Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование радиозащитных свойств церулоплазмина

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование радиозащитных свойств церулоплазмина"

КИЇВСЬКИМ НАЦІОНАЛЬНИМ УНІВЕРСИТЕТ імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

Корж Світлана Миколаївна

' УДК 615.012+615.03 : 612.014.48

ДОСЛІДЖЕННЯ РАДІОЗАХИСНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ ЦЕРУЛОПЛАЗМІНУ

03.00.01 — радіобіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ-2000

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор

Бердянських Ніна Костянтинівна, Інститут експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, завідувач відділу біохімії пухлин

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук

Виноградова Руфіна Петрівна,

Київський національний університет імені Тараса Шевченка, професор кафедри біохімії

доктор біологічних наук Дружина Микола Олександрович,

Інститут експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, провідний науковий співробітник відділу біофізики канцерогенезу

Провідна установа: Український науковий центр

радіаційної медицини АМН України

Захист відбудеться «24» квітня 2000 р. о 14:00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26. 001. 24 в Київському національному університеті імені Тараса Шевченка за адресою: 03127, Київ, проспект Глушкова, 2, корпус 12, біофак, ауд.215; поштова адреса: Київ, 01033, вул. Володимирська, 64.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського націо пального університету імені Тараса Шевченка за адресою: вул. Воло димирська, 58 .

Автореферат розісланий « Л. 2000 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Брайон О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ Актуальність теми. Класичні радіопротектори, що застосовуються при роменевих ураженнях, не повністю відповідають сучасним вимогам, оскільки, як равило, характеризуються високою токсичністю (Кудряшов Ю.Б. и др., 999).Тому актуальним с пошук радіозахисних засобів природного походження, етоксичних, притаманних організмові, здатних підвищувати та підтримувати вдогенний фон радіорезистентності при опроміненні у широкому діапазоні доз эойко В.Н. и др., 1995).

Церулоплазмін, фероксидаза (залізо(ІІ): кисеньоксидоредуктаза,

!Ф1.16.3.І) - мідьвмісний глікопротеїн плазми крові ссавців, який

арактеризугться поліфункціональними властивостями (Harris Z.L. et al., 1997). Сьогодні відомо, що церулоплазмін приймає участь у протіканні різних важливих іізіологічних процесів, а саме: у транспорті та утилізації міді, у метаболізмі аліза, окисленні біогенних амінів, тощо (McCord J.,1993; Vulpe C.D. et al., 1995; Laplan J.et al., 1996). Церулоплазмін - основний антиоксидант екстрацелюлярних 'ідин (Halliwell В., 1990; Дубинина Е.Е.,1992). Вважають, що механізми нтиоксидантної дії церулоплазміну пов’язані з його фероксидазними ластивостями та здатністю інгібувати стимульоване іонами заліза та міді іерекисне окислення ліпідів (ПОЛ) у мембранах клітин (Kim I.J. et al., 1998), іозщеплювати перекиси ліпідів (Atanasi R.L.et аі.,1998), перехоплювати вільні іадикали та дисмутувати супероксидні радикали у міжклітинному просторі Ярополов А.И. и др., 1986; Berdinskikh N.K. et al.,1997; Kim I.G.et al.,1998).

Встановлено, що при фізіологічній концентрації церулоплазмін інгібує на І0% процеси ГІОЛ у плазмі крові (Бобырев В.Н. и др., 1989) та, як білок “гострої зази”, реагус на окисний стрес різної природи (Goldstein I.M.et al.; 1982).

Питанню дії радіації на цей фермент присвячено поодинокі роботи, які до ого ж протирічать одна одній (Савицкий И.В. и др., 1980; Aladzhov E.et al.,1990; Іевина А.А. и др., 1993). На сьогодні не з’ясовано вплив різних доз опромінення іа вміст та активність церулоплазміну в організмі, значення цього ферменту як ікстрацелюлярного антиоксиданту для захисту біологічних структур при >адіаційних ураженнях, вплив церулоплазміну на процеси перекисного

окислення. Не з’ясована також можливість розробки на основі церулоплазміну радіо протектора та ефективність його застосування при променевих ураженнях.

Все вищевикладене обумовило наш інтерес до вивчення впливу опромінення на динаміку вмісту церулоплазміну в крові щурів та дослідження механізмів дії екзогенного церулоплазміну на процеси перекисного окислення у плазмі крові, печінці та селезінці тварин в умовах опромінення у широкому діапазоні доз.

Зв’язок роботи з науковими програмами, темами. Дисертаційне дослідження с результатом творчого співробітництва відділу біохімії пухлин Інституту експериментальної патології, онкології та радіобіології ім.Р.Є.Кавецького НАН України та науково-дослідницької лабораторії підприємства “Біофарма” і виконане в рамках Державної комплексної програми розвитку медичної промисловості України на 1997-2003 рік.

