Исследование структурно-функционального состояния бактерий в микробных сообществах методами электронной микроскопии

Баринова, Екатерина Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование структурно-функционального состояния бактерий в микробных сообществах методами электронной микроскопии
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование структурно-функционального состояния бактерий в микробных сообществах методами электронной микроскопии"

На правах рукописи

БАРИНОВА Екатерина Сергеевна

ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ БАКТЕРИЙ В МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВАХ МЕТОДАМИ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ

Специальность 03 00 07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2008

003168688

Работа выполнена в Институте микробиологии им С Н Виноградского РАН и Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им Г К Скрябина РАН

Научный руководитель

член-корреспондент РАН, доктор биологических наук В.Ф. Гальченко

Официальные оппоненты доктор биологических наук,

профессор В.М. Горленко

Ведущая организация

кандидат биологических наук Б.А. Воробьёва

Биологический факультет Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится « 19 »мая 2008 г в 1400 ч на заседании Диссертационного совета Д 002 224.01 в Институте микробиологии им СН Виноградского РАН по адресу 117312, Москва, Проспект 60-летия Октября, д 7, корп 2

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института микробиологии им С Н. Виноградского РАН

Автореферат разослан апреля 2008 года

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Т.В. Хижияк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Микроскопические методы являются неотъемлемой частью микробиологических исследований на протяжении всего существования микробиологии, что связано с малыми размерами микроорганизмов Благодаря этим исследованиям стало возможным определять такие параметры как, численность микроорганизмов, ультраструктурное строение, физиологическое состояние, локализацию ферментов (Холодный, 1935, Перьфильев с соавт, 1961, Аристовская, 1962, 1963, Звягинцев, 1978, Громов 1976, 1985, Дуда 1982, 1984, Сузина с соавт, 2001, Дмитриев с соавт, 2001, 2004, Laue et al, 2007) В результате электронно-микроскопического исследования большого количества микроорганизмов в чистых культурах на разных стадиях развития были выявлены общие диагностические критерии (состояние нуклеоида, мембран, цитоплазмы, наличие особых структур, например, покровы спор), позволяющие характеризовать на уровне ультраструктуры физиологическое состояние исследуемого микроорганизма С помощью рентгеновского микроанализа было показано, что у микроорганизмов (за исключением диатомовых водорослей) качественно одинаковый элементный состав так называемых биогенных элементов (фосфор, сера, калий, кальций) В то же время было обнаружено, что разные виды микроорганизмов отличаются по содержанию и соотношению этих элементов (Screrrer et al, 1987, Norland et al, 1995, Мулюкин с соавт, 1996,1997, 2002, Никитин с соавт, 1998)

Однако, изучение ультраструктуры и элементного состава микроорганизмов чистых культур не открывало исследователям того, в каких структурно-функциональных состояниях они существуют в естественных условиях Только со второй половины двадцатого века начали появляться единичные работы по изучению структурно-функционального состояния микроорганизмов in situ (Никитин с соавт, 1962, Bae et al, 1973, Balkwill et al, 1975, Amelio et al, 1987) Системное и развернутое изучение структурно-функционального состояния микроорганизмов в их естественных местах обитания начали проводить сравнительно недавно (Дмитриев с соавт, 1997, 2001, 2004, Розанов, 2002, Wierzchos et al, 2004, Lacap et al, 2005, Дуда с соавт, 2007)

Проведение электронно-микроскопических исследований

микроорганизмов и их сообществ в природных образцах связано с рядом

проблем методического плана 1) некоторые природные среды, такие как

криогрунты или вода олиготрофных водоемов, содержат относительно мало

клеток, что делает их прямую визуализацию затруднительной, наличие

минеральных образований, морфологически сходных с микробными клетками,

затрудняет интерпретацию изображений, 2) минеральная компонента многих образцов не позволяет получать ультратонкие срезы и «маскирует» микробные клетки, 3) для корректной характеристики микробных сообществ с высокой численностью клеток, таких, как бактериальные маты, требуется получить информацию не только о типах входящих в них клеток и их физиологическом состоянии, но и об их естественной пространственной организации

Таким образом, различное соотношение содержания в образцах микроорганизмов и минеральной компоненты делают невозможной стандартизацию подготовки проб для электронно-микроскопического анализа Поэтому совершенствование известных и разработка новых методических приемов для исследования структурно-функционального состояния бактерий в микробных сообществах является актуальным

Цели и задачи исследования. Цель данной работы усовершенствовать известные и разработать новые методы для изучения структурно-функционального состояния бактерий в микробных сообществах Для выполнения этой цели поставлены следующие задачи

разработать метод экспресс-дифференциации биогенных/абиогенных микрообъектов,

усовершенствовать метод низкотемпературного фракционирования и концентрирования микроорганизмов, разработанный ранее для дрожжей, и адаптировать его для бактерий,

разработать метод, позволяющий наблюдать за изменениями в структурно-функциональном состоянии «замаскированных» бактерий из уникальных природных образцов,

усовершенствовать метод «микромонолитов» для максимального сохранения нативной ультраструктуры микроорганизмов в сообществах определить эффективность совместного применения микроскопических и молекулярно-биологических методов при исследовании микробных сообществ в различных экосистемах Научная новизна. Разработан метод экспресс-дифференциации на основе рентгеновского микроанализа, позволяющий обнаруживать биогенные микрообъекты и определять их вероятное физиологическое состояние в различных природных образцах

Разработан метод субстратных агаровых каналов Этот метод позволил в динамике, на ультраструктурном уровне, наблюдать за развитием «замаскированных» ультратонкими минеральными компонентами бактерий из криогрунтов Восточной Сибири

Усовершенствован метод низкотемпературного фракционирования клеток, что позволило увеличить численность и морфологическое разнообразие клеток, извлекаемых из криогрунтов Восточной Сибири

Модифицирован метод «микромонолитов» Данная модификация позволяет минимизировать влияние механических воздействий на пространственную организацию микроорганизмов в биопленках, бактериальных обрастаниях, циано-бактериальных матах в отобранных и подготовленных для ультратонких срезов образцах Благодаря использованию этого метода была обнаружена, а затем выделена в чистую культуру бактерия, формирующая наноклетки С помощью этого метода была описана ультраструктура и пространственная организация клеток данной бактерии в естественных условиях обитания

Практическая значимость. Предложенные методы позволяют проводить изучение структурно-функционального состояния микроорганизмов в природных микробных сообществах без выделения в чистые культуры

Используемые в данной работе подходы к электронно-микроскопическому изучению микроорганизмов можно использовать для проведения экологического мониторинга состояния экосистем независимо от их геологической (минеральной) матрицы и количественного содержания в них микроорганизмов

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на 7-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - Наука XXI века» (Пущино, 2003 г), Всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005), П-ой международной молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2006), Международной научной конференции «Современные экологические проблемы севера» (Апатиты, 2006), 17ш Evergreen International Phage Biology Meeting (Olympia, 2007), 2-м Байкальском микробиологическом симпозиуме с международным участием (Иркутск, 2007)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 6 тезисов

Место проведения работы. Экспериментальная часть работы была выполнена в лаборатории классификации и хранения уникальных форм микроорганизмов ИНМИ им С Н Виноградского РАН, Москва, в отделе Всероссийской коллекции микроорганизмов и лаборатории структурно-функциональной адаптации микроорганизмов ИБФМ им Г К Скрябина РАН, Пущино

Благодарности. Автор глубоко признателен своим учителям и руководителям - чл -корр РАН Гальченко В Ф., д б н, проф Дуде В И, д б н, проф Вайнштейну МБ, к б н Сузиной НЕ, к б н Акимову В H и к б н Дмитриеву В В за постоянное внимание, помощь и полезные советы Автор выражает благодарность всем коллегам и друзьям за содействие и поддержку при выполнении диссертационной работы

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа изложена на 165 страницах машинописного текста и включает 97 рисунков и 12 таблиц Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей описание материалов и методов, результатов и обсуждения исследования, выводов и библиографического списка, который содержит 195 наименований

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования. Образцы грунтов криолитозоны были любезно предоставлены д г-м н Д А Гиличинским (ИФХиБП РАН), илы нефтешламов антропогенного происхождения - к б н В В Дмитриевым (ИБФМ РАН, г Пущино), керн атмосферного льда - д б н С С Абызовым (ИНМИ РАН) Образцы микробных обрастаний из теплых и горячих источников Камчатки (Кальдеры Узон, Долины Гейзеров) были отобраны автором в ходе экспедиции сотрудников ИНМИ РАН 2005 года

Микроорганизмы и условия их культивирования. Культуру Bacillus subtilis В-720 ВКМ выращивали на 50% мясопептонном бульоне и мясопептонном агаре, а также на синтетической среде с добавлением 12 г/л глюкозы (Мулюкин с соавт, 1996) Micrococcus sp, штамм KHI, выделенные из нефтешлама, культивировали на среде 5/5 ИБФМ (г/л) гидролизат казеина - 5, дрожжевой экстракт - 1, экстракт сои - 30, агар - 20, пептон - 60 мл/л pH 8,0 Накопительную культуру Kais tía adipata, штамм NF1 получали на агаризованной вытяжке из нефтешлама, дальнейшую очистку и культивирование проводили на среде 5/5 при 28-29°С

Люминесцентная микроскопия. Использовали микроскопы марок OPTON ICM 405, ЛМ-2 (ЛОМО), Jenaval mterphako (CarlZeiss, Jena), Axiolmager Dl (Carl Zeiss, Jena), в качестве красителей - акридиновый оранжевый и комплексный краситель Live/Dead (BacLight™ Bacterial Viability Kit)

Подготовка образцов для микроскопии. Разработанные и модифицированные автором методы подготовки проб для электронной микроскопии изложены в разделе «Результаты и обсуждение».

Электронная микроскопия. Образцы для микроскопии фиксировали 2,5% раствором глютарового альдегида в 0,05М какодилатном буфере, дальнейшую обработку образцов проводили по методикам, описанным ранее (Фихте с соавт, 1973, Уикли, 1975, Сузина, 1984, Миронов с соавт, 1994, Гальченко, 2001) Препараты просматривали в электронных микроскопах JEM-100CXII, JEM-100B (JEOL, Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ

Рентгеновский микроанализ. Для рентгеновского микроанализа использовали препараты целых бактериальных клеток, подготовленные по методу предложенному Мулюкиным с соавт 2002. Расчет относительного содержания биогенных элементов проводили по значениям площадей соответствующих пиков в спектрах, получаемых с помощью микроанализатора LINK-860 с детектором Е5423 (Link-System, Великобритания) В качестве модельного объекта для исследования дифференциации клеток в различных физиологических состояниях (клетки вегетативные, с проспорами, споры, цистоподобные клетки, лизированные клетки) использовали Bacillus subtilis В каждом указанном состоянии исследовали по 30 бактериальных клеток Полученные данные обрабатывали в программе Excel, Windows ХР Professional Молекулярно-биологические методы. Данную часть работы проводили совместно с к б н. В Н Акимовым (ИБФМ РАН) ДНК из клеток штамма NF1 и природных образцов льда (Антарктида), бактериальных и цианобактериальных обрастаний (Камчатка), выделяли стандартным методом (Маниатис, 1984) Гены 16S рРНК амплифицировали с использованием универсальных бактериальных праймеров 27f, 69f, 1392г и 1492r (Lane et al, 1991) На ампликонах, полученных из бактериальных и циано-бактериальных обрастаний, получали библиотеки клонов в векторе pGEM-T (Promega), согласно указаниям фирмы-производителя Работы по обработке клонотек проводили методом ARDRA (рестрикционный анализ ампликонов рДНК) (Heyndrickx et al, 1996) с использованием эндонуклеаз рестрикции НаеШ и Rsal Секвенирование фрагментов генов 16S рРНК проводили на секвенаторе CEQ2000 XL (Beckman Coulter, USA) Полученные нуклеотидные последовательности фрагментов генов 16S рРНК сравнивали с последовательностями генов 16S рРНК, имеющихся в международной базе данных GenBank, с помощью программы BLAST (http //www nebí nlm gov/BLAST) Нуклеотидные последовательности выравнивали в программе Clustal X Дендрограммы строили с помощью программы TREECON

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1.1. Разработка и применение метода экспресс-дифференциации биогенных/абиогенных микрообъектов.

1.1.1. Обобщение литературных данных по элементному составу бактерий и расчёт области «биогенного». Ряд авторов в своих работах рассматривали возможность использования данных по элементному составу бактерий, как критериев оценки биогенного или абиогенного происхождения микрообъектов С помощью рентгеновского микроанализа был исследован элементный состав клеток следующих культур Bacillus cereus, Micrococcus luteus, Hyphomicrobium vulgare, Caulobacter bacteroides, Flectobacillus major, Escherichia coll, Arthrobacter globiformis и др (Screrrer et al, 1987; Norland et al, 1995, Мулюкин с соавт, 1996,1997,2002, Никитин с соавт, 1998) Предлагаемый ими алгоритм был достаточно сложным в применении и не позволял использовать ранее полученные данные по элементному составу уже исследованных бактерий

Мы объединили имеющуюся разрозненную информацию по элементному составу бактерий и создали единый массив данных Для этого площадь пика каждого биогенного элемента нормировали к сумме площадей пиков всех элементов На основании этих данных был построен общий график, на котором были определены минимальные и максимальные значения содержания биогенных элементов (рис 1)

Рисунок 1 Суммарные значения содержания биогенных элементов в бактериальных клетках по литературным данным. 1 - максимальные значения, 2 -минимальные значения

Было установлено, что если элементный состав природного микрообъекта попадает в обозначенную область между кривыми 1 и 2, то данный микрообъект можно отнести к биогенному. Если элементный состав микрообъекта выходит за пределы коридора между кривыми 1 и 2, то данный микрообъект можно считать абиогенным

1.1.2. Определение диапазонов содержания элементов в клетках с различным физиологическим состоянием. В развитие метода было проведено исследование около 180 клеток бактерии Bacillus subtilis в различных стадиях развития, в том числе со спорообразованием и формированием цистоподобных клеток Были исследованы клетки в следующих физиологических состояниях вегетативные, вегетативные

п 60 Р о ц40

'30

20 Ы10

\ > /

у, - г

- ■*- - ■ — - +2

S_CI

стационарные с проспорами, споры, покоящиеся цистоподобные, лизированные.

Было показано, что в клетках в процессе их развития происходят изменения в содержании биогенных элементов (рис. 2).

Рисунок 2. Примеры клеток, которые анализировали с помощью рентгеновского микроанализа, типичные спектры и рассчитанные для 30 клеток в этом состоянии области значений содержания биогенных элементов (в %), нормированных к сумме всех элементов: а) вегетативная клетка; 6) вегетативная клетка, в которой начинается процесс формирования споры; в) спора; г) цистоподобная клетка; д) лизированная клетка.

Средние кривые на графиках обозначают средние значения содержания элементов в 30-ти клетках. Верхние и нижние кривые обозначают максимальные и минимальные допустимые значения содержания элементов в клетках данного физиологического состояния.

Как видно из графиков максимальное содержание фосфора приходится на вегетативные клетки. Вероятно, это связано с тем, что в период роста в

клетках активно протекают процессы синтеза нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), а так же фосфолипидов

При формировании в клетках проспор и спор соотношение элементов изменяется, то есть уменьшается содержание фосфора и повышается уровень кальция. Это связано с тем что при формировании спор в клетке накапливается дипиколиновая кислота связанная с кальцием

В цистоподобных клетках уровень содержания фосфора ниже, чем в вегетативных, что может быть связано с приостановкой синтеза нуклеиновых кислот и фосфолипидов Однако, уровень серы в цистоподобных клетках выше, чем в вегетативных, что можно объяснить присутствием белков, выполняющих стабилизирующие функции Содержание калия и кальция остается на уровне вегетативных клеток

Особый интерес, с точки зрения элементного состава, представляют лизированные клетки Суммарный график их элементного состава очень близок к цистоподобным клеткам. Это связано с тем, что клетки лизируются не мгновенно В клетках с признаками деструкции зачастую остаются фрагменты мембран, цитоплазмы и нуклеиновых кислот И только лишь на последних стадиях деструкции лизированные клетки выглядят как на рисунке 2 д

Большая часть полученных данных по элементному составу В виЬиЬз лежала в ранее рассчитанной нами области «биогенного» Объединяя, собственные и литературные данные нами был рассчитан суммарный коридор значений содержания биогенных элементов по всем типам исследованных клеток в различных физиологических состояниях (рис 3) Во всех графиках дополнительно был введен кремний, показывающий, что рассчитанная область действительна только для биогенных элементов Соединение разных элементов пунктирными линиями использовано для наглядности

Рис 3 Суммарные значения содержания элементов в бактериальных клетках (% к сумме всех элементов) в различных физиологических статусах 1 - максимальные значения, 2 - минимальные значения, 3 -средние значения содержания элементов в лизированных и мертвых клетках

N3 51 Р 5 С! К Са Таким образом, используя данные, полученные по В зиЪЫга, можно определять живой или неживой обнаруженный микрообъект В том случае если микрообъект оказывается живым, то можно определить его примерный физиологический статус

Примером использования разработанного подхода является изучение микробной компоненты из ледового керна над озером Восток (Антарктида). Высокий интерес микробиологов к этому объекту связан с тем, что антарктический лёд является естественным хранилищем микроорганизмов, замороженных в нём не менее 400 тыс. лет назад. Антарктический лед может также рассматриваться как модельный объект экзобиологии, имитирующий условия других планет и их спутников, покрытых льдом, возможно хранящим остатки исчезнувшей внеземной жизни. С помощью люминесцентной микроскопии установлено, что во льду антарктического щита численность микроорганизмов варьирует от 102 до 103 кл/мл (Абызов с соавт., 1979, 1982, 1998, 2004; Каг1 ег а1., 1999). Большая часть обнаруженных бактерий были спорообразующими. При этом численность микроорганизмов с повышением глубины кернов уменьшается. В связи с этим, возникает потребность в использовании дополнительных методов обнаружения бактерий в антарктическом льду, а в дальнейшем и в озере Восток.

Микрочастицы из талой воды (из центральной части керна) для микроскопических исследований были получены путём фильтрации воды (100 мл) на мембранные фильтры с размером пор 0,2 мкм. С помощью метода экспресс-дифференциации было проанализировано 60 частиц, внешне похожих на бактериальные клетки. Только 8 из них по элементному составу были отнесены к бактериальным клеткам. Их спектры лежали в области, определённой нами как зона лизированных клеток в модельных культурах.

Частицы, которые по элементному составу можно отнести к биогенным микрообъектам, чаще всего не имели правильной (классической) формы бактериальных клеток и обладали малыми размерами - 0,25 до 0,5 мкм (рис. 4

Иногда встречались частицы, внешне похожие на палочковидные и коккоподобные клетки микроорганизмов, но по данным элементного состава содержащие преимущественно соединения кремния (рис. 4 а).

Методом люминесцентной микроскопии осадка из антарктического льда с использованием красителя Live/Dead нами было выявлено всего два объекта. Первый из них имел палочковидную форму и красное свечение и

Ь) клетка.

'исунок 4. а,

неральная частица, внешне похожая на микроорганизм; связанная с минеральной частицей. Мм - микроорганизм, М - минеральная частица.

предположительно был погибшим микроорганизмом Второй имел смешанное свечение, переходящее от красного к зеленому - скорее всего, принадлежащее покоящейся клетке с изменённой барьерной функцией мембраны

Проведенный двухстадийный ПЦР-анализ проб керна не дал положительных результатов Использованный метод ПЦР позволяет получать продукты амплификации из тест-организма Е coli при численности 100-1000 кл/мл Вероятно, количество клеток, если они есть, недостаточно для анализа проб льда Не исключено также, что использованные методы выделения ДНК (кипячение фильтров с клетками перед ПЦР или выделение ДНК из клеток фенольным методом) не являются достаточно эффективными для подобных необычных образцов

Таким образом, использование метода рентгеновского микроанализа в сочетании с массивом данных по элементному составу бактерий в различном физиологическом состоянии для подобных природных объектов является информативным

1.2. Модификация и применение метода низкотемпературного

фракционирования микроорганизмов из образцов с большим содержанием

минеральной компоненты. Для анализа образцов с малой численностью

микроорганизмов и большим содержанием минеральной компоненты (почвы,

илы, грунты из криолитозоны) используют разнообразные методы

фракционирования и концентрирования Однако эти процедуры чаще всего

проводятся при температуре и влажности, позволяющих реактивацию

покоящихся клеток и размножение, что может искажать результаты анализа

Одним из наиболее удачных методов является низкотемпературное

фракционирование микроорганизмов из грунтов криолитозоны, предложенный

Дмитриевым с соавторами (1997) Согласно этой методике клетки

микроорганизмов отделяют от минеральной компоненты при отрицательных

температурах, что позволяет сохранить клетки в их естественном состоянии

Дмитриевым с соавт этот метод отрабатывался на модельной культуре

дрожжевых клеток Cryptococcus albidus При этом извлечение клеток из

модельного грунта составило около 75-80% Большую часть микробного

сообщества грунтов криолитозоны составляют бактерии С помощью методики,

отработанной на дрожжевых микроорганизмах, при модельном

фракционировании было извлечено меньшее количество бактерий 57%) от

внесенного количества Это также было подтверждено контрольными высевами

на плотные питательные среды из осадков и супернатантов Поэтому нами была

предпринята попытка модифицировать этот метод Для того, чтобы определить,

какие изменения необходимо внести в метод, была проведена серия

экспериментов фракционирования бактериальных клеток Micrococcus sp. штамм КН1 из модельного грунта, по структуре сходного с грунтами криолитозоны. В результате этого в существующую методику были внесены следующие изменения: использован глицерин в концентрации 35% с добавлением 0,1% пирофосфата натрия и 0,1% пирувата натрия (было глицерин в концентрации 35%, 40%, 50%, без добавок); после каждого центрифугирования осадок подвергался обработке ультразвуком 1 мин 15 кГц, 0,44А; изменены режимы и количество этапов центрифугирования (было 1000g (по 1 мин 13 раз), 10000g (по 60 мин 1 раз), стало 800g (по 45 с 10 раз), 10000g (по 60 мин 2 раза)). После внесения модификаций в данный метод эффективность извлечения модельной культуры составила примерно 80-85%) индикаторной бактерии.

С помощью модифицированного метода низкотемпературного фракционирования нами были получены фракции клеток из грунтов криолитозоны (два образца). Присутствие жизнеспособных бактерий в образцах определяли по высевам на плотные питательные среды для гетеротрофов. Прямыми методами микроскопии, методами сколов и ультратонких срезов удалось выявить микроорганизмы только в одном образце. Электронно-микроскопический анализ ультратонких срезов показал, что обнаруженные микроорганизмы, судя по ультраструктурным признакам, находились в цистоподобном состоянии. Одни из них были заключены в органоминеральные капсулы, как описано ранее (Дмитриев с соавт., 2001), другие не имели подобных капсул.

Рисунок 5. Микроорганизмы, извлечённые из грунтов криолитозоны и наблюдаемые прямыми методами микроскопии: а) бактерии заключённые в минеральные капсулы; б) дрожжевая клетка без капсулы; в) скол бактериальной клетки.

Во втором образце из грунтов криолитозоны бактериальные клетки были прочно связаны с ультратонкой минеральной фазой, что сделало невозможным их прямую визуализацию.

1.3. Разработка и применение метода субстратных агаровых каналов.

Метод субстратных агаровых каналов состоит из следующих этапов расплавленной агаризованной питательной средой заливают стеклянные стержни 0 » 1-1,5 мм, уложенные решеткой, после застывания среды стеклянные стержни извлекают, потом из этого материала вырезают прямоугольные блоки 5x5x20 мм с каналом внутри, в канал помещают аликвоту суспензии образца, открытые концы канала заливают той же средой, после чего эти блоки инкубируют при заданной температуре, затем эти блоки заключают в полимерные смолы (по стандартной методике) и готовят ультратонкие срезы для электронно-микроскопического анализа

Необходимо отметить преимущества использованного метода- 1) при изготовлении агаровых каналов можно варьировать состав питательной среды, что позволяет наблюдать за конкретными трофическими группами микроорганизмов, 2) в условиях агаровых каналов рост бактерий проходит на границе раздела фаз, что приближает созданные условия к естественным, 3) микроаэрофильные условия предотвращают окислительный стресс при прорастании покоящихся форм, 4) в первых генерациях прорастает и формирует микроколонии большее количество клеток, нежели при формировании макроколоний при стандартных посевах на плотные среды, 5) наблюдение, проводимое на уровне ультратонких срезов, позволяет определять, в каком физиологическом состоянии находятся клетки, как изменяется соотношение морфотипов бактерий в процессе подращивания

Разработанный метод был использован для подращивания «замаскированных» бактериальных клеток из грунтов криолитозоны. Образцы клеток, заключенные в каналы агаризованной питательной среды 5/5 (состав среды указан в разделе «Материалы и методы»), инкубировали при 4°С, 20°С и 29°С. Для каналов, инкубируемых при температуре 4°С, отбор проб производили каждые 20 дней (3 точки отбора), при температурах 20°С и 29°С -каждые 10 дней (3 точки отбора) С помощью этого метода было обнаружено три типа развития бактерий из уникальных образцов грунтов криолитозоны

По первому типу развития покоящиеся формы микроорганизмов прорастали и формировали на стенках каналов микроколонии Затем в этих микроколониях образовывались покоящиеся формы В большинстве своем они были представлены цистоподобными клетками Необходимо отметить, что лишь небольшая часть клеток в микроколониях образовывали покоящиеся формы, остальные отмирали (лизировались)

Согласно второму типу, покоящиеся клетки в органоминеральных капсулах из анализируемого образца переходили в вегетативное состояние, но не размножаясь погибали

По третьему типу покоящиеся формы микроорганизмов не реагировали на появление питательных субстратов и повышение температуры

Было отмечено, что с повышением температуры инкубации от 4 до 29°С увеличивалась степень морфологического разнообразия прорастающих микроорганизмов По-видимому, микробное сообщество, заключенное в грунтах криолитозоны, представлено преимущественно мезофильными формами Этот результат согласуется с данными многих исследователей, проводивших культивирование микроорганизмов из образцов криолитозоны (Vorobyova et al, 1997, Гиличинский с соавт, 1989, Вишнивецкая, 2002, Хименков, 2006)

1.4. Модификация и применение метода «микромонолитов». С помощью

данного метода можно изучать ультраструктуру микроорганизмов, как

природных систем, так и антропогенных с высокой численностью микробного

сообщества Кроме этого данный метод позволяет получать детальную

информацию о пространственной организации микробных сообществ in situ

Для проведения исследований ненарушенных сообществ микроорганизмов из

таких мест обитания, обычно, вырезают фрагмент образца, в некоторых случаях

заключают в агар, а затем заливают в эпоксидную смолу Из полученного блока

изготавливают ультратонкие срезы

В нашей работе, в данный метод было внесено несколько изменений

Внесенные нами модификации заключались в следующем 1) во время

фиксации использовали рутениевый красный, который вступает в

цитохимическую реакцию с полисахаридами, 2) после полимеризации смолы с

«микромонолитов» срезали верхние слои материала, в которых могли быть

внесены механические повреждения в процессе их вырезания Таким образом,

предложенные модификации позволяют достоверно обнаруживать

полисахариды и минимизировать механические повреждения образцов Кроме

этого, «микромонолиты» получали, учитывая макрозональность строения

анализируемого материала

Из образцов нефтешламов и микробных обрастаний термальных

источников Камчатки отбирали монолитные блоки матов (3x3 см) Затем их

фиксировали 2,5-3,2% глютаровым альдегидом с добавлением 0,01%

рутениевого красного После этого фиксированные блоки заключали в агар с

целью сохранения формы объекта Из блоков вырезали фрагменты материала

(3x3 мм) - «микромонолиты», отличающиеся по зональному строению (рис 6)

«Микромонолиты» фиксировали в 1% 0s04 в 0,05М какодилатном буфере в

течение 3 часов После чего микромонолиты отмывали в том же буфере и

обезвоживали в серии спиртов и ацетоне Подготовленные блоки заливали в

смесь эпоксидных смол Эпон 812 и Аралдит М согласно стандартной методике (Миронов с соавт., 1994).

/ИШШЩ:?- светло серая

ggf темно серая Рисунок 6- Схема отбора яя^швшат^ т „ г «микромонолитов» из

•зипа

-чёрная зона нефтешлама.

ч- •■"■

микромонолиты <~

После полимеризации смолы с «микромонолитов» срезали верхние слои материала, в которых в микробном сообществе могли быть внесены механические повреждения в процессе их вырезания. После этого из ненарушенных областей подготавливали ультратонкие срезы. Окраску ультратонких срезов проводили комплексным свинцовым контрастёром и уранилацетатом (Миронов с соавт., 1994).

С помощью метода «микромонолитов» были исследованы две группы объектов: 1) нефтешламы; 2) циано-бактериальные обрастания гидротерм.

1.4.1. Изучение структурно-функционального состояния бактерий в нефтешламовых «микромонолитах». В этой эконише был обнаружен широкий спектр бактериальных клеток различной морфологии: спирохеты, вибрионы, почкующиеся формы, простекобактерии, коринеформы и др. При анализе ультратонких срезов нефтешламных «микромонолитов» (3*3 мм) было выявлено несколько различных типов агрегации бактерий: одиночные клетки; скопление клеток одного вида, окружённых общей капсулой, отделяющей микроколонию от остальных микроорганизмов; микроколонии без капсулы, развивающиеся внутри минеральных частиц (рис. 7 а, б).

Рисунок 7. Микроколонии образованные клетками одного морфотипа: а) с капсулой; б) без капсулы, заключённая внутри минеральной частицы.

Второй тип микроколоний был наиболее распространён и представлен несколькими популяциями морфологически различающихся микроорганизмов (рис. 8).

Рис. 8. Второй тип микроколонии, состоящий из нескольких популяций морфологически различающихся микроорганизмов. ЦПК - цистоподобные клетки.

В нефтешламах присутствовало большое количество покоящихся форм. В основном, так же как и в грунтах криолитозоны, они были представлены цистоподобными клетками и цистами. Некоторые клетки обладали структурами, сходными с органоминеральными капсулами (рис. 9), наблюдаемыми у микроорганизмов, выделенных из грунтов криолитозоны (Дмитриев с соавт., 2001,2004).

Рисунок 9. Клетка с органо-минеральной капсулой

обнаруженная в нефтешламах. НС - наружний слой, ВС - внутренний слой, Кр - кристаллы, КС -клеточная стенка.

Обнаружение подобных структур в сильно различающихся экосистемах говорит об универсальности данного механизма переживания неблагоприятных условий. Наиболее вероятным назначением формирования таких капсул является защитная функция. Присутствие спор в нефтешламах отмечалось крайне редко.

В микроколониях рост бактерий, по-видимому, ограничивался как токсичными компонентами среды, так и высокой плотностью популяций (Бухарин с соавт., 2005).

1.4.1.1. Выявление и исследование бактерии Кшяйа шИра/а из нефтешламов. В процессе изучения микробного сообщества нефтешламов методом «микромонолитов» нами была обнаружена бактерия с необычной морфологией. Анализ большого количества микроколоний этой бактерии показал, что крупные клетки в колонии состоят из маленьких, объединённых «материнской» клеткой (рис. 10). Часть маленьких клеток, с диаметром 0,2 мкм (наноклетки), отделялись от «материнской» в пространство микроколонии. По нашим наблюдениям эти маленькие клетки способны расти и формировать новую «материнскую» клетку. В тех случаях, когда наблюдали разрушение слизистого матрикса микроколонии, наноклетки выходили в окружающую среду.

Рисунок 10. Ассоциация наноклеток в нефтешламе. П - периплазма, ВМ -внешняя мембрана, Пф - полифосфаты, Н - нуклеоид, ЦПМ -цитоплазматическая мембрана, К-внутреннее пространство колонии.

Обнаруженный микроорганизм был выделен в чистую культуру - штамм NF1. По типу питания данная бактерия относится к гетеротрофам. Она способна расти как на богатых, так и на бедных питательных средах. На бедных питательных средах (почвенная вытяжка) рост замедлялся. В цитоплазме клеток штамма NF1 было отмечено формирование включений поли-Р-гидроксибутирата. Эти включения на срезах выглядят как электронно-прозрачные зоны, окружённые однослойной мембраной толщиной «30А, а на сколах имеют форму вытянутых острых кристаллов. In situ, в клетках этого микроорганизма, было отмечено присутствие плотных гранул полифосфатов и необычных мембраноподобных образований в виде стопок тонких, вероятно, миелиновых мембран размером 25-40А><150-300А. В лабораторных условиях в клетках стопки мембранных структур и гранулы полифосфатов встречались редко.

Анализ гена 16S рРНК бактерии NF1 показал 99% сходства с последовательностью микроорганизма Kaistia adipata на участке гена размером в 650 пар нуклеотидов.

Таким образом, с помощью метода «микромонолитов» была обнаружена бактерия, формирующая наноклетки, которая затем выделена в чистую культуру. Это позволило сравнить ультраструктуру данной бактерии в естественных и в лабораторных условиях обитания.

1.4.2. Изучение структурно-функционального состояния бактерий в циано-бактериальном мате подножия гейзера Великан. Для циано-бактериальных обрастаний подножия гейзера Великан выделяли три зоны: верхнюю, получающую наилучшее освещение, но подвергающуюся прямым периодическим воздействиям воды с высокой температурой; среднюю, получающую меньшее количество световой энергии, но подвергавшуюся меньшим воздействием высоких температур; и нижнюю, получающую крайне малое количество света, но практически не подвергающуюся действию высоких температур. В вертикальном разрезе этого мата концентрация минеральных частиц от верхнего слоя к нижнему возрастала. Выпадение минерального вещества в нижних горизонтах мата, вероятнее всего, было связано с подщелачиванием среды в результате активных процессов фотосинтеза, при которых минеральная компонента из раствора переходит в осадок (Заварзин, 1989; Phoenix, 2003; Konhauser, 2003).

Доминирующим представителем верхнего слоя оказался фотосинтетический микроорганизм (рис. 11), по наличию внешней, цитоплазматической и фотосинтетических мембран напоминающий Oscillatoria (Федоров с соавт., 1964). Однако в отличие от Oscillatoria обнаруженный микроорганизм был одноклеточным и не формировал нитей. В структуре циано-бактериального мата клетки были расположены на значительном расстоянии друг от друга. Всё межклеточное пространство было заполнено полисахаридами (цитохимическая реакция с рутениевым красным). Возможно, этот полисахаридный матрикс имеет не только защитные и коммуникативные функции, но и играет роль фильтра (или линзы) для дневного света. Между клетками фотосинтетика размещались редкие микроколонии более мелких одноклеточных микроорганизмов.

Несмотря на то, что клетки верхнего слоя исследуемого мата подвергаются периодичному влиянию высоких температур, покоящихся форм обнаружено не было. Крайне редко встречались погибшие клетки, представленные клетками-тенями.

Рисунок 11. Фотосинтезирующий микроорганизм в верхнем слое оливкового мата. ВМ - внешняя мембрана, Пп - периплазма, ЦПМ - цитоплазматическая мембрана, ФМ

фотосинтетические мембраны.

Под верхним (оранжево-оливковым) слоем располагалась зелёная зона. По ультраструктурным признакам составляющие её нитчатые бактерии имели высокое сходство с представителями рода РИогтгсИит. Нити этой цианобактерии имели горизонтальную ориентацию роста, и только некоторые располагались вертикально и были выявлены (прорастали) в верхнем слое мата. Кроме цианобактерий было выявлено большое количество бактерий. Стратегия существования одноклеточных микроорганизмов зелёной зоны была разнообразной: одни внедрялись в полисахаридный матрикс, другие прикреплялись к нему посредством выростов, третьи выбирали пространство, не заполненное полисахаридом (рис. 12 а, б, в, г).

Рисунок 12. Микроорганизмы зелёной зоны мата: а) внедряющийся в полисахаридный матрикс; б, в) прикрепляющиеся выростами к полисахаридным тяжам; г) обитающий в пространстве не заполненном полисахаридом. Пф -полифосфаты; в - структуры сходные с в-слоями; Кв - клеточные выросты; В -включения; С - слизь.

В нижележащем (белом) слое мата доминировали бактерии. В этом слое так же были обнаружены разрушающиеся клетки цианобактерий, по ультраструктуре сходные с Ркогт'кИит и Зупескососст. В этой зоне количество погибших и лизирующихся клеток было гораздо больше, чем в двух вышележащих слоях. Анализ ультратонких срезов позволяет предположить существование различных процессов деструкции цианобактерий - путём автолиза, при взаимодействии с гидролитическими бактериями и в результате развития бактерий-паразитов. Характерной чертой бактериальных клеток белого слоя мата было наличие различного рода клеточных выростов. Одни клетки имели простеки диаметром около 0,06 мкм, другие - выросты на внешней стороне оболочки.

Во всех исследованных слоях циано-бактериального мата были обнаружены только вегетативные и лизированные клетки; покоящихся форм микроорганизмов найдено не было. Это может быть обусловлено режимом извержения гейзера - с периодичностью один раз в 6 часов. Циклы развития микроорганизмов в этом случае, можно назвать «усечёнными». Вероятно, в периоды оптимальных температур клетки размножались с максимальной скоростью, затем их рост замедлялся либо за счёт плотности клеток в объёме

(высокой концентрации ауторегуляторных факторов), либо за счет температурного стресса, то есть микроорганизмы не успевали сформировать покоящихся форм

1.4.3. Цитологическая и таксономическая характеристика циано-бактсрнальных сообществ гидротерм Восточного термального поля (Узон).

Для решения вопроса о сопоставимости результатов микроскопической и молекулярно-биологической оценок микробного биоразнообразия в природных системах было проведено цитологическое и геносистематическое (с помощью создания библиотек клонов генов 16S рРНК) исследования микробных сообществ из пяти гидротерм кальдеры Узон, отличающихся физико-химическими параметрами и биологической продуктивностью Микробные сообщества представляли собой бактериальные и цианобактериальные обрастания, выстилающие стенки и чаши гидротермальных источников на глубине 5 - 25 см

В таблице 1 представлены таксоны бактерий, обнаруженные методом создания библиотек клонов генов 16S рРНК в изучаемых источниках Интересной особенностью микробных сообществ всех гидротерм, оказалось выявление в них бактерии с последовательностью нуклеотидов в 16S рДНК близкой к последовательности вида Chlorobuculum tepidum Хотя по ультраструктурным данным количество этих бактерий по сравнению с другими микроорганизмами было невелико В некоторых клонотеках последовательности принадлежащие этому таксону доминировали (источник Л и теплая зона источника О) Постоянное выявление и в некоторых случаях преобладание филотипа Chlorobuculum, вероятнее всего, связано с перекосом выборки при ПЦР и клонировании Тогда как электронно- микроскопически данная бактерия выявлялась не во всех источниках и не являлась доминирующим представителем сообществ

В качестве примера сопоставления цитологических и молекулярно-биологических данных подробнее рассмотрим результаты исследования структуры микробного сообщества источника П В этом источнике были обнаружены молекулярными методами 5 филотипов бактерий (табл 1), а по ультраструктурным данным - 6 морфотипов клеток микроорганизмов Наиболее интересным компонентом микробного сообщества оказался микроорганизм, по ультраструктуре сходный с представителями Geothrix Характерной ультраструктурной особенностью этого микроорганизма является формирование клетками длинных волосоподобных нитей - чехлов, на поверхности которых сорбируются мелкие минеральные частички (Coates et al, 1998)

Название Таксоны обнаруженные Частота Количество

источника методом клонирования встречае- морфотипов,

мости, % обнаруженных в

источниках

Источник О. Sulfurihydrogenibium sp 70

голубовато- Chloroflexus aggregans 10

белые нити, Gammaproteobacteria

Enviromental samples 10

Uncultered bacterium И

clone lb62 10

Chlorobuculum tepidum 70

Oscillatoria

циано- amph igran ulata 10

бактериальное Roseiflexus castenholzii 10

сообщество Meiothermus cerbereus 10

Источник Р Rhodoferax ferrireducens 66,6 5

Chlorobuculum tepidum 33,4

Источник X Gammaproteobacteria

Uncultered hydrocarbon

seep bacterium BPC028 50 6

Chlorobuculum tepidum 20

Spirochaeta stenostrepta 20

Химера 10

Источник Л Chlorobuculum tepidum 90 6

Rhodopseudomonas

palustris 10

Источник П Thiomonas sp. 30

Chlorobuculum tepidum 20

Geothrix fermentans 20 6

Rhodoblastus acidophila 20

Acidobactenaceae

Ellin 5095 (AY234512) 10

Это свойство обусловлено способностью данного микроорганизма

восстанавливать железо, которое затем откладывается на поверхности клеток и

колоний Авторы, описавшие этот микроорганизм, изучали его строение в

сканирующем микроскопе Однако этот вид микроскопии не позволяет выявить

все ультраструктурные особенности клеток На ультратонких срезах бактерии

из источника П было видно, что волосоподобные структуры формируются за

счет экзоцеллюлярного вещества, выделяемого клетками (рис 13) Этот тип

экзоцеллюлярного вещества имеет настолько тонкую структуру, что увидеть ее

в сканирующем микроскопе затруднительно Клетки делятся внутри этого

чехла, таким образом, формируя нити По нашим наблюдениям, это

внеклеточное вещество обладает высокими адгезивными свойствами, что

позволяет нитям склеиваться, образуя волосоподобную структуру. Кроме этого, на чехле наблюдали множественное присутствие мелких минеральных частиц

Рисунок 13. Микроорганизмы сходные с Оео&г'а ¡р., заключённые в полисахаридный чехол. Красным пунктиром обозначены фрагменты нитей. М - минеральные частицы, Эв -экзоцеллюлярное вещество, Пф -полифосфаты.

сообщества в источнике П был микроорганизм, по ультраструктуре близкий к представителям рода КЬ.ос1ор8еиаотстаз и некоторых других несерных пурпурных бактерий. Характерными признаками этой бактерии являются: полярный рост клеток, ассиметричное деление и формирование почек. Внутренние фотосинтетические мембраны представлены ламеллами, расположенными параллельно цитоплазматической мембране (рис. 14 а, б). Клетки бактерии, сходные по ультраструктуре с Шойорвеиаотопав ¿р., в источнике часто находились в близком контакте с двумя другими микроорганизмами - грамотрицательной палочкой (рис. 14 а) и с фотосинтетическим микроорганизмом, обладающим везикулярным фотосинтетическим аппаратом (рис. 14 б). Причины, по которым не был выявлен филотип микроорганизма с везикулярным фотосинтетическим аппаратом (рис. 14 б) пока не ясны, так как количество и физиологическое состояние клеток позволяло ожидать успешного выделения пригодной для исследования ДНК.

(рис. 13).

Следующим компонентом

МКЧ

Рисунок 14. Бактерии из источника П: а) с ламеллярным фотосинтетическим аппаратом, сходная с несерными пурпурными бактериями, рядом с которыми обитает бактерия с грамотрицательным типом строения клеточной стенки; б) клетка сходная с ./Угофргеис/отоиа? ¡р., обитающая в близком соседстве с пурпурными бактериями, обладающими фотосинтетическим аппаратом везикулярного типа. Лф - фотосинтетический аппарат ламелярного типа; Вф - фотосинтетический аппарат везикулярного типа.

Поскольку выявленные молекулярно-биологическим методом представители Thiomonas не имеют каких-либо ярко выраженных ультраструктурных особенностей, то в наблюдаемых цитологических картинах образца из источника П достаточно сложно предположительно отнести тот или иной морфотип клеток к рассматриваемому таксону

Таким образом, при исследовании образца из источника П молекулярно-биологическим методом было выявлено 5 филотипов, а методом ультратонких срезов микромонолитов - 6 морфотипов клеток В остальных источниках количество обнаруженных морфотипов также превышало число определенных филотипов (табл 1)

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработаны методы экспресс-дифференциации и субстратных агаровых каналов, позволяющие обнаруживать биогенные микрообъекты и определять их вероятное физиологическое состояние в различных природных образцах Усовершенствованы методы низкотемпературного фракционирования клеток и «микромонолитов», что позволяет более детально изучать ультраструктуру микроорганизмов in situ

В палеоэконишах (ледовый щит Антарктиды, криогрунты Восточной Сибири) микроорганизмы и их сообщества не формируются, а хранятся Так в Антарктический щит микроорганизмы привносятся случайно с потоками воздушных масс и вмерзают в ледяную толщу Микробное сообщество криогрунтов Восточной Сибири было сформировано в более ранний геологический период при благоприятных условиях, которые позднее сменились на условия вечной мерзлоты

Было показано, что формирование сообщества, характерного для определенной среды обитания, зависит от физико-химических условий и скоростей их изменения В нефтешламмах было отмечено высокое содержание покоящихся форм с ярко выраженными ультраструктурными признаками В противоположность им в микробных матах гидротерм Камчатки покоящиеся формы практически не встречались, что указывает на иную стратегию выживания микроорганизмов

секвенируемых клонов Вместе с тем, очевидно, что по ультраструктурным данным возможно лишь приблизительное определение бактерий с точностью до крупных таксонов и в зависимости от наличия ярких морфологических особенностей Дифференциация большого числа морфологически однообразных гетеротрофных микроорганизмов оказывается вообще невозможной Поэтому для оценки микробного разнообразия методы электронной микроскопии и метод анализа клонотек генов рРНК следует рассматривать как взаимодополняющие и равно важные для исследования

ВЫВОДЫ

1 Разработан метод экспресс-дифференциации биогенных/абиогенных микрообъектов и их вероятного физиологического состояния на основании данных по элементному составу бактериальных клеток

2 Методом экспресс-дифференциации исследован осадок из керна льда ледового щита Антарктиды над озером Восток, и обнаружены биогенные объекты с большой долей вероятности относящиеся к лизированным бактериальным клеткам

3 Усовершенствован метод низкотемпературного фракционирования для выделения и концентрирования бактериальных клеток из экониш с низкой численностью микроорганизмов

4 Разработан новый метод «субстратных агаровых каналов» для исследования динамики развития «замаскированных» вегетативных и покоящихся форм бактерий из фракций грунтов криолитозоны (Восточная Сибирь) на ультратонком уровне

5 Модифицирован метод «микромонолитов» для электронно-микроскопического исследования бактерий и их сообществ в эконишах с высокой микробной численностью (нефтешламы, термальные источники) С помощью этого метода обнаружена бактерия, формирующая наноклетки, в дальнейшем выделенная в чистую культуру

6 Показана эффективность совместного применения молекулярно-биологических подходов с методами электронной микроскопии для исследования микробных сообществ в различных экосистемах

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи

1 Сузина H Е, Мулюкин A JI, Козлова А H, Шорохова А П, Дмитриев В В , Баринова Е С . Мохова О H, Эль-Регистан Г И, Дуда В И Тонкое строение покоящихся клеток некоторых неспорообразующих бактерий Микробиология 2004 Т 73 №4 С 516-529

2 Дмитриев В В., Сузина H Е, Баринова Е С . Дуда В И, Воронин A M Электронно-микроскопическое изучение ультраструктуры микробных клеток in situ в экстремальных биотопах Микробиология 2004 Т 73 №6 С 832 -840

3 Suzina N Е, Mulyukin A L, Dmitriev V V, Nikolaev Y А, Shorokhova А Р, Bobkova Y S , Barinova E S„ Plakunov V К, El-Registan GI, Duda VI The structural bases of long-term anabiosis in non-spore-formmg bacteria Advances in Space Research 2006 V 36 (6), P 1209-1219

4 Дуда В И, Сузина H E, Акимов В H, Вайнштейн M Б , Дмитриев В В , Баринова Е С , Абашина Т H, Олейников Р Р, Есикова Т 3 , Воронин A M Особенности ультраструктурной организации и цикла развития почтенных ультрамикробактерий, относящихся к классу Alphaproteobacteria Микробиология 2007 Т76 №5 С 652-661

Тезисы

1 Баринова Е С, Лаптева Ю С Ультраструктура нативных форм микроорганизмов Сборник тезисов 7-я Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» Пущино 2003. С 264-265

2 Баринова ЕС Поиск диагностических критериев для оценки структурно-функционального состояния микробов in situ на примере культуры Bacillus subtihs Сборник тезисов Всероссийская молодежная школа-конференция молодых ученых «Актуальные аспекты современной микробиологии» Москва, 2005. С. 8 - 9

3 Баринова Е С Изучение ультраструктуры микробных клеток in situ методом микромонолитов Сборник тезисов Н-ая Международная молодежная школа-конференция молодых ученых «Актуальные аспекты современной микробиологии» Москва, 2006 С 4-5

4 Баринова Е С Новый метод обнаружения и исследования тонкой структуры микроорганизмов, находящихся в почве Сборник тезисов Международная научная конференция «Современные экологические проблемы севера» Апатиты 2006 С 29-30

5 Barinova E , Kulikov Е , Manykin A and Letarov A The applications electron microscopy in phage ecology 17th Evergreen International Phage Biology Meeting Olympia 2007. p. Е-16.

6 Баринова E С . Подосокорская О А, Акимов В H, Гальченко В Ф Таксономическая и цитологическая характеристика бактериальных сообществ гидротерм Кальдеры Узон (Камчатка) 2-ой Байкальский микробиологический симпозиум с международным участием. Иркутск 2007, с 21

Подписано в печать 15 04 2008 Печать трафаретная

Заказ № 269 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Баринова, Екатерина Сергеевна

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Подходы к изучению микроорганизмов в их естественных местах обитания.

1.2. Требования к методам изучения микроорганизмов в их естественных местах обитания.

1.3. Проблема оценки жизнеспособности клеток микроорганизмов в исследованиях.

1.4. Применение методов световой микроскопии в изучении микроорганизмов in situ.

1.5. Применение методов люминесцентной микроскопии в изучении микроорганизмов ex situ и in situ.

1.6. Применение методов электронной микроскопии в изучении микроорганизмов ex situ и in situ.

1.7. Применение молекулярно-биологических методов в изучении микроорганизмов in situ.

1.8. Культуральные методы оценки микробной компоненты экосистем.

1.9. Аналитические методы оценки микробной составляющей экосистем.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование структурно-функционального состояния бактерий в микробных сообществах методами электронной микроскопии"

До конца ХХ-го столетия основные усилия микробиологов были направлены на изучение ультраструктурной организации микроорганизмов ex situ, т.е., при культивировании микроорганизмов в лабораторных условиях.

Были выявлены общие диагностические критерии, позволяющие характеризовать на уровне ультраструктуры физиологическое состояние исследуемого микроорганизма. Однако, ряд исследователей указывал на закономерную связь физиологии, клеточной ультраструктуры и экологии изучаемых микроорганизмов (Холодный, 1935; Новогрудский, 1949; Перфильев с соавт., 1961). Только во второй половине двадцатого века начали появляться единичные работы по изучению зависимости ультраструктурной организации клеток микроорганизмов и форм их обитания in situ, то есть, исследование микроорганизмов непосредственно извлечённых из их естественной среды обитания (Никитин с соавт., 1962; Аристовская, 1962; Звягинцев, 1962, 1987; Bae et al., 1973; Balkwill et al., 1975; Amelio et al., 1987). Применённый Никитиным с соавт. метод прямой электронной микроскопии для изучения водных микроорганизмов, без предварительного культивирования, позволил открыть новые морфологические формы микроорганизмов и, как оказалось впоследствии, и новые таксоны (Никитин с соавт., 1962). Бае с соавт. применили метод фракционирования для отделения клеток микроорганизмов от почвенных частиц, затем полученную фракцию клеток изучили на ультратонких срезах в электронном микроскопе. Эти исследования показали наличие серьёзных отличий в ультраструктуре клеток, непосредственно извлечённых из грунта, по сравнению с бактериями из лабораторных культур (Bae et al., 1973). Подробное изучение структурно-функционального статуса микроорганизмов в их естественных местах обитания начали проводить сравнительно недавно (Дмитриев с соавт., 1997, 2001, 2004; Вишневецкая, 2002; Розанов, 2002; Wierzchos et al., 2004; Lacap et al., 2005; Дуда с соавт., 2007). Дмитриевым с соавт. было показано, что - в криогрунтах Восточной Сибири, находящихся в зоне вечной мерзлоты, присутствуют жизнеспособные про- и эукариотные микроорганизмы, для которых основной формой покоя являются цистоподобные клетки (Дмитриев с соавт., 1997, 2001, 2004). Современные работы, посвящённые исследованию микроорганизмов in situ, с помощью подходов электронной микроскопии показывают, что определяющим и являются методы подготовки проб из исследуемых образцов.

Проведение электронно-микроскопических исследований микроорганизмов и их сообществ в образцах окружающей среды связано с рядом проблем методического плана: 1) некоторые природные среды, такие как криогрунты или вода олиготрофных водоёмов, содержат относительно мало клеток, что делает их прямую визуализацию затруднительной; наличие минеральных образований, морфологически сходных с микробными клетками, затрудняет интерпретацию изображений; 2) минеральная компонента многих образцов не позволяет получать ультратонкие срезы и «маскирует» микробные клетки, 3) для корректной характеристики микробных сообществ с высокой численностью клеток, таких, как бактериальные маты, требуется получить информацию не только о типах входящих в них клеток и их физиологическом состоянии, но и об их естественной пространственной организации.

Таким образом, различное соотношение содержания в образцах микроорганизмов и минеральной компоненты делают невозможной стандартизацию подготовки проб для электронно-микроскопического анализа. Поэтому совершенствование известных и разработка новых методических приёмов для исследования структурно-функционального состояния бактерий в микробных сообществах является актуальным.

Цели и задачи исследования. Усовершенствовать известные и разработать новые методы для изучения структурно-функционального состояния бактерий, в микробных сообществах.

Для выполнения этой цели поставлены следующие задачи: разработать метод экспресс-дифференциации биогенных/абиогенных микрообъектов; усовершенствовать метод низкотемпературного фракционирования и концентрирования микроорганизмов, разработанный ранее для дрожжей, и адаптировать его для бактерий; разработать метод, позволяющий наблюдать за изменениями в структурно-функциональном состоянии «замаскированных» бактерий из уникальных природных образцов; усовершенствовать метод «микромонолитов» для максимального сохранения нативной ультраструктуры микроорганизмов в сообществах. определить эффективность совместного применения микроскопических и молекулярно-биологических методов при исследовании микробных сообществ в различных экосистемах.

Научная новизна. Разработан метод экспресс-дифференциации на основе рентгеновского микроанализа, позволяющий обнаруживать биогенные микрообъекты и определять их вероятное физиологическое состояние в различных природных образцах.

Разработан метод субстратных агаровых каналов. Этот метод позволил в динамике, на ультраструктурном уровне, наблюдать за развитием «замаскированных» ультратонкими минеральными компонентами бактерий из криогрунтов Восточной Сибири.

Модифицирован метод «микромонолитов». Данная модификация позволяет минимизировать влияние механических воздействий на пространственную организацию микроорганизмов в биоплёнках, бактериальных обрастаниях, циано-бактериальных матах в отобранных и подготовленных для ультратонких срезов образцах. Благодаря использованию этого метода была обнаружена, а затем выделена в чистую культуру бактерия, формирующая наноклетки. С помощью этого метода была описана ультраструктура и пространственная организация клеток данной бактерии в естественных условиях обитания.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на 7-ой Пущинской школе-конференции молодых учёных «Биология - Наука XXI века» (Пущино, 2003), Всероссийской молодёжной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005), Н-ой международной молодёжной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2006), Международной научной конференции «Современные экологические проблемы севера» (Апатиты, 2006), 17th Evergreen International Phage Biology Meeting (Olympia, 2007), 2-ой Байкальский микробиологический симпозиум с международным участием (Иркутск, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статей и б тезисов.

Место проведения работы. Экспериментальная часть работы выполнялась в лаборатории классификации и хранения уникальных форм микроорганизмов ИНМИ им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, в отделе Всероссийской коллекции микроорганизмов и лаборатории структурно-функциональной адаптации микроорганизмов ИБФМ им. Г.К.Скрябина РАН, Пущино.

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа изложена на 165 страницах машинописного текста и включает 97 рисунков и 12 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей описание материалов и методов, результатов и обсуждения исследования, выводов и библиографического списка, который содержит 195 наименований.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Баринова, Екатерина Сергеевна

выводы

1. Разработан метод экспресс-дифференциации биогенных/абиогенных микрообъектов и их вероятного физиологического состояния на основании данных по элементному составу бактериальных клеток.

2. Методом экспресс-дифференциации исследован осадок из керна льда ледового щита Антарктиды над озером Восток, и обнаружены биогенные объекты с большой долей вероятности относящиеся к лизированным бактериальным клеткам.

3. Усовершенствован метод низкотемпературного фракционирования для выделения и концентрирования бактериальных клеток из экониш с низкой численностью микроорганизмов.

4. Разработан новый метод «субстратных агаровых каналов» для исследования динамики развития «замаскированных» вегетативных и покоящихся форм бактерий из фракций грунтов криолитозоны (Восточная Сибирь) на ультратонком уровне.

5. Модифицирован метод «микромонолитов» для электронно-микроскопического исследования бактерий и их сообществ в эконишах с высокой микробной численностью (нефтешламы, термальные источники). С помощью этого метода обнаружена бактерия, формирующая наноклетки, в дальнейшем выделенная в чистую культуру.

6. Показана эффективность совместного применения молекулярно-биологических подходов с методами электронной микроскопии для исследования микробных сообществ в различных экосистемах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработаны методы экспресс-дифференциации и субстратных агаровых каналов, позволяющие обнаруживать биогенные микрообъекты и определять их вероятное физиологическое состояние в различных природных образцах. Усовершенствованы методы низкотемпературного фракционирования клеток и «микромонолитов», что позволяет более детально изучать ультраструктуру микроорганизмов in situ.

В палеоэконишах (ледовый щит Антарктиды, криогрунты Восточной Сибири) микроорганизмы и их сообщества не формируются, а хранятся. Так в Антарктический щит микроорганизмы привносятся случайно с потоками воздушных масс и вмерзают в ледяную толщу. Микробное сообщество криогрунтов Восточной Сибири было сформировано в более ранний геологический период при благоприятных условиях, которые позднее сменились на условия вечной мерзлоты.

Было показано, что формирование сообщества, характерного для определенной среды обитания, зависит от физико-химических условий и скоростей их изменения. В нефтешламмах было отмечено высокое содержание покоящихся форм с ярко выраженными ультраструктурными признаками. В противоположность им в микробных матах гидротерм Камчатки покоящиеся формы практически не встречались, что указывает иную стратегию выживания микроорганизмов.

Сравнительное электронно-микроскопическое и молекулярно-экологическое исследование микробных обрастаний из пяти гидротерм позволили оценить соотношение клеток различных морфологических типов и обнаруживаемых таксонов в образце. Было показано, что с помощью электронной микроскопии легко выявляются минорные компоненты сообщества, которые могут быть пропущены при ограниченном количестве секвенируемых клонов. Вместе с тем, очевидно, что по ультраструктурным данным возможно лишь приблизительное определение бактерий с точностью до крупных таксонов и в зависимости от наличия ярких морфологических особенностей. Дифференциация большого числа морфологически однообразных гетеротрофных микроорганизмов оказывается вообще невозможной. Поэтому для оценки микробного разнообразия методы электронной микроскопии и метод анализа клонотек генов рРНК следует рассматривать как взаимодополняющие и равно важные для исследования.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Баринова, Екатерина Сергеевна, Москва

1. Абызов С.С., Липенков В.Я., Бобин Н.Е., Кудряшов Б.Б. Характеристика различных слоев ледника Центральной Антарктиды в связи с микробиологическими исследованиями // Антарктика: Докл. Комиссии. М., 1993. Вып.32. С.188-194.

2. Абызов С.С., Мицкевич И.Н., Поглазова М.Н. Микрофлора глубоких горизонтов ледника центральной Антарктиды. Микробиология, 1998, т. 67, № 4 с. 547-555.

3. Абызов С.С., Мицкевич И.Н., Поглазова М.Н., Иванов М.В. Микробиологические исследования ледниковой толщи Антарктиды. Труды института микробиологии им. С.Н. Виноградского. Юбилейный сборник к 70-летию института. Выпуск XII. Наука. М., 2004, с. 7 — 28.

4. Аринушкина Е.В. Химический анализ почв и грунтов. М.: МГУ, 1952, с. 240.

5. Аристовская Т.В. О принципах экологического анализа в почвенной микробиологии. // Почвоведение. 1962, №1, с. 7-16.

6. Аристовская Т.В. О природных формах существования почвенных бактерий. // Микробиология, 1963, том 32, вып. 4, с. 662 — 667.

7. Бактериальная палеонтология. Ред. Розанов А.Ю. МГУ. М. 2002, с. 188.

8. Бейли Н. Математика в биологии и медицине. Изд-во Мир, М., 1970, с. 326.

9. Биология сине-зелёных водорослей. Под. ред. Федорова В.Д. и Телитченко М.М. Изд-во Московского Университета, 1964, с. 161.

10. Булат С.А., Васильева Л.П., Пети Ж.Р., Лукин В.В., Алёхина И.А. Молекулярно-биологическое исследование бактериального состава жидкости для бурения из скважины 5Г-1, станция Восток, Антарктида. // Проблемы Арктики и Антарктики. 2003. Вып.74. С.88-102.

11. Бухарин О.В., Гинцбург A.JL, Романова Ю.М., Эль-Регистан Г.И. Механизмы выживания бактерий. Изд-во Медицина, 2005, с. 366.

12. Винберг. Г.Г. К вопросу о балансе органического вещества в водоёмах. Сообщ. I-V // Тр. Лимнол. ст. в Косине. Вып. 18. 1934; Вып. 20. 1935; Вып. 21. 1937; Вып. 22. 1939.

13. Вишнивецкая Т.А. Зелёные водоросли и цианобактерии как компонент микробных сообществ вечномёрзлых отложений арктики и антарктиды. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологический наук. Пущино, 2002, с. 123.

14. Гальченко В.Ф. Метанотрофные бактерии. Изд-во ГЕОС, М. 2001, с. 500.

15. Гайер Г. Электронная гистохимия. Изд-во "Мир". М., 1974, с. 488.

16. Герасименко Л.М., Карпов Г.А., Орлеанский В.К., Заварзин Г.А. Роль циано-бактериального фильтрав трансформации газовых компонентов гидротерм на примере кальдеры Узон на Камчатке. // Журнал общей биологии. 1983, т. XLIV, №6, с. 842-851.

17. Герасименко Л.М., Орлеанский В.К. Актуалистическая палеонтология цианобактерий. В юбилейном сборнике к 70-летию Института. Наука. М., 2004, с. 80- 108.

18. Гиличинский Д.А., Хлебникова Г.М., Звягинцев Д.Г., Фёдоров- Давыдов Д.Г., Кудрявцева Н.Н. Микробиологические характеристики при изучении осадочных пород криолитозоны. // Известия АН СССР, серия геологическая, 1989, №6, с. 103-115.

19. Головлёв Е.Л. Метастабильность фенотипа у бактерий. // Микробиология. 1998. т. 67, №2 с. 149-155.

20. Головлёв Е.Л. Другое состояние неспорулирующих бактерий. // Микробиология, 1998, т. 67, №6, с. 725 735.

21. Горленко В.М., Компанцева Е.И., Пучкова Н.Н. Влияние температуры на распространение фототрофных бактерий в термальных источниках. // Микробиология, 1985, т. 54, вып. 5, с. 848 853.

22. Горленко В.М., Старынин Д.А., Бонч-Осмоловская Е.А., Качалкин В.И. Продукционные процессы в микробных сообществах горячего источника Термофильного. // Микробиология. 1987, т. 56, вып. 5, с. 872 878.

23. Горленко В.М., Бонч-Осмоловская Е.А., Компанцева Е.И., Старынин Д.А. Дифференциация сообществ микроорганизмов в связи с изменением физикохимических условий в источнике Термофильном. // Микробиология. 1987, т. 56, вып. 2, с. 314-322.

24. Громов Б.В. Ультраструктура сине-зелёных водорослей. Ленинград. Изд-во Ленинградского Ун-та, 1976, с. 96.

25. Громов Б.В. Строение бактерий. Ленинград. Изд-во Ленинградского Ун-та. 1985, с.186.

26. Демкина Е.В., Соина B.C., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм Arthrobacter globiformis в автолизирующихся суспензиях. // Микробиология, 2000, т. 69, №3, с.383-388.

27. Дмитриев В.В., Гиличинский Д.А., Файзутдинова Р. Н., Шершунов И.Н., Голубев В.И., Дуда В.И. Обнаружение жизнеспособных дрожжей в грунтах вечной мерзлоты Сибири возрастом около 3 млн. лет.// Микробиология, 1997, т. 66, № 5, с. 600 655.

28. Дмитриев В.В., Сузина Н.Е., Баринова Е.С., Дуда В.И., Воронин A.M. Электронно-микроскопическое изучение ультраструктуры микробных клеток in situ в экстремальных биотопах. // Микробиология, 2004, т. 73, №6, с. 832 — 840.

29. Дорошенко Е.В., Лойко Н.Г., Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Горнова И.Б., Климанова Е.В., Эль-Регистан Г.И. Характеристика диссоциатов Bacillus cereus. // Микробиология, 2001, т. 70, № 6, с. 811 819.

30. Дуда В.И., Пронин С.В., Эль-Регистан Г.И., Капрельянц А.С., Митюшина Л.Л. Образование покоящихся рефрактильных клеток у Bacillus cereus под влиянием ауторегуляторного фактора.//Микробиология. 1982. Т.51, вып.1.с.77-80.

31. Дуда В.И. Особенности цитологии спорообразующих бактерий. // Успехи микробиологии, 1982, т.17, с. 87- 117.

32. Дуда В.И. Архебактерии новое царство живых организмов. // Природа, 1984, №2, с. 13-25.

33. Заварзин Г.А. Бактерии и состав атмосферы. / Отв. ред. А.А. Имшенецкий. М.: Наука, 1984. с. 189.

34. Заварзин Г.А. Становление биосферы.// Вестник РАН, 2001, т. 71, №11, с. 988 -1001.

35. Заварзин Г.А. Развитие микробных сообществ в истории Земли. Труды ицртитута микробиологии им. С.Н. Виноградского. Выпуск XII. Юбилейный сборник к 70-летию института. Изд-во Наука. 2004, с. 149-159.

36. Звягинцев Д.Г. Изучение микрофлоры ризосферы с помощью флуоресцентной микроскопии в отражённом свете. 1962, т. 31, вып. 1,с. 111 — 115.

37. Звягинцев Д.Г. Применение тушителей при изучении почвенных микроорганизмов при помощи флуоресцентной микроскопии. // Микробиология, 1963, т. 32, вып. 4, с. 732 — 736.

38. Звягинцев Д.Г. Взаимодействие микроорганизмов с твёрдыми поверхностями. М. Изд-во Московского Университета, 1973, с. 176.

39. Звягинцев Д.Г., Дмитриев Е.А., Кожевин П.А. О люминесцентно-микроскопическом изучении почвенных микроорганизмов. // Микробиология. 1978. Т.47, №6. С. 1091-1096.

40. Звягинцев Д. Г. Основные принципы функционирования комплексов почвенных микроорганизмов. // Проблемы почвоведения. 1978. с. 97-102.

41. Звягинцев Д. Г. Почва и микроорганизмы. М.: МГУ, 1987, с. 256.

42. Звягинцев Д.Г. Методы почвенной микробиологии и биохимии. Изд-е 2-е. М.: МГУ, 1991, с. 304.

43. Зубжицкий Ю.Н. Метод люминесцентной микроскопии. Л., 1964.

44. Иванов В.Б. Доказательство образования ковалентных связей при окраске гистологических препаратов проционовыми красителями Цитология, 1976, т. 18, № 2,227-229.

45. Барский В.Е., Иванов В.Б., Скляр Ю.Е; Михайлов Г.И. Дихлортриазиниламинофлуоресцеин новый флуорохром для цито- и гистохимического выявления белка — Изв. АН СССР. Сер. биол. 1968, № 5, 744— 747.

46. Иванов И.И., Шафоростова Л.Д., Работнова И.Л., Сотников Г.Г. Роль катаболических и анаболическсих процессов в связи с неравномерным ростом

47. Bacillus megaterium в экспоненциальной фазе роста. // Микробиология, 1972, т. 41. №1, с.64-67.

48. Иванов М.В., Поликарпов Г.Г., Леин А.Ю., Гальченко В.Ф., Егоров В.Н., Гулин С.Б., Гулин М.Б., Русанов И.И., Миллер Ю.М. и Купцов В.И. Биогеохимия цикла углерода в районе черноморских метановых сипов. Доклады АН СССР, 1991, т. 320, с. 1235-1240.

49. Иванов М.В., Леин А.Ю, Гальченко В.Ф., Егоров В.Н., Гулин С.Б., Гулин М.Б., Русанов И.И., Миллер Ю.М. и Купцов В.И. Биогенохимия цикла углерода в районе метановых газовыделений Чёрного моря. Доклады АН СССР, 1991, т. 320, с. 1240 1245.

50. Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Шмидт М.А., Дорошенко Е.В., Мулюкин А.Л., Эль-Регистан Г.И. Роль бактериальных ауторегуляторов роста группы алкилоксибензолов в ответ стафилококков на стрессовые воздействия. // Микробиология, 2002, т. 71, № 1, с.23 — 29.

51. Кальдерные микроорганизмы. Под ред. Г.А. Заварзина. «Наука». М. 1989., с. 114.

52. Кузнецов С.И. Микроорганизмы горячих ключей Камчатки. // Труды Института микробиологии АН СССР, 1955, вып. 4, с. 130 154.

53. Леин А.Ю. Русанов И.И., Саввичев А.С., Пименов Н.В., Миллер Ю.М., Павлова Г.А. и Иванов М.В. (1996) Биогеохимические процессы циклов серы и углерода в Карском море. Геохимия, 11:1027-1044.

54. Лойко Н.Г., Соина B.C., Сорокин Д.Ю., Митюшина Л.Л., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм у грамотрицательных хемолитоавтотрофных бактерий Thioalklivibrio versutus и Thioalkalimicrobium aerophilum. // Микробиология, 2003, т. 72, №3, с.328-337.

55. Луста К.А., Фихте Б.А. Методы определения жизнеспособности микроорганизмов. АН СССР НУ БИ ИБФМ. Пущино. 1990. с. 187.

56. Люминесцентный анализ. Под ред. М.А. Константиновой-Шлезингер. Изд-во Физико-математической литературы. М. 1961, с.399.

57. Мазор Л. Методы органического анализа. Изд-во М.: Мир, 1986, с. 584.

58. Маниатис Т., Фрич Э.Ю, Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. Методы генной инженерии. М.: Мир.-1984. с. 479.

59. Мейсель М.Н., Корчагин В.Б. Люминесцентно-микроскопическое выявление нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов. // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1952, №33, с. 3.

60. Мейсель М.Н. Люминесцентная микроскопия. // Вестник Акдемии наук СССР, 1953, №10, с. 1-10.

61. Мейсель М.Н., Миролюбова Л.В. Сравнительное люминесцентное исследование строения бактерий. // Известия Академии наук СССР, серия биологическая, 1959, №6, с. 865-878.

62. Мейсель М.Н., Медведева Г.А., Алексеева В.М. О выявлении живых, повреждённых и мёртвых микроорганизмов. // Микробиология. 1961, т. 30, вып. 5, с. 855-862.

63. Мейсель М.Н. Флуоресцентная микроскопия и цитохимия в общей микробиологии. // Успехи микробиологии. 1971, с. 3 32.

64. Миронов А.А., Комиссарчик Я.Ю., Миронов В.А. Методы электронной микроскопии в биологии и медицине. Изд-во "Наука". С.-П.,1994, с. 399.

65. Мишустин Е.Н., Емцев В.Т. Почвенные азотфиксирующие бактерии рода Clostridium. М.: Наука, 1974, с. 252.

66. Мукамолова Г.В., Кормер С.С., Янопольская Н.Д. Капредьянц А.С. Свойства покоящихся клеток культуры Micrococcus luteus, пребывающих длительное время в стационарной фазе. Микробиология, 1996, т. 64, с. 341-346.

67. Мукамолова Г.В., Янг М., Келл Д., Капрельянц А.С. Бактериальные феромоны и клеточное деление. Успехи биологической химии. 1999, т. 39, с. 225-254.

68. Мулюкин А.Л., Луста К.А., Грязнова М.Н., Козлова А.Н., Дужа М.В., Дуда В.И., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм Bacillus cereus и Micrococcus luteus. //Микробиология, 1996 а, т. 65, №6, с. 782-789.

69. Мулюкин А.Л., Козлова А.Н., Капрельянц А.С., Эль-Регистан Г.И. Обнаружение и изучение динамики накопления ауторегуляторного фактора Д1 в культуральной жидкости клеток Micrococcus luteus. II Микробиология, 1996 б, т. 65, с. 20-25.

70. Никитин Д.И. Применение электронной микроскопии для изучения почвенных суспензий и культур микроорганизмов. // Почвоведение, 1964, №6, с. 86 91.

71. Никитин Д.И., Васильева Л.В., Лохмачёва Р.А. Новые редкие формы микроорганизмов. Изд-во «Наука», 1966, с. 120.

72. Новогрудский Д.М. Природные и культуральные формы почвенных микроорганизмов. // Изв. АН Каз. ССР, серия почвоведение, 1949, вып. 5, с. 30 -41.

73. Перьфильев Б.В., Габе Д.Р. Капиллярные методы изучения микроорганизмов. М.-Л., Изд-во АЛ СССР, 1961, с.534.

74. Пешков М.А. Цитология бактерий. Изд-во АН СССР, М. 1955. Пешков М.А. Сравнительная цитология сине-зелёных водорослей, бактерий и актиномицетов. «Наука», М., 1966. Авакян, Кац, 1972.

75. Питрюк А.В., Пушева М.А., Сорокин В.В. элементный состав клеток у экстремально алкалофильных анаэробных бактерий. // Микробиология, 2002, т. 71, №1, с. 30-36.

76. Липенков В.Я. Результаты исследований палеоклимата и подденикового озера Восток. Проблемы Арктики и Антарктики. Сборник статей. Юбилейный выпуск 72 (к 80-летию ААНИИ). С-П. Гидрометеоиздат. 2000, с. 267.

77. Пронин С.В., Жуков В.Г. Альтернативный спорообразованию путь сохранения жизнеспособности популяции клеток Bacillus cereus в экстремальных условиях. // Доклады АН СССР, 1989, т. 309, №1, с. 223 226.

78. Романенко В.И., С.И. Экология микроорганизмов пресных водоёмов. Лабораторное руководство. Л.: Наука, 1974. с. 194.

79. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. Ред. Егорова Н.С. Изд-во МГУ, 1983, с. 221.

80. Свободные радикалы в биологии. Ред. Прайор У. Изд-во "Мир", 1979, т.1, с. 318.

81. Стейниер Р., Эдельберг Э., Ингрэм Дж. Мир микробов. Изд-во "Мир", т.1, 2, 3. М., 1979, с. 320.

82. Сузина Н. Е. Сравнительное изучение тонкого строения мембран и поверхностных структур метанотрофных бактерий. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологический наук,- Пущино,1984, с. 217.

83. Сузина Н.Е., Мулюкин А.Л., Козлова А.Н., Шорохова А.П., Дмитриев В.В., Баринова Е.С., Мохова О.Н., Эль-Регистан Г.И., Дуда В.И. Тонкое строение покоящихся клеток некоторых неспорообразующих бактерий. // Микробиология, 2004, том 73, №4, с. 516-529.

84. Сэги Й. Методы почвенной микробиологии. Изд-во "Колос". М., 1983, с. 296.

85. Тихоненко А.С. Ультраструктура вирусов бактерий. М.: Наука, 1968. С.90.

86. Уикли Б. Электронная микроскопия для начинающих. М. Мир. - 1975, с. 324.

87. Феофилова Е.П. Торможение жизненной активности как универсальный биохимический механизм адаптации микроорганизмов к стрессовым воздействиям. // Прикладная биохимия и микробиология, 2003, т. 99, №1, с. 524.

88. Фихте Б.А., Заичкин Э.И., Ратнер Е.Н. Новые методы физического препарирования биологических объектов для электронно-микроскопических исследований. Пущино, 1973. 150 с.

89. Хименков А.Н., Брушков А.В. Введение в структурную криологию. М., Наука, 2006, с. 279.

90. Холодный Н.Г. Методы непосредственного наблюдения почвенной микрофлоры. // Микробиология, 1935, том 4, вып. 2. С. 153 — 164.

91. Экология микроорганизмов под ред. А.И. Нетрусова М. Изд-во Academa. 2004. С.267.

92. Элиот В., Элиот Д. Биохимия и молекулярная биология. / Под ред. Арчакова А.И. и др. М.: МАИК "Наука / Интерпериодика", 2002, с. 446.

93. Amelio E.D., Cohen Y., and Des Marais DJ. Association of new type of gliding, filamentous, purple phototrophic bacterium inside bundles of Microcoleus chthonoplastes in hypersaline cyanobacterial mats. // Arch. Microbiol. 1987, v. 147, pp. 213-220.

94. Amman, R., Ludwig, V. and Schleifer, K.-H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiology Reviews, 1995, v. 59, pp. 143-196.

95. Ascaso C., Wierzchos J. New approaches to the study of Antarctic litobiontic microorganisms and their ionorganic traces, and their application in the detection of life in Martian rocks. // Int Microbiol?, 2002, V. 5, pp. 215 222.

96. Bae H.C., Cota-Robles E.H. and Casida L.E. Jr. Microflora of soil as viewed by transmission electron microscopy. // Applied Microbiology, March, 1972, pp. 637 — 648.

97. Bae H.C. and Casida L.E., Jr. Responses of indigenous microorganisms to soil incubation as viewed by transmission electron microscopy of cell thin sections. // Journal of Bacteriology, 1973, march, pp. 1462 1473.

98. Bakken, L.R. Separation and purification of bacteria from soil. // Appl. Environ. Microbiol. 1985. V. 49. P. 1482-1487.

99. Biology of microorganisms, by edition Brock Southern Illinois University, Carbondale, 1999, http://cwx.prenhall.com/brock/chapter23/deluxe.html

100. Bisset K.A. and Whiteby H. Demonstration of nuclear and cellular division in Bacillus cereus by epifluorescent microscopy. // Journal of General Microbiology, 1978, 107, pp. 231-234.

101. Brehm-Stecher B.F. and Johnson E.A. Single-cell microbiology: tools, technologies, and applications. // Microbiology and molecular biology reviews. 2004, v. 68, №3, pp. 538-559.

102. Castenholz R.W. and Utkilen H.C. Physiology of sulfide tolerance in a thermophilic Oscillatoria. // Arch. Microbiol. 1984 a. v. 138, pp. 299 305.

103. Castenholz R.W. and Utkilen H.C. Loss of sulfide adaptation in a thermophilic Oscillatoria. II Arch. Microbiol. 1984 6. v. 138, pp. 306 309.

104. Castenholz R.W., Bauld J., and Jorgenson B.B. Anoxygenic microbial mats of hot springs: thermophilic Chlorobium sp. // FEMS Microbiology Ecology, 1990, v. 74, pp. 325-336.

105. Cho J.-C., and Giovannoni S.J. Cultivation and growth characteristics of a diverse group of oligotrophic marine Gammaproteobacteria. II Applied and Environmental Microbiology. 2004. Vol. 70, №1, pp. 432-440.

106. Coates J.D., Ellis D.J., Gaw C.V. and Lovley D.R. Geothrix fermentans gen. nov., sp. nov., a novel Fe (III)-reducing bacterium from a hydrocarbon-contaminated aquifer. // International Journal of Systematic Bacteriology, 1998, v. 49, pp. 1615 — 1622.

107. Coleman A.W. Cell staining with DAPI alive. // Trends in Genetics, 1989, vol. 5, №9, pp. 292-29?.

108. Connon S.A., and Giovannoni S.J. High-throughput methods for culturing microorganisms in very-low-nutrient media yield diverse new marine isolates. // Applied and Environmental Microbiology. 2002. Vol. 68, №8, pp. 3878-3885.

109. Cooper L.W., Whitledge Т.Е., Grebmeier J.M., Weingartner T. The nutrient, salinity, and stable oxygen isotope composition of Bering and Chukchi seas waters in and near the Bering Strait // J. Geophys. Res. 1997. V. 102. P. 12.

110. Elsas J.D.v. and Waalwijk C. Methods for the detection of specific bacteria and their genes in soil. // Agriculture Ecosystems and Environment. 1991. vol. 34, № 1 — 4, pp. 97-105.

111. Figueras J.B., Garcia-Gil L.J., Abella C.A. Phylogeny of the genus Chlorobium based on 16S rDNA sequence. // FEMS Microbiology Letters. 1997, v. 152, pp. 31 — 36.

112. Hohmann-Marriott M.F., Blankenship R.E., & Roberson R.W. The ultrastructure of Chlorobium tepidum chlorosomes revealed by electron microscopy. Photosynthesis research. 2005, v. 86, pp. 145 154.

113. Holt S.C. and Canale-Parola E. Fine structure of Spirochaeta stenostrepta, a free-living, anaerobic spirochete. // Journal of Bacteriology, 1968, Sept., pp. 822 835.131. http://www.iki.rssi.rU/jplmirror/mars/mgs/sci/fifthconf99/6104.pdf

114. Hugenholtz P., Goebel B.M., and Pace N.R. Impact of culture-independent studies on the emerging phylogenetic view of bacterial diversity. 1998. J. Bacteriol. Vol. 180, pp. 4765-4774.

115. Im W.T., Yokota A., Kim M.K., and Lee S.T. Kaistia adipata gen. nov., sp. nov., a novel a-proteobacterium. // J. Gen. Appl. Microbiol., 2004, v. 50, pp. 249 254.

116. Jannasch H.W., and Jones G.E. Bacterial populations in seawater as determined by different methods of enumeration. // Limnol. Oceanogr, 1959, №4, pp. 128-139.

117. Joseph S.J., Hugenholtz P., Sangwan P., Osborne C.A. and Janssen P.H. Laboratory cultivation of widespread and previously uncultured soil bacteria. // Applied and Environmental Microbiology, December, 2003, vol. 69, № 12, pp. 7210 7215.

118. Karl D.M., Bird D.F., Bjorkman K., Houlihan Т., Shackelford R., Tupas L. Microorganisms in the accreted ice of Lake Vostok, Antarctica. Science. 1999, December, vol. 286, pp. 2144-2147.

119. Kennedy M.J., Reader S.L. and Swierczynsky L.M. Preservation records of microorganisms: evidence of the tenacity of life. // Microbology, 1994, v. 140, pp. 2513 — 2529.

120. Kepner R.L., JR. and Pratt J.R. Use of fluorochromes for direct enumeration of total bacteria in environmental samples: past and present. // Microbiological Reviews, 1994, December, v. 58, № 4, pp.603 615.

121. Kogure K., Simidu U., and Taga N. A tentative direct microscopic method for counting living marine bacteria. // Can. J. Microbiol., 1979, № 25, pp. 415-420.

122. Konhauser K.O., Jones В., Reysenbach A.-L., and Renaut R. W. // Can. J. Earth Sci., 2003. v. 40, pp. 1713 1724.

123. Kristjansson J.K., Ingason A., and Alfredsson G.A. Isolation of thermophilic obligately autotrophic hydrogen-oxidizing bacteria, similar to Hydrogenobacter thermophilus, from Icelandic hot springs. // Arch. Microbiol., 1985, v. 140, pp. 321 -325.

124. Lacap D.C., Smith G.J., Warren-Rhodes K., and Pointing S.B. Community structure of free-floating cyanobacterial mats from the Wonder Lake geothermal springs in the Philippines. // Can. J. Microbiol. 2005, v. 51, pp. 583 589.

125. Lappin-Scott H.M. and Costerton J.W. Starvation and penetration of bacteria in soil and rocks. // Experientia, 1990, v. 46, №8, pp. 807-812.

126. Laue M., Niederwohrmeier В., Bannert N., Rapid diagnostic thin section electron microscopy of bacterial endospores. // Journal of Microbiological Methods, 2007, v. 70, pp. 45-54.

127. Lundgren B. Fluerescein diacetate as a stain of metabolically active bacteria in soil. OIKOS, 1981, vol. 36, № 1, pp. 17-22.

128. Masurat P., Fru E.C. and Pedersen K. Identification of Meiothermus as the dominant genus in a storage system for spent nuclear fuel. // Journal of Applied Microbiology, 2005, v. 98, pp. 727 740.

129. Moreira D. and Amils R. Phylogeny of Thiobacillus cuprinus and other mixotrophic Thiobacilli: proposal for Thiomonas gen. nov. // International Journal of Systematic Bacteriology, 1997, Apr., v. 47, №2, pp. 522 528.

130. Nakagawa S., Shtaih Z., Banta A., Beveridge T.J., Sako Y., Reysenbach A.-L. Sulfurihydrogenibium yellowstonense sp. nov., an extremely thermophilic, facultatively heterotrophic, sulfur-oxidizing bacterium from Yellowstone National

131. Park, and emended description of the genus Sulfurihydrogenibium, Sulfurihydrogenibium subterraneum and Sulfurihydrogenibium azorense. II International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2005, Nov., v. 55, pp.2263 2268.

132. Panikov, N.S. Contribution of nanosized bacteria to the total biomass and activity of a soil microbial community.// Adv. Appl. Microbiol. 2005. V. 57, P. 245-296.

133. Paster В J., Dewhirst F.E., Weisburg W.G., Tordoff L.A., Fraser G.J., Hespell R.B., Stanton T.B., Zablen L., Mandelco L., and Woese C.R. Phylogenetic analysis of the Spirohetes. // Journal of Bacteriology, 1991, Oct., pp. 6101 6109.

134. Patel B.K.C., Morgan H.W. and Daniel R.M. Thermophilic anaerobic spirochetes in New Zelland hot springs. // FEMS Microbology Letters, 1985, v. 26, pp. 101 106.

135. Phoenix V.R., Konhauser K.O., and Ferris F.G. Experimental study of iron and silica immobilization by bacteria in mixed Fe-Si systems: implications for microbial silification in hot springs. // Can. J. earth Sci., 2003. v. 40, pp. 1669 1678.

136. Pierson B.K., Castenholz R.W. A phototrophic gliding filamentous bacterium of hot springs, Chloroflexus aurantiacus, gen. nov. and sp. nov. // Arch Microbiol, 1974, 100,5-24.

137. Pierson B.K., Giovannoni S.J., and Castenholz R.W. Physiological ecology of gliding bacterium containing bacteriochlorophyll a. // Appl. Environ. Microbiol., 1984, v. 47, pp. 576 584.

138. Pierson B.K., Giovannoni S.J., Stahl D.A., and Castenholz R.W. Heliothrix oregonensis, gen. nov., sp. nov., a phototrophic filamentous gliding bacterium containing bacteriochlorophyll a. // Arch. Microbiol., 1985, v. 142, pp. 164 167.

139. Pohlschroeder M., Leschine S. В., Canale-Parola E. Spirochaeta caldaria sp. nov., a thermophilic bacterium that enhances cellulose degradation by Clostridium thermocellum. II Arch. Microbiol., 1994, v. 161, pp. 17-24.

140. Pugsley A.P., Evison L.M. A fluorescent antibody technique for the enumeration in faecal streptococci in water//J.Appl. Bacteriol. 1 975- Vol.3 8.P. 63-65.

141. Rappe M.S., Giovannoni S.J. The uncultured microbial majority // Annu. Rev. Microbiol. 2003. V. 57. P. 369 394.

142. Rasmussen B. Filamentous microfossils in a 3,235 million-year-old volcanogenic massive sulphide deposit.// Nature. 2000, vol. 405, no.8, pp. 676 679.

143. Reysenbach A.-L., Wickham G.S., and Pace N.R. Phylogenetic analysis of the hyperthermophilic pink filament community in Octopus Spring, Yellowstone National Park. // Appl. Environ. Microbiol., 1994, June, v. 60, №6, pp. 2113 2119.

144. Reynolds E.S. The use of lead citretat high pH as an electronopaque strain in electron microscopy. J. Cell Biol., 1963, v. 17, pp. 208 - 212.

145. Rivkina, E., S. Wagener, J. McGrath, D. Gilichinsky and J. Tiedje. 1998. Biogeochemical activity of anaerobic microorganisms from buried permafrost sediments. Geomicrobiology. 15:187-193.

146. Rodrigues G.G., Phipps D., Ishiguro K. And Ridgway H. F. Use of a fluorescent redox probe for direct visualization of actively respiring bacteria. // Applied and Environmental Microbiology, 1991, vol. 58, № 6, pp. 1801 1808.

147. Rondon M.R., Goodman R.M. and J. Handelsman. The Earth's bounty: assessing and accessing soil microbial diversity. TIBTECH OCTOBER. 1999, vol. 17, pp. 403 -409.

148. Rozanov A.Y., Zhegallo E.A., Hoover R.B. Microbiota of the botogol graphites. // SPIE. vol. 3755, no. pp. 38 42.

149. Schelble R.T., Westall F., Allen C.C., Nealson K.H. Ga iron-mineralized microbiota in the Gunflint iron formation. COSPAR, 10-18 October, 2002, Ontario, Canada, p. 111.

150. Schmidt E.L. Quantitative autecological study of microorganisms insoil by immunofluorescence. Soil Sci. 1974. Vol. 118. P.141 149.

151. Schmidt E.L, Bankole R.O. Specificity of immunofluorescent staining for study of Aspergillus flavus in soil// Appl. Microbiol. 1965. Vol. 13. P. 673 679.

152. Schmidt E.L, Bankole R.O., Bohlool B.B. Fluorescent antibody approach to the study of rhizobia in soil//Bacteriol. 1968. Vol. 95. P. 1987 1992.

153. Stackebrandt E. In Microbial Diversity in Time and Space. Plenum Press, 1996, pp. 19-24.

154. Stankiewicr B.A., Briggs D.E.G., Evershed R.P., Flannery M.B., Wuttke M. Preservation of chitin in 25-million-year-old fossils. // Science. 1997, vol. 276, no. 6, pp. 1541 1547.

155. Staley J.T., and Konopka A. Measurements of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestial habitats. // Annu. Rev. Microbiol. 1985. 39 : 321-346.

156. Stanier R.Y. and van Niel C.B. The concept of a bacterium. // Archiv fur Mikrobiologie, 1962, v. 42, pp. 17 35.

157. Steeman-Nielsen E. The use radioactive carbon (C14) for measuring organic production in the Sea. // J. Conseil l'explorat. mer, 1952, v. 18, №2, 127-140.

158. Takai K., Kobayashi H., Nealson K.H. and Horikoshi K. Sulfurihydrogenibium subterraneum gen. nov., sp. nov., from a subsurface hot aquifer. // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2003, v. 53, pp. 823 — 827.

159. Takahashi, I., Yamanaka, S., Nishiyama, Т., Hiraishi, A., Isolation and phylogenetic analysis of aerobic copiotrophyc ultramicrobacteria from urban soil. // J. Gen. Appl. Microbiol. 1998. V. 44. P. 75-84.

160. Thompson T.L., Mefferd R.B.,JR, and Wyss O. The protection of bacteria by pyruvate effects. // J. Bacteriol. vol. 62, no.l, pp. 39.

161. Tsapin F.I. The Fifth International Conference on Mars, Pasadena, California, July, 1999, pp. 19-24.

162. Varga A.R. and Staehelin L.A. Spatial differentiation in photosynthetic and non-photosynthetic membranes of Rhodopseudomonas palustris. // Journal of Bacteriology, 1983, June, v. 154, № 3, pp. 1414 1430.

163. Vorobyova E., Soina V., Gorlenko M. et al. The deep cold biosphere: facts and hypothesis // FEMS Microbiol. Rev. 1997. V. 20. P. 277-290.

164. Vorobyova E., Philimonova A., Osipov G., Bolshakova A., Yaminsky I. Microbial life in Antarctic permafrost and ice. COSPAR, 10—18 October, 2002, Ontario, Canada, p. 64.

165. Wahlund T.M., Woese C.R., Castenholz R.W., and Madigan M.T. A thermophilic green sulfur bacterium from New Zealand hot springs, Chlorobium tepidum sp. nov. // Arch. Microbiol. 1991, v. 156, pp. 81-90.

166. Ward D.M., Cohan F.M. Microbial diversity in hot spring cyanobacterial mats: pattern and prediction. Geothermal Biology and Geochemistry in Yellowstone National Park. ?. pp. 185 202.

167. Watson S.W., Graham L.B., Remsen C.C. and Valois F.W. A lobular, ammonia-oxidizing bacterium, Nitrosolobus multiformis nov. gen. nov. sp. // Arch. Microbiology, 1971, vol. 76, pp. 183 203.

168. Wierzchos J., De Los Rios A., Sancho L.G., Ascaso C. Viability of endolithic microorganisms in rocks from the McMurdo Dry Valleys of Antarctica established by confocal and fluorescence microscopy. // Journal of Microscopy, 2004, vol. 216, pp. 57-61.

169. Willerslev E., Hansen A.J. and Poinar H.N. Isolation of nucleic acids and cultures from fossil ice and permafrost. // TRENDS in Ecology and Evolution, 2004, March, vol. 19, No.3, pp. 141 147.

170. Zechman J.M. Casida L.E.Jr. Death of Pseudomonas aerugenosa in soil. // Can. J. microbial. 1982. V. 28. p. 788 794.

171. Zinder S.H., Salyers A.A. Microbial ecology — new direction, new impotance. // Bergey's manual of systematic bacteriology. 2nd ed. / Eds. Boone D.R., Castenholz R.W., Garrity G.M. Baltimore: Williams & Wilkins, 2001. V. 1. P. 101 109.

172. Список условных сокращений

173. УФ ультрафиолетовые лучи ДНК - дизоксирибонуклеиновая кислота РНК - рибонуклеиновая кислота DAPI- 4', 6-диамидино-2-фенил индол FITC - флуоресцеин изотиоционат

174. DATF 5-(4, 6- дихлортриазин-2-ил), амино-флуоресцеин1. FDA флуоресцеин диацетат

175. SFDA 5-(и 6-) сульфофлуоресцеиндиацетат

176. СТС 5-циано-2,3-дитолил тетразолиум хлорид

177. КОЕ колониеобразующие единицы1. ОП оптическая плотность

178. ФВК фосфорновольфрамовая кислота1. УА уранил ацетат

179. ПЦР полимеразная цепная реакция1. НМ наружная мембрана1. К кортекс1. ВМ внутренняя мембрана1. Пс покровы споры1. Ц цитоплазма1. Мв мембранные везикулы1. КС клеточная стенка

180. ЦПМ цитоплазматическая мембрана

181. Пфс перегородка формирующейся споры

182. ВМпс внутренняя мембрана проспоры1. Мк материнская клетка1. Н нуклеоид1. Лк- лизированные клетки1. ЦПК цистоподобные клетки1. Кр кристалл1. Мкс микрокапсула1. Мл мембранные лепестки1. Мм микроорганизм1. М минеральная частица

183. НС наружный слой покровов клеток1. ВС внутренние слои

184. PF выпуклая поверхность скола

185. EF вогнутая поверхность скола1. Мт митохондрии1. Ипк извилистый профиль1. Мез мезосомы1. Кт клетка тень

186. Эв экзоцеллюлярное вещество1. Мк — микроколония1. Кп капсула

187. Пм полисахаридный матрикс А - агар

188. Стк стационарная клетка Пс - проспора Вк - вегетативная клетка Сл - слизь1. Мкт микротрубочки

189. РВнМ разрывы во внешней мембране1. Кк клеточные конгломераты1. ММ миелиновые мембраны1. Пф полифосфаты1. П периплазма

190. ФМ фотосинтетические мембраны S - S-слои

191. ПОМ поли-(3-оксимасляная кислота1. Т тилакоиды1. Кв клеточные выросты1. Бк бактериальная клетка

192. Оцб оболочка циано-бактерии

193. Ппр периплазматические простеки1. В включения1. Мм мостики Байера1. Бц баеоциты

194. Моб — оболочка материнской клетки1. Фбс фикобилисомы

195. Эпч экзополисахаридный чехол1. Хлс хлоросомы1. Бф бактерифаг1. Сс слущивающиеся слои

196. Пт формирующаяся перетяжка1. Ж жгутик1. Мкт микротрубочки

197. Лф фотосинтетический аппарат ламелярного типа Вф - фотосинтетический аппарат везикулярного типа ЗН - зона нуклеоида

Информация о работе

Баринова, Екатерина Сергеевна
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.07

Диссертация

Исследование структурно-функционального состояния бактерий в микробных сообществах методами электронной микроскопии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы