Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование селективного переноса генетического материала в соматические клетки путем рецептор-опосредованного эндоцитоза

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование селективного переноса генетического материала в соматические клетки путем рецептор-опосредованного эндоцитоза"

я г; ^ г; " ; :» \

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕГ"НИЯ

... - . На правах рукописи

УДК 557.2.08 ♦ 57.085.23 + 577.171.6

ЯЧМЕНЕВ Сергей Викторович

ИССЛЕДОВАНИЕ СЕЛЕКТИВНОГО ПЕРЕНОСА ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА В СОМАТИЧЕСКИЕ КЛЕТКИ ПУТЕМ РЕЦЕПТОР-ОПОСРЕДОВАННОГО ЭНДОЦИТОЗА

03.00.04 - Биохимия

__________________АВТОРЕФЕРАТ.______________________

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва (992

Работа выполнена в отделе биомембран Всероссийского Научного Центра молекулярной диагностики и лечения и в отделе клеточной биологии Института биофизики общества им. М. Планка.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты: %

Ведущая организация:

доктор биологических науй, профессор А.С. Соболев

доктор биологических наук, профессор Н.Б. Гусев доктор биологических наук, профессор В.А. Ткачук

Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина РАН

Защита состоится " ' " 1993г. в 10 часов на заседании

Специализированного совета Д 074-51.01 при Всероссийском Научном Центре молекулярной диагностики и лечения по адресу: 113149, Москва, Симферопольский бульвар, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского Научного Центра молекулярной диагностики и лечения.

/9

Автореферат разослан " ' г\ " декабря 1992г.

Ученый секретарь Специализированного совета Д 074.51.01,

кандидат биологических наук ^ __ОтраДн°ва

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы, Доставка чужеродного генетического материала в эукариотические клетки является одной из актуальных проблем современной клеточной биологии, биотехнологии и медицины. О высоком интересе к этой проблеме свидетельствует большое количество имеющихся на данный момент методов трансфекции - более четырех десятков, не считая различных модификаций. Однако, ни один из известных методов траисфекции не может быть использован без существенных ограничений для решения прикладных медицинских задач, в частности такой, как компенсация генетических дефектов в отдельных соматических клетках (генокоррекция) на уровне целого многоклеточного организма. Это объясняется тем, что почти все существующие методы трансфекции являются либо неспецифическими (по характеру взаимодействия ДНК-транспортирующих частиц с цитоплазматической мембраной клеток) и нецеленаправленными (по способу транспорта экзогенной ДНК в ядра трансфеЗируемых клеток), либо технически сложными или повреждающими клетки, либо принципиально не могут быть использованы в экспериментах in vivo.

Специфическим, целенаправленным и неповреждающим образом транспортируют свой генетический материал в клетки вирусы (Fields, Knipe, 1990), но и использование вирусов и вирусных частиц, собранных in vitro, для переноса экзогенной ДНК в клетки также накладывает ряд ограничений в силу того, что вирусы являются многофункциональными образованиями и находящиеся в их составе компоненты обладают рядом нежелательных функций, помимо необходимых для экспериментаторов (Strauss et al., 1986). Поэтому, оправ-даной, на наш взгляд, являемся попытка создать более простые растворимые молекулярные конструкции, моделирующие только поло- . жительные свойства вирусов. Для многих вирусов, как частиц, специализированных на переносе генетической информации в ядро клеток-хозяев, характерно наличие структур, специфически узнаваемых иктеркализуемым клеточным рецептором; присутствие сигнальной последовательности, обеспечивающей транспорт вирусного генома в ядро и, наконец, обратимое взаимодействие нуклеиновой кислоты с транспортирующими ее молекулами (Fields, Knipe, 1990). Молекулярные конструкции, обладающие такими же свойствами, могут состоять из полианиона, такого как ДНК, нековалентно взаимодействующего с

поликатионом, к которому ковалентно присоединены компоненты, обеспечивающие как связывание с интернализуемым клеточным рецептором,. так и транспорт в ядро клетки-мишени. При таком подходе появляется возможность легко менять как тип клеток-мишеней, так и нуклеиновые кислоты в составе этих конструкций.

