Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование роли метаболитов ненасыщенных жирных кислот в регуляции пролиферации и гибели клеток

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование роли метаболитов ненасыщенных жирных кислот в регуляции пролиферации и гибели клеток"

На правах рукописи

Гриченко Ольга Евгеньевна

Исследование роли метаболитов ненасыщенных жирных кислот в регуляции пролиферации и гибели

клеток.

03.00.04 Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2004

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г. Пущино.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

Корыстов Юрий Николаевич.

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук

Акатов Владимир Семенович,

доктор биологических наук Новоселова Елена Григорьевна.

Ведущая организация: Филиал института биоорганической химии

РАН.

Защита состоится 21 июня 2004 г. в 10 ч 00 мин. на заседании диссертационного совета Д 002.066.01 при Институте фундаментальных проблем биологии РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская 2, ИФПБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института фундаментальных проблем биологии РАН.

Автореферат разослан 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Общая характеристика работы

Актуальность темы. К прогрессивному опухолевому росту приводят изменения важнейших сигнальных путей, участвующих в регуляции пролиферации и гибели клеток. Одна из проблем химиотерапии - это низкая избирательность действия противоопухолевых препаратов. Традиционная химиотерапия опухолей базируется, в основном, на селективном поражении делящихся клеток и при этом вместе с опухолевыми клетками погибают также нормальные делящиеся клетки, за счёт которых осуществляется регенерация крови, иммунной системы и всех эпителиев. В результате, при химиотерапии происходит нарушение кроветворения, иммунитета и поражение различных эпителиев. Имеются отдельные и противоречивые данные о том, что в регуляции пролиферации и гибели опухолевых клеток задействованы метаболиты ненасыщенных жирных кислот, и в некоторых типах опухолей изменена, по сравнению с нормальными тканями, сигнализация метаболитами ненасыщенных жирных кислот. Различие во внутриклеточной сигнализации между нормальными и опухолевыми клетками можно использовать для настоящей селективной химиотерапии опухолевых клеток.

Радиотерапия является другим способом терапии опухолей. Однако, тимоциты, при дифференцировке которых формируется Т-клеточный иммунитет, очень чувствительны к радиации, что приводит к снижению иммунитета после радиотерапии опухолей. Кроме того, при облучении могут активироваться события, связанные с метаболизмом ненасыщенных жирных кислот. Поэтому, кроме изучения различий в сигнализации нормальных и опухолевых клеток в решении вопросов терапии опухолей, важно и понимание механизмов гибели нормальных клеток, в частности механизма радиационного апоптоза иммунных клеток. Известны многие мессенджеры и ферменты, опосредующие радиационную гибель клеток, однако данные о роли метаболитов ненасыщенных жирных кислот в радиационной гибели нормальных клеток отсутствуют.

Цель работы. Целью настоящей работы явилось исследование роли внутриклеточной сигнализации, осуществляемой метаболитами ненасыщенных жирных кислот в регуляции пролиферации и гибели опухолевых и нормальных лимфоидных клеток.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Оценить роль продуктов различных липоксигеназ в регуляции пролиферации и гибели клеток лимфолейкоза Р388 на стационарной и логарифмической стадиях роста.

2. Исследовать роль продуктов циклооксигеназ в регуляции пролиферации и гибели клеток лимфолейкоза Р388.

3. Исследовать действие ингибиторов метаболизма ненасыщенных жирных кислот на тимоциты.

4. Оценить участие 5-липоксигеназы, 12-липоксигеназы, и 15-липоксигеназы в радиационном апотгпр тимпцтггпп методом

ингибиторного анализа.

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ] БИБЛИОТЕКА СПстер О» и»';

5. Изучить роль продуктов 15-липоксигеназы в радиационном апоптозе тимоцитов.

6. Изучить активность 15-липоксигеназы тимоцитов в норме и после облучения и оценить ее возможную роль в регуляции радиационного апоптоза.

Научная новизна работы. О роли метаболитов ненасыщенных жирных кислот в регуляции пролиферации и гибели трансформированных клеток существует противоречивая информация, и на лимфолейкозе Р388 впервые показано, что продукты липоксигеназ необходимы для выживаемости и роста опухолевых клеток лимфолейкоза Р388.

Впервые показано, что ионизирующая радиация активирует 15-липоксигеназу нормальных лимфоидных клеток, продукт которой участвует в инициации апоптоза тимоцитов. Эти данные являются основанием для утверждения потенциальной роли продуктов 15-липоксигеназы в радиационной гибели нормальных клеток.

Таким образом, в работе показано, что продукты липоксигеназ необходимы для выживания и пролиферации опухолевых клеток лимфолейкоза Р388 и участвуют в радиационной гибели нормальных лимфоидных клеток..

Практическая значимость работы. Полученные данные могут послужить основой для. селективной химиотерапии лейкозов, с помощью ингибиторов липоксигеназ.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были представлены на Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 1998 г; Пущинских конференциях молодых ученых «Горизонты физико-химической биологии» 2000 г; «От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям» Пущино 2001 г; на научных конференциях «Клеточная биология на пороге XXI века» Санкт-Петербург 2000 и 2001 гг, Путинской конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», 2004 г.

По материалам работы опубликовано 5 печатных работ, из них четыре статьи в отечественных журналах и 1 статья в зарубежном журнале.

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа изложена на 106 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Список цитированной литературы состоит из 185 источников. Диссертация содержит 26 рисунков и 5 таблиц.

Обзор литературы. Литературный обзор состоит из трех разделов. Первый раздел посвящен определению места ненасыщенных жирных кислот во внутриклеточной сигнализации и роли их метаболитов в регуляции основных клеточных функций. Подробно описаны основные пути окисления ненасыщенных жирных кислот. Во втором разделе рассмотрены известные литературные данные о роли метаболитов ненасыщенных жирных кислот в регуляции пролиферации и гибели опухолевых клеток. В этом разделе уделяется внимание противоречивости имеющихся данных и особенностям

метаболизма ненасыщенных жирных кислот в опухолевых клетках. Третий раздел посвящен раскрытию феномена радиационного апоптоза лимфоидных клеток. Кратко описана роль апоптоза в дифференцировке лимфоидных клеток в норме и проведен анализ литературных данных по основным молекулярным и биохимическим событиям, необходимым для инициации и реализации радиационного апоптоза, с целью выяснения возможного участия метаболизма ненасыщенных жирных кислот в гибели клеток после облучения.

Материалы и методы исследования.

1. Объект исследования. Объектом исследования были мышиные опухолевые клетки лимфолейкоза Р388 и нормальные тимоциты крыс и мышей.

2 Ингибиторный анализ. Перед инкубацией in vitro к выделенным клеткам добавляли исследуемые ингибиторы. В экспериментах использовали 4-бромфенацилбромид, (БФБ) - ингибитор ФЛАг, индометацин - общий ингибитор циклооксигеназы, нордигидрогуаретовую кислоту (НДГК) - общий ингибитор липоксигеназы, байкалеин — специфический ингибитор 12-липоксигеназы (12-ЛО), АА861 - специфический ингибитор 5-липоксигеназы (5-ЛО), ПГЕ2 - продукт циклооксигеназы (ЦО), а также - продукт окисления арахидоновой кислоты 15-липоксигеназой - 15-гидроксиэйкозотетраеновую кислоту (15(S)HETE). Все ингибиторы были произведены фирмой "Sigma", США. Ингибиторы растворяли в диметилсульфоксиде. При добавлении ингибиторов к клеткам концентрация диметилсульфоксида не превышала 0,2%, и эта концентрация не влияла на выживаемость клеток.

3. Методы определения апоптоза. Гибель клеток лимфолейкоза Р388 определяли по уменьшению их количества (лизис) и по окраске раствором (0,04 %) трипанового синего ("Serva", Германия).

Повреждение ядер оценивали по конденсации хроматина (пикноз) и фрагментации конденсированного хроматина (фрагментация ядра).

Распределение клеток по содержанию ДНК исследовали методом проточной цитометрии.

Межнуклеосомную деградацию ДНК определяли по методу (Maniatis Т., 1982) с некоторыми модификациями. Разделение ДНК проводили в 1,5% агарозном геле в течение 4 ч при U = 5 В/см. После окрашивания этидиум бромидом образцы фотографировали в УФ-свете.

4 Выделение белка из тимоиитов. После окончания инкубации клетки отмывали в растворе Хенкса ("Sigma", США) рН 7,4 и лизировали на льду добавлением к осадку дистиллированной воды, t = 2-4° С. Все дальнейшие процедуры проводили при такой же температуре. Остатки клеток удаляли центрифугированием при 20000 g, 20 мин. Белок осаждали высаливанием сульфатом аммония в течение 2 ч, добавляя его в супернатант до 55% насыщения, затем центрифугировали при 10000 g, 20 мин и отделяли белковый осадок. Осадок растворяли в 1 мл 0,1 М КН2РО4 и диализовали против раствора этого же буфера. Полученный белковый раствор использовали для определения активности липоксигеназ. Концентрацию белка определяли

спектрофотометрически по поглощению при 260 и 280 нм по формуле: С (мг/мл) = (Е28оХ 1,5)-(Е260 х 0,76) (Мешкова и др., 1979).

5. Выделение 15-липоксигеназы из ретикулоиитов. Известно, что ретикулоциты содержат большое количество 15-липоксигеназы (Rapoport et al., 1979). Количество ретикулоцитов в крови резко возрастает при кровопотерях или лизисе эритроцитов. Для получения большого выхода 15-липоксигеназы из крови крысам вводили фенилгидразин, 50 мг/кг, лизирующий эритроциты (Criswell et al., 2000) и определяли кинетику изменения ретикулоцитов в крови. Содержание ретикулоцитов достигало максимума 65% через 5 сут. после введения фенилгидразина. Соответственно в этот срок производили забор крови из сердца, клетки осаждали центрифугированием и затем из клеток выделяли белок так же как из тимоцитов.

6. Определение активности 15-липоксигеназы. Активность 15-липоксигеназы определяли по модифицированному методу (Rapoport et al., 1979). Метод основан на спектрофотометрическом определении гидроперекисей, образующихся при окислении линолевой кислоты липоксигеназой и имеющих максимум поглощения при X = 234 нм. Коэффициент экстинции гидроперекисей равен 25000 М"'см"' (Массагопе., Zadelhoff., 2000). Увеличение поглощения (ДА234/МИН) регистрировали на спектрофотометре Perkin-EImer (M-40) при температуре 2-4°С и постоянном перемешивании. Скорость окисления линолевой кислоты белковой фракцией подсчитывалась программой Origin 6,0 по коэффициенту В линейной регрессии кривой, описываемой уравнением: Y = А + ВХ, где Y - оптическая плотность, X - время реакции.

Результаты исследований и их обсуждение.

Часть 1. Исследование роли метаболитов ненасыщенных жирных кислот в гибели клеток лимфолейкоза Р388.

Известно, что опухолевые клетки изменены по метаболизму ненасыщенных жирных кислот по сравнению с нормальными. В настоящее время существуют противоречивые данные о роли продуктов циклооксигеназ и липоксигеназ в регуляции пролиферации и гибели опухолевых клеток. В этой части работы исследовали действие ингибиторов окисления ненасыщенных жирных кислот на ранней и поздней стадиях роста опухолевых клеток лимфолейкоза Р388 и продукта циклооксигеназы - ПГЕ2 на клетки лимфолейкоза Р388.

1.1. Действие общих ингибиторов метаболизма ненасыщенных жирных кислот.

На рис. 1 показано, что БФБ - ингибитор ФЛА и НДГК - общий ингибитор липоксигеназ снижают выживаемость клеток лимфолейкоза Р388 пропорционально росту логарифма концентрации ингибиторов. БФБ более

эффективен, чем НДГК. Однако при низких концентрациях ингибиторов -БФБ< 0,08 мкМ, а НДГК < 0,3 мкМ, выживаемость увеличивается по сравнению с контролем. Индометацин не влияет на выживаемость клеток вплоть до концентрации 10 мкМ: выживаемость составляла 100 ± 6% при концентрации индометацина 1 мкМ и 98 ± 3% при 10 мкМ. Полученные данные указывают на необходимость оптимального уровня продуктов липоксигеназ для выживаемости клеток лимфолейкоза Р388.

