Исследование рецептор-опосредованной трансфекции клеток эпителия молочной железы in vitro и in vivo

Смирнова, Ольга Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование рецептор-опосредованной трансфекции клеток эпителия молочной железы in vitro и in vivo
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Исследование рецептор-опосредованной трансфекции клеток эпителия молочной железы in vitro и in vivo"

На правах рукописи

СМИРНОВА Ольга Анатольевна

? Г 5 ОД

* 3 Aüp IJCJ

ИССЛЕДОВАНИЕ РЕЦЕПТОР-ОПОСРЕДОВАННОЙ ТРАНСФЕКЦИИ КЛЕТОК ЭПИТЕЛИЯ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ IN VITRO ИIN VIVO.

(специальность 03.00.23 - биотехнология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2000

Работа выполнена в биофизической лаборатории ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Научные руководители: профессор,

доктор биологических наук А.С. Соболев,

кандидат биологических наук АЛ. Розенкранц

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАН и

РАМН, профессор,

доктор биологических наук В:А. Ткачук,

кандидат биологических наук В.Г. Лунин

Ведущая организация НИИ биомедицинской химии РАМН

Защита диссертации состоится УУ " / ¿/¿¿/сТ-Я_

2000 г. в /X часов на заседании Диссертационного Совета Д.020.40.01 при ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН по адресу: 127550, Москва, ул. Тимирязевская, д. 42.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан " 2000 г.

у /

Ученый секретарь ^

Диссертационного Совета К е

кандидат биологических наук С. А.Меликова

еьчу* 0

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние десятилетия получили широкое развитие методы создания рекомбинантных ДНК, доставки ДНК в клетки млекопитающих in vitro и in vivo, а также методы исследования экспрессии введенных генов. Применение этих достижений делает возможным производство белков, имеющих большое значение для медицины и других потребностей человека. Получение таких белков в достаточных количествах является одной из важных задач биотехнологии. Развитие методов генной инженерии привело к созданию бактериальных систем экспрессии для получения требуемых белков. Однако в бактериальных системах не всегда удается осуществить или точно воспроизвести посттрансляционные модификации эукариоти-ческих белков. Эта проблема решается при использовании эука-риотических систем экспрессии, например - масштабного культивирования клеток млекопитающих. Недостатком эукариотиче-ских систем экспрессии является их низкая рентабельность, т.к. для культивирования требуются относительно большие затраты, а выход и концентрация белков невелики. Другое направление основано на создании трансгенных животных-биореакторов, способных продуцировать целевые белки и транспортировать их во внеклеточные жидкости организма.

В этой связи молочная железа млекопитающих представляется естественным биореактором для продукции рекомбинантных белков и секреции их с молоком. Молочная железа обладает огромным синтетическим потенциалом, так как исходно предназначена для синтеза и извлечения большого количества белка. Концепция молочной железы как биореакгора потенциально имеет ряд преимуществ с точки зрения биотехнологии: получение натив-ных белков, большой выход, отсутствие токсичных примесей.

В качестве одного из путей введения трансгена для создания животных-биореакторов,, предлагается использование методов трансфекции соматических клеток. Несмотря на то, что к настоящему времени разработано большое количество методов введения чужеродной ДНК, проблема эффективного транспорта ДНК in vivo остается нерешенной. В последнее время проводятся интен-

сивные исследования в области систем доставки ДНК в организм животных, в том числе - рецептор-опосредованной трансфекции. Рецептор-опосредованная доставка генетического материала сочетает использование естественного для клетки механизма рецептор-опосредованного транспорта и синтетических лигандирован-ных конструкций, что, в принципе, позволяет специфически трансфецировать любой выбранный тип клеток (Michael and Cu-riel, 1994; Guy et al. 1995). Данный метод обладает высоким потенциалом. Для внедрения метода в биотехнологию представляется важным дальнейшее исследование закономерностей и механизмов и оптимизация рецептор-опосредованной трансфекции для работы in vivo.

На основании имеющейся на сегодня совокупности данных нами была предложена идея создания животного-биореактора путем рецептор-опосредованной трансфекции молочной железы. В развитие этой идеи и выполнялась данная работа.

Цель и задачи исследования: Целью настоящей работы было изучение возможности использования рецептор, опосредованной доставки генетического материала в клетки эпителия молочных желез для получения целевых белков с молоком сельскохозяйственных животных.

Для реализации указанной цели были поставлены следующие практические задачи:

1. Исследовать рецептор-опосредованный эндоцитоз и внутриклеточный транспорт конъюгата инсулин-полилизин и ДНК-переносящих конструкций, содержащих данный конъюгат, в клетках эпителия молочной железы в культуре.

2. Исследовать и оптимизировать состав и свойства ДНК-переносящих конструкций для получения наибольшего уровня трансфекции клеток в культуре.

3. Осуществить рецептор-опосредованную доставку репор-терного гена в клетки эпителия молочной железы in vivo.

4. Оценить возможность рецептор-опосредованной доставки гена, кодирующего секретируемый с молоком белок, в клетки эпителия молочной железы in vivo.

Научная новизна н практическая значимость работы. В

данной работе впервые осуществлена рецептор-опосредованная трансфекция молочной железы путем локального введения ДНК-переносящих конструкций, в результате чего получена секреция с молоком продукта экспрессии введенного гена. Предложенный нами способ создания животных-биореакторов в перспективе может быть использован для получения целевых белков с молоком сельскохозяйственных животных.

Впервые исследованы мембранолитические свойства ДНК-переносящих конструкций с эндосомолитическим компонентом. Установлена связь литических свойств аденовирусов в составе конструкций с эффективностью экспрессии репортерного гена в результате трансфекции данными конструкциями.

В результате экспериментов по оптимизации содержащих вирус конструкций получено увеличение экспрессии репортерного гена в культуре более чем в 10 раз, при понижении концентрации доставляемой ДНК также приблизительно на порядок.

Получены результаты по сравнительной эффективности метода при трансфекции клеток эпителия молочной железы in vitro и in vivo.

Представленные результаты могут быть использованы для разработки эффективных систем получения животных-биореакторов.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, глав "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение результатов", выводов и списка литературы, включающего 202 библиографические ссылки. Работа изложена на 100 машинописных страницах, содержит 7 таблиц и 26 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. Материалы и методы исследования.

Клетки эпителия молочной железы мыши линия НС-11 растили в среде RPMI-1640 с 10% фетальной сыворотки, 50 мкг/мл гентамицина и 5 мкг/мл инсулина при 37°С, в атмосфере с 5% СОг.

Эксперименты по трансфекции молочных желез in vivo проводили на самках мышей линии BALB/c весом 18-20 грамм и 3-летних овцах романовской породы.

Аденовирусы человека тип 5 штамм dl312, уток - Duck Egg Drop Syndrome 76 (EDS-76) и кур - Chicken Embryo Lethal Orphan virus (CELO) были предоставлены сотрудниками лаборатории генетики микроорганизмов ВНИИСБ.

Бычий инсулин (Sigma) или стрептавидин (Molecular Probes, США) ковалентно присоединяли к 70-130 кДа поли-Ь-лизину (Sigma) с помощью бифункционального реагента N-сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP, Sigma) по ранее описанному методу (Rosenkranz et al., 1992), с модификациями. Были синтезированы конъюгаты инсулин-полилизин (5:1) и стрептавидин-полилизин (1,5:1). Для визуализации транспорта конъюгаты метили флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ).

Использовали плазмиды pRSVLuc (5,9 т.п.н.), pCMVLuc (6,9 т.п.н.), pCMVLALuc (9,1 т.п.н.), pRSVSpBLGLuc (5,9 т.п.н.) которые содержат репортерный ген люциферазы светлячка (Photinus pyralis) (из плазмиды pRSVLuc, любезно предоставленной доктором Д. Хелински). Все плазмиды были сконструированы сотрудниками биофизической лаборатории И.Н. Шатским и И.А. Шиловым.

Выделение ДНК осуществляли по методу Фрица (Фриц, 1988). Очистку ДНК проводили двукратным центрифугированием в градиенте CsCl.

Эндоцтоз ФИТЦ-меченных конструкций регистрировали методом видеоинтенсификационной микроскопии с помощью микроскопа Axioplan (Zeiss, Германия) и видеокамеры с охлаждаемой ПЗС-матрицей (АТ200 cooled CCD camera, Photometries, США).

Представлены результаты типичных экспериментов, выполненных в трех повторностях. Активность люциферазы выражена в относительных световых единицах (o.e.) и представлена в виде среднее ± стандартная ошибка.

Эксперименты по трансфекции молочных желез in vivo проводили совместно с сотрудником биофизической лаборатории В. А. Никитиным. ДНК-переносящие конструкции водили в проток молочной железы с помощью специально разработанного устройства (Соболев и др. 1994).

2. Результаты.

2.1. ДНК-переносящие конструкции.

Компоненты ДНК-переносящих конструкций. Безвирусные конструкции, предназначенные для рецептор-опосредованной трансфекции, состояли из следующих функциональных компонентов: плазмидная ДНК с репортерным геном, инсулин, в качестве эндоцитируемого лиганда, полилизин, как присоединяющий и компактизующий ДНК компонент. В состав конструкции, содержащей вирус, входил аденовирус (в качестве эндосомолитиче-ского компонента), а также стрептавидин и биолгнн для включения вируса в состав конструкции. Для объединения всех частей в конструкцию были синтезированы конъюгаты инсулин-полилизин и стрептавидин-полилизин, был модифицирован биотипом аденовирус.

Оценка связывания ДНК с конъюгатом инсулин-полилизин. Для количественной оценки состава комплекса ДНК-полилизин может использоваться величина лизин/нуклеотид. Ли-зин/нуклеотид определяется как отношение числа мономеров по-лилнзина (остатков лизина) к числу мономеров ДНК (нуклеоти-дов) в составе конструкции. Эта характеристика дает возможность сравнивать состав комплексов, образованных полимерами разной длины, а также отражает заряд комплексов.

Определение количества конъюгата инсулин-полилизин, необходимого для связывания ДНК, было проведено по методу оценки изменения подвижности ДНК в агарозном геле. К раствору ДНК добавляли инсулин-полилизин до указанных соотношений лизин/нуклеотид и инкубировали 30 минут при комнатной температуре. Электрофорез комплексов в 0,8% агарозном геле показал, что при соотношении лизин/нуклеотид от 0,2 до 0,5 в смеси присутствовало достаточное количество свободной ДНК (рис. 1, дорожки 2-5). При соотношении лизин/нуклеотид более 0,5 почти вся ДНК задерживалась на старте (рис. 1, дорожки 6-9). Таким образом, при соотношении лизин/нуклеотид выше 0,5 ДНК почти полностью связана с инсулин-полилизином. Анализ комплексов инсулин-полилизин-ДНК в агарозном геле подтвердил способность конъюгата связывать ДНК.

Рисунок 1.

Электрофорез конструкций инсулин-полилизин-ДНК

в агарозном геле. 4 5 6 7

Конструкции (инсулин-полилгаин)-рСМУЬис были приготовлены в HBS при соотношении лизин/нуклеошщ 0,2 (2), 0,3 (3), 0,4 (4), 0,5 (5), 0,55 (6), 0,6 (7), 0,65 (8), 0,7 (9). Свободная ДНК pCMVLuc (1) и конструкции были проанализированы электрофорезом в 0,8% агарозном геле в присутствии 0,5 мкг/мл бромистого этвдия для визуализации ДНК.

Сборка ДНК-переносящих конструкций. ДНК-переносящие конструкции собирали при комнатной температуре путем последовательного смешивания компонентов в 25 мМ HEPES, рН 7,5, 150 мМ NaCl. После каждого этапа инкубировали 30 минут. Схемы сборки безвирусной и содержащей вирус конструкций представлены соответственно на рисунках 2 и 3.

Рисунок 2.

Схема формирования ДНК-переносящей конструкции.

2.2. Исследование транспорта ДНК-переносящих конструкций в клетки линии НС-11 методом видеоинтенеификационной микроскопии.

