Исследование регуляции оперона rpsB-tsf, кодирующего рибосомный белок S2 и фактор элонгации трансляции Ts

Асеев, Леонид Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование регуляции оперона rpsB-tsf, кодирующего рибосомный белок S2 и фактор элонгации трансляции Ts
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование регуляции оперона rpsB-tsf, кодирующего рибосомный белок S2 и фактор элонгации трансляции Ts"

На правах рукописи

Асеев Леонид Викторович

ИССЛЕДОВАНИЕ РЕГУЛЯЦИИ ОПЕРОНА граВ-Щ, КОДИРУЮЩЕГО РИБОСОМНЫЙ БЕЛОК Б2 И ФАКТОР ЭЛОНГАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ Те.

Специальность 03.01.03 - молекулярная биология

Автореферат Диссертации ни соискание учёной степени Кандидата биологических наук

Москва-2010

2 1 0К: ?ГП

004611264

Работа выполнена в лаборатории структуры и функций генов человека Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Научный руководитель:

кандидат химических наук Бони Ирина Венедиктовна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Копылов Алексей Михайлович доктор биологических наук Колб Вячеслав Адамович

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Защита диссертации состоится « ЯР"» еипх^Я. 2010 года в /0:О0 часов на заседании диссертационного совета Д002.019.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан « » сентября 2010 г.

Учёный секретарь диссертационного совета,

доктор физ.-мат. наук ^С-^^у В.А. Олейников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы.

Синтез белков в любых клетках происходит на рибосомах, сложных рибонуклеопротеидных комплексах, состоящих из нескольких молекул рибосомных РНК и нескольких десятков различных рибосомных белков (р-белков). Биогенез рибосом требует значительных энергетических затрат и строго регулируется у всех организмов. Для экономии клеточных ресурсов и обеспечения эквимолярности синтеза рибосомных компонентов в процессе эволюции появились регуляторные механизмы, контролирующие экспрессию рибосомных генов. У бактерий активность транскрипции рРНК зависит от состава окружающей среды и доступности питательных веществ (стимулируется на богатой среде и ингибируется на бедной), а синтез р-белков скоординирован с синтезом рРНК по принципу обратной связи (аутогенный контроль). Почти в каждом опероне р-белков один из продуктов является не только структурным компонентом рибосомы, напрямую взаимодействующим с рРНК на первых этапах сборки субчастиц, но и негативным регулятором, способным подавлять трансляцию своей мРНК, если его количество в клетке превышает количество свободной рРНК.

Молекулярные механизмы аутогенного контроля исследованы для многих оперонов р-белков, но не для всех. Так, регуляция оперона грбВ^б/, кодирующего жизненно важные компоненты трансляционного аппарата клетки - р-белок Б2 и фактор элонгации Тб, никогда не исследовалась, и даже промотор оперона не был локализован. О функциях р-белка Б2 в трансляции известно мало. В отличие от большинства р-белков, которые служат аутогенными репрессорами, белок Б2 не способен узнавать свободную рРНК и участвует в сборке ЗОБ рибосомной субчастицы на последнем этапе; после него присоединяется только белок - компонент рибосом, строго необходимый для связывания мРНК на этапе инициации трансляции. Для белка 81 было доказано, что он представляет собой исключение и является репрессором своего синтеза, хотя и не связывает свободную рРНК при сборке рибосомы. Априори нельзя было исключить такую возможность и для белка 82, который может быть вовлечен в регуляцию оперона как аутогенный репрессор,

если синтезируется в избытке по отношению к другим рибосомным компонентам. Исследование регуляции экспрессии жизненно важных генов, вовлеченных в биосинтез белка, является актуальной задачей современной

биологии, так как в перспективе может дать абсолютно новые результаты, необходимые для понимания базовых принципов регуляции генной экспрессии у бактерий.

Цели и задачи исследования. Основной целью диссертационной работы являлось исследование механизмов регуляции экспрессии оперона rpsB-tsf у Е. coli и родственных бактерий, поиск общих черт и различий по сравнению с известными примерами контроля экспрессии рибосомных оперонов. Были поставлены следующие задачи:

1. Изучить регуляцию оперона rpsB-isf in vivo и исследовать роль р-белка S2 как потенциального аутогенного регулятора.

2. Локализовать промотор/промоторы оперона rpsB-tsf, изучить его структуру и свойства с помощью мутационного анализа.

3. Выяснить, на какой стадии контролируется экспрессия каждого из генов оперона, какие cis-элементы и trans-факторы участвуют в регуляции.

4. С помощью филогенетического анализа оценить консервативность механизма регуляции оперона rpsB-tsf у разных видов у-протеобактерий.

Научная новизна и практическая значимость работы. В работе впервые картирован и охарактеризован промотор оперона rpsB-tsf. Впервые показано, что белок S2 является негативным регулятором обоих генов оперона in vivo и что оба гена регулируются за счёт связывания S2 с протяжённой 5'-нетранслируемой областью (НТО) мРНК перед цистроном rpsB. Филогенетический анализ выявил высокую консервативность промотора и вторичной структуры 5'-НТО у у-протеобактерий, а также ряд идентичных для всех исследованных у-протеобактерий последовательностей, которые, по результатам делеционного анализа, являются негативными регуляторными элементами. Показано, что механизм аутогенного контроля оперона rpsB-tsf консервативен в более широком спектре семейств у-протеобактерий, чем в случае оперонов rpsA и S10, что предусматривает различное время возникновения механизмов регуляции синтеза рибосомных белков в процессе эволюции. Показано нарушение аутогенного контроля не только в мутантах по гену белка-регулятора S2, но и в мутанте по гену белка S1, то есть в регуляции может участвовать комплекс этих белков. Возможность образования такого комплекса доказана с помощью иммунопреципитации. Это предполагает

принципиальное отличие механизма аутогенного контроля rpsB-tsf от известных моделей регуляции, в которых белку-репрессору не требуется помощник.

Таким образом, получены абсолютно новые данные о регуляции жизненно важного оперона rpsB-tsf, которые не только имеют важное фундаментальное значение, но в перспективе могут быть полезными для поиска новых ингибиторов бактериальных инфекций.

Апробация и публикация работы. По результатам диссертационной работы опубликовано 3 статьи в рецензируемых научных журналах. Результаты работы были представлены на следующих научных конференциях: 1) XIII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2006", секция Биология, 12-15 апреля 2006, Москва; 2) VIII Чтения, посвященные памяти академика Ю.А. Овчинникова, 25-27 окт. 2006, Москва; 3) IV Съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 11-15 мая 2008 г., Новосибирск, Россия; 4) Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов - 2008», секция Биология, 8-11 апреля 2008, Москва; 5) XXI зимняя молодёжная научная школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». 9-11 февраля 2009, Москва; 6).Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова, 28 сентября - 1 октября 2009, Москва; 7) VII International conference «Ribosome synthesis-2006», August 16-20, 2006, Virginia, USA; 8) International Conference "Ribosomes 2007", June 3-8,2007, Cape Cod, MA USA; 9) II International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology "BioMicroWorld-2007". 28 November-1 December 2007, Seville, Spain; 10) III International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology "BioMocroWorld-2009". 2-4 December 2009, Lisbon, Portugal.

Структура и объём работы. Диссертационная работа изложена на; Ш страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация содержит // таблиц^ и 'Л-Ь рисунков. Список цитируемых литературных источников включает Y наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Рибосом ныи белок S2 является негативным регулятором собственного синтеза in vivo.

Методический подход. Биосинтез рибосомных белков в большинстве случаев регулируется на уровне инициации трансляции. Одним из методов для проверки гипотезы об аутогенной регуляции является анализ экспрессии репортёрного гена lacZ, трансляция которого направляется регуляторными элементами исследуемого оперона, в норме и при избытке белка-регулятора in trans (синтезируемого с плазмиды). Для поддержания постоянной дозы гена-репортера предпочтительны однокопийные конструкции, встроенные в бактериальный геном. По уровню синтеза Дгалактозидазы в рекомбинантных штаммах и измеряется уровень экспрессии. Если регуляция действительно происходит по механизму аутогенной репрессии, то уровень синтеза ß-галактозидазы должен снижаться в присутствии плазмиды, экспрессирующей ген белка-регулятора.

Для применения описанного подхода при исследовании возможности регуляции экспрессии rpsB-тъна. белком S2, на основе вектора pACYC184 была создана плазмида pS2, экспрессирующая ген белка S2. Фрагмент ДНК для клонирования был получен с помощью ПЦР и включал структурный ген rpsB, протяженную 5'-НТО (заведомо содержащую промотор, хотя локализация его оставалась неизвестной), и межгенный терминатор/аттенюатор на 3'-фланге (рис. 1). Также были получены штаммы Escherichia coli LABrpsBTIR-208::lacZ и LABrpsBTIR-50::lacZ, несущие два варианта регуляторной области rpsB гена перед хромосомным lacZ геном. В первом варианте (ТИР-208) при клонировании использовали такую же длину 5'-НТО, как и в плазмиде pS2, так что синтез /J-галактозидазы контролировался на транскрипционном уровне lac промотором и оператором, а также промотором rpsB, а на трансляционном уровне полноразмерным трансляционным инициаторным районом (ТИР) гена rpsB. Присутствие /у»5-промотора обеспечивало экспрессию lacZ при закрытом /ас-промоторе (в отсутствие ИПТГ в среде). Во втором варианте использовали укороченную 5'-НТО (ТИР-50), не содержащую промотора rpsB (экспрессия репортера rpsB-IacZ наблюдалась только в присутствии ИПТГ). Схематическое изображение фрагментов ТИР, использованных при создании хромосомных конструкций rpsB-lacZ показано на рисунке 1.

att

rpsB tsf

726 bp 258 bp 851 bp

-208-208

-50

- rpsB вставка в pS2

+41 TIR208 +41 TIR50

-270 ocaaaogtgc cactgaaggt tttctataat agaaaattcg aogtctgatg

-220 ctgtacacag cgccaacaat tattggbgtc caagacgtat ttgtggtata

-170 aagtgogccg gacttccgat ocatttcgta tacacagact ggacggaagc

-120 gacaatctca ctttgtgtaa caacacacac gtatoggcac atattooggg

-70 gtgacctttg gggtoggtaa tatgggatac gtggaggcat aacaxaact

-20 tttatataga ggttttaatc atggcaactg tttccatgcg cgacatgctc

+31 aaggctggtg ttcacttogg tcaccagacc ogttactgga aoccgaaaat

Рисунок 1. Структура оперона rpsB-tsf E. coli и его области, клонированной в вектор pACYC184 для получения плазмиды pS2, а также фрагменты, использованные в качестве трансляционных инициаторных районов rpsB, и их положение в структуре оперона. Р- промотор оперона (неизвестной локализации), att -межгенный терминатор-аттенюатор, t - главный терминатор оперона. Внизу приведена последовательность, соответствующая 5'-НТО и началу кодирующей области /-/м5-гена; инициаторный кодон и элемент Шайна-Дальгарно подчеркнуты.