Рис 1. Действие БФБ (1), НДГК (2) и индометацина (3) на выживаемость клеток лимфолейкоза Р388.

По оси абсцисс - концентрация, мкМ. По оси ординат выживаемость, %.

Одним из признаков гибели клеток по типу апоптоза является пикнотизация хроматина и фрагментация ядра. С ростом концентрации БФБ и НДГК увеличивается доля поврежденных ядер исследуемых клеток. Так при концентрации 1 мкМ БФБ и НДГК доля поврежденных ядер составляет 34 ± 2 и 33 ± 1%, а при 5 мкМ - 57 ± 3 и 55 ± 5% соответственно.

На электрофореграмме (рис. 2) показано, что оба ингибитора при относительно небольших концентрациях вызывают межнуклеосомную фрагментацию ДНК, т.е. клетки погибают по типу апоптоза.

Рис. 2 Межнуклеосомная фрагментация ДНК клеток лимфолейкоза Р388 после действия ингибиторов метаболизма ненасыщенных жирных кислот.

1 - контроль,

2 - НДГК 1 мкМ, 3-БФБ 0,3мкМ.

Таким образом, БФБ при концентрациях больше 0,1 мкМ и НДГК при концентрациях больше 0,3 мкМ подавляют рост и вызывают апоптоз клеток

Р388, а индометации, общий ингибитор циклооксигеназ, при концентрациях 1-10 мкМ не снижает пролиферацию и не вызывает гибель клеток Р388. Полученные данные указывают на необходимость продуктов метаболизма ненасыщенных жирных кислот, а именно - липоксигеназной ветви метаболизма для роста и выживания клеток лимфолейкоза Р388.

1.2. Действие специфических ингибиторов липоксигеназ на апоптоз клеток лимфолейкоза Р388 на ранней и поздней стадиях роста клеток.

Клетки лимфолейкоза Р388 ранней стадии роста (4-суточная опухоль) находятся в логарифмической стадии роста, в то время как клетки поздней стадии роста (7-суточная опухоль) находятся в стационарной стадии роста.

На рис. 3 показано действие НДГК и специфических ингибиторов 5-ЛО и 12-ЛО на выживаемость клеток Р388 в стационарной и логарифмической стадиях роста. Видно, что все три ингибитора на разных стадиях роста в широком диапазоне концентраций (1-50 мкМ) снижают выживаемость опухолевых клеток и вызывают их гибель. Клетки в логарифмической стадии роста менее чувствительны к действию общего ингибитора липоксигеназ НДГК: ЛД50 для стационарных клеток равно 3 мкМ, в то время как для делящихся клеток ЛД50 = 10 мкМ (рис 3, А). Однако, эти клетки более чувствительны к действию ингибитора 5-ЛО - АА861 (рис 3, Б). Чувствительность клеток к байкалеину - ингибитору 12-ЛО примерно одинакова (рис 3, В).

140 120 100 80 60 40 20 0

100-, 80 60-1 40 20

100

80

60

40

0.1

10

100

20

10

100

Рис. 3. Действие общего ингибитора липоксигеназ - НДГК (А), ингибитора 5-ЛО - АА861 (б), ингибитора 12-ЛО -байкалеина (В) в стационарной (1) и логарифмической стадиях роста (2) на выживаемость клеток Р388. По оси абсцисс - выживаемость, %, По оси ординат - концентрация, мкМ.

10

100

При совместном действии 50 мкМ байкалеина и 50 мкМ АА861 выживаемость клеток логарифмической стадии роста снижалась до 8 ± 6 %, а

выживаемость клеток стационарной стадии роста - до 33 ± 7 %. Эти данные подтверждают вывод о необходимости продуктов липоксигеназ для выживания клеток лимфолейкоза Р388 и свидетельствуют о том, что эффекты ингибиторов липоксигеназ зависят от стадии роста клеток.

Излом кривых выживаемости на рисунках 3 (Б и В) можно объяснить тем, что при малых концентрациях ингибиторов (до 10-20 мкМ) подавляется деление клеток, а при увеличении концентрации (выше 10-20 мкМ) происходит их гибель. Так, процент поврежденных ядер начинает возрастать по сравнению с контролем (9 ± 2%) лишь при концентрации 20 мкМ, и при концентрации 50 мкМ доля поврежденных ядер увеличивается до 26 ± 4% для байкалеина и 36,5 ± 5% для АА861 в логарифмической стадии роста и 32 ± 4,5% и 23,5 ± 6% соответственно - в стационарной стадии роста. Доля поврежденных ядер при сочетанном действии ингибиторов одинаковой концентрации (50 мкМ) равна 84,2 ± 4% для клеток логарифмической стадии роста, в то время как для клеток стационарной стадии роста - 35 ± 4%.

По критериям выживаемости и проценту поврежденных ядер клетки логарифмической стадии роста более чувствительны к ингибированию 5-ЛО и одновременному ингибированию 5-ЛО и 12-ЛО, чем клетки в стационарной стадии роста.

Кроме пикноза и фрагментации ядер, признаком апоптоза также является уменьшение в клетках содержания ДНК за счет ее межмолекулярной фрагментации и выброса из клеток фрагментов ДНК. В норме по содержанию ДНК клеточный цикл четко разделяется на три фазы: Gl, S и G2+M. В результате гибели по типу апоптоза увеличивается количество клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК - суб^1

На рис. 4 показано действие НДГК (1 мкМ) и АА861 (50 мкМ) на распределение клеток лимфолейкоза Р388 по содержанию ДНК на разных стадиях роста. При концентрации НДГК 1 мкМ в логарифмической стадии роста доля клеток с гиподиплоидным набором ДНК не увеличивается, в то время как в стационарной — увеличивается до 30% (рис. 4, Б). Однако и на ранней и на поздней стадии роста НДГК блокирует G1-S переход, снижая пролиферативный потенциал клеток.

После действия ингибитора 5-ЛО - АА861 50 мкМ доля клеток с гиподиплоидным набором ДНК существенно больше в клетках логарифмической стадии роста (рис. 4, В), в то же время доля клеток с содержанием ДНК, соответствующей S-фазе и G2M, уменьшается, что указывает на подавление ингибитором пролиферации.

Таким образом, по этому критерию клетки логарифмической стадии роста также менее чувствительны к действию общего ингибитора НДГК и более чувствительны к действию ингибитора 5-ЛО, это позволяет заключить, что именно продукты 5-ЛО необходимы для выживания и роста клеток Р388.

Байкалеин - ингибитор 12-ЛО также блокирует переход клеток из G1 в S, одновременно увеличивая количество клеток в sub.Gl, однако действие

байкалеина на распределение клеток по содержанию ДНК на разных стадиях роста клеток Р388 также примерно одинаково.

Рис. 4 Распределение клеток по содержанию ДНК после действия общего ингибитора липоксигеназ НДГК и ингибитора 5-ЛО - АА861 на разных стадиях роста клеток. А -контроль, Б - НДГК 1 мкМ, В - АА861 50 мкМ, 1 - клетки в стационарной стадии роста, 2 - клетки в логарифмической стадии роста по оси абсцисс изображено содержание ДНК в относительных единицах, по оси ординат - количество клеток.

Таким образом, все три ингибитора вызывают апоптоз клеток Р388 и их эффект зависит от стадии роста опухоли. Надо отметить, что клетки логарифмической стадии роста оказываются менее чувствительными к

действию общего ингибитора липоксигеназы - НДГК и более чувствительными к действию ингибитора 5-ЛО, а чувствительность этих клеток к ингибитору 12-ЛО практически не меняется по сравнению с клетками стационарной стадии роста. Противоположные эффекты общего ингибитора липоксигеназ - НДГК и ингибитора 5-ЛО - АА861 на клетки логарифмической стадии роста, по-видимому, связаны с разной устойчивостью клеток к окислительному стрессу. Ранее нами было показано, что чувствительность стационарных клеток Р388 к окислительному стрессу также выше, чем клеток логарифмической стадии роста (Шапошникова и др., 2002). Поскольку продукты окисления ненасыщенных жирных кислот липоксигеназами являются гидроперекисями, способными в определённых условиях образовывать активные формы кислорода и, следовательно, окислительный стресс, то, по крайней мере, часть эффектов ингибиторов липоксигеназ может реализоваться через регуляцию окислительного стресса. В частности, известно, что для пролиферации и выживания клеток необходим определённый уровень окислительного стресса (вкоШ., 1998, Иагпзоп., 1995).

Таким образом, чувствительность клеток логарифмической стадии роста к ингибированию 5-ЛО и 12-ЛО оказывается разной.Полученные в этой части работы данные показывают, что для роста и пролиферации клеток лимфолейкоза Р388 необходимы продукты 5- и 12-ЛО. Опухолевые клетки в логарифмической стадии роста более чувствительны к отсутствию продуктов 5-ЛО.

1.3. Действие продукта циклооксигеназы - простагландина Е2 на клетки лимфолейкоза Р388.

По предыдущим данным показано, что индометацин, общий ингибитор циклооксигеназ, при концентрациях 1-10 мкМ не снижает пролиферацию и не вызывает гибель клеток Р388. Следовательно, снижение концентрации простагландинов не влияет на выживаемость клеток лимфолейкоза Р388.

Однако, при действии ингибиторов липоксигеназ большая часть ненасыщенных жирных кислот может окисляться через циклооксигееназный путь, поэтому эффект ингибиторов липоксигеназ может быть обусловлен не только недостатком продуктов липоксигеназы, но и избытком эндогенно образующихся простагландинов. Поэтому исследовали влияние продукта циклооксигеназы - простагландина Е2 (ПГЕ2) на клетки лимфолейкоза Р388. На рис. 5 показано, что ПГЕ2 в зависимости от дозы снижает выживаемость и вызывает повреждение ядер клеток лимфолейкоза. Концентрация простагландина Е2, снижающая выживаемость на 50%, равна 4 мкМ.

Таким образом увеличение концентрации простагландина Е^ от 1-10 нМ подавляет пролиферацию клеток Р388 и вызывает апоптоз. Этот факт важен, поскольку в других типах опухолевых клеток продукты как липоксигеназ, так и циклооксигеназ являются факторами выживания. Однако предпочтение лейкотриенов или простагландинов клетками зависит от типа опухоли.

Рис. 5. Действие ПГЕ2 разной концентрации на выживаемость (1) и на повреждение ядер (2) клеток лимфолейкоза Р388. По оси абсцисс - концентрация, нМ По оси ординат: слева -выживаемость, %, справа -повреждение ядер %.

По полученным данным, очевидно, что эффекты ингибиторов липоксигеназ в экспериментах могли быть обусловлены не только уменьшением в клетках лейкотриенов, но и увеличением эндогенно образующихся простагландинов.

На рис. 6 показано распределение клеток по содержанию ДНК после сочетанного действия общего ингибитора липоксигеназ - НДГК, 10 мкМ и продукта циклооксигеназы, простагландина Ег, 1 мкМ. Видно, что при совместном их действии доля апоптозных клеток резко возрастает (до 79 %), а переход клеток в фазу синтеза ДНК практически полностью блокируется. Следовательно, продукты циклооксигеназы усиливают антипролиферативный и апоптозный эффекты ингибиторов липоксигеназ в клетках Р388.

Рис. 6. Распределение клеток по содержанию ДИК после обработки клеток лимфолейкоза Р388 НДГК 10 мкМ (1) и сочетании НДГК 10 мкМ с ПГЕ2 1 мкМ (2). По оси абсцисс изображено содержание ДНК в относительных единицах, по оси ординат - количество клеток.

Таким образом, для роста и выживания клеток лимфолейкоза Р388 необходимы продукты липоксигеназ метаболизма ненасыщенных жирных

кислот. Апоптоз клеток вызывает как недостаток продуктов липоксигеназ, так и избыток продукта циклооксигеназы -ПГЕг«

Часть 2. Исследование роли метаболитов ненасыщенных жирных кислот в

гибели нормальных лимфоидных клеток.

Исследования в предыдущей части работы показали, что в регуляции пролиферации и табели опухолевых клеток лимфолейкоза Р388 задействованы продукты метаболизма ненасыщенных жирных кислот. Эти данные расширяют известные литературные данные о роли этих метаболитов в других типах опухолевых клеток. Важным вопросом в химиотерапии опухолей является избирательность действия противоопухолевых препаратов, поскольку при терапии опухолей погибают и нормальные клетки. Известно, что метаболиты ненасыщенных жирных кислот требуются для регуляции пролиферации и гибели также и нормальных клеток. Различия во внутриклеточной сигнализации, осуществляемой метаболитами ненасыщенных жирных кислот в нормальных и опухолевых клетках, могут послужить основой для повышения эффективности химиотерапии опухолей. Поэтому дальнейшей задачей явилось исследование действия ингибиторов метаболизма ненасыщенных жирных кислот на нормальные лимфоидные клетки.

2.1. Действие общих ингибиторов метаболизма ненасыщенных жирных кислот на тимоциты мыши.

Ингибиторы метаболизма ненасыщенных жирных кислот, как показано на рис. 7 и в таблице 1, не вызывают гибель нормальных клеток даже при дозах, превышающих те, при которых уже наблюдается апоптоз опухолевых клеток лимфолейкоза Р388. По критериям подсчета процента поврежденных ядер (рис. 7) и доли клеток с гаподиплоидным содержанием ДНК (табл. 1) воздействие этих ингибиторов на тимоциты in vitro сравнимо со значением в контроле. Более того, блокатор ФЛАг - бромфенацилбромид снижает долю клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК по сравнению с контролем практически до нуля.

Рис. 7. Действие БФБ 10 мкМ (2), НДГК 10 мкМ (3), индометацина 10 мкМ (4) на тимоциты мыши по критерию повреждения ядер через 6 час инкубации in vitro.

1 - контроль. По оси ординат - доля клеток с поврежденными ядрам.

Таким образом, в отличие от опухолевых лимфоидных клеток ингибиторы метаболизма ненасыщенных жирных кислот не вызывают гибель нормальных лимфоидных клеток - тимоцитов мыши. Кроме того, снижение

уровня апоптозных клеток в контроле, которые неизбежно присутствуют в постановке опытов in vitro, после действия БФБ, указывает на то, что продукты окислительного метаболизма ненасыщенных жирных кислот могут участвовать в гибели тимоцитов. Для изучения вопроса о роли метаболитов ненасыщенных жирных кислот в гибели тимоцитов исследовали их участие в радиационной гибели тимоцитов. Известно, что после облучения происходит массовая гибель тимусных клеток. Так, при радиотерапии опухолей, например, ослабевает иммунная система организма. Этот эффект является побочным и нежелательным действием радиотерапии опухолей. Мессенджерами гибели тимоцитов, по-видимому, могут быть и метаболиты ненасыщенных жирных кислот.

Таблица 1. Действие БФБ (10 мкМ), НДГК (10 мкМ) и индометацина (10 мкМ) на распределение тимоцитов мыши по содержанию ДНК (n = 5).

Условия Процент клеток с содержанием ДНК

cy6Gi G, S g2m

Контроль И ±2 65 ±4 15 ±3 8 ±0,5

БФБ(ЮмкМ) 0,5 ±4 76+1 12,5 ±2 11 ±2

НДПС(ЮмкМ) 15±3 65 ±3 13 ±2 7± 1

Индо. (ЮмкМ) 14 ±0,5 62 ±0,5 15 ±3 9±2

2.2. Исследование роли метаболитов ненасыщенных жирных кислот в радиационной гибели тимоцитов.

Эту работу проводили на тимоцитах крыс, поскольку, тимус крыс является более удобным объектом для исследования ввиду большей его массы и соответственно - количества клеток (109 клеток из тимуса крысы и 107 клеток из тимуса мыши), а также в тимусе крыс гораздо меньшая примесь эритроцитов. Присутствие эритроцитов может искажать исследование, например, определение активности липоксигеназы. Для сравнения тимоцитов двух видов грызунов были проведены эксперименты по действию ингибиторов метаболизма ненасыщенных жирных кислот также на тимоциты крыс. Данные, полученные на тимоцитах крыс в целом не отличаются от данных полученных на мышиных тимоцитах - ингибитор ФЛА2 - БФБ, общий ингибитор липоксигеназ - НДГК и общий ингибитор циклооксигеназ - индометацин не вызывают гибель тимоцитов крысы. Однако НДГК (10 мкМ) снижает гибель тимоцитов, вызванную облучением, а БФБ (10 мкМ) снимает радиацианную гибель до уровня контроля - рис. 8. Индометацин и ингибитор эпоксигеназы -проадифен не влияли на радиационный апоптоз тимоцитов.

Рис. 8. Действие ингибиторов метаболизма ненасыщенных жирных кислот на облученные тимоциты крыс по критерию повреждения ядер через 6 час инкубации in vitro. 1 -контроль, 2 - 6 Гр, 3 - 6 Гр + БФБ 10 мкМ, 4 - 6 Гр + НДГК, 10 мкМ,

5 - бГр + ивдометацин, 10 мкМ,

6 - 6 Гр + проадифен, 10 мкМ

По оси ординат - доля клеток с поврежденными ядрами в процентах.

На электрофореграмме (рис. 9) показано отсутствие фрагментации ДНК после действия БФБ на облученные тимоциты. Таким образом, блокирование высвобождения ненасыщенных жирных кислот из фосфолипидов полностью снимает апоптоз тимоцитов, облученных в дозе 6 Гр.

Рис. 9 Межнуклеосомная фрагментация ДНК контрольных и облученных тимоцитов крысы через 6 час. инкубации in vitro. 1 - контроль

2-6Гр

3-6Гр + БФБ10мкМ.

Полученные данные указывают на то, что для инициации или реализации радиационного апоптоза тимоцитов необходимы продукты ненасыщенных жирных кислот, и по всей видимости, - продукты липоксигеназной ветви их окисления.

Поскольку в первой части этой работы было показано, что именно эти продукты необходимы для пролиферации и выживаемости опухолевых клеток лимфолейкоза Р388, исследование участия продуктов липоксигеназ в гибели нормальных лимфоидных клеток представляет интерес в плане повышения избирательности действия противоопухолевых препаратов. Поэтому, следующей задачей было изучение вклада каждой из липоксигеназ в радиационный апоптоз тимоцитов. Показано, что ни байкалеин - ингибитор 12-ЛО, ни АА861 - ингибитор 5-ЛО не снижали радиационный апоптоз тимоцитов, и даже при небольших концентрациях проявляли тенденцию к

усилению повреждения ядер и увеличению клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК, особенно в облученных клетках. На рис. 10 представлены данные по распределению клеток по содержанию ДНК в разных фазах клеточного цикла в контроле, после облучения и обработки облученных тимоцитов ингибиторами 5- и 12-ЛО.

Специфические ингибиторы 5-липоксигеназы и 12-липоксигеназы по всем критериям повреждения клеток не только не снижают, но даже увеличивают радиационный апоптоз тимоцитов. В то же время общий ингибитор липоксигеназ - НДГК снижает радиационный апоптоз тимоцитов. Эти факты позволяют предположить, что ключевым ферментом в радиационном апоптозе тимоцитов может быть 15-липоксигеназа, а не 5- и 12-липоксигеназы. По-видимому, при подавлении 5- и 12-липоксигеназ большая часть субстрата окисляется 15-липоксигеназой и количество продукта 15-липоксигеназы увеличивается, с чем и связано усиление радиационного апоптоза тимоцитов специфическими ингибиторами 5- и 12-липоксигеназ.

Рис 10. Распределение клеток по содержанию ДНК в контроле (1), после облучения в дозе 6 Гр (2) и обработки облученных тимоцитов байкалеином 10 мкМ (3)и АА86120 мкМ(4).

по оси абсцисс - содержание ДНК в относительных единицах, по оси ординат -количество клеток.

2 3. Исследование действия продукта 15-липоксигеназы на тимоциты крыс in vitro.

Специфический ингибитор 15-липоксигеназы на сегодняшний момент не известен, поэтому для подтверждения роли 15-липоксигеназы в радиационном апоптозе тимоцитов мы использовали другой подход: исследовали возможность индукции апоптоза в тимоцитах продуктом 15-липоксигеназы - 15(S)HETE. При действии 15(S)HETE наблюдается дозозависимое увеличение процента поврежденных ядер и в дозах 1 мкМ и 10 мкМ - небольшое, но достоверное увеличение повреждения ядер (рис. 11). Поскольку 15(S)HETE быстро распадается в физиологических условиях и адсорбируется белками сыворотки

Рис. 11. Влияние продукта 15-липоксигеназы - 15(S)HETE на тимоциты по критерию повреждения ядер через 6 час инкубации in vitro. 1 - контроль. 2-15(S)HETE0,1MKM 3 - 15(S)IffiTE 1 мкМ 4-15(S)HETE10MKM По оси ординат - повреждение ядер, %.

0 12 3 4

15(S)HETE является перекисным продуктом 15-липоксиигеназы и может участвовать в окислительно-восстановительных реакциях клетки, и его эффект может быть неспецифичным. В работе показано, что 15(S)HETE вызывает апоптоз тимоцитов при концентрациях, при которых перекись водорода не вызывает апоптоз тимоцитов.

Таким образом, продукт 15-липоксигеназы 15(S)HETE способен инициировать программируемую гибель в тимоцитах и работает как внутриклеточный мессенджер в гибели тимоцитов.

Совокупность полученных результатов этой части работы позволяет сделать вывод, что, по всей видимости, ионизирующая радиация активирует 15-липоксигеназу, продукт которой участвует в инициации или реализации апоптоза тимоцитов. По литературным данным, продукты 15-ЛО инициируют апоптоз в разных типах клеток (Maccarrone, Ranalli et al., 2000, Sandstrom et al., 1995). Активация липоксигеназы после облучения может быть обусловлена как увеличением её количества за счёт экспрессии гена и синтеза, так и непосредственной активацией существующего фермента. Изучение активности 15-ЛО в норме и после облучения явилось следующей задачей исследования.

2.4. Исследование активности 15-липоксигеназы в контрольных и облученных тимоцитах.

Клетки облучали in vitro и через разные сроки инкубации после облучения выделяли белковую фракцию, содержащую 15-ЛО. Метод определения активности липоксигеназ был отработан и апробирован на разных клетках. Для определения активности 15-ЛО в тимоцитах в кювету с реакционной смесью всегда добавляли одинаковую концентрацию общего белка - 50 мкг/мл. После того, как в реакционную смесь добавляли фракцию выделенных из тимоцитов белков, добавляли далее специфический субстрат 15-ЛО - линолевую кислоту, и спектрофотометрически записывали динамику изменения гидроперекисей с течением времени реакции.

На рис. 12 показана кинетика окисления линолевой кислоты белковой фракцией, выделенной из облученных тимоцитов через разные сроки инкубации клеток после облучения в дозе 6 Гр. Графики построены за вычетом значений окисления линолевой кислоты белковой фракцией выделенной из необлученных клеток - контрольных значений.

^ 5-)

V = 0,82279 мкМ/мн

6 7 В

у

V = 0,63076 мкМ/мн

-1 0 1

Рис. 12. Кинетика окисления линолевой кислоты белковой фракцией, выделенной из облученных тимоцитов сразу после облучения (А), через 30 минут после облучения (Б) и через 1 час после облучения клеток n vitro (В), по оси абсцисс - время реакции (мин), по оси ординат - концентрация перекисей (мкМ)

-1 012345678

Активация липоксигеназы облучением транзитная, поскольку она снижается со временем инкубации тимоцитов in vitro, и в течение одного часа активация 15-ЛО снижается в два раза.

Как видно из графиков, кинетика образования перекисей липоксигеназой не линейна, что обусловлено ее инактивацией промежуточными продуктами окисления.

Полученные данные показывают, что облучение сразу активирует существующую в тимоцитах липоксигеназу, которая в течение 1,5-2 часов инактивируется в процессе функционирования собственным промежуточным продуктом. При облучении не активируется синтез липоксигеназы, поскольку в сроки 2-4 ч, когда может быть увеличено количество липоксигеназы в клетках за счёт её синтеза, увеличения активности не наблюдается.

Выводы:

1. Ингибитор ФЛА - БФБ вызывает апоптоз в клетках лимфолейкоза Р388.

2. Общий ингибитор липоксигеназ НДГК и специфические ингибиторы 5-липоксигеназы - АА861 и 12-липоксигеназы - байкалеин снижают выживаемость клеток лимфолейкоза Р388 и вызывают апоптоз.

3. Клетки в логарифмической стадии роста Р388 более чувствительны к ингибитору 5-липоксигеназы - АА861 и менее чувствительны - к общему ингибитору липоксигеназ.

4. Избыток простагландинов подавляет пролиферацию клеток Р388 и вызывает их гибель по типу апоптоза.

5. Ингибиторы, окислительного метаболизма ненасыщенных жирных кислот (БФБ, НДГК, индометацин), не вызывают гибель тимоцитов.

6. Ингибитор - БФБ и общий ингибитор липоксигеназ - НДГК подавляют радиационный апоптоз тимоцитов.

7. Специфические ингибиторы 5-липоксигеназы-АА861 и 12-липоксигеназы - байкалеин не подавляют радиационный апоптоз тимоцитов, а даже его усиливают.

8. Продукт 15-липоксигеназы - 15(8)НЕТЕ вызывает апоптоз тимоцитов.

9. Показана активация облучением 15-липоксигеназы в тимоцитах.

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1. Korystov, Yu.N., Shaposhnikova, V.V., Levitman, A.A., Kudryavtsev, A.A., Kublik, L.N., Narimanov A.A., Orlova O.E. The effect of arachidonic acid metabolism on proliferation and death of tumor cells. 1998, FEBS Letters, 431,224-226.

2. Шапошникова В.В., Кублик Л.Н., Нариманов А.А, Левитман М.Х, Орлова O.E. (Гриченко O.E)., Кудрявцев А.А., Лещенко В.В., Корыстов Ю.Н. Подавление роста и индукция гибели опухолевых клеток ингибиторами фосфолипазы А и липоксигеназы. Известия АН. Серия биологическая, 2001,№2,стр.249-252.

3. Шапошникова В.В., Орлова О.Е (Гриченко О.Е)., Кудрявцев А.А., Корыстов Ю.Н. Изменение чувствительности клеток лимфолейкоза Р388 к окислительному стрессу и платидиаму по мере роста опухоли. Известия АН. Серия биологическая, 2002, № 6, стр.659-662.

4. Гриченко О.Е., Шапошникова В.В., Левитман MX, Кудрявцев А.А., Корыстов Ю.Н. Исследование роли липоксигеназ в радиационном апоптозе тимоцитов. Ингибиторный анализ. Радиационная биология. Радиоэкология, 2004, т.44, № 1, стр. 27-31.

5. Гриченко О.Е., Шапошникова В.В., Кудрявцев А.А., Корыстов Ю.Н. Апоптоз в клетках лимфолейкоза Р388 при действии специфических ингибиторов 5- и 12-липоксигеназ и продукта циклооксигеназы -простагландина Е2. Известия АН. Серия биологическая, 2004, № 3, стр. 16.

6. Гриченко О.Е, Пушин А.С, Шапошникова В.В, Левитман М.Х., Корыстов Ю.Н. Исследование активности 15-липоксигеназы в тимоцитах после облучения. Известия АН. Серия биологическая, (принято в печать).

7. Шапошникова В.В., Кублик Л.Н., Нариманов А.А., Левитман Л.Х., Орлова О.Е (Гриченко О.Е)., Кудрявцев А.А., Корыстов Ю.Н. Подавление роста и индукция гибели опухолевых клеток ингибиторами фосфолипазы А2 и липоксигеназы. Тезисы Международной конф. «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 21-25 сентября 1998 г, стр. 255.

8. Орлова О.Е.(Гриченко О.Е). Роль 15-липоксигеназы в радиационном апоптозе тимоцитов. Тезисы конф. «Горизонты физико-химической биологии», Пущино, 2000 г, стр.300.

9. Орлова О.Е (Гриченко О.Е), Шапошникова В.В., Корыстов Ю.Н. Роль 15-липоксигеназы в радиационном апоптозе тимоцитов. Тезисы конф. «Клеточная биология на пороге XXI века», Санкт-Петербург, Цитология, 2001, №4, стр.375.

10.Шапошникова В.В., Орлова О.Е. (Гриченко О.Е), Левитман М.Х., Кублик Л.Н., Корыстов Ю.Н. Роль продуктов метаболизма арахидоновой кислоты в регуляции пролиферации и гибели опухолевых клеток. Тезисы конф. «Клеточная биология на пороге XXI века», Санкт-Петербург, Цитология, 2001,№4,С413.

П.Шапошникова В.В., Гриченко О.Е., Корыстов Ю.Н. Регуляция апоптоза метаболитами арахидоновой кислоты. Тезисы конф. «От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям», Пущино, 24-26 октября 2001 г, стр.112.

12.Гриченко О.Е. Активация 15-липоксигеназы при радиационном апоптозе тимоцитов. Тезисы VIII Путинской конференции Молодых ученых «Биология - наука XXI века», г.Пущино, 17-21 мая 2004 г.

Принято к исполнению 20/05/2004 Исполнено 20/05/2004

Заказ № 221 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095)747-64-70 (095)318-40-68 www autoreferat га

i - 97 19

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гриченко, Ольга Евгеньевна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

ГЛАВА 1. Роль метаболитов ненасыщенных жирных кислот во внутриклеточной сигнализации.

1.1. Основные представления о внутриклеточной сигнализации.

1.1.1. Внутриклеточные посредники передачи сигнала.

1.1.2. МАР-киназы в передаче внутриклеточного сигнала.

1.2. ФЛАг и основные пути окисления арахидоновой и линолевой кислот.

1.2.1 ФЛАг и регуляция ее активности.

1.2.2.0сновные пути ферментативного окисления арахидоновой и линолевой кислот.

1.2.3. Участие арахидоновой кислоты и продуктов окислительного метаболизма ненасыщенных жирных кислот воо внутриклеточной сигналиизации.

1.3. Роль ненасыщенных жирных кислот в регуляции основных клеточных функций.

1.3.1.Участие продуктов окисления ненасыщенных жирных кислот в воспалительных реакциях.

1.3.2. Роль ненасыщенных жирных кислот и продуктов их окисления в пролиферации и гибели клеток.

Резюме.

ГЛАВА 2. Метаболизм ненасыщенных жирных кислот в опухолевых клетках.

2.1. Роль продуктов окисления ненасыщенных жирных кислот в регуляции пролиферации и дифференцировки опухолевых клеток.

2.2. Роль продуктов окисления ненасыщенных жирных кислот в гибели опухолевых клеток.

Резюме.

ГЛАВА 3. Радиационный апоптоз тимоцитов.

3.1. Апоптоз тимоцитов в норме.

3.2. Апоптоз тимоцитов после облучения (феноменология).

3.3. О некоторых аспектах генной регуляции радиационного апоптоза.

3.4. О внутриклеточной сигнализации при радиационном апоптозе тимоцитов.

3.5. Роль мембран в радиационном апоптозе тимоцитов.

Резюме.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. Материалы и методы исследования

1. Объект исследования.

2. Ингибиторный анализ.

3. Методы определения апоптоза.

4. Выделение белка из тимоцитов.

5. Выделение 15-липоксигеназы из ретикулоцитов.

6. Определение активности 15-липоксигеназы.

Результаты исследований и их обсуждение.

Часть 1. Исследование метаболизма ненасыщенных жирных кислот в гибели опухолевых клеток лимфолейкоза Р

1.1. Исследование действия общих ингибиторов метаболизма ненасыщенных жирных кислот на клетки лимфолейкоза Р388.

1.2. Исследование действия специфических ингибиторов липоксигеназ на клетки лимфолейкоза РЗ 88.

1.3. Исследование действия продукта циклооксигеназы - простагландина Е2 на клетки лимфолейкоза Р388.

Резюме.

Часть 2. Исследование роли метаболитов ненасыщенных жирных кислот в гибели нормальных лимфоидных клеток.

2.1. Исследование действия неспецифических ингибиторов метаболизма ненасыщенных жирных кислот на тимоциты.

2.2. Исследование роли метаболитов ненасыщенных жирных кислот в радиационной гибели тимоцитов.

2.3. Исследование действия продукта 15-липоксигеназы на интактные тимоциты крыс in vitro.

Резюме.

Часть 3. Исследование активности 15-JIO при радиационном апоптозе тимоцитов.

3.1. Отработка оптимальных условий измерения активности 15-липоксигеназы.

3.2. Исследование активности 15-липоксигеназы спленоцитов крысы.

3.3. Исследование активности 15-липоксигеназы в интактных и облученных тимоцитах.

Резюме.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование роли метаболитов ненасыщенных жирных кислот в регуляции пролиферации и гибели клеток"

Межклеточная и внутриклеточная сигнализация участвует в регуляции гибели, пролиферации и дифференцировки клеток в организме. Показано, что существует несколько основных сигнальных систем, специфичных не только для типа клеток, но и для сигналов. Это означает, что один и тот же сигнал может включать в разных клетках разные системы сигнализации и приводить к разным клеточным ответам. Известно также, что многие мутации, приводящие к трансформации клеток, являются мутациями генов сигнализации, что позволяет трансформированной клетке не реагировать на контролирующие сигналы организма и размножаться до образования макроскопических опухолей. В идеале, при химиотерапии опухолей препарат должен вызывать гибель опухолевых клеток и не действовать на нормальные клетки. Этот идеал, однако, пока не реализован и существует мнение, что он в принципе невозможен. Традиционная химиотерапия опухолей базируется, в основном, на селективном поражении делящихся клеток и при этом вместе с опухолевыми клетками погибают также нормальные делящиеся клетки, за счёт которых осуществляется регенерация крови, иммунной системы и всех эпителиев. В результате при химиотерапии происходит нарушение кроветворения, иммунитета и поражение различных эпителиев.

Имеются отдельные и противоречивые данные о том, что в регуляции пролиферации и гибели опухолевых клеток задействованы метаболиты ненасыщенных жирных кислот. Так, например, лейкотриены - продукты 5-ЛО стимулируют пролиферацию лейкемических клеток, а в клетках эритролейкемии, нейробластомы и меланомы наработка этих продуктов увеличивается во время программируемой гибели клеток. Показано также, что в некоторых типах опухолей изменена, по сравнению с нормальными тканями сигнализация метаболитами ненасыщенных жирных кислот. В частности для деления и выживания опухолевых клеток эпителиального происхождения (рак толстой кишки, предстательной железы) необходимы продукты циклооксигеназ, в то время как в нормальных клетках простагландины являются агентами, участвующими в воспалительных реакциях клетки. Поддержание концентрации этих продуктов на необходимом высоком уровне в опухолевых клетках обеспечивается благодаря экспрессии дополнительной циклооксигеназы: циклооксигеназы 2. Такое различие в сигнализации между нормальными и опухолевыми клетками можно использовать для настоящей селективной химиотерапии. И действительно, ингибиторы циклооксигеназ подавляют рост этих опухолей, а эпидемиологические исследования показывают снижение частоты рака этих локализаций у людей, постоянно принимающих такой ингибитор циклооксигеназ, как аспирин.

Другим основным способом терапии опухолей является радиотерапия. При радиотерапии также повреждаются не только опухолевые, но и нормальные клетки. Особенно чувствительны к радиации тимоциты, при дифференцировке которых формируется Т-клеточный иммунитет. Кроме того, при облучении могут активироваться события, связанные с метаболизмом ненасыщенных жирных кислот. Поэтому кроме изучения различий в сигнализации нормальных и опухолевых клеток в решении вопросов терапии опухолей, важно и исследование механизмов гибели нормальных клеток, в частности механизма радиационного апоптоза иммунных клеток. Известны многие мессенджеры и ферменты, опосредующие радиационную гибель клеток, однако данные о роли метаболитов ненасыщенных жирных кислот в радиационной гибели нормальных клеток отсутствуют.

Целью настоящей работы явилось исследование роли внутриклеточной сигнализации, осуществляемой метаболитами ненасыщенных жирных кислот, в регуляции пролиферации и гибели опухолевых и нормальных лимфоидных клеток.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Оценить роль продуктов различных липоксигеназ в регуляции пролиферации и гибели клеток лимфолейкоза Р388 на стационарной и логарифмической стадиях роста.

2. Исследовать роль продуктов циклооксигеназ в регуляции пролиферации и гибели клеток лимфолейкоза Р388.

3. Исследовать действие ингибиторов метаболизма ненасыщенных жирных кислот на тимоциты.

4. Оценить участие 5-липоксигеназы, 12-липоксигеназы и 15-липоксигеназы в радиационном апоптозе тимоцитов методом ингибиторного анализа.

5. Изучить роль продуктов 15-липоксигеназы в радиационном апоптозе тимоцитов.

6. Изучить активность 15-липоксигеназы тимоцитов в норме и после облучения и оценить ее возможную роль в регуляции радиационного апоптоза.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Гриченко, Ольга Евгеньевна

ВЫВОДЫ:

1. Ингибитор ФЛАг - БФБ вызывает апоптоз в клетках лимфолейкоза РЗ88.

2. Общий ингибитор липоксигеназ НДГК и специфические ингибиторы 5-липоксигеназы - АА861 и 12-липоксигеназы — байкалеин снижают выживаемость клеток лимфолейкоза Р388 и вызывают апоптоз.

3. Клетки Р388 в логарифмической стадии роста более чувствительны к ингибитору 5-липоксигеназы - АА861 и менее чувствительны к общему ингибитору липоксигеназ.

4. Избыток простагландинов подавляет пролиферацию клеток Р388 и вызывает их гибель по типу апоптоза.

5. Ингибиторы окислительного метаболизма ненасыщенных жирных кислот (БФБ, НДГК, индометацин) не вызывают гибель тимоцитов.

6. Ингибитор ФЛАг - БФБ и общий ингибитор липоксигеназ - НДГК подавляют радиационный апоптоз тимоцитов.

7. Специфические ингибиторы 5-липоксигеназы — АА861 и 12-липоксигеназы — байкалеин не подавляют радиационный апоптоз тимоцитов, а даже его усиливают.

8. Продукт 15-липоксигеназы 15-НЕТЕ вызывает апоптоз тимоцитов.

9. Показана активация облучением 15-липоксигеназы в тимоцитах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

К прогрессивному опухолевому росту приводят изменения важнейших сигнальных путей, участвующих в регуляции пролиферации и гибели клеток. Известно, что клетки злокачественных тканей отличаются от нормальных клеток по метаболизму липидов. Однако, в литературе существуют достаточно противоречивые данные о роли продуктов ферментативного окисления ненасыщенных жирных кислот в пролиферации и гибели опухолевых клеток. Факторами выживания для опухолевых клеток могут являться как продукты окисления ненасыщенных жирных кислот липоксигеназами, так и циклооксигеназами. Тип окисления ненасыщенных жирных кислот в клетке специфичен и зависит от характерного набора ферментов клетки. Так, клетки эпителиального происхождения (карциномы) продуцируют больше циклооксигеназных продуктов, и в ответ на обработку ингибитором циклооксигеназ — индометацином рост карцином подавляется. В настоящей работе показано, что для выживания и пролиферации клеток лимфолейкоза Р388 необходимы продукты липоксигеназ, причем на разных стадиях роста меняется их вклад в пролиферацию - продукты 5-липоксигеназы оказываются важнее в стадии логарифмического роста клеток. Подавление 12-липоксигеназы также снижает выживаемость клеток лимфолейкоза Р388 и вызывает апоптоз, однако этот эффект не зависит от стадии роста клеток in vivo. Стационарные клетки более чувствительны к общему ингибитору липоксигеназ - НДГК. Различная чувствительность клеток к НДГК, по-видимому, отражает разный вклад, не только 5-, но и 15-липоксигеназы в регуляции пролиферации и гибели клеток лимфолейкоза Р388. Известно, что стационарные клетки более чувствительны к окислительному стрессу, чем клетки логарифмической стадии роста (Шапошникова, 2002) и это может быть одной из причин их большей чувствительности к действию НДГК. Возможно, что концентрации НДГК (1-10 мкМ), не являющиеся токсичными для клеток ранней стадии роста, являются токсичными для клеток поздней (стационарной) стадии роста.

Апоптоз клеток лимфолейкоза Р388 вызывает не только недостаток продуктов липоксигеназ, но и избыток продуктов циклооксигеназ. Показано, что простагландин Ег в малых концентрациях вызывает апоптоз в клетках и усиливает антипролиферативный и апоптозный эффекты НДГК. Таким образом, апоптоз клеток лимфолейкоза Р388 при ингибировании липоксигеназ мог быть обусловлен не только недостатком продуктов липоксигеназ, но и избытком эндогенно образующихся простагландинов.

Таким образом, данные, полученные в работе согласуются с литературными о необходимости продуктов окислительного метаболизма ненасыщенных жирных для роста опухолей. В отличие от клеток карцином, требующих для роста продукты циклооксигеназ, пролиферация и выживание лейкозных клеток стимулируется продуктами липоксигеназ. Одной из проблем химиотерапии является избирательность действия противоопухолевых препаратов. Обычно химиотерапевтические препараты повреждают и нормальные клетки, снижают иммунный статус организма, приводят к нарушению кроветворения и всех эпителиев. Поэтому важно найти такие препараты, которые повреждали бы только опухолевые клетки. Возможным источником для получения таких селективных препаратов могут быть ингибиторы окислительного метаболизма ненасыщенных жирных кислот. Метаболизм ненасыщенных жирных кислот в нормальных клетках изучен достаточно широко. Известно, что метаболиты ненасыщенных жирных кислот участвуют в воспалении клеток и опосредуют реакции гибели клеток после воспаления, но также могут являться митогенами, стимулирующими клеточный рост.

Роль метаболитов ненасыщенных жирных кислот в регуляции пролиферации и гибели нормальных лимфоидных клеток исследовали на тимоцитах. Показано, что ингибитор ФЛАг - БФБ и общие ингибиторы липоксигеназ - НДГК и циклооксигеназ - индометацин не влияют на выживаемость тимоцитов мыши, более того БФБ снижает уровень апоптозных клеток в контроле при инкубации in vitro. Это различие в реакции опухолевых и нормальных клеток на действие ингибиторов метаболизма ненасыщенных жирных кислот может стать полезным в практике для создания противоопухолевых препаратов. Кроме того, эти данные указывают и на то, что метаболиты ненасыщенных жирных кислот в нормальных лимфоидных клетках могут быть необходимы для их гибели. Для исследования роли метаболитов ненасыщенных жирных кислот в гибели тимоцитов, их гибель индуцировали ионизирующей радиацией. Радиотерапия используется для лечения опухолей, и известно, что после действия радиации, ослабевает иммунная система организма. Это связано с гибелью иммунокомпетентных клеток в результате облучения, что является побочным эффектом радиотерапии. Нами показано, что БФБ и общий ингибитор липоксигеназ, НДГК подавляют радиационный апоптоз тимоцитов. В тоже время, специфические ингибиторы 5- и 12-липоксигеназ не снижают и даже усиливают радиационный апоптоз тимоцитов. Это обстоятельство может быть связано с увеличенной наработкой продуктов 15-ЛО при ингибировании 5- и 12-ЛО. В литературе показано, что при ингибировании одних липоксигеназ, увеличивается синтез продуктов другими, что и должно быть при общем субстрате (гл.1 и гл. 2). И действительно, в диссертации показано, что продукты 15-ЛО - 15-НЕТЕ способны инициировать апоптоз в тимоцитах in vitro.

Исследование активности 15-ЛО в интактных и облученных тимоцитах показало, что активность 15-ЛО сразу облучения возрастает. Активация 15-ЛО транзитная и снижается с течением времени инкубации клеток после облучения. По всей видимости, облучение не активирует синтез 15-ЛО, поскольку на период 2-4 часа активность 15-ЛО после облучения не возрастает и даже сравнима с контрольным значением (необлученные клетки). Таким образом, облучение активирует существующую 15-ЛО, по-видимому, перекисями, образующимися после облучения.

Таким образом, в работе показано, что продукты липоксигеназ необходимы для пролиферации и роста опухолевых клеток лимфолейкоза Р388, и участвуют в гибели нормальных лимфоидных клеток. В нормальных тимоцитах эффект продуктов липоксигеназы (15-ЛО) противоположный: они требуются для гибели, инициированной облучением. Полученные данные могут послужить основой для селективной химиотерапии лейкозов с помощью ингибиторов липоксигеназ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гриченко, Ольга Евгеньевна, Пущино

1. Епифанова О.И. Лекции о клеточном цикле. «КМК» издание, Москва, 2003.

2. Добровинская О.Р., Корыстов Ю.Н., Шапошникова В.В., Эйдус Л.Х. Исследование гибели тимоцитов при инкубации in vitro: роль активных форм кислорода. // Иммуннология, 1989, № 2, стр. 20-22.

3. Зенков Н.К. и Менщикова Е.Б. Активированные кислородные метаболиты в биологических системах. // Усп. соврем, биол., 1993; 113,286-292.

4. Крутецкая З.И., Лебедев О.Е. Арахидоновая кислота и ее продукты: пути образования и метаболизма в клетках. Цитология, 1993; Т. 35, №11/12,3-35.

5. Лаптева-Попова М.С., Губин В.А., Соколов М.Ф., Александрова М.Ф. Клетки крови при лучевой болезни. М.: Медгиз, 1959. 81 с.

6. Матышевская О.П., Пастух В.Н, Солодушко В.А. Ингибирование липоксигеназной активности снижает индуцированную радиацией фрагментацию ДНК лимфоцитов. // Радиационная биология. Радиоэкология, 1999, том 39, № 2-3, стр.282-286.

7. Мешкова Н.П., Северина С.Е. Практикум по биохимии. М: МГУ, 1979.430 с.

8. Михайлов В.Ф., Водолдазская Н.А и Ракова И.А. Ранние изменения мембран клеточной поверхности у крыс после ощего воздействия нейтронов и у-излучения. // радиобиология, 1986; 26,253-256.

9. Нелипович П.А., Кулагина Т.П., Уманский С.Р. // Радиобиология, 1984, т. 24, № 4, стр. 435

10. Робинсон М.В., Труфакин В.А. Апоптоз клеток иммунной системы. // Успехи современной биологии, 1991; т.З, стр. 246-259.

11. Рыскулова С.Т. // Радиационная биология плазматических мембран. 1986;. Энергооатомиздат, М.

12. Турпаев К.Г. Активные формы кислорода и регуляция экспрессии генов. // Биохимия. 2002; т. 67, вып.З, стр. 339-352.

13. Шапошникова В.В., Орлова О.Е (Гриченко О.Е), Кудрявцев А.А., Корыстов Ю.Н. Изменение чувствительности клеток лимфолейкоза Р388 к окислительному стрессу и платидиаму по мере роста опухоли. // Известия АН. Серия биологическая, 2002, № 6, стр. 659-662

14. Ярилин А.А., Буланова Е.Г., Шарова Н.И., Будагян В.М. Апоптоз и развитие тимоцитов (эпиттелиальные клетки как индукторы апоптоза тимоцитов). Известия АН Серия биоллогическая., 1998, № 2, стр. 142-150.

15. Ярилин А.А. Радиация и иммунитет. Вмешательство ионизирующих излучений в ключевые иммунные процессы. // Радиационная биология. Радиоэкология, 1999, т.39, № 1, стр.181-189.

16. Akiyama, Т., Ishida, J., Nakagawa, S., Ogawara, H., Watanabe, S. I., Itoh, N., Shibuya, M., Fukami, Y. Genistein, a specific inhibitor of tyrosine-specific protein kinases. // J. Biol. Chem., 1987; 262,5592-5595.

17. Alles, A., Alley, K., Barret, J.C. et al. Apoptosis: a general comment // FASEB J. 1991. V.5. p.2127.

18. Aoshima, H., Satoh, Т., Sakai, N., Yamada,M., Enokido,Y., Ikeuchi, Т., Hatanaka, H. Generation of free radicals during lipid hydroperoxide-triggered apoptosis in PC12h cells. // Biochim.Biophys.Acta., 1997; 1345, 35^12.

19. Ara, G, Teicher, B.A. Cyclooxygenase and lipoxygenase inhibitors in cancer therapy. // Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids, 1996; 54:3-16.

20. Ashwell, J.D., Schwartz, R.H., Mitchell, J.B and Russo, A. Effect of gamma radiation on resting B-lymphocytes. Oxygen-dependent damage to the plasma membrane results in increasing permeability and cell enlargement. // J.Immunol., 1986; 136,3649-3656.

21. Averdunk, R., Gunther, T. Protein kinase С in cytosol and cell membranes of concanavalin A-stimulated rat thymocytes. // FEBS Lett., 1986; 195, № 1-2,357-361.

22. Bailey, J.M., Bryant, R.W., Low, C.E., Pupillo, M.B and Vanderhoek, J.Y. Regulation of T-Lymphocyte Mitogenesis by the Leukocyte Product 15-Hydroxy-eicosatetraenoic acid (15-HETE). // Cell Immunology, 1982,67,112-120.

23. Balazy, M. Trans-arachidonic acid: new mediators of inflammation. // J. Physiol. Pharmacol., 2000; 51,4, 597-607.

24. Begin, M.E., Greg, Ells., Undurti, N.Das., David F.Horrobin. Differential killing of human carcinoma cells supplemented with n-3 and n-6 polyunsaturated fatty acids. // JNCI, 1986; V.77, No.5.

25. Ben-Efraim, S, Bonta, I.L. Modulation of Antitumour Activity of Macrophages by Regulation of Eicosanoids and Cytokine Production. // Int J Immunopharmacol., 1994 May-Jun;16(5-6):397-9.

26. Bevan, S., Wood, J.N. Arachidonic acid metabolites as second messengers. // Nature, 1987; V.328, p. 20.

27. Brady, H.J.M., Gil-Gormez, G., Kirberg, J. and Berns, A.J.M. Bax a perturbs T cell development and affects cell cycle entry of T cells. // EMBO J., 1996; 15, 6991-7001.

28. Brash, A.R. Arachidonic acid as a bioactive molecule. // J.Clin. Invest., 2001; 107, 1339 — 1345.

29. Brawley, O.W. and Thompson, I.M. Chemoprevention of prostate cancer.// Urology, 1994; 43, 594-599.

30. Brinckmann, R., Topp, M.S., Zalan, I., Heydeck, D., Ludwig, P., Kuhn, H., Berdel, W. and Habenicht, A.J.R. //Biochem. J., 1996; 318,305-312.

31. Brune, K. Safety of anti-inflammatory treatment-new ways of thinking. // Rheumatology (Oxford). 2004; 1:116-120.

32. Burdon, R.H. Superoxide and hydrogen peroxide in relation to mammalian cell proliferation. // Free Radic. Biol. Med., 1995; 18, 775 794.

33. Buskens, C.J, Ristimaki, A, Offerhaus, G.J, Richel, D.J, van Lanschot, J.J. Role of cycIooxygenase-2 in the development and treatment of oesophageal adenocarcinoma. // Scand. J. Gastroenterol Suppl., 2003; (239): 87-93.

34. Chan, C., Duhamel, E. and Ford-Hutchingson, A. Leukotriene B4 and 12-hydroxyeicosatetraenoic acid stimulate epidermal proliferation in vivo in the guinea pig. // J. Invest. Dermatol., 1985, 85,333 340.

35. Chang, L and Wang, J. Signal transduction pathways for activation of extracellular signal-regulated kinase by arachidonic acid in rat neutrophils. // J. Leukoc. Biol., 2001; 69: 659665.

36. Chao, D.T., Linette, G.P., Boise, L.H., White, L.S., Thompson, C.B., and Korsmeyer, S.J. Bcl-XL and Bcl-2 repress a common pathway of cell death. // J. Exp. Med., 1995; 182, 821-828

37. Chen, Y.-R., Meyer, C.F., and Tan, T.-H. Persistent activation of c-Jun N-terminal kinase 1 (JNK1) in gamma radiation-induced apoptosis. // J. Biol. Chem., 1996; 271, 631-634.

38. Clayson, D.B., Mehta, R., and Iverson, F. Oxidative DNA damage the effects of certain genotoxic and operationally non-genotoxic carcinogens. Mutat. Res., 1994; 317,25-42.

39. Cohen, J .J., and Duke, R.C. Glucocorticoid activation of a calcium- dependent endonuclease in thymocyte nuclei leads to cell death. // J. Immunol., 1984; 132,38.

40. Conrad, D.J., Kuhn, H., Mulkins, M., Highland, E., and Sigal, E. Specific inflammatory cytokines regulate the expression of human monocyte 15-lipoxygenase. II Proc. Natl. Acad. Sci. UJS.A., 1992; 89,217-221.

41. Cornwel, D.G1., Morisaki, N. Fatty acid paradoxes in the control of cell proliferation: prostaglandins, lipid peroxides and cooxidation reaction. // In: Pryor W.A., ed. Free radicals in biology. 1984; V.5,95-148.

42. Criswell K.A., Sulkanen A.P., Hochbaum A.F.,Bleavins M.R. Effect of phenylhydrasine or phlebotomy on peripheral blood, bone marrow and erythropoietin in Wistar rats // J. Appl. Toxicol. 2000. V. 20. P. 25—34.

43. Davis, R.J. Signal transduction by the JNK group of MAP kinases. // Cell., 2000; 109, p. 239252.

44. Dayer, J.M., Beutler, D., Cerami A. Cachectin/tumor necrosis factor stimulates collagenase and prostaglandin Ег production by human synovial cells and dermal fibroblasts. // J.Exp.Med., 1985; 162:2163-2168.

45. Derijard, В., Hibi, M., Wu, I.-H., Barrett, Т., Su, В., Deng, Т., Karin, M., Davis, R.J. JNK1: a protein kinase stimulated by UV light and Ha-Ras that binds and phosphorylates the c-Jun activation domain. // Cell, 1994; 76, 1025-1037.

46. Elder, D.J, Paraskeva C. Induced apoptosis in the prevention of colorectal cancer by nonsteroidal anti-inflammatory drugs.//Apoptosis, 1999; 4(5):365-72.

47. Evan, G.I., Wyllie, A.H., Gilbert, C.S., Littlewood, T.D., Land, H., Brooks, M.,Waters, C.M., Penn, L.Z. and Hancock, D.C. Induction of apoptosis in fibroblasts by c-myc protein. // Cell, 1992; 69, 119-128.

48. Eling, Т.Е., Glasgow, W.C. Cellular proliferation and lipid metabolism: importance of lipoxygenases in modulation epidermal growth factor-dependent mitigenesis. // Cancer and Metastasis Rewiews, 1994,13: 397-410.

49. Engels, F. and Nijkamp, P.P. Pharmacological inhibition of leukotriene actions. // Pharm. World Sci., 1998; 20,60-65.

50. Earnest, D.L., Hixcon, L.J., Alberts, D.S. Piroxicam and other cyclooxigenase inhibitors: potencial for cancerchemoprevention.//J.Cell.Biochem.Suppl., 1992; 161, 156-166.

51. Fantl, W.J., Jonson, D.E., Williams, L.T. Signalling by receptor tyrosine kinase. // Ann. Rev. Biochem., 1993,62,453-481.

52. Farrar, W.L. and Humes, J.L. The role of arachidonic acid metabolism in the activation of IL- 1 and IL-2. J. Immunol., 1985; 135: 1153.

53. Fans, M., Latinis, K.M., Kempiak, S.J., Koretzky, G.A., and Nel, A. Stress-induced Fas ligand expression in T cells is mediated through a MEK kinase 1-regulated response element in the Fas ligand promoter. //Mol. Cell. Biol., 1998: 18, 5414-5424.

54. Fulton, A.M. In vivo effects of indomethacin on the growth of murine mammary tumours. // Cancer.Res., 1984; 44,2416-2420.

55. Fulton, A.M. Interaction of natural effector cells and prostaglandins in the control of metastasis. //J.Natl.Cancer.Inst., 1987; 78, 735-741.

56. Furuta, Y., Hall, E. R., Sanduja, S., Barkley, Т., Jr., and Milas, L. (1988). Prostaglandin production by murine tumors as a predictor for therapeutic response to indomethacin. Cancer Res., 48: 3002-3007.

57. Furuta, Y., Hunter, N., Barkley, Т., Hall, E., and Milas, L. Increase in radioresponse of murine tumors by treatment with indomethacin. // Cancer Res., 1988; 48: 3008- 3013.

58. Gati, I., Bergstrom, M., Csoka, K., Muhr, C., Carlsson, J. Effects of the 5-lipoxygenase inhibitors AA-863 and U-60,257 on human glioma cell lines. Prostagland.Leuk.Essent.Fatty Acid., 1990; 40(2), 117-24.

59. Genaro, A.M., Hortelano, S., Alvarez, A., Martinez, C. and Bosca, L. Splenic В lymphocyte programmed cell death is prevented by nitric oxide release through mechanisms involving sustained Bcl-2 levels. // J. Clin. Inves., 1995,95, 18884-1890.

60. Gerber, M., Ball. D., Chadia S. and Ploch Y. Irradiation and production of IL-2. // Immunobiology, 1984; 167,394a

61. Gil-Gomez, G., Berns, A. and Brady, J.M. A link between cell cycle and cell death: Bax and Bcl-2 modulate Cdk2 activation during thymocyte apoptosis. // The EMBO Journal, 1998; Vol. 17 No.24 pp.7209-7218.

62. Gillis, R.C., Daley, B.J., Enderson, B.L. and Karlstad, M.D. Role of downstream metabolic processing of proinflammatory fatty acids by 5-lipoxygenase in HL-60 cell apoptosis.// J Trauma. 2003; Jan;54(l):91-102; discussion 102-3.

63. Girotti, A.W. Lipid hydroperoxide generation, turnover, and effector action in biological systems. // J. Lipid Res., 1998; 39,1529 1542.

64. Giovannucci, E., Rimm, E. В., Colditz, G. A., Stampfer, M. J., Ascherio, A., Chute, С. C. and Willett, W. C. A prospective study of dietary fat and risk of prostate cancer. // J. Natl. Cancer Inst., 1993; 85, 1571-1579.

65. Ghosh, J., Myers, Ch.E. Inhibition of arachidonate 5-lipoxygenase triggers massive apoptosis in human prostate cancer cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998; Vol. 95, pp. 13182-13187.

66. Goetzl, E. // J. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1981; 101,344-350.

67. Goetzl, E.J., An, S. and Zeng, L. Specific suppression by prostaglandin E2 of activation-induced apoptosis of human CD4+CD8+ T lymphoblasts. // J. Immunol., 1995,154, 1041-1047.

68. Goodman, Y., Steiner, M. R., Steiner, S. M. & Mattson, M. P. Nordihydroguaiaretic acid protects hippocampal neurons against amyloid beta-peptide toxicity, and attenuates free radical and calcium accumulation. // Brain Res., 1994; 654, 171-176.

69. Goodwin, J.S., Ceuppens, J.L. Regulation of the immune response by prostaglandins. // J. Clin.1.munol., 1983; Oct;3(4):295-315.

70. Grisham, M.B. Role of reactive oxygen metabolites in inflammatory bowel disease. // Curr. Opin. Gastroenterol., 1993; 9, 971-980.

71. Hannigan, G.E., and Williams, B.R. Signal transduction by interferon-a through arachidonic acid metabolism. // Science, 1991; 251,204 207.

72. Harrison, K.A., and Murphy, R.C. Isoleukotrienes are biologically active free radical products of lipid peroxidation. //J. Biol. Chem., 1995; 270, 17273 17278.

73. Higgs, G.A., Salmon, J.A. and Spayne, J.A.Br. // J. Pharmacol., 1981; 74,429-433.

74. Hockenbery, D.M., Oltvai, Z.N., Yin, X-M., Milliman, C.L., and Korsmeyer, S.J. Bcl-2 functions in an antioxidant pathway to prevent apoptosis. // Cell, 1993; 75,241-251.

75. Horiguchi, J. D., Spriggs, К. I., Stone, R. L. and Kufe, D. Role of arachidonic acid metabolism in transcriptional indurtion Of tumor necrosis factor gene expression by phorbol ester. // Mol. Cell. Biol., 1989; 9:252.

76. Hostein I, Dorion-Bonnet F., Bloch, В., Vaillier, D., Juzan, M, Gualde N. 5-Lipoxygenase gene expression in the thymus. // Thymus, 1992; 20(2), 101-108.

77. Hofmanova, J., Musilova E., Kozubik A. Suppression of human cancer cell proliferation by lipoxygenase inhibitors and gamma-radiation in vitro. // Gen.Physiol.Biophys., 1996; V.15, 317-331.

78. Hugues, P., Montaudon, D., Robert, J. Incorporation and turnover of phospholipid precursors in normal and tumor glial cells in culture. // Int.J.Biochem, 1985; 17: 611-617.

79. Jackson, W. F. Lipoxygenase inhibitors block 02 responses of hamster cheek pouch arterioles. // Am. J. Physiol., 1988; 255, (4 Pt 2):H7U-H716.

80. Joseph, Т., O'Flaherty, Brad A., Chadwell, Mary W., Kearns, Susan Sergeant and Larry W. Daniel. // The Journal of Biological Chemistry, 2001; Vol. 276, No. 27, pp. 24743-24750.

81. Jayadev, S., Linardic, C.M., and Hannun, Y.A. Identification of arachidonic acid as a mediator of sphingomyelin hydrolysis in response to tumor necrosis factor. // J. Biol. Chem., 1994; 269, 5757-5763.

82. Jones, R., Adel-Alvarez, L,A., Alvarez, 0,R., Broaddus, R., Das, S. Arachidonic acid and colorectal carcinogenesis. // Mol. Cell. Biochem., 2003; 253(1-2): 141-9.

83. Kamitani, Hideki., Geller, Mark., and Eling, Thomas. Expression of 15-Lipoxygenase by Human Colorectal Carcinoma Caco-2 Cells during Apoptosis and Cell ifferentiation. // 1998, Vol. 273, No. 34, Issue of August 21, pp. 21569-21577.

84. Kanai, A.J., Pearce, L.L., Birder, L.A., et al. Identification of a neuronanal nitric oxide synthase in isolated cardiac mitochondria using electrochemical detection. // Proc.Natl.Acad.Sci. USA 2001; 98,14126-14131.

85. Kang, L., Vanderhoek, J.Y. Characterization of specific subcellular 15-hydroxyeicosatetraenoic acid (15-HETE) binding sites on rat basophilic leukemia cells. // Biochim. Biophis. Acta., 1995; 1256: 297-304.

86. Kase, S., Osaki, M., Honjo, S., Hashimoto, K., Adachi, H., Tsujitani, S., Ito, H. Expression of cyclooxygenase-1 and cyclooxygenase-2 in human esophageal mucosa, dysplasia and carcinoma. // Pathobiology, 2004; 71(2):84-92.

87. Koch, C.A., Anderson, D., Moran, M.F. et al. SH2 and SH3 domains: Elements that control interaction of cytoplasmic signaling proteins. // Sciense, 1991; 252,668-674.

88. Cohen, J.J. Programmed cell death in the immune system. // Advances in immunology, 1991, V.50, p.55-85.

89. Konings, A.W.T. Role of membrane lipid composition in radiation-induced death of mammalian cells. // In: Prostaglandin and lipid metabolism in radiation injury. Plenum Press, N.Y.-L., 1987; p.29-43.

90. Korn, S., and Horn, R. Nordihydroguaiaretic acid inhibits voltage-activated Ca2+ currents independently of lipoxygenase inhibition. // Mol. Pharmacol., 1990; 38,524-530.

91. Korystov, Yu.N. Cross-linking of cell surface receptors as a trigger of cell apoptosis and proliferation. // Scann. Microscopy, 1995; v.9, n.3, p. 757-762.

92. Korystov, Y.N., Dobrovinskaya, O.R., Shaposhnikova, V. V. and Eidus, L. K. // FEBS Lett., 1996; 388,238-241.

93. Kozubik, A., Hofmanova J., Pospisil M., Netikova J. Effects of drugs inhibiting prostaglandin and leukotriene biosynthesis on postirradiation haematopoiesis in mouse. // Int.J.Radiat.Biol., 1994; 65,369-377.

94. Krebs, E.G., Beavo, J.A. Phosphorylation-dephosphorylation of enzymes. // Annu. Rev. Biochem., 1979; 48:923-59.

95. Maier, J.A.M., Hia, Т., and Maciag, T. Cyclooxygenase is an immediate-early gene induced by interleukin-1 in human endothelial cells. // J. Biol. Chem., 1990; 265, 10805 10808.

96. Maccarrone, M., Catani, M.V., Agro, A.F., and Melino, G. // Cell Death Differ., 1997; 4, 396402.

97. Maccarrone, M. Activation of 5-Lipoxygenase and Related Cell Membrane Lipoperoxidation in Hemodialysis Patients. // J Am Soc Nephrol, 1999; 10: 1991-1996.

98. Maccarone, M., Van Zadelhoff, G., Veldink, G.A. et al. Early activation of lipoxygenase in lentil (Lens culinaris) root protoplasts by oxidative stress induced programmed cell death // Eur. J. Biochem. 2000; V. 267. p. 5078—5084.

99. Maccarrone, M., Ranalli, M., Bellincampi, L. et al. Activation of different lipoxygenase isozymes induces apoptosis in human erythroleukemia and neuroblastoma cells // Biochem. Biophys. Res. Com. 2000. V. 272. P. 345—350.

100. Maccarrone, M., Melino, G., Finazzi-Agro. Lipoxygenases and their involvement in programmed cell death. // Cell Death and Differentiation, 2001; 8, 776-78.

101. Maniatis, Т., Fritsch, E., Sambrook J. // Molecular cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1982. p. 159-163.

102. Martin, S.J and Cotter, Th.G. (1991) Ultraviolet В irradiation of human leukemia HL-60 cells in vitro induces apoptosis.//Int. J. Radiat. Biol, 59,1001-1016.

103. Mathy-Hartert, M., Martin, G., Devel, P., Deby-Dupont, G., Pujol, J.P., Reginster, J.Y, Henrotin, Y. Reactive oxygen species downregulate the expression of pro-inflammatory genes by human chondrocytes. // Inflamm Res., 2003 Mar; 52(3): 111-8.

104. McGahon, A.J., Nishioka, W.K., Martin, S.J., Mahboubi, A., Cotter, T.G. and Green, D.R. // J. Biol. Chem., 1995,270,22625-22631.

105. McConrey, D., Hartzell P., Jondell, M. // J. Biol. Chem., 1989, V.264, № 23, p. 13399.

106. McDonald, P.P., McColl, S.R., Naccache, P.H. and Borgeat, P. Activation of the human neutrophil 5-lipoxygenase by leukotriene B4. // Br. J. Pharmacol., 1992; 107,226-232.

107. McPhail, L. C., Clayton, C., Snyderman, R. A potential second messenger role for unsaturated fatty acids: activation of Ca21-dependent protein kinase. // Science, 1984; 224,622-626.

108. Meikrantz, W., and Schlegel, R. Apoptosis and the cell cycle. // J. Cell. Biochem., 1995; 58, 160-174.

109. Milas, L., Furuta, Y., Hunter, N., Nishiguchi, I., and Runkel, S. Dependence of indomethacin-induced potentiation of murine tumor radioresponse on tumor host immunocompetence. // Cancer Res., 1990; 50:4473-4477.

110. Milas, L., Nishiguchi, I., Hunter, N., Murray, D., Fleck., R, Ito, H., Travis, E. Radiation protection against early and late effects of ionizing irradiation by the prostaglandin inhibitor indomethacin. // Adv.Space Res., 1992; 12(2-3):265-71.

111. Morrow, J.D., Chen, Y., Brame, С J., Yang, J., Sanchez, S.C., Xu, J., Zackert, W.E., Awad, J.A., and Roberts, L.J. The isoprostanes: unique prostaglandin-like products of free radical initiated lipid peroxidation. // Drug Metab. Rev., 1999; 31,117-139.

112. Muller, C., Friedrichs,B., Wingler, K., and Brigelius-Flohe, R. Perturbation of Lipid Metabolism by Linoleic Acid Hydroperoxide in CaCo-2 Cells. // Biol. Chem., 2002; Vol. 383, pp. 637 -648.

113. Nagy, L., Tontonoz, P., Alvarez, J.G.A., Chen, H. and Evans, R.M. Oxidized LDL regulates macrophage gene expression through ligand activation of PPARgamma. // Cell, 1998; 93, 229-240.

114. Nassar, G.M., Morrow, J.D., Roberts, L.J., 2nd, Lakkis, F.G., and Badr, K.F. Induction of 15-lipoxygenase by interleukin-13 in human blood monocytes. // J. Biol. Chem., 1994; 269, 27631-27634.

115. Neale, M.L, Fiera, R.A and Matthews, H. Involvement of phospholipase A2 activation in tumor cell killing by tumor necrosis factor. // Immunology, 1988; 64:81-85.

116. Nishiguchi, I., Furuta, Y., Hunter, N., Murray, D., Milas, L. Radioprotection of hematopoietic tissues in mice by indomethacin. // Radiat Res., 1990; 122(2): 188-92.

117. Nishio, E., and Watanabe, Y. The involvement of reactive oxygen species and arachidonic acid in alpha 1-adrenoceptor-induced smooth muscle cell proliferation and migration. // Br. J. Pharmacol., 1997; 121, 665-670.

118. Nishizuka Y. Studies and perspectives of protein kinase C. // Science, 1986; 233, № 4761, 305312.

119. Nishizuka Y. The role of protein kinase С in cell surface signal transduction and tumour promotion. //Nature, 1984; 308, №5961,693-698.

120. Nishizuka Y. The molecular heterogeneity of protein kinase С and its implication for cellular regulation. //Nature, 1988; 334:661-665.

121. Noguchi, M., Kitagawa H., Miyazaki I., Mizumaki. //J.Cancer.Res., 1993; 84, 1010-1023.

122. Noguchi, M., Rose, D. P., Earashi, M. and Miyazaki, I. The role of fatty acids and eicosanoid synthesis inhibitors in breast carcinoma. // Oncology, 1995; 52,265-271.

123. Nozawa Y., Nakashina Sh., Nagata K. Phospholipid-mediated signaling in receptor activation of human platelets. //Biochim. Biophys. Acta., 1991; V.1082, p.219-138.

124. Nunez Martinez O., Clemente Ricote G., Garcia Monzon C. Role of cyclooxygenase-2 in the pathogenesis of chronic liver diseases. // Med. Clin. (Bare)., 2003; 121(19):743-8.

125. Ohuchi, K., and Levine, L. // Prostagland. Med., 1978; 1,421-431.

126. Okuda, S., Saito, H., and Katsuki, H. Arachidonic acid: toxic and trophic effects on cultured hippocampal neurons. // Neuroscience, 1994; 63, 691 699.

127. Park, D.S., Stefanis, L., Yan, C.Y.I., Farinelli, S.E., and Greene, L.A. // J. Biol. Chem., 1996; 271,21898-21905.

128. Pawson, T and Gish, G. SH2 and SH3 domains: from structure to function. // Cell, 1992; 71(3): 359-362.

129. Pazin, M.J, Williams, L.T. Triggering signaling cascades by receptor tyrosine kinases. // Trends Biochem. Sci., 1992 Oct; 17(10):374-8.

130. Peppelenbosch, M.P., Tertoolen, G.J., den Hertog J., de Laat, S.W. Epidermal factor growth activated calcium channels by phospholipase A2/5-lipoxygenase-mediated leukotriene C4 production. // 1992; V. 69,(2): p.295-303

131. Peeper,D., Parker,L.L., Ewen,M.E., Toebes,M., Hall,F.L., Xu,M., Zantema,A., van der Eb,A.J. and Piwnica-Worms,H. A- and B-type cyclins differentially modulate substrate specificity of cyclin-Cdk complexes.//EMBO J., 1993; 12,1947-1954.

132. Polyak, K., Lee, M.-H., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P. and Massaguer, J. Cloning of p27Kipl, a cyclin-dependent kinase inhibitor and a potential mediator of extracellular antimitogenic signals. // Cell, 1994,78, 59-66.

133. Rapoport, S. M., Scheue, Т., Wiesner, R., Halangk, W., Ludwig, P., Janicke-Hohne, M., Tannert, C., Hiebsch, C., and Klatt, D. // Eur. J. Biochem., 1979,96,545-561

134. Rotondo, D., Earl, C.R., Laing, K.J., Kaimakamis, D. Inhibition of cytokine-stimulated thymic ymphocyte proliferation by fatty acids: the role of eicosanoids. // Biochim Biophys Acta., 1994; Sep 8; 1223(2): 185-94.

135. Roshak, A.K., Capper, E.A., Stevenson, C., Eichman, C., and Marshall, L.A. Human calcium-independent phospholipase A2 mediates lymphocyte proliferation. // J. Biol. Chem., 2000, 275, 35692-35698.

136. Roy, В., and Cathcart, M. K. Induction of 15-lipoxygenase expression by IL-13 requires tyrosine phosphorylation of Jak2 and Tyk2 in human monocytes. // J. Biol. Chem., 1998; 273, 3202332029.

137. Ruderman, J.V. MAP kinase and the activation the quiescent cells. // Curr.Opin.Cell Biol., 1991; 5: 207-213.

138. Samielsson В. // Science (Wash. D. C.) 1983; V. 220. p. 568-575.

139. Sandstrom, P.A., Pardi, D., Tebbey, P.W. et al. Lipid hydroperoxid-induced apoptosis: lack of inhibition by Bcl-2 over-expression // FEBS Lett. 1995; V. 365. P. 66—70.

140. Schatzman, R.S., Grifo J.A., Merrick, W.S., Kuo, J.F. Phospholipid-sensitive Ca2+-dependent protein kinase phosphorylates the beta subunit of eukaryotic initiation factor 2 (eIF-2). // . FEBS Lett., 1983; 159,167-170.

141. Schnurr, K., Hellwing, M., Seidemann, В., Jungblut, P., Kuhn, H., Rapoport, S.M., and Schewe, T. Oxygenation of biomembranes by mammalian lipoxygenases: the role of ubiquinone. // Free Radical Biol. Med., 1996; 20,11-21.

142. Schultz, R.M., Pavlidis, N.A., Stylos, W.A., Chirigos, M.A. Regulation of macrophage tumoricidal function: a role for prostaglandins of the E series. II Science, 1978,202: 320-323.

143. Seedorf, K., Felder, S., Millauer, В., et al. Analysis of platelet derived growth factor receptor domain functions using a novel chimeric receptor approach. // J.Biol.Chem., 1991; 266:12424-12431.

144. Seger, R., Krebs, E.G. The МАРК signaling cascade. // FASEB J., 1995 Jun; 9(9):726-35.

145. Sellins, K.S., Cohen, J.J. Gene induction by gamma-irradiation leade to DNA fragmentation in lymphocytes. // J.Immunol., 1987, 139,3199.

146. Seong, J, Kim, S.H, Suh, C.O. Enhancement of tumor radioresponse by combined chemotherapy in murine hepatocarcinoma. // J.Gastroenterol.Hepatol., 2001, 16(8):883-9.

147. Shaposhnikova,V.V., Korystov, Y.N. Thymocyte proliferation and apoptosis induced by ionizing radiation. // Scanning Microsc. 1995; 9(4): 1203-6.

148. Snyder, D.S., С astro, R., Desforges, J.F. Antiproliferative effects of lipoxygenase inhibitors on malignant human hematopoietic cell lines. // Exp.Hematol., 1989; 17,6-9.

149. Spaargaren, M., Defize, L.H., Boonstra, J., de Laat, S.W. Antibody-induced dimerization activates the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase. // J. Biol. Chem., 1991 Jan 25; 266(3): 1733-9.

150. Surette, M.E., Winkler, J.D., Fonteh, A.N. and Chilton, F.H. Relationship between arachidonate-phospholipid remodeling and apoptosis. // Biochemistry, 1996; 35,9187 9196.

151. Surette, M.E., Finteh, A.N., Bernatchez, C., and Chilton, F.H. Perturbations in the control of cellular arachidonic acid levels block cell growth and induce apoptosis in HL-60 cells. // Carcinogenesis, 1999; 20, 757 763.

152. Tang, D.G., Guan, K.-L., Li L., Honn, K.V., Chen, Y. Q., Rice, R.L., Taylor, J.D., and Porter, A. T. // Int. J. Cancer., 1997; 72,1078-1087

153. Tang, D.G. and Honn, K.V. Apoptosis of W256 carcinosarcoma cells of the monocytoid origin induced by NDGA involves lipid peroxidation and depletion of GSH: role of 12-lipoxygenase in regulating tumor cell survival. //J. Cell. Physiol., 1997,172, 155-170

154. Tang, D.G., Chen, Y.Q., and Honn, K.V. Arachidonate lipoxygenases as essential regulators of cell survival and apoptosis. H Proc. Natl. Acad. Sci., USA 1996; 93,5241 5246.

155. Tang, D.G., La, E., Kem, J. and Kehrer J.P. Fatty acid oxidation and signaling in apoptosis. // Biol. Chem., 2002 Vol. 383, pp.425-442.

156. Todt, J.C., Ни, В., Curtis, J.L. The receptor tyrosine kinase MerTK activates phospholipase С {gamma}2 during recognition of apoptotic thymocytes by murine macrophages. // J. Leukoc. Biol., 2004, Apr;75(4):705-13.

157. Tompson, G.B. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. // Science, 1995; V.267, Is. 5203,1456-1462.

158. Tong, W.G., Ding, X.Z., Adrian, Т.Е. The mechanisms of lipoxygenase inhibitor-induced apoptosis in human breast cancer cells. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 2002 Aug 30; 296(4):942-8.

159. Totoshima, H. and Hunter, T. p27, a novel inhibitor of G1 cyclin-Cdk protein kinase activity, is related to p21. // Cell, 1994; 78, 67-74.

160. Touqui, L., Rothhut, В., Shaw, A.B., Fradin, A., Vargaftig, B.B., Russo-Marie, F. Platelet activation: a role for a 40 К antiphospholipase Ai protein indistinguishable from lipocortin. I I Nature, 1986. Vol. 321. P. 177-180.

161. Vanderhoek, J.Y and Bailey, J.M. Activation of a 15-Lipoxygenase/Leukotriene Pathway in Human Polymorphonuclear Leukocytes by the Anti-inflammatory Agent Ibuprofen. // J.Biol.Chem., 1984; Vol.259, No.l 1, pp.6752-6756.

162. Wagenknecht, В., Gulbins, E., Lang, F., Dichgans, J., and Weller, M. Lipoxygenase inhibitors block CD95 ligand-mediated apoptosis of human malignant glioma cells. // FEBS Lett., 1997; 409(1): 17-23.

163. Walden, T.L., Farzaneh, M.K. Biological mediators. // In: Biochemistry of ionizing Radiation, 1990; p.85-88, Ravel Press Ltd. N.Y.

164. Wang, J.F., Jerrelis, T.R., Spitzer, J.J. Decreased production of reactive oxygen intermediates ia an early event during in vitro apoptosis of rat thymocytes. // Free Radical Biology and Medicine, 1996; Vol. 20, No. 4, pp.533-542.

165. Wang, D., Yu, X. and Brecher, P Nitric oxide and N-acetylcysteine inhibit the activation of mitogen-activated protein kinases by angiotensin 2 in rat cardiac fibroblasts. // J.Bol. Chem., 1998; 273,33027-33034.

166. West, D.W., Slattery, M.L., Robison, L. M., French, Т.К. and Mahoney, A.W. // Cancer Causes Control, 1991, 2, 85-94.

167. Whatley, R.E., Zimmerman, G.A., Mclntyre, T.M., Prescott, S.M. Lipid metabolism and signal transduction in endothelial cells. // Prog Lipid Res., 1990; 29(l):45-63.

168. Whitfield, J., Neam, S. J., Paquet, L., Bernard, O., and Ham, J. Dominant-negative c-Jun promotes neuronal survival by reducing BIM expression and inhibiting mitochondrial cytochrome с release. // Neuron, 2001; 29,629-643.

169. William E. M. Lands, Marshall, P.J. and Kulmacz, R.J. Hydroperoxide Availability in the Regulation of the Arachidonate Cascade. // Advances in Proslaglandin, Thromboxane, and Leukotriene Research, 1985; Vol. 15, 233-235.

170. Williams, O., and Brady, J.M. The role of molecules that mediate apoptosis in T-cell selection. // TRENDS in Immunology, 2001, Vol.22, No.2,107

171. Winkler, J.D., Sung, C.-M., Hubbard, W. C. and Chilton, F. H. Influence of arachidonic acid on indices of phospholipase A2 activity in the human neutrophil. // Biochem. J., 1993; 291, 825831.

172. Wu, S.H., Kelefiotis, D.P., Lianos, E.A. Modulatory effects of eicosanoids on mesangial cell growth in response to immune injury. // Immunopharmacology, 1994 Sep-Oct; 28(2): 125-36.

173. Xu, B, Bhattachaijee, A., Roy, B, Gerald, M.F. and Cathcart, M.K. Role of protein kinase С isoforms in the regulation of IL-13-induced 15-lipoxygenase gene expression in human monocytes. // JBC., 2004; Apr 16; 279(16): 15954-60.

174. Yang, C.Y, Meng, C.L, Liao, C.L, Wong, P.Y. Regulation of cell growth by selective COX-2 inhibitors in oral carcinoma cell lines. // Prostaglandins Other Lipid Mediat., 2003; 72(3-4): 115-30.

175. Yang, D. D. et al. Differentiation of CD4+ T cells to Thl cells requires MAP kinase JNK2. // Immunity, 1998; 9,575-585.

176. Young, M. R. // Cancer Metastasis Rev., 1994, 13, 337-348.

177. Zhou, F., and Thompson, E. B. Role of c-jun induction in the glucocorticoid-evoked apoptotic pathway in human leukemic lymphoblasts. // Mol. Endocrinol., 1996; 10,306-316.

178. Ziboh, V.A., Cho, Y., Mani, I., Xi, S. Biological significance of essential fatty acids/prostanoids/lipoxygenase-derived monohydroxy fatty acids in the skin. // Arch. Pharm. Res., 2002; Dec;25(6):747-58.

179. Zidovetzki, R., Laptalo L., Crawford J. Effects of diacylglycerols on the activity of cobra venom, bee venom and pig pancreatic phospholipase Аг. // Biochemistry, 1992, V.31, p.7683-7691.