Мета дослідження. Дослідити радіозахисні властивості церулоплазміну, отриманого з плазми крові людини.

Завдання дослідження:

1. Отримати біологічно активний церулоплазмін з відходів виробництва препаратів крові людини та охарактеризувати його основні фізико-хімічні та біологічні властивості з метою з’ясування можливості застосування препарату, як радіозахисного засобу.

2. Вивчити роль екзогенного церулоплазміну в процесах виживання щурів після опромінення летальними дозами, а також його вплив на радіорезистентність клітин у дослідах in vitro.

3. З’ясувати вплив церулоплазміну на показники периферичної крові щурів у ранні строки після гострого опромінення.

4. Вивчити вплив різних доз опромінення (1 Гр, 3 Гр, 5 Гр) на вміст церулоплазміну у сироватці крові щурів на протязі 7 діб після опромінення.

5. Оцінити вплив церулоплазміну на процеси ПОЛ, зокрема вміст малонового діапьдегіду у крові , селезінці та печінці щурів у пострадіаційній динаміці.

з

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в експерименті встановлено вплив гострого опромінення у широкому діапазоні доз на зміну вмісту церулоплазміну у крові щурів у ранній постпроменевий період.

Встановлено, що зміни рівня церулоплазміну пов’язані зі змінами процесів ПОЛ, зокрема малонового діальдегіду (МДА), у сироватці крові, селезінці та печінці тварин. Показано, що одноразове опромінення у різних дозах викликає зміни вмісту МДА у різних органах, ефект мас дозозалежний характер.

Введення препарату “Церулоплазмін” перед опроміненням нормалізує рівень церулоплазміну в крові тварин при нелетальних і прискорює процес відновлення його рівня до контрольних значень при летальних дозах. Вперше показано, що при різних дозах одноразового опромінення екзогенний церулоплазмін регулює баланс церулоплазмін-МДА у сироватці крові, позитивно впливає на показники периферичної крові, знижує вміст МДА у селезінці та печінці тварин та підвищує виживання тварин. Це вказує на важливу роль зовнішньоклітинного антиоксиданту церулоплазміну у підтримці прооксидантно-антиоксидантного гомеостазу у екстрацелюлярних рідинах і позитивно впливає на клітини та організм вцілому в умовах опромінення.

Практичне значення отриманих результатів. Результати досліджень є науковим обгрунтуванням цілеспрямованного використання препарату “Церулоплазмін” як радіозахисного засобу при променевих ураженнях. “Церулоплазмін” можна рекомендувати для подальшого вивчення і розробки схем введення.

Особистий внесок здобувана. Автором особисто проведено аналіз вітчизняної та зарубіжної літератури по темі дисертаційної роботи. Планування етапів дослідження проведено разом з науковим керівником професором, д.м.н Бердинських І І.К. Експериментальні дослідження, аналіз первинного матеріалу, статистична обробка отриманих даних, їх узагальнення, висновки, зроблені самостійно. Спосіб отримання медичного препарату “Церулоплазмін” був розроблений автором сумісно із співробітниками відділу біохімії пухлин Інституту експериментальної патології, онкології та радіобіології

ім.Р.Є.Кавецького НАН України та підприємства “Біофарма”, на що бул отримано патент України (1994 р.).

Апробація результатів дисертаційної роботи. Результати робот доповідалися на ІУ-й міжнародній конференції “Біосснсори і біологічні метод; аналізу зовнішнього середовища” (Мінорка, Іспанія, 1999); IV Українськії науково-практичній конференції з актуальних питань алергології, клінічної т лабораторної імунології (Київ, 1999); на науковій конференції професорсько викладацького складу Київського національного університету імені Тарас Шевченка (Київ, 1997); розширеному засіданні відділу біохімії пухлин, біофізик канцерогенезу та радіобіології Інституту експериментальної патології, онколог: та радіобіології ім.Р.Є.Кавецького НАН України (1999).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 7 робіт. З них 4 в наукови журналах, 3 в тезах доповідей. Також отримано 2 авторських свідоцтва та патент України (1994).

Структура та об’єм роботи. Дисертація складається з вступу, огляд літератури, матеріалів та методів дослідження, 4-х розділів власних досліджені заключення, висновків, списку літератури, що містить 212 джерел. Робот викладена на 127 сторінках друкованого тексту, містить 12 таблиць та 2 рисунків.

ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. У роботі використано 490 біли: нелінійних самців щурів з вихідною вагою 180-200 г. Тварин утримували н, стандартному раціоні у віварії інституту експериментальної патології, онкологі та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького.

Опромінення щурів (30 у кожній групі) проводили на рентгенівськом; апараті РУМ-17 за умов: напруга 180 кв, фокусна відстань 40 см, сила струму II мА, фільтри - 0,5 мм Си+1мм АІ, потужність дози 0,48 Гр/хв. Сумарні поминен дози 1 Гр, 3 Гр, 5 Гр, 7 Гр.

Опромінення культури клітин (трансформовані фібробласти лінії Ь проводили на у-установці ІГУР (ш Се) 10 хвилин у дозі 5 Гр. За 5, ЗО хв д<

опромінення і через 5, ЗО хв та 1 год після опромінення у флакони з культурами вводили “Церулоплазмін” у кількості 0,05 та 0,5 мг/мл живильного середовища. Через 3 доби препарати фарбували 0,2 % розчином трипанового синього і досліджували життєздатність клітин під мікроскопом,

В експериментах використовували виділений нами церулоплазмін. Препарат був стерильним, апірогенним, з ферментативною активністю 12-15 у.о./мг білка, з коефіцієнтом очищення Е^к/Езко - 0,037-0,042, що відповідає 8590% ступеню чистоти препарату. Виділення церулогілазміну проводили з відходів виробництва імуноглобулінів донорських і плацентарних осадів фракцій III та фракції 1V-I, які зберігали в замороженому стані у низькотемпературних камерах. Концентрацію білка в одержаних препаратах "Церулоплазмін" визначали спектрофотометрично за специфічним поглинанням при 280 нм, використовували коефіцієнт поглинання кристалічного церулоплазміну (Solomon Е.1. et al., 1997). Ступінь чистоти церулоплазміну (коефіцієнт очищення препарату) визначали спектрофотометричним методом за відношенням оптичних густин Е(,иУЕ2йг> (Саенко Е.Л. и др., 1986). Прозорість, pH, забарвленість, стерильність, токсичність, пірогенність препарату "Церулоплазмін" проводили за загально прийнятими методами (Государственная Фармакопея, 1990). Ферментативну активність препарату “Церулоплазмін” визначали за методами (Ravin Н.А.,1969) та (Тен

Э.В.,1981).

Електрофорез зразків церулоплазміну проводили в градієнтному поліакриламідному гелі при pH 8,3 в Трис-НСІ гліциновому буфері, а також у присутності DS-Na в градієнті иоліакриламідного гелю (Pharmacia Fine Chemicals, 1980). Аналіз гелей для виявлення фрагментів церулоплазміну, що мають оксндазну активність по відношенню до ортодіанізидину, проводили за Aarsen P.N. (1964).

ЕПР-досліджеиня церулоплазміну виконані у відділі біофізики канцерогенезу Інституту експериментальної патології, онкології та радіобіології ім.Р.Є.Кавецького НАНУ у режимі низькотемпературної стабілізації (Кавецкий Р.Е. и др., 1976).

Визначення вмісту церулоплазміну в сироватці крові базується на оксидазних властивостях церулоплазміну (Amaud Р.Н., 1988). Реакцію окислення парафенілендіаміну використовували для кількісного визначення вмісту церулоплазміну у сироватці крові опромінених тварин за методами (Ravin

Н.А.,1969; Тен Э.В.,1981).

При вивченні впливу церулоплазміну на ЗО добову летальність щурів його вводили внутрішньоочеревинно в дозах 10 мг/кг та 20 мг/кг за 1 годину до або через 1 годину після опромінення. Для порівняння впливу гетерологічного для щурів церулоплазміну, виділеного з крові людей, та гомологічного дослідним тваринам вводили препарат церулоплазміну щурів (Санкт-Петербург). При вивченні впливу препарату "Церулоплазмін" на периферичну кров щурів його вводили в дозі 10 мг/кг ваги за 1 годину до їх опроміненя. Показники гемо грам вивчали загальноприйнятими методами (Неменова Ю.В, 1976).

Оцінку стану процесів ПОЛ проводили визначенням одного з його кінцевих продуктів - МДА у сироватці крові, гомогенатах тканин селезінки та печінки (Стальная И.Д., 1977). Білок визначали за методом (Greenberg Ch.S.,1982).

Результати експериментів обробляли статистично за критерієм Ст’юдента (Лакин Г.Ф., 1990) та за точним методом Фішера (Гублер Е.В., 1978). Інтегральний показник захисту розраховували за методами числового аналізу (Бойко В.Н.,1997).

ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ З метою дослідження радіозахисних властивостей церулоплазміну препарат “Церулоплазмін” одержували з відходів виробництва препаратів крові людини за розробленим нами способом. Спосіб включає гомогенізацію відхідних осадів в розчині хлористого натру, сорбцію на ДЄАС-целюлозі, елюцію, осадження етанолом, центрифугування при низькій температурі, очистку органічними розчинниками, стерилізуючу фільтрацію, ліофільне висушування.

Електрофоретичний аналіз у 7,5% поліакриламідному гелі у лужній системі вказує на однорідність зразків препарату. Смуга препарату мас ферментативну оксидазну активність. Оксидазна активність зразків 12-15 у.о./мг білка. Препарати церулоплазміну при спектрофотометричному аналізі мають

<арактерні максимуми поглинання при 610 нм; коефіцієнт очистки препарату, відношення показників ЕМО/Е280, становить 0,037-0,042; молекулярна маса злнзько 132 Кда. Положення та рівень сигналу на спектрі ЕПР, іцо характеризує :тан двохвалентної міді та її оточення, говорить про збереження активного центру церулоплазміну. Встановлено, що "Церулоплазмін" повністю відповідає вимогам до медичних препаратів, на що отримано авторські свідоцтва та патент. Стерильній, ятрогенний препарат використовували у радіобіологічних експериментах in vivo та in vitro.

На моделі гострого рентгенівського опромінення дослідили вплив препарату "Церулоплазмін" на показники 30 добової летальності щурів. Показано, що введення препарату у дозах 10 мг/кг та 20 мг/кг, як за 1 годину до, так і через 1 годину після опромінення, підвищує резистентність тварин до дії радіації. На це вказує кількість тварин у групах, що пережили термін 30 доби (Рис.1).

Опромінення 5 Гр

100

ео-

о4 SC-

S 70-

1 60-

р 50.

J)

h о І0-

‘2 ЗО-

Й 20-

£ 10-

0-

а

s

33

З

’З

8,

Р,

Ъ а £ З •§ Я £.'§ Ю о

II

чч £5 2 а ІІ § 1 &§•

Опромінення 7 Гр

Рис.1 Вплив церулонлазміну на ЗО добову летальність опромінених щурів.

Примітка: іа точним метолом Фішера суттевість різниці кількості шарик, шо вижили у дослідних групах, у порівнянні і контролем становить: р—0,00015 у випадку 5 І р. р~0,026 у випадку 7 Гр.

Слід зазначити, що в експериментах не спостерігалось суттєвої різниці впливу гомологічного (виділеного з крові щурів - ЦП щурів) та гетерологічного (виділеного з крові людей - ЦП людини) на виживання опромінених щурів.

Враховуючи суттєві позитивні результати щодо виживання тварин дослідних груп та тенденції до зниження швидкості загибелі цих тварин у порівнянні з контрольними, нами був розрахований інтегральний показник захисту (ІГІЗ), який враховує результати ЗО добової летальності (%) та швидкість загибелі тварин у дослідних групах (Рис.2).

Інтегральний показник захисту

(2досл«"^іюіпропь) ^ ю са

§ я

Оі

§

Опромінення* ЦП ЛЮДИНИ

ЦП людини* Опромінення

Аль6умін+

Опромінення

\

ЦП людини+ Опромінення

ЦП щурів+ Опромінення

Опромінення +ЦП людини

Опромінення +ЦП щурів

ххх

ч.

Опромінення б Гр

і

і ! .

а?

$

І г

Опромінення 7 Гр

Рис.2 Вплив церулоплазміну на інтегральний показник захисту опромінених тварин.

Біологічний зміст ІПЗ полягає у різниці (або в співвідношенні) резистентності тварин контрольних та дослідних груп до опромінення (Бойко

В.Н.,1997).

Введення церулоплазміну тваринам, що були опромінені летальними дозами, підвищувало виживання тварин. Встановлено, що ефект був більш вираженим зі зменшенням дози. При опроміненні у дозі 7 Гр (ЛД|Іюзо) вижило біля 20 % тварин, у дозі 5 Гр - 100 % (при 40 % загибелі в контролі).

Моделлю подальшого вивчення радіозахисного ефекту церулоплазміну були тварини, яких опромінювали у дозах 5, 3 та 1 Гр.

Первинна реакція на опромінення характеризується змінами в системі

крові (рис.З). Зниження рівня лейкоцитів, яке спостерігалось на 1, 5, 7 добу було

менш значним у тварин, яким вводили церулоплазмін. У цей період у

опромінених тварин не спостерігалась виражена анемія, підтримувався вміст гемоглобіну в межах норми (р<0,05). Суттєве підвищення кількості ретикулоиитів може свідчити про відновлення червоного ростка кровотворення (Волощенко Ю.В. та ін„ 199В).

Гемоглобін, г/л ЕЕоитооцити, Юіг/л

і ОУ 1 40 1 20 1 00

З 8

і

іЬ

BUU

600

400

200

о

5 доба

Тромбоцити,109/л

J

І_ІйЙ

7

5.0 2.5

2.0 1.3 1.0 0.5

Ретикулоцити, °/а

'У/ґ/ул.

з

ВІЙН

1 а 14 12 1 О 8 є 4 2

добо

Лейкоцити, 103/л

5

доби

ЕЗ

cap

___ доба

ГП опромінення ггт-і інтактні І І ЦП+опромінення тварини

Рис.З Показники периферичної крові щурів під впливом церулоплазміну та опромінення (5 Гр).