Транспорт конъюгата инсулии-полилизин. Для проверки возможности специфического переноса генетического материала в клетки эпителия молочной железы исследовали транспорт конъюгата инсулин-полилизин в клетки с помощью видеоинтенеификационной микроскопии. Флуоресцентно-меченный коньюгат (в концентрации 30 нМ по полилизину) инкубировали с клетками линии НС-11 в течение 3 часов при 37°С. Чтобы определить, насколько специфичен транспорт данного конъюгата к инсулиновым рецепторам, клетки также инкубировали с конъюгатом в присутствии избытка свободного инсулина в среде (10 мкМ инсулина). Данные видео микроскопии представлены на рисунке 4.

Этапы формирования содержащей вирус ДНК-переносящей конструкции.

аденовирус-биотин

ш>

стрептавидин-полилизин

лл/7

инсулин-полшшзш

адеиовирус-стрспгавидин-полипизш!--ДНК-инсулин-полилнзин

Нами показано, что инсулин-полилизин эффективно интер-нализуется клетками НС-11 (рис. 4Б), а избыток свободного инсулина конкурентно вытесняет коньюгат (рис. 4Г). Представленные результаты подтверждают, что коньюгат инсулин-полилизин

Рисунок 4.

Транспорт коньюгага инсулин-полилизш 1-ФИТЦ в клетки НС-11

А, Б - Клетки инкубировали с 30 нМ конъюгатом инсулин-полилизин-ФИТЦ в течение 3 часов при 37°С в атмосфере 5% С02. В, Г - Клетки инкубировали с 30 нМ конъюгатом инсулин-полилизин-ФИТЦ и 10 мкМ инсулином в течение 3 часов при 37°С в атмосфере 5% СОг А, В - фазовый котраст. Б, Г - флуоресцентные изображения. Объектов х40, численная апертура 0,75.

транспортируется преимущественно через инсулиновые рецепторы. После интернализации инсулин-полилизин находится и в цитоплазме, и в ядрах клеток. Ядерная локализация конъюгата показывает, что инсулин-полилизин не только эффективно эндо-цитируется клетками, но также поступает из эндоцитозных ком-партментов в цитоплазму и затем транспортируется в ядро. Литературные данные позволяют предположить, что выход в цитоплазму обеспечивается поликатионной составляющей конъюгата, а поступление в клеточное ядро может осуществляться как за счет инсулина, так и за счет полилизина. Исследования транспорта конструкции (инсулин-полилизин-ФИТЦ)-ДНК также показали эффективную инсулин-зависимую интернализацию клетками. Таким образом, результаты исследования свойств конъюгата инсулин-полилизин позволяют сделать вывод о возможности использования этого конъюгата в качестве эффективного носителя ДНК для рецептор-опосредованной трансфекции.

Внутриклеточная локализация ДНК-переносящих конструкций. Для сравнения внутриклеточной локализации безвирусной и содержащей вирус ДНК-переносящих конструкций были собраны конструкции (инсулин-полилизин)-ДНК-(стрептавидин-

поднлизин-ФИТЦ) и (инсулин-полилизин)-ДНК-(стрептавидин-полилизин-ФИТЦ)-{биотинилированный аденовирус Е08-76). Клетки инкубировали с флуоресцентно-меченными ДНК-переносящими конструкциями в течение 18 часов. На рисунке 5 представлены флуоресцентные изображения клеток после интернализации безвирусной (рис. 5А) и содержащей вирус (рис. 5Б) конструкций.

В клетках, инкубированных с конструкцией (инсулин-полилизин)-ДНК-(стрептавидин-полилизин-ФИТЦ)> наблюдалась флуоресценция, сосредоточенная в гранулярных структурах, в основном, вокруг ядра (рис. 5А). После инкубации с конструкцией (инсулин-полилизин)-ДНК-(стрептавидин-полилизин-ФИТЦ)-аденовирус цитоплазма клеток имела равномерное флуоресцентное окрашивание (рис. 5Б), что свидетельствует о распределении содержащей вирус конструкции во всем объеме цитоплазмы в результате выхода из везикулярных компартментов.

Рисунок 5.

Внутриклеточное распределение флуоресцентно-меченных ДНК-переносящих конструкций.

Флуоресцентные изображения клеток линии НС-11 после 18-часовой инкубации с конструкциями (инсулин-полилизинУДНК4стрептавидин-полилизин-ФИТЦ) (А), или (инсулин-полилгаи^ДНК-(с1рептавидин-полилгоин-ФШш-аденовирус (Б). Концентрация по ДНК =2 нМ, инсулии-полилизин-=23,5 нМ, стрегпавидин-полилизин-ФИТЦ — =21,5 нМ, аленошь ove - 2-10 вирусных частиц (в.ч.) в мл. Объектив х100. численная nneim ра

2.3. Влияние аденовирусов на проницаемость Фосфолипид-ной мембраны.

Мембранолитическую активность аденовирусов оценивали по способности влиять на проницаемость фосфолипидиой мембраны. В качестве тест-объекта были выбраны фосфатидилхоли-новые липосомы, нагруженные кальцеином в концентрации, вызывающей концентрационное тушение флуоресценции. Если под действием аденовирусов нарушалась целостность фосфолипидной мембраны, кальцеин должен был выходить из липосом, что вызывало бы увеличение флуоресценции кальцеина за счет снижения концентрационного тушения. По изменению флуоресценции кальцеина оценивали (в процентах от контроля) выход кальцеина из липосом (выход содержимого липосом) под действием аденовирусов:

% выхода содержимого липосом - (Ф-Ффом)/(Фм*«гФфон)х100,

где Ф - флуоресценция после инкубации с аденовирусом, ФфоН -флуоресценция в результате спонтанного выхода кальцеина в тех же условиях, Фш - флуоресценция после обработки липосом 1% Тритон Х-100 (100% выход содержимого липосом).

Выход содержимого липосом под действием аденовирусов. Исследовали влияние аденовируса человека AdSneo, аденовирусов птиц (EDS-76 и CELO) на проницаемость фосфолипидной мембраны липосом в зависимости от рН среды инкубации. Нами не выявлено принципиальных отличий в действии данных аденовирусов на липосомы (рис. б). Максимальный выход содержимого липосом для всех аденовирусов наблюдался при рН около 3.

Рисунок: 6.

рН-зависимосгь выхода содержимого липосом под действием аденовирусов

рН

Аденовирус человека Ad5neo (-♦-) и утиный аденовирус EDS-76 (-о-) по 5х1010 вирусных частиц в 10 мкл CsCl (1,36 г/мл) и аденовирус кур CELO (-А-) по 10" в.ч. добавляли к 190 мкл липосом в 25 мМ цитратном буфере с заданным рН, 150 мМ NaCl и инкубировали 30 минут при 37°

Исследована кинетика выхода кальцеина из липосом под действием аденовируса Е08-76 (рис. 7). Зависимости выхода кальцеина от времени под действием аденовируса при рН 3 и рН 5 приведены на рисунке 7А. При сравнении кинетик видно, что при меньшем значении рН скорость процесса значительно выше. На рисунке 7Б представлены временные зависимости выхода кальцеина из липосом при оптимальном рН и различных температурах. При всех тестированных температурах (2°С, 20°С, 37°С) зависимости имеют нелинейный характер. Скорость выхода и количество высвободившегося кальцеина возрастают с увеличением температуры среды инкубации.

Рисунок 7.

Кинетика высвобождения кальцеина из липосом после добавления аденовируса ЕР8-76.

Ввод, мин

4 6 8

Влемя. мин.

I I 10

А. Сравнения кинетик высвобождения кальцеина под действием аденовируса Е05-76 при рН 3 и рН 5.

Б. Высвобождение кальцеина при различных температурах. Аденовирус (2,8х1010в.ч./мл) в 50 мкл раствора СбС1 добавляли к липосомам в 25 мМ цитратном буфере, рН 3, 150 мМ ИаС! и регистрировали флуоресценцию (верхние кривые) при термостатировании. Нижние кривые - фоновый выход содержимого липосом при добавлении 50 мкл СбС1 без аденовируса. Высота вертикального отрезка соответствует 200 нМ кальцеина.

Мембранолитическая активность аденовируса, включенного в состав ДНК-пере носящей конструкции. Несомненный интерес представляют данные по мембранолитическим свойствам вируса в составе ДНК-переносящей конструкции. Добавление стрепта-видин-полилизина к аденовирусу приводило к стабилизации и усилению литической активности последнего с выходом на плато при соотношении стрептавидин-полилизин/внрус больше 100. Характер рН-зависимосги при этом не менялся. На разных этапах сборки полной конструкции тестировали мембранолитическую активность аденовируса по выходу кальцеина из липосом. Наибольшая литическая активность отмечена для содержащих вирус конструкций с соотношением лизин/нуклеотид = 2 и более (рис. 8). Таким образом, в процессе сборки содержащей вирус конструкции способность аденовирусов вызывать выход содержимого липосом не теряется, а напротив, в ряде случаев возрастает. Последнее может быть обусловлено как стабилизацией ви-рионов в водной среде при добавлении дополнительных компонентов, так и облегчением взаимодействия с фосфолипидной мембраной.

2.4. Трансфекция клеток эпителия молочной железы мыши in vitro.

Доставка генетического материала с помощью ДНК-переносящих конструкций была исследована на культуре клеток эпителия молочной железы мыши линии НС-11. Эффективность трансфекции оценивали по уровню экспрессии репортерного гена.

Трансфекция клеток эпителия молочной железы мыши линии НС-11 конструкцией инсулин-полилизин-ДНК. Была проанализирована способность конструкции (инсулин-полилизин)-ДНК трансфецировать клетки по рецептор-опосредованному механизму. Через 48 часов после трансфекции в клетках, инкубированных с конструкцией, была обнаружена активность люциферазы, в клетках, инкубированных с конструкцией в присутствии избытка свободного инсулина (1 мкМ) активность люциферазы отсутствовала (таблица 1).

Трансфекция конструкциями (инсулин-полилизин)-ДНК-(стрептавидин-полилизин)-аденовирус. Компартментализация ДНК-переносящих конструкций в везикулярных структурах представля&гся одним из главных лимитирующих этапов внутриклеточного транспорта конструкций. Использование различных агентов, обеспечивающих высвобождение ДНК-переносящих конструкций в цитоплазму из эндосом, значительно повышает эффективность доставки генов. В качестве эндосомолитического компонента для усиления трансфекции в данной работе были взяты аденовирусы человека Аё5 и птиц. Утиный аденовирус Е08-76 впервые использован в данной работе.

Рисунок 8.

Выход содержимого липосом под действием аденовируса в составе ДНК-переносящей конструкции.

вирус-

стрептавидин-полилизин конструкция

лизин^уютесщд

90мю1кснлрукциив 150 мМ№С1,25 мМНЕРЕ8,рН7,8 (101и в.ч. СЕЬОбисгтн, 2,49 пмапь стрепгвЕЭДИНжшитшна, 0,1 госта, ДНК, югупюнютшюин до соотвеплвукщего значения лизинЛ^кгаеощд) (-❖-) смешивали с 90 мкл 50 мМ цотра-пгго буффа, рН 3,150мМ№С1и 20 мхл липхгал №«>€»фсвали 30 минут щи 37°С. -0 Выход содержимого лигюсом под действием комплекса СЕЪОбеюпм (10ю в.ч) с стрешаащилшилизингаи (2,49 пшль) в 150мМЬШ,25мМНЕРЕ8,рН7,8.

Трансфекция конструкциями (инсулин-полилизин)-ДНК-(стрептавидин-полилизин) и (инсулин-полилизин)-ДНК-(стрептавидин-полилизин)-аденовирус.

Состав конструкции Активность люциферазы о.е.

№ Инсулин-полилизин рЯБУЬис Стрепта- ВНДИН- полнлнзин А(15 (11312-биотин Инсулин в среде

1 13,4 нМ 2,7 нМ 2,9 нМ 2,5±0,7

2 13,4 нМ 2,7 нМ 2,9 нМ 1 мкМ 0

3 13,4 нМ 2,7 нМ 2,9 нМ 3,6х 109 в.ч./мл 2520±336

4 13,4 нМ 2,7 нМ 2,9 нМ 3,6х109 в.ч./мл 1 шсМ 880±193

Трансфекция конструкция/ли (инсулин-полилизин)-ДНК-(стрептавидин-полилизин)-аденовирус. Компартментализация ДНК-переносящих конструкций в везикулярных структурах представляется одним из главных лимитирующих этапов внутриклеточного транспорта конструкций. Использование различных агентов, обеспечивающих высвобождение ДНК-переносящих конструкций в цитоплазму из эндосом, значительно повышает эффективность доставки генов. В качестве эндосомолитического компонента для усиления трансфекции в данной работе были взяты аденовирусы человека Ас15 и птиц. Утиный аденовирус ЕОБ-76 впервые использован в данной работе.