Исследование аутогенной регуляции оперона rpsB-tsf в полученных штаммах. Для проверки гипотезы о возможности аутогенной регуляции гена rpsB полученные штаммы трансформировали плазмидой pS2 и измеряли активность Д-галактозидазы в клетках. Плазмиды pACYC184 и pSl (экспрессирующая ген белка S1), использовали для контроля специфичности получаемого эффекта. Показано, что в присутствии pS2 происходит падение активности /í-галактозидазы в штамме LABrpsBTIR-208::lacZ примерно в 10 раз по сравнению с контрольными клетками, несущими плазмиды pACYC184 и pSl (рис. 2). В штамме, содержащем короткий ТИР-50, уровень синтеза ß-галактозидазы не изменялся в присутствии плазмиды pS2. Полученные данные (рис. 2) показывают, что белок S2 способен специфически регулировать свой синтез по принципу отрицательной обратной связи, но для регуляции необходима область длиной более 50 нуклеотидов перед инициаторным кодоном AUG.

3000

-ИПТГ

12000

+ИПТГ

s §

Et E! 2500

E О

К ic P tH

£ S 2000 л 5

V J® 1500

д ,0,

о а Ю00

500

8000

6000

2000

pACYC184

ТИР-50 ТИР-208

pACYC 184

ТИР-50 ТИР-208

Рисунок 2. Влияние белка S2 in trans на активность rpsB-ТИР-208 и ТИР-50 по результатам измерения уровня синтеза /?-галактозидазы. Показаны средние значения по результатам измерений как минимум трех независимых образцов и стандартные отклонения. Пустой вектор pACYC 184 и производная от него плазмида pSl, экспрессирующая ген р-белка S1, использовались в качестве контролей на специфичность регуляции.

2. Локализация промотора оперона rpsB-tsf

Положение и структура промотора оперона rpsB-tsf долгое время оставались неопределёнными. Для исследования трансляционной регуляции оперона необходимо было локализовать промотор, так как в контроль на уровне трансляции вовлечена 5'-нетранслируемая область мРНК (5'-НТО), которую невозможно определить без знания положения транскрипционного старта. Локализацию промотора rpsB проводили методом удлинения rpsB-специфичного праймера на суммарной клеточной РНК E.coli. Были использованы два праймера, комплементарные началу кодирующей последовательности гена rpsB и меченные 32Р по 5'-концам. Результаты указывают на существование единственного r/w5-np0M0T0pa, для которого стартовая точка транскрипции соответствует позиции -162 (относительно А +1 в инициаторном кодоне AUG) (рис.3). Попытка найти аналогичным методом промотор в межгенной области оперона не дала результатов; таким образом, оба гена оперона транскрибируются скорее всего с одного промотора. Так как в межцистронной области оперона rpsB-tsf расположен аттенюатор/терминатор (рис. 1), то в результате транскрипции должно образоваться два вида мРНК: моноцистронная rpsB и бицистронная rpsB-tsf, что и было подтверждено Нозерн-блот анализом (рис. 3).

М ОТ-1 ОТ-2 С Т A G

1000 Ы 500 —

400

300 -

200 —

234

т G Т g g Т А Т л А

л 5'

с (-162)->

g с С с G с

с G

5'-удлинение -10 элемент дискриминатор TGTGGTATAAAGCGCGäQGG

продую- ОТ

промотор rpsB:

rpsB

rpsB-tsf

-<-+24/72

rpsB

"А

старт

транскрипции -162

праймер S2-5'RT праймер rpsB AUGcomp

Рисунок 3. Картирование промотора rpsB методом удлинения праймера на суммарной РНК Е.соИ. Показано положение продукта обратной транскрипции (ОТ-1) с праймера S2-5'RT относительно меченного 32Р ДНК маркера (М) и положение продукта ОТ-2 с праймера rpsBAUGcomp относительно данных секвенирования плазмиды pES2TIR208. На приведенной последовательности указаны идентифицированная точка начала транскрипции и предполагаемая структура -10 -области /ртД-промотора. Показан также фрагмент авторадиограммы с Нозерн-блот-анализом /■/иД-транскриптов (моноцистронного rpsB и бицистронного rpsB-tsf), синтезируемых в Е. coli.

Перед картированным сайтом начала транскрипции расположена последовательность TAT AAA, отличающаяся от консенсуса -10 элемента (ТАТААТ) только последним нуклеотидом (рис. 3). Такой -10 элемент типичен для промоторов, узнаваемых о70 субъединицей РНК полимеразы. На расстоянии 18 п.о. перед ТАТААА-элементом расположена последовательность TTGGTG, соответствующая промоторному элементу -35, хотя и вырожденному по сравнению с консенсусом TTGACA. Характерной особенностью rpsB-промотора является наличие TGTG(G) удлинения перед гексамером -10, которое, согласно литературным данным, стабилизирует взаимодействие промотора и а70 субъединицы РНК полимеразы и уменьшает вклад -35 элемента в транскрипцию с данного промотора [Burr et al., 2000]. Транскрипция с rpsB-промотора начинается с СТР, редкого инициирующего нуклеозид-трифосфата, большинство промоторов использует АТР в качестве инициирующего нуклеотида. Последовательность GCGCGC, разделяющая гексамер -10 и точку начала транскрипции, так называемый дискриминатор, типична для промоторов

стабильных РНК (рРНК, тРНК), активность которых подвержена негативной регуляции алармоном ppGpp. Филогенетический анализ последовательностей, предшествующих инициаторному кодону rpsB в секвенированных бактериальных геномах, выявил высокую степень консервативности удлинённого -10 промотора в сочетании с GC-богатым дискриминатором в широком спектре у-протеобактерий (рис. 4). Консервативность промоторов позволила провести сравнительный анализ соответствующих 5'-НТО.

3. Механизм регуляции оперона rpsB-tsf консервативен у у-протеобактерий.

Анализ консервативности 5'-нетранслируемой области (НТО) оперона rpsB-tsf. Выравнивание последовательностей 5'-НТО показало, что, несмотря на различия по длине и в целом по последовательности, 5'-НТО /ртЯ-мРНК включают несколько универсально консервативных коротких участков длиной 6-8 нуклеотидов (рис. 4). Инициаторному кодону AUG предшествует последовательность Шайна-Дальгарно (SD) из 4-5 н.о. в AU богатом контексте и SD-подобная последовательность GUGGAGG с последующим участком из нескольких С нуклеотидов. Несмотря на то, что как по длине, так и в целом по последовательности 5'-НТО у разных видов у-протеобактерий различаются, компьютерное моделирование с помощью программы Mfold выявило удивительное сходство в их фолдинге (рис. 5). Лидерные области rpsB-генов, и длинные как у Yersenia pestis (234 и.о.), и короткие как у Haemophilus influenzae (131 н.о.) или у Pseudomonas aeruginosa (126 и.о.), «укладываются» в однотипные вторичные структуры. Предсказанная вторичная структура содержит две несовершенные шпильки LH (Left Hand) и RH (Right Hand), отделённые друг от друга слабо структурированной или неструктурированной центральной областью CR (Central Region). Спиральные участки LH и RH прерываются небольшими или более выраженными внутренними петлями (bulges). Некоторые из них высоко консервативны даже в удалённых видах. Интересно, что высоко консервативные участки последовательности 5'-НТО /ywß-мРНК занимают сходные положения в структуре (см. рис. 4 и 5) и входят в состав шпильки RH и окружающих её областей, что предполагает их участие в авторегуляции (см. ниже). В отличие от CR и RH 5'-концевая протяженная последовательность шпилечной структуры LH не содержит консервативных участков.

tcggtggcgtaj pgttgtggctgj x'cgcaggcggm ctgcgtccacq

tttaaccgcaJ

cacaggggcgij ctttagggctij

jcgaaccgcactata 4tga-----------

удлиненный -10 промотор

TRTGRTATAAA старт транскрипции

Escherichia coli (E.c.) CAACAATTRTTGGTG

Salmonella typhimurium IS.I.) CAACAATTATTGGTG Yersinia peslis (Y.p.) CAACAAAAGÎTGGTGt'

Erwinia carotovara (Er.c.) taacaaatgttggtg Pseudomonas aeruginosa (P.a.) cggcggcgggtttca Haemophilus injluenzae (H.i.) CAAAATAAACTGGTT Vibrio cholerae (V.ch.) aattttttc tagccä

Shewanella oneidensis (Sh.o.) AÎGCAAAAATTTGTG Saccharophagus degradans ¿S'cOGCTCAAA'ncTTTAAi

E.c.

S.t.

Y.p.

Er.c.

P.a.

H.i.

V.ch.

Sh.o.

S.d.

CCAT-----

CCA------

GAATATGAATC1 GGATATTGGTTiB?

GC-------

CCTTA----

GAATTACCCAAC ACAAC------

ЩТАТАСА-CAGAC—TGGACGGj AAGACTACACACGATGGACGGI gATGACGTATTCTGACGATAAG'

-----gtatct—aaci

-----GCCTTT---TCCG

------CCTTT----CAA

je--------CCTGTT-GGCG,

GCTTTATCTGCTTTTGGGCGA' ¡TCGAGCAACCTTGTGTTGTTTI

AATC WTC AATC

:ac

:асг

:act<

r—

CATA

t:acBt-

tgtgg igtgs tgtgb

tgtg|

-----------------c№

■—TTTAGCCGGGCAATACCA

-----------------CTAAACjl

----------------CAAACC------------В

----------------GTTTTTTAATTAC-----J

T-------GGGAACCACAAACCTAATT----GT1»

[AACTAAAGATGGCGGCCATTATACATGGCAATTTATCM ------------------TTAGTTGGGTAAATTTCIIJ

gatact

Iactat

'AAAGTTTTTGATTGTTATCAATCGCTT/

TGAGGTGTT-----TCAC------CGGi

д---------------------------

TCAGCTGTTAA-----------CTGC —

TAGCTGTTAAAG-------------C—

- - с aaaaggaa----aatatt

------tagaggattttà-ад

■aaattttaaggtaatag-aij

- -aaacaggaa-tactaa—j

CTTTTA A-CTTAATC Ï-CTGATAC TACTTAATT CTTA-

SD инициаторныи кодон

tatagaggttttaa-tcg atagaggttttaaat-c?

ratagaggttttaa-tcb

•4a7agaggt---aa-tcg

■—tcgaggaacta- -t

В - идентичные участки

@ - консервативные участки (не менее 7 совпадений из 9 возможных)

участки, консервативные у энгеробактерий h - неконсервативные участки

3'-АТОССОССА...165РНК.

Рисунок 4. Множественное выравнивание последовательностей 5'-НТО г/и\б-генов представителей различных семейств у-протеобактерий.

u-g u-a u с a-u c-g c-g u-a

ßct

Escherichia coli

-100

cggä -ih

a q. а * u-a g-c u-a g-c u-a,.

fgacaaucucacuu-

21 -lio

j» -»Ж

c-g--« gg.

-c-g gaggcauaacccca"uuuaaucaug

1 °c

И BS Й8 M

RH IÖ

Щ*

t'd Yersinia pestis

с G-JUÜUUUAAUUACUAACMCACA GAGGCUCAACCCCAACAAAAGGAAAAUAUUAUG

Haemophilus influenzae

rh i:

U c-g c-g g-u g-c u-a

GGCAAUACCAAUCGCACUCAUA1

CRiA 1 О

W «В....... ÜSD

C-G GAGGCAUAACCCCAA AGGUUUUAAUCAÜG

c-g g-c g-c

a-u u и g-c r-u

c-g g-c u-g a-u

¿.Oft,.

c-g* c-g

,_с асамсссаса baggccuaa aacuauctyjq

Pseudomonas aeruginosa

Рисунок 5. Консервативность укладки 5'-нетранслируемых областей rpsB-мРНК у-протеобактерий. LH - левая шпилька; CR - центральная область; RH - правая шпилька. Серым выделены участки универсально консервативных последовательностей.