Отже, “Церулоплазмін”, введений щурам за І годину до опромінень дозою 5Гр, сприяє 100% виживанню дослідних тварин та позитивно впливає і-показники периферичної крові.

Для з’ясування впливу церулоплазміну на клітини дослідили ефеь препарату "Церулоплазмін" на чутливість трансформованих фібробластів / у-опромінення дозою 5 Гр у дослідах in vitro (табл.1).

Профілактична ефективність иерулоплазміну нри у-опроміїїсіїні L-клітии.

Умови досліду Час введення ЦП до опромінення, хв. Кількість ЦП мг/імл середовища Кількість живих клітин, % від 50.000 клітин Примітка

5ГР п=5 - 0,6±0.3 Збереглися поодинокі клітини

ЦП+5Гр п=5 ЗО 0,05 30,0+8* Моношар почав формуватись

ЦП+5Гр п=5 ЗО 0,5 80,0+24* Моношар сформований

ЦП+5Гр п=5 5 0,5 55,0+15* Моношар формується

Примітка: * - р<0.05

Виявилось, ідо препарат "Церулоплазмін", введений у культуру клітин до опромінення, проявляє високу радіозахисну дію. Найкращий ефект спостерігали при введенні церулоплазміну в концентрації 0,5 мг/мл в середовище культивування за ЗО хв до опромінення. При цьому 80 % клітин вижило, а моношар клітин був сформований через 3 доби після опромінення. Захисну дію церулоплазмін проявляв in vitro і при введенні у середовище культивування після опромінення. Найкращий ефект спостерігали при введенні 0,5 мг/мл препарату через 5 хв після опромінення.

Таким чином, у дослідах in vitro при у-опроміненні L-клітин встановлено захисну дію церулоплазміну на клітини при введенні його, як до, так і після опромінення. Ефективність залежала від дози препарату та часу його введення.

Відомо, що церулоплазмін—-білок “гострої фази” і його вміст змінюється при патологічних станах, тобто церулоплазмін реагує на окисний стрес різної природи (Асельдерова А.Ш., 1992). Питанню впливу радіації на цей фермент присвячені поодинокі роботи, що мають суперечливі висновки (Савицкий И.В. и др.,1980; Aladzhov Е., 1990;). Вивчення впливу одноразового опромінення дозами

1, 3 та 5 Гр показало зниження вмісту церулоплазміну у крові щурів у перші години (з мінімальними значеннями на 6 годину) після дії радіації. Швидкість відновлення вмісту церулоплазміну залежала від дози опромінення (рис.4).

Час після опромінення, години Рнс.4 Вміст церулоплазміну у крові щурів в пострадіаційній динаміці.

Введення препарату "Церулоплазмін" 10 мг/кг ваги за 1 годину до

опромінення нормалізувало рівень церулоплазміну у крові тварин (рис.5).

Час після опромінення, години

——опромінення-----------------цп+опромінення інтактні тварини

Рис.5 Влив препарату “Церулоплазмін” на вміст церулоплазміну у крові

опроміненії* щурів.

Зниження вмісту церулоплазміну приводить до інтенсифікації процесів перекисного окислення, зокрема до підвищення вмісту МДА у крові опромінених щурів (рис.6).

Рис.6 Вміст малеїнового діальдегіду і церулоплазміну у крові щурів у пострадіаційній динаміці.

Церулоплазмін: 1 - опромінення 1 Гр: 2 - опромінення 3 Гр.

МДА: 3 - опромінення 1 Гр; 4 - опромінення 3 Гр.

Введення 10 мг/кг препарату "Церулоплазмін" за годину до опромінення

нормалізує вміст церулоплазміну і знижує рівень МДА у крові цих тварин. Аналіз

динаміки вмісту церулоплазміну та МДА у крові, опромінених дозою 1 Гр щурів,

свідчить про наявність оберненої залежності цих показників (рис.7).

5

>г

с

с

о

&

ф

=г

б

X

Вміст МДЛ,її моль.мг білк.і

Рис.7 Динаміка вмісту малонового діальдегіду в залежності від змін рівня церулоплазміну після опромінення у дозі 1 Гр.

Примітка: біля кожної точки залежності проставлено час спостереження (години)

Гак, наприклад, якщо вміст церулоплазміну на 6 годину після опромінення знижувався, то рівень МДА зростав, і, навпаки, з 6 до 24 години після опромінення вміст церулоплазміну зростав, в той час як вміст МДА зменшувавсь. В протилежність цьому баланс цих показників у сироватці крові тварин, які за 1 годину до опромінення отримували “Церулоплазмін”, суттєво відрізнявся від контрольної залежності. Іншою мовою довжина адаптаційного шляху тварин дослідної групи була суттєво меншою, ніж щурів контрольної групи. Аналогічна, але більш виразна картина, спостерігалась у випадку опромінення дозою 3 Гр. Викладене вказує на важливу антиоксидантну роль церулоплазміну у крові тварин, що, можливо, позитивно впливає на стан інших органів.

Дослідження вмісту МДА у гомогенаті селезінки,' що с найбільш радіочутливим органом, показало, що цей показник у опромінених щурів повторює вцілому динаміку змін вмісту МДА у сироватці крові, але з меншою амплітудою коливання. Максимальних значень вміст МДА у сироватці крові та селезінці досягає на 6 годину після опромінення, коли рівень церулоплазміну у крові найнижчий. При введенні 10 мг/кг за 1 годину до опромінення препарату “Церулоплазмін” спостерігали тенденцію до зниження вмісту МДА у цьому органі, але суттєво (р<0,05) цей показник знижувався лише на 1 добу після опромінення дозою 3 Гр (рис.8).

І 1 Контроль V / / ї\ ДОСЛІД

Рнс.8 Вплив препарату “Церулоплазмін” на рівень шалонового діальдсгіду у селезінці щурів опромінених у дозах 1 Гр та 3 Гр.

У процесах адаптації до впливу радіації велику роль відіграє печінка. Вивчення процесів ПОЛ у печінці опромінених тварин показало, що вони розвивались повільніше ніж у селезінці. Це може бути пов’язане з високою компенсаторною здатністю цього органу та з тим, що саме у гепатоцитах відбувається синтез церулоплазміну. Але вже на 24 годину після опромінення показник МДА у печінці опромінених тварин був вдвічі (1 Гр) та втричі (ЗГр) вищим ніж у інтактних. Введення 10 мг/кг за 1 годину до опромінення препарату "Церулоплазмін" приводило до нормалізації рівню МДА у цьому органі, а саме, на першу добу після опромінення та введення препарату вміст МДА знижувався на 25% (І Гр) та на 34% (ЗГр) та наближався до значень показника інтактних тварин на 5 добу досліду (рис.9).

1 Гр

2.5

1.5

§1 °'5 СІ

II

пН

&

г-іі

інтактні 3 6 1

тварини години годин доба

5

ДІБ

7

діб

І І Контооль ША Дослід

Рис.9 Вплив препарату "Церулоплазмін" на рівень малонового діальдегіду у печінці щурів опромінених у дозах 1 Гр та 3 Гр.

Такий вплив церулоплазміну на показник кінцевого продукту перекисного окислення МДА - найбільш надійного критерію для визначення процесів ПОЛ (Барабой В.А., 1997) у досліджених системах при променевій дії, може бути пов’язаний і властивостями церулоплазміну перехоплювати вільні радикали завдяки наявності в його структурі тіолових груп, яких у молекулі

церулоплазміну чотири (Atanasi R.L.,1998). Більш того, речовини, що містять ці групи-- відомі радіопротектори (Кудряшов Ю.Б. и др.,1999). Проте основна антиоксидантна роль церулоплазміну, як вважають більшість дослідників, полягає в його фероксидазній властивості окислювати Fe2* в Feb, в результаті чого блокуються процеси ПОЛ, що стимулюються іонами Fe2\ крім цього в результаті такої реакції не утворюються активні радикали ОН, а іони Fe3+ зв’язуюються з молекулою апотрансферину, а далі трансферин транспортує залізо у кістковий мозок де відбувається синтез гему. Таким чином церулоплазмін включається в коло процесів кровотворення (Санина О.Л., Бердинских Н.К., 1986).

Захисний ефект церулоплазміну на кров, а саме, підвищення кількості ретикулоцитів — відновлення червоного ростка кровотворення та інгібування процесів ПОЛ у крові та інших досліджених нами органів,відбувається завдяки широкому спектру антиоксидантних властивостей церулоплазміну (Atanasi R.L. et аі.,1998; Корж С.Н., Бердинских Н.К. и др.,1999).

Отже, "Церулоплазмін", виділений з відходів виробництва препаратів крові людини, проявляє радіозахисний ефект як у дослідах in vivo, так і у дослідах in vitro, що дозволяє рекомендувати його як ефективний засіб захисту при опроміненні.

ВИСНОВКИ

1. Запропоновано спосіб отримання біогенного, біологічно активного препарату "Церулоплазмін" з відходів виробництва препаратів крові людини, вивчено фізико-хімічні властивості, встановлено радіозахисну дію препарату в експериментах in vivo та in vitro в широкому діапазоні доз.

2. Препарат “Церулоплазмін” при введенні його до, або у ранній час після опромінення підвищує резистентність тварин та клітин in vitro до радіації.

3. Церулоплазмін нормалізує показники периферичної крові тварин у ранні строки після опромінення: гальмує зниження кількості лейкоцитів, підтримує вміст гемоглобіну та підвищує кількість ретикулоцитів, що свідчить про відновлення червоного ростка кровотворення.

4. Одноразове тотальне опромінення щурівудозах !Гр, ЗГр, 5Гр приводить до зниження вмісту церулоплазміну у ранній постпроменевий період. Ступінь змін і

час відновлення рівня ендогенного церулоплазміну залежить від дози опромінення.

5. Аналіз динаміки вмісту церулоплазміну та МДА при різних дозах опромінення свідчить про їх кореляційний зв’язок та вказує на антиоксиданти) роль церулоплазміну у підтримці прооксидантно-ангиоксидантного гомеостазу > крові, селезінці та печінці тварин у ранні строки після опромінення.

6. Введення препарату “Церулоплазмін” 10 мг/кг за 1 годину до опроміненню у дозах ІГр, ЗГр та 5Гр нормалізує вміст ендогенного церулоплазміну та регулює співвідношення церулоплазмін-МДА у сироватці крові щурів.

7. Радіозахисні властивості та відсутність побічних ефектів дозволяюті рекомендувати препарат "Церулоплазмін" як ефективний засіб захисту прі опроміненні.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ

1.Волощенко Ю.В., Берлинских Н.К., Кокшарева Н.В., Шушуріна Н.О., Кор»

С.М., Лялюшко Н.М., Рядська Л.С. Фізико-хімічні властивості та радіозахиснщ ефект нової лікарської форми церулоплазміну .//Український Фармацевтичній' ж-л,- 1998.-N6. - С.66-70. .

2. Корж С.Н., Берлинских Н.К., Волощенко Ю.В. Изменение чувствительности L клеток к действию гамма-радиации под влиянием церулоплазмина.//Доповід НАН України. - 1999.- N4. - С. 174-177.

3. .Корж С.М., Долишняк 0.1., Нальовіна О.Є. Вплив рентгенівськоп опромінення на фосфорилювання білкових субстратів цитозолю лімфоцити селезінки циклонуклеотид та кальцій залежними протеінкіназами.//Вісник КУ Сер. Біол. - 1999. - Вип.ЗО,- С.7-10.

4. Кнышов Г.В., Баланник З.Т., Корж С.Н., Воробьева A.M., Руденко А.В Применение церулоплазмина для лечения хирургических больны? инфекционным эндокардитом.//Журн. АМН України. - 1999.- Т.5.- №4.- С.764 771.

5. Пат. 1319 Украина, МКИ5. А 61К 37/47, А 61К35/16. Способ получени: церулоплазмина. Берлинских Н.К., Басова Р.В., Волощенко Ю.В., Гавриш И.II. Дробаха С.Н. и соавт./№4661776; Заявл. 15.07.93; Опубл.25.03.94. Бюл.№1.

6. А. с. №1438041 СССР, МКИ А 61 К 35/16. Способ получения церулоплазмина/ Скоробогатько О.В., Павлов А.Р., Басевич В.В., Ярополов А.И., Волошенко Ю.В., Дробаха С.Н. и соавт. (СССР) №4168413; Заявлено 31.10.86; Опубл. 15.07.88, Бюл. №6. 2 с.

7. А.с. №1607137 СССР, МКИ А 61 К 35/16. Способ получения церулоплазмина /Дробаха С.Н. и соавт. (СССР) №4661776; Заявлено 8.02.89; Опубл. 15.07.90, Бюл. №7. 4 с.

8. Корж С.Н., Берлинских Н.К., Стасенко А.А. Церулоплазмин и его влияние на неспецифические факторы защиты у больных с патологией печени.// Імунологія та алергологія. - IV науково-практична конференція з актуальних питань алергології та клінічної імунології. - 1999. — №3.- С. 58.

9. S.N.Korsh, N.K.Berdinskikh, U.V. Voloschenko, O.V.Koroleva-Skorobogat’ko Ceruloplasmin-Level Alteration in Blood as a Marker of Radiation Injury.//Forth Workshop on Biosensors and Biological Techniques in Enviromental Analysis, Menorca, Spain. - December 1-3,- 1999. - P.33.

10. Берлинских H.K., Волощенко Ю.В., Савцова З.Д., Рядская Л.С., Корж С.Н., Гоголь С.В. Иммуномодулирующее и антиоксидантное действие нового лекарственного препарата церулоплазмин.// Імунологія та алергологія.- IV пауково-практична конференція з актуальних питань алергології та клінічної імунології. - 1999. - №3. - С.57.

АНОТАЦІЯ

Корж С.Н. Дослідження радіозахисних властивостей церулоплазміну. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за. спеціальністю 03.00.01 - радіобіологія. Київський національний Університет імені Тараса Шевченка.

Дослідження присвячені отриманню біологічно активного церулоплазміну і вивченню його радіозахисних властивостей. В експериментах вивчався вплив препарату "Церулоплазмін" на виживання опромінених тварин, радіочутливість L-клітин та механізми дії церулоплазміну на систему перекисного окислення ліпідів після тотального рентгенівського опромінення у широкому діапазоні доз. Встановлено зміну вмісту церулоплазміну у крові щурів після опромінення

дозами 1, 3, 5 Гр. Природа змін і час відновлення залежать від дози опромінення. Введення препарату “Церулоплазмін” у дозі 10 мг/кг за одну годину до опромінення підвищувало рівень церулоплазміну у крові опромінених щурів та знижувало вміст МДА у крові, селезінці та печінці цих тварин. В експериментах in vivo та in vitro показано радіозахисний ефект "Церулоплазміну" на досліджувані процеси, що обумовлений антиоксидантними властивостями церулоплазміну.

Ключові слова: церулоплазмін, опромінення, радіозахисні препарати, антиоксидант.

АННОТАЦИЯ

Корж С.Н. Исследование радиозащитных свойств церулоплазмина.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.01-радиобиология. Киевский национальный университет имени Тараса Шевченка.

Исследование посвящено получению биологически активного церулоплазмина и изучению его радиозащитных свойств.

В экспериментах изучалось влияние препарата "Церулоплазмин" на выживаемость облученных животных, радиочувствительность L-клеток и механизм действия церулоплазмина на систему перекисного окисления липидов после тотального рентгеновского облучения в широком диапазоне доз. Выделенный из отходов производства препаратов крови человека “Церулоплазмин” в дозах 10 мг/кг и 20 мг/кг вводили крысам за 1 час до или через 1 час после тотального облучения дозами 5 Гр, 7 Гр. Также исследовано влияние гомологичного - крысиного церулоплазмина, который вводили крысам в аналогичных условиях. В опытах in vivo церулоплазмин снижал летальность крыс после облучения на 20% при дозе 7 Гр, на 100% при дозе 5 Гр и положительно влиял на показатели периферической крови животных в ранние сроки после облучения.

Установлен радиозащитный эффект препарата ’’Церулоплазмин” при введении его как до, так и после облучения L-клеток в опытах in vitro. Эффект препарата зависит от дозы и времени его введения.

Исследована динамика уровня церулоплазмина в крови животных после эблучения дозами IГр, ЗГр, 5Гр в течении 7 дней. Однократное облучение фиводит к снижению уровня церулоплазмина в крови крыс в первые часы 1ействия радиации и скорость его восстановления зависит от дозы облучения. Зведение препарата “Церулоплазмин” за 1 час до облучения поддерживает /ровень церулоплазмина в крови животных, облученных дозами 1 Гр и ЗГр, в тределах нормы на протяжении эксперимента. При облучении животных дозой 5Гр и введении препарата “Церулоплазмин” уровень церулоплазмина в кропи нормализуется уже через 24 часа, тогда как у крыс контрольной группы лишь к 5 :уткам после облучения. Тотальное облучение приводит к усилению перекисного экисления, в частности к повышению уровня МДА в крови, селезенке и печени подопытных животных. Введение 10 мг/кг препарата “Церулоплазмин” за час до эблучения снижает уровень МДА и повышает содержание церулоплазмина в крови крыс, приводит к снижению уровня МДА в селезенке и печени этих животных, что указывает на высокую антиоксидантную роль церулоплазмина. В экспериментах in vivo и in vitro показан радиозащитный эффект препарата "Церулоплазмина" на изучаемые процессы, что обусловлено антиоксидантными свойствами церулоплазмина.

Ключевые слова: церулоплазмин, облучение, радиозащитные препараты, антиоксидант.

ANNOTATION

Korzh S.N. Investigation of radioprotective efficacy of ceruloplasmin.

The thesis for competition of scientific degree of candidate of biological sciences on a speciality 03.00.01-radiobiology - Taras Shevchenko Kyiv National University.

The obtaining of ceruloplasmin and radioprotective efficacy of ceruloplasmin were the purpose of this investigation. “Ceruloplasmin” drug influence on irradiated animals survival, L-cells radiosensityvity and mechanisms of ceruloplasmin action on the system of lipoperoxidation of lipids after total x-rays irradiation in the wide range of doses were studied.

The blood ceruloplasmin level was changing after exposure lo x-rays at 1,3,5 Gy. It is important to note that the nature of changes in the ceruloplasmin level in the blood is the same, but degree of alteration is dose-dependent. So, the degree and time of restoration depend on the dose of irradiation. Ceruloplasmin drug at 10 mg/kg 1 hour before exposure to x-rays was injected to rats. This increased the level of ceruloplasmin in the blood and decreased the level of MDA in the blood, spleen and liver of the exposed animals.

Radioprotective effects of ceruloplasmin were shown in experiments in vivo and in vitro. The mechanisms of radioprotective actions of ccruloplasmin are based on its antioxidant capacities.

Key words: ceruloplasmin, irradiation, radioprotective drugs, antioxidant.