Клетки линии НС-11 трансфецировали конструкцией (инсу-лин-полилизин)-рК8УЬис-(стрептавидин-полилизин)-Ас15. Было получено 1000-кратное увеличение экспрессии репортерного гена по сравнению с такой же конструкцией без вируса (таблица 1). При инкубации клеток с содержащей вирус конструкцией и избытком свободного инсулина уровень экспрессии снижался на 65% (таблица 1). Уменьшение экспрессии в присутствии инсулина, указывает на то, что и содержащая вирус конструкция транспортируется посредством инсулиновых рецепторов.

Включение в состав конструкции (инсулнн-полилизин)-ДНК-(стрептавидин-полилизин)-аденов1фус биотинилированных птичьих аденовирусов CELO и EDS-76 также приводило к усилению трансфекции на 3 порядка. Мы не выявили различий в усилении трансфекции между тремя исследованными аденовирусами при включении их в состав конструкции.

Динамика экспрессии репортерного гена в культуре клеток. Рецептор-опосредованная доставка репортерного гена в составе плазмидной ДНК приводит как правило к временной экспрессии чужеродного генетического материала в клетках-мишенях. Тем не менее, продолжительность экспрессии может сильно варьировать. Была исследована динамика экспрессии репортерного гена при трансфекции in vitro. Клетки НС-11 трансфецировали конструкцией (инсулнн-полилизин)-рК5УЬис-(стрептавндин-полилизин)-(аденовирус). Через указанные на рисунке 9 интервалы времени проводили анализ люциферазной активности. Максимальный уровень активности люциферазы наблюдался через 3 суток после трансфекции. На 9 сутки после трансфекции уровень люциферазной активности составлял 80% от максимального. Известно, что период полужизни люциферазы в клетках млекопитающих составляет всего 3 часа (Thompson et al. 1991). Следовательно, более длительное сохранение ферментативной активности осуществляется за счет продолжения транскрипции, что свидетельствует об относительной стабильности введенной ДНК в клетках-реципиентах. Если трансфецированные клетки пересаживали, стимулируя их к делениям, активность люциферазы в таких клетках резко уменьшалась. Очевидно, что причиной падения активности является потеря чужеродной ДНК в процессе клеточных делений. Получение длительной экспрессии внехромосомной ДНК в ряде случаев представляется предпочтительнее достижения интеграции чужеродной ДНК, которая может оказывать нежелательное влияние на геном хозяина. Для решения этой задачи в настоящее время разрабатываются молекулярно-генетические подходы к проблеме пролонгирования экспрессии, например, создание реплицирующихся плазмидных векторов (Wendelburg and Vos, 1998).

Динамика экспрессии гена люциферазы в клетках линии НС-11.

100 Время, часы

150

200

Клетки трансфецировали конструкцией (инсулин-полилизин)-рИ5УЬис-{стрегпавидин-полилизин)-(СЕЬО-биотин) (0,1 нМ ДНК, Ю10 в.ч./мл). Активность люциферазы измеряли через указанное время после трансфекцин и нормировали на содержание белка в клеточных экстрактах.

Оптимизация содержащих вирус конструкций. Используемые в данной работе содержащие вирус ДНК-переносящие конструкции являются сложными многокомпонентными системами. Соотношения компонентов в составе таких конструкций могут влиять на их трансфецирующую способность. Были рассмотрены пути оптимизации состава конструкций с целью повышения эффективности доставки ДНК в клетки.

Для решения этой задачи сначала провели поиск оптимальных условий включения вирусных частиц в состав конструкций. Были подобраны условия биотинилирования аденовирусов (соотношение биотин/вирус = 75:1), а также определено соотношение

стрептавидин/вирус = (100-200): 1, при которых конструкции оказались наиболее эффективны.

На следующем этапе анализировали, как влияет соотношение количества вирусных частиц и молекул плазмиднон ДНК на трансфекцию. Максимальная экспрессия репортерного гена наблюдалась при применении конструкций, в которых по расчетам приходилось от 4 до 10 молекул плазмндной ДНК на 1 вирусную частицу (рис. 10).

Рисунок 10.

Трансфекцня клеток НС-11 конструкциями с различным соотношением вирус/плазмида.

а.

<и

я ЕГ 2

о я в

О)

0,01 0,1 1

Вирус/плазмида

Клетки транефепировали конструкцией следующего состава: 16,6 пМ биогиннлированный вирус CELO (Ю10 в.ч./мл), 3,3 нМ стрептавидин-полилизии, 0,08-3,6 мкг/мл pCMVLuc, инсулин-полилизин, полилизин, лизии/нуклеотид 4.

Как отмечалось выше, соотношение лизин/нуклеотид отражает заряд ДНК-переносящих конструкций. Заряд конструкций может влиять на размеры и поведение частиц в растворе (например, агрегацию или ее отсутствие), а также на транспорт конструкций

в клетки. Для исследования влияния заряда конструкций на доставку генетического материала были поставлены эксперименты по трансфекции конструкциями с различными соотношениями лизин/нуклеотид. Увеличение соотношения лизин/нуклеопгид в конструкции (ннсулин-полшшзин)-ДНК-{стрептавидин-

полилизин)-аденовирус-полилизин до 2 приводило к значительному увеличению люциферазной активности в трансфецирован-ных клетках (рис. 11). При трансфекции конструкциями с соотношением лизин/нуклеотид - б и более уровень экспрессии введенного гена вновь падал.

Рисунок 11.

Трансфекция клеток НС-11 конструкциями с различным соотношением лизин/нуклеотид.

и о

4 & 12 16 20 Лизин/нуклеотид

Клетей трансфецировали конструкциями, «держащими СНГ О-бисгган (10ю в.ч.), страпаввдин-полилюин (3,3 пмоль), рСМУЬис (0,2 пмоль), икулин-тлнлизнн (4,6 пмоль) и голилюин до соответствующего соотношения лкзин'нуклеотвд. Активность люциферазы измяли через 48 часов пхлз транофекцни.

Проведенная в данной работе серия экспериментов по оптимизации содержащих вирус конструкций позволила получить увеличение экспрессии репортерного гена в культуре более чем в

10 раз, и понизить концентрацию доставляемой ДНК также приблизительно на порядок без уменьшения эффективности.

Нами получены экспериментальные данные, что отсутствие или наличие сыворотки в среде для трансфекцин, а также хранение при температуре -70°С в течение месяца и более не влияют на свойства ДНК-переносящих конструкций н эффективность трансфекцин ими. Такие свойства ДНК-переносящих конструкций дают возможность готовить стандартные партии препарата и 'использовать их в течение длительного времени.

2.5. Рецептор-опосредованная трансфекция эпителия молочных желез in vivo.

Трансфекция молочных желез мыши. Для исследования экспрессии чужеродной ДНК in vivo конструкцию (инсулин-полилизин)-ДНК вводили в протоки молочных желез мышей. Через 1, 3, б и 9 дней после трансфекцин животных забивали и препарировали молочные железы. Активность люциферазы определяли в тканевых гомогенатах в течение всего эксперимента (9 дней, рисунок 12).

Мы трансфецировали молочные железы мышей различными безвирусными и содержащими вирус ДНК-переносящими конструкциями с целью определить варианты конструкций, наиболее эффективные in vivo. Наиболее высокий уровень активности люциферазы в ткани молочных желез регистрировали в результате трансфекцин конструкциями (инсулин-полилизин)-ДНК с соотношением лизин/нуклеотид 0,6 и концентрацией по ДНК порядка 30-40 нМ. Полученные экспериментальные данные позволили сопоставить результаты трансфекцин клеток в культуре и трансфекцин молочных желез одними и теми же конструкциями (рис. 13). На их основании нами выявлены некоторые особенности ре-цептор-опосредованой доставки ДНК in vitro и in vivo.

Во-первых, рецептор-опосредованная трансфекция клеток в культуре приводит к более высокому уровню экспрессии репор-терного гена. Во-вторых, при включении аденовируса в состав конструкции наблюдается усиление трансфекцин культуры клеток более чем на 3 порядка, тогда как при трансфекцин молочных

Динамика экспрессии люциферазы в молочной железе мыши.

Конструкцию (инсулин-полилизтО-рЯЗУЬис (646 нМ инсулин-полилизина, 37,5 нМ ДНК) в растворе Хенкса вводили в молочные протоки мыши по 25 мкл (опыт). В контрольные железы вводили по 25 мкл раствора Хенкса (контроль). Через указанные интервалы времени после трансфекции мышей забивали и измеряли активность люциферазы в гомогенатах молочных желез.

желез — в 10-20 раз. Кроме того, при трансфекции in vitro наибольший уровень экспрессии дают конструкции с соотношением лизин/нуклеотид 2-4, in vivo такие конструкции не работают. Полученное нами данные свидетельствуют, что эффективность доставки генов in vivo мало предсказуема на основе результатов, получаемых in vitro, По-ввдимому, эффективность ДНК-переносящих конструкций in vivo и in vitro определяется различными факторами. При трансфекции клеток в культуре на первый

опыт контроль

Время, дни.

Трансфекция эпителия молочной железы мыши in vivo и in vitro.

Клетки НС-11 в культуре (in vitro) и молочные железы мышей (in vivo) трансфецировали конструкциями А. (инсулин-полилизин)-ДНК (3 нМ ДНК, лизин/нуклеотид 0,6); Б. (инсулин-полилизин)-ДНК-(стрептавидин-полилизин)-аденовирус (3 нМ ДНК, лизин/нуклеотид 0,6, Ad5 Ю10 в.ч./мл); В. (инсулин-полилизин)-ДНК-(стрептавидин-полилизин)-аденовирус (3 нМ ДНК, лизин/нуклеотид 2, Ad5 Ю10 в.ч./мл). Активность люциферазы измеряли в клеточных лизатах и тканевых гомогенатах через 48 часов после трансфекции.

план выходят факторы, обусловливающие эффективное проникновение конструкций в клетки и преодоление внутриклеточных барьеров. Успешная доставка ДНК in vivo зависит от учета дополнительных условий и биологических барьеров в организме, отсутствующих в системах культур клеток. Так, при местном введении ДНК-переносящие конструкции могут взаимодействовать с материалом внеклеточного матрикса, при инъекциях в кровеносную систему — также с клетками ретикулоэндотелиальной системы, белками крови и т.п. Отрицательную роль играет и неспецифическое связывание с клетками и тканями.

Трансфекция молочных желез овец. Молочные железы овец трансфецировали конструкцией (инсулин-полилизин)-р118УЬис-

(стрептавидин-полилизин)-Е08-76.

Через 1, 3, 8 и 29 дней после введения конструкции в проток молочной железы брали биопсию паренхимы молочной железы. Изменение активности люциферазы в гомогенатах ткани с течением времени после введения конструкции представлено на рисунке 14. При трансфекции молочных желез овец, как и в случае трансфекции молочных желез мышей, максимальный уровень экспрессии наблюдался через сутки после трансфекции затем происходило резкое падение активности. В биоптатах молочной железы овцы активность люциферазы была обнаружена спустя месяц после введения ДНК-переносящих конструкций.

Таким образом, впервые продемонстрирована возможность трансфекции молочных желез животных путем рецептор-опосредованного переноса генетического материала, введенного в молочный проток. Однако трансфекция молочных желез является не единственным возможным способом создания животных биореакторов при помощи рецептор-опосредованного переноса генов. В совместной работе с М.М. Ивановой, Б.С. Народицким и В. Ланда конструкции (инсулин-полилизин)-ДНК и (инсулин-полилизин)-ДНК-(стрептавидин-полилизин)-аденовирус использовали для трансфекции ранних эмбрионов млекопитающих. Методом видеоинтенсификационной микроскопии и блот-гибридизационного анализа показано, что конструкции эффективно доставляют ДНК в доим плантационные эмбрионы млекопитающих.