Известно (Ii et al., 1973), что ДНК нековалентно связывает поликатионы, в частности, полн-£.-лизии, который может быть' модифицирован при помощи различных бифункционально-сшивающих реагентов, причем ПОЛИ-/.-ЛНЗИН при взаимодействии с ДНК образует растворимые комплексы. Удобным, на наш взгляд, лигандом в такой конструкции является инсулин, так как он, во-первых, специфически связывается и интернализуется клетками путем рецептор-опосредованного эндоцитоза через инсулиновые рецепторы (Pehlmann et al., 1982), а во-вторых, может непосредственно транспортироваться в клеточные ядра (Smith, Jarett, 1990).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было создание растворимой молекулярной конструкции, способной избирательно и целенаправленно доставлять чужеродный генетический материал в ядра клеток-мишеней путем рецептор-опосредованного эндоцитоза и цито-плазменнр-ядерного транспорта.

В задачи исследования входило:

1. Синтезировать конъюгат инсулин-поли-/--лизин, способный образовывать комплексы с плазмидными ДНК.

2. Определить оптимальные условия хомплексообразования конъюгата инсулия-поли-1.-лизин с плазмидными ДНК, при которых образуются растворимые молекулярные конструкции инсулин-поли-£-лизин-щщзмида.

3. Определить параметры специфического связывания и эндоцитоза инсулина в выбранных клетках-мишенях.

4. Оценить способность растворимой конструкции инсулин-поли-/,-ли-зин-плазмидная ДНК специфически связываться с инсулиновыми рецепторами клеток-мишеней.

5. Исследовать рецептор-опосредованный эндоцитоз и внутриклеточный транспорт растворимой конструкции инсулин-поли-Х.-лизин-плазмида в выбранных клетках-мишенях.

6. Осуществить трансфехцию клеток-мишеней, имеющих эндоцитиру-емые инсулиновые рецепторы, с помощью растворимой молекулярной конструкции инсулнн-поли-Л.-лизин-плазмидная ДНК.

Научная новизна исследования. В настоящей работе впервые было показано, что искусственно синтезированная растворимая молекулярная конструкция инсулин-поли-Л-лизин-плазмидная ДНК специфически и с высоким сродством связывается с инсулиновыми рецепторами клеток гепатомы человека линии РЬС/РйР/5, а затем путем рецептор-опосредованного эндоцитоза интернализуется этими рецепторами и специфически транспортируется в кислые внутриклеточные компартменты. Важность данного исследования также заключается в том, что впервые продемонстрирована возможность с помощью растворимой молекулярной конструкции инсулин-поли-/,-лизин-плазмида специфически, посредством инсулиновых рецепторов доставлять чужеродный генетический материал в ядра соматических клеток и, как следствие, трансформировать эти клетки.

Практическая значимость исследования, Выполненная работа имеет важное научное и практическое значение, так ках создание растворимых молекулярных конструкций такого ' класса, способных селективно доставлять чужеродную ДНК в ядра клеток-мишеней, в перспективе может цозволить решать проблемы генокоррекции - компенсации генетических дефектов в отдельных соматических клетках на уровне целого многоклеточного организма.

Апробация работы. Научные результаты, представленные в диссертации были доложены на Совещании по медицинской биохимии (Москва, 1988), на 3-м Европейском конгрессе по клеточной биологии (Флоренция, Италия, 1990), на семинаре Института биофизики общества им. М. Планка (Франкфурт-на-Майне, ФРГ, 1990), на 1-3-й Всесоюзных конференциях по направлению ."Генная и клеточная инженерия" (Пущино, 1990-1992), на. 15-м Международном конгрессе по биохимии (Иерусалим, Израиль, 1991), на Всесоюзном совещании "Функциональная морфология клетки" (С.-Петербург, 1991), на семинаре кафедры биофизики биологического факультета МГУ (Москва, 1951), на семинаре Института биохимии Йенского Университета им. Ф. Шиллера (ЙЬна, ФРГ, 1992), на Всесоюзной конференции "Биология -клетки в культуре" (С.-Петербург, 1992). Диссертация апробирована на межлабораторном семинаре во Всероссийском Научном Центре молекулярной диагностики и лечения (Москва, 1992).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ з отечественной и зарубежной печати.

Структура и объем диссертаций. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на .122 страницах машинописного текста и иллюстрирована • 15 рисунками и 1 таблицей.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа проводилась на культуре клеток гепатомы человека линии PLC/PRF/5 (Институт Вирусологии, Москва).

