Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование состояния и фазовых переходов белковых молекул и липидных мембран по измерениям объема и сжимаемости растворов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование состояния и фазовых переходов белковых молекул и липидных мембран по измерениям объема и сжимаемости растворов"

РГБ ОД 1 О АПР Ш5

На правах рукописи

Уаракоз Дмитрий Петрович

ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТОЯНИЯ И ФАЗОВЫХ ПЕРЕХОДОВ БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ И ЛИПИДНЫХ МЕМБРАН ПО ИЗМЕРЕНИЯМ ОБЪЕМА И СЖИМАЕМОСТИ РАСТВОРОВ

03. 00. 02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

Пущино - 1995

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Официальные оппоненты:

Доктор физико-математических наук Доктор биологических наук Доктор химических наук

А.В. фкнкельштейн

А. А. Заиятнин

Г. Г. Маленков

Ведущая организация:

Физический факультет Московского государственного университета

Защита состоится 20 апреля 1995 года в 1300 на заседании диссертационного совета Д200.22.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142292 Пущино Иосковской обл. , ИТЭЕ РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН

Автореферат разослан

марта 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

'ОССи

П.А. Нелипович

ВВЕДЕНИЕ

Основной преднет диссертации - исследование сжимаемости белков и модельных систем (низкомолекулярных соединений и липидных кекбран) в водной среде. Объемы растворов рассматриваются в работе лишь в той мере, в какой это необходимо для исследования сжимаемости.

Сжимаемость, производная объема по давлению - один из важнейших физических параметров, который в конденсированных средах характеризует жесткость потенциалов иежколекуляркого взаимодействия и реакцию молекулярной структуры на давление. Эти два фактора обуславливают, соответственно, мгновенную (высокочастотную) и релаксационную часть сжимаемости. Величина сжимаемости определяет фазовую скорость звука в среде, а ее релаксационная часть - величину поглощения звука. Поэтому исследования сжимаемости оказались частью молекулярной акустики. Измерения скорости и поглощения ультразвука при параллельном измерении плотности среды позволяют определять сжимаемость среды и ее релаксационную часть с наиболее высокой точностью.

Чем интересны измерения сжимаемости в исследованиях белков?

В водном растворе сжимаемость сильно зависит от гидратации растворенного вещества. Почти любой моленулярный процесс в растворе сопровождается изменением гидратации, поэтому с помощью измерений сжимаемости эти процессы можно регистрировать и характеризовать.

Сжимаемость - чувствительная характеристика агрегатного состояния вещества. В контексте настоящей диссертации это - наиболее существенный аспект, потому что белковая молекула и липядная мембрана это системы с достаточно большим числом внутренних степеней свободы и их можно рассматривать как фазу малого размера и описывать их свойства в "макроскопических" терминах (Блюменфельд, 1974).

Вопрос о состоянии и общих физических свойствах молекулы белка в растворе - один из старых и важных в физике белка (Morozovr Morozova, 1990). Подобна ли молекула жидкой капле или твердой частице? В какой мере и по каким свойствам? От ответа на эти вопросы зависят представления о динанических свойствах белка, о роли упругости в ферментативном катализе (Чернавский, Хургин, Шноль, 1967). Ответ, в свою очередь, в сильной мере определяется величинами констант упругости белковой молекулы, и, в частности,

величиной ее внутренней сжимаемости.

С вопросом о состоянии нативной белковой молекулы неразрывно связан столь же старый вопрос о природе денатурированного состояния (см., например, дискуссию на совещании по проблеме белка в Киеве в 1954 г. ; Белки, их специфические свойства; ред. Гулый, Белицер; Изд-во АН УССР: Киев, 1955). В самом деле, если нативная молекула - жидкая капля, то для разулорядоченного денатурированного состояния остается только предполагать, что это развернутая полипептидная цепь, что и было доминирующей точкой зрения до 80-х годов. Если же нативная молекула - твердая частица, то какая структура могла бы отвечать ее жидко-подобному состоянию? Общие ответы на эти вопросы были получены только сравнительно недавно (Ptitsyn, 19871, и определенную роль в этом сыграли измерения сжимаемости белковых растворов.

Чей интересны измерения сжимаемости в исследованиях липидных мембран?

Отметин только один аспект. Известно, что фазовый переход типа плавления в липидной фазе биологической мембраны играет существенную роль в физиологии клетки (Конев, Нажуль, 1977; Шноль, 1979). Кинетика этого фазового перехода исследована очень слабо. Неизвестны важнейшие факторы, определяющие кинетику зарождения и развития зародыша новой фазы. Характерные времена элементарных стадий этого процесса соответствуют области ультразвуковых частот и, следовательно, информация о них содержится в поведении релаксационной части акустически измеряемой сжимаемости.

О задачах диссертации:

Несмотря на важность сжимаемости как характеристики состояния веществ в растворе, ее измерения до недавнего времени занимали скромное место в исследованиях биомолекулярных систем, не в пример измерениям теплоемкости, которые давно стали классическим методом в молекулярной биофизике. Такое состояние дел связано с двумя взаимосвязанными методическими проблемами:

1. Проблема техники измерения. Сжимаемость растворов трудно измерять с точностью, необходимой для решения биофизических задач. Проблема техники измерения была решена относительно недавно, с развитием метода акустического резонатора в работах Эггерса и Функа в Геттингене (Eggers, Funck, 1973) и Сарвазяна в Пущине (Сарвазян, Харакоз, 1979, 1981; Sarvazyan, 1982).

2. Проблема молекулярной интерпретации. Из-за отсутствия

строгой теории водных растворов важнейшим условием, обеспечивающим информативность любого физико-химического параметра, является развитая эмпирическая база метола. По сжимаемости растворов биологических веществ такой базы не было. И это несмотря на то, что первые исследования и первые попытки количественной интерпретации были сделаны около полувека назад, в пионерских работах Пасынского (1938, 1946, 1948) и Якобсона (1950).

Проблемой молекулярной интерпретации посвящена настоящая диссертационная работа. Для этого в работе решались следующие з адач и:

1. Получение недостающих экспериментальных данных по сжимаемости и объему растворов белков и модельных соединений.

2. Систематизация собственных и литературных данных с целью поиска эмпирических закономерностей, связывающих измеряемые величины со структурой растворенного вещества, критический анализ старых и поиск новых подходов к количественной интерпретации.

3. Исследование сжимаемости нативных белков в растворе и анализ ее связи с равновесной динамикой белка.

4. Исследование сжимаемости и объема денатурированных форм белка и поиск путей их структурной интерпретации.

5. Исследование сжимаемости липидных мембран при фазовом переходе "гель - жидкий кристалл". Первоначально это исследование планировалось как частная задача, в которой плавление мембраны рассматривалось как модель для сравнения с плавлением белковой глобулы. Однако, в процессе выполнения оно приобрело самостоятельное значение, потому что был впервые найден способ определения важнейших физических характеристик фазового перехода типа плавления в липидной мембране - межфазного натяжения и констант скорости элементарного акта развития зародыша новой фазы - из поведения температурной зависимости сжимаемости вблизи перехода.

Сжимаемость невозможно рассматривать в отрыве от объема, производной которого она является. Поэтому в диссертации заметное место отведено анализу этой термодинамической характеристики раствора и решению некоторых проблем ее молекулярной интерпретации.

Основное положение, выносимое на защиту:

Систематизированы собственные и литературные данные по парциальным объемам и сжимаемостям белков и модельных систем в водной среде и разработаны новые подходы к молекулярной интерпретации этих величин, благодаря чеку появилась возможность получать новую, прежде недоступную информацию о межмолекулярных взаимодействиях в

водных растворах, о физических свойствах белковых молекул и липид-ных мембран и о фазовых переходах в них.

о структуре диссертации:

Диссертация состоит из введения, шести глав и общего заключения, включающего в себя список основных результатов и выводов. Часть рутинного материала вынесена в Приложение. Первая глава посвящена обзору литературы и обоснованию задач. Результаты работы изложены в главах 2-6. В конце каждой главы кратко сформулированы основные ее результаты.

СОДЕРЖАНИЕ 1 ГЛАВ ДИССЕРТАЦИИ

ГЛАВА 1 посвящена обзору литературы и обоснованию задач. Обзор ограничен необходимым минимумом для формулировки основных задач диссертационной работы. В этой же главе введены основные величины и соотношения между ними (первый параграф), а также кратко изложены способы их измерения в растворе (второй параграф).

измерительная техника, которая использовалась в экспериментальной части работы: осцилляторный плотномер DM&-60 (Anton Рааг, Австия) с относительной точностью 10~4 '/.; акустический резонатор (частота 6-8 МГц) лабораторного изготовления с относительной точностью 10"V. по скорости звука и 2У, по поглощению звука. В диссертации отмечено участие автора в разработке уникальной акустической измерительной техники (на защиту не выносится).

Обзор работ по исследованию сжимаемости водных растворов низкомолекулярных соединений, белков и суспензий липидных мембран. Из обзора сделаны следующие выводы.

1. Подходы к молекулярной интерпретации парциального объема растворенного вешества, известные из литературы, непригодны для анализа молекул произвольной формы и размера. Разработка такого метода - актуальная задача, без решения которой затруднено рассмотрение парциальных объемов белков и низкомолекулярных модельных соединений с единых позиций.

2. Неудовлетворительно исследованы факторы, определяющие парциальные объемы нативных белков. Известный эмпирический метод численной оценки парциального объема белка (метод Кона и Эдсолла,

1943, уточненный впоследствии Замятниным, 1972, 1984) по своему физическому смыслу пригоден для описания развернутой, но не натив-ной формы белка.

3. Неснотря на большое число работ по сжимаемости растворов низкомолекулярных соединений, в литературе практически не было обобщений, которые описывали бы связь сжимаености со структурой молекулы и ее гидратацией. Подавляющее число изиерений проводилось при одной температуре, хотя и было известно, что особенности гидратации хорошо проявляются а характере температурной зависимости сжимаемости. Отмечено, что известные из литературы попытки количественной интерпретации сжимаемости раствора в терминах чисел гидратации основывались на некорректных предположениях.

4. Факторы, определяющие парциальную сжимаемость глобулярных белков (собственная сжимаемость глобулы, гидратационные и релаксационные вклады) исследованы недостаточно для того, чтобы можно было из измерений сжимаемости раствора получать количественную информацию о внутренней сжимаемости нативной белковой молекулы. Многочисленные попытки оценить внутреннюю сжимаемость основывались на произвольных допущениях о гидратации, которые могли приводить к большим ошибкам.

5. Среди вопросов о денатурированном состоянии, которые требовали решения, выделены два:

A. Какова величина парциальной сжимаемости полностью развернутой полипептидной цепи? Эта величина - необходимая опорная точка для оценки степени развернутости белка из величины сжимаемости раствора.

Б. Какова гидратация белка в состоянии расплавленной глобулы? Актуальность этого вопроса связана с тем, что из теории IЕ1пке1аЪе1п, Sha)chnovich/ 1989) следует существование двух видов расплавленной глобулы: "сухой", не содержащей воду внутри, и "мокрой", внутренние пустоты которой заполнены водой (терминология финкельштейна и Шахновича). На сильную гидратированность расплавленной глобулы указывают экспериментальные данные: изменения парциального объема при денатурации белков очень малы - меньше 1%, в то время как для "сухого плавления" ожидалось бы увеличение на 4-30 •/..

5. Подчеркивается, что до работ автора экспериментально наблюдаемые изменения объема и сжимаемости при денатурации белка не получили количественного объяснения.

B. Из исследований перехода "жидкий кристалл - гель" в липид-ных мембранах известно, что он, с одной стороны, сопровождается

скачком объема и энтальпии, что свойственно фазовому переходу первого рода, а с другой стороны, вблизи перехода наблюдается острый пик флуктуации объема, что свойственно переходу второго рода. Это послужило основанием для рассмотрения перехода ка "псевдо-критического" явления (Мз.Ьаки, 1983). При этом в литературе не рассматривалась возможность описания этих флуктуаций нак гетерофазных, которые могут иметь место вблизи перехода первого рода (Френкель). Не был измерен один из существенных факторов, определяющих тип перехода и его кинетику, - свободная энергия межфазной границы. Неизвестны были также константы скорости элементарных стадий развития новой фазы.

ГЛАВА 2 посвящена рассмотрению некоторых общих вопросов о связи парциального объема и сжимаемости с гидратацией низкомолекулярных соединений и разработке нового подхода к молекулярной интерпретации парциального объема.

Понятие гидратного комплекса. Гидратный комплекс - это молекула растворенного вещества вместе с некоторым объемом воды, в котором сосредоточена основная часть возмущения структуры воды под дейст-вкек молекулы-"гостя". Это не в строгом химическом смысле комплекс, потому что вода в нем не обязательно прочно связана с растворенным веществом, но ее структура и свойства заметно изменены. Делается утверждение, что, поскольку гидратационные изменения воды локальны (охватывают в основном первую и частично вторую координационную сферу вокруг "гостя"; Букин, Сарвазян, Харакоз, 1989), то естественной границей гидратного комплекса можно считать второй или третий минимум парной корреляционной функции "растворенное вещество - вода". Тогда число гидратации (число молекул измененной воды) определяется количеством "мест" в координационной сфере. Из этого вытекают важные следствия.

Первое. Можно сделать очевидную качественную оценку зависимости числа гидратации от давления и температуры: зависимость от давления должна быть, порядка величины сжимаемости жидкостей ( 31пя/ЗР и |3 < 10 4 бар , а от температуры - порядка величины коэффициента расширения ( а1пл/э7" ~ а. < 10~3 К-1). Следовательно, число гидратации не может сильно зависеть от Т и Р. На порядки более крутые температурные зависимости п , сообщавшиеся в ряде работ, это результат некорректности предположений, заложенных

в основу расчетапь из экспериментальных данных.

Второе следствие. Из локальности гидратационных изменений следует принципиальная возможность описания молярных парциальных характеристик растворенного вещества как аддитивной функции вкладов составляющих его атомных групп.

Третье следствие. Простейшие качественные формулы связи парциального объема ¡/г и парциальной сжимаемости с гидратацией, которые были выведены в рамках модели раствора как сплошной среды (БЬНо и др., 1953), могут быть переписаны так, чтобы параметрам формул можно было придать несколько более строгий молекулярный смысл:

и

-«л. (2)

где \/ и К - мольный объем и мольная сжимаемость гидратного

1) Т,Т)

комплекса: И и /С - парциальный мольный объем и сжимаемость чистой воды; - число гидратации. Если размер гидратного комплекса выбран в соответствии с условием, что за его пределами вода неотличима от чистой воды (см. выше), то величине I/ можно придать смысл "парциального" объема гидратного комплекса, который рассматривается как "молекула" в идеальной снеси с чистой водой. При Таком определении величина К совпадает с парциальным объемом гипотетической жидкости, состоящей из гидратных комплексов состава Н-(НО) , в которой отсутствует непосредственное взаимодействие

молекул М друг с другом (как при бесконечном разбавлении). Такой

же смысл придается и сжимаемости гидратного комплекса К (в эту

ч

величину, вообще говоря, входит также релаксационный вклад обмена воды между гидратным комплексом и фазой растворителя, но по приближенным оценкам этот вклад мал и им можно пренебречь).

Особенности адиабатического сжатия раствора. При адиабатическом сжатии раствора в целом условие адиабатичности не выполняется для отдельных гидратных комплексов, потому что за время сжатия они успевают обменяться теплом с растворителем. Для сохранения удобного простого вида связи между адиабатической сжимаемостью и гидратацией вводится понятие псевдоадиабатической сжимаемости комплекса

1С так, чтобы выполнялось равенство о, Ч

К.Л "V.,1-

(3)

Показано, как связаны между собой Л^ ^ к К^ j).

Числа гидратации из температурной зависимости. Из предположений о том, что ^ = const и что температурная зависимость объема и сжимаемости гидратного комплекса линейна (это справедливо для гидратации электролитов и заряженных атомных групп, а также для полярных групп, собранных в тесные кластеры) легко выводятся простые формулы для расчета числа гидратации из кривизны температурных зависимостей парциальных величин:

з^/гт2 - -nja'^/af) (4)

и

a2KJef--nia2i<Jsf). (S)

2 hi

В этих формулах все параметры, кроме /?ь, - экспериментально определяемые величины. Иетод был впервые предложен Сарвазяном и Букины« для исследования гидратации электролитов (на защиту не выносится).

Новый полуэмпирический метод описания парциального объема молекул произвольной формы и размера. Подход сформулирован в терминах теории массштабированной частицы (Ке^зз, 1965). Из теории следует, что парциальный объем можно представить в виде сункы собственного молекулярного объема растворенного вещества 1/, "теплового" обьема I/ (результат теплового движения молекулы в полости), объемного эффекта притяжения 'ь/ между растворенным веществом и растворителем (в результате электрострикции или водородного связывания) и вклада поступательных степеней свободы ЭЙ7ЧР - коэффициент сжимаемости растворителя):

+ + В^Т. (6)

В основу метода заложено предположение (обоснованное теоретически и эмпирически) о том, что величину "теплового объема" можно условно представить как прилегающий к молекуле слой "пустоты", толщина которого Л оаинахова вдоль всей поверхности молекулы, независимо от ее локальной кривизны (КЬагаког, 1992а). Тогда величины собственного объема V я "теплового объема" V для моле-

' «

кул известной структуры можно вычислять из очевидных геометрических соображений, используя данные по вандерваалсовым радиусам атомов. Подчеркивается, что "пустота" - это лишь условное геометрическое представление реальной картины теплового движения молекул растворенного вещества и растворителя.

Из сравнения вычисляемой суммы (|/ + + с эксперимен-

тальной величиной получается величина объемного эффекта взаимодействия |/ гидрофильных атомных групп с растворителем. Объемный эффект - величина аддитивная. Каждая функциональная атомная группа характеризуется своим собственным значением ]/, слабо зависящим от окружения в разных молекулах. Развитый в диссертации метод, в отличие от прежних, служит основанием для аддитивного способа расчета парциального объема молекул произвольной формы и размера, в том числе белков.

Для полярных групп I/ < 0. Уменьшение объема обусловлено сближением полярной группы с молекулой воды при образовании водородной связи. В рамках предложенного метода вычислен объемный

эффект образования одной водородной связи: ДК = -2,2 ± 0,6

з 113

см/моль (в эту величину входит не только перекрывание объемов <|/

+ |/) при сближении молекул на расстояние водородной связи, но и

вклад реорганизации окружающей воды). Отсюда вытекает возможность

расчета числа водородных связейп "полярная молекула-вода":

П = У/аУ . (7)

НВ I кв

Строго говоря, П это некая эффективная величина, но она коррелирует с потенциальным числом водородных связей, в которые может вступить полярная группа. Подчеркивается, что существует весьма ограниченное число методов, позволяющих исследовать стехиометрию гидратации низкомолекулярных соединений в растворе.

Для проверки метода был вычислен парциальный объем воды в состоянии чистой жидкости, исходя из вандерваальсового радиуса молекулы воды 0,168 нм и из числа водородных связей 4. Получено значение 18,5 см3моль"1 - в хорошем согласии с экспериментом (18,1 см'моль"1).

В рамках нового метода впервые было найдено объяснение физического смысла кообьема Траубе - существенной константы в одной из наиболее известных эмпирических аддитивных схем для расчета парциального объема (Траубе, 1899-, СаЬап1 и др., 1981). Траубе полагал, что кообъем это мера свободного объема, ассоциированного с растворенным веществом. В диссертации же показано, что это - чисто

подг .ночный параметр, компенсирующий некорректность эмпирической процедуры выделения вкладов концевых атомных групп.

ГЛАВА 3 посвящена гидратации атомных групп в низкомолекулярных соединениях.

Для описания парциальных сжимаемостей нет удобной теоретической базы, которая могла бы послужить основанием для разработки способов анализа вкладов атомных групп. Поэтому вклады определялись в ранках чисто эмпирического подхода, аналогичного аддитивной схеме Траубе (1899). Согласно схеме Траубе, первоначально развитой для парциального объема:

К = ^ ^ + <8>

где - вклад л.-й атомной группы; / - эмпирическая постоянная, которую называют кообьемом, она равна около 13 см'моль"1. Аналогично и для парциальной сжимаемости можно записать

& = I, & + Ко' <в»

где ^ - вклад 1-й атомной группы; К - корректирующая константа, которая в работе названа косжимаемостью (по аналогии с кообьемом Траубе). в рамках формулы (9) проанализированы собственные экспериментальные данные (КЬагаког, 1991) по температурной зависимости

Таблица 1. Параметры аддитивной схемы для расчета парциальной адиабатической сжимаемости.

Атомная группа

к ак /ат а к /зт

3 8 8

СМ

кбар коль Мбар моль К Нбар моль К2

Алифатические группы:

>С< ООО

>СН- -0,08 8 -0,07

>СНг -0,19 19 -0,16

"СНз -0,31 29 -0,23

"Н.1Рь 11 "0,09

Атомная группа

К

9 Э

см

ак /ат

3

3

эк /вт'

в

з

кбар моль Мбар моль К Мбар коль К

Нормирование алифатического кольца из линейной цепи:

5-членного

6-членного

Ароматические группы:

=С<

=СН-

-н

0,14 0,30

-0,06 -0,19 -0,13

40 14 10

-0,04 -0,18 -0,15

Полярные группы: "Одиночные" "Промежуточные" "Кластерные" (1/2)(-СОЯН-)

в пептидной группе -О- в диэти-

ленгликоле

О,38+0,07 -0,2±0,3 -0,55+0,07 -0,24±0,18

-0,51

-17 + 8 0+10 11+04 4+2

0,2+0,1 -0,1±0,1 -0,24+0,09

Другие незаряженные группы:

-SH в цистеине -0,87

>S в метионине -0,14

31 10

-0,06 -0,14

Пары заряженных групп: а-NH* и -СОО" -3,68

сближенные в глицине

e-NH* и -СОО" -4,25

отдельные, в лизине и монокарбоновых кислотах

a-NH* и -СОО~ -4,38

отдельные, в олигопептидах

e-NH* и С1~ -2,18

-ImH+ и С1~ -2,78

+

-NH= и С1~ -2,15

20

24

-0,9

-1,1

Косжимаемость:

1,2±0,3

0

0

парциальных сжимаемостей всех основных аминокислот, встречающихся в белках. К анализу были привлечены также некоторые данные по спиртам, этиленгликолям и карбоновым кислотам. Результаты анализа представлены в табл. 1.

Сжкмаеность - характеристика более чувствительная к межмолекулярным вз&ккодействиям, чей объем. Поэтому аддитивность по атомному составу в строгом смысле для сжимаемости не выполняется -вклады атомных групп сильно зависят от окружения в молекуле, лля приближенного учета взаимодействия с окружением полярные атомные группы были разделены на три класса: "одиночные" полярные группы -те, что отделены от других полярных или заряженных атоков четырьмя и более С-атомами по ковалентному хребту молекулы; "промежуточные" - отделенные от других полярных атомов тремя С-атомами по хребту; "кластерные" - отделенные от других полярных атомов двумя и менее С-атомами по хребту. Показано принципиальное различие между одиночными и кластерными группами по их действию на сжимаемость воды и, соответственно, по их вкладу в Кг• Если первые увеличивают сжимаемость, то вторые, напротив, уменьшают ее (табл. 1). При этом влияние полярных групп слабо зависит от их химической природы. Например, сравнивая анидную и карбоксильную группы, можно видеть, что их вклады в Кг неотличимы друг от друга при условии одинаковой удаленности от других полярных атомов.

Интерпретация различия нежду "одиночными" и "кластерными" полярными группами состоит в следующем.

Одна из характерных особенностей воды - необычно высокая изменчивость ее структуры под действием температуры и давления. Вблизи полярных кластеров структура стабилизируется в результате ближней корреляции молекул воды, связанных с жесткой полярной матрицей. Вследствие этого резко ограничивается способность связанной воды участвовать в произвольных конфигурациях сети водородных связей и значительно понижается релаксационная часть ее сжимаемости.

Иная ситуация, когда вода связана с одиночной полярной группой. В этом случае способность ее водородных связей принимать произвольные углы не сильно отличается от ситуации в чистой воды, релаксационная часть сжимаемости при этом может даже увеличиться (возможность увеличения релаксационной части следует из простой качественной модели двух состояний воды).

Исследование стехиометрии полярных кластеров (на примере углеводов) с помощью изложенных новых подходов показало, что каждая молекула воды гидратной оболочки связана с кластером только

одной водородной связью. "Водных мостиков" (молекул воды, связанных одновременно с двумя соседними полярными атомами) нет или их очень мало.

Вклады противоположно заряженных атомных групп заметно уменьшаются при сближении их друг с другом (табл. 1) из-за взаимного ослабления их электрострикционного действия на воду. Аналогичное поведение известно и для парциального объема.

Наиболее характерная особенность неполярных атомных групп состоит в том, что они обладают самой крутой температурной зависимостью сжимаемости гидратного' комплекса. Этот результат имеет важное практическое значение для оценок изменения степени неполярности доступной поверхности молекулы при конформационном переходе.

Ароматические группы практически не отличаются от алифатических по действию на сжимаемость воды.

Вычислен коэффициент сжимаемости для гидратных комплексов заряженных и неполярных групп и показано, что даже для заряженных групп она всего на 33 % ниже сжимаемости чистой воды. Отсюда следует вывод, что часто используемые в литературе предположения о том, что сжимаемость гидратной воды пренебрежимо мала или близка к сжимаемости льда, несостоятельны и отражают ограниченность старых подходов к интерпретации сжимаемости раствора.

Сформулирован ряд правил аддитивности для расчета парциальной сжимаемости молекул, содержащих полярные кластеры. Показано, что аддитивная схема при учете поправок на взаимодействие между атомными группами дает оценки К2 для широкого класса соединений с хорошей точностью. Прежние аддитивные схемы носили частный характер - каждая из них была пригодна только для своего узкого класса веществ.

ГЛАВА 4 посвящена исследованию нативных белков. В ней рассмотрены основные факторы, определяющие парциальные обьем и сжимаемость. Значительную часть главы занимает исследование связи сжимаемости и равновесной динамики нативной белковой молекулы.

Iакторы, определяющие парциальный объем нашивного белка. Известно, что вычисляемый из кристаллографических атомных координат молекулярный объем белка с хорошей точностью совпадает с парциальным объемом в растворе. Возникает вопрос, почему гидратация поверхности не дает вклада в парциальную величину?

Факторы, определяющие парциальный объем белка рассматривались в рамках развитого в главе 2 полуэмпирического подхода. В качестве оценки величины V были взяты результаты расчета молекулярного объема из кристаллографических данных (Павлов, Федоров, 1982). Вклад "теплового объема" ^ вычислялся как объем слоя "пустоты" толщиной 0,04 нм, прилегающей к поверхности молекулы (значение О, 04 нм получено эмпирически из анализа малых молекул, в которых неводородные атомы аппроксимированы сферами). Для оценки вклада полярных групп в !£ оценивалось число молекул воды, контактирующих с доступными полярными атомами поверхности и это число умножалось на объемный эффект образования одной водородной связи (-2,2 см3моль-1). Затем учитывался электрострикционный эффект для всех пар заряженных атомных групп (-17 см3моль"1 на каждую пару, из сравнения цвиттерионов пептидов с незаряженными полярными изомерами). Вклад трансляционного движения р КТ пренебрежимо мал. Оценивался также возможный вклад переноса воды во внутриглобулярные полости и было показано, что он тоже незначителен. Вычисления проведены для трех белков в изоэлектрическом состоянии (см. табл. 2).

Совпадение расчета с экспериментом хорошее. Следует обратить внимание на то, что "тепловой обьем" почти полностью компенсируется вкладом V (табл. 2). Этим и объясняется странный на первый взгляд факт, что парциальный объем близок к нолекулярному объему

Таблица 2. Факторы, определяющие парциальный обьем (см'г"1) для нативных глобулярных белков. Расчет и сравнение с экспериментом.

Рибонуклеаз а Лизоцим Миоглобин

=13700 =14300 =17800

V 0, 679 Расчет 0, 703 0, 734

К 0, 094 0, 087 0, 082

К -0, 076 -0, 073 -0, 071

% * к+ к 0, 774 0, 793 0, 814

0, 697 0, 717 0, 743

к 0, 704 Эксперимент 0, 720 0, 736

(эксп. ) - (расч. ) 0, 007 Сравнение 0, 003 -0, 009

(ср. V с Если бы вся поверхность белковой молекулы была

покрыта только неполярньши группами, то ее парциальный объем был бы на 12 X больше (ср. сукну I/ + Vv с величиной и^).

Sакторы, определяющие парциальную сжимаемость белка. Корректная оценка внутренней сжимаемости белковой глобулы в растворе впервые была получена в ранней работе автора (Сарвазян, Харакоз, 1977). Более детально вопрос был рассмотрен в работе (Kharakoz, Sarva-zyan, 1993).

Выделение факторов основано на представлении о макромолекуле как о фазе малого размера, которая отделена от растворителя границей раздела, включающей в себя поверхностные атомные группы с гидратной водой. В соответствии с этим

Р = К + ( 10)

2 m h

где К - молярная сжимаемость собственно глобулы белка; -

вклад поверхности. Объемный и поверхностный вклады могут быть разделены двумя методами: "регрессионным" и "аддитивным".

"Регрессионный" метод основан на предположении, что для глобулярных белков разного размера удельная сжимаемость 4г 0 первом приближении линейно связана с удельной поверхностью белковой молекулы. В качестве меры удельной поверхности удобно выбрать экспериментальную величину /М- Тогда

+ VV0p/3'w- (id

Для регрессинного анализа использовались экспериментальные данные по парциальной сжимаемости 31-го белка с молекулярной массой от 12 тыс. до 9 млн. Дальтон. Проверялась устойчивость результатов статистического анализа путем разбивки общей выборки на подгруппы и для всех способов разбивки был» получены совпадающие результаты. Общий результат: средние по всем белкам величины = 9 ± 2

Ибар"1см3г"1, = 9'5 1 2 Ибар"1см3г"1, О = -200 ± '60

Мбар 1моль 1/3см. Отсюда для коэффициентов сжимаемости было найдено 3 s ///= 13 ± 3 и ¡3 = 14 ± 3 Мбар"1 (при учете

0,ш 0,ю m T,m r *

I/ = О, 72 см г" ; Павлов и Федоров, 1Э82).

Была сделана оценка влияния давления Лапласа (около 200 бар для глобулы диаметром 3, 5 нм) на сжимаемость глобулы, а также оценены возможные вклады релаксационных процессов в сжимаемость.

Показано, что эти дополнительные вклады составляют налую долю от общей сжимаемости интерьера и частично компенсируют друг друга таким образом, что полученную величину

0 =14 Мбар"1

Т,Ю

можно считать хорошей оценкой для статической изотермической сжимаемости интерьера белковой глобулы.

Из величины а^ = -200 Мбар_1моль"1/3см следует, что сжимаемость воды в гидратной оболочке белка меньше сжимаемости чистой воды всего на 20 •/.. Это в 2 раза выше сжимаемости так называемой "льдоподобной" воды, которую принимали в ряде работ для оценки сжимаемости глобулы из парциальной величины. Предположения о "льдоподобной" сжимаемости гидратной воды или о ее несжимаемости несостоятельны V ведут к ложным результатам.

Оценку, полученную в диссертации, следует считать на сегодня наиболее обоснованной и наиненее зависящей от произвола в выборе предположений. Кроме того она подтверждена независимым "аддитивным" методом.

"Аддитивный" метод разделения объемного и поверхностного вкладов основан на предположении об аддитивности вкладов доступных атомных групп в поверхностную ("гидратационную") составляющую парциальной сжимаемости белка. Расчет гидратационной составляющей основывался только на экспериментальных значениях вкладов атомных групп без дополнительных предположений (кроме предположения об аддитивности). Результаты расчета для четырех белков (рибонуклеа-за, лизоцим, миоглобин, апо-миоглобин) дали среднюю величину для удельной псевдоадиабатической сжимаемости интерьера 4 ™ 11±2 Мбар см г , что в пределах точности совпадает с результатом более строгого "регрессионного" метода.

Иативный белок - твердое тело. Этот вывод следует из сравнения полученной оценки сжимаемости интерьера с макроскопическими телами и со сжимаемостью липидного бислоя в твердом и жидком состояниях (см. табл. 3). К такому же. выводу пришли Гейвиш с соавт. (Сау1зЬ и др., 1983), но их оценка внутренней сжимаемости базировалась на произвольных допущениях о гидратации и была в 1,5 раза занижена относительно нашей.

Твердоподобность нативного белка следует также из высокой плотности упаковки атомов в интерьере, из больших значений модуля

Юнга и из других физических свойств, подробный обзор которых сделан Морозовым и Морозовой (1990). высокие значения модуля Юнга - наиболее убедительный показатель твердоподобности. В табл. 4 приведены значения модуля Юнга, £", и модуля сдвига, вычисленные из сжимаемости по известным формулам в предположении, что коэффициент Пуассона v равен 1/3 (как для большинства аморфных твердых тал). Вычисленный модуль Юнга совпадает с измеренным в сухих кристаллах белков (Morozov, Morozova, 1982) (табл. 4), что является косвенным подтверждением правильности полученной оценки внутренней сжимаемости белковой молекулы.

Таблица 3. Сравнение интерьера1 белка с другими объектами по коэффициенту сжимаемости (Э, Мбар" ).

Жидкости:

Метанол 100*

Этанол 91*

Ацетон 89*

Бенз ол 65*

-Терфенил (ж. ) 50

Масла разные 47-63

Анилин 36*

Глицерин 21,5*

Липидный бислой (ж. кр. ) 40-60

Резины:

СКТФТ-100 77

Другие 31-40

Твердые тела:

Поли( 4-метил- 1-пентан) 37

-Терфенил (стекло) 30

-Терфенил (крист. ) 20

Нафталин 19

Полиэтилены 16- 19

Найлон-6 (у) 18

Плексиглас 15-17

Парафин 15

Мочевина 14

Гексаметилентетрамин 12

Полиоксиметилен 12

ЫаС1 3, 2

Лед ок. 20

Сухой белковый кристалл 17

Липидный бислой (гель) 25-45

интерьер молекулы белка в водной растворе: Нативный 14; 13**

Расплавленная глобула 31**

ПРИМЕЧАНИЕ: Все данные приведены к температуре 20-30 °С. Звездочкой (*) обозначены адиабатические величины, двойной звездочкой (**) - псевдоадиабатические, остальные величины -изотермические.

Таблица 4. Модуль всестороннего сжатия В, модуль Юнга £*, модуль сдвига 6 (Мбар) ^ -ццлцца^ц^ "УЧШ1н*Ч''Д^ для нативной белковой молекулы.

1/(3 0,07 Вычислено из /3

г т,я

3 2^ О, 07 Вычислено из Зт при V - 1/3

т 0,06 Измерено в сухойшкристалле лизоцима" 3(1 - 2и\

¿3 (1 + г) 027 Вычислено из ^ при V = 1/3

а Из работы (Morozov, Morozova, 1982)

Следствия из твердоподобности нативного белка обсуждаются

ниже.

Отрицательная электрострикция интерьера белка и нелинейный параметр. Один из наиболее интересных результатов работы состоит в тон, что впервые было экспериментально зарегестрировано явление отрицательной электрострикции интерьера белковой молекулы и предложено объяснение причин этого явления. Методом титрования белка в одной пробе измерялись изменения парциальных объема и сжимаемости цитохрома при окислительно-восстановительном переходе. Проводилось два .независимых эксперимента: восстановленный белок титровался феррицианидом и окисленный белок - аскорбатом. Были учгены гидратационные эффекты химических процессов, сопровождающих титрование, и определены изменения удельного объема и удельной сжимаемости интерьера белка. Прямое и обратное титрование дали одинаковые результаты: при увеличении заряда гемового железа от +2 до +3 (окисление) удельный объем интерьера увеличивался в среднем на 0,0008 см3г-1 (на 0,1 '/. относительно объема интерьера), а удельная сжимаемость - на О, 25 Ибар"1см'г"1 (на 2,8 '/. относительно средней сжимаемости интерьера).

Результат означает, что электр'острикция интерьера как диэлектрика отрицательна (положительной электрострикцией принято называть уменьшение объема и сжимаемости под действием иона или заряженной группы, как это наблюдается в жидкостях). Факт отрицательной электрострикции можно объяснить только в рамках представления о белке как твердом диэлектрике с ориентационной поляризуемостью. В работе приведены некоторые оценки, сделанные в рамках модели белка как сплошного диэлектрика, и показано, что для интерьера белка с его упругими свойствами отрицательная электро-стрикция должна наблюдаться при относительной диэлектрической проницаемости с > 2, 2. Для белка это условие заведомо выполняется (е * 4).

Сжимаемость белка и водородный обмен. По одной из моделей механизма водородного обмена внутренних атомных групп нативного белка катализатор обмена (ион воды) проникает внутрь нативной белковой глобулы без ее разрушения ("модель диффузии" или "penetration model"). В формальной кинетической схеме процесса проникновение иона внутрь соответствует переходу белка в промежуточное обмено-способное состояние. В рамках этой модели в диссертации рассмотрена связь между сжимаемостью белка и скоростью водородного обмена.

Для внедрения иона (и любой другой малой частицы) в интерьер глобулы необходимо образование полости подходящего размера. Из твердоподобности интерьера следует, что образование полости требует затраты работы по преодолению сил упругости. Оценка упругой энергии сделана по приближенной формуле Френкеля, выведенной им для анализа дефектов в твердом теле (Френкель, Кинетическая теория жидкости, 1975):

где W- работа по преодолению упругих сил при увеличении радиуса предсушествуюшей полости от f до Л2 в среде с модулем сдвига 0. в диссертации показано, что при образовании полости, достаточной для размещения в ней молекулы воды, значение составляет от О (для областей с большими полостями в статической структуре белка) до 30 кЛж/моль (для областей с максимально плотной упаковкой). Для сравнения: свободные энергии промежуточных состояний белка в процессе обмена лежат в диапазоне 10-30 кДж/моль (Woodward и др., 1982; Абатуров и др. , 1983)). Таким образом, работа против сил упругости может составлять существенную часть свободной энергии переноса частицы из растворителя в глобулу, поэтому должна наблюдаться корреляция: чем выше сжимаемость глобулы, тем выше скорость обмена.

Корреляция между сжимаемостью белка и скоростью обмена в различных белковых процессах качественно подтверждалась в ряде экспериментальных работ. Однако, в диссертации показано, что большинство экспериментальных данных по изменению сжимаемости были получены при некорректной постановке опыта - путем сравнения отдельно приготовленных форм белка в разных состояниях. Это приводит к большой систематической ошибке, которая не позволяет судить о реальной корреляции. Есть только два случая, когда изменения сжимаемости белка определялись методом титрования белка в одном образце и результатам можно доверять: связывание трисахарида с лизоцимом в работе Никитина и др. (1984) и окислительно-восстановительный переход цитохрома с в работе Харакоза и Мхитарян (1986). В обоих случаях ожидаемая корреляция подтверждается качественно. Но только в одном случае - в случае лизоцима - наблюдается количественное согласие между экспериментальным (5-10-кратным) уменьшением скорости обмена и ожидаемым (вычисленным из 10-15 У.-ного уменьшения сжимаемости белка при связывании). В

случае же цитохромас? известное 30-кратное увеличение скорости обмена при окислении нельзя объяснить малым, всего 2,5 /i-ным увеличением сжимаемости. В диссертации подчеркивается, что электростатический фактор - изменение заряда гемового железа - может значительно сильнее повлиять на вероятность проникновения ОН -иона внутрь и тем самым увеличить скорость обмена в цитохроме с.

Вывод: известные экспериментальные данные не могут уверенно подтвердить предположение о корреляции скорости обмена и сжимаемости, но и не противоречат ему.

Из формулы (12) вытекает еще одно следствие: должна наблюдаться прямая корреляция между скоростью обмена водорода в индивидуальных атомных группах белка и локальной плотностью упаковки вблизи данной группы. Косвенные указания на существование такой закономерности можно найти в обзоре Абатурова и др. (1983).

О немонотонной зависимости скорости водородного обмена от давления. Из литературы известно, что умеренные давления замедляют скорость водородного обмена в белке, а высокие ускоряют его (обзор Woodward и др., 1982). Этот факт рассматривался как один из немногих аргументов против гипотезы о диффузии катализатора обмена внутрь нативной глобулы. Аргумент состоял в том, что, если катализатор проникает в пустоты внутри белка, то объемный эффект переноса его из растворителя должен быть отрицательным и, следовательно, повышение давления всегда должно ускорять обмен.

В диссертации показано, что, напротив, этот экспериментальный факт хорошо укладывается в "модель диффузии". На основе полученных данных о физических свойствах интерьера белковой глобулы была сделана оценка объемного эффекта переноса иона воды из растворителя внутрь белковой глобулы при разных давлениях и было показано, что объемный эффект должен быть положительным при низких и отрицательным при высоких давлениях. Основными факторами, которые определяют положительный знак объемного эффекта переноса при атмосферном давлении, являются положительная электрострикция воды и отрицательная электрострикция интерьера белка, в результате чего переход иона-катализатора из воды в глобулу сопровождается увеличением объема и растворителя, и глобулы. Смена знака при высоком давлении происходит по той же причине: из-за различия в знаке электрострик-ции воды и интерьера белка перенос иона в интерьер сопровождается общим увеличением сжимаемости системы. Следовательно, при некотором высоком давлении положительный знак объемного эффекта переноса сменится на отрицательный. Сделанные в диссертации количественные

оценки согласуются с результатами обсуждаемого эксперимента по водородному обмену под давлением.

Таким образом, аргумент против диффузионного механизма водородного обмена снимается.

ГЛАВА 5 посвящена исследованию изменений объема и сжимаемости растворов белков при денатурации.

По современным представлениям (Ptitsyn, 1987) существует три термодинамически устойчивых состояния молекулы глобулярного белка в водном растворе: нативное (N1 и два денатурированных - развернутое клубкоподобное (Ш и состояние компактной расплавленной глобулы (М) с нарушенной уникальной упаковкой боковых цепей. В главе обсуждаются следующие вопросы: Как изменяются плотность и сжимаемость белка при денатурации двух названных видов? Почему денатурация при некоторых условиях приводит не к падению, а увеличению парциальной сжимаемости, и почему парциальный объем при этом почти не меняется? Какие выводы о свойствах денатурированного состояния можно сделать из результатов измерения этих величин?

Полностью развернутая полипептидная цепь. Аддитивная схема. Значе ния парциального объема и парциальной сжимаемости развернутого полипептидной цепи - важные опорные точки для анализа состояния денатурированного белка. Для природных глобулярных белков в водном растворе полностью развернутое состояние экспериментально недостижимо без добавления сильных денатурантов. Поэтому единственный способ оценки этих опорных значений для водного раствора - расчет из данных по модельным соединениям, в которых атомные группы полностью доступны растворителю.

В диссертации разработана аддитивная схема, основанная на предположении, что вклад боковой группы в парциальную величину не зависит от того, находится ли данная группа в составе свободной анинокислоты или в аминокислотном остатке развернутого полипептида. Главное отличие схемы от известных состоит в том, что в ней учитывается вклад ионизации боковых групп. Аддитивная схема была апробирована на экспериментальных данных по синтетическим развернутым полипептидам и показала удовлетворительную точность расчета.

Следует заметить, что для расчета парциальной сжимаемости полипептидов была известна только одна аддитивная схема (ХяЬа1, УеггаИ, 1988). Но она не была апробирована на развернутых моде-

лях, давала результаты, завышенные по абсолютной величине в 4-5 раз, и потону не может быть принята.

изменение парциального объема и сжимаемости белка при переходе из нашивного в полностью развернутое состояние. Из сравнения экспериментальных значений Р2 и 42 Для нативных белков с вычислен ными для полностью развернутой полипептидной цепи следует (табл. 5), что полное разворачивание должно приводить к значительному, на 12-18 Мбар-1см3г-1, падению парциальной сжимаемости с переходом в область отрицательных величин, в то же время изменение парциального объема мало, менее 2, 5'/., и знак изменения может быть любым.

Таблица 5. Ожидаемые изменения парциального объема (✓ ) и парциальной сжимаемости глобулярных белков при переходе из натив-ного состояния (эксперимент) в полностью развернутое (расчет) в изоионных или близких к ним условиях.

з -1 т -1 э -1

У . см г А , Мбар см г

Белок Развер- Натив- Эффект раз- Развер- Натив- Эффект раз-нутый ный вертывания нутый ный вертывания

__(Расч. ) (Эксп.) (Расч.-Эксп.) (Расч.) (Эксп. ) (Расч.-Эксп)

а-ЛАК

Лизоцим

ХТГ

Иит.с

МБ

апо-МБ РНК-за

0,714 0,736

0,709' 0,720

0,730 0,733

0,731е" 0,729

О, 739е" 0,736

0,739 0,731

0,706 0,704

-0,022 -0,011 -0,ООЗ 0,002 0,003 0,008 0, 002

-12,2е -12,0""

- 10, 5 -11, Ба

-11,3*

- 11,3 -11,1

б, о

4, 0

4.0 0,8 5,6

2.1 0,7

-18,2 -16,0 -14,5 -12,4 -16,9 -13,4 -11,8

Ожидаемые эффекты полного развертывания белка

от 0,008 до -0,017

от -12 до -18

w«r -1 3 -1

мбар см г

it. Источники белков и сокращения: а-лактальбумин человека (а-ЛАЧ) и коровы (а-ЛАК), панкреатический химотрипсиноген быка (ХТГ), цитохром сердца лошади (Цит.<? ), лизоцим яичного белка, мио-глобин кашалота (МБ), рибонуклеаза (РНК-за). ++ ё. Вычислено с учетом эквимолярного количества Ca

присутствующего в растворе из-за отшепления этого иона от нативного белка при денатурации. Соответствующие поправки умень^ииди .объем на -0,005 см г"1 и сжимаемость на -0,4 Мбар" см г" . С. Рассчитано для апо-формы белка.

1

см г

Денатурация белков: экспериментальные Ванные и качественная интерпретация. Экспериментальные результаты представлены в табл. 6 вместе с литературными данными для сравнения.

Химотрипсиноген. В экспериментах по денатурации химотрипсино-гена теплом наблюдался рост парциальной сжимаемости и парциального объема (КЬагаког, Эагтагуап, 1980), что противоречило общепринятому в то время представлению о развертывании белка, так как при развертывании ожидалось бы падение как объема, так и сжимаемости (табл. 5). Кроме того, полученный в работе наклон температурной зависимости денатурационного изменения сжимаемости был в несколько

Таблица 6. Изменения парциального объема (Ьу2> и парциальной адиабатической сжимаемости (йГ ) белков при денатурации.

Белок

Химотрипсиноген (Т)

Химотрипсиноген (TP)

Миоглобин (Н; О,010 М КС1) Переход I

рн

3-1 -1 3-1

С см г Мбар см г

Примечание

1, 8 2, 6

2, 1

41 0,003 52е 0,006

42

3, 85 25

Переход II 3,4

Миоглобин 4, 3 (Н; 0,1 U КС1)

Миоглобин ~4 (TP)

а

а-Лактальбумин 3-4 (Н; О,050 М КС1)

25

20

О, 0022

2, 6 3, 2

1,2"

-О, 0021* -г, 8 -О, 0015* -2, 2

О, 0013* -4, 1 -О, 0054* -5, 1

-3, 5 -О, 2 1, 9

20 -0,006 25 -0,002

Прямые измерения (Kharakoz, Sar-vazyan, 1980)

Из фазовых диаграмм (Hawley, 1971)

Прямые измерения. С поправкой на вклад ионизации. (Харакоз, Кършиков, 1984)

Прямые измерения. С поправкой на вклад ионизации. (Харакоз, Кършиков, 1984)

Прямые измерения. (Leung и др. , 1986)

Из фазовых диаграмм (Zipp, Kauzmann, 1973)

Из прямых измерений с поправкой на вклад ионизации (Харакоз,Бычкова, 1993)

ПРИМЕЧАНИЕ. Денатурация теплом (Т), теплом и давлением (ТР), кислотой (Н). Звездочкой (*) отмечены данные из работы Katz и др. (1973). Из анализа фазовых диаграмм при ТР денатурации получаются изотермические сжимаемости. Все остальные данные адиабатические, полученные из акустических измерений.

раз меньше, чем ожидалось бы при полном обнажении внутренних неполярных групп (гидратация неполярных групп должна приводить к сильному возрастанию температурного наклона, гл. 3). Для объяснения этих результатов в работе (КЬагаког, вапгагуап, 1980) было высказано предположение, что при денатурации белок сохраняет компактную структуру, а сжимаемость и объем растут благодаря увеличению внутримолекулярной подвижности. Это предположение вскоре нашло подтверждение в экспериментальных Юо1д1кЬ и др., 1981) и теоретических (Шахнович, Финкельштейн, 1982) работах, в которых было с разных сторон убедительно показано существование нового термодинамически устойчивого компактного денатурированного состояния глобулярных белков, которое теперь принято называть расплавленной глобулой.

Ниоглобин. При денатурация миоглобина кислотой при низкой ионной сипе было обнаружено, что кривая денатурации в координатах "рН - удельная скорость звука" имеет двухфазый характер (Харакоз, Кьршиков, 1984). Первый переход наблюдался при рН = 4, второй - в области рН между 3,8 и 2,8. Особенности этих двух переходов (область рН, ширина по шкале рН, амплитуда изменения сжимаемости, характер зависимости перехода от ионной силы) указывали на то, что первый переход приводит белок в состояние расплавленной глобулы, а второй - в частично развернутое состояние. В этой работе было впервые показано существование двух типов денатурированного состояния миоглобина в водном растворе без химических денатурантов.

и-Лактальбунин. Исследование денатурации а-лактальбумина человека кислотой (КЬагаког, ВусЬколта, 1993) имело важное значение с точки зрения развития метода, потому что а-лактальбумин - классический объект, на котором существование состояния расплавленной глобулы было впервые убедительно показано и ее свойства охарактеризованы многими нетодами (По1дИсЬ и др., 1981). Было обнаружено, что переход в состояние расплавленной глобулы приводит к увеличению парциальной сжимаемости на 20 У. относительно собственной сжимаемости нативной глобулы, а парциальный объем практически не меняется. Последний факт особенно интересен, потому что'гидродинамический объем молекулы при этом переходе увеличивается в полтора раза. Качественное объяснение этого кажущегося противоречия состоит в том, что М-состояние представляет собой не "сухую" расплавленную глобулу, как предполагалось в первых работах по этому состоянию белка, а "мокрую", сильно гидратированную. Количественные характеристики гидратации обсуждаются ниже.

Гидратация, плотность и сжимаемость интерьера расплавленной глобулы (количественный анализ). Для количественного анализа экспериментальных результатов по а-лакгальбунину необходимо выбрать такую модель М-состояния, которая удовлетворяла бы следующим экспериментальным фактам:

конформационная часть парциального объема (за вычетом ионизации карбоксильных групп) с точностью до 0,3 У. неизменен при И-М переходе;

конформационная часть парциальной сжимаемости увеличена на 1,9 Мбар"1см3г"1 (на 20'/. относительной );

гидродинамический обьем М-состояния увеличен в 1,4 раза (вазЬ и др., 1986) по сравнению с нативным (N1;

средние межатомные расстояния в гидрофобном ядре увеличены на 4 У, (по данным диффузного рентгеновского рассеяния; ПалпаэсЬип и др., 1986).

В диссертации рассмотрены три упрощенных модели: (а) модель "сухой" расплавленной глобулы - расплавленное состояние с увеличенным объемом без воды внутри; (б) смешанная модель - гидрофобное ядро находится в "сухом" набухшем состоянии, а остальная часть молекулы белка полностью экспонирована в растворитель; (в) модель "мокрой" расплавленной глобулы - интерьер набухшей глобулы пропитан водой. Количественный анализ с привлечением данных по изменению сжимаемости и объема при полном разворачивании белка (см. выше) показал, что единственная непротиворечивая модель это модель "мокрой" расплавленной глобулы. В ее рамках и были сделаны оценки количества воды, проникшей внутрь глобулы, плотность интерьера расплавленной глобулы (с учетом проникшей воды) и коэффициент сжимаемости интерьера. Число молекул воды было определено из сравнения гидродинамического и парциального объема. При этом учитывалась доля молекул воды, приходящаяся на увеличившуюся поверхность глобулы (эта доля составляла всего около 20 К от общего увеличения гидратации при переходе). При расчете внутренней сжимаемости учитывался вклад увеличившейся поверхности в гтарциальную сжимаемость.

Результаты оценок:

1. В интерьере находится около 270 молекул воды (35 '/, от сухого веса белка), это число сравнимо с числом полярных атомов белка в интерьере (в нативном лизоциме - структурном аналоге а-лактальбумина - находится около 220 внутренних полярных атомов).

2. Плотность интерьера (включая внутреннюю воду) на 4У. ниже плотности нативного белка.

3. Коэффициент сжимаемости интерьера в 2,5 раза выше сжимае-

мости нативной белковой молекулы. Для сравнения: сжимаемость липидного бислоя увеличивается при плавлении в 1,5 раза; сжимаемость органических материалов - в 1,5-3 раза. По величине сжимаемости <0 = 31 Нбар"1) интерьер расплавленной1 глобулы подобен сильно ассоциированным жидкостям. Для сравнения: коэффициенты сжимаемости сильно ассоциированных глицерина и воды равны 22 и 45 Мбар"1, соответственно, а у слабо ассоциированного этанола - 91 Нбар"1 1см. также табл. 4). Это естественно, потому что расплавленная глобула представляет собой систему, элементы которой сильно связаны между собой не только ковалентными связями, но и водородными связями внутренней воды.

Об оценках флуктуации объема глобулы. После работы Купера (Cooper, 1976) стало традиционным во всех исследованиях по сжикаености белков вычислять средне-квадратичные амплитуды флуктуации объема белковой нолекулы по известной термодинамической формуле

<8?> =Vt3 & Т (13)

т в

(4в - константа Больцмана). Ее используют даже в отношении расплавленной глобулы в недавно появившихся работах. В диссертации подчеркивается, что эта формула относится к системе с фиксированным числом частиц, поэтому она более или менее справедлива лишь в отношении нативных белков, интерьер которых почти не обменивается водой с фазой растворителя. Применение же ее к расплавленной глобуле с сильно гидратированным интерьером не вполне корректно, потому что в этом случае значительная (может быть, подавляющая) часть флуктуации объема глобулы обусловлена флуктуацией числа частиц - молекул воды в интерьере. Для оценки этой части следует использовать другое термодинамическое соотношение (Ландау, Лифшиц, 1964).

Комментарий к исследованиям по денатурации белков давлением. Известно, что белки можно денатурировать высокими давлениями. Как правило, это давления выше 3 кбар. Возникает вопрос, в какое состояние при этом переходит белок, в развернутое или в состояние расплавленной глобулы? На основе полученных в диссертации данных о соотношении изменений объема и сжимаемости при двух типах денатурации (развертывание и N-м переход) были сделаны некоторые приближенные оценки, из которых следует, что в условиях комнатной температуры давления выше 1-2 кбар не могут приводить к развертыванию,

но способствуют переходу в состояние расплавленной глобулы.

ГЛАВА 6 посвящена описанию метода определения релаксационных характеристик наносекундных процессов в растворе из акустических измерений на одной частоте и исследованию кинетики образования зародышей новой фазы при переходе "жидкий кристалл - гель" в везикулярной мультислойной липидной мембране в водной суспензии.

Кинетика быстрых процессов из акустических измерений на одной частоте. Из теории акустической релаксации следует, что время релаксации т связано с отношением релаксационных составляющих поглощения на длину волны [а 3 н скорости звука [!£3, измеренных на круговой частоте и:

[*] = -(2иит)"1Гаг). (14)

Эта формула использовалась ранее для расчета из известного

поглощения [а^] (Загтагуап, КЬагакож, Нептаеэ, 1979). Из нее же можно получать величину т, если известны релаксационные составляющие скорости и поглощения звука. Обычно релаксационные составляющие определяют с помощью акустической спектроскопии. На высоких частотах (и » т"1) релаксационный процесс "выключается" и измеряемые величины отражают только мгновенную сжимаемость среды. В работе (КЬагаког, 19926) показано, что в ряде случаев VI] и [а^] можно определять из измерений на одной, частоте, если релаксационный процесс можно "выключать" другим способом - варьируя те или иные параметры среды. Метод был апробирован на реакции ионизации органических кислот (КЬагаког, 19926) и показал хорошие результаты. Затем он был использован для исследования ионизации аминокислот (С11а1ак1ап, КЬагакох н др. , 1992) и для исследования кинетики фазового перехода в липидной мембране (КЬагаког и др., 1993).

В случае процесса со спектром времен релаксации величина т в формуле (14) представляет собой некоторую эффективную, усредненную характеристику акустического спектра.

Зародите образование и гетерофазные флуктуации плотности при фазовом переходе типа плавления. Исследована температурная зависимость скорости и поглощения ультразвука в суспензии мультислойных липид-ных (дипальмитоилфосфатидилхолиновых) везикул в области термотроп-

ного фазового перехода "жидкий кристалл - гель" (КЬагаког и др., 1993). Показано, что флуктуации плотности (наблюдаемые по аномальному поведению скорости и поглощения вблизи температуры перехода) хорошо описываются в рамках теории Френкеля о гетерофазных флукту-ациях вблизи фазового перехода первого рода. Гетерофазные флуктуации представляют собой спонтанное образование нестабильных зародышей новой фазы при приближении к точке фазового перехода. Их акустические проявления состоят в том, что вблизи температуры перехода резко возрастает сжимаемость (из-за дополнительной флуктуации плотности) и, как следствие, наблюдается аномальный рост поглощения и аномальное падение скорости звука (отклонение от нормальной сигмоидной кривой).

На основе теории Френкеля разработана кинетическая модель роста и распада зародыша метастабильной гелевой фазы внутри стабильной жидко-кристаллической. Кинетическая схема процесса представляет собой линейную цепочку реакций первого порядка, описывающих зарождение минимального кластера гелевой фазы и последовательное присоединение липидных молекул к нему:

С <--}> С <--}> С <--.-> ... <--}"> С <-{-> С , (15)

О / 1 / 2 / Н-1 £ «

е1 сг сз -1 ь к

Хикпогенциал кластера представлялся как сумма "объемной" составляющей - пропорциональной числу молекул в кластере, и "пограничной" - пропорциональной периметру. Коэффициент пропорциональности в "пограничной" составляющей - кэффициент линейного натяжения - служил одним из двух подгоночных параметров. Второй использованный в модели подгоночный параметр это константа скорости элементарного акта распада зародыша. Ее физический смысл -вероятность того, данная пограничная липидная молекула выйдет из кластера за единицу времени. Отношения прямых и обратных констант скорости в системе (15) задавались из простых геометрических и термодинамических соображений. Необходимые для расчетов изменения молярной энтропии и мольрного объема при присоединении липида к кластеру были приняты равными экспериментальным макроскопическим эффектам фазового перехода.

Вычисляемыми параметрами в кинетической модели были удельная релаксационная скорость и удельное релаксационное поглощение ультразвука. Они подгонялись методом наименьших квадратов под экспериментальные значения при помощи названных подгоночных параметров. Экспериментальные кривые с высокой точностью совпали с

расчетными.

Результаты:

1. Коэффициент линейного натяжения на границе раздела фаз "жидкий кристалл - гель" равен 3, 5x10"' эрг/см. Этот существенный параметр фазового перехода определен для липидной мембраны впервые. Полученное значение соответствует энергии О,7-0,8 ^г/"на одну пограничную молекулу липида. Эта оценка дает представление об энергетической "стоимости" межфазной границы. Если учесть, что граница зародыша составлена множеством молекул, то нетрудно видеть, что "стоимость" границы достаточно высока, чтобы промежуточные состояния были невыгодны и переход проходил по типу перехода первого рода. С другой стороны, межфазное натяжение достаточно мало, чтобы обеспечить заметные гетерофазные флуктуации. Для сравнения: пересчитанное на единицу площади межфазной границы (с учетом толщины бислоя Б нм) межфазное натяжение в бислое в 20-30 раз слабее, чем в органических жидкостях на границе с газом.

2. Константа элементарного акта распада зародыша равна 40 цс'1. Этот параметр имеет прямое отношение к скорости распространения фронта новой фазы вдоль мембраны в условиях, когда материнская фаза метастабильна. Скорость распространения равна примерно 1 см/с. Если в природной биологической мембране эта скорость такого же порядка величины, то критический зародыш, раз образовавшись во внутриклеточной везикуле размером 1 ц (характерный размер клеточных органелл), охватит всю везикулу за время порядка 0,1 мс. Эта оценка попадает в область времен, характерных для многих процессов в живой клетке.

Применение модели гетерофаэных флуктуаций к другим задачам. Проводилось акустическое исследование взаимодействия мелиттина с липидной мембраной. Анализ экспериментальных результатов с помощью модели гетерофазных флуктуаций позволил обнаружить новое фазовое состояние мембраны, индуцированное келиттином (Со1о^о, КЬагаког и др. , 1993).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Об информативности измерений сжимаемости:

Сжимаемость, как и любая другая интегральная физическая характеристика раствора, становится информативной только в сочетании с другими характеристиками (объем, гидродинамический объем и др.) или при измерении ее зависимости от параметров среды (температура, рЛ, ионная сила и др.), от структуры молекул (атомный состав, размер и форма молекул и др. ). В настоящей работе проводилось именно такое комплексное исследование. Такая возможность была обеспечена прежде всего развитием современной акустической измерительной техники, приспособленной к задачам молекулярной биофизики - техники, позволяющей сравнительно легко проводить большие серии измерений при калом расходе дорогостоящих препаратов.

Главный результат работы состоит в том, что был расширен эмпирический "фундамент" метода, благодаря чему значительно повысилась информативность измерений сжимаемости и объема растворов. "Расширение фунданента" состояло не столько в получении новых экспериментальных результатов (например, впервые систематично исследованы температурные зависимости парциальных сжимаемостей и объемов аминокислот), сколько в систематизации собственных и литературных данных и в разработке ряда новых подходов к исследованию и количественной интерпретации измеряемых величин. Благодаря этому были получены новые сведения о физических свойствах белков, липид-ных мембран и низкомолекулярных соединений в водном растворе, о связи сжимаемости с гидратацией и с динамическими свойствами молекул в водной среде.

О сравнении с другими методами:

При сравнении с другими интегральными физическими методами следует подчеркнуть дополнительность информации, получаемой из измерений сжимаемости. Для иллюстрации достаточно сделать сравнение с калориметрией, отметив только один аспект из многих.

Денатурация белка всегда дает сильные калориметрические эффекты, в то время как изменения сжикаемости при денатурации не всегда выражены столь отчетливо. С другой стороны, два денатурированных состояния (развернутое и компактное) резко различаются по сжимаемости, в то время как калориметрические различия между ними выражены значительно слабее. Возможно, слабая чувствительность калориметрии к различию между двумя денатурированными состояниями было одной из главных причин того, что до 80-х годов компактное

денатурированное состояние не квалифицировалось как особое фазовое состояние белковой молекулы - расплавленная глобула. И это несмотря на то, что компактность денатурированных белков наблюдалась неоднократно, а идея о денатурации как о переходе типа "внутримолекулярного плавления" с сохранением компактности активно обсуждалась почти сорок лет назад (дискуссия на совещании по проблеме белка в Киеве в 1954 году).

Совокупность полученных в диссертации результатов позволяет полагать, что создана основа для того,, чтобы акустические измерения сжимаемости по своей информативности стали в один ряд с развитыми термодинамическими методами в исследованиях водных растворов.

О перспективах:

Касаясь перспектив дальнейшего развития исследований сжимаемости и объема, можно отметить следующие возможные направления:

1. Необходимо систематическое исследование температурных зависимостей парциальных объемов и сжимаемостей белков - в этом направлении можно получить ценную информацию о физических свойствах белковой молекулы в водном растворе и сравнить их с хорошо изученными свойствами белка в кристалле. Для этого необходимо исследование серий белков разной структуры как в нативном, так и в денатурированном состояниях.

2. То же самое можно сказать и об исследовании кинетики первичных стадий фазового перехода плавления в липидной мембране - на сегодня изучена пока только единичная система, мультислойная мембрана одного из липидов.

3. В исследованиях зависимости динамики белка от давления сжимаемость играет ключевую роль. В настоящей работе обсуждалась только одна из характеристик равновесной динамики белка - скорость водородного обмена. Не исследована связь сжимаемости с другими характеристиками, например, с' поведением флуоресценции и эффекта Мёссбауэра при изменении давления.

4. Для разработки более точных методов эмпирического расчета парциальных величин необходим более полный учет внутримолекулярных взаимодействий. Для этого необходимы дополнительные сравнительные исследования гомологических серий соединений: например, олиго- и полипептидов, составленных из разных комбинаций аминокислот, а также других кодельных попимеров. Такое исследование было бы полезно не только для уточнения эмпирических расчетов (это - чисто практическая задача), но и для выяснения характера взаимодействий

между атомными группами в молекуле - по отклонениям от аддитивности.

О научно-практической значимости работы:

Значимость работы для фундаментальных исследований биомолекулярных систем определяется тем, что, во-первых, в работе получили развитие основы молекулярной интерпретации сжимаемости и объема, во-вторых, получена новая количественная информация о фундаментальных физических свойствах белковых молекул и липидных мембран как конденсированных молекулярных систем.

Результаты работы могут быть полезны в учреждениях, где исследуются физические свойства белков и липидных мембран, молекулярные механизмы их функционирования, а также гидратация биологических соединений. Например, на кафедрах Биофизики Физического и Биологического факультетов МГУ, в Институте молекулярной биологии РАН, в Институте белка РАН, в Институте химической физики РАН, в Институте органической и неорганической химии РАН, в Институте физической химии РАН.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

/. из исследования гидратации низкомолекулярных соединений:

1. Предложен новый полуэмпирический подход к молекулярной интерпретации парциальных объемов веществ в водном растворе, основанный на некоторых результатах теории жидкости. С помощью этого подхода был впервые объяснен физический смысл кообъена Траубе - эмпирической константы наиболее известного и часто используемого аддитивного кетода расчета парциального объема. Предложенный подход позволяет исследовать стехиометрию водородного связывания полярных групп с водой в растворе - таким образом, появился новый количественный метод исследования молекулярных механизмов гидратации.

2. Собрана наиболее полная сводка экспериментальных данных (собственных и литературных) по температурной зависимости сжимаемости водных растворов низкомолекулярных соединений. Сформулирован ряд закономерностей, связывающих сжимаемость со структурой молекул и со свойствами гидратной воды. Благодаря этому измерения температурной зависимости сжимаемости стали ценным инструментом исследования особенностей гидратации разных атомных групп. Показано, что прежние попытки количественного исследования гидратации из данных по сжимаемости базировались на некорректных предположениях.

3. Обоснована возможность сравнительно точного аддитивного расчета парциальной сжимаемости широкого класса соединений из вкладов атомных групп. Прежние аддитивные схемы носили частный характер -каждая из них была пригодна только для своего узкого класса веществ.

//. Из исследования состояния белков в растворе:

4. Впервые сжимаемость интерьера нашивного белка в растворе определена с помощью физически обоснованных подходов. Прежние попытки базировались на некорректных предположениях. По величине сжимаемости глобула подобна твердому телу (что согласуется с данными других методов).

5. Впервые экспериментально обнаружено явление отрицательной злек-

трострикции интерьера нативной глобулы - взаимодействие интерьера с зарядом, помещенным внутрь глобулы приводит не к уменьшению, а к увеличению ее объема и сжимаемости, что свойственно только твердым телам с ориентационной поляризуемостью.

6. Из факта твердоподобности нативной белковой молекулы выведены некоторые важные следствия, относящиеся к равновесной динамике белка. А именно:

А. Впервые сделана оценка упругой части энергии образования полости внутри белка и показано, что значительная доля свободной энергии переноса малой частицы (воды или иона) в интерьер глобулы определяется работой против упругих сил. Из этого следует, например, что должна наблюдаться прямая корреляция между сжимаемостью глобулы и скоростью водородного обмена внутренних групп нативного белка. Доступные скудные экспериенталь-ные данные не противоречат этому предположению. Б. На основе полученных результатов впервые непротиворечиво и без привлечения произвольных предположений объяснен известный экспериментальный факт двухфазной зависимости скорости водородного обмена в нашивном белке от давления, когда умеренные давления замедляют обмен, а высокие ускоряют его. Этот факт прежде рассматривался как противоречащий гипотезе о диффузии катализатора водородного обмена внутрь нативной белковой глобулы. В диссертации же показано, что, напротив, он легко объясняется именно в рамках этого механизма.

7. Исследована связь парциального объема и сжимаемости белков в растворе с их фазовым состоянием - нативным, развернутым и компактным расплавленным (расплавленная глобула). Получены следующие результаты:

A. Впервые надежно показано резкое различие двух денатурированных состояний по парциальной сжимаемости.

Б. Впервые для объяснения роста сжимаемости и объема при тепловой денатурации белка было выдвинуто предположение о том, что белок при денатурации остается в компактном состоянии при увеличении внутримолекулярной подвижности.

B. На классическом примере расплавленной глобулы (на кислой форме а-лактальбумина человека) впервые показано, что внутрь расплавленной глобулы проникает большое количество воды: около 270 молекул, что сравнимо с числом внутренних полярных атомов (около 200).

Г. Впервые корректно (с учетом внутренней гидратации) рассмотрено изменение плотности и сжимаемости интерьера белка при переходе в состояние расплавленной глобулы. Плотность гидратированной расплавленной глобулы понижена на 4 '/., а сжимаемость увеличена в 2,5 раза относительно нативного состояния. По величине сжимаемости расплавленная глобула подобна сильно ассоциированным жидкостям.

Д. Из совокупности полученных результатов следует, что денатурация высокими давлениями (выше 2 кбар) не может приводить белок в развернутое состояние. Денатурированное состояние в этом случае - расплавленная глобула.

Ш. из исследования кинетики фазового перехода плавления в липидной мембране:

8. Разработан новый метод исследования кинетики быстрых процессов - с помощью акустических измерений на одной частоте. В ряде случаев это избавляет от необходимости прибегать к технически сложным методам акустической спектроскопии.

Э. С помощью теории гетерофазных флуктуаций Френкеля из акустических измерений впервые определены важнейшие параметры, определяющие кинетику фазового перехода "жидкий кристалл - гель" в липидных мембранах: (а) межфазное линейное натяжение и (б) константы скорости элементарных актов роста и распада зародыша новой фазы. Величина межфазного натяжения достаточно мала, чтобы обеспечить возможность больших гетерофазных флуктуаций, и при этом достаточно велика, чтобы фазовый переход проходил как переход первого рода.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ:

Результаты работы доклавывались на отечественных и международных конференциях, в частности, на следующих: 2-я Всесоюзная конференция по вопросам методики и техники ультразвуковой спектроскопии (Вильнюс, 1973)! IX Всесоюзная акустическая конференция (Москва, 1977) ; 5-е Всесоюзное совещание по конформационным изменениям биополимеров в растворах (Тбилиси, 1980); 10-th International Сопдгезз on Acoustics (Sydney, 1980); Workshop "Water and water solutions in biological systems" (Belgrad, Yugoslavia, 1981); 5-Й симпозиум "Ультразвук в биологии и медицине" (Пущино, 1981); XIII Yugoslav Symposium on Biophysics (Protoroz, Yugoslavia, 1982); а-й Всесоюзный биофизический съезд (Москва, 1982); Симпозиум "Акустические свойства биологических объектов" (Пущино, 1984); Симпозиум "Физико-химические свойства биополимеров в растворе и клетках" (Пущино, 1985); Gordon Conférence, Biopolymers (Newport, USA, 1980); VI European Colloid and Interface Society Conférence (Graz, Auatria, 1992). Всего сделано более 30 докладов, из них пленарных и секционных около 10, остальные стендовые.

Кроме того было сделано около 20 выступлений на различных лабораторных и институтских семинарах в стране и за рубежом (в Москве, Санкт-Петербурге, Софии, Брно, Граце, Нью-Йорке).

Опубликовано более 50 рабст в отечественных и зарубежных изданиях.

СПИСОК НАИБОЛЕЕ СУЩЕСТВЕННЫХ ПУБЛИКАЦИЙ:

1. Сарвазян А. П., Харакоз Д. П. ( 1977) Акустические исследования

конформационных состояний белков в растворе. В кн.: Молекулярная и клеточная биофизика; Ред. Франк Г.М. ; Наука: Москва; с. 93-106.

2. Сарвазян А. П., Харакоз Д. п. ( 1977) Сжимаемость гидратной

оболочки алифатических аминокислот. Труды IX Всес. акустической конференции; Секция "г", Наука: Москва; с. 115-118.

3. Сарвазян А.П., Харакоз Д.П. (1979) Авторское свидетельство

N 655960 (СССР), опубл. В В.И., N 13, С. 153.

4. Sarvazyan А.P., Kharakoz D.P., Hemmes P. (1979) Ultrasonic

investigation of the pH-dependent solute-solvent interactions in aqueous solutions of amino acids and proteins. 7.

Php. Chqn.p 3:1796-1799.

5. Kharakoz D.P., Sarvazyan A.P. (1980) Hydration and adiabatic

compressibility changes of chymotrypsinogen denaturation, StuiUB*f>kftr 79:179-180.

6. Сарвазян А. П., Харакоз Д. П. (1981) Дифференциальный интерферо-

метр малого объема для измерения скорости и поглощения ультразвука. Приборы и техника эксперимента, N 3, с. 203-206.

7. Харакоз Д. П. , Никитин С. Я. ( 1984) Изменения скорости ультра-

звука и объемно-упругих свойств белков в различных процессах. Тезисы докладов симпозиума "Акустические свойства биологических объектов"; НЦБИ РАН: Пущино; с. 6-11.

8. Харакоз Д.П. , Кършиков А. (1984) Акустическое исследование

состояния глобулы миоглобина ' при кислотной денатурации. Тезисы докладов симпозиума "Акустические свойства биологических объектов"; НЦБИ РАН: Пущино; с.17-20.

9. Харакоз Д. П. , Мхитарян А. Г. ( 1986) Изменение сжимаемости

глобулы цитохрома при окислительно-восстановительном

переходе. Нол. биол., 20:396-406.

10. Букин В. А. , Сарвазян А. П. , Харакоз Д. П. (1989) Вода вблизи

биологических молекул. В кн. : Вода в дисперсных системах; Ред. Дерягин Б. В., Чураев н. В. , Овчаренко Ф. Д. ; Химия: Москва; с. 45-63.

11. Kharakoz D.P. (1989) Volumetric properties of proteins and

their analogs in diluted water solutions. 1. Partial volumes of amino acids at 15-55 deg С. Btcpfyi. ¿hc*>., 34:115-125

12. Харакоз Д.П. (1991) Сжимаемость и равновесная динамика глобу-

лярных белков. В кн. : Равновесная динамика структуры биапо-

пинеров; Ред. Э. А. Бурштейн; НЦБИ РАН: Пушино; с. 114-123.

13. Kharakoz D.P. (1991) Volumetric properties of proteins and

their analogs in diluted water solutions. 2. Partial compressibilities of amino acids at 15-70 deg C. tJ, PjiyS ChiM, 94:5634-5642.

14. Kharakoz D.P. (1992a) Partial molar volumes of molecules of

arbitrary shape and effect of hydrogen bonding with water.tZ Schton 21:569-595.

15. Kharakoz D.P. (19926) Single-frequency ultrasonic measurement

of kinetic constants and volume and compressibility effects of the proton-transfer reaction in aqueous solutions, J., aiCns{£- й^«(91:287-289.

16. Chalikian T.V., Kharakoz D.P., Sarvazyan A.P., Cain C.A.,

McGough R.J., Pogosova I.v., Gareginian T.N. (1992) Ultrasonic study of proton-transfer reactions in aqueous solutions of amino acids .J.P//ys. 96:876-883.

17. Kharakoz D.P., Sarvazyan A.P. (1993) Hydrational and intrinsic

compressibilities of globular proteins,fitopi-fytntfi, 33:1126.

18. Kharakoz D.P., Bychkova V.E. (1993) Molten globule of

a-lactalbumin: Ultrasonic and densitometric study. ÛistrJi 1>J Ihi 11-th IliteriiùtuiifU fiicphyuc, Cs/jrej..Budapest (Hungary). Page 83 (Poster A4.30).

19. Kharakoz D.P., Colotto A., Lohner C., Laggner P. (1993) Fluid-

gel interphase line tension and density fluctuations in dipalmitoyl phosphatidylcholine bilayers. An ultrasonic study ,\J, Phys. (hern., 97:9844-9851.

20. Colotto A., Kharakoz D.P., Lohner C., Laggner P. (1993) Ultra-

sonic study of melittin effects on phospholipid model membranes. &ii[hy$.J. / 65:2360-2367.

21. Kharakoz D.P. (1993) Volume and compressibility effects of

phase transitions in lipid bilayers compared to that in proteins in aqueous solutions. Prtp Cllliu/ S^i.