2.6. Секреция модифицированной люциферазы в молоко после трансфекции молочной железы in vivo.

Секреторные формы люциферазы. Известно, что в клетках млекопитающих, трансфецированных геном люциферазы, исходный белок локализуется в пероксисомах (Keller et al., 1987).

Динамика экспрессии люциферазы в паренхиме молочной железы овцы.

180

а>

2 ч

о о К я

150 120 90 60 30 0

Время, дни

Конструкцию (инсулин-полилизин)-р118У1л1С-

(стрептавидин-полнлизин)-Е08 (2,7 нМ по ДНК) вводили проток молочной железы овцы. Через указанное время после трансфекции измеряли активность люциферазы в биоптатах.

Группой И.Н. Шатского была проведена работа по созданию репортерных генов, кодирующих секреторные белки на основе люциферазы. С целью изменить внутриклеточную локализацию люциферазы были сконструированы химерные белки (таблица 2) представляющие собой шоциферазу с добавленным на Ы-конец сигнальным пептидом секреторного белка (сигнальная последовательность овечьего Р-лакто глобулина) и люциферазу, слитую с самим секреторным белком (а-лактальбумин человека). Для рецептор-опосредованной трансфекции гены модифицированной люциферазы были встроены в плазмиды - рКБУзрВЬОЬис, рСМУЬАЬис.

Таблица 2.

Секреторные белки на основе люциферазы.

Кодируемый белок Секреторный, сигнал Обозначение

Люцифераза Ьис

Сигнальный пептид овечьего Р-лактоглобулина-люцифераза МКСЬЬЬАЬСЬА ЬАССУОАНУТО ТМКЕОАСМКК... БрВШЬис

а-лактальбумин-люцифераза \1RFFVPLFLVGIL 1ТА1ЬАКдр ЬАЬис

Анализ активности люциферазы в молоке трансгенных животных. Плазмиды рИЗУЬис и рИБУврВЬСЬис были использованы для трансфекции молочных желез мышей. Плазмидную ДНК (2,7 нМ) в составе конструкции (инсулин-полилизин)-ДНК-(стрептавидин-полилизин)-ЕВ8-биотин (лизин/нуклеотид 0,6, Ю10 в.ч./мл) вводили в проток молочной железы мыши на 14, 16, 18 день беременности. После родов и начала лактации брали пробы молока и измеряли активность люциферазы. Результаты представлены в таблице 3. Только мыши, молочные железы которых были трансфецированы конструкцией с рЯБУврВЬСЬис, дали молоко с люциферазной активностью.

Таблица 3.

Секреция люциферазы с молоком мыши.

Плазмнда Активность люциферазы в молоке, о.е./мл Число проб

рЯБУЬис 0 4

р^УврВЬСЬис 118±13 6

Для трансфекции молочных желез овец была выбрана плаз-мида с геном, кодирующим химерный белок лактальбумин-

люцифераза. В течение 14 дней 3 овцы получали гормональные инъекции для индукции лактации (Archer et al. 1994). Конструкцию (инсулин-полилизин)-рСМУЬАЬис (30 нМ ДНК, 910 нМ полилизина) вобъеме 75 мл вводили каждой овце на 10 день инъекций в одну железу и на 12 день - в обе железы. По окончании курса гормональной стимуляции у двух овец появилось молоко. В течение лактации молоко собирали отдельно из каждой железы и анализировали в нем экспрессию гена люциферазы по ферментативной активности и методом иммуноблоттинга. В молоке из однократно трансфецированных желез на пятый день лактации была зарегистрирована активность люциферазы 2 о.е./мл. В другие дни ферментативная активность не обнаружена. Железы, в которые конструкция была введена дважды, секретировали молоко с более высокой активностью люциферазы, пик активности наблюдался на четвертый и пятый дни от начала лактации (рис. 15). На рисунке 16 приведены результаты Вестерн-блот анализа образцов молока, взятых на 2 и 4 дни лактации из дважды транс-фецированной молочной железы овцы.

Рисунок 15.

Секреция люциферазы с молоком овцы.

Время лактации, дни.

Конструкцию (инсулин-полилизин)-рСМУЬАЬис ввели в молочную железу овцы на 10 и 12 день гормональной индукции лактации. В ходе лактации отбирали пробы молока и анализировали активность люциферазы.

Рисунок 16.

Анализ молока методом иммуоблотгинга.

Iter U

1- люцифераза светлячка (Sigma), 2 - экстракт клеток HC-11, трансфецированных плазмидой pCMVLALuc, 3-4 -образцы молока, взятые на 2 и 4 дни лактации. Первичные антитела - кроличьи антитела к люциферазе (Promega).

ВЫВОДЫ.

1. Показано, что ДНК-переносящие конструкции, содержащие инсулин-полилизин, обеспечивают транспорт ДНК в клетки эпителия молочной железы мыши линии НС-11 через инсулино-вые рецепторы. Успешно проведена рецептор-опосредованная трансфекция клеток эпителия молочной железы в культуре.

клеток линии НС-11 более чем на 3 порядка. Максимальная экспрессия репортерного гена наблюдается в результате трансфек-ции конструкциями с соотношением лизин/нуклеотнд от 2 до 4, а плазмида/вйрус от 4 до 10.

3. Впервые осуществлена рецептор-опосредованная транс-фекция эпителия молочной железы in vivo путем местного введения ДНК-переносящих конструкций. Получены данные об особенностях рецептор-опосредованной доставки ДНК in vitro и in vivo.

4. Исследована динамика экспрессии репортерного гена в результате рецептор-опосредованной трансфекции клеток эпителия молочной железы в культуре, а также рецептор-опосредованной трансфекции молочных желез мышей и овец.

5. Впервые продемонстрирована принципиальная возможность получения секретируемых белков с молоком сельскохозяйственных животных в результате рецептор-опосредованной трансфекции молочных желез при введении ДНК-переносящих конструкций через молочный проток.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Смирнова O.A., Розенкранц A.A., Никитин В.А., Шатский И.Н., Народицкий Б.Н., Соболев A.C. Трансформация клеток молочной железы ДНК-переносящнми конструкциями in vitro и in vivo. В кн.: Международная конференция, посвященная памяти акад. A.A. Баева. Москва, 20-22 мая, 1996, с. 62.

2. Смирнова O.A., Шилов И.А., Розенкранц A.A., Никитин В.А., Шатский И.Н., Соболев A.C. Секреция светлячковой люци-феразы в молоко мышей после трансформации молочной железы in vivo. В кн.: Международная конференция, посвященная памяти акад. A.A. Баева. Москва, 20-22 мая, 1996, с. 63.

3. Розенкранц A.A., Смирнова O.A., Соболев A.C. Исследование транспорта ДНК-переносящих конструкций в культивируемых клетках молочной железы линии НС-11. В кн.: Международная конференция, посвященная памяти акад. A.A. Баева. Москва, 20-22 мая, 1996, с. 59.

4. Розенкранц A.A., Смирнова O.A., Юров Г.К., Гулак П.В., Неугодова Г.Л., Народицкий Б.Н., Соболев A.C. Усиление рецептор-опосредованной генетической трансформации клеток адено-

вирусами и синтетическим конъюгатом с амфипатическим пептидом. В кн.: Международная конференция, посвященная памяти акад. A.A. Баева. Москва, 20-22 мая, 1996, с. 60.

5. Соболев A.C., Розенкранц A.A., Иванова М.М., Смирнова O.A., Никитин В.А., Народицкий Б.С., Эрнст JI.K. Способ получения трансгенных животных. Патент РФ № 2108714,1996.

6. Иванова М.М., Соболев A.C., Смирнова O.A., Розенкранц A.A., Никитин В.А., Народицкий Б.С.. Введение чужеродного генетического материала методом рецептор-опосредусмого эндо-цитоза в эмбрионы млекопитающих. В кн.: тезисы докладов международной конференции "ДНК технологии в животноводстве и ветеринарии". Киев. 20-21 ноября, 1997, с. 26

7. Smimova ОА, Rosenkranz A.A., Nikitin V.A., Naioditsky B.S., Sobolev AS. The comparison of insulin reeeptor-mediated transformation of mammaiy gland cells in vitro and in vivo. "Secood Advanced Course of Geoe Therapy." Venice, 13-18 September, 1997, p. 53.

8. Rosenkranz, A.A., Antooenko, Y.N., Smimova, OA., Yurov, O.K., Naioditsky, B.S., and Sobolev, A.S. Avian Adenovirus Induces loa Channels in Model Bilayer Lipid Membranes. Biochan.Biophys.Rßs.Commun. 236:750-753,1997.

9. Soboiev, A.S., Rosenkranz, A.A., Smimova, O.A., Nikitin, VA, Neugodova, O.L., Naioditsky, B.S., Shilov, I.N., Shatsld, I.N., and Emst, L.K. Rßoeptor-mediated transfectioß of murine and ovine mammaiy glands in vivo. J.Biol.Chem. 273:7928-7933,1998.

10. Ivanova, M.M., Rosenkranz, AA, Smimova, О A, Nikitin, VA, Sobolev, AS., Landa, V., Naioditsky, B.S., and Emst, L.K. Receptor-Mediated Transport of Foreign DNA Inio Preimplantatk» Mammalian Embryos. Molecular Repioductk» and Development 54:112-120,1999.

11. Смирнова O.A., Розенкранц A.A., Соболев A.C. Использование аденовирусов как эндосомолитических компонентов рецептор-опосредованных ДНК-переносящих конструкций: функциональный анализ и оптимизация системы (аденовирус-сгрептавидин-полилизин)-ДНК-инсулин-полнлизин. В кн.: П съезд биофизиков России, тезисы докладов. Москва, 23-27 августа, 1999, с. 287-288.

12. Розенкранц АА, Смирнова O.A., Иванов Н.Е., Соболев АС. Зависимость эффективности трансфекции клеток в культуре от заряда модульных конструкций для переноса генов при помощи рецептор-опосредованного эндоцитоза. В кн.: П съезд биофизиков России, тезисы докладов. Москва, 23-27 августа, 1999, с. 272-273.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Смирнова, Ольга Анатольевна

Список сокращений.

Введение.

Обзор литературы.

1. Рецептор-опосредованная трансфекция.

1.1. ДНК-переносящие конструкции для рецептор-опосредованной трансфекции.

1.1.1. ДНК.

1.1.2. Лиганды.

1.1.3. Поликатионы.

1.1.4. Компактизация ДНК и размеры трансфецирующих комплексов.

1.2. Транспорт ДНК-переносящих конструкций.

1.2.1. Эндоцитоз.

1.2.2 Внутриклеточный транспорт конструкций.

1.2.2.1. Транспорт через мембрану эндосом.

1.2.2.2. Транспорт в ядро.

2. Использование аденовирусов для усиления эффективности трансфекции.

2.1. Транспорт аденовирусов.

2.2. Влияние аденовирусов на транспорт макромолекул в клетки.

2.3.Усиление рецептор-опосредованной доставки генетического материала.

2.4. Включение аденовирусов в систему рецептор-опосредованной доставки ДНК.

2.5. Действие аденовирусов на другие методы трансфекции.

3. Доставка генетического материала in vivo.

3.1. Способы введения ДНК-переносящих конструкций in vivo.

3.2. Некоторые особенности рецептор-опосредованной трансфекции ш vivo.

3.2.1 Введение ДНК-переносящих конструкций и иммунный ответ организма.

3.2.2 Пути увеличения продолжительности экспрессии трансгена.

3.2.2.1. Частичная гепатэктомия.

3.2.2.2. Оптимальная конденсация ДНК.

4. Животные-биореакторы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование рецептор-опосредованной трансфекции клеток эпителия молочной железы in vitro и in vivo"

14. Анализ активности люциферазы.44

14.1. Получение клеточных и тканевых лизатов.44

14.2 Определение содержания белка в пробах.45

14.3. Определение активности люциферазы.45

15. Вестерн-блот анализ.45

Результаты.46

1. Сборка ДНК-переносящих конструкций.46

1.1. Синтез компонентов ДНК-переносящих конструкций.46

1.2. Оценка связывания ДНК с конъюгатом инсулин-полилизин.46

1.3. Сборка ДНК-переносящих конструкций.48

2. Исследование транспорта ДНК-переносящих конструкций в клетки линии НС-11 методом видеоинтенсификационной микроскопии.49

2.1. Транспорт конъюгата инсулин-полилизин.49

2.2. Транспорт флуоресцентно-меченной ДНК-переносящей конструкции в клетки линии НС-11.51

2.3. Внутриклеточная локализация ДНК-переносящих конструкций.53

3. Влияние аденовирусов на проницаемость фосфолипидной мембраны.54

3.1. Выход содержимого липосом под действием аденовирусов.54

3.2. Мембранолитическая активность аденовируса, включенного в состав ДНК-переносящей конструкции.56

4. Трансфекция клеток эпителия молочной железы мыши in vitro.59

4.1. Трансфекция клеток эпителия молочной железы мыши линии НС-11 конструкцией инсулин-полилизин-ДНК.59

4.2. Использование аденовирусов для усиления рецептор-опосредованной трансфекции.60

4.2.1. Трансфекция в присутствии свободных аденовирусов.60

4.2.2. Трансфекция конструкциями (инсулин-полилизин)-ДНК-(стрептавидин-полилизин)-аденовирус.61

4.2.3. Оптимизация содержащих вирус конструкций.64

5. Рецептор-опосредованная трансфекция эпителия молочных желез in vivo.66

5.1. Трансфекция молочных желез мыши.66

5.2. Трансфекция молочных желез овец.69

6. Секреция модифицированной люциферазы в молоко после трансфекции молочной железы in vivo.71

6.1. Секреторные формы люциферазы.71

6.2. Анализ активности люциферазы в молоке трансгенных животных.72

Обсуждение результатов.75

Выводы.83

Список литературы.84

Благодарности.100

Список сокращений.

Ad2 - аденовирус человека серотип 2 Ad5 - аденовирус человека серотип 5

BES - К,К-бис(2-оксиэтил)-2-аминоэтансульфоновая кислота CELO - Chicken Embryo Lethal Orphan CMV - цитомегаловирус

EDS-76 - Egg Drop Syndrome-76 Синдром снижения яйценоскости EGF - эпидермальный фактор роста HBS - 25 мМ HEPES, рН 7,5, 150 мМ NaCl

HEPES - К-(2-оксиэтил)пиперазин-ГчГ'-(2-этансульфоновая кислота) LA - а-лактальбумин Luc - люцифераза

NHS-AC-биотин - N-оксисукцинимидный эфир биотинамидокапроата RSY - вирус саркомы Рауса SDS - додецилсульфат натрия

SpBLG - сигнальный пептид овечьего Р-лактоглобулина

SPDP - N-сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио)пропионат

БСА - бычий сывороточный альбумин в.ч. - вирусные частицы

ДТТ - дитиотреитол о.е. - относительные световые единицы т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов

ФИТЦ - флуоресцеинизотиоцианат

ЭГТА - этиленгликоля, бис(2-аминоэтиловый эф ир)-Ы ,N,N ' ,N ' -тетраацетат ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

Введение.

К настоящему времени изолированы и охарактеризованы сотни генов, кодирующих белки, имеющие большое значение для медицины и других потребностей человека. Получение таких белков в достаточных количествах является одной из важных задач биотехнологии. Выделение и очистка необходимых белков из крови или тканей является дорогостоящей процедурой, сопряженной с возможной контаминацией инфекционными агентами. Развитие методов генной инженерии привело к созданию бактериальных систем экспрессии для получения требуемых белков. Однако, в бактериальных системах не всегда удается осуществить посттрансляционные модификации эукариотических белков, такие как фосфорилирование, гликозилирование и аминирование. С этой же целью могут использоваться эукариотические системы экспрессии, например - масштабное культивирование клеток млекопитающих. Недостатком эукариотических систем экспрессии является их низкая рентабельность, т.к. для культивирования требуются относительно большие затраты, а выход и концентрация белков не велики. Другое направление основано на создании трансгенных животных-биореакторов, способных продуцировать целевые белки человека и транспортировать их во внеклеточные жидкости организма.

В этой связи молочная железа млекопитающих представляется естественным биореактором для продукции рекомбинантных белков и секреции их с молоком. Молочная железа обладает огромным синтетическим потенциалом, так как исходно предназначена для синтеза и извлечения большого количества белка. Концепция молочной железы как биореактора потенциально имеет ряд преимуществ с точки зрения биотехнологии: получение нативных белков, большой выход, отсутствие токсичных примесей.

В качестве одного из путей введения трансгена для создания животных-биореакторов предлагается использование методов трансфекции соматических клеток. Трансфекция молочной железы может осуществляться путем непосредственного введения генетического материала через молочный проток. Местное введение ДНК-переносящих конструкций представляется несложной и малотравматичной процедурой, кроме того, оно позволяет создать более высокие концентрации трансфецирующих конструкций и минимизировать потери, неизбежные при системном введении.

К настоящему времени разработано большое количество методов введения чужеродной ДНК в эукариотические клетки (Yang, 1992; Desnick and Schuchman, 1998). В последнее время проводятся интенсивные исследования в области систем доставки ДНК в организм животных, в том числе - рецептор-опосредованной трансфекции. Рецептор-опосредованная доставка генетического материала сочетает использование естественного для клетки механизма рецептор-опосредованного транспорта и синтетических лигандированных конструкций, что, в принципе, может позволить специфически трансфецировать любой выбранный тип клеток (Michael and Curiel, 1994; Guy et al. 1995). Этот метод дает возможность трансфецировать также дифференцированные и неделящиеся клетки. Он применяется для трансфекции in vitro и in vivo. Данный метод позволяет легко варьировать и заменять компоненты конструкций, в том числе доставляемый генетический материал и адресный лиганд. Метод не накладывает строгих ограничений по последовательности и размерам молекул ДНК. Компоненты ДНК-переносящих конструкций могут быть выделены (плазмиды) или синтезированы (бифункциональные конъюгаты) в достаточно большом количестве. Для внедрения метода в биотехнологию представляется важным дальнейшее исследование закономерностей и механизмов рецептор-опосредованной трансфекции и ее оптимизация, особенно для применения in vivo.

Под руководством A.C. Соболева была разработана система рецептор-опосредованной доставки генетического материала с инсулином в качестве лиганда (Соболев, 1988). Этот подход успешно использовался при трансфекции клеток гепатомы человека в культуре (Розенкранц и др. 1990; Rosenkranz et al. 1992). Исходя из того, что клетки эпителия молочной железы обладают инсулиновыми рецепторами (Burnol et al. 1990), инсулин был выбран в качестве лиганда для рецептор-опосредованной доставки генетического материала в клетки эпителия молочной железы. Таким образом, на основании имеющейся на сегодня совокупности данных нами была предложена идея создания животного-биореактора путем рецептор-опосредованной трансфекции молочной железы. В развитие этой идеи и выполнялась данная работа. 7

Цель исследования:

Целью настоящей работы было изучение возможности использования рецептор-опосредованной доставки генетического материала в клетки эпителия молочных желез для получения целевых белков с молоком сельскохозяйственных животных.

Для реализации указанной цели были поставлены следующие практические задачи:

3. Осуществить рецептор-опосредованную доставку репортерного гена в клетки эпителия молочной железы in vivo.

Обзор литературы.

Человеческое знание неизмеримо во все стороны, и из того, что достойно знания, никто в одиночку не может знать даже и тысячной доли.

Артур Шопенгауэр "Афоризмы и максимы "

В последние десятилетия получили широкое развитие методы создания рекомбинантных ДНК, доставки ДНК в клетки млекопитающих in vitro и in vivo, а также методы исследования экспрессии введенных генов. Эти технологические достижения привели к возможности практического применения в биотехнологии - для производства белков клинической важности, ранее получаемых из природных источников, и в медицине - для лечения генетических заболеваний путем интродукции нормального гена в соответствующие клетки больного организма (генная терапия).

Несмотря на то, что к настоящему времени разработано большое количество методов введения чужеродной ДНК, проблема эффективного транспорта ДНК in vivo остается нерешенной (Yang, 1992; Desnick and Schuchman, 1998). Существует ряд требований, обеспечивающих возможность и эффективность применения in vivo тех или иных систем доставки: 1) направленность - поступление ДНК в избранный тип клеток/тканей, 2) эффективность, 3) отсутствие токсичности и безопасность для организма, 4) устойчивость при хранении и введении в организм, 5) технологичность и относительная дешевизна получения переносчиков ДНК, 6) отсутствие ограничений переносимой ДНК. Метод рецептор-опосредованной трансфекции во многом соответствует этим требованиям (Michael and Curiel, 1994; Guy et al. 1995). Этот метод сочетает использование естественного для клетки механизма рецептор-опосредованного транспорта и синтетических лигандированных конструкций, что, в принципе, может позволить специфически трансфецировать любой выбранный тип клеток. Он применяется для трансфекции клеток животных in vitro и in vivo. В настоящее время во многих научных лабораториях идет интенсивная работа по превращению потенциальных возможностей данного метода в реальный высокоэффективный способ направленной доставки генов in vivo.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Смирнова, Ольга Анатольевна

Выводы.

1. Показано, что ДНК-переносящие конструкции, содержащие инсулин-полилизин, обеспечивают транспорт ДНК в клетки эпителия молочной железы мыши линии НС-11 через инсулиновые рецепторы. Успешно проведена рецептор-опосредованная трансфекция клеток эпителия молочной железы в культуре.

2. Показано, что включение аденовирусов человека и птиц в качестве мембранолитических компонентов в состав ДНК-переносящих конструкций и дальнейшая оптимизация таких конструкций приводят к увеличению эффективности трансфекции клеток линии НС-11 более чем на 3 порядка. Максимальная экспрессия репортерного гена наблюдается в результате трансфекции конструкциями с соотношением лизин/нуклеотид от 2 до 4, плазмида/вирус от 4 до 10.

3. Впервые осуществлена рецептор-опосредованная трансфекция эпителия молочной железы in vivo путем местного введения ДНК-переносящих конструкций. Получены данные об особенностях рецептор-опосредованной доставки ДНК in vitro и in vivo.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Смирнова, Ольга Анатольевна, Москва

1. Розенкранц А.А., Ячменев С.В., Соболев А.С. (1990) Использование искусственных конструкций для селективного переноса генетического материала в клетки человека путем рецептор-опосредованного эндоцитоза, Докл. А.Н. СССР 312: 493-494.

2. Соболев А.С. (1988) Динамика мембранных рецепторов. Международная конференция по медицинской биохимии МЗ СССР, 17-21 октября Москва.

3. Соболев А.С., Розенкранц А.А., Иванова М.М., Смирнова О.А., Никитин В.А., Народицкий Б.С., Эрнст J1.K. (1996) Способ получения трансгенных животных. Патент РФ №2108714.

4. Соболев А. С., Розенкранц А. А., Никитин В. А. (1994) Способ генетической трансформации молочной железы животного и устройство для введения генетического материала в молочный проток молочной железы животного. Патент РФ №2025487.

5. Фриц Ханс-Иоахим. (1988) Гл.8. Направляемый олигонуклеотидами мутагенез в рекомбинантных нитевидных фагах. Стр. 191-205 в книге Клонирование ДНК. Методы: Пер. с англ./ Под ред. Д. Гловера. М.: Мир,.-538 е., ил.

6. Airth, R.L., Rhodes, W.C. and McElroy, W.D. (1958) The function of coenzyme A in luminescence. Biochim. Biophys. Acta, 27: 519-532.

7. Akhlynina, T.V., Jans, D.A., Rosenkranz, A.A., Statsyuk, N.V., Balashova, I.Y., Toth, G., Pavo, I., Rubin, A.B. and Sobolev, A.S. (1997) Nuclear targeting of chlorin e6 enhances its photosensitizing activity, J. Biol. Chem. 272: 20328-20331.

8. Akhlynina, T.V., Rosenkranz, A.A., Jans, D.A., Gulak, P.V., Serebryakova, N.V. and Sobolev, A.S. (1993) The use of internalizable derivatives of chlorin e6 for increasing its photosensitizing activity, Photochem. Photobiol. 58: 45-48.

9. Akhlynina, T.V., Rosenkranz, A.A., Jans, D.A. and Sobolev, A.S. (1995) Insulinmediated intracellular targeting enhances the photodynamic activity of chlorin e6, Cancer Res. 55: 1014-1019.

10. Baker, A. and Cotten, M. (1997) Delivery of bacterial artificial chromosomes into mammalian cells with psoralen-inactivated adenovirus carrier, Nucleic Acids Res. 25: 19501956.

11. Ball, R.K., Friis, R.R., Schoenenberger, C.A., Doppler, W. and Groner, B. (1988) Prolactin regulation of beta-casein gene expression and of a cytosolic 120-kd protein in a cloned mouse mammary epithelial cell line, EMBO J. 7: 2089-2095.

12. Batra, R.K., Wang-Johanning, F., Wagner, E., Garver, R.I., Jr. and Curiel, D.T. (1994) Receptor-mediated gene delivery employing lectin-binding specificity, Gene Ther. 1: 255-260.

13. Blumenthal, R., Seth, P., Willingham, M.C. and Pastan, I. (1986) Ph-dependent lysis of liposomes by adenovirus, Biochemistry, 25: 2231-2237.

14. Boletta, A., Benigni, A., Lutz, J., Remuzzi, G., Soria, M.R. and Monaco, L. (1997) Nonviral gene delivery to the rat kidney with polyethylenimine, Hum. Gene Ther. 8: 12431251.

15. Bommineni, V.R., Chowdhury, N.R., Wu, G.Y., Wu, C.H., Franki, N., Hays, R.M. and Chowdhury, J.R. (1994) Depolymerization of hepatocellular microtubules after partial hepatectomy, J. Biol. Chem. 269: 25200-25205.

16. Buckel, P. (1996) Recombinant proteins for therapy, Trends Pharmacol. Sci. 17: 450456.

17. Bunnell, B.A., Askari, F.K. and Wilson, J.M. (1992) Targeted delivery of antisense oligonucleotides by molecular conjugates, Somat. Cell Mol. Genet. 18: 559-569.

18. Burnol, A.F., Loizeau, M. and Girard, J. (1990) Insulin receptor activity and insulin sensitivity in mammary gland of lactating rats, Am. J. Physiol. 259: E828-34.

19. Campbell, P.G., Frey, D.M. and Baumrucker, C.R. (1987) Changes in bovine mammary insulin binding during pregnancy and lactation, Comp. Biochem. Physiol. BJ. 87: 649-653.

20. Capecchi, M.R. (1980) High efficiency transformation by direct microinjection of dna into cultured mammalian cells, Cell, 22: 479-488.

21. Carstea, E.D., Miller, S.P., Christakis, H. and ONeill, R.R. (1993) Analogues of butyric acid that increase the expression of transfected DNAs, Biochem. Biophys. Res. Commun. 192: 649-656.

22. Chardonnet, Y. and Dales, S. (1970) Early events in the interaction of adenoviruses with HeLa cells. I. Penetration of type 5 and intracellular release of the DNA genome. Virology, 40: 462-477.

23. Charnock Jones, D.S., Sharkey, A.M., Jaggers, D.C., Yoo, H.J., Heap, R.B. and Smith, S.K. (1997) In-vivo gene transfer to the uterine endometrium, Hum. Reprod. 12: 1720.

24. Chen, J., Gamou, S., Takayanagi, A. and Shimizu, N. (1994) A novel gene delivery system using egf receptor-mediated endocytosis, FEBSLett. 338: 167-169.

25. Cheng, D.Y., Kolls, J.K., Lei, D. and Noel, R.A. (1997) In vivo and in vitro gene transfer and expression in rat intestinal epithelial cells by El-deleted adenoviral vector, Hum. Gene Ther. 8: 755-764.

26. Cheng, S., Merlino, G.T. and Pastan, I.H. (1983) A versatile method for the coupling of protein to dna: synthesis of alpha 2-macroglobulin-dna conjugates, Nucleic Acids Res. 11: 659-669.

27. Chin, D.J., Green, G.A., Zon, G., Szoka, F.C., Jr. and Straubinger, R.M. (1990) Rapid nuclear accumulation of injected oligodeoxyribonucleotides, New Biol. 2: 1091-1100.

28. Chiou, H.C., Tangco, M.Y., Levine, S.M., Robertson, D., Kormis, K., Wu, C.H. and Wu, G.Y. (1994) Enhanced resistance to nuclease degradation of nucleic acids complexed to asialoglycoprotein-polylysine carriers, Nucleic Acids Res. 22: 5439-5446.

29. Chu, B.C., Wahl, G.M. and Orgel, L.E. (1983) Derivatization of unprotected polynucleotides, Nucleic Acids Res. 11: 6513-6529.

30. Cotten, M., Baker, A., Saltik, M., Wagner, E. and Buschle, M. (1994) Lipopolysaccharide is a frequent contaminant of plasmid dna preparations and can be toxic to primary human cells in the presence of adenovirus, Gene Ther. 1: 239-246.

31. Cotten, M., Wagner, E., Zatloukal, K. and Birnstiel, M.L. (1993) Chicken adenovirus (celo virus) particles augment receptor-mediated dna delivery to mammalian cells and yield exceptional levels of stable transformants,Virol. 67: 3777-3785.

32. Cristiano, R.J., Smith, L.C. and Woo, S.L. (1993) Hepatic gene therapy: adenovirus enhancement of receptor-mediated gene delivery and expression in primary hepatocytes, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 90: 2122-2126.

33. Croughan, M.S., Chiou, T.W. and Wang, D.I. (1995) Immobilized animal cell bioreactors, Bioprocess. Technol. 21: 377-411.

34. Curiel, D.T. (1994) High-efficiency gene transfer employing adenovirus-polylysine-dna complexes, Nat. Immun. 13: 141-164.

35. Curiel, D.T., Agarwal, S., Wagner, E. and Cotten, M. (1991) Adenovirus enhancement of transferrin-polylysine-mediated gene delivery, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 88: 8850-8854.

36. Curiel, D.T., Wagner, E., Cotten, M., Birnstiel, M.L., Agarwal, S., Li, C.M., Loechel, S. and Hu, P.C. (1992) High-efficiency gene transfer mediated by adenovirus coupled to dna-polylysine complexes, Hum. Gene Ther. 3: 147-154.

37. Defer, C., Belin, M.T., Caillet-Boudin, M.L. and Boulanger, P. (1990) Human adenovirus-host cell interactions: comparative study with members of subgroups b and c, J. Virol. (United. States),. Aug. 64: 3661-3673.

38. Desnick, R.J. and Schuchman, E.H. (1998) Gene therapy for genetic diseases, Acta Paediatr. Jpn. 40: 191-203.

39. Dunlap, D.D., Maggi, A., Soria, M.R. and Monaco, L. (1997) Nanoscopic structure of DNA condensed for gene delivery, Nucleic Acids Res. 25: 3095-3101.

40. Ebbinghaus, S.W., Vigneswaran, N., Miller, C.R., Chee Awai, R.A., Mayfield, C.A., Curiel, D.T. and Miller, D.M. (1996) Efficient delivery of triplex forming oligonucleotides to tumor cells by adenovirus-polylysine complexes, Gene Ther. 3: 287-297.

41. Edwards, R.J., Carpenter, D.S. and Minchin, R.F. (1996) Uptake and intracellular trafficking of asialoglycoprotein-polylysine-DNA complexes in isolated rat hepatocytes, Gene Ther. 3: 937-940.

42. Egilmez, N.K., Iwanuma, Y. and Bankert, R.B. (1996) Evaluation and optimization of different cationic liposome formulations for in vivo gene transfer, Biochem. Biophys. Res. Commun. 221: 169-173.

43. Erbacher, P., Bousser, M.T., Raimond, J., Monsigny, M., Midoux, P. and Roche, A.C. (1996) Gene transfer by DNA/glycosylated polylysine complexes into human blood monocyte-derived macrophages, Hum. Gene Ther. 7: 721-729.

44. Erbacher, P., Roche, A.C., Monsigny, M. and Midoux, P. (1996) Putative role of chloroquine in gene transfer into a human hepatoma cell line by dna/lactosylated polylysine complexes, Exp. Cell Res. 225: 186-194.

45. Erbacher, P., Roche, A.C., Monsigny, M. and Midoux, P. (1997) The reduction of the positive charges of polylysine by partial gluconoylation increases the transfection efficiency of polylysine/DNA complexes, Biochim. Biophys. Acta, 1324: 27-36.

46. Ferkol, T., Kaetzel, C.S. and Davis, P.B. (1993) Gene transfer into respiratory epithelial cells by targeting the polymeric immunoglobulin receptor, J. Clin. Invest. 92: 23942400.

47. Ferkol, T., Mularo, F., Hilliard, J., Lodish, S., Perales, J.C., Ziady, A. and Konstan, M. (1998) Transfer of the human Alphal-antitrypsin gene into pulmonary macrophages in vivo, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 18: 591-601.

48. Ferkol, T., Perales, J.C., Eckman, E., Kaetzel, C.S., Hanson, R.W. and Davis, P.B. (1995) Gene transfer into the airway epithelium of animals by targeting the polymeric immunoglobulin receptor, J. Clin. Invest. 95: 493-502.

49. Ferkol, T., Perales, J.C., Mularo, F. and Hanson, R.W. (1996) Receptor-mediated gene transfer into macrophages, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 93: 101-105.

50. Ferrari, S., Moro, E., Pettenazzo, A., Behr, J.P., Zacchello, F. and Scarpa, M. (1997) ExGen 500 is an efficient vector for gene delivery to lung epithelial cells in vitro and in vivo, GeneTher. 4: 1100-1106.

51. Fisher, K.J. and Wilson, J.M. (1994) Biochemical and functional analysis of an adenovirus-based ligand complex for gene transfer, Biochem. J. 299: 49-58.

52. Fitzgerald, D.J., Padmanabhan, R., Pastan, I. and Willingham, M.C. (1983) Adenovirus-induced release of epidermal growth factor and pseudomonas toxin into the cytosol ofkb cells during receptor-mediated endocytosis, Cell, 32: 607-617.

53. Fitzgerald, D.J., Trowbridge, I.S., Pastan, I. and Willingham, M.C. (1983) Enhancement of toxicity of antitransferrin receptor antibody-pseudomonas exotoxin conjugates by adenovirus, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 80: 4134-4138.

54. Forsayeth, J.R. and Garcia, P.D. (1994) Adenovirus-mediated transfection of cultured cells, Biotechniques, 17: 354-6, 357-8.

55. Fortunati, E., Bout, A., Zanta, M.A., Valerio, D. and Scarpa, M. (1996) In vitro and in vivo gene transfer to pulmonary cells mediated by cationic liposomes, Biochim. Biophys. Acta, 1306: 55-62.

56. Gao, L., Wagner, E., Cotten, M., Agarwal, S., Harris, C., Romer, M., Miller, L., Hu, P.C. and Curiel, D. (1993) Direct in vivo gene transfer to airway epithelium employing adenovirus-polylysine-dna complexes, Hum. Gene Ther. 4: 17-24.

57. Gao, X. and Huang, L. (1996) Potentiation of cationic liposome-mediated gene delivery by polycations, Biochemistry, 35: 1027-1036.

58. Ginobbi, P., Geiser, T.A., Ombres, D. and Citro, G. (1997) Folic acid-polylysine carrier improves efficacy of c-myc antisense oligodeoxynucleotides on human melanoma (Ml4) cells, Anticancer Res. 17: 29-35.

59. Gooding, L.R. (1992) Virus proteins that counteract host immune defenses, Cell (United. States),. Oct. 2. 71: 5-7.

60. Goula, D., Benoist, C., Mantero, S., Merlo, G., Levi, G. and Demeneix, B.A. (1998) Polyethylenimine-based intravenous delivery of transgenes to mouse lung. Gene Ther. 5: 1291-1295.

61. Goula, D., Remy, J.S., Erbacher, P., Wasowicz, M., Levi, G., Abdallah, B. and Demeneix, B.A. (1998) Size, diffusibility and transfection performance of linear PEI/DNA complexes in the mouse central nervous system, Gene Ther. 5: 712-717.

62. Gould, S.G., Keller, G.A. and Subramani, S. (1987) Identification of a peroxisomal targeting signal at the carboxy terminus of firefly luciferase, J. Cell Biol. 105: 2923-2931.

63. Greber, U.F., Webster, P., Weber, J. and Helenius, A. (1996) The role of the adenovirus protease on virus entry into cells, EMBO J. 15: 1766-1777.

64. Greber, U.F., Willetts, M., Webster, P. and Helenius, A. (1993) Stepwise dismantling of adenovirus 2 during entry into cells, Cell, 75: 477-486.

65. Guy, J., Drabek, D. and Antoniou, M. (1995) Delivery of dna into mammalian cells by receptor-mediated endocytosis and gene therapy, Mol. Biotechnol. 3: 237-248.

66. Hansma, H.G., Golan, R., Hsieh, W„ Lollo, C.P., Mullen Ley, P. and Kwoh, D. (1998) DNA condensation for gene therapy as monitored by atomic force microscopy, Nucleic Acids Res. 26: 2481-2487.

67. Harris, C.E., Agarwal, S., Hu, P., Wagner, E. and Curiel, D.T. (1993) Receptor-mediated gene transfer to airway epithelial cells in primary culture, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 9: 441-447.

68. Honda, M., Hu, P.C., Huang, C.H., Matsui, H. and Lemon, S.M. (1996) A replication-deficient adenovirus enhances liposome-mediated nucleic acid transfer into a stable cell line expressing T7 RNA polymerase, J. Virol. Methods, 58: 41-51.

69. Houdebine, L.M., Djiane, J., Dusanter-Fourt, I., Martel, P., Kelly, P.A., Devinoy, E. and Servely, J.L. (1985) Hormonal action controlling mammary activity, J. Dairy. Sci. 68: 489-500.

70. Huckett, B., Ariatti, M. and Hawtrey, A.O. (1990) Evidence for targeted gene transfer by receptor-mediated endocytosis. stable expression following insulin-directed entry of neo into hepg2 cells, Biochem. Pharmacol. 40: 253-263.

71. Huckett, B., Gordhan, H., Hawtrey, R., Moodley, N., Ariatti, M. and Hawtrey, A. (1986) Binding of dna to albumin and transferrin modified by treatment with water-soluble carbodiimides, Biochem. Pharmacol. 35: 1249-1257.

72. Jones, N. and Shenk, T. (1979) Isolation of adenovirus type 5 host range deletion mutants defective for transformation of rat embryo cells, Cell, 17: 683-689.

73. Katayose, S. and Kataoka, K. (1998) Remarkable increase in nuclease resistance of plasmid DNA through supramolecular assembly with poly(ethylene glycol) -poly(L-lysine) block copolymer, J. Pharm. Sci. 87: 160-163.

74. Keller, G.A., Gould, S., Deluca, M. and Subramani, S. (1987) Firefly luciferase is targeted to peroxisomes in mammalian cells, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 84: 3264-3268.

75. Kerr, D.E., Liang, F., Bondioli, K.R., Zhao, H., Kreibich, G., Wall, R.J. and Sun, T.T. (1998) The bladder as a bioreactor: urothelium production and secretion of growth hormone into urine see comments., Nat. Biotechnol. 16: 75-79.

76. Kircheis, R., Kichler, A., Wallner, G., Kursa, M., Ogris, M., Felzmann, T., Buchberger, M. and Wagner, E. (1997) Coupling of cell-binding ligands to polyethylenimine for targeted gene delivery, Gene Ther. 4: 409-418.

77. Kircheis, R., Schuller, S., Brunner, S., Ogris, M., Heider, K.-H., Zauner, W. and Wagner, E. (1999) Polycation-based DNA complexes for tumor-targeted gene delivery in vivo. The Journal of Gene Medicine, 1: 111-120.

78. Klemm, A.R., Young, D. and Lloyd, J.B. (1998) Effects of polyethyleneimine on endocytosis and lysosome stability, Biochem. Pharmacol. 56: 41-46.

79. Koths, K. (1995) Recombinant proteins for medical use: the attractions and challenges, Curr. Opin. Biotechnol. 6: 681-687.

80. Laver, W.G., Younghusband, H.B. and Wrigley, N.G. (1971) Virology, 45: 598-614.

81. Lee, R.J. and Huang, L. (1996) Folate-targeted, anionic liposome-entrapped polylysine-condensed dna for tumor cell-specific gene transfer, J. Biol. Chem. 271: 84818487.

82. Li, P., Bellett, A.J. and Parish, C.R. (1984) The structural proteins of chick embryo lethal orphan virus (fowl adenovirus type 1), J. Gen. Virol. 65: 1803-1815.

83. Limonta, J.M., Castro, F.O., Martinez, R., Puentes, P., Ramos, B., Aguilar, A., Lleonart, R.L. and de la Fuente, J. (1995) Transgenic rabbits as bioreactors for the production of human growth hormone, J. Biotechnol. 40: 49-58.

84. Lozier, J.N., Thompson, A.R., Hu, P.C., Read, M., Brinkhous, K.M., High, K.A. and Curiel, D.T. (1994) Efficient transfection of primary cells in a canine hemophilia b model using adenovirus-polylysine-dna complexes, Hum. Gene Ther. 5: 313-322.

85. Mahato, R.I., Takakura, Y. and Hashida, M. (1997) Nonviral vectors for in vivo gene delivery: physicochemical and pharmacokinetic considerations, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier. Syst. 14: 133-172.

86. Martinez-Fong, D., Mullersman, J.E., Purchio, A.F., Armendariz-Borunda, J. and Martinez-Hernandez, A. (1994) Nonenzymatic glycosylation of poly-l-lysine: a new tool for targeted gene delivery, Hepatology, 20: 1602-1608.

87. McKee, T.D., De Rome, M.E., Wu, G.Y. and Findeis, M.A. (1994) Preparation of asialoorosomucoid-polylysine conjugates, Bioconjug. Chem. 5: 306-311.

88. Mellman, I. (1996) Endocytosis and molecular sorting, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12: 575-625.

89. Michael, S.I. and Curiel, D.T. (1994) Strategies to achieve targeted gene delivery via the receptor-mediated endocytosis pathway, Gene Ther. 1: 223-232.

90. Midoux, P., Mendes, C., Legrand, A., Raimond, J., Mayer, R., Monsigny, M. and Roche, A.C. (1993) Specific gene transfer mediated by lactosylated poly-l-lysine into hepatoma cells, Nucleic Acids Res. 21: 871-878.

91. Mislick, K.A. and Baldeschwieler, J.D. (1996) Evidence for the role of proteoglycans in cation-mediated gene transfer, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 93: 1234912354.

92. Mislick, K.A., Baldeschwieler, J.D., Kayyem, J.F. and Meade, T.J. (1995) Transfection of folate-polylysine DNA complexes: evidence for lysosomal delivery, Bioconjug. Chem. 6: 512-515.

93. Monsigny, M., Roche, A.C., Midoux, P. and Mayer, R. (1994) Glycoconjugates as carriers for specific delivery of therapeutic drugs and genes, Advanced Drug Delivery Reviews, 14: 1-24.

94. Novoa, I., Benavente, J., Cotten, M. and Carrasco, L. (1997) Permeabilization of mammalian cells to proteins: poliovirus 2A(pro) as a probe to analyze entry of proteins into cells, Exp. Cell Res. 232: 186-190.

95. OConnell, B.C., Lillibridge, C.D., Ambudkar, I. and Kruse, D. (1998) Somatic gene transfer to salivary glands, Ann. N. Y. Acad. Sci. 842: 171-180.

96. Ogris, M., Brunner, S., SchDller, S., Kircheis, R. and Wagner, E. (1999) PEGylated DNA/transferrin-PEI complexes: reduced interaction with blood components, extended circulation in blood and potential for systemic gene delivery, Gene Ther. 6: 595-605.

97. Ogris, M., Steinlein, P., Kursa, M., Mechtler, K., Kircheis, R. and Wagner, E. (1998) The size of DNA/transferrin-PEI complexes is an important factor for gene expression in cultured cells. Gene Ther. 5: 1425-1433.

98. Ohmori, N., Niidome, T., Wada, A., Hirayama, T., Hatakeyama, T. and Aoyagi, H. (1997) The enhancing effect of anionic alpha-helical peptide on cationic peptide-mediating transfection systems, Biochem. Biophys. Res. Commun. 235: 726-729.

99. Otero, M.J. and Carrasco, L. (1987) Proteins are cointernalized with virion particles during early infection, Virology, 160: 75-80.

100. Page, R.L., Butler, S.P., Subramanian, A., Gwazdauskas, F.C., Johnson, J.L. and Velander, W.H. (1995) Transgenesis in mice by cytoplasmic injection of polylysine/dna mixtures, Transgenic. Res. 4: 353-360.

101. Perales, J.C., Ferkol, T., Beegen, H., Ratnoff, O.D. and Hanson, R.W. (1994) Gene transfer in vivo: sustained expression and regulation of genes introduced into the liver by receptor-targeted uptake, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 91: 4086-4090.

102. Perales, J.C., Ferkol, T., Molas, M. and Hanson, R.W. (1994) An evaluation of receptor-mediated gene transfer using synthetic dna-ligand complexes, Eur. J. Biochem. 226: 255-266.

103. Philipson, L., Lonberg-Holm, K. and Pettersson, U. (1968) Virus-receptor interaction in an adenovirus system. J. Virol. 2: 1064-1075.

104. Plank, C., Mechtler, K., Szoka, F.C., Jr. and Wagner, E. (1996) Activation of the complement system by synthetic DNA complexes: a potential barrier for intravenous gene delivery, Hum. Gene Ther. 7: 1437-1446.

105. Plank, C., Oberhauser, B., Mechtler, K., Koch, C. and Wagner, E. (1994) The influence of endosome-disruptive peptides on gene transfer using synthetic virus-like gene transfer systems, J. Biol. Chem. 269: 12918-12924.

106. Plank, C., Zauner, W. and Wagner, E. (1998) Application of membrane-active peptides for drug and gene delivery across cellular membranes, Advanced Drug Delivery Reviews, 34: 21-35.

107. Pollard, H., Remy, J.S., Loussouarn, G., Demolombe, S., Behr, J.P. and Escande, D. (1998) Polyethylenimine but not cationic lipids promotes transgene delivery to the nucleus in mammalian cells, J. Biol. Chem. 273: 7507-7511.

108. Prchla, E., Plank, C., Wagner, E., Blaas, D. and Fuchs, R. (1995) Virus-mediated release of endosomal content in vitro: different behavior of adenovirus and rhino virus serotype 2, J. Cell Biol. 131: 111-123.

109. Relloso, M. and Esponda, P. (1998) In vivo gene transfer to the mouse oviduct epithelium, Fértil. Steril. 70: 366-368.

110. Rojanasakul, Y., Wang, L.Y., Malanga, C.J., Ma, J.K. and Liaw, J. (1994) Targeted gene delivery to alveolar macrophages via fc receptor-mediated endocytosis, Pharm. Res. 11: 1731-1736.

111. Rosen, J.M., Li, S., Raught, B. and Hadsell, D. (1996) The mammary gland as a bioreactor: factors regulating the efficient expression of milk protein-based transgenes, Am. J. Clin. Nutr. 63: 627S-32S.

112. Rosenkranz, A.A., Yachmenev, S.V., Jans, D.A., Serebryakova, N.V., Murav'ev, V.I., Peters, R. and Sobolev, A.S. (1992) Receptor-mediated endocytosis and nuclear transport of a transfecting dna construct, Exp. Cell Res. 199: 323-329.

113. Ross, G.F., Bruno, M.D., Uyeda, M., Suzuki, K., Nagao, K., Whitsett, J.A. and Korfhagen, T.R. (1998) Enhanced reporter gene expression in cells transfected in the presence of DMI-2, an acid nuclease inhibitor. Gene Ther. 5: 1244-1250.

114. Ross, G.F., Morris, R.E., Ciraolo, G., Huelsman, K., Bruno, M., Whitsett, J.A., Baatz, J.E. and Korfhagen, T.R. (1995) Surfactant protein a-polylysine conjugates for delivery of dna to airway cells in culture, Hum. Gene Ther. 6: 31-40.

115. Schaffer, D.V. and Lauffenburger, D.A. (1998) Optimization of Cell Surface Binding Enhances Efficiency and Specificity of Molecular Conjugate Gene Delivery. J. Biol. Chem. 273: 28004-28009.

116. Seth, P. (1994) Mechanism of adenovirus-mediated endosome lysis: role of the intact adenovirus capsid structure, Biochem. Biophys. Res. Commun. 205: 1318-1324.

117. Seth, P. (1994) A simple and efficient method of protein delivery into cells using adenovirus, Biochem. Biophys. Res. Commun. 203: 582-587.

118. Seth, P. (1994) Adenovirus-dependent release of choline from plasma membrane vesicles at an acidic ph is mediated by the penton base protein, J. Virol. 68: 1204-1206.

119. Seth, P., Brinkmann, U., Schwartz, G.N., Katayose, D., Gress, R., Pastan Ira and Cowan, K. (1996) Adenovirus-mediated gene transfer to human breast tumor cells: an approach for cancer gene therapy and bone marrow purging, Cancer Res. 56: 1346-1351.

120. Seth, P., Fitzgerald, D.J., Willingham, M.C. and Pastan, I. (1984) Role of a low-ph environment in adenovirus enhancement of the toxicity of a pseudomonas exotoxin-epidermal growth factor conjugate, J. Virol. 51: 650-655.

121. Seth, P., Rosenfeld, M., Higginbotham, J. and Crystal, R.G. (1994) Mechanism of enhancement of dna expression consequent to cointernalization of a replication-deficient adenovirus and unmodified plasmid dna, J. Virol. 68: 933-940.

122. Seymour, L.W. (1992) Passive tumor targeting of soluble macromolecules and drug conjugates, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier. Syst. 9: 135-187.

123. Smith, R.M. and Jarett, L. (1990) Partial characterization of mechanism of insulin accumulation in H35 hepatoma cell nuclei, Diabetes, 39: 683-689.

124. Sobolev, A.S., Akhlynina, T.V., Yachmenev, S.V., Rosenkranz, A.A. and Severin, E.S. (1992) Internalizable insulin-bsa-chlorin e6 conjugate is a more effective photosensitizer than chlorin e6 alone, Biochem. Int. 26: 445-450.

125. Sosnowski, B.A., Gonzalez, A.M., Chandler, L.A., Buechler, Y.J., Pierce, G.F. and Baird, A. (1996) Targeting DNA to cells with basic fibroblast growth factor (FGF2), J. Biol. Chem. 271: 33647-33653.

126. Stankovics, J., Crane, A.M., Andrews, E., Wu, C.H., Wu, G.Y. and Ledley, F.D. (1994) Overexpression of human methylmalonyl coa mutase in mice after in vivo gene transfer with asialoglycoprotein/polylysine/dna complexes, Hum. GeneTher. 5: 1095-1104.

127. Strydom, S., Van Jaarsveld, P., Van Helden, E., Ariatti, M. and Hawtrey, A. (1993) Studies on the transfer of dna into cells through use of avidin-polylysine conjugates complexed to biotinylated transferrin and dna, J. Drug Target. 1: 165-174.

128. Szoka, F., Jr. and Papahadjopoulos, D. (1978) Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 75: 4194-4198.

129. Taxman, D.J., Lee, E.S. and Wojchowski, D.M. (1993) Receptor-targeted transfection using stable maleimido-transferrin/thio-poly-l-lysine conjugates published erratum appears in anal biochem 1993 nov 1; 214(2):588.,^na/. Biochem. 213: 97-103.

130. Thompson, J.F., Hayes, L.S. and Lloid, D.B. (1991) Modulation of firefly luciferase stability and impact on studies of gene regulation. Gene, 103: 171-177.

131. Thurnher, M., Wagner, E., Clausen, H., Mechtler, K., Rusconi, S., Dinter, A., Birnstiel, M.L., Berger, E.G. and Cotten, M. (1994) Carbohydrate receptor-mediated gene transfer to human t leukaemic cells, Glycobiology. 4: 429-435.

132. Trubetskoy, V.S., Torchilin, V.P., Kennel, S.J. and Huang, L. (1992) Use of n-terminal modified poly(l-lysine)-antibody conjugate as a carrier for targeted gene delivery in mouse lung endothelial cells, Bioconjug. Chem. 3: 323-327.

133. Uherek, C., Fominaya, J. and Wels, W. (1998) A modular DNA carrier protein based on the structure of diphtheria toxin mediates target cell-specific gene delivery, J. Biol. Chem. 273: 8835-8841.

134. Vitiello, L., Bockhold, K., Joshi, P.B. and Worton, R.G. (1998) Transfection of cultured myoblasts in high serum concentration with DODAC:DOPE liposomes, Gene Ther. 5: 1306-1313.

135. Vitiello, L., Chonn, A., Wasserman, J.D., Duff, C. and Worton, R.G. (1996) Condensation of plasmid DNA with polylysine improves liposome-mediated gene transfer into established and primary muscle cells, Gene Ther. 3: 396-404.

136. Wadhwa, M.S., Knoell, D.L., Young, A.P. and Rice, K.G. (1995) Targeted gene delivery with a low molecular weight glycopeptide carrier, Bioconjug. Chem. 6: 283-291.

137. Wagner, E., Cotten, M., Foisner, R. and Birnstiel, M.L. (1991) Transferrin-polycation-dna complexes: the effect of polycations on the structure of the complex and dna delivery to cells, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 88: 4255-4259.

138. Wall, R.J., Rexroad, C.E., Jr., Powell, A., Shamay, A., McKnight, R. and Hennighausen, L. (1996) Synthesis and secretion of the mouse whey acidic protein in transgenic sheep, Transgenic. Res. 5: 67-72.

139. Wendelburg, B.J. and Vos, J. (1998) An enhanced EBNA1 variant with reduced IR3 domein for long-term episomal maintenance and transgene expression of oriP-based plasmids in human cells. Gene Ther. 5: 1389-1399.

140. Wickham, T.J., Filardo, E.J., Cheresh, D.A. and Nemerow, G.R. (1994) Integrin alpha v beta 5 selectively promotes adenovirus mediated cell membrane permeabilization, J. Cell Biol. 127: 257-264.

141. Wickham, T.J., Mathias, P., Cheresh, D.A. and Nemerow, G.R. (1993) Integrins alpha v beta 3 and alpha v beta 5 promote adenovirus internalization but not virus attachment, Cell, 73: 309-319.

142. Winters, W.D. and Russell, W.C. (1971)/. Gen. Virol. 10: 181-184.

143. Wolfert, M.A. and Seymour, L.W. (1996) Atomic force microscopic analysis of the influence of the molecular weight of poly(l)lysine on the size of polyelectrolyte complexes formed with dna, Gene Ther. 3: 269-273.

144. Wolfert, M.A. and Seymour, L.W. (1998) Chloroquine and amphipathic peptide helices show synergistic transfection in vitro, Gene Ther. 5: 409-414.

145. Wolff, J.A., Williams, P., Acsadi, G., Jiao, S., Jani, A. and Chong, W. (1991) Conditions affecting direct gene transfer into rodent muscle in vivo, Biotechniques, 11: 474485.

146. Wu, C.H. and Wu, G.Y. (1998) Targeted inhibition of hepatitis C virus-directed gene expression in human hepatoma cell lines, Gastroenterology, 114: 1304-1312.

147. Wu, G.Y., Wilson, J.M., Shalaby, F., Grossman, M., Shafritz, D.A. and Wu, C.H. (1991) Receptor-mediated gene delivery in vivo. Partial correction of genetic analbuminemia in Nagase rats, J. Biol. Chem. 266: 14338-14342.

148. Wu, G.Y. and Wu, C.H. (1987) Receptor-mediated in vitro gene transformation by a soluble dna carrier system published erratum appears in j biol chem 1988 jan 5; 263(1):588., J. Biol. Chem. 262: 4429-4432.

149. Wu, G.Y. and Wu, C.H. (1988) Evidence for targeted gene delivery to hep g2 hepatoma cells in vitro, Biochemistry, 27: 887-892.

150. Wu, G.Y. and Wu, C.H. (1988) Receptor-mediated gene delivery and expression in vivo, J. Biol. Chem. 263: 14621-14624.

151. Xu, B., Wiehle, S., Roth, J.A. and Cristiano, R.J. (1998) The contribution of poly-L-lysine, epidermal growth factor and streptavidin to EGF/PLL/DNA polyplex formation. Gene Ther. 5: 1235-1243.

152. Yang, N.S. (1992) Gene transfer into mammalian somatic cells in vivo, Crit. Rev. Biotechnol. 12: 335-356.

153. Yang, Y., Nunes, F.A., Berencsi, K., Furth, E.E., Gonczol, E. and Wilson, J.M. (1994) Cellular immunity to viral antigens limits el-deleted adenoviruses for gene therapy, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 91: 4407-4411.

154. Yarns, S., Rosen, J.M., Cole, A.M. and Diamond, G. (1996) Production of active bovine tracheal antimicrobial peptide in milk of transgenic mice, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 93:14118-14121.

155. Yin, W. and Cheng, P.W. (1994) Lectin conjugate-directed gene transfer to airway epithelial cells, Biochem. Biophys. Res. Commun. 205: 826-833.

156. Yoshimura, A. (1985) Adenovirus-induced leakage of co-endocytosed macromolecules into the cytosol, Cell Struct. Funct. 10: 391-404.

157. Yoshimura, K., Rosenfeld, M.A., Seth, P. and Crystal, R.G. (1993) Adenovirus-mediated augmentation of cell transfection with unmodified plasmid vectors, J. Biol. Chem. 268: 2300-2303.

158. Zabner, J., Fasbender, A.J., Moninger, T., Poellinger, K.A. and Welsh, M.J. (1995) Cellular and molecular barriers to gene transfer by a cationic lipid, J. Biol. Chem. 270: 1899719007.

159. Zanta, M.A., Boussif, O., Adib, A. and Behr, J.P. (1997) In vitro gene delivery to hepatocytes with galactosylated polyethylenimine, Bioconjug. Chem. 8: 839-844.99

160. Zauner, W., Blaas, D., Kuechler, E. and Wagner, E. (1995) Rhinovirus-mediated endosomal release of transfection complexes, J. Virol. 69: 1085-1092.

161. Zauner, W., Kichler, A., Schmidt, W., Sinski, A. and Wagner, E. (1996) Glycerol enhancement of ligand-polylysine/DNA transfection, Biotechniques, 20: 905-913.

162. Zhang, K., Lu, D., Xue, J., Huang, Y. and Huang, S. (1997) Construction of mammary gland-specific expression vectors for human clotting factor IX and its secretory expression in goat milk, Chin. J. Biotechnol. 13: 271-276.

163. Ziady, A.G., Ferkol, T., Gerken, T., Dawson, D.V., Perlmutter, D.H. and Davis, P.B. (1998) Ligand substitution of receptor targeted DNA complexes affects gene transfer into hepatoma cells. Gene Ther. 5: 1685-1697.1001. Благодарности.

164. Выражаю благодарность научному руководителю — профессору, доктору биологических наук Александру Сергеевичу Соболеву за предоставленную возможность работать над данной темой в биофизической лаборатории и под его руководством.

165. Также выражаю благодарность второму научному руководителю кандидату биологических наук Андрею Александровичу Розенкранцу за совместную работу, за неоценимую помощь в планировании и проведении экспериментов и в написании данной работы.

166. Очень признательна Владимиру Афанасьевичу Никитину за совместную работу с животными и Татьяне Григорьевне Киселевой за ведение культур клеток, а также всем сотрудникам биофизической лаборатории за помощь и поддержку.

Информация о работе

Смирнова, Ольга Анатольевна
кандидата биологических наук
Москва, 2000
ВАК 03.00.23

Диссертация

Исследование рецептор-опосредованной трансфекции клеток эпителия молочной железы in vitro и in vivo - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы