повышенной
концентрацией соли (200 мМ) - в 2,1 раза (рис. 5Б). В проростках, выращенных
11
при пониженной температуре, уровень экспрессии генов был пониженным, а при действии солевого раствора при концентрации №С1 100 мМ достоверных отличий от контроля не наблюдалось.
А.350
300 250
2
I 200
ь
о 150
ас
3« 100
50 0
** I
нкн
—
**
4 "С 37 *С
Рис. 5. Изменение уровня экспрессии генов 4-Суз пептидов пшеницы Т. ШИагае в условиях абиотического стресса. А. Действие температурного стресса. Б. Действие солевого стресса. Данные приведены в % к среднему контролю ± стандартное отклонение (п=6). Достоверность отличий от контроля определяли тестом 1-Стьюдента. Статистически достоверные отличия отмечены ** -р<0,01. К- контроль.
Изменение уровня экспрессии генов 4-Суз пептидов при выращивании растений в разных температурных режимах может быть связано с общим изменением уровня метаболизма. Причины повышения уровня экспрессии генов при увеличении концентрации соли в среде требуют дальнейших исследований.
Поиск генов-гомологов 4-Суэ пептидов у разных представителей семейства
злаковых
Поскольку генетика злаковых очень сложна, а в образовании полиплоидных пшениц участвовали не менее пяти диплоидных видов, то для исследования распространения генов-гомологов 4-СуБ пептидов были выбраны виды, принимавшие участие в образовании Т. Шкагае (Т. иторкееуп, Ае. ¡аизски), и диплоидные виды - доноры геномов (Т. топососсит, Т. игагЫ, Ае. 8ре1Ш(1е$). Кроме этого, была проанализирована пшеница мягкая -Т. аезШит, которая является основной злаковой культурой в мире, но менее устойчива к фитопатогенам, чем Т. Шагае. Мы предполагаем, что это явление может быть связано, в том числе, и с различиями в генах семейства 4-Суз пептидов. Также для анализа распространения генов 4-СуБ среди злаковых был
12
взят колосняк песчаный ¿еутия агепагш, который не является близкородственным видом для вида Т. Икагае.
Путем амплификации с геномной ДНК с использованием праймеров, специфичных к консервативным участкам генов 4-СуБ пептидов, было показано наличие генов 4-СуБ пептидов во всех видах, кроме Ае. зре1Мс1ез - донора генома В.
Как видно из рис. 6, все предшественники, выведенные по нуклеотидным последовательностям, образуют три больших кластера по числу содержащихся в них 4-СуБ пептидов. На основании полученных данных можно высказать предположение о принадлежности генов, кодирующих тот или иной тип предшественника, к определенным геномам.
0,1
0,2
0.3
0,4
0,5
0.6
а а соро РР
а"аЧ;спр аиа"вв№
аЧ'ссор
аьаьссл)р
а "л "с с
а"а"вврр
а"а"
аьаь
а"а"
а"а"вврр
а"а"ссрр
аусг,
аЧ"вврр
а"аьг,с,рр
аиаиввро
Рис. 6. Филогенетический анализ видов семейства злаковых, основанный на гомологии последовательностей предшественников 4-Су5 пептидов. В правой колонке указан геномный состав вида.
Так, гены, кодирующие предшественники S-типа, связаны с геномом D, так как это единственный тип предшественника, обнаруженный у Ае. tauschii, и этот тип предшественника обнаружен во всех проанализированных видах, имеющих в составе своего генома геном D (Т. kiharae, Т. aestivum).
Гены, кодирующие предшественники М-типа, находятся в геноме А, так как все диплоидные виды, имеющие геном А (Т. urartu, Т. boeoticum, Т. топососсит), имеют гены, кодирующие предшественник М-типа. Кроме этого, все проанализированные полиплоидные виды также имеют гены, кодирующие такой тип предшественника.
Гены, кодирующие предшественники L-типа, связаны с родственными геномами В и G, так как они присутствуют во всех полиплоидах, имеющих данные геномы (Т. kiharae, Т. aestivum, Т. timopheevii). Отсутствие близких гомологов этих генов в диплоидном виде Ае. speltoides - доноре генома В, может объясняться тем, что современный вид Ае. speltoides отличается от диплоидного вида, принимавшего участие в образовании тетраплоидной пшеницы Т. timopheevii и гексаплоидного вида Т. aestivum.
Кроме непосредственного клонирования целевых генов, нами был проведен поиск последовательностей, гомологичных генам 4-Cys пептидов, в базах данных, доступных на сервере NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).
Гомологичные последовательности были обнаружены в ячмене, кукурузе, рисе, сорго, картофеле. Очевидно, что подобные белки-предшественники, содержащие несколько пептидных доменов, широко распространены у растений, прежде всего у злаков. Можно предположить, что биосинтез длинных предшественников, расщепляющихся на несколько коротких пептидов, обеспечивает быстрый синтез нескольких активных соединений с разной специфичностью действия, что усиливает и расширяет спектр защиты растения.
Гетерологичная экспрессия гена пептида Tk-AMP-ХЗ в клетках Е. coli
Для наработки пептида Tk-AMP-ХЗ в достаточных для биологических испытаний количествах была использована экспрессия гена этого пептида в клетках Е. coli в составе гибридного белка с нативным белком бактерий -тиоредоксином, что позволяет повысить выход пептида и обеспечить
правильный фолдинг. В результате был получен рекомбинантный пептид Тк-АМР-ХЗ в количестве, достаточном для биологических испытаний. Выход пептида составил 11 мг/л культуры.
Пептид Tk-AMP-ХЗ был протестирован на антимикробную активность в отношении ряда фитопатогенов: Fusarium oxysporum, Fusarium graminearum, Aliernaria altemata, Bipolaris sorokiniana, Aspergillus niger, Phoma betae. Оказалось, что этот пептид не ингибирует рост исследованных микроорганизмов в концентрациях менее 100 мкМ. Возможно, патогены, чувствительные к этому пептиду, не были включены в испытания. Не исключена и вероятность того, что не все пептиды, входящие в состав мультидоменного предшественника, обладают антимикробной активностью, а выполняют в клетке какие-либо иные функции.
Гены 10-Cys пептидов
Выделение и определение структуры пептида LAMP из семян колосняка
песчаного
Выделение антимикробных пептидов колосняка песчаного проводили сочетанием различных типов хроматографии: аффинной, эксклюзионной и обращенно-фазовой. В результате были получены два пептида, различающиеся наличием остатка аргинина на С-конце молекулы, названные нами LAMP-la и LAMP-lb (oT"Leymus antimicrobial peptide").
Определение числа остатков цистеина в молекуле пептида LAMP-la показало, что она содержит 10 остатков, образующих 5 дисульфидных связей. Путем секвенирования по Эдману в сочетании с масс-спектрометрией была установлены полные аминокислотные последовательности пептидов LAMP-1а/Ь, состоящих из 43/44 аминокислотных остатков: AQKCGEQGRGAKCPNCLCCGRYGFCGSTPDYCGVGCQSQCRGC(R).
Сравнение аминокислотной последовательности выделенного пептида
LAMP-la с другими антимикробными пептидами растений выявило сходство с
гевеином и гевеиноподобными АМП. Наибольшая гомология аминокислотной
последовательности пептида LAMP-la наблюдалась с гевеиноподобным
15
пептидом WAMP-la, выделенным ранее в лаборатории из зерновок пшеницы Т. kiharae. По сравнению с пептидом пшеницы в пептиде колосняка выявлены 8 замен, из которых 5 консервативных, и одна делеция остатка серина. Пептид колосняка, как и пептид пшеницы, относится к новому структурному типу 10-Cys антимикробных пептидов растений.
Гетерологичная экспрессия гена пептида LAMP в клетках Е. coli и тестирование его антифуигальной активности
Для исследования биологических свойств пептида LAMP-1а было необходимо получить' его в значительных количествах. Для этого была проведена экспрессия синтетического гена этого пептида в клетках Е. coli.
В результате был получен рекомбинантный пептид LAMP-1а в количестве, достаточном для биологических испытаний (2 мг/л культуры).
Исследование биологической активности пептида LAMP-1а выявило его высокую антифунгальную активность. Пептид подавлял прорастание спор грибов F. oxysporum и В. sorokiniana в микромолярных концентрациях (табл. 1). Для сравнения параллельно проводили испытания биологической активности выделенного ранее гомологичного пептида WAMP-la.
Таблица 1. Антифунгальная активность пептидов LAMP-la и WAMP-la.
Гриб 1C50, мкМ (инкубация 24ч/48 ч)
LAMP-la WAMP-la
Fusarium oxysporum 4,1 / 6,0 2,915,9
Bipolaris sorokiniana 2,7 / 5,6 2,1/6,2
Следует отметить, что хотя пептиды колосняка и пшеницы высоко гомологичны, они, тем не менее, несколько различаются по биологической активности. Можно предположить, что эти различия связаны с неконсервативными заменами Gly28, Asp29 и А1а30 на Thr, Pro и Asp соответственно, а также с делецией остатка серина между Cys-7 и Cys-8, которые были обнаружены в аминокислотной последовательности пептида LAMP-la.
Клонирование кДНК, кодирующей пептид LAMP, и установление структуры его предшественника
Были получены две последовательности кДНК, названные lamp-] и lamp-2, кодирующие пептид LAMP-1 и его гомолог LAMP-2. Анализ этих последовательностей показал, что они высококонсервативны и гомологичны ранее установленным последовательностям кДНК wamp-1 и wamp-2, кодирующим пептиды WAMP пшеницы Triticum kiharae. кДНК lamp-1 и lamp-2 кодируют два предшественника длиной 106 и 109 аминокислотных остатков, названные Lamp-1 и Lamp-2 соответственно (рис. 7).
Lamp-1 (1) MKPYMSTgagRATRVAAILLAWLAftaLATgVMGftQKCGEQGRGAKCPNCLCCGRYGFCG Lamp-2 (1) MKPYMSTTVLRATRVaAILgAVVLAAVLATAVNGBQÍCGEQGRGAKCPNCLCCGRYGFCG Wamp-1 (1) MKPBMSSTVLRAFRVAAILLAVVLAAVLATAVNGAQRCGDQARGAKCPNCLCCGKYGFCG
Lamp-1 (58) STPDYCGVG-CQSQCRGCRDDVMGQTLLGESDSTRAPATSSLSA------TTAGGP
Lamp-2 (61) STPDYCGVG-CQSQCRGCRDDVMGQTLLGESDSTRAPATSSLSA------TTAGGP
Wamp-1 (61) SGDAYCGAGSCQSQCRGCRDDViGQgLSSESgSTRAiASSSJSSAESbfflJISTlGGP
Рис. 7. Последовательности предшественников пептида LAMP-1 и его гомолога LAMP-2. Подчеркнута последовательность сигнального пептида, последовательности зрелых пептидных доменов выделены полужирным шрифтом, замены выделены серым.
Оба предшественника состоят из сигнального пептида (31 и 34 аминокислотных остатка для Lamp-1 и Lamp-2 соответственно), пептидного домена длиной 44 аминокислотных остатка и С-концевого домена. Было установлено, что сигнальные пептиды предшественников, кроме делеции трех аминокислотных остатков, различаются тремя заменами. Зрелый пептид LAMP-1 идентичен пептидам LAMP-la/b, выделенным ранее из семян колосняка. Зрелый пептид LAMP-2 отличается от пептида LAMP двумя заменами: Alai на Asp и Lys3 на Met. С-концевые домены предшественников идентичны.
Сравнение последовательностей предшественников Lamp с установленной ранее последовательностью предшественника Wamp-1 выявило высокую степень их гомологии (более 75 %). При этом наиболее вариабельной областью является С-концевой домен.
Кроме этого, было установлено, что нуклеотидные последовательности кДНК lamp и wamp за участком, кодирующим пептидные домены, в другой рамке считывания (+3 для 1атр-1/2 и wamp-1 и +2 для wamp-2) кодируют последовательности, высоко гомологичные С-концевой области каталитических доменов растительных хитиназ класса I (рис. 8Б).
Д LAMP1 LAMP2 WAMP1 КАМР2
Т. aestivum chitinase О.sativa chitinase Н. vulgare chitinase
(32) AQKCGEQGRGAKCPNCLCCGRYGFCGSTPDYCGVG-CQSQCRGCR (35] DQMCGEQGRGAKCPNCLCCGRYGFCGSTPDYCGVG-CgSQCRGCR
(35) AQRCGDCARGAKCPNCICCGKYGFCGSGDAYCGAGSCQSQCRGCR
(36) AQRCGDQARGAKCPNCLCCGKYGFCGSGDAYCGKGSCQSCCRGCR (21) EQCGSQAGGATCPNCLCCSKFGFCGTTSDYCGTG-CQSQCNGCS-
(33) EQCGAQAGGARCPNCI.CCSRWGWCGSTSDFCGDG-CQSQCSGCG-(28) QQCGSQAGGATCPHCLCCSRFGYCGSTSDYCGAG-CQSQCSOCG-
lamp-1/2 +3 ORF wamp-1 +3 ORF wamp-2 +2 ORF T. aestivum chitinase O.sativa chitinase И.vulgare chitinase
-GPDVAGRIGFYESSCDV1WGYYSRRALNSGLASQ* -GAGVAGRTGFYKSYCGVLGVGQGIKLDCYNRRPLNGWARVAVKTAGD-
-GARVAGRTGFYKSYCGVLGVGYGIKLDCYNRRPLSSGLTAGLAWQ*
-DARVADRIGFYKRYCDLIiGVSYGDNLDCYNQRPFA* (317)
-DDRVANRIGFYQRYCGAFGIGTGGNLDCYNQRPFNSGSSVGLAEQ» (335)
-DSRVADRIGFYQRYCNILGVGYGGNLDCYNQRPFVEGLLIORVTE* (332)
b. 5'
ХитиназаI
I ХИТИН-
I связывающий H домен
Г" '
Яш
■няявипн
......
Шшшшшмшт
LAMP
Рис. 8. Гомология генов lamp и wamp с генами хитиназ растений. А. Выравнивание аминокислотных последовательностей пептидов LAMP и WAMP с хитин-связывающими доменами хитиназ. Б. Выравнивание кДНК lamp-1/2, wamp-1 и wamp-2, транслированных со сдвигом +3, +J и +2 соответственно, по отношению к открытой рамке считывания, с С-кон1{евыми последовательностями хитиназ растений Triticum aestivum (AAR11388.1), Oryza sativa (AAA18585.1), Hordeum vulgare (AAA56787.1). Идентичные остатки выделены серым, * - стоп-кодон. В. Схема выравнивания гена хитиназы I Triticum aestivum и кДНК lamp. Гомологичные области обозначены одинаковым цветом. СП - сигнальный пептид, Н -пролин-, гистидин-богатый участок.
По-видимому, гены lamp и wamp произошли от предковых генов хитиназ класса I. Эти гены кодируют двудоменные белки с хитин-связывающим и каталитическим доменами. Делеция фрагмента ДНК, кодирующего каталитический домен, привела к сдвигу рамки считывания и образованию генов lamp и wamp (рис. 8В). Гены lamp и wamp могли также образоваться в результате нескольких последовательных событий: альтернативного
сп хитин-'
связывающим -
домен
сплайсинга пре-мРНК, обратной транскрипции и встраивания полученной последовательности в геном. Отбор этих генов в процессе эволюции произошел из-за наличия антимикробной активности у продуктов этих генов (LAMPs и WAMPs), что повысило устойчивость растений к патогенам.
Подтверждением происхождения генов lamp и wamp от генов хитиназ является сходство аминокислотных последовательностей пептидов LAMP и WAMP и хитин-связывающих доменов хитиназ класса I (рис. 8А). Полученные результаты позволяют сделать предположение о ходе эволюции хитин-связывающих белков. Наличие высококонсервативного хитин-связывающего домена в различных белках предполагает их происхождение от общего предка за счет дупликации и слияния генов.
Идентификация генов-гомологов wamp у представителей родов Triticum и
Aegilops
Для поиска генов-гомологов wamp у представителей родов Triticum и Aegilops были использованы следующие диплоидные виды: Ае. speltoides (геном ВВ), Ае. tauschii (геном DD), Т. топососсит (геном АЬАЬ), Т. urartu (геном А"А"), которые считаются донорами геномов полиплоидных пшениц. Также был проанализирован тетраплоидный вид Т. timopheevii (геном AbAbGG), который является родительской формой для Т. kiharae.
Кроме этого, была проанализирована геномная ДНК Т. kiharae, кодирующая пептиды WAMPs. Для этого вида были получены три последовательности ДНК: wamp-], wamp-2, wamp-З. Последовательности wamp-] и wamp-2 полностью совпадали с соответствующими последовательностями кДНК, что свидетельствует о том, что в кодирующей части генов нет интронов.
В результате путем ПЦР-амплификации с геномной ДНК с использованием праймеров, специфичных к генам wamp, было установлено, что виды Т. топососсит и Т. urartu (доноры геномов А) не содержат близких гомологов генов wamp. В других исследованных видах были обнаружены близкие гомологи генов wamp (рис. 9).
Кроме этого, была проанализирована база данных геномных последовательностей Т. aestivum (сорт Chinese Spring) для поиска гомологов генов wamp. Были обнаружены три гомологичные последовательности, названные wamp-1.2, wamp-2 и wamp-3.1.
Сравнение нуклеотидных последовательностей генов wamp показало, что они являются высоконсервативными, особенно области, кодирующие зрелые пептидные домены, а наибольшая вариабельность наблюдается в 3'-нетранслируемых областях.
Анализ распределения генов wamp среди видов Triticum и Aegilops (рис. 9) позволяет сделать предположение о принадлежности определенных генов к определенным геномам. Так, высокогомологичные гены wamp-1 (Т. kiharae), wamp-1.1 (Ае. tauschii) и wamp-1.2 (Т. Aestivum), вероятнее всего, связаны с геномом D. Ген wamp-2 относится к геному В или G. Wamp-З и wamp-3.1, скорее всего, кодируются геномами G и В соответственно.
D
В
-wamp-1 TK(A"AhGGDD) -wamp-1.1 AT (DP) -wamp-1.2 ТА (AUAUBBDD) -wamp-3.1 ТА (AUA"BBDD)
В
B/G
-warnp-4 AS (BB)
г TK. (AbAbGGDD) -wamp-3 ТТ(АьАьоо)
ТА (A"A"BBDD) -wamp-2 TK(AhAbGGDD) TT (AbAhGG)
Рис. 9. Филогенетическое дерево, построенное на основе последовательностей генов wamp. ТК-Т. Шагае; ТТ - Т. ИторИееуи; ТА - Т. ае$йхит; АТ - Ае. юшсЫи АБ-Ае. .чреИоШез.
Определение антимутагенного действия пуротионина Тк-АМР-ВР на
клетки человека
Кроме направлений, сосредоточенных на решении фундаментальной проблемы иммунитета растений и защиты растений от патогенов, было проведено исследование антимутагенных эффектов антимикробных пептидов растений, на примере одного из тионинов Т. кШагае, на клетки человека (перевиваемая линия ИХ)). Поиску новых лекарственных агентов, а также соединений, обладающих антиоксидантными свойствами или активизирующих собственную защитную систему клеток, в настоящее время уделяется большое внимание, поэтому обнаружение новых активных молекул имеет важное значение для медицины.
В данной работе впервые исследовали антимутагенные свойства индивидуального АМП на примере р-пуротионина Тк-АМР-ВР, выделенного из семян пшеницы Т. кИшгае. Параллельно проверяли антимутагенную активность водного экстракта, полученного из проростков этого же вида пшеницы, а также экстракты алоэ и зеленого чая. В качестве мутагена использовался хлорид кадмия.
Полученные данные свидетельствуют о том, что при использовании оптимальной концентрации антимутагена (концентрации, вызывающей максимальный эффект) самой высокой активностью обладал пуротионин: коэффициент защиты от мутагенного действия хлористого кадмия достигал 8588 % при микромолярных концентрациях пептида (8-32 мкг/мл), тогда как уровень защиты, достигаемый при использовании экстракта этого же вида пшеницы в исследованном диапазоне концентраций не превышал 73 %. Водные экстракты алоэ и зеленого чая, широко известные своими антимутагенными свойствами и использованные в качестве контроля, также обеспечивали более низкий уровень защиты.
Механизм антимутагенного действия пуротионина не ясен. Можно предположить непосредственное взаимодействие тионина с ионами кадмия, хотя отсутствие свободных сульфгидрильных групп в молекуле пуротионина исключало образование хелатных комплексов с ионами этого металла. Тем не
менее, связывание кадмия за счет каких-либо иных взаимодействий нельзя было исключить.
Можно предположить, что защитное действие пуротионина связано с непосредственным взаимодействием с ДНК. В пользу этого предположения свидетельствует обнаружение в молекулах тионинов НТН (ЬеНх-Шгп-ЬеНх) мотива, характерного для ДНК-связывающих белков, к которым относятся регуляторы транскрипции. За счет этого участка (НТН домена) происходит связывание НТН ДНК-связывающих белков с большой бороздкой молекулы ДНК.
Следует также упомянуть возможность влияния пуротионина Тк-АМР-ВР на антиоксидантный статус клетки. В пользу этого предположения свидетельствуют данные об участии пуротионинов в окислительно-восстановительных реакциях в клетке. Нельзя исключить участие пуротионинов в активации сигнальных систем, индуцирующих защитные реакции клеток. Так, показано, что некоторые тионины (вискотоксины) обладают иммуномодулирующим действием на клетки млекопитающих.
Таким образом, впервые показано, что пуротионин Тк-АМР-ВР пшеницы защищает клетки млекопитающих от воздействия тяжелых металлов, однако установление механизма протекторного действия этого пептида на ДНК требует дальнейших исследований.
Выводы
1. Впервые обнаружено три класса генов, кодирующих сложные, модульные предшественники 4-СуБ антимикробных пептидов пшеницы Т. кИгагае. 4-СуБ пептиды пшеницы образуются из предшественников, содержащих от пяти до семи пептидных доменов. При этом белок-кодирующие области генов 4-СуБ пептидов не содержат интронов.
2. Экспрессия генов 4-Суэ пептидов пшеницы усиливается в ответ на заражение фитопатогенными грибами, а также солевой и тепловой стресс. Уровень экспрессии этих генов зависит от вида гриба.
3. Выявлены гены-гомологи 4-Cys и 10-Cys антимикробных пептидов у различных представителей родов Triticum и Aegilops. На основании гомологии последовательностей ДНК установлена принадлежность определенных генов, входящих в семейства 4-Cys и 10-Cys антимикробных пептидов, к A, B(G) и D геномам полиплоидной пшеницы.
4. Впервые из семян колосняка песчаного Leymus arenarius выделен и охарактеризован новый антимикробный пептид LAMP-1, определена его аминокислотная последовательность и биологическая активность.
5. Установлена структура двух кДНК, кодирующих антимикробный пептид LAMP-1 и его гомолог LAMP-2. Пептиды LAMP синтезируются в виде предшественников, состоящих из сигнального пептида, зрелого пептида и С-концевого продомена. Предшественники 10-Cys пептидов колосняка высокогомологичны предшественникам 10-Cys пептидов пшеницы WAMP.
6. Предложен механизм происхождения генов 10-Cys пептидов от предковых генов хитиназ класса I.
7. Разработана система гетерологичной экспрессии цистеин-содержащих антимикробных пептидов растений в клетках Е. coli.
8. Впервые показано антимутагенное действие тионина Тк-АМР-ВР пшеницы Triticum kiharae на клетки человека (перевиваемая линия RD) в отношении хлорида кадмия.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи:
1. Utkina L.L., Slavokhotova A.A., Odintsova T.I., Korostyleva T.V., Pukhalskiy V.A., Musolyamov A.K., Egorov T.A. Novel antimicrobial peptides from seeds of Triticum kiharae and Leymus arenarius II Annual Wheat Newsletter. 2009. Vol. 55. P. 181-183.
2. Уткина JUL, Жабон E.O., Славохотова A.A., Рогожин Е.А., Шиян А.Н., Гришин Е.В., Егоров Ц.А., Одинцова Т.И., Пухальский В.А. Гетерологичная экспрессия синтетического гена нового гевеиноподобного пептида Leymus arenarius в клетках Escherichia coli И Генетика. 2010. Т. 46. № 12. С. 1645-1651.
3. Одинцова Т.И., Васильева И.М., Коростылева Т.В., Уткина JIJL, Славохотова A.A., Рогожин Е.А., Шиян А.Н., Пухальский В.А., Засухина Г.Д. Антимутагенная активность ß-иуротионина Тк-АМР-ВР пшеницы // Генетика. 2011. Т. 47. № 9. С. 1267-1270.
Тезисы конференций:
1. Уткина Л.Л., Славохотова A.A., Коростылева Т.В., Андреев Я.А., Василевский A.A., Рогожин Е.А., Одинцова Т.И., Егоров Ц.А., Гришин Е.В. Гетерологичная экспрессия генов, кодирующих новые защитные пептиды зерновок пшеницы Кихара (Triticum kiharae) и колосняка песчаного (Leumus arenarius) в клетках Escherichia coli. II В сб.: «Биотехнология: состояние и перспективы развития»: 5-ый Московский международный конгресс. Т 1. 2009. С. 357-358.
2. Уткина Л.Л., Славохотова A.A., Рогожин Е.А., Одинцова Т.И., Пухальский В.А., Кудрявцев A.M. Экспрессия гена нового антимикробного пептида колосняка песчаного Leymus arenarius в прокариотической системе. // В сб.: V съезд ВОГИС. Ч. II. 2009. С. 385.
3. Коростылева Т.В., Андреев Я.А., Уткина Л.Л., Одинцова Т.И., Пухальский В.А. Исследование экспрессии генов семейства антимикробных пептидов WAMP-1 пшеницы Triticum kiharae Dorof. et Migusch. в ответ на абиотический стресс. // В сб.: V съезд ВОГИС. Т. 1.2009. С. 249.
4. Уткина ЛЛ., Славохотова A.A., Одинцова Т.И., Пухальский В.А., Егоров Ц.А. Выделение пептида LAMP из семян колосняка песчаного (Leymus arenarius L.) и гетерологичная экспрессия кодирующего его гена в клетках Escherichia coli. II В сб.: IV Российский симпозиум «Белки и пептиды». 2009. С. 300.
5. Уткииа ЛЛ., Славохотова A.A. Выделение и гетерологичная экспрессия пептида из семян солевыносливого представителя семейства злаковые - колосняка песчаного (Leumus arenarius) И В сб.: «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», 9-ая научная конференция молодых ученых. 2009. С. 38-39.
6. Уткина ЛЛ., Андреев Я.А. Структурная организация генов антимикробных пептидов пшеницы Triticum kiharae. II В сб.: «Биология - наука XXI века»: 14-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых, Пущино, 2010. Т. 2. С. 191.
7. Уткина Л.Л., Андреев Я.А., Егоров Ц.А., Одинцова Т.И., Пухальский В.А. Структура генов новых антимикробных пептидов пшеницы Triticum kiharae. II В сб.: «Симбиоз-Россия 2010» III Всероссийский с международным участием конгресс студентов и аспирантов-биологов, Нижний Новгород, 2010. С. 113-114.
8. Коростылева Т.В., Славохотова A.A., Уткина Л.Л., Андреев Я.А., Жабон Е.О., Рогожин Е.А., Одинцова Т.И. Исследование нового структурного типа антимикробных пептидов злаков. // В сб.: «Генетика и биотехнология на рубеже тысячелетий», Международная научная конференция, посвященная 45-летию основания Института генетики и цитологии Национальной АН Беларуси, Минск, 2010 г. С. 58.
9. Уткина Л.Л., Андреев Я.А., Одинцова Т.И., Пухальский В.А. Гены новых антимикробных пептидов пшеницы Triticum kiharae. II В сб.: «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», XXIII Международная зимняя молодежная научная школа, Москва, 2011 г. С. 73.
10. Уткина ЛЛ., Пухальский В.А., Андреев Я.А. Модульные предшественники антимикробных пептидов пшеницы Triticum kiharae. II В сб.: «Биология - наука XXI века»: 15-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых, Пущино, 2011. С. 58.
11. Уткина Л Л., Андреев Я. А., Пухальский В. А., Егоров Ц.А., Одинцова Т.И. Модульные предшественники новых антимикробных пептидов пшеницы Triticum kiharae. II В сб.: V Российский симпозиум «Белки и пептиды». 2011. С. 293.
Заказ № 40-a/l 1/2011 Подписано в печать 10.11.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2
4r -'N. ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30
( $)) www.cfr.ru; e-mail:info@cfr.ru
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Уткина, Любовь Леонидовна
Благодарности.
Список сокращений.
1 Введение.
1.1 Актуально сть темы.
1.2 Цели и задачи работы.
1.3 Научная новизна.
1.4 Практическая значимость.
2 Обзор литературы.
2.1 Антимикробные пептиды.
2.1.1 Тионины.
2.1.1.1 Структура.
2.1.1.2 Функции и антимикробные свойства.
2.1.1.3 Структура генов, экспрессия и локализация.
2.1.1.4 Экспрессия в трансгенных растениях.
2.1.2 Дефензины.:.
2.1.2.1 Структура.
2.1.2.2 Функции и антимикробные свойства.
2.1.2.3 Структура генов, экспрессия и локализация.
2.1.2.4 Экспрессия в трансгенных растениях.
2.1.3 Липид-переносящие белки.
2.1.3.1 Структура.
2.1.3.2 Функции и антимикробные свойства.
2.1.3.3 Структура генов, экспрессия и локализация.
2.1.3.4 Экспрессия в трансгенных растениях.
2.1А Гевеиноподобные антимикробные пептиды.
2.1.4.1 Структура.
2.1.4.2 Функции и антимикробные свойства.
2.1.4.3 Структура генов, экспрессия и локализация.
2.1.4.4 Экспрессия в трансгенных растениях.
2.1.5 Ноттиноподобные пептиды.
2.1.6 Макроциклические пептиды (циклотиды).
2.1.7 Антимикробные пептиды, содержащие четыре остатка цистеина.
2.1.7.1 МВР-1.
2.1.7.2 УШ.
2.1.7.3 МІАМР2.
2.1.7.4 ІЬ-АМРб.
2.2 Процессинг полипептидных предшественников 2.2.1 Гидролиз.
2.2.2 Другие посттрансляционные модификации.
2.3 Систематика рода Triticum L. и происхождение полиплоидных пшениц.
2.3.1 Систематика рода Triticum L.
2.3.2 Происхождение полиплоидных пшениц.
3 Материалы и методы.
3.1 Материалы.
3.1.1 Объекты исследования.'.
3.1.2 Реактивы и материалы.
3.1.3 Бактериальные штаммы и плазмидные векторы.
3.1.4 Наборы реактивов.
3.1.5 Растворы.
3.1.6 Грибы.
3.1.7 Среды для культивирования клеток Е. coli.
3.1.8 Праймеры.
3.2 Методы.
3.2.1 Установление структуры кДНК, кодирующей предшественники антимикробных пептидов.70.
3.2.1.1 Выделение РНК.
3.2.1.2" Синтез первой цепи кДНК.
3.2.1.3 ГШР-амплификация.
3.2.1.4 Выделение ДНК из агарозного геля.
3.2.1.5 Лигирование.
3.2.1.6 Приготовление компетентных клеток для электропорации.
3.2.1.7 Электротрансформация клеток Е. coli.73t
3.2.1.8 Анализ рекомбинантных плазмид.73:
3.2.1.9 ' Выделение плазмидной ДНК.
3.2.1.10 Секвенирование ДНК.
3.2.1.11 Определение нуклеотидных последовательностей предшественников пептидов, получение полноразмерной кДНК.
3.2.2 Поиск гомологов генов 4-Cys и Ю-Cys пептидов пшеницы у представителей семейств Triticum, Aegilops и Leymus.
3.2.2.1 Выделение геномной ДНК.
3.2.2.2 Получение кодирующей части генов.
3.2.3 Экспрессия рекомбинантных пептидов в клетках Е. coli.
3.2.3.1 Синтез гена и получение экспрессионного вектора.
3.2.3.2 Получение рекомбинантного полипептида.
3.2.3.3 МАЛДИ-времяпролетная масс-спектрометрия.
3.2.3.4 N-концевое секвенирование белковых молекул.
3.2.4 Определение изменения уровня экспрессии генов 4-Cys пептидов под действием биотических и абиотических стрессовых факторов методом ОТ-ПЦР
3.2.4.1 Заражение проростков.
3.2.4.2 Абиотический стресс.
3.2.4.3 ОТ-ПЦР.
3.2.5 Определение антимикробной активности пептидов.
3.2.6 Компьютерный анализ последовательностей.
3.2.7 Выделение антимикробных пептидов из зерновок злаковых.
3.2.8 Определение содержания элементов вторичной структуры пептидов.
3.2.9 Определение антимутагенной активности пуротионина Тк-АМР-ВР и водных экстрактов растений.
4 Результаты и обсуждение.
4.1 Гены 4-Cys пептидов.
4.1.1 Исследование структуры генов, кодирующих предшественники пептидов Tk-AMP-Xl и Тк-АМР-Х2.
4.1.1.1 Клонирование кДНК, кодирующей 4-Cys пептиды, и установление структуры их предшественников.
4.1.1.2 Анализ последовательностей кДНК.
4.1.1.3 Клонирование геномной ДНК, кодирующей 4-Cys пептиды.
4.1.1.4 Установление сайтов специфического протеолитического расщепления предшественников 4-Cys пептидов.
4.1.1.5 Аминокислотные последовательности 4-Cys пептидов.
4.1.2 Влияние биотических и абиотических стрессовых факторов на уровень экспрессии генов 4-Cys пептидов.
4.1.3 Поиск генов-гомологов 4-Cys пептидов у разных представителей семейства злаковых.
4.1.4 Гетерологичная экспрессия гена пептида Tk-AMP-ХЗ в клетках Е. coli.
4.2 Гены 10-Cys пептидов.
4.2.1 Выделение и определение структуры пептида LAMP из семян колосняка песчаного Leymus arenarius.
4.2.2 Гетерологичная экспрессия гена пептида LAMP в клетках Е. coli и тестирование его антифунгальной активности.
4.2.3 Исследование структуры генов, кодирующих предшественники 10-Cys пептидов злаковых.
4.2.3.1 Клонирование кДНК, кодирующей пептид LAMP, и установление структуры его предшественника.
4.2.3.2 Клонирование геномной ДНК, кодирующей пептиды WAMPs.
4.2.4 Идентификация генов-гомологов wamp у представителей родов Triticum и Aegilops.
4.3 Определение антимутагенного действия пуротионина Тк-АМР-ВР на клетки человека.
5 Выводы.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование структурной организации и экспресси новых генов антимикробных пептидов злаков"
1.1 Актуальность темы
На фоне стремительного роста населения земного шара проблема повышения* урожайности сельскохозяйственных культур становится все более актуальной. Заболевания, вызванные различными патогенами (к которым относятся грибы, бактерии, вирусы, вироиды, а также насекомые и нематоды), наносят существенный урон урожаю, который может составлять, от 30 до 70 % (с учетом- потерь при хранении) (Oerke et: al:, 1994). Для защиты от патогенов в сельском хозяйстве применяют три основные стратегии: ротационное земледелие, традиционную селекцию; направленную на получение устойчивых форм; и, наконец; использование: химических средств защиты растений. Традиционные методы селекции не всегда: эффективны из-за их длительности" и- отсутствия- в ряде случаев источников; устойчивости. Использование средств химической защиты растений является дорогостоящим и представляет угрозу экологической безопасности: Кроме, этого, возникают формы патогенов; устойчивые к пестицидам,.в1результате чего снижается; их эффективность.
Альтернативной- стратегией повышения устойчивости: сельскохозяйственных культур к патогенам и насекомым-вредителям, а также к другим стрессовым факторам окружающей- среды абиотической природы (засухе, засоленности почвы и пр.) служит генетическая инженерия; которая- позволяет встраивать гены, обусловливающие устойчивость, в геномы культурных растений. Важнейшим достижением в этой области было встраивание генов энтомотоксинов бактерии Bacillus thuringiensis в геномы сельскохозяйственных культур, что привело к: созданию форм, устойчивых к насекомым-вредителям (Schuler et al., 1998). Еще более перспективным является повышение иммунитета самих растений как за счет усиления экспрессии собственных защитных генов, так и за счет встраивания генов защитных соединений из других растительных видов, в частности, дикорастущих, которые более устойчивы к патогенным микроорганизмам, чем культурные растения, и практически не изучены.
В ходе эволюции у растений выработалась сложная система иммунитета, которая позволяет им узнавать патогены и активировать защитные реакции, направленные на предотвращение распространения инфекции. В растениях существует целый арсенал соединений, создающий структурный барьер, препятствующий попаданию патогенов в ткани растения, а также преформированных антимикробных веществ, которые позволяют предотвратить или' замедлить развитие инфекции. Кроме того, заражение патогенами инициирует в растениях ряд индуцибельных защитных реакций, к которым относится укрепление структурного барьера, развитие сверхчувствительной реакции и синтез соединений с антимикробными свойствами, важнейшими из которых являются антимикробные пептиды (АМП).
Антимикробные пептиды обладают широким спектром антимикробного действия, не вызывают появления устойчивых форм, и их гены могут быть непосредственно ^ встроены в геном^ чувствительных к патогенам растений. Кроме того, считается, что использование для трансформации растений генов растительного происхождения предпочтительнее, чем генов бактерий. Все это делает гены антимикробных пептидов перспективными для трансформации растений с целью повышения их устойчивости.
Не менее важный аспект применения АМП состоит в разработке на их основе лекарственных препаратов нового поколения, что требует детального исследования их биологической активности.
Заключение Диссертация по теме "Генетика", Уткина, Любовь Леонидовна
5 Выводы
1. Впервые обнаружены три класса генов, кодирующих сложные, модульные предшественники 4-Cys антимикробных пептидов пшеницы Т. kiharae. 4-Cys пептиды пшеницы образуются из предшественников, содержащих от пяти до семи пептидных доменов. При этом белок-кодирующие области reHOB.4-Cys пептидов не содержат интронов:
2. Экспрессия генов 4-Cys пептидов пшеницы усиливается в ответ на заражение фитопатогенными грибами, а также солевой и тепловой стресс. Уровень экспрессии этих генов зависит от вида гриба.
3. Выявлены гены-гомологи 4-Cys и 10-Cys антимикробных пептидов у различных представителей родов Triticum и Aegilops. На основании гомологии последовательностей ДНК установлена принадлежность определенных генов, входящих в семейства 4-Cys и,-10-Cys антимикробных пептидов, к А, В (G) и D геномам полиплоидной пшеницы.
4. Впервые из семян колосняка песчаного выделен и охарактеризован новый антимикробный пептид LAMP-1, определена-его аминокислотная последовательность и, биологическая активность.
5. Установлена структура двух кДНК, кодирующих антимикробный пептид LAMP-1 и его гомолог LAMP-2. Пептиды LAMP синтезируются в виде предшественников, состоящих из сигнального пептида, зрелого пептида и С-концевого продомена. Предшественники 10-Cys пептидов колосняка высокогомологичны предшественникам 10-Cys- пептидов пшеницы.
6. Предложен механизм происхождения генов 10-Cys пептидов от предковых генов хитиназ класса I/IV.
7. Разработана система гетерологичной экспрессии1 цистеин-содержащих антимикробных пептидов растений, относящихся к семействам 4-Cys и 10-Cys пептидов, в клетках Е. coli.
8. Впервые показано антимутагенное действие тионина Тк-АМР-ВР пшеницы Triticum kiharae на клетки человека линии RD в отношении хлорида кадмия.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Уткина, Любовь Леонидовна, Москва
1. Васильева И. М., Семячкина А. Н., Семенова С. С., Засухина Г. Д. Защитное действие антимугагенов в репаративно-дефектных клетках человека // Радиац. биол. Радиоэкол. 2008. Т. 48. С. 195-198.
2. Гончаров Н. П. Систематика рода Triticum: проблема классификаций //Доклады Россельхозакадемии. 2000. Т. 2. С. 3-5.
3. Гончаров Н. П. Сравнительная генетика пшениц и их сородичей. 2002. Новосибирск: Сиб. унив. изд-во. 251 с.
4. Гончаров Н. П., Кондратенко Е. Я. Происхождение, доместификация и эволюция пшениц//Вестник ВОГиС. 2008. Т. 12. С. 159-179.
5. Дорофеев В. Ф., Филатенко А. А., Мигушова Э. Ф., Удачин Р. А., Якубцинер М. М. Пшеница. 1979, Л.: Колос. 346 с.
6. Жуковский П. М. Культурные растения и их сородичи. 1971. Л.: Колос. 752 с.
7. Засухина Г. Д., Кузьмина Н. С. Генетический полиморфизм в защите клеток человека от мутагенов // Молекулярный полиморфизм человека, под ред. С. Д. Варфоломеева. 2007. Рос. ун-т дружбы народов: Москва. С. 583-599.
8. Пухальский В. А. К познанию роли генома D как носителя генов, супрессирующих устойчивость мягкой пшеницы к мучнистой росе // Фактори експериментальної еволюціі організмів. 2003. Аграрна Наука: Киів. С. 191-194.
9. Яаска В. Э. Происхождение тетраплоидных пшениц по данным электрофоретического изучения ферментов //Изв. АН Эст. ССР. 1974. Т. 23. С. 201-220.
10. Abe Y., Shirane К., Yokosawa Н., Matsushita Н., Mitta М., Kato I., Ishii S. Asparaginyl endopeptidase of jack bean seeds. Purification, characterization, and high utility in protein sequence analysis //J Biol Chem. 1993. V. 268. P. 3525-3529.
11. Archer B. L., Audley B. G., Sweeney G., Hong Т. C. Studies on composition of latex serum and "bottom fraction" particles //J. Rubber Res. Inst. Malaya. 1969 V. 21. P. 560-569.
12. Arondel V., Tchang F., Baillet В., Vignols F., Grellet F., Delseny M., Kader J. C., Puigdomenech P. Multiple mRNA coding for phospholipid-transfer protein from Zea mays arise from alternative splicing//Gene. 1991. V. 99. P. 133-136.
13. Atkinson A. H., Heath R. L., Simpson R. J., Clarke A. E., Anderson M. A. Proteinase inhibitors in Nicotiana alata stigmas are derived from a precursor protein which is processed into five homologous inhibitors //Plant Cell. 1993. V. 5. P. 203-213.
14. Badaeva E. D., Friebe В., Gill B. S. Genome differentiation in Aegilops. 1. Distribution of highly repetitive DNA sequences on chromosomes of diploid species // Genome. 1996. V. 39. P. 293-306.
15. Berrocal-Lobo M., Segura A., Moreno M., Lopez G., Garcia-Olmedo F., Molina A. Snakin-2, an antimicrobial peptide from potato whose gene is locally induced by wounding and responds to pathogen infection //Plant Physiol. 2002. V. 128. P. 951961.
16. Bohlmann H., Apel K. Isolation and characterization of cDNAs coding for leaf-specific thionins closely related to the endosperm-specific hordothionin of barley Hordeum vulgare L. //Мої Gen Genet. 1987. V. 207. P. 446-454.
17. Bolter C., Jongsma M. A. The adaptation of insects to plant protease inhibitors // J Insect Physiol. 1997. V. 43. P. 885-895.
18. Bowden W. M. The taxonomy and nomenclature of the wheats, barleys and ryes and their relatives //Can. J. Bot. 1959. V. 37. P. 657-684.
19. Boyd P. M., Barnaby N., Tan-Wilson A., Wilson K. A. Cleavage specificity of the subtilisin-like protease CI from soybean //Biochim Biophys Acta. 2002. V. 1596. P. 269-282.
20. Brandolini A., Vaccino P., Boggini G., Ozkan H., Kilian B., Salamini F. Quantification of genetic relationships among A genomes of wheats //Genome. 2006. V. 49. P. 297-305.
21. Brennan R. G., Matthews B. W. The helix-turn-helix DNA binding motif // J Biol Chem. 1989. V. 264. P. 1903-1906.
22. Broekaert I., Lee H. I., Kush A., Chua N. H., Raikhel N. Wound-induced accumulation of mRNA containing a hevein sequence in laticifers of rubber tree (Hevea brasiliensis) //Proc Natl Acad Sci USA. 1990. V. 87. P. 7633-7637.
23. Broekaert W. F., Cammue B. P. A., De Bolle M. F. C., Thevissen K., De Samblanx G. W., Osborn R. W. Antimicrobial peptides from plants // Crit. Rev. Plant Sci. . 1997. V. 16. P. 297-323.
24. Broekaert W. F., Cammue B. P. A., Osborn R. W., Rees S. B. Biocidal chitin-binding proteins. International patent application W094/11511. 1994.
25. Broekaert W. F., Terras F. R., Cammue B. P., Osborn R. W. Plant defensins: novel antimicrobial peptides as components of the host defense system // Plant Physiol. 1995. V. 108. P. 1353-1358.
26. Brown R. L., Kazan K., McGrath K. C., Maclean D. J., Manners J. M. A role for the GCC-box in jasmonate-mediated activation of the PDF1.2 gene of Arabidopsis //Plant Physiol. 2003. V. 132. P. 1020-1032.
27. Carmona M. J., Molina A., Fernandez J. A., Lopez-Fando J. J., Garcia-Olmedo F. Expression of the alpha-thionin gene from barley in tobacco confers enhanced resistance to bacterial pathogens //Plant J. 1993. V. 3. P. 457-462.
28. Carvalho A. O., Filho G. A., Ferreira B. S., Branco A. T., Okorokova-Facanha A. L., Gomes V. M. Cloning and characterization of a cDNA encoding a cowpea seed defensin and analysis of its expression //Protein Pept Lett. 2006. V. 13. P. 1029-1036.
29. Carvalho A. O., Gomes V. M. Role of plant lipid transfer proteins in plant cell physiology A concise review //Peptides. 2007. V. 28. P. 1144-1153.
30. Carvalho A. 0., Gomes V. M. Plant defensins prospects for the biological functions and biotechnological properties//Peptides. 2009. V. 30. P. 1007-1020.
31. Casey R., Domoney C., Ellis N. Legume storage proteins and their genes // Oxford surveys of plant molecular and cell biology, B. J. Miflin, Editor. 1986. Oxford University Press: Oxford, p. 1-95.
32. Casteels-Josson K., Capaci T., Casteels P., Tempst P. Apidaecin multipeptide precursor structure: a putative mechanism for amplification of the insect antibacterial response//Embo J. 1993. V. 12. P. 1569-1578.
33. Castro M. S., Fontes W. Plant defense and antimicrobial peptides //Protein Pept Lett. 2005. V. 12. P. 13-18.
34. Chagolla-Lopez A., Blanco-Labra A., Patthy A., Sanchez R., Pongor S. A novel alpha-amylase inhibitor from amaranth (Amaranthus hypocondriacus) seeds // J Biol Chem. 1994. V. 269. P. 23675-23680.
35. Chen G. H., Hsu M. P., Tan C. H.', Sung H. Y., Kuo C. G., Fan M. J., Chen H. M., Chen S., Chen C. S. Cloning and characterization of a plant defensin VaDl from azuki bean//J Agric Food Chem. 2005. V. 53. P. 982-988.
36. Chlan C. A., Borroto K., Kamalay J. A., Dure L. Developmental biochemistry of cottonseed embryogenesis and germination XIX. Sequences and genomic organization of the (globulin (vicilin)) genes of cottonseed. //Plant Mol Biol 1987. V. 9. P: 533546.
37. Claeson P., Goransson U., Johansson S., Luijendijk T., Bohlin L. Fractionation Protocol for the Isolation of Polypeptides from Plant Biomass //J Nat Prod. 1998. V. 61. P. 77-81.
38. Coffeen W. C., Wolpert T. J. Purification and characterization of serine proteases that exhibit caspase-like activity and are associated with programmed cell death in Avena sativa//Plant Cell. 2004. V. 16. P. 857-873'.
39. Colilla F. J., Rocher A., Mendez E. gamma-Purothionins: amino acid sequence of two polypeptides of a new family of thionins from wheat endosperm //FEBS Lett. 1990. V. 270. P. 191-194.
40. D'Hondt K., Bosch D., Van Damme J., Goethals M., Vandekerckhove J., Krebbers E. An aspartic proteinase present in seeds cleaves Arabidopsis 2 S albumin precursors in vitro//J Biol Chem. 1993. V. 268. P. 20884-20891.
41. De Bolle M. F., Eggermont K., Duncan R. E., Osborn R. W., Terras F. R., Broekaert W. F. Cloning and characterization of two cDNA clones encoding seed-specific antimicrobial peptides from Mirabilis jalapa L //Plant Mol Biol. 1995. V. 28. P. 713721.
42. Duvick J. P., Rood T., Rao A. G., Marshak D. R. Purification and characterization of a novel antimicrobial peptide from maize (Zea mays L.) kernels // J Biol Chem. 1992. V. 267. P. 18814-18820.
43. Dvorak J., Mcguire P. E., Cassidy B. Apparent sources of the A genomes of wheats inferred from polymorphism in abundance and restriction fragment length of repeated nucleotide sequences//Genome. 1988. V. 30. P. 680-689.
44. Egorov T. A., Odintsova T. I., Pukhalsky V. A., Grishin E. V. Diversity of wheat antimicrobial peptides //Peptides. 2005. V. 26. P. 2064-2073.
45. Eipper B. A., Stoffers D. A., Mains R. E. The biosynthesis of neuropeptides: peptide alpha-amidation //Annu Rev Neurosci. 1992. V. 15. P. 57-85.
46. Epple P., Apel K., Bohlmann H. An Arabidopsis thaliana thionin gene is inducible via a signal transduction pathway different from that for pathogenesis-related proteins // Plant Physiol. 1995. V. 109. P. 813-820.
47. Epple P., Apel K., Bohlmann H. Overexpression of an endogenous thionin enhances resistance of Arabidopsis against Fusarium oxysporum // Plant Cell. 1997. V. 9. P. 509-520.
48. Evett G. E., Donaldson D. M., Vernon L. P. Biological properties of Pyrularia thionin prepared from nuts of Pyrularia pubera//Toxicon. 1986. V. 24. P. 622-625.
49. Farrokhi N., Whitelegge J. P., Brusslan J. A. Plant peptides and peptidomics // Plant Biotechnol J. 2008. V. 6. P. 105-134.
50. Felizmenio-Quimio M. E., Daly N. L., Craik D. J. Circular proteins in plants: solution structure of a novel macrocyclic trypsin inhibitor from Momordica cochinchinensis // J Biol Chem. 2001. V. 276. P. 22875-22882.
51. Fleming A. J., Mandel T., Hofmann S., Sterk P., de Vries S. C., Kuhlemeier C. Expression pattern of a tobacco lipid transfer protein gene within the shoot apex // Plant J. 1992. V. 2. P. 855-862.
52. Florack D. E., Stiekema W. J. Thionins: properties, possible biological roles and mechanisms of action//Plant Mol Biol. 1994. V. 26. P. 25-37.
53. Flicker L. D. Carboxypeptidase E // Annu Rev Physiol. 1998. V. 50. P. 309-321.
54. Friebe B., Gill B. S. Chromosome banding and genome analysis in diploid and cultivated polyploid wheats // Methods in genome analysis in plants: their merits and piffals, P. P. Jauhar, Editor. 1996. CRC Press, Boca Ration: N.Y., L., Tokyo, p. 39-60.
55. Garcia-Olmedo F., Molina A., Alamillo J. M., Rodriguez-Palenzuela P. Plant defense peptides//Biopolymers. 1998. V. 47. P. 479-491.
56. Garcia-Olmedo F., Molina A., Segura A., Moreno M. The defensive role of nonspecific lipid-transfer proteins in plants //Trends Microbiol. 1995. V. 3. P. 72-74.
57. Garcia-Olmedo F., Rodriguez-Palenzuela P., Molina A., Alamillo J. M., Lopez-Solanilla E., Berrocal-Lobo M., Poza-Carrion C. Antibiotic activities of peptides,131hydrogen peroxide and peroxynitrite in plant defence //FEBS Lett. 2001. V. 498. P. 219-222.
58. Gincel E., Simorre J. P., Caille A., Marion D., Ptak M., Vovelle F. Three-dimensional structure in solution of a wheat lipid-transfer protein from multidimensional 1H-NMR data. A new folding for lipid carriers //Eur J Biochem. 1994. V. 226. P. 413-422.
59. Gomord V., Faye L. Posttranslational modification of therapeutic proteins in plants // Curr Opin Plant Biol. 2004. V. 7. P. 171-181.
60. Goransson U., Luijendijk T., Johansson S., Bohlin L., Claeson P. Seven novel macrocyclic polypeptides from Viola arvensis //J Nat Prod. 1999. V. 62. P. 283-286.
61. Goransson U., Sjogren M., Svangard E., Claeson P., Bohlin L. Reversible antifouling effect of the cyclotide cycloviolacin 02 against barnacles //J Nat Prod. 2004. V. 67. P. 1287-1290.
62. Guihard G., Benedetti H., Besnard M., Letellier L. Phosphate efflux through the channels formed by colicins and phage T5 in Escherichia coli cells is responsible for the fall in cytoplasmic ATP //J Biol Chem. 1993. V. 268. P. 17775-17780.
63. Hager K. P., Wind C. Two ways of legumin-precursor processing in conifers. Characterization and evolutionary relationships of Metasequoia cDNAs representing two divergent legumin gene subfamilies //Eur J Biochem. 1997. V. 246. P. 763-771.
64. Hallock Y. F., Sowder R. C., 2nd, Pannell L. K., Hughes C. B., Johnson D. G., Gulakowski R., Cardellina J. H., 2nd, Boyd M. R. Cycloviolins A-D, anti-HIV macrocyclic peptides from Leonia cymosa // J Org Chem. 2000. V. 65. P. 124-128.
65. Hara-Nishimura I., Inoue K., Nishimura M. A unique vacuolar processing enzyme responsible for conversion of several proprotein precursors into the mature forms // FEBS Lett. 1991. V. 294. P. 89-93.
66. Hara-Nishimura I., Takeuchi Y., Nishimura M. Molecular characterization of a vacuolar processing enzyme related to a putative cysteine proteinase of Schistosoma mansoni //Plant Cell. 1993. V. 5. P. 1651-1659.
67. Heath R. L., Barton P. A., Simpson R. J., Reid G. E., Lim G., Anderson M. A. Characterization of the protease processing sites in a multidomain proteinase inhibitor precursor from Nicotiana alata //Eur J Biochem. 1995. V. 230. P. 250-257.
68. Huang R. H., Xiang Y., Liu X. Z., Zhang Y., Hu Z., Wang D. C. Two novel antifungal peptides distinct with a five-disulfide motif from the bark of Eucommia ulmoides Oliv //FEBS Lett. 2002. V. 521. P. 87-90.
69. Huang R. H., Xiang Y., Tu G. Z., Zhang Y., Wang D. C. Solution structure of Eucommia antifungal peptide: a novel structural model distinct with a five-disulfide motif//Biochemistry. 2004. V. 43. P. 6005-6012.
70. Ishii S. Legumain: asparaginyl endopeptidase //Methods Enzymol. 1994. V. 244. P. 604-615.
71. Jaaska V. NADP-dependent aromatic alcohol dehydrogenase in polyploid wheats and their diploid relatives. On the origin and phylogeny of polyploid wheats // Theoretical and Applied Genetics. 1978. V. 53. P. 209-217.
72. Jang G. S., Lee H. J., Chang S. J., Seo Y. W. Expression and promoter analysis of the TaLTPl gene induced by drought and salt stress in wheat (Triticum aestivum L.) // Plant Sci. 2004. V. 167. P. 995-1001.
73. Janzik I., Macheroux P., Amrhein N., Schaller A. LeSBTl, a subtilase from tomato plants. Overexpression in insect cells, purification, and characterization // J Biol Chem. 2000. V. 275. P. 5193-5199.
74. Jennings C., West J., Waine C., Craik D., Anderson M. Biosynthesis and insecticidal properties of plant cyclotides: the cyclic knotted proteins from Oldenlandia affinis // Proc Natl Acad Sci USA. 2001. V. 98. P. 10614-10619.
75. Johnson T. C., Wada K., Buchanan B. B., Holmgren A. Reduction of purothionin by the wheat seed thioredoxin system //Plant Physiol. 1987. V. 85. P. 446-451.
76. Julius D., Brake, A., Blair, L., Kunisawa, R., Thorner, J. . Isolation of the putative structural gene for the lysine-arginine cleaving endopeptidase required for processing of yeast preproalfa-factor. //Cell. 1984. V. 37.
77. Jung H. W., Kim W., Hwang B. K. Three pathogen-inducible genes encoding lipid transfer protein from pepper are differentially activated by pathogens, abiotic, and environmental stresses //Plant Cell Environ. 2003. V. 26. P. 915-928.
78. Kader J. C. Lipid-Transfer Proteins in Plants // Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 1996. V. 47. P. 627-654.
79. Kembhavi A. A., Buttle D. J., Knight C. G., Barrett A. J. The two cysteine endopeptidases of legume seeds: purification and characterization by use of specific fluorometric assays //Arch Biochem Biophys. 1993. V. 303. P. 208-213.
80. Kimber G., Feldman M. Wild wheat: an introduction. 1987. College of Agriculture, University of Missouri-Columbia. 146 p.
81. Koike M., Okamoto T., Tsuda S., Imai R. A novel plant defensin-like gene of winter wheat is specifically induced during cold acclimation // Biochem Biophys Res Commun. 2002. V. 298. P. 46-53.
82. Kosina R. Selected items of wheat variation from paleobotany to molecular biology //Acta Societatis Botanicorum Poloniae. 1999. V. 68. P. 129-141.
83. Kozlov S. A., Vassilevski A. A., Grishin E. V. Secreted protein and peptide biosynthesis: precursor structures and processing mechanisms // Protein biosynthesis. 2009. Nova Science Publishers, Inc. P. 225-248.
84. Kramer K. J., Klassen L. W., Jones B. L., Speirs R. D., Kammer A. E. Toxicity of purothionin and its homologues to the tobacco hornworm, Manduca sexta (L.) (Lepidoptera:Sphingidae) //Toxicol Appl Pharmacol. 1979. V. 48. P. 179-183.
85. Lay F. T., Brugliera F., Anderson M. A. Isolation and properties of floral defensins from ornamental tobacco and petunia//Plant Physiol. 2003. V. 131. P. 1283-1293.
86. Le-Nguyen D. L., Heitz A., Chiche L., Castro B., Baigegrain F., Favel A., Coletti-Previero A. Molecular recognition between serine proteases and new bioactive microproteins with a knotted structure //Biochimie. 1990. V. 72. P. 431-435.
87. Lee H. I., Broekaert, W.F., Raikhel, N.V. Co- and post-translational processing of the hevein preproprotein of latex of the rubber tree (Hevea brasiliensis) //J. Biol. Chem. . 1991. V. 266. P. 15944-15948.
88. Lee H. I., Raikhel N. V. Prohevein is poorly processed but shows enhanced resistance to a chitin-binding fungus in transgenic tomato plants //Braz J Med Biol Res. 1995. V. 28. P. 743-750.
89. Lehrer R. I., Ganz T., Selsted M. E. Defensins: endogenous antibiotic peptides of animal cells //Cell. 1991. V. 64. P. 229-230.
90. Li S. S., Claeson P. Cys/Gly-rich proteins with a putative single chitin-binding domain from oat (Avena sativa) seeds //Phytochemistry. 2003. V. 63. P. 249-255.
91. Lindberg I., Hutton, J.C. . Peptide processing proteinases with selectivity for paired basic residues // Peptide Biosynthesis and Processing F. L. D. B. Raton, Editor. 1991, CRC Press, p. 141-174.
92. Lindholm P., Goransson U., Johansson S., Claeson P., Gullbo J., Larsson R., Bohlin L., Backlund A. Cyclotides: a novel type of cytotoxic agents // Mol Cancer Ther. 2002. V. 1. P. 365-369.
93. Lipkin A., Anisimova V., Nikonorova A., Babakov A., Krause E., Bienert M., Grishin E., Egorov T. An antimicrobial peptide Ar-AMP from amaranth (Amaranthus retroflexus L.) seeds //Phytochemistry. 2005. V. 66. P. 2426-2431.
94. Lipkind G., Gong Q., Steiner D. F. Molecular modeling of the substrate specificity of prohormone convertases SPC2 and SPC3 // J Biol Chem. 1995. V. 270. P. 1327713284.
95. Liu Y., Luo J., Xu C., Ren F., Peng C., Wu G., Zhao J. Purification, characterization, and molecular cloning of the gene of a seed-specific antimicrobial protein from pokeweed//Plant Physiol. 2000. V. 122. P. 1015-1024.
96. Mac Key J. The taxonomy of hexaploid wheat // Swensk Botanisk Tidskrift. 1954. V. 48. P. 587-597.
97. Marcus J. P., Green J. L., Goulter K. C., Manners J. M. A family of antimicrobial peptides is produced by processing of a 7S globulin protein in Macadamia integrifolia kernels//Plant J. 1999. V. 19. P. 699-710.
98. Martins J. C., Maes D., Loris R., Pepermans H. A., Wyns L., Willem R., Verheyden P. H NMR study of the solution structure of Ac-AMP2, a sugar binding antimicrobial protein isolated from Amaranthus caudatus //J Mol Biol. 1996. V. 258. P. 322-333.
99. Mentlein R. Dipeptidyl-peptidase IV (CD26)~role in the inactivation of regulatory peptides // Regul Pept. 1999. V. 85. P. 9-24.
100. Meyer B., Houlne G., Pozueta-Romero J., Schantz M. L., Schantz R. Fruit-specific expression of a defensin-type gene family in bell pepper. Upregulation during ripening and upon wounding //Plant Physiol. 1996. V. 112. P. 615-622.
101. Molina A., Garcia-Olmedo F. Developmental and pathogen-induced expression of three barley genes encoding lipid transfer proteins //Plant J. 1993. V. 4. P. 983-991.
102. Molina A., Garcia-Olmedo F. Enhanced tolerance to bacterial pathogens caused by the transgenic expression of barley lipid transfer protein LTP2 //Plant J. 1997. V. 12. P. 669-675.
103. Montesinos E. Antimicrobial peptides and plant disease control // FEMS Microbiol Lett. 2007. V. 270. P. 1-11.
104. Morris R., Sears E. R. The cytogenetics of wheat and its relatives // Wheat and Wheat improvement, R. S. Quisenberry,L. P. Reitz, Editors. 1967: Madison, p. 19-87.
105. Nakayama K. Furin: a mammalian subtilisin/Kex2p-like endoprotease involved in processing of a wide variety of precursor proteins //Biochem J. 1997. V. 327. P. 625635.
106. Naranjo T. Chromosome structure of Triticum longissimum relative to wheat // Theoretical and Applied Genetics. 1995. V. 91. P. 105-109.
107. Nielsen K. J., Heath R. L., Anderson M. A., Craik D. J. The three-dimensional solution structure by 1H NMR of a 6-kDa proteinase inhibitor isolated from the stigma ofNicotiana alata//J Mol Biol. 1994. V. 242. P. 231-243.
108. Nielsen K. K., Nielsen J. E., Madrid S. M., Mikkelsen J. D. New antifungal proteins from sugar beet (Beta vulgaris L.) showing homology to non-specific lipid transfer proteins//Plant Mol Biol. 1996. V. 31. P. 539-552.
109. Nielsen K. K., Nielsen J. E., Madrid S. M., Mikkelsen J. D. Characterization of a new antifungal chitin-binding peptide from sugar beet leaves //Plant Physiol. 1997. V. 113. P. 83-91.
110. Oerke E.-C., Dehne H.-W., Schonbeck F., Weber A. Crop Production and Crop Protection: Estimated Losses in Major Food and Cash Crops. 1994, Amsterdam: Elsevier Science Ltd. 830.
111. Ohtani S., Okada T., Yoshizumi H., Kagamiyama H. Complete primary structures of two subunits of purothionin A, a lethal protein for brewer's yeast from wheat flour /7 J Biochem. 1977. V. 82. P. 753-767.
112. Onaderra M., Monsalve R. I., Mancheno J. M., Villalba M., Martinez del Pozo A., Gavilanes J. G., Rodriguez R. Food mustard allergen interaction with phospholipid vesicles //Eur J Biochem. 1994. V. 225. P. 609-615.
113. Park S. S., Abe K., Kimura M., Urisu A., Yamasaki N. Primary structure and allergenic activity of trypsin inhibitors from the seeds of buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) //FEBS Lett. 1997. V. 400. P. 103-107.
114. Park S. Y., Jauh G. Y., Mollet J. C., Eckard K. J., Nothnagel E. A., Walling L. L., Lord E. M. A lipid transfer-like protein is necessary for lily pollen tube adhesion to an in vitro stylar matrix//Plant Cell. 2000. V. 12. P. 151-164.
115. Pathak G. N. Studies in the cytology of sereals //J. Genet. 1940. V. 39. P. 437-467.
116. Pelegrini P. B., Quirino B. F., Franco O. L. Plant cyclotides: an unusual class of defense compounds //Peptides. 2007. V. 28. P. 1475-1481.
117. Pena-Cortes H., Willmitzer L., Sanchez-Serrano J. J. Abscisic Acid Mediates Wound Induction but Not Developmental-Specific Expression of the Proteinase Inhibitor II Gene Family//Plant Cell. 1991. V. 3. P. 963-972.
118. Ponz F., Paz-Ares J., Hernandez-Lucas C., Garcia-Olmedo F., Carbonero P. Cloning and nucleotide sequence of a cDNA encoding the precursor of the barley toxin alpha-hordothionin //Eur J Biochem. 1986. V. 156. P. 131-135.
119. Prigge S. T., Mains R. E., Eipper B. A., Amzel L. M. New insights into copper monooxygenases and peptide amidation: structure, mechanism and function // Cell Mol Life Sci. 2000. V. 57. P. 1236-1259.
120. Provan J., Wolters P., Caldwell K. H., Powell W. High-resolution organellar genome analysis of Triticum and Aegilops sheds new light on cytoplasm evolution in wheat // Theor Appl Genet. 2004. V. 108. P. 1182-1190.
121. Pyee J., Kolattukudy P. E. The gene for the major cuticular wax-associated protein and three homologous genes from broccoli (Brassica oleracea) and their expression patterns //Plant J. 1995. V. 7. P. 49-59.
122. Pyee J., Yu H., Kolattukudy P. E. Identification of a lipid transfer protein as the major protein in the surface wax of broccoli (Brassica oleracea) leaves // Arch Biochem Biophys. 1994. V. 311. P. 460-468.
123. Raikhel N. V., Lee H.-I. Structure and function of chitin-binding proteins //Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 1993. V. 44. P. 591-615.
124. Reimann-Philipp U., Behnke S., Batschauer A., Schafer E., Apel K. The effect of light on the biosynthesis of leaf-specific thionins in barley, Hordeum vulgare // Eur J Biochem. 1989. V. 182. P. 283-289.
125. Rivillas-Acevedo L. A., Soriano-Garcia M. Isolation and biochemical characterization of an antifungal peptide from Amaranthus hypochondriacus seeds // J Agric Food Chem. 2007. V. 55. P. 10156-10161.
126. Romero A., Alamillo J. M., Garcia-Olmedo F. Processing of thionin precursors in barley leaves by a vacuolar proteinase //Eur J Biochem. 1997. V. 243. P. 202-208.'
127. Saether O., Craik D. J., Campbell I. D., Sletten K., Juul J., Norman D. G. Elucidation of the primary and three-dimensional structure of the uterotonic polypeptide kalata B1 //Biochemistry. 1995. V. 34. P. 4147-4158.
128. Samuel D., Liu Y. J., Cheng C. S., Lyu P. C. Solution structure of plant nonspecific lipid transfer protein-2 from rice (Oryza sativa) // J Biol Chem. 2002. V. 277. P. 35267-35273.
129. Satani M., Takahashi K., Sakamoto H., Harada S., Kaida Y., Noguchi M. Expression and characterization of human bifiinctional peptidylglycine alpha-amidating monooxygenase//Protein Expr Purif. 2003. V. 28. P. 293-302.
130. Sax K. Sterility in wheat hybrids. Et. Chromosome behavior in partially sterile hybrids //Genetics. 1922. V. 7. P. 513-552.
131. Schechter I., Berger A. On the size of the active site in proteases. I. Papain //Biochem Biophys Res Commun. 1967. V. 27. P. 157-162.
132. Schrader-Fischer G., Apel K. cDNA-derived identification of novel thionin precursors in Viscum album that contain highly divergent .thionin domains but conserved signal and acidic polypeptide domains //Plant Mol Biol. 1993. V. 23. P. 1233-1242.
133. Schuler T. H., Poppy G. M., Kerry B. R., Denholm I. Insect-resistant transgenic plants //Trends Biotech. 1998. V. 16. P. 168-175.
134. Scott M. P., Jung R., Muntz K., Nielsen N. C. A protease responsible for post-translational cleavage of a conserved Asn-Gly linkage in glycinin, the major seed storage protein of soybean//Proc Natl Acad Sci USA. 1992. V. 89. P. 658-662.
135. Segura A., Moreno M., Garcia-Olmedo F. Purification and antipathogenic activity of lipid transfer proteins (LTPs) from the leaves of Arabidopsis and spinach // FEBS Lett. 1993. V. 332. P. 243-246.
136. Segura A., Moreno M., Molina A., Garcia-Olmedo F. Novel defensin subfamily from spinach (Spinacia oleracea) //FEBS Lett. 1998. V. 435. P. 159-162.
137. Selitrennikoff C. P. Antifungal proteins //Appl Environ Microbiol. 2001. V. 67. P. 2883-2894.
138. Sels J., Mathys J., De Coninck B. M., Cammue B. P., De Bolle M. F. Plant pathogenesis-related (PR) proteins: a focus on PR peptides //Plant Physiol Biochem. 2008. V. 46. P. 941-950.
139. Shin D. H., Lee J. Y., Hwang K. Y., Kim K. K., Suh S. W. High-resolution crystal structure of the non-specific lipid-transfer protein from maize seedlings // Structure. 1995. V. 3.P. 189-199.
140. Silverstein K. A., Graham M. A., Paape T. D., VandenBosch K. A. Genome organization of more than 300 defensin-like genes in Arabidopsis // Plant Physiol. 2005. V. 138. P. 600-610.
141. Silverstein K. A., Moskal W. A., Jr., Wu H. C., Underwood B. A., Graham M. A., Town C. D., VandenBosch K. A. Small cysteine-rich peptides resembling antimicrobial peptides have been under-predicted in plants //Plant J. 2007. V. 51. P. 262-280.
142. Sossountzov L., Ruiz-Avila L., Vignols F., Jolliot A., Arondel V., Tchang F., Grosbois M., Guerbette F., Miginiac E., Delseny M., et al. Spatial and temporal expression of a maize lipid transfer protein gene //Plant Cell. 1991. V. 3. P. 923-933.
143. Srivastava R., Liu J. X., Howell S. H. Proteolytic processing of a precursor protein for a growth-promoting peptide by a subtilisin serine protease in Arabidopsis // Plant J. 2008. V. 56. P. 219-227.
144. Stec B. Plant thionins-the structural perspective //Cell Mol Life Sei. 2006. V. 63. P. 1370-1385.
145. Steinmuller K., Batschauer A., Apel K. Tissue-specific and light-dependent changes of chromatin organization in barley (Hordeum vulgare) //Eur J Biochem. 1986. V. 158. P. 519-525.
146. Sterk P., Booij H., Schellekens G. A., Van Kämmen A., De Vries S. C. Cell-specific expression of the carrot EP2 lipid transfer protein gene //Plant Cell. 1991. V. 3. P. 907-921.
147. Stuart L. S., Harris T. H. Bactericidal and fungicidal, properties of a crystalline proteinfrom unbleached wheat flour//Cereal Chem. 1942. V. 19. P. 288-300.
148. Tabiasco J., Pont F., Foumie J. J., Vercellone A. Mistletoe viscotoxins increase naturalkiller cell-mediated cytotoxicity //Eur J Biochem. 2002. V. 269. P. 2591-2600.
149. Tailor R. H., Acland D. P., Attenborough S., Cammue B. P., Evans I. J., Osborn R.
150. W., Ray J. A., Rees S. B., Broekaert W. F. A novel family of small cysteine-richantimicrobial peptides from seed of Impatiens balsamina is derived from a singleprecursor protein //J Biol Chem. 1997. V. 272. P. 24480-24487.
151. Tam J. P., Lu Y. A., Yang J. L., Chiu K. W. An unusual structural motif ofantimicrobial peptides containing end-to-end macrocycle and cystine-knot disulfides //
152. Proc Natl Acad Sei USA. 1999. V. 96. P. 8913-8918.
153. Terras F. R., Penninckx I. A., Goderis I. J., Broekaert W. F. Evidence that the role of plant defensins in radish defense responses is independent of salicylic acid // Planta. 1998. V. 206. P. 117-124.
154. Thevissen K., Ferket K. K., Francois I. E., Cammue B. P. Interactions of antifungal plant defensins with fungal membrane components //Peptides. 2003. V. 24. P. 17051712.
155. Thevissen K., Ghazi A., De Samblanx G. W., Brownlee C., Osborn R. W., Broekaert W. F. Fungal membrane responses induced by plant defensins and thionins // J Biol Chem. 1996. V. 271. P. 15018-15025.
156. Thevissen K., Osborn R. W., Acland D. P., Broekaert W. F. Specific, high affinity binding sites for an antifungal plant defensin on Neurospora crassa hyphae and microsomal membranes //J Biol Chem. 1997. V. 272. P. 32176-32181.
157. Thevissen K., Warnecke D. C., Francois I. E., Leipelt M., Heinz E., Ott C., Zahringer U., Thomma B. P., Ferket K. K., Cammue B. P. Defensins from insects and plants interact with fungal glucosylceramides //J Biol Chem. 2004. V. 279. P. 3900-3905.
158. Thoma S., Hecht U., Kippers A., Botella J., De Vries S., Somerville C. Tissue-specific expression of a gene encoding a cell wall-localized lipid transfer protein from Arabidopsis//Plant Physiol. 1994. V. 105. P. 35-45.
159. Thoma S., Kaneko Y., Somerville C. A non-specific lipid transfer protein from Arabidopsis is a cell wall protein //Plant J. 1993. V. 3. P. 427-436.
160. Thomma B. P., Cammue B. P., Thevissen K. Plant defensins // Planta. 2002. V. 216. P. 193-202.
161. Torres-Schumann S., Godoy J. A., Pintor-Toro J. A. A probable lipid transfer protein gene is induced by NaCl in stems of tomato plants // Plant Mol Biol. 1992. V. 18. P. 749-757.
162. Trabi M., Craik D. J. Circular proteins—no end in sight //Trends Biochem Sci. 2002. V. 27. P. 132-138.
163. Tsuboi S., Osafune T., Tsugeki R., Nishimura M., Yamada M. Nonspecific lipid transfer protein in castor bean cotyledon cells: subcellular localization and a possible role in lipid metabolism //J Biochem. 1992. V. 111. P. 500-508.
164. Van Parijs J., Broekaert, W.F., Goldstein, I.J., Peumans, WJ. . Hevein: an antifungal protein from rubber-tree (Hevea brasiliensis) latex//Planta: 1991. V. 183. P. 315-323.
165. Van Slageren M. W. Wild wheats: a monograph of Aegilops L. and Amblyopyrtim (Jaub. & Spach) Eig (Poaceae). 1994, Wageningen: Agricultural University. 513.
166. Vernon L. P., Bell J. D. Membrane structure, toxins and phospholipase A2 activity // Pharmacol Ther. 1992. V. 54. P. 269-295.
167. Wall J., Golding C. A., Van Veen M., O'Shea P. The use <?f fluoresceinphosphatidylethanolamine (FPE) as a real-time probe for peptide-membrane interactions//Mol Membrane Biol. 1995. V. 12. P. 183-192.
168. Walujono K., Scholma R. A., Beintema J. J., Mariono A., Hahn A. M. Amino acid sequence of hevein//Proc Int Rubber Conf. 1975. V. 2. P. 518-531.
169. Witherup K. M., Bogusky M. J., Anderson P. S., Ramjit H., Ransom R. W., Wood T., Sardana M. Cyclopsychotride A, a biologically active, 31-residue cyclic peptide isolated from Psychotria longipes //J Nat Prod. 1994. V. 57. P. 1619-1625.
170. Xin X., Varlamov O., Day R., Dong W., Bridgett M. M., Leiter E. H., Flicker L. D. Cloning and sequence analysis of cDNA encoding rat carboxypeptidase D // DNA Cell Biol. 1997. V. 16. P. 897-909.
171. Yamada K., Shimada T., Kondo M., Nishimura M., Hara-Nishimura I. Multiple functional proteins are produced by cleaving Asn-Gln bonds of a single precursor by vacuolar processing enzyme //J Biol Chem. 1999. V. 274. P. 2563-2570.
172. Yang H., Matsubayashi Y., Nakamura K., Sakagami Y. Diversity of Arabidopsis genes encoding precursors for phytosulfokine, a peptide growth factor //Plant Physiol. 2001. V. 127. P. 842-851.
173. Yeats T. H., Rose J. K. The biochemistry and biology of extracellular plant lipid-transfer proteins (LTPs) //Protein Sci. 2008. V. 17. P. 191-198.cJ
-
Уткина, Любовь Леонидовна
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2011
-
ВАК 03.02.07
- Экспрессия синтетических генов антибактериальных пептидов
- Получение и характеристика устойчивых к патогенам трансгенных растений с повышенной биобезопасностью
- Биологическая активность антимикробных пептидов из яда паука Lachesana tarabaevi на модели инфекции Chlamydia trachomatis
- Создание векторных конструкций, содержащих гены фунгицидно-бактерицидных пептидов, и анализ полученных с их помощью трансгенных растений
- Биосинтез пептид-нуклеотидного антибиотика микроцина C и его гомологов