Следует ли из показанного выше сходства структур 5'-НТО сходство механизмов регуляции, и будут ли соответствующие экзогенные области в составе химерных генов rpsB-lacZ в хромосоме E.coli подвержены регуляции белком S2 в E.coli? Для проверки возможности негативной регуляции были созданы штаммы E.coli LABrpsB_Yp::lacZ, LABrpsB_Hinf:;lacZ и LABrpsB_Paer::lacZ, содержащие в составе хромосомного гена-репортера rpsB-lacZ экзогенные фрагменты rpsB из Y.pestis, Н.influenzae и P.aeruginosa, соответственно. Фрагменты включали предполагаемые промоторные области, полноразмерные 5'-НТО и начало кодирующих ф.?5-областей.

Анализ активности rpsB промоторов из Y.pestis, Н.influenzae и P.aeruginosa при транскрипции в составе хромосомы E.coli.

Консервативность промоторной области rpsB-генов у-протеобактерий предполагает, что экзогенные промоторы должны работать в E.coli. Положение

регуляторных элементов перед геном lacZ в полученных штаммах изображено на рисунке 6а. Измерение активности Д-галактозидазы в клеточных культурах, выращенных в отсутствие IPTG, т.е. при молчащем /ас-промоторе, показало, что экзогенные промоторы действительно способны направлять экспрессию репортерных генов rpsB-lacZ, хотя эффективность экспрессии была различна -максимальна в случае Н.influenzae и минимальна для P.aeruginosa (рис. 66). Разница в уровне экспрессии в приведённых случаях может определяться рядом факторов. Например, последовательность, предшествующая промоторной области «-35» и взаимодействующая с а-субъединицей РНК-полимеразы (так. наз. UP-элемент), у эффективных промоторов в Е. coli, как правило, А-богатая. В случае P.aeruginosa GC-богатая область перед «-35» элементом может снижать эффективность связывания РНК-полимеразы E.coli. С другой стороны, на эффективность трансляционного этапа экспрессии генов влияет 5'-НТО мРНК, ответственная за связывание рибосомы и регуляцию инициации синтеза белка. Необычно высокая эффективность 5'-НТО Н. influenzae обусловлена, предположительно, наименьшей структурированностью в сайте связывания рибосомы.

а rpsB (гсшма-) lacZ (E.coli)

Р lac Р rpsB AUG

I I \\шф J—

*чт epamop r

Источник rpsB (гамма-) Активность /?-галактозидазы

E.coli 2400 ±150

Y.pestis 920 ±50

Н.influenzae 18500 ±2500

P.aeruginosa 250 ±30

Рисунок 6. Анализ активности экзогенных промоторов rpsB в E.coli. а) Схема расположения регуляторных элементов, направляющих экспрессию химерных генов rpsB-lacZ в составе хромосомы E.coli: ?1ас и РrpsB - промоторы (белая и чёрная стрелки); Тм5(гамма) - клонированные в рамке с /acZ-геном области rpsB-генов гамма-протеобактерий. б) Активности Д-галактозидазы в клеточных культурах при росте в отсутствие ИПТГ, приведены средние значения для как минимум трёх независимых измерений со стандартными отклонениями.

Анализ способности белка S2 Е. coli к регуляции экзогенных 5'-НТО in vivo. Штаммы LABrpsB_Yp::lacZ, LABrpsB_Hinf::lacZ и LABrpsB_Paer::lacZ трансформировали плазмидой pS2 и исходным вектором pACYC184 в качестве контроля. Результаты измерения активности уЗ-галактозидазы показали, что во всех случаях наблюдается аутогенная репрессия (даже в конструкции,

содержащей rpsB-обпастъ P.aeruginosa), хотя и в меньшей степени по сравнению с эндогенной областью rpsB из E.coli (рис. 7). Ранее для оперонов rpsA [Tchufistova et al., 2003], S10 и spc [Allen et al., 1999; 2004] было показано, что регуляторные структуры, узнаваемые р-белками-репрессорами на мРНК, у энтеробактерий кардинально отличаются от структур соответствующих областей у псевдомонад. Мы показали, что по сравнению с регуляцией rpsA-, S10- и 5/?с-оперонов, консервативность укладки 5'-НТО r/иБ-мРНК и, как следствие, механизма негативной регуляции р-белком S2, проявляется в более широком спектре у-протеобактерий. На основании этого можно предположить, что механизм контроля оперона rpsB-tsf появился в эволюции раньше, чем произошла дивергенция этих семейств.

Escherichia coli

Yersinia pestis

pACYC184 pS2

Haemophilus influenzae

pACYC184 pS2

Pseudomonas aeruginosa

Рисунок 7. Активность синтеза /3-галактозидазы (нмоль ОНФГ/мин/мг белка) под контролем экзогенных фрагментов rpsB из Y.pestis, Н. influenzae и Р.aeruginosa в клетках несущих плазмиды pACYC184 (контроль - пустой вектор) и pS2 (экспрессирующая ген р-белка S2).

5. Делеционный анализ регуляторной области оперона rpsB-tsf Escherichia coli.

Для определения участков последовательности/структуры, ответственных за аутогенную регуляцию, были созданы хромосомные конструкции rpsB'-'lacZ, несущие делеции в 5'-НТО rpsB, и измерен эффект этих мутаций на

уровень экспрессии /3-галактозидазы и ингибирование её синтеза в присутствии pS2 (табл. 1). Анализ активности /?-галактозидазы в 5'-делеционных мутантах показал, что шпилька LH не обязательна для аутогенной регуляции, тогда как центральная область (CR) и шпилька RH строго необходимы. Для внутренних делеций были выбраны универсально консервативные участки 5'-НТО (см. рис. 4). Делеции этих коротких последовательностей rpsB ТИР во всех случаях приводили к нарушению регуляции белком S2, и одновременно к повышению активности синтеза Дгалактозидазы. Таким образом, универсально консервативные участки ТИР Аумб-мРНК являются негативными регуляторными элементами при аутогенном контроле оперона. Повышение эффективности экспрессии rpsB-lacZ-генов при делеции этих негативных элементов свидетельствует о том, что в норме rpsB-тгн репрессирован избытком белка S2, синтезируемого в клетке. Значительное повышение активности и потеря способности регуляции белком S2 наблюдается и при делеции консервативной петли GGGU в шпильке RH из лидерной области rpsB P. aeruginosa (последняя строка в таблице 1), что ещё раз подтверждает консервативность механизмов регуляции исследуемого оперона в отдалённых семействах у-протеобактерий.

Таблица 1. Влияние делеций в консервативных областях 5'-НТО rpsB на активность Дгалактозидазы в химерных хромосомных конструкциях rpsB-lacZ. Фактор репрессии - отношение /3-галактозидазной активности в контроле (pACYC184) к активности в условиях избытка S2, синтезируемого с плазмиды (PS2).

Делеция (длина 5'-НТ0 или положение делеции) Активность (З-гапашшдазы PACYC184 pS2 Фактор репрессии

Дикий тип (162-н.о.) 6400 +/-250 680 +/-40 9.4

ДLH (121-н.о.) 7120+/-1100 890+/-180 8.0

Д1Н, ACR (93-н.о.) 7520+/-1650 8200 +/-1800 0.9

AGGGU-петля в RH 67700 +/-8500 73400 +/-6700 1.05

ACR (от-121 до-93) 30900 +/-4200 33300 +/-3500 0.92

AGUGGAGG (от 40 до -33) 35700 +/-4000 37200 +/-6500 0.96

ДС-кластер (от -33 до -23) 10600 +/-1500 8900+/-1100 1.2

Дикий тип 5'-НТО P. aeruginosa 340 +/-70 115+/-20 3

AGGGU-петля в RH 5'НТО Р.аег. 1315 +/-30 1370 +/-50 0.96

6. Механизм регуляции синтеза EF-Ts.

Как в ранних работах, так и в данной работе не удалось обнаружить промотор в межцистронной области оперона rpsB-tsf. Следовательно, синтез фактора элонгации трансляции Ts вероятнее всего происходит с бицистронной мРНК rpsB-tsf и может контролироваться белком S2. Влияние S2 in trans на синтез Ts исследовали с помощью Вестерн-блот-анализа. Значительное уменьшение количества Ts в клетке в присутствии pS2 подтверждает предположение о том, что S2 негативно регулирует синтез фактора (рис. 8а). Вестерн-блот анализ также показал, что количество белка S2 не увеличивается пропорционально введённой в клетку дозе гена (в присутствии плазмиды pS2), что полностью согласуется с аутогенным контролем rpsB. Полученные данные позволяют заключить, что экспрессия обоих генов оперона rpsB-tsf негативно регулируется белком S2.

Регуляция синтеза Ts из-за нарушения трансляционного сопряжения в опероне rpsB-tsf, скорее всего, невозможна, так как межцистронная область является слишком протяженной (258 н.о.) и к тому же структурированной. Нельзя полностью исключить возможность того, что S2 регулирует экспрессию tsf независимо от rpsB, связываясь со структурными элементами в межцистронной области. Для проверки такой возможности была получена конструкция tsf'- 'lacZ, включающая полноразмерную межцистронную область и 3'-концевую область rpsB-гена. Анализ активности /?-галактозидазы показал, что полученная конструкция активна в трансляции, но не регулируется белком S2 in trans (рис.86). Кроме того, экспрессия /?-галактозидазы в ней возможна только при индукции /ас-промотора, что подтверждает отсутствие дополнительного промотора в межгенной области оперона rpsB-tsf. Это позволяет сделать вывод, что в негативный контроль синтеза обоих белков вовлечен единственный регуляторный район, расположенный в 5'-НТО перед кодирующей областью rpsB.

ФИВФ ШШШ aiiTH-S2 pACYC184 pSl psT

активность /i-галактозидазы в конструкциях tsf- 'lacZ (при индуцированном ИПТГ /ас-промоторе)

pACYC184 pSl pS2

3470 ±200 3400±50 3750±150

Рисунок 8. Белок S2 регулирует синтез Ts, взаимодействуя с единственной регуляторной областью, расположенной перед кодирующей областью rpsB. а) Вестерн-блот анализ синтеза белков S2 и Ts в клетках E.coli, трансформированных плазмидами pACYCL84, pSl (контрольные плазмиды) и pS2. б) Активность синтеза уЗ-галактозидазы в штамме, содержащем трансляционно слитый хромосомный ген tsf'-'lacZ, при трансформации плазмидами pACYC184, pSl, и pS2. в) Нозерн-блот анализ транскриптов rpsB и rpsB-tsf в норме и при избыточном синтезе S2 in trans с использованием специфических зондов на /-/м5-транскрипты (проба rpsB) и й/-транскрипты (проба tsf).

Известно, что для нормальной экспрессии белковых генов в бактериях необходимо, чтобы синтезируемая мРНК транслировалась ещё до окончания её транскрипции, иначе происходит преждевременная терминация транскрипции (эффект полярности). При связывании S2 с регуляторной областью подавляется трансляция rpsB, что в свою очередь приводит к преждевременной терминации транскрипции, и синтез бицистронной РНК rpsB-tsf резко снижается (рис. 8в). Таким образом, 82-опосредованная репрессия трансляции rpsB оказывает полярный эффект на экспрессию tsf из-за нарушения транскрипционно-трансляционного сопряжения.

7. Влияние мутаций в опероне rpsB-tsf на синтез белков S2 и Ts в клетке.

