Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Упругие свойства белковых кристаллов и липидных везикул в различных условиях

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Упругие свойства белковых кристаллов и липидных везикул в различных условиях"

На правах рукописи

ПОЖАРСКИЙ ЭДВИН ВЛАДИМИРОВИЧ

УДК 577.32.2:539.3

Упругие свойства белковых кристаллов и лииидных везикул в различных условиях

03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Пущино, 1998 г.

На правах рукописи

ПОЖАРСКИЙ ЭДВИН ВЛАДИМИРОВИЧ

УДК 577.32.2:539.3

Упругие свойства белковых кристаллов и липидных везикул в различных условиях

03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Пущино, 1998 г.

Работа выполнена в Институте Теоретической и Экспериментальной Биофизики Российской Академии Наук.

Научные руководители:

доктор биологических наук Симон Эльевич Шноль доктор физико-математических наук Виктор Николаевич Морозов

доктор физико-математических наук Дмитрий Петрович Харакоз

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Фазоил Иноятович Атауллаханов доктор физико-математических наук Наталья Георгиевна Есипова

Ведущая организация: Институт Биохимической Физики РАН

Защита диссертации состоится ¿К 1998 г. в

час Ъ^ мин на заседании диссертационного совета Д200.22.01 в Институте Теоретической и Экспериментальной Биофизики РАН по адресу: 142292, г.Пущино Московской области, Институт Теоретической и Экспериментальной Биофизики РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Теоретической и Экспериментальной Биофизики РАН.

Автореферат разослан и 1998 г.

Общая характеристика работы Актуальность темы.

Упругие свойства твердого тела прямо связаны с подвижностью частиц, его составляющих. Поэтому, изучая упругие свойства белковых кристаллов, можно получить информацию о влиянии различных физико-химических факторов на общий уровень подвижности белковых молекул. Хорошо известно, что динамика белка прямо связана с его функциональными свойствами. Таким образом, актуальность темы данной работы обусловлена важностью решения фундаментальной задачи о взаимосвязи механических и функциональных свойств белковых молекул.

Многолетние исследования В.Н.Морозова с сотрудниками показали, что упругие свойства различных белковых кристаллов подчиняются общей закономерности. Модуль Юнга белковых кристаллов убывает линейно в широком диапазоне температур. Экстраполяцией модуля Юнга к нулю можно получить температуру потери белковым кристаллом механической стабильности Тт. Оказалось, что Гш, во-первых, лишь ненамного превышает температуру денатурации, что отличает белковый материал от обычных материалов, для которых температуры плавления и потери механической стабильности отличаются на сотни градусов. Как показано в работе [28], термодинамически это означает высокую степень энтальшшно-энтропийной компенсации процесса деформирования в широком диапазоне относительных деформаций. Во-вторых, Тт для ряда белковых кристаллов одинакова и равна примерно 80 °С, то есть является универсальной характеристикой белкового материала.

Возникает вопрос, не означает ли это, что в белковом кристалле есть некая наиболее мягкая мода и что описанная закономерность является особенностью лишь этой мягкой моды, а не белкового материала в целом. Попытка приблизиться к ответу на этот вопрос представлена в настоящей работе.

Нативная молекула белка in vivo находится в водном окружении. Как показано в ряде работ [19,25,29], вода служит «катализатором подвижности» белка. Задача выяснения конкретного физического механизма влияния водного окружения на внутримолекулярную подвижность далека от решения. Ранее было показано [25], что высушивание белковых кристаллов приводит к значительному увеличению жесткости и росту температуры потери механической стабильности Гт. Но при таком способе дегидратации происходит сильная структурная перестройка белка [22]. Необходимо проверить эти результаты при другом, более мягком способе обезвоживания, например, путем переноса в безводный растворитель.

Другой важный аспект взаимодействия белковой молекулы с водным окружением связан с процессами обмена, когда молекула воды диффундирует из объема растворителя внутрь белковой глобулы. Термодинамика этого процесса исследуется в настоящей работе в разделах, посвященных изотермам гидратации расплавленной глобулы и моделированию водородного обмена.

Исследование кинетики фазовых переходов в биополимерах представляет интерес ввиду их несомненного функционального значения. Для фазовых переходов первого рода, какими являются денатурация белка и плавление липидных мембран, кинетика всего перехода определяется кинетикой образования зародыша новой фазы в ходе гетерофазных флуктуации. Теоретическая разработка

вопроса о вкладе энергии упругой деформации в свободную энергию образования зародыша предпринята в настоящей работе. Результаты расчетов апробируются на случае главного фазового перехода в липидных мембранах.

Цель и задачи работы.

Основные дели настоящей работы следующие:

1. Исследование связи упругости и динамики белка в кристалле.

2. Исследование взаимосвязи между гидратацией и упругими свойствами белков.

3. Исследование роли упругой деформации в кинетике зародышеобразования.

В связи с этим решались следующие конкретные задачи:

1) Разработка нового подхода к изучению упругих свойств белковых кристаллов, основанного на измерении температурной зависимости интенсивности рентгеновской дифракции.

2) Разработка магнитного микрометода измерения модуля Юнга.

3) Разработка микрогравиметрического метода измерения изотерм гидратации белковых пленок.

4) Исследование температурной зависимости интенсивности рентгеновской дифракции тетрагональными кристаллами лизоцима.

5) Исследование температурной зависимости модуля Юнга тетрагональных кристаллов лизоцима при связывании ингибитора (аналога субстрата) - Ы-ацетил-Б-глюкозамина.

з

6) Исследование модуля Юнга и его температурной зависимости для триклинных кристаллов лизоцима в условиях безводного ацетонитрила и в смеси вода-ацетонитрил.

7) Получение изотерм гидратации а-лактальбумшга человека в нативном состоянии и в состоянии расплавленной глобулы.

8) Разработка модели водородного обмена в белках [17], в которой в явном виде учитываются энергии упругой деформации и электростатического взаимодействия как основные факторы, определяющие кинетику обмена.

9) Разработка такой модели зародышеобразования при фазовом переходе первого рода, в которой учитывался бы вклад упругой деформации. Апробация модели на случае гетерофазных флуктуации, сопровождающих фазовый переход в липидных мембранах дипалъмитоилфосфатидилхолина.

Научная новизна.

Показано, что размягчение белкового кристалла при нагреве нельзя свести к размягчению отдельно взятых мод трансляционного движения глобулы как целого или внутримолекулярной моды взаимного движения доменов. Вероятно, в кристалле происходит пропорциональное увеличение амплитуд колебаний всех основных мод внутримолекулярного движения и движения как целого.

Показано, что замена водного окружения безводным растворителем (ацетонитрил) меняет термодинамику деформирования так же, как это происходит при дегидратации высушиванием. По-видимому, в обоих случаях изменения динамики белка определяются именно снижением активности воды.

Впервые получены изотермы гидратации белка в состоянии расплавленной глобулы, из которых следует, что молекулы воды стехиометричсски связываются внутренними атомными группами белка.

Впервые количественно показано, что индивидуальные вариации скоростей водородного обмена внутренних атомных групп нативных белков определяются двумя главными факторами: упругой деформацией и электростатическим взаимодействиями при проникновении иона-переносчика из растворителя в белковую глобулу.

Практическое значение работы.

В рамках нового рентгеновского подхода к исследованию упругих свойств белковых кристаллов возможна оценка средней подвижности и определение параметров движения белковой глобулы как целого. Объем измерений при этом сокращается на два порядка по сравнению с традиционной рентгеновской процедурой.

Новый магнитный микрометод измерения модуля Юнга может применяться не только к белкам, но и к другим полимерным материалам. По сравнению с предложенными ранее методиками ([21,25,27]) он обладает более высокой точностью измерений, включает относительно простую процедуру приготовления образцов, позволяет проводить измерения в капле раствора.

Апробация работы.

Материалы диссертации докладывались:

на семинаре лаборатории физической биохимии ИТЭБ РАН;

на Институтской научной конференции ИТЭБ РАН (Пущино, 1997);

на Юбилейной научной конференции МФТИ «Современные проблемы фундаментальной и прикладной физики и математики» (Долгопрудный, 1997);

на 11-ой международной конференции "Surface Forces" (Москва, 1996);

на 6-ой международной биофизической летней школе "Supramolecular structure and function" (Ровинь, Хорватия, 1997);

на летней школе "Physics of Molecular Biology" (Хумлебек, Дания, 1998); ~

на международной конференции по физической метрологии "Fizmet'98", (Санкт-Петербург, 1998);

' на 1-ой, 2-ой и 3-ей Пущинских городских конференциях молодых ученых (Пущино, 1996-1998).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ (4 статьи и 11 тезисов докладов).

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на /(О страницах и состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы, благодарности и список литературы. Библиография включает /Го источников. Работа проиллюстрирована З^-рисунками.

Материалы и методы

В работе использовали трикдинные, тетрагональные и

моноклинные кристаллы лизоцима, выращенные по методикам, описанным в [30]. Во всех случаях кристаллы фиксировали

б

глутаровым альдегидом чтобы избежать их разрушения при механическом воздействии и изменении условий.

Интенсивность рентгеновской дифракции измеряли рентгеновским дифрактометром ДАРБ, дополненным системой контроля температурного режима. Проведен теоретический анализ возможности исследования упругих свойств белковых кристаллов на основе температурной зависимости интенсивности рентгеновской дифракции.

Модуль Юнга тетрагональных кристаллов лизоцима в комплексе с ингибитором и триклинных кристаллов в безводном ацетонитриле и смеси вода-ацетонитрил измеряли разработанным в настоящей работе магнитным микрометодом [1].

Изотермы гидратации белковых пленок измеряли микрогравиметрическим методом, основанным на измерении сдвига резонансной частоты колебаний кварцевого резонатора при изменении его массы. Относительную влажность паров воды в диапазоне (42-97)% создавали уравновешиванием паров с раствором хлорида кальция надлежащей концентрации.

Константы скоростей водородного обмена для бычьего панкреатического ингибитора трипсина, ингибитора а-амилазы -тендамистата Streptomyces Tendae и тиоредоксина Е. Coli были взяты из литературы. Были разработаны алгоритмы и компьютерные программы для расчета электростатического потенциала и упаковочной плотности белковой молекулы. Структуры белков были взяты из Protein Data Bank (коды структур 5pti, 2ait, lxoa).

Температурные зависимости скорости и поглощения ультразвука суспензией везикул дипальмитоилфосфатидилхолина были получены Д.П.Харакозом и Г.В.Шильниковым по методике, описанной в [7]. Компьютерные программы для расчета межфазного

натяжения, константы скорости межфазного обмена и упругих констант липидной мембраны были разработаны на основе модели, предложенной в [24].

Результаты и обсуждение

Температурная зависимость интенсивности рентгеновской дифракции тетрагональных кристаллов лизоцима. Были получены температурные зависимости интенсивности рентгеновской дифракции в диапазоне (20-60) °С для 20 предварительно отобранных рефлексов, соответствующих различным межплоскостным расстояниям в диапазоне от 3 до 40 А. В качестве примера на рисунке 1 приведены результаты измерений интенсивности рефлексов [0 1 3], [1 8 4] и [4 18 1]. Показано, что интенсивность падает при нагреве обратимо вплоть до примерно

Показано, что температурный ход интенсивности для измеренных 20 рефлексов аппроксимируется формулой

где параметры /0 и А индивидуальны для каждого рефлекса, а параметр Тт -общий. Вид температурной зависимости следует из температурной зависимости модуля Юнга, флуктуационно-диссипативной теоремы и общей схемы рентгенодинамического анализа. Получена температура потери механической стабильности Тт =(77±4) "С, прекрасно согласующаяся с данными прямых механических измерений [28]. Параметры А зависят от индексов Миллера и в принципе могут быть вычислены теоретически, если известна структура белка и температурная зависимость амплитуд различных мод колебаний белковой глобулы в кристалле. Были

50 °С.

предложены три различных модели, учитывающие только

1600

2.

- 1000 к

3

- 800 ¡5

о

- 1400

- 1200 "

- 200

0

о

20

30

«0

Температура, °С

50

60

Рис. 1, Температурная зависимость интенсивности рентгеновской дифракции тетрагональных кристаллов лизоцима. а - [0 1 3], о - [1 8 4], 0 - [4 18 1].

трансляционное движение глобулы как целого. Показано, что наилучшее согласие с экспериментом дает модель, описывающая анизотропное трансляционное движение, причем главные оси такого движения не совпадают с осями кристаллической решетки. Определенные из эксперимента главные оси совпадают с осями вращений глобулы как целого, приведенными в работе [31].

Получены оценки для средней амплитуды тепловых колебаний атомов белка при комнатной температуре (<&г2>т^о"с ~ 0.7 А2). Отсюда в рамках модели, развитой в работе [26] и учитывающей движение глобулы как целого в кристаллической решетке, для модуля Юнга тетрагонального кристалла лизоцима имеем Е ~ 0.3 ГПа. В обеих случаях имеется отличное согласие с литературными данными [18,28].

Исследование упругих свойств тетрагональных кристаллов лизоцима в комплексе с ингибитором. Исследовали влияние

Температура, "С

Рис. 2. Температурная зависимость модуля Юнга нативного (о) и ингнбированнного (•) К-ацетил-О-глюкозамином тетрагонального кристалла лизоцима. За Ео принят модуль Юнга кристалла с ингибитором при 300 К.

связывания ингибитора (М-ацетил-Б-глюкозамина, далее - NAGA) на модуль Юнга тетрагональных кристаллов лизоцима и на его зависимость от температуры. На рисунке 2 показаны температурные зависимости модуля Юнга для нативного и ингибированного кристаллов. На основании того, что связывание ингибитора приводит к незначительному смещению точки потери механической стабильности, можно сделать следующие выводы. Те моды внутримолекулярной подвижности, которые демпфируются при связывании ингибитора, не определяют размягчение белковых кристаллов при нагреве. Таким образом, свести высокую степень энтальпийно-энтропийной компенсации процесса деформации белка к аномальному поведению мягких мод (типа hinge-bending моды взаимного движения доменов) нельзя.

Уаругие свойства триклшшых кристаллов лизоцима в безводном ацетонитрилс. Как показано в работе [20] на примере

ю

субтшшзина Карлсберга, трехмерная структура этого белка неизменна при переносе в безводный ацетонитрил. Нами показано [9], что из трех исследованных кристаллических модификаций лизоцима (тетрагональной, моноклинной и триклинной) триклинная сохраняет размеры при переносе в безводный ацетонитрил, Этот факт делает триклинные кристаллы лизоцима удобным объектом для исследования влияния гидратации на упругие свойства белковых кристаллов.

В данной работе показано, что при переносе триклинных кристаллов лизоцима в безводный ацетонитрил происходит примерно трехкратное увеличение модуля Юнга, а его температурный коэффициент при этом по абсолютной величине

1.00 0.75

i U?

¡Ü 0.50 0.25 0.00

О 20 40 60 80 100

fflHj0, %

Рис. 3. Зависимость модуля Юнга триклинных кристаллов лизоцима от массовой доли воды в смеси вода-ацетонитрил.

уменьшается вдвое. Эффект переноса в ацетонитрил качественно совпадает с эффектом частичной дегидратации высушиванием по данным работы [25], что свидетельствует о том, что параметром,

п

определяющим влияние гидратации на жесткость белка, является активность воды.

Зависимость модуля Юнга триклинных кристаллов лизощша от содержания воды в смеси вода-ацетонитрил приведена на рисунке 3. Отметим, что несмотря на падение модуля Юнга более чем на порядок, что характерно для денатурации белкового кристалла, по крайней мере заметная часть белка в кристалле остается в нативпом состоянии, что следует из данных по рентгеновской дифракции [16].

Изотермы гидратации а-лактальбумина ~ человека в нативном состоянии и в состоянии расплавленной глобулы. Как указывается в работе [23], наиболее согласующейся с данными исследований белка в состоянии расплавленной глобулы является модель "мокрой расплавленной глобулы". Исследование изотерм гидратации расплавленной глобулы а-лактальбумина человека было предпринято для проверки этой модели и для оценки энергетических параметров связывания воды белковой молекулой.

Показано, что в отличие от нативного состояния а-лактальбумина человека, для которого изотерма гидратации в исследованном диапазоне активностей воды описывается моделью поликонденсации Брунауэра-Эммета-Теллера, степень гидратации белка в состоянии расплавленной глобулы остается постоянной в пределах точности измерений. Полученные оценки числа молекул воды в гидратной оболочке расплавленной глобулы хорошо совпадают с полным числом полярных групп белка. Эти данные свидетельствует о сильном стехиометричесхом связывании воды полярными группами белка как на его поверхности, так и во внутриглобулярных областях.

Кинетика водородного обмена в белках - роль электростатики в упругой деформации при диффузии воды

внутрь глобулы. Кинетика водородного обмена в белках представляет из себя мощное средство изучение внутримолекулярной динамики белковой глобулы благодаря развитию техники ЯМР, позволяющей определять константы скорости обмена индивидуальных амидных протонов. В настоящее время приняты две основные модели процесса водородного обмена (в условиях, далеких от денатурации), неразличимые кинетическими методами - модель локального проникновения (local penetration) и модель локального развертывания (local unfolding). В данной работе в рамках модели диффузионного проникновения молекул воды из раствора внутрь белковой глобулы рассматриваются как определяющие вероятность водородного обмена вклады электростатического взаимодействия и упругой деформации.

Согласно предложенной модели, константы скоростей водородного обмена индивидуальных амидов рассчитываются по соотношению -

к = к0 ехр(- (Elastic + EeiKtrostatic)/kET),

где Et!astic и Eeiectrostaic — упругая и электростатическая части энергии проникновения иона ОН" внутрь белковой глобулы соответственно (именно этот ион является основным катализатором водородного обмена в стандартных условиях). Энергия упругой деформации рассчитывается на основании формулы вычисления работы упругих сил при деформации сферической полости в бесконечной упругой среде, полученной еще в XIX веке Ламе. При этом в данной реализации модели энергия упругой деформации выражена через локальную упаковочную плотность, вычисляемую для каждого амидного протона из структуры белка и зависит от одного свободного параметра - сжимаемости (средней) белкового материала. Электростатическая энергия вычислялась по закону

Кулона, парциальные заряды атомов белка взяты из квантово-механических расчетов. Свободным параметром в электростатическом слагаемом является средняя диэлектрическая проницаемость белка.

Проанализированы литературные данные по кинетике водородного обмена в молекулах бычьего панкреатического ингибитора трипсина, ингибитора а-амилазы — тендамистате Streptomyces Tendae и тиоредоксине Е. Coli. Показано, что набор констант скоростей индивидуальных амидных протонов хорошо описывается в рамках предложенной модели. Расчеты показывают, что собственная диэлектрическая проницаемость белка составляет несколько единиц, а сжимаемость белкового материала примерно равна 10 Мбар'1, что согласуется с литературными данными.

Математическое моделирование гетерофазных флуктуации при главном фазовом переходе в липидных мембранах дипальмитоилфосфатидилхолина. В работе [24] были обнаружены сильные гетерофазные флуктуации, сопровождающие фазовый переход в липидной мембране. При этом было сделано предположение, что образование зародышей новой фазы при отвердевании мембраны происходит кооперативно в соседствующих монослоях соседних бислоев. Нами показано [7], что это предположение было ошибочным и обусловленным неполнотой экспериментальных1 данных в области высоких температур. Вывод сделан на основании более полных экспериментальных данных с помощью модели гетерофазных флуктуации, развитой в работе [24] и усовершенствованной в настоящей работе (учтен вклад упругой деформации в свободную энергию образования зародыша новой фазы). Получена оценка поверхностных упругих констант везикул дипальмитоилфосфатидилхолина.

Основные результаты работы. Выводы.

1. Разработай новый подход к изучению динамики белков в кристаллах, основанный на измерениях температурной зависимости интенсивности рентгеновской дифракции и на известной связи между подвижностью атомов и константами упругости.

2. Показано, что размягчение белкового кристалла при нагреве не может быть сведено к поведению какой-либо выделенной моды движения белка в кристалле. Более вероятным представляется предположение, что в кристалле происходит пропорциональное увеличение амплитуд колебаний всех основных мод внутримолекулярного движения и движения глобулы как целого.

3. При переносе триклинных кристаллов лизоцима из водного окружения в безводный ацетонитрил происходит такое же изменение модуля Юнга и его температурного коэффициента, как и при дегидратации высушиванием. Вероятно, изменение модуля Юнга при дегидратации определяется снижением активности воды и не зависит от способа, которым это достигается.

4. Из изотерм гидратации а-лактальбумина в состоянии расплавленной глобулы следует, что вода связывается во внутренних областях глобулы по стехиометрическому механизму - число мест связывания строго определено и совпадает с числом полярных групп.

5. Показано, что вероятность водородного обмена в белках определяется: 1) взаимодействием иона гидроксония с парциальными зарядами атомов белка; 2) энергией упругой

деформации при диффузии молекул воды во внутриглобулярные полости.

6. Усовершенствована ранее предложенная модель зародышеобразования при фазовом переходе в липидных мембранах - учтен вклад упругой деформации в энергию зародышеобразования. Модель стала более универсальной в том смысле, что она описывает кинетику фазового перехода как при отвердевании, так и при плавлении мембраны.

Список работ по теме диссертации.

1 .Т. A.Zenchenko, E.V.Pozharski, V.N.Morozov. A magnetic micromethod to measure Young's modulus of protein crystals and other polymer materials. J. Biochem. Biophys. Methods. 1996, 33, 207-215.

2.Э.В.Пожарский. Исследование температурной зависимости упругих свойств белковых кристаллов рентгеновским методом. Городская научная конференция молодых ученых. Тезисы докладов. Пущино, 1996. с. 71.

3.D.P.Kharakoz, G.V.Shilnikov, E.V.Pozharski. Is there a specific inter-bilayer interaction in the lipid multilayers? 11th International Conference "Surface Forces". Moscow, Russia, 1996. p.109.

4.Э.В.Пожарский, Т.А.Зенченко. Упругие свойства белковых кристаллов в безводном ацетонитриле. XXXIX Юбилейная научная конференция Московского физико-технического института "Современные проблемы фундаментальной и прикладной физики и математики". Тезисы докладов. Долгопрудный, 1996. с. 112.

5.Т.А.Зенченко, Э.В .Пожарский. Снижение энергии активации гидролиза кристаллической карбоксипептидазой А обусловлено изменением характера упругости кристаллов фермента. . II открытая городская научная конференция молодых ученых города Пущино. Тезисы докладов. Пущино, 1997. с. 74.

б.Э.В.Пожарский, Т.А.Зенченко. Упругие свойства кристаллического лизоцима в системе вода-ацетонитрил. II открытая городская научная конференция молодых ученых города Пущино. Тезисы докладов. Пущино, 1997. с. 81.

7.Д.П.Харакоз, Г.В.Шильников, Э.В.Пожарский. Сравнение гетерофазных флуктуаций в мульти- и бислойных везикулярных мембранах дипальмитоилфосфатидилхолина. Биофизика, 1997, 42,395-399.

8.E.V.Pozharski. Temperature dependence of protein crystal X-ray diffraction intensity: Correlation with protein crystal mechanics. 6th International Summer School on Biophysics "Supramolecular Structure and Function". Book of Abstracts. Rovinj, Croatia, 1997. p. 137.

9.Э.В.Пожарский, Т.А.Зенченко. Упругие свойства триклинных кристаллов лизоцима в безводном ацетонитриле. Биофизика, 1998,43,31-34.

10.Э.В.Пожарский, Д.П.Харакоз. Кинетика водородного обмена в белках ~ роль электростатики и упругой деформации при диффузии воды внутрь глобулы. III Пущинская конференция молодых ученых. Тезисы докладов. Пущино, 1998. с. 60.

11 .Э.В.Пожарский, Т.А.Зенченко, В.Н.Морозов. Температурная звасисимость модуля Юнга ингибированных кристаллов лизоцима: роль hinge-bending моды в термодинамике деформирования. III Пущинская конференция молодых ученых. Тезисы докладов. Пущино, 1998. с. 95.

12.Э.В.Пожарский, В.Н.Морозов, Д.П.Харакоз. Изотермы гидратации а-лактальбумина человека в состоянии расплавленной глобулы. III Пущинская конференция молодых ученых. Тезисы докладов. Пущино, 1998. с. 96.

13.Э.В.Пожарский, А.Р.Сковорода, Д.П.Харакоз. Локальный и глобальный объемные эффекты деформации упругих и пластических сред: линейные и нелинейные модели. III Пущинская конференция молодых ученых. Тезисы докладов. Пущино, 1998. с. 97.

14.T.A.Zenchenko, E.V.Pozharski, V.N.Morozov. A magnetic micromethod to measure Young's modulus of protein crystals. The third International Conference of physical metrology "Fizmet'98". Book of abstracts. Saint Petersburg, Russia, 1998. p. 37.

15.Э.В.Пожарский. Применение рентгеновской дифракции к исследованию температурной зависимости модуля Юнга белковых кристаллов. Биофизика, в печати.

Цитированная литература

16.Г.С.Качалова, частное сообщение.

17.Д.П.Харакоз. Сжимаемость и равновесная динамика глобулярных белков. В кн.: Равновесная динамика структуры

биополимеров. Ред. Э.А. Бурштейн; НЦБИ: Пущино, 1991, 114-123.

lS.PJ.Artymiuk, C.C.F.Blake, D.E.P.Grace, S.J.Oatley, D.C.Phillips, M.J.E.Sternberg. Nature, 1979,280, 563-568.

19.Y.N.Chirgadze, A.M.Ovsepyan. Biopolymers, 1972,11,2179-2186.

20.P.A.Fitzpatrick, A.C.U.Steinmetz, D.Ringe, A.M.Klibanov. Proc. Nail. Acad. ScL, 1993, 90,8653-8657.

21. A.V.Gorelov, V.N.Morozov.Biophys. Chem., 1987,28,199-205.

22.G.S.Kachalova, V.N.Morozov, T.Ya.Morozova, E.T.Myachin, A.A.Vagin, B.V.Strokopytov, Yu.V.Nekrasov. FEES Lett., 1991, 284,91-94.

23.D.P.Kharakoz, V.E.Bychkova. Biochemistry, 1997,36,1882-1890.

24.D.P.Kharakoz, A.Colotto, KXohner, P.Laggner. J. Phys. Chem., 1993, 97, 9844-9850.

25.V.N.Morozov, T.Ya.Morozova. Biopolymers, 1981,20,451-467.

26.V.N.Morozov, T.Ya.Morozova. J. Theor. Biol., 1986,121,73-88.

27. V.N.Morozov, T.Ya.Morozova, G.S.Kachalova, E.T.Myachin. Int. J.

Biol. Macromol. 1988,10, 329-336.

28.V.N.Morozov, T.Ya.Morozova. J. Biomol. Struct. Dyn., 1993, 11, 459-481.

29.P.J.Steinbach, B.R.Brooks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1996, 93, 5559.

30.L.K.Steinrauf. Acta Cryst., 1959,12, 77-79.

31.MJ.E.Sternberg, D.E.P.Grace, D.C.Philips. J.Mol.Biol., 1979, 130, 231-253.

Типография ВГТРК, Москва, 5-ая ул. Ямского Поля. Тираж 100 экз. Отпечатано с оригинала автора.