В экспериментах использовались: человеческий t125I] -инсулин, меченный по тирозину А14, N-гидроксасукцшшмидиловый эфир t-бутокси-карбонкл-1-J^S]-метионкна ("Amersham", Великобритания); бычий инсулин, поли-£-лизин (90 и 120 кД) ("Sigma", США); цигракониевый ангидрид, флуоресцеинизотиоцианат (ФИт1д) ("Serva", ФРП; сефакрил S-200, сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP) ("Pharmacia", Швеция) и другие.

Бычий [lJiI] -инсулин был ковалентно присоединен к [MS] -поли-Z.-лизину (90 и 120 кД) при помощи бифункционального сшивающего реагента SPDP по методу Jupg et al. (1981). При конъюгации N-кон-цевые аминогруппы инсулина были защищены цитракониевым ангидридом согласно методу Schechter et al. - (1978). Конъюгацию и очистку ■полученного коньюгата методом гель-фильтрации на колонке с сефак-рилом S-200 проводили в буфере, содержащем 50 мМ HEPES, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 2- М гуанидин. Все операции проводили при 4°С. Радиоактивность полученных - препаратов определяли на гамма-счетчике RlaGamma 1271 и на жидкостном сцинтнлляционном счетчике RackBeta 1217 (UCB, Швеция).

Плазмиды pSVRP8 (5,9 тысяч пар оснований, предоставлеивая К .А Бендукидзе, Институт биотехнологии, Москва) и pSV3neo (8,6 тысяч пар оснований) были наработаны, выделены и очищены в градиенте CsCl по методу Birnbolm and Doly (1979).

Формирование комплексов между конъюгатом инсулин-полн-1.-лизип и плазмидной ДНК, а также оценку их растворимости проводили согласно Ll et al. (1973). Образование конструкций янсулин-поли-Ь-ли-зин-плазмидная ДНК с различным молярным соотношением мономеров лизин/нуклеотид контролировали при помощи электрофореза в 1% ara-

розном геле в ТАЕ буфере (Maniatis et а)., 1982), а также методом аналитического ультрацентрифугирования (Черняк, 1978).

Сродство немеченой конструкции инсулин-поли-^-лизин-плазмидная ДНК к инсулиновым рецепторам клеток линии PLC/PRF/5 определяли с помощью конкурентного рЗдиолигандного анализа, используя [12iI]-инсулин, меченный по тирозину А14, с удельной радиоактивностью 66 ТБк/ммоль.

Исследования внутриклеточного транспорта конструкций, меченных флуореснеинизотиоцианатом (ФИТЦ), проводили с помощью методов видеоинтенсификвционной микроскопии (В ИМ) и количественной конфокальной - лазерной сканирующей микроскопии (Л СМ). Видеомикроскопическая установка состояла из универсального микроскопа Axioplan (Opton, ФРГ), гибридного преобразователя изображений (СССР) и анализатора изображений IBAS (Kontron, ФРГ). Флуоресцентные изображения клеток записывались, линейно усиливались и обрабатывались на анализаторе изображений по методу Castleman (1979). В случае методе ЛСМ флуоресценция клеток была впзуаяизована и количественно измерена при помощи конфокального лазерного сканирующего микроскопа фирмы Leitz (ФРГ).

В экспериментах по трансфекции клетки линии PLC/PRF/5 после инкубации с конструкцией инсулин-поли-£-лизин-плазмида pSVRPS фиксировали холодным ацетоном и экспрессию большого Т-антигена вируса SV40 в этих клетках определяли методом непрямой иммуно-флуоресценции, используя хомячью антисыворотку против этого антигена (Kalderon et а!„ 1984) и вторичные флуоресцентно меченные антитела.

Все количественные результаты в работе представлены в виде среднего +/- стандартная ошибка, достоверность различия оценивалась по критерию Стыодента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Бычий инсулин,* радиоактивно меченный l2JI, был коваленгао присоединен к меченному 3SS поли-1-лизину (90 и 120 хД) при помощи 6i функционального , реагента SPDP, хоторын, модифицируя свободные аминогруппы конъюгирующих компонентов, сшивает их между собой посредством -S-S- связей (рис. 1, шаг А). После взаимодействия компонентов полученный конъюгат был очищен гель-фильтрацией на

Рис.1 Этапы формирования конструкций инсулин-поли-Ь-лизин-плазмидная ДНК.

колонке с сефакрилом S-200. Типичный профиль элюции представлен на рис. 2. Как видно из рис. 2, около 80% модифицированного инсулина было конъюпфовано с поли-£-лнзином (90 кД), так как совпадают максимальные пики профилей элюций 1г51-инсулина и 358-поли-Х,-лизина. Очищенные коньюгаты содержали 8 и 10 молей инсулина на 1 моль 90 кД и 120 кД поли-Д-лизина соответственно.

Поля-Х-лизин при взаимодействии с ДНК может образовывать как растворимые, так и нерастворимые комплексы в зависимости от молярного соотношения мономеров лизин/нуклеотид в комплексах и условий комплексообразования (Li et al., 1973, Weiskopf, Li, 1977). Для определения оптимальных условий - .получение растворимой конструкции инсулия-поли-£,-лизин-плазмидная ДНК (рис. 1, шаг Б) комплексооб-разование проводили в растворе с- низкой ионной силой при различных соотношениях лизин/нуклеотид. Исходя из полученных результатов (рис. 3), - ковалентная пришивка инсулина к поли-Х,-лизину отражалась .• на растворимости получаемых комплексов, так как критическая точка начала выпадения нерастворимого преципитата, в случае конструкции инсулин-поли-/.-лизин-плазмида pSVRP8, смещалась в сторону больших соотношений лизин/нуклеотид, по сравнению с таковой для комплекса неконъюгированного поли-Ь-лизина с аналогичной плазмидой. Напротив, растворимость конструкций инсулин-поли-£-лизин-плазмидная ДНК практически не зависела от типа и размера используемой в их составе плазмиды. Полученные конструкции с плазмидами pSVRP8 (5,9 тысяч пар оснований) и pSV3neo (8,6 тысяч пар оснований) были растворимыми зплоть до молярного соотношения мономеров лизин/нуклеотид, равного 0,5.

Формирование растворимых комплексов инсулин-поли -/--лизин-плаз-мида контролировали аналитическим ультрацентрифугированием и электрофорезом. При аналитическом ультрацентрифугировании растворимые конструкции с различными соотношениями « лизин/нуклеотид содержали легкую фракцию ДНК с зариабельной константой седиментации и тяжелую фракцию ДНК, которая осаждалась прс ультрацентрифугировании на дно пробирки. С увеличением моляриого соотношения мономеров лизин/нуклеотид в растворимом диапазоне нелинейно снижалась доле легкой фракции и, соответственно, увеличивалась доля тяжелой фракции плазмидной ДНК э составе конструкции. Аналогичные результаты были получены и при электрофорезе, где также с увеличением соотношения лизин/нуклеотид

N

. Рис.2 Профиль элюции конъюгата [ ш1] -инсулин- -поли-Ь-лизин

после хроматографии на колонке (размером 0,7x70 см) ' с сефакрилом 8-200.

Ось абцисс (№ номер фракции.

Ось ординат (срт) - радиоактивность, импульсы в минуту. 0 . [З^] -полп-Ь-лизин, о - Г>«1)-инсулин, У0 - пустой объем колонки, - общий объем колонки, БСА - бычий сывороточный альбумин, мол. масса - 67 кД. Инс. - бычий инсулин, мол. масса - 5,9 кД. Представлен типичный профиль элюции.

12В

не в*

X в.

4«

а»

•

Рис.3 Зависимость растворимости комплекса поли-Ь-лизин-плазмида рБУИРв и конструкции инсулин-поли-Ь-лизин-плазмида р5УКР8 от молярного соотношения в них мономеров лизин/нуклеотид.

Ось абцисс (1/п)-молярное соотношение мономеров лизин/нуклеотид.

Ось ординат (%)-растворимость комплексов, в % от контроля.

* - комплехс поли-Ь-лизин-плазмида рЭУНРЗ,

О - конструкция инсулин-поли-Ь-лизин-ялазмида р8УЙР8.

е е.а е.4 э.в е.в 1 1.2 1.4

1/П

(от 0,1 до 0,5) возрастала доля плазмидной ДНК в составе конструкции, остающейся на старте в виде неподвижной фракции. Исходя из этих результатов можно предположить, что в растворимом интервале соотношений лнзин/нуклеотид образуются, как минимум, два класса конструкций (легкая и тяжелая фракции ДНК), различающийся по константам седиментации.

В качестве хлеток-мишеней, имеющих эндоцитируемые инсулиновые рецепторы, в нашем исследовании были использованы клетки гепатомы человека линии PLC/P&F/5. Специфическое связывание радиоактивно меченного инсулина в определенном диапазоне концентраций (от 0,4 до 40 нм) с поверхностью клеток гепатомы при 0°С было линейным в координатах Скэтчарда, что говорит о наличии однородной популяции инсулиновых рецепторов. Константа диссоциации инсулин-рецепторного комплекса была равна 3,7 + /-0,63 нМ, а количество мест связывания составило 160000 +/-11000 рецепторных молекул на клетку. Как линейность графика Скэтчарда (в аналогичном диапазоне концентраций инсулина), так и количество инсулиновых рецепторов на клетку хорошо согласуются с литературными данными, полученными на клетках печеночного ряда (Terris, Steiner, 1980). В экспериментах при 37°С было определено количество меченого инсулина, находящегося внутри клеток. Через 1 час после начала инкубации при насыщающих концентрациях лиганда в среде в клетке находилось 28000+/-5500 молекул интернализоваиного инсулина, а концентрация инсулина при полумаксимальной скорости эндоцитоза была равна 1,15 + /-0,05 нМ.

С помощью конкурентного радиолигандного анализа было определено сродство конструкции инсулин-поли-1-лизин-плазмида pSVRP8 к инсулиновым рецепторам клеток линии PLC/PRF/5. Растворимая конструкция эффективно конкурировала с радиоактивно меченным лигандом за инсулиновые рецепторы клеток гепатомы (рис. 4) с таким же сродством, как и у немеченого инсулина (кривые вытеснения в обоих случаях практически совпадали); что говорит о способности конструкции специфически связываться С инсулиновыми рецепторами на поверхности клеток.

Для изучения пути доставки чужеродного генетического материала с помощью искусственных растворимых молекулярных конструкций- в клетки были проведены исследования внутриклеточного транспорта таких конструкций, меченных флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ), с помощью

-1дССЗ

Рис.4 Вытеснение конструкцией инсулин-поли-Ь-лизин-плазмвда р5УКР8 и немеченным инсулином 1г51-инсулина, специфически связанного с клетками гепатомы человека линии РЬС/РЯР/5.

Ось абцисс (-^[С]) - отрицательный логарифм концентрации иемеченного лигацда.

Ось ординат (%) - специфическое связывание 1г51-инсулина, в % от максимального.

* - конструкция инсулин-поли-Ь-лизии-плазмида рЭУИРЙ,

О - немеченный инсулин.

методов видеоинтенсификационной микроскопии (ВИМ) и количественной конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (ЛСМ).

В исследованиях с помощью ВИМ клетки РЬС/РЯР/5 инкубировали с 7 нМ растворимой флуоресценто меченной конструкцией инсулин-поли--¿-лизин-плазмида рБУЯРв при 37°С. После 2-х часовой инкубации были получены флуоресцентные изображения клеток, которые накапливали и обрабатывали на анализаторе изображений. Результаты экспериментов показывают, что ФИТЦ-меченная растворимая конструкция специфически аккумулируется в клетках: так, флуоресценция цитоплазмы после инкубации с конструкцией, меченной ФИТЦ, была значительно ярче, чем в случае клеток, инкубированных с конструкцией в присутствии 10 мкМ избытка свободного инсулина, или же в клетках, инкубированных без такой конструкции - автофлуоресценция. Частота распределения интенсивности флуоресценции цитоплазмы клеток также подтверждала вывод, что интернализация такой конструкции клетками опосредована инсулиновыми рецепторами.

В исследованиях по связыванию с помощью метода ЛСМ клетки РЬС/РЯР/5 инкубировали с 3,7 нМ ФИТЦ-меченной конструкцией при 21°С. Спустя 7 минут после добавления конструкции к клеткам, были обнаружены ярко флуоресцирующие участки на поверхности клеток, количественная оценка которых представлена в табл. 1, А. В присутствии 10 мкМ свободного инсулина средняя интенсивность флуоресценции этих ярких участков, на поверхности клеток была меньше на 40%, по сравнению с клетками, инкубированными только с ФИТЦ-меченной конструкцией (табл. 1, А), что указывает* на специфическое связывание тахой конструкции с инсулиновыми рецепторами на поверхности' клеток.

В исследованиях по интернализации с помощью ЛСМ клетки инкубировали с 3,7 нМ флуоресцентно меченной конструкцией при 37°С. После двухчасовой инкубации клеток в этих условиях наблюдалось специфическое (рис. 5, А), блокируемое свободным инсулином (рис. 5, С) накопление ФИТЦ-меченной конструкции инсулин-поли-Ь-лизин-плаз-мида внутри клеток, в околоядерных участках. Результат представлен в ввде частот распределений интенсивностей флуоресценции.

Известно, что после рецептор-опосредованного зндоцитоза интер-нализуемые лиганды попадают в кислые компартменты клеток (МеИшапп е( а!-, 1986). Так как флуоресценция флуоресцеина заметно снижается при кислых рН, то к клеткам для увеличения интенсивности

конструкции

[8ьЛ

Щ

У".'''

I им поо вео мм змю «ооо аоо щоо мюо

* Итвчсишкх!» <|>про)>оецт«ц|1М

I:

ксжструкцма хлорид ьммоння

IV"» П« 2М Мее )МЯ 4001 4МП М00 1М0 ЫМ 61М 7000 7Мв Интенсивность флуор«сцс«м*м

конструкция + мкуимн

ах» гзоо ям по* ««ее 4><х> )оо* »«а мяв »и» тиио г»» Итаисишмост» флуорасцвищч

& 'р.

й ' г4

конструкция + инсулин + хлорид аммония

Щ

МИ 2М МИ1 )ЯВ Иит«мсиа

мм IV» еде» «и« 7иие :т* фл у орде ця1 **"Н

Рис.5 (Количественная оценка ннтенсивностей флуоресценции цитоплазматических околоядерных участков живых клеток гепатомы человека линии Р1,С/Р1?Р/5 после эндоцитоза ФИТЦ-меченной конструкции инсулин-поли-Ь-лизив-плазмида рЗУИРЗ, измеренных методом ЛСМ в двух идентичных площадях (10,1 мкм2) около каждых ядер. Результаты представлены в виде частот распределений интенсивностей флуоресценции [т.е. количество клеток (ордината) с соответствующей интенсивностью флуоресценции (абцисса)] после инкубации с конструкцией в отсутствии (А, В) или в присутствии (С, И) избытка свободного инсулина. В случаях В и Б, в среду перед измерением был добавлен хлорид аммония. Результаты приведены без вычетания фона.

Табл.1 Связывание и интернализация ФИТЦ-меченной конструкции инсулин-пали-Ь-лиэин-плазмида р5УЯР8 клетками гепатомы человека линии Р1С/Р№/5, измеренные методом ЛСМ.

А. 7-минутная инкубация при 21°С

Клеточная поверхность Цитоплазма

3,7 нМ конструкция 3,7 нМ конструкция + + 10 мкМ инсулин Интенсивность (усл. е; 2993 + /-219 1698+ /-145 флуоресценции синицы)* 845 + /-54 724 + /-69

В. 2-х часовая инкубация при 37°С _(+ 10 мМ хлорид аммония)

Живые клетки Фиксированные клетки

Цитоплазма Ядра Цитоплазма Ядра

■ около ядер около ядер

Интенсивность флуоресценции (усл. единицы)*

3,7 нМ конструкция 2469+ /-91 408 + /-11 4119 + /-127 2051+ /-91

3,7 нМ конструкция + -

+ 10 мкМ инсулин 1319+ /-29 316+ /-5 2568 + /-74 1103+ /-29

Автофлуоресценция 843 + /-38 157 + /-4 2260 + /-93 934 + /-33

* Во всех случаях различия между интенсивностями флуоресценции после инкубации с конструкцией в отсутствии или в присутствии свободного инсулина длк живых или фиксированных клеток были статистически достоверными (р«0,001).

флуоресценции (в случае, если ФИТЦ-меченная конструкция транспортируется в кислые компартменты) был добавлен хлорид аммония, который может быстро защелачивать эндоцитозные компартменты (Pool, Ohkuma, 1981). Добавление 10 мМ хлорида аммония в среду, перед началом измерения методом ЛСМ заметно увеличивало флуоресценцию поглощенной конструкции в клетках (рис. 5, В). Добавление избытка свободного инсулина также существенно снижало интенсивность флуоресценции, измеренной в аналогичных условиях (рис. 5, Д). Результаты количественной обработки флуоресцентных изображений живых клеток,' полученых при помощи ЛСМ в присутствии хлорида аммония, представлены также в_ табл. 1, В (живые клетки).

С этими результатами сходны данные, полученные на препаратах клеток, фиксированых ^-формальдегидом (табл. 1, В, фиксированные клетки). Эти результаты позволяют предположить, что ФИТЦ-меченная конструкция инсулин-поли-Л-лизин-плазмидная ДНК поступает в клетки ■ PLC/PRF/5 рецептор-опосредованным' эндоцитозом через инсулиновые рецепторы и, как следствие, специфически транспортируется в кислые внутриклеточные компартменты.

Важность данного исследования также заключается в том, что было обнаружено увеличение флуоресценции в ядрах живых клеток, инкубированных с флуоресцентно меченной конструкцией (табл. 1, В). Это увеличение было также рецептор-специфическим, так как интенсивность флуоресценции в ядрах была достоверно ниже • в присутствии избытка свободного инсулина (табл. 1, В, живые клетки). Эти различия для ядер (табл. 1, В, фиксированные клетки) существенно более выражены для фиксированных клеток, возможно, это объясняется тем, что при фиксации клетки становятся более плоскими и в оптический срез попадает большее количество флуоресцентной метки. Однако, на основании результатов ЛСМ трудно решить, обусловлено ли . • это увеличение флуоресценции в ядрах накоплением целой флуоресцентно меченной конструкции инсулин-поли-£-лизин-плазмидная ДНК или же только конъюгата инсулин-поли-^-лизин-ФИТЦ без плаз-миды. Подтверждением того, что именно ДНК конструкции инсулин-по-ли-Х/-лязин-плаэмида pSVRP8 транспортируется в ядра клеток является тот факт, что клетки PLC/PRF/5 могут быть специфически трансфецированы этой конструкцией.

- Плазмида рБУЙРв содержит раннюю область обезьянего вируса БУ40, включая ген большого Т-антигена, который использовался в наших экспериментах в качестве маркера трансфекции, так как в норме клетки линии РЬС/РЛР/5 не содержат и, соответственно, не экспрессируют этот ген. Клетки гепатомы инкубировали в течение 18 часов при 37°С со 100 пкМ растворимой конструкцией инсулин-поли-1,-лизин-плазмида рЗУ1?Р8. После фиксации и прокрашивания методом непрямой иммунофлуоресценции были обнаружены клетки с ярко флуоресцирующими ядрами (т.к. продукт экспрессии является карио-фильным белком), что указывает на высокий уровень экспрессии гена большого Т-антигена в этих клетках» Такие, экспрессирующие Т-антиген клетки совершенно отсутствовали среди контрольных нетрансфеци-рованных клеток, ядра которых не флуоресцировали. Эффективность экспрессии . в случае инкубации клеток гепатомы с конструкцией составляла 0,95+ /-0,16 % (рис. 6, В). Свободный 40 нМ инсулин, добавленный к клеткам вместе со 100 пкМ конструкцией, достоверно снижал количество клеток, экспрессирующих Т-антиген, до 0,24+ /-0,09 % (рис. 6, С), что говорит о. специфичности доставки ДНК такой конструкцией в ядра трансфецируемых клеток. В клетках, инкубированных со 100 пкМ плазмидой рБУЛРв не в составе конструкции, не было обнаружено экспрессии большого Т-антигена (рис. 6, А). В идентичных экспериментах по трансфекции с инсулинированной конструкцией эмбриональных . легочных фибробластов человека, которые содержали менее чем 600 инсулиновых рецепторов на клетку, также не было обнаружено клеток, экспрессирующих Т-антиген.

Таким образом, конъюгат инсулин-поли-£,-лизин в комплексе с ДНК можно рассматривать как растворимую ' ДНК-транспортирующую конструкцию, которая, специфически взаимодействуя с инсулиновыми рецепторами путем рецептор-опосредованного эндоцитоза поступает внутрь клеток в кислые внутриклеточные компартменты, а также специфически транспортируется в ядра клеток-мишеней с последующей трансформацией этих клеток. В перспективе молекулярные конструкции такого класса смогли бы ~ позвг ить решать проблемы компенсации генетических дефектов в отдельных соматических клетках на уровне целого мйогоклеточного организма.

%

Рис.6 Эффективность экспрессии большого Т-антигена вируса SV40 в

клетках гепатомы человека линии PLC/PRF/5, трансфецированных с конструкцией инсулин-поли-Ь-лизнн-плазмида pSVRP8.

Ось ординат (%) - количество клеток, экспрессирующих Т-анти-ген, в % от общего количества клеток.

(A) - 100 пкМ плазмидная ДНК (контроль),

(B) - 100 пкМ конструкция инсулин-поли-Ь-лизин-плазмидная ДНК,

(C) - 100 пкМ конструкция инсулин-поли-Ь-лизин-плазмидная ДНК вместе с 40 нМ свободным инсулином.

.ВЫВОДЫ

1. Синтезирован конъюгат инсулин-поли-Ь-лизин и определены оптималыше условия комплексообразования этого конъюгата с плазмидными ДНК, при которых полученные конструкции инсулин-поли-¿-лизин-плазмида являются растворимыми.

2. При формировании растворимых комплексов конъюгата инсулик-поли-£-лизин с плазмидвой ДНК образуются, как минимум, два класса конструкций, различающихся по константам седиментации, и растворимость этих конструкций не зависит от типа и размера используемой в их составе плазмиды.

3. Инсулиновые рецепторы клеток линии PLC/PRF/5 специфически, с высоким сродством, таким же, как и к «модифицированному инсулину, связывают конструкцию инсулин-поли-Л-лизин-плазмцда.

4. Показано, что конструкция инсулин-поли-£-лизин-плазмида специфически интернализуется клетками гепатомы человека при помощи внсулиновых рецепторов и транспортируется в' кислые внутриклеточные компартмевты.

5. Конструкция инсулин-поли-£-лизин-плазмидяая ДНК специфически, посредством инсулиновых рецепторов транспортирует маркерный ген в ядра клеток гепатомы человека линии PLC/PRF/5 с последующей трансформацией этих клеток. „

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Розенкранц A.A., Ячменев C.B., Соболев A.C. Использование искусственных конструкций для селективного переноса генетического материала в клетки человека путем рецептор-опосредованного эндоцитоза. Докл. АН СССР, 1990, Т.312, N2, с.493-494. .

2. Sobolev A.S., Rosenkranz A.A., and Yachrnenev. S.V. Usine artifical constructions - models of viruses for selective targeting of genes into living cells. Cell Biol. Infernal. Rep., 1990, v.14, p.216.

3. Соболев A.C., Розенкранц A.A., Никитин B.A., Ячменев C.B., Серебрякова Н.В., Гулак П.В., Ахлынина Т.В., Киселева Т.Г., Бубчиков В.И., Васильева А.П. Создание молекулярных конструкций для направленной доставки генетического материала в клетки. В кн: Тезисы .

докладов I Всесоюзной конференции "Генная н клеточная инженерия". Пущино, ноябрь-декабрь 1990, М„ 1991, с.56-58.

4. Rosenkranz A., Yachmenev S., Serebryakova N., Sobolev S., Jans D., Peters R. Targeted endocytosis and nuclear transport of a transfecting DNA construct observed by confocal laser scanning microscopy. "15th International congress of biochemistry". Jerusalem, Israel, August 4-8, 1991. Abstracts., 1991, p.334.

5. Розенкратщ А.Л., Ячменеп C.B., Пане Д., Серебрякова H.B'., Муравьев В.И., Петере Р., Соболев A.C. Применение видеоинтенсификациониой и лазерной сканирующей микроскопии единичных клеток для исследования рецептор-опосредованного эндоцитоза флуоресцентно меченной ДНК-переносящей конструкции. Цитология, 1991, Т.ЗЗ, N9, с.100.

6. Соболев A.C., Розенкраиц A.A., Ячменев С.В., Серебрякова Н.В., Гулак П.В., Ахлынина Т.В., Никитин В.А., Киселева Т.Г., Бубчиков В.И., Йанс Д., Петере Р. Создание молекулярных конструкций для направленной доставки генетического материала в клетки. В кн: Тезисы докладов 1Г Всесоюзной конференции "Генная и клеточная инженерия". Пущино, ноябрь-декабрь 1991, М., 1992, с.52-53.

7. Sobolev A.S., Akhlynina T.V., Yachmenev S.V., Rosenkranz A.A., Severin E.S. Internalizable insulin-BSA-chlorin e6 conjugate is a more effective photosensitizer than chlorin e6 alone. Blochem. Int.,- 1992, v.26, N.3, p.445-450.

8. Rosenkranz A.A., Yachinenev S.V., Jans D.A., Serebryakova N.V., Murav'ev V.l., Peters R., and Sobolev A.S. Receptor-mediated .endocytosis and nuclear transport of a transfecting DNA construct. Exp, Cell Res., 1992, v.199, N.4, p.323-329.