Регуляция оперона rpsB-tsf белком S2 была также подтверждена при изучении экспрессии rpsB и tsf в мутантах по гену rpsB. Для этого мы использовали два ранее охарактеризованных ф^В-мутанта - rpsBl(ts) и rpsBli(rpsB::lSl). Мутация rpsBl - точечная мутация в гене rpsB, которой соответствует термочувствительный фенотип: rpsB 1-клетки не могут расти при температуре выше 40°С, потому что нестабильный мутантный S2 денатурирован и не принимает участие в сборке 30S субчастиц. Мутация

проба rpsB проба tsf

pS2

ащ rpsB-tsf i rpsB

pS2

грБВП - это инсерция 1Б/ элемента сразу за тандемом стоп кодонов /ртВ, дестабилизирующая мРНК гряВ и таким образом понижающая количество Б2 в клетке. Мутации вносили с помощью Р1-трансдукции в штаммы, несущие в хромосоме конструкции гряВ'- Час2.

Анализ синтеза белков Б2 и Тб методом Вестерн-блоттинга показал, что в мутанте грвВ!^) количество фактора элонгации Тб увеличивается в 2-3 раза, тогда как в грзВИ его количество значительно ниже по сравнению со штаммом дикого типа (рис. 9а). При этом количество Б2 в мутанте грзВ1 не повышается, что возможно связано с быстрой деградацией нестабильного мутантного белка клеточными протеазами. В мутанте гряВИ количество Б2 снижено по сравнению с /ум'Д+клетками из-за дестабилизации мРНК гряВ. Увеличение количества фактора Тб в мутанте гр$В1 вызвано ослаблением Б2-опосредованной репрессии, что прямо доказано при исследовании активности /2-галактозидазы в мутантах. Активность нерегулируемой конструкции ТИР-50 не изменяется при введении мутаций в клетки, тогда как активность ТИР-208 повышается приблизительно в 3 раза в мутанте гр$В1 и более чем в 6 раз в грБВП (рис. 96). Вероятно, мутантный 82(1э) отчасти теряет регуляторную способность вследствие частичной денатурации белка даже при пермиссивной температуре 37°С. Трансформация плазмидой рБ2 мутантного штамма гряВ] возобновляет синтез полноценного Б2 и, соответственно, вызывает падение активности ТИР-208 до значения сравнимого с ТИР-208/рБ2 в гряВ+ клетках (рис.9б). В мутанте грзВП дестабилизация мРНК замедляет накопление Б2 в клетке, и весь синтезированный белок связывается с ЗОБ субчастицами. В результате не образуется избытка Б2, который в норме репрессирует собственный синтез, и активность синтеза р-галактозидазы под контролем гряВ-ТИР повышается (рис. 96).

Существенное уменьшение количества Тб в клетках мутанта гряВИ (рис. 9а), возможно, является следствием полярного эффекта ^/-элемента на экспрессию tsf (1Б7 содержит терминатор, останавливающий транскрипцию с внешнего промотора). Природа остаточного синтеза фактора Тб в мутанте грзВП была неясна- либо элемент 1Б/ обладает неполной полярностью, либо он активирует критический -10-промоторный элемент в межгенной области (т.к. содержит элемент -35, РгеШЫ е1 а!., 1986).

Рисунок 9. Влияние мутаций грзВ1 и грьВП на экспрессию оперона грвВ^. а) Вестерн-блот анализ синтеза белков Б2 и Тэ в мутантных штаммах Е.соИ. Сверху указаны антитела, использованные для идентификации белков, снизу - обозначение гр$В-аллеля. б) Активность синтеза /3-галактозидазы в штаммах ЬАВгрзВТЖ-208::1ас2 и ЬАВгрзВТШ-50::1ас2 дикого типа и содержащих мутации грзВ!^) и гр$В11(¥&1). Мутант грзВ! 1 не может быть трансформирован плазмидой р82.

Были получены веские аргументы в пользу первого варианта. Оказалось, что трансформация плазмидой рБ2 детальна для клеток штамма гряВП. Если небольшое количество Тб образуется в мутанте гряВП из-за неполной (не 100%) полярности 187, то есть синтезируется с г^В-/5/-мРНК, введение избытка Б2 с плазмиды должно привести к дополнительной репрессии синтеза жизненно важного фактора и к гибели клетки. Если же активируется критический промотор - плазмида рБ2 не должна обладать летальностью, так как синтез Те будет происходить с моноцистронного транскрипта, направляемого вновь образованным гибридным промотором. Поскольку клетки гибли в присутствии р82, активации промотора перед й/ не происходит. Для прямого подтверждения этого вывода клетки штамма гряВП были трансформированы двумя совместимыми плазмидами рБ2 и рТгс99А-1з£ экспрессирующей ген tsfпод контролем промотора Ггс. В результате летальный эффект рБ2 упразднялся за счёт синтеза Тб со второй плазмиды, что подтверждает предположение о неполной полярности 1Б/ в мутанте гр$В11.

45000

35000 30000 25000 20000 15000

5000 О

8. Аутогенная регуляция /ртВ-й/возможно осуществляется комплексом

белков 81 и 82

Параллельно с экспериментами с г/«5-мутантами исследовали, как изменяется экспрессия репортера грзВ(ТШ208)-1ас2 в мутанте по гену р-белка Б1 грзА::\Б10 {ззуР29). Оказалось, что активность /2-галактозидазы в гр$А-мутанте повышена на 50% (рис. 10а). Инсерция мобильного элемента 18/0 на 3'-конце гена гряА вызывает дестабилизацию АртЛ-мРНК, что приводит к замедлению накопления в клетке укороченного с С-конца варианта (Вош е1 а1., 2000). В присутствии плазмиды рБ1 активность /ртВ-ТИР-208 в мутанте не отличалась от активности в гр.чА '-клетках (рис. 10а), то есть наблюдаемое повышение связано именно с мутацией в гене белка Б1.

Рисунок 10. Репрессорная активность S2 зависит от концентрации S1 в клетке, а) Активность у£галактозидазы в штамме LABrpsBTIR-208::lacZ, содержащем мутацию rpsA::\S10 (ssyF29) (объяснения в тексте), б) Иммунопреципитация комплекса белков S1-S2 из клеточных лизатов E.coli с применением специфичных к белку S2 козьих антител, иммобилизованных на A/G-белок-агарозе. Вестерн-блот анализ иммобилизованной фракции белков после разделения в 12,5% ПААГ по Лэммли с применением поликлональных кроличьих антител к белкам S1 и Ts. S1 - 50 нг очищенного индивидуального S1; лизат wt и лизат ssyF - 2 мкг суммарных растворимых клеточных белков из лизатов rpsA+- и ssyF29-клеток (экспоненциальные культуры); IPcont - контроль на специфичность, показывающий, что белок S1 не соосаждается с белком S15 на иммуносорбенте с иммобилизованными козьими антителами к белку S15.

Кроме того, синтез белка Б2 с плазмиды подавлял активность г/м5-ТИР208 в мутанте грзА::1$>10 в меньшей степени (в 2-3 раза) по сравнению с гряЛ*-клетками (в 10 раз), то есть наблюдался пониженный уровень аутогенной репрессии. Можно предположить, что для аутогенной регуляции оперона грт5-й/ необходимо достаточное количество белка 81 дикого типа. Для проверки этого предположения была создана плазмида рВ1182, экспрессирующая ген грзВ и совместимая с плазмидой рБ I. Анализ активности /?-галактозидазы в мутанте показал, что одновременное введение плазмид рБ1 и рВЯ82 в

клетки обеспечивает 9-10 кратную репрессию грвВ-\ас2, как и в /ртЛ+-штамме (рис. 10а). Исходя из полученных данных, можно предположить, что белок Б1, возможно, принимает участие в аутогенной регуляции оперона грзВ^. Известно, что белки 81 и 82 взаимодействуют в составе рибосомы. Методом иммунопреципитации мы показали, что комплекс белков 81-82 присутствует в лизатах клеток. Следует отметить, что с 82 соосаждается не только 81 дикого типа, но и 81 из мутанта ввуР29 (рис. 106). Таким образом, ослабление аутогенного контроля экспрессии грвВ в этом мутанте связано не с присутствием укороченного мутантного варианта 81, а с его низкой (по сравнению с г/иЛ+-клетками) концентрацией.

Как оказалось, плазмида рЭ1 восстанавливает способность клеток мутанта грзВ1(1з) к росту при температуре 42°С. (Рис. 11). Вероятно, связывание избытка белка 81 с мутантным белком 82(1$) приводит к стабилизации его структуры (шаперонный эффект), что также говорит в пользу образования комплекса 81-82 в клетке.

Рисунок 11. Супрессия мутации грзВ1(Хз) при введении плазмид рБ 1 и рЭ2. Слева - рост мутантных колоний, трансформированных плазмидами рАСУС184, рБ 15, рЭ 1 и рЭ2 при 37 °С. Справа - рост мутантных колоний, трансформированных плазмидами рАСУС184, рБ15 (отрицательный контроль), рБ 1 и рв2 при 42°С.

9. Исследование свойств промотора оперона Мутационный анализ. Как уже обсуждалось выше, локализация промотора оперона выявила его необычную структуру: удлиненный -10-элемент (TGTGgTATAAA), редкий транскрипционный старт С, СС-богатый дискриминатор, вырожденный элемент -35 (TTGgtg, 3/6). Для определения роли отдельных элементов последовательности промотора был проведён сайт-направленный мутагенез удлинённой -10 области и -35 области Влияние мутаций на активность промотора оценивали по активности экспрессии гена !ас2 под контролем мутантного Рг/мВ (рис. 12). Чтобы исключить влияние мутаций на пост-транскрипционный контроль репортера гр$-В-1ас1, для изучения свойств необычного г/иб-промотора была использована конструкция ТИР-208, несущая небольшую делецию (ДОСОи, позиции от -72 до -69), полностью снимающую аутогенный контроль (таблица 1).

С помощью мутагенеза были получены строгие доказательства того, что г/мВ-промотор действительно принадлежит к классу удлиненных «-10»-промоторов, активность которых зависит от ТвТО-удлинения перед элементом «-10». Замена ТвТв на ТСТС или ТСАС приводила к драматическому падению активности, причем эта потеря не восстанавливалась при мутации области -35, превращающей ее в идеальный элемент ТТвАСА. Мутации в консервативной последовательности ТГС в области -35 также значительно понижали активность промотора (рис. 12). Таким образом, активность промотора г/«5 зависит как от удлинённого -10 элемента, так и от области -35 (рис. 12).

консенсус О-70 промотора;ТТ€АСА (спейсер) татаат

-40 -30 -20 -ю и +10

конструкции Относительная

1. активность

удлинение

промотора. „35 .и _|ц ц промотора %

»1 СААСААТТАТТСететССАССАССТАТТТСТСвТАТАААССОССССССАСТТССС 100

ГГШЬсхН ............................ТСТС....................... 2.4

ти1-ех12 ............................ТСАС..............................................0.64

-35соп8. тШ-ехи........ттйжса..............тсас....................... 0.8

»пи-35 .........дасстс........................................ 8.8

АТ-аи ........................................ааатт....................n.0.

Рисунок 12. Мутации в последовательности промотора г/и б, полученные методом сайт-направленного мутагенеза, и соответствующие активности мутантных промоторов, оцененные по уровню синтеза /?-галактозидазы.

Полученные в результате мутационного анализа данные ещё раз подтверждают положение элементов промотора, намеченное при картировании

5'-концов /-/»'Я-транскриптов, а также показывают необходимость сочетания всех элементов промотора для эффективной транскрипции.

Изучение влияния аминокислотного голодания на активность РrpsB. Механизм строгого контроля (stringent control) регулирует синтез стабильных РНК (рРНК и тРНК), а также экспрессию ряда других генов, вовлеченных в биосинтез белка. В условиях голодания потребность в синтезе рибосом снижается и возникает необходимость активации других оперонов, например, ответственных за синтез аминокислот. В ответ на голодание клетка синтезирует низкомолекулярный регулятор (p)ppGpp, подавляющий промоторы рРНК и тРНК (и ряда других генов), и при этом активирующий промоторы оперонов, продукты которых необходимы для выживания в условиях стресса. Для промоторов, активность которых подавляется (p)ppGpp характерно присутствие GC-богатого дискриминатора, отделяющего -10 элемент от точки начала транскрипции. Именно такой дискриминатор присутствует в /рт.5-промоторе. Мы проверили, реагирует ли промотор rpsB на аминокислотное голодание по механизму строгого контроля. Голодание по серину индуцировали стандартным методом с помощью добавления к культурам клеток серингидроксамата (SHX), который стимулирует синтез ppGpp, ингибируя сериновую аминоацил-тРНК-синтазу. Из контрольных культур (до добавления SHX) и «голодающих» (30 мин после добавления) выделяли суммарную клеточную РНК. Активность промотора оценивали по количеству 5'-концевого фрагмента /уиЯ-транскриптов, используя метод ОТ-ПЦР. В качестве контроля оценивали в тех же пробах активность промотора Р1 оперона ггпВ (рРНК), для которого подавление активности при аминокислотном голодании изучено в деталях. Оба промотора снижали активность после добавления SHX. Чтобы выяснить, в какой степени отрицательный stringent-ответ /уий-промотора определяется присутствием GC-богатого дискриминатора, его заменили на АТ-богатую последовательность (рис. 12). Выяснилось, что при введении мутаций в область дискриминатора регуляция пропадает (рис. 13).

п.о. М Р,ид Р,7кв-сН5АТ

400 --гр$в

тпп ............■ ттт <ш*щ* .....

2оо— ► ггпВР!

100 - * _§НХ +8НХ-ЗНХ+8НХ Рисунок 13. Влияние ррйрр на активность промоторов ггпВ Р1 и г/ш5 дикого типа и с заменой дискриминатора в г/и£-промоторе на АТ-богатую последовательность. М - маркер размеров ДНК-фрагментов, Рф5в - промотор с дискриминатором дикого типа, Рф^-сНвАТ - промотор с заменой ОС-богатого дискриминатора на АТ-богатый.+/-8НХ - наличие/отсутствие серингидроксамата в среде с культурой клеток, из которой выделяли тотальную РНК для ОТ-ПЦР.

Таким образом, ррОрр-зависимая негативная регуляции транскрипции оперона гр.?В-(з/ определяется присутствием ОС-богатого дискриминатора. Можно сделать вывод, что регуляция синтеза белка 82 и фактора Тб осуществляется не только на уровне трансляции по механизму аутогенной репрессии, но и на уровне транскрипции под воздействием глобального регулятора (р)ррСрр.

выводы

1. Картирован единственный промотор оперона грзВ-Котносящийся к классу удлинённых -10 промоторов. Промотор высоко-консервативен у у-протеобактерий. Структура промотора доказана мутационным анализом.

2. Белок 82 является аутогенным регулятором обоих генов оперона грзВ^я/. Негативная регуляция гена гряВ осуществляется на уровне мРНК по механизму трансляционной репрессии. Экспрессия гена й/подавляется за счёт нарушения транскрипционно-трансляционного сопряжения.

3. Аутогенная регуляция генов грБВ и М/ осуществляется с единого операторного участка, расположенного в 5'-НТО перед геном грзВ. Структура оператора консервативна у у-протеобактерий.

4. Белок 81 принимает участие в регуляции оперона формируя комплекс с 82.

5. Транскрипция грзВМ/ негативно регулируется низкомолекулярным регулятором ррОрр при аминокислотном голодании из-за присутствия ОС-богатого дискриминатора в промоторе грьВ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в научных журналах:

1. Асеев Л.В., Левандовская A.A., Скапцова Н.В., Бонн И.В. 2009. Консервативность регуляторных элементов, контролирующих экспрессию rpsB-tsf оперона у гамма-протеобактерий. Молекулярная биология, 43(1): 111118.

2. Leonid V. Aseev, Alexandrina A. Levandovskaya, Ludmila S. Tchufistova, Nadezda V. Scaptzova, and Irina V. Boni. 2008. A new regulatory circuit in ribosomal protein opérons: S2-mediated control of the rpsB-tsf expression in vivo. RNA, 14(9): 1882-1894.

3. Комарова A.B., Чуфистова Л.С., Асеев Л.В., Бони И.В. 2005 Штамм Escherichia coli, продуцирующий безлидерную мРНК с хромосомного /ас-промотора. Биоорган, химия. 31, №5, 557-560.

Тезисы докладов на российских и международных конференциях:

1. Асеев Л.В. Исследование аутогенного контроля экспрессии оперона rpsB-tsf Escherichia coli: идентификация регуляторной области. Тезисы докладов XIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2006", секция Биология, 12-15 апреля 2006, МГУ, с. 16-17.

2. Бони И.В., Чуфистова (Калединская) Л.С., Асеев Л.В. Регуляция синтеза рибосомных белков. Тезисы докладов VIII чтений, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова. 25-27 окт. 2006, ИБХ РАН, с. 24.

3. Асеев Л.В., Левандовская A.A., Скапцова Н.В., Бони И.В. Регуляция оперона rpsB-tsf, кодирующего рибосомный белок S2 и фактор элонгации трансляции Ts. Тезисы докладов IV Съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск 11-15 мая 2008 г., с. 90.

4. Асеев Л. Консервативность регуляторных элементов, контролирующих экспрессию оперона rpsB-tsf у гамма-протеобактерий. Тезисы докладов международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов - 2008», секция Биология 8-11 апреля 2008, МГУ, с. 144-145.

5. Асеев Л.В., Левандовская A.A., Бони И.В. Аутогенная регуляция оперона rpsB-tsf, кодирующего рибосомный белок S2 и фактор элонгации трансляции Ts. Тезисы докладов XXI зимней молодёжной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». 9-11 февраля 2009, ИБХ РАН, с.13.

6. Асеев Л.В., Бони И.В. Регуляция оперона rpsB-tsf, кодирующего рибосомный белок S2 и фактор элонгации Ts. Тезисы докладов международной научной

конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчиннокова. 28 сентября - 1 октября 2009, ИБХ РАН, том 2, с 14-15.

7. Aseev L.V., Boni I.V. Autogenous regulation of the rpsB-tsf operon of Escherichia coli. Abstracts of VII International conference Ribosome synthesis-2006, Airlie Conference centre, Virginia, USA, p. 58.

8. Leonid V. Aseev, Ludmila S. Tchufistova and Irina V. Boni. A new regulatory circuit in ribosomal protein operons: S2-mediated control of rpsB-tsf expression. Abstracts of International Conference "Ribosomes 2007", Sea Crest Resort, Cape Cod, MA USA, June 3-8, p.33.

9. L.V. Aseev, N.V. Scaptzova, and I.V. Boni. Conservation of the regulatory elements that control expression of the rpsB-tsf operon in gamma-proteobacteria. Book of Abstracts, II International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology. 28 November-1 December 2007, Seville, Spain, p. 538.

10. Aseev L.V., Levandovskaya A.A., Skaptsova N.V., Boni I.V. Dissection of the Escherichia coli rpsB promoter: in vivo analysis of activity and stringent response. Book of Abstracts, III International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology. 2-4 December 2009, Lisbon, Portugal, p. 580.

Заказ № 133-а/09/10 Подписано в печать 20.09.2010 Тираж 75 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Асеев, Леонид Викторович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ. Общая характеристика работы.

1.1 Актуальность работы.

1.2 Цели и задачи исследования.

1.3 Научная новизна и практическая значимость работы.

1.4 Апробация и публикация работы.

ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1 Внерибосомные функции рибосомных белков.

2.1.1 Введение.

2.1.2 Внерибосомные функции рибосомных белков у прокариот.

2.1.3 Внерибосомные функции рибосомных белков у эукариот.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование регуляции оперона rpsB-tsf, кодирующего рибосомный белок S2 и фактор элонгации трансляции Ts"

4.2 Рибосомный белок S2 является негативным регулятором собственного синтеза in vivo.81

4.2.1 Принцип экспериментального подхода к изучению регуляции оперона in vivo.81

4.2.2 Создание генетических конструкций для исследования регуляции оперона rpsB-tsf.82

4.2.3 Исследование аутогенной регуляции оперона rpsB-tsf в полученных штаммах.86

4.3 Локализация промотора оперона rpsB-tsf.87

4.4 Анализ консервативности 5'-нетранслируемой области (НТО) оперона rpsB-tsf.92

4.5 В регуляцию экспрессии гена rpsB вовлечена 5'-НТО rpsB-мРНК.96

4.6 Консервативность механизма аутогенной регуляции гена rpsB у гамма-протеобактерий.97

4.7 Анализ активности rpsB промоторов из Y.pestis, H.influenzae и

P.aeruginosa при транскрипции в составе хромосомы E.coli.98

4.8 Анализ способности белка S2 Е. coli к регуляции экзогенных 5'-НТО in vivo.100

4.9 Делеционный анализ регуляторной области оперона rpsB-tsf Escherichia coli.102

4.10 Механизм регуляции синтеза EF-Ts.104

4.11 Влияние мутаций в опероне rpsB-tsf на синтез белков S2 и Ts в клетке. .106

4.12 Аутогенная регуляция rpsB-tsf возможно осуществляется комплексом белков S1 и S2.111

4.13 Исследование свойств промотора оперона rpsB-tsf.114

4.13.1 Мутационный анализ.114

4.13.2 Изучение влияния аминокислотного голодания на активность Рф5в. .117

ГЛАВА 5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ.119

ВЫВОДЫ.124

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.125

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

30S - малая рибосомная субчастица. ак.о. - аминокислотный остаток.

ДСН - додецилсульфат натрия

ДТТ - дитиотреитол. ед. акт. — единица активности.

ИПТГ - изопропил-Р-Б-тиогалактопиранозид. мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота. нкРНК - малая некодируюгцая рибонуклеиновая кислота

НТО - нетранслируемая область. н.о. - нуклеотидный остаток.

ОНФГ - ортонитрофенил-Р-О-галактозид.

ОТ — обратная транскрипция.

ПААГ - полиакриламидный гель.

ПЦР или PCR - полимеразная цепная реакция. п.о. (Ь.р.) - пара оснований (англ. base pairs). рРНК - рибосомная рибонуклеиновая кислота.

ТИР (TIR) - трансляционный инициаторный район (translation initiation region). тРНК - транспортная рибонуклеиновая кислота, т.п.о. (kb.) — тысяча пар оснований (англ. kilobase). ЭДТА - этилендиаминтетраацетат.

Ampr и Amps - ампициллин-резистентные и ампициллин-чувствительные клеточные культуры.

ВВ и ХС - маркеры-красители бромфеноловый синий и ксиленцианол.

Cm - антибиотик хлорамфеникол dNTP - 2'-дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфат. ddNTP - 2'-дидезоксирибонуклеозид-5'-трифосфат.

IRU/ERIC - Межгенный повторяющийся элемент, или энтеробактериальный повторяющийся межгенный консенсус (от англ. Intergenic Repeat Unit и Enterobacterial repetitive intergenic consensus)

PBS - фосфатно солевой буфер (от англ. Phosphate Buffer Saline). PMSF - фенилметилсульфонилфторид

RBS - участок связывания рибосомы на мРНК (от англ. ribosome binding site).

SD - последовательность Шайна-Дальгарно. SHX - DL-серингидроксамат. Tet - антибиотик тетрациклин.

Tetr - тетрациклин-резистентные клеточные культуры. X-gal - 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-Р~В-тиогалактопиранозид.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Асеев, Леонид Викторович

ВЫВОДЫ

1. Картирован единственный промотор оперона гряВ^/, относящийся к классу удлинённых -10 промоторов. Промотор высоко-консервативен у у-протеобактерий. Структура промотора доказана мутационным анализом.

2. Белок 82 является аутогенным регулятором обоих генов оперона грБВ^з/. Негативная регуляция гена грзВ осуществляется на уровне мРНК по механизму трансляционной репрессии. Экспрессия гена tsf подавляется за счёт нарушения транскрипционно-трансляционного сопряжения.

3. Аутогенная регуляция генов гряВ и осуществляется с единого операторного участка, расположенного в 5'-НТО перед геном гряВ. Структура оператора консервативна у 7-протеобактерий.

4. Белок принимает участие в регуляции оперона гряВ^я/, формируя комплекс с 82.

5. Транскрипция гряВ^я/ негативно регулируется низкомолекулярным регулятором ррврр при аминокислотном голодании из-за присутствия ОС-богатого дискриминатора в промоторе гряВ.

ГЛАВА 5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ

В работе исследовали регуляцию оперона rpsB-tsf Escherichia coli, кодирующего два жизненно важных компонента трансляционного аппарата клетки - рибосомный белок S2 и фактор элонгации Ts. Молекулярные механизмы аутогенного контроля синтеза рибосомных белков были изучены для многих рибосомных оперонов, однако регуляция оперона rpsB-tsf никогда не исследовалась и даже действительное положение и структура промотора оставались неопределёнными. В работе впервые картирован промотор rpsB-tsf и показано, что он является единственным промотором оперона, с которого образуются моноцистронный rpsB и бицистронный rpsB-tsf транскрипты. Промотор имеет необычную структуру, которая высоко консервативна у гамма-подкласса протеобактерий. Структура промотора подтверждена мутационным анализом. Промотор включает два разнонаправленных элемента - удлинённый -10 элемент (TGTGnTATAAA), который согласно литературным данным стабилизирует открытый комплекс РНК-полимеразы с промотором, и GC-богатый дискриминатор, который, наоборот, должен дестабилизировать этот комплекс, особенно в стрессовых ситуациях, когда в клетке повышен уровень ppGpp. Из известных промоторов, подверженных негативному ppGpp-опосредованному stringent-контролю, ни один не принадлежит к классу удлиненных промоторов, поэтому априори нельзя было даже предположить, как будет отвечать ф,?2?-промотор на аминокислотное голодание и повышение уровня ppGpp в клетке. Полученные в работе данные показывают, что экспрессия rpsB-tsf негативно регулируется ppGpp при аминокислотном голодании. Это новые данные. Они открывают перспективы для дальнейшего исследования. Работа по изучению свойств г/адВ-промотора только начинается, еще многое предстоит сделать в этом направлении - выяснить, как поведет себя промотор в релаксированных штаммах (не синтезирующих ppGpp), какова функция белка-регулятора DksA, который для ряда промоторов является медиатором ррСрр-опосредованного контроля (например, для промоторов рРНК, Haugen et al., 2008), как изменяется активность фяЯ-промотора при низкой температуре.

Впервые показано, что р-белок S2, как и многие другие р-белки, имеет внерибосомную функцию в E.coli и других гамма-протеобактериях, являясь негативным регулятором экспрессии жизненно важного оперона rpsB-tsf. В большинстве регулируемых оперонов р-белков репрессор связывается с мРНК и блокирует трансляцию [Zengel & Lindahl 1994]. Аналогично, S2-опосредованная репрессия осуществляется на уровне РНК, а не ДНК. В отличие от других оперонов р-белков, которые регулируются р-белками, напрямую взаимодействующими с рРНК на первых этапах сборки рибосомных субчастиц, оперон rpsB-tsf регулируется белком, который не узнает свободную рРНК и включается в состав 30S субчастицы на завершающем, этапе сборки. Поэтому как белок-репрессор, S2 представляет собой исключение из общего правила. Другим исключением, как было показано ранее [Skouv et al., 1990; Boni et al. 2001], является белок SI, который присоединяется к ЗОБ-субчастице последним, когда к ней уже присоединился* S2. Таким образом, аутогенными регуляторами являются как «первичные» белки, инициирующие сборку и чувствующие присутствие свободной рРНК, так и «третичные», S1 и S2, завершающие сборку и чувствующие присутствие завершенных зрелых рибосомных субчастиц.

Механизм аутогенной регуляции rpsB-tsf-ouepoua высоко консервативен у у-протеобактерий. Не только структура промоторов, но и структура 5'-НТО rpsB мРНК консервативны у многих семейств, даже настолько удаленных как энтеробактерии и псевдомонады. Обращает на себя внимание тот факт, что, несмотря на различие по длине и в целом по последовательности, 5'-НТО укладываются в очень похожие вторичные структуры, в которых универсально консервативные короткие участки последовательности занимают сходное положение. Филогенетические предсказания подтверждены экспериментально, и в экспериментах in vivo доказана возможность регуляции белком S2 из E.coli экзогенных регуляторных областей из других видов у-протеобактерий. Интересно, что не у всех оперонов р-белков наблюдается столь высокая консервативность. Так, в оперонах S10 [Allen et al., 1999] и rpsA [Tchufistova et al., 2003] сходство регуляторных структур, а соответственно и механизмов аутогенного контроля, не распространяется на псевдомонады, в то время как для rpsB-tsf мы экспериментально доказали, что репортер rpsB-lacZ, несущий регуляторную область из Р. aeruginosa регулируется белком S2 в Е. coli. Из этого можно сделать вывод о различии во времени возникновения тонких механизмов регуляции синтеза р-белков в эволюции у-протеобактерий- до отделения псевдомонад от остальных семейств (rpsB-tsf) и после (S10, rpsA). Это хорошо согласуется с современными представлениями об эволюции прокариот, с тем, что у-протеобактерии* представляют собой наиболее позднюю ветвь [Gupta 2000]. В перспективе филогенетический анализ регуляторных структур других оперонов р-белков может дать более полную информацию об эволюционной истории аутогенного контроля.

Многие опероны р-белков включают нерибосомные гены - гены трансляционных факторов или субъединиц РНК-полимеразы. Часто эти гены не подвержены регуляции вместе с генами р-белков. Так, sir-onepoH включает гены р-белков S12 (rpsL) и S7 (rpsG), за которыми следуют гены двух факторов элонгации трансляции - EF-G и EF-Tu (fus и tuf А, соответственно). Белок-регулятор S7, связываясь с межцистронным участком rpsL-rpsG, регулирует трансляцию собственного гена и фактора EF-G, но не фактора Tu. Как было показано, ген Tu-фактора транскрибируется1 не только с промотора оперона (перед геном rpsL), но и с двух промоторов в пределах гена EF-G, что обеспечивает его экспрессию при репрессии предшествующих генов (см. Zengel and Lindahl, 1994). Как мы показали, в случае оперона rpsB-tsf оба гена (и белка-регулятора S2 и фактора Ts) подвержены отрицательной регуляции белком. S2, который связывается с единственным оператором, расположенным в 5'-НТО мРНК rpsB между промотором и сайтом связывания рибосомы. В межцистронной области не существует ни дополнительного промотора, ни дополнительного участка связывания белка S2. Более того, трансляция цистрона tsf не зависит от трансляции предыдущего гена. Установлено, что репрессия трансляции мРНК rpsB белком S2 оказывает полярный эффект на экспрессию tsf за счёт нарушения транскрипционно-трансляционного сопряжения в опероне.

В работе показано, что для аутогенной регуляции своего оперона белку S2 требуется помощник, р-белок S1. Оказалось, что нарушение аутогенного контроля происходит не только в ф^-мутантах (нарушение регуляции в мутантах по гену белка-регулятора типично для многих регулируемых оперонов), но и в мутанте по гену белка S1 (rpsA\:IS10) с низким уровнем синтеза укороченного варианта белка. Зависимость от уровня синтеза р-белка, кодируемого* в другом опероне, предполагает, что в регуляции может участвовать комплекс белков» S1-S2. Образование такого комплекса показано с помощью иммунопреципитации. В пользу образования комплекса говорит и обнаруженный в работе нетривиальный факт, что S1 является экзогенным супрессором условно-летальной мутации rpsBl(ts) в гене белка S2, приводящей к его денатурации при повышенных температурах роста. Такая супрессия свидетельствует о том, что S1 проявляет шаперонную активность по отношению к S2.

Таким образом, выявлено принципиальное отличие механизма аутоконтроля оперона rpsB-tsf от известных моделей регуляции других оперонов р-белков, где белку-репрессору не требуется помощник. Единственный случай, когда в регуляцию вовлечен комплекс р-белков - это трансляционная репрессия rplJL-оперона пентамерным комплексом L10(L7/12)4 [Johnsen et al. 1982], но в этом случае оба р-белка являются продуктами одного оперона, их пентамерный комплекс стабилен и образует важный структурный и функциональный домен бОэ-субчастицы. Уникальный случай кооперации S1 и 82-белков для негативной регуляции, безусловно, требует дальнейшего изучения. В перспективе необходимы исследования in vitro, с целью выяснения контактов каждого из белков с операторной областью мРНК. Без этих данных невозможно описание молекулярного механизма регуляции экспрессии оперона rpsB-tsf.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Асеев, Леонид Викторович, Москва

1. Асеев Л.В., Левандовская A.A., Скапцова Н.В., Бонн И.В. (2009). Консервативность регуляторных элементов, контролирующих экспрессию оперона rpsB-tsf у гамма-протеобактерий. Мол. Виол. 43 (1): 111-118.

2. Балуева К.Э., Малыгин A.A., Карпова Г.Г., Невинский Г.А., Жарков Д.О. (2008). Взаимодействие рибосомного белка S3 человека с неповрежденной и поврежденной ДНК. Мол. Биол. 42 (2): 314-322.

3. Иванов A.B., Малыгин A.A., Карпова Г.Г. (2004). Рибосомный белок S26 человека ингибирует сплайсинг собственной пре-мРНК Мол. Биол. 38 (4): 676-683.

4. Комарова A.B., Чуфистова JI.C., Асеев Л.В., Бони И.В. (2005). Штамм Escherichia coli, продуцирующий безлидерную мРНК с хромосомного /ас-промотора. Биоорг. Химия 31 (5): 557-560.

5. Малыгин A.A., Бочкаева З.В., Бондаренко Е.И., Косинова O.A., Локтев В.Б., Шатский И.Н., Карпова Г.Г. (2009). Связывание IRES-элемента РНК вируса гепатита с 40S субчастицей рибосомы: роль белка р40. Мол. Биол. 43 (6): 1070-1076.

6. Парахневич Н.М., Иванов A.B., Малыгин A.A., Карпова Г.Г. (2007). Рибосомный белок S13 человека ингибирует сплайсинг собственной пре-мРНК, Мол. Биол., 41 (1): 51-58.

7. Allen Т., Shen P., Samsel L., Liu R., Lindahl L. and Zengel J.M. (1999). Phylogenetic analysis of L4-mediated autogenous control of the S10 ribosomal protein operon. J. Bacteriol. 181: 6124-6132.

8. Allen T.D., Watkins Т., Lindahl L. and Zengel J.M. (2004). Regulation of ribosomal protein synthesis in Vibrio cholerae. J. Bacteriol. 186(17): 5933-5937.

9. Amsterdam A., Sadler K.C., Lai K., Farrington S., Bronson R.T., Lees J.A. and Hopkins N. (2004). Many ribosomal protein genes are cancer genes in zebrafish. PLoSBiol. 2(5):E139.

10. An G., Bendiak D.S., Mamelak L.A. and Friesen J.D. (1981). Organization and nucleotide sequence of a new ribosomal operon in Escherichia coli containing the genes for ribosomal protein S2 and elongation factor Ts. Nucleic Acids Res. 9:4163.-4171.

11. Aseev L.V., Levandovskaya A.A., Tchufistova L.S., Scaptsova N.V. and Boni I.V. (2008). A new regulatory circuit in ribosomal protein operons: S2-mediated control of the rpsB-tsf expression in vivo. RNA 14(9): 1882-1894.

12. Ban N., Nissen P., Hansen J., Moore P.B. and Steitz T.A. (2000) The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 A resolution. Science 289(5481): 905-920.

13. Barne, K.A., Bown J.A., Busby S.J. and Minchin S.D. (1997). Region 2.5 of the Escherichia coli RNA polymerase sigma70 subunit is responsible for the recognition of the "extended-10" motif at promoters. EMBOJ. 16: 4034-4040.

14. Bollen A., Lathe R., Herzog A., Denicourt D., Lecocq J.P., Desmarez L. and Lavalle R. (1979). A conditionally lethal mutation of Escherichia coli affecting the gene coding for ribosomal protein S2 (rpsB). J. Mol. Biol. 132: 219 233.

15. Boni I.V., Zlatkin I.V. and Budowsky E.I. (1982). Ribosomal protein SI associates with Escherichia coli ribosomes by means of protein-protein interactions. Eur. J. Biochem. 121: 371-376.

16. Boni I.V., Artamonova V.S. and Dreyfus M. (2000). The last RNA-binding repeats of the Escherichia coli ribosomal protein SI is specifically involved in autogenous control. J. Bacteriol. 182(20): 5872-5879.

17. Boni, I.V., Artamonova V.S., Tzareva N.V. and Dreyfus M. (2001). Non-canonical mechanism for translation control in bacteria: synthesis of ribosomal protein SI.EMBOJ. 20(15): 4222 4232.

18. Boubakri H, de Septenville A.L., Viguera E. and Michel B. (2010). The helicases DinG, Rep and UvrD cooperate to promote replication across transcription units in vivo .EMBOJ. 29(1): 145-157.

19. Britton, R.A., Powell B.S., Court D.L. and Lupsky J.R. (1997). Characterization of mutations affecting the Escherichia coli essential GTPase Era that suppress two temperature-sensitive dnaG alleles. J. Bacteriol. 179(14): 4575-4582.

20. Brodersen D.E., Clemons W.M. Jr, Carter A.P., Wimberly B.T. and Ramakrishnan V. (2002). Crystal structure of the 30S ribosomal subunit from Thermus thermofilus: Structure of the proteins and their interaction with 16S RNA. J. Mol Biol. 316: 725-768.

21. Bubunenko M, Baker T. and Court D.L. (2007) Essentiality of ribosomal and transcription antitermination proteins analyzed by systematic gene replacement in Escherichia coli. J. Bacteriol 189(7): 2844-2853.

22. Burns H.D., Belyaeva T. A., Busby S J. and Minchin S.D. (1996). Temperature-dependence of open-complex formation at two Escherichia coli promoters with extended -10 sequences. Biochem. J. 317(Pt 1): 305-311.

23. Burr T., Mitchell J., Kolb A., Minchin S. and Busby S. (2000). DNA sequence elements located immediately upstream of the -10 hexamer in Escherichia coli promoters: a systematic study. Nucleic Acids Res. 28: 1864-1870.

24. Buttner K., Pich A., Neubauer P., Schmid R., Bahl H. and Hecker M. (1997). Co-purification of ribosomal protein S2 and DNA-dependent RNA-polymerase from heat-shocked cells of Bacillus subtilis. J. Basic Microbiol. 37: 3-9.

25. Caffarelli E., Fragapane P., Gehring C. and Bozzoni I. (1987) The accumulation of mature RNA for the Xenopus laevis ribosomal protein LI is controlled at the level of splicing and turnover of the precursor RNA. EMBO J. 6(11): 3493-3498.

26. Carter A.P., Clemons W.M., Brodersen D.E., Morgan-Warren R.J., Wimberly B.T. and Ramakrishnan V. (2000). Functional insights from the structure of the 30S ribosomal subunit and its interactions with antibiotics. Nature 407(6802): 340-348.

27. Chakraborty A., Uechi T., Higa S., Torihara H. and Kenmochi N. (2009). Loss of ribosomal protein Lll affects zebrafish embryonic development through a p53-dependent apoptotic response. PLoS OA® 4(l):e4152.

28. Choonee N., Even S., Zig L. and Putzer H. (2007). Ribosomal protein L20 controls expression of the Bacillus subtilis infC operon via a transcription attenuation mechanism. Nucleic Acids Res. 35(5): 1578-1588.

29. Ciampi M.S., Schmid M.B. and Roth J.R. (1982). Transposon Tn 10 provides a promoter for transcription of adjacent sequences. Proc. Natl. Acad. Aci. USA 79: 5016-5020.

30. Climie S.C. and Friesen J.D. 1987. Feedback regulation of the rplJL-rpoBC ribosomal protein operon of Escherichia coli requires a region of mRNA secondary structure. J. Mol Biol 198(3): 371-381.

31. Clodi E., Semrad K. and Schroeder R. (1999). Assaying RNA chaperone activity in vivo using a novel RNA folding trap. EMBOJ. 18(13): 3776-3782.

32. Coetzee T., Herschlag D.and Belfort M. (1994). Escherichia coli proteins, including ribosomal protein SI2, facilitate in vitro splicing of phage T4 introns by acting as RNA chaperones. Genes Dev. 8(13): 1575-1588.

33. Cornish P.V., Ermolenko D.N., Staple D.W., Hoang L., Hickerson R.P., Noller H.F. and Ha T. (2009). Following movement of the LI stalk between three functional states in single ribosomes. Proc Nat. Acad. Sci. USA 106(8): 25712576.

34. Cuccurese M., Russo G., Russo A. and Pietropaolo C. (2005) Alternative splicing and nonsense-mediated mRNA decay regulate mammalian ribosomal gene expression. Nucleic Acids Res. 33(18): 5965-5977.

35. Cukras A.R., Southworth D.R., Brunelle J.L., Culver G.M. and Green R. (2003) Ribosomal proteins S12 and S13 function as control elements for translocation of the mRNA:tRNA complex. Mol. Cell 12(2): 321-328

36. Culver G.M. (2003). Assembly of the 30S ribosomal subunit. Biopolymers 68: 234-249.

37. Dabbs E.R. (1991) Mutants lacking individual ribosomal proteins as a tool to investigate ribosomal properties. Biochimie 73(6): 639-645.

38. Dabeva M.D. and Warner J.R. (1993). Ribosomal protein L32 of Saccharomyces cerevisiae regulates both splicing and translation of its own transcript. J. Biol. Chem. 268(26): 19669-19674.

39. Dai M.S., Zeng S.X., Jin Y., Sun X.X., David L. and Lu H. (2004). Ribosomal protein L23 activates p53 by inhibiting MDM2 function in response to ribosomal perturbation but not to translation inhibition. Mol. Cell Biol. 24(17): 7654-7668.

40. Dai M.S., Arnold H., Sun X.X., Sears R. and Lu H. (2007). Inhibition of c-Myc activity by ribosomal protein LI 1. EMBO J. 26(14): 3332-3345.

41. Dai M.S. and Lu H. (2008). Crosstalk between c-Myc and ribosome in ribosomal biogenesis and cancer. J. Cell. Biochem. 105(3): 670-677.

42. Danilova N., Sakamoto K.M. and Lin S. (2008). Ribosomal protein S19 deficiency in zebrafish leads to developmental abnormalities and defective erythropoiesis through activation of p53 protein family. Blood 112(13): 52285237.

43. Davies I.J. and Drabble W.T. (1996). Stringent and growth-rate-dependent control of the gua operon of Escherichia coli K-12. Microbiology 142 (Pt 9): 2429-2437.

44. De Gregorio E., Silvestro G., Petrillo M., Carlomagno M.S. and Di Nocera P.P. (2005). Enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence repeats in yersiniae: genomic organization and functional properties. J. Bacteriol. 187: 7945-7954.

45. Degenhardt R.F. and Bonham-Smith P.C. (2008). Arabidopsis ribosomal proteins RPL23aA and RPL23aB are differentially targeted to the nucleolus and are desperately required for normal development. Plant Physiol. 147(1): 128-142.

46. Demianova M., Formosa T.G. and Ellis S.R. (1996). Yeast proteins related to the p40/laminin receptor precursor are essential components of the 40S ribosomal subunit. J. Biol Chem. 271: 11383-11391.

47. Dreyfus M. (1988). What constitutes the signal for the initiation of protein synthesis on Escherichia coli mRNAs? J. Mol. Biol. 204: 79-94.

48. Durfee T., Hansen A-M., Zhi H., Blattner F.R. and Jin D.J. (2008).Transcription profiling of the stringent response in Escherichia coli. J Bacteriol. 190(3): 1084— 1096.

49. Ebert B.L., Pretz J., Bosco J., Chang C.Y., Tamayo P., Galili N., Raza A., Root D.E., Attar E., Ellis S.R. and Golub T.R. (2008). An identification of RPS14 as a 5q- syndrome gene by RNA interference screen. Nature 451(7176): 335-339.

50. Eng F.J. and Warner J.R. (1991). Structural basis for the regulation of splicing of a yeast messenger RNA. Cell 65(5): 797-804.

51. Fei J., Kosuri P., MacDougall D.D. and Gonzalez R.L. Jr. (2008) Coupling of ribosomal LI stalk and tRNA dynamics during translation elongation. Mol. Cell 30(3): 348-359.

52. Fewell S.W. and Woolford J.L. Jr. (1999). Ribosomal protein S14 of Saccharomyces cerevisiae regulates its expression by binding to RPS14B pre-mRNA and to 18S rRNA. Mol. Cell. Biol. 19(1):.826-834.

53. Ford C.L., Randal-Whitis L. and Ellis S.R. (1999). Yeast proteins related to the p40/laminin receptor precursor are required for 20S ribosomal RNA processing and the maturation of 40S ribosomal subunits. Cancer Res. 59(3): 704-710.

54. Gabashvili I.S., Gregory S.T., Valle M., Grassucci R., Worbs M., Wahl M.C., Dahlberg A.E. and Frank J. (2001) The polypeptide tunnel system in the ribosome and its gating in erythromycin resistance mutants of L4 and L22. Mol. Cell 8(1): 181-188.

55. Gao H., Sengupta J., Valle M., Korostelev A., Eswar N., Stagg S.M., Van Roey P., Agrawal R.K., Harvey S.C., Sali A., Chapman M.S. and Frank J. (2003).

56. Study of the structural dynamics of the E. coli 70S ribosome using real-space refinement. Cell 113: 789-801.

57. Gourse R.L., Ross W. and Gaal T. (2000). Ups and downs in bacterial transcription initiation: the role of the alpha subunit of RNA polymerase in promoter recognition. Mol. Microbiol. 37: 687-695.

58. Gupta R.S. (2000). The natural evolutionary relationships among prokaryotes. Crit. Rev. Microbiol. 26: 111-131.

59. Haentjens-Sitri J., Allemand F., Springer M. and Chiaruttini C. (2008). A competition mechanism regulates the translation of the Escherichia coli operon encoding ribosomal proteins L35 and L20. J Mol Biol. 375(3): 612-625.

60. Harms J., Schluenzen F., Zarivach R.} Bashan A., Gat S., Agmon I., Bartels H., Franceschi F. and Yonath A. (2001) High resolution structure of the large ribosomal subunit from a mesophilic eubacterium. Cell 107(5): 679-688.

61. Haugen S.P., Berkmen M.B., Ross W., Gaal T., Ward C. and Gourse R.L. (2006). rRNA promoter regulation by nonoptimal binding of sigma region 1.2: an additional recognition element for RNA polymerase. Cell 125(6): 1069-1082.

62. Hershberg R., Altuvia S. and Margalit H. (2003). A survey of small RNA-encoding genes in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 31: 1813-1820.

63. Hershberg R., Bejerano G., Santos-Zavaleta A. and Margalit H. (2001). PromEC: An updated database of Escherichia coli mRNA promoters with experimentally identified transcriptional start sites. Nucleic Acids Res. 29: 277.

64. Hoogvliet G., van Wezel G.P. and Kraal B. (1999). Evidence that a single EF-Ts suffices for the recycling of multiple and divergent EF-Tu species in Streptomyces coelicolor A3(2) and Streptomyces ramocissimus. Microbiology 145: 2293-2301.

65. Hook-Barnard I.G. and Hinton D.M. (2007). Transcription initiation by mix and match elements: flexibility for polymerase binding to bacterial promoters. Gene Regul. Syst. Bio. 1: 275-293.

66. Houry W.A., Frishman D., Eckerskorn C., Lottspeich F. and Hartl F.U. (1999). Identification of in vivo substrates of the chaperonin GroEL. Nature 402(11): 147-154.

67. Hubner P., Iida S. and Arber W. (1987). A transcriptional terminator sequence in the prokaryotic transposable element IS7. Mol. Gen. Genet. 206: 485-490.

68. Hulton C.S., Higgins C.F. and Sharp P.M. (1991). ERIG sequences: a novel family of repetitive elements in the genome of Escherichia coli, Salmonella typhimurium and other enterobacteria. Mol. Microbiol. 5: 825-834.

69. Jin A., Itahana K., O'Keefe K. and Zhang Y. (2004). Inhibition of HDM2 and activation of p53 by ribosomal protein L23. Mol. Cell. Biol. 24(17): 7669-7680.

70. Jung S.O., Lee J.Y. and Kim J. (2001). Yeast ribosomal protein S3 has an endonuclease activity on AP DNA. Mol. Cells. 12(1): 84-90.

71. Kalapos M.P., Paulus H. and Sarkar N. (1997). Identification of ribosomal protein SI as a poly(A) binding protein in Escherichia coli. Biochimie 79(8): 493-502.

72. Kapasi P., Chaudhuri S., Vyas K., Baus D., Komar A.A., Fox P.L., Merrick W.C. and Mazumder B. (2007). L13a blocks 48S assembly: role of a general initiation factor in mRNA-specific translational control. Mol. Cell 25(1): 113-126.

73. Karring H., Mathu S.G., van Duin J., Clark B.F., Kraal B. and Knudsen C.R. (2004). Qbeta-phage resistance by deletion of the coiled-coil motif in elongation factor Ts. J. Biol. Chem. 279: 1878-1884.

74. Kawano M., Reynolds A.A., Miranda-Rios J. and Storz G. (2005). Detection of 5'- and 3'-UTR-derived small RNAs and cis-encoded antisense RNAs in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 33: 1040-1050.

75. Kazmin D.A., Chinenov Y., Larson E. and Starkey J.R. (2003). Comparative modeling of the N-terminal domain of the 67kDa laminin-binding protein: implications for putative ribosomal function. Biochem. Biophys. Res. Commun. 300: 161-166.

76. Kim J., Chubatsu L.S., Admon A., Stahl J., Fellous R. and Linn S. (1995). Implication of mammalian ribosomal protein S3 in the processing of DNA damage. J Biol Chem. 270(23): 13620-13629.

77. Kim T.S., Kim H.D. and Kim J. (2009). PKCdelta-dependent functional switch of rpS3 between translation and DNA repair. Biochim. Biophys. Acta 1793(2): 395405.

78. Knorr C., Beuermann C., Beck J. and Brenig B. (2007). Characterization of the porcine multicopy ribosomal protein SA/37-kDa laminin receptor gene family. Gene 395(1-2): 135-143.

79. Ko S.I., Park J.H., Park M.J., Kim J., Kang L.W., Han Y.S. (2008). Human ribosomal protein S3 (hRpS3) interacts with uracil-DNA glycosylase (hUNG) and stimulates its glycosylase activity. Mutat. Res. 648(1-2): 54-64.

80. Koc E.C., Burkhart W., Blackburn K., Moseley A. and Spremulli L.L. (2001). The small subunit of the mammalian mitochondrial ribosome. Identification of the full complement of ribosomal proteins present. J. Biol. Chem. 276: 1936319374.

81. Kondo M. (1975). Structure and function of RNA replicase of bacteriophage Qbeta. Arch. Int. Physiol. Biochim. 83(5): 909-948.

82. Kongsuwan K., Yu Q.} Vincent A., Frisardi M.C., Rosbash M., Lengyel J.A. and Merriam J. (1985). A Drosophila Minute gene encodes a ribosomal protein. Nature 317(6037): 555-558.

83. Kovacs D., Rakacs M., Agoston B., Lenkey K., Semrad K., Schroeder R. and Tompa P. (2009). Janus chaperones: assistance of both RNA- and protein-folding by ribosomal proteins. FEBS Lett. 583(1): 88-92.

84. Kuhn J.F., Tran E.J. and Maxwell E.S. (2002). Archaeal ribosomal protein L7 is a functional homolog of the eukaryotic 15.5kD/Snul3p snoRNP core protein. Nucleic Acids Res. 30(4): 931-941.

85. Kuroda A., Nomura K., Ohtomo R., Kato J., Ikeda T., Takiguchi N., Ohtake H. and Kornberg A. 2001. Role of inorganic polyphosphate in promoting ribosomal protein degradation by the Lon protease. Science 293: 705-708.

86. Laemmli U. K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227(259): 680-685.

87. Lai M.D. and Xu J. (2007). Ribosomal proteins and colorectal cancer. Curr. Genomics 8(l):43-49.

88. Regulation of HDM2 activity by the ribosomal protein Lll. Cancer Cell. 3(6): 577-587.i105Luo X., Hsiao H.H., Bubunenko M., Weber G., Court D.L., Gottesman M.E., I Urlaub H. and Wahl M.C. (2008). Structural and functional analysis of the E. coli

89. Sato M., Kong C.J., Yoshida H., Nakamura Т., Wada A., Shimoda C. and Kaneda Y. (2003). Ribosomal proteins SO and S21 are involved in the stability of 18S rRNA in fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Biochem.Biophys. Res. Commun. 311:942-947.

90. Sengupta J., Nilsson J., Gursky R., Spahn C.M., Nissen P. and Frank J. (2004). Identification of the versatile scaffold protein RACK1 on the eukaryotic ribosome by cryo-EM. Nat Struct Mol Biol. 11(10): 957-962.

91. Squires C.L. and Zaporojets D. (2000). Proteins shared by the transcription and translation machines. Annu Rev Microbiol. 54: 775-798.

92. Starmer J., Stomp A., Vouk M. and Bitzer D. (2006). Predicting Shine-Dalgarno sequence locations exposes genome annotation errors. PLoS Comput. Biol., 2(5):e57.

93. Tchufistova L.S., Komarova A.V. and Boni, I.V. (2003). A key role for the mRNA leader structure in translational control of ribosomal protein S1 synthesis in gamma-proteobacteria. Nucleic Acids Res. 31: 6996-7002.

94. Wagner R. (2002). Regulation of ribosomal RNA synthesis in E. coli: effects of the global regulator guanosine tetraphosphate (ppGpp). J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 4(3):331-40.

95. Watson K.L., Konrad K.D., Woods D.F. and Bryant P.J. (1992) Drosophila homolog of the human S6 ribosomal protein is required for tumor suppression in the hematopoietic system. Proc. Natl. Acad. Sc.i USA 89(23): 11302-11306.

96. Wilson D.M. 3rd, Deutsch W.A. and Kelley M R. (1994). Drosophila ribosomal protein S3 contains an activity that cleaves DNA at apurinic/apyrimidinic sites. J. Biol Chem. 269(41): 25359-25364.

97. Wilson L.A. and Sharp P.M. (2006). Enterobacterial repetitive intergenic consensus (ERIC) sequences in Escherichia coli: evolution and implication for ERIC-PCR. Mol Biol Evol. 23: 1156-1168.

98. Wilson D.N. and Nierhaus K.H. (2005). Ribosomal proteins in the spotlight. Crit. Rev. Biochem. Mol Biol 40: 243-267.

99. Wimberly B.T., Brodersen D.E., Clemons W.M. Jr, Morgan-Warren R.J., Carter A.P., Vonrhein C., Hartsch T. and Ramacrishnan V. (2000). Structure of the 30S ribosomal subunit. Nature 407: 327-339.

100. Woodgate R., Rajagopalan M., Lu C. and Echols H. (1989). UmuC mutagenesis protein of Escherichia coli: purification and interaction with UmuD and UmuD'. Proc Natl Acad Sci USA 86(19): 7301-7305.

101. Wool I.G. 1996. Extraribosomal functions of ribosomal proteins. Trends Biochem. Sci. 21(5):164-165.

102. Yacoub A., Kelley M.R. and Deutsch W.A. (1996). Drosophila ribosomal protein PO contains apurinic/apyrimidinic endonuclease activity. Nucleic Acids Res. 24(21): 4298-4303.

103. Yancey J.E. and Matson S.W. (1991). The DNA unwinding reaction catalyzed by Rep protein is facilitated by an RHSP-DNA interaction. Nucleic Acids Res. 19(14): 3943-3951.

104. Zhang Y., Wolf G.W., Bhat K., Jin A., Allio T., Burkhart W.A. and Xiong Y. (2003). Ribosomal protein Lll negatively regulates oncoprotein MDM2 and mediates a p53-dependent ribosomal-stress checkpoint pathway. Mol. Cell. Biol. 23(23): 8902-8912.

105. Zimmermann R.A. (2003). The double life of ribosomal proteins. Cell 115(2): 130-132.214Zuker M., (2003). Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31(13): 3406-3415.

Информация о работе

Асеев, Леонид Викторович
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.03

Диссертация

Исследование регуляции оперона rpsB-tsf, кодирующего рибосомный белок S2 и фактор элонгации трансляции Ts - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы