Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование пространственной структуры трансмембранного домена проапоптозного белка BNIP3 методом спектроскопии ЯМР

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование пространственной структуры трансмембранного домена проапоптозного белка BNIP3 методом спектроскопии ЯМР"

на правах рукописи УДК 577.322.5

Пугговалова Юлия Евгеньевна

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ ТРАНСМЕМБРАННОГО ДОМЕНА ПРОАПОПТОЗНОГО БЕЛКА ВМРЗ МЕТОДОМ СПЕКТРОСКОПИИ ЯМР

03.00.02 -Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 2006

Диссертация выполнена в Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, на кафедре физико-химической биологии и биотехнологии МФТИ (ГУ).

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Арссиьсв Александр Сергеевич

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор

Заседателе в Александр Сергеевич

доктор химических наук, профессор

Сергеев Николай Михайлович

Ведущая организации:

Институт теоретической н экспериментальной биофизики РАН (г. Пущине МО)

Зашита состоится " 20 ™ декабря 2006 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета K212.lj6.03 при Московском физико-техническом институте (ГУ) по адресу: 141700, Московская область, г. Долгопрудный, Институтский переулок, 9., тел.: (495) 40857-00,408-56-27.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского физико-технического института (ГУ).

Автореферат разослан

ноября 2006 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета К 212.156.03 к.ф.-м.н., доцент

Братин В.Е

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Уникальные свойства мембранных белков во многом определяют пространственная структура и функциональная подвижность их трансмембранных доменов. Одним из часто встречающихся в мембранных доменах белков структурным элементом является а-спираль. Существует множество функциональных классов мембранных белков (ионные каналы, рецепторы и т.д.), для которых предполагается структурная организация в вше «пучков», состоящих из а-спнральных сегментов, а функционирование непосредственно обеспечивается взаимодействиями между ними. Более того, для многих мембранных белков необходимым условием функционирования является их днмеризация (или олигомеризация). В связи с этим большой интерес представляет понимание механизмов межмолекулярных взаимодействий в гетерогенной среде, которой является липидный бислой биологической мембраны. В данной работе исследована довольно простая, но вместе с тем широко распространенная в природе, модель — гомодимер трансмембранных а-спиралей.

Помимо этого, интерес представляет и сам объект исследования - белок ВЫ1РЗ. Этот белок относится к группе "ВНЗ-оп1у" семейства белков-медиаторов апоптоза ВСЬ-2. Как и все представители "ВНЗ-оп1у" ВШРЗ вызывает митохондрия-опосредованный апоптоз с высокой избирательностью к сигналу смерти. ВЫ1РЗ экепрессируется и накапливается в клетках при гипоксии, а активируется при понижении внутриклеточного рИ во время ацидоза, вызванного переходом клетки на гликолиз вследствие нехватки кислорода. Наиболее изученный случай подобного действия ВЫ1РЗ наблюдается при инфаркте миокарда в тканях сердца. Кроме того, интересен механизм действия ЕШ1РЗ на молекулярном уровне, так как он достаточно специфичен. Несмотря на принадлежность к семейству ВСЬ-2, этот белок вызывает каспазо-независимый аноигоз, иногда с признаками некроза. Также показано (Е,5. БиЛзгуо е/ а/.), что трансмембранный домен ВЫ1РЗ необходим для проапоптозной активности белка.

Цель и задачи исследования

Целью данной диссертационной работы является определение структурно-динамических свойств трансмембранного домена (ТМ) проапоптозного белка ВЫ1РЗ, а также изучение их связи с биологической функцией ВМРЗ.

Методы исследования

В работе использовался комплексный подход, сочетающий в себе экспериментальный метод (спектроскопия ЯМР высокого разрешения) и теоретический — метод молекулярной динамики. Это позволило обойти ряд существенных ограничений, накладываемых гидрофобной природой объекта на экспфиментальные методы.

В качестве объекта исследования был выбран фрагмент (остатки 146-190) человеческого белка ВЫ1РЗ, включающий в себя трансмембранный домен (остатки 164184).

Научная новизна н практическая значимость работы

На сегодняшний день опубликована только одна пространственная структура высокого разрешения димера трансмембранных а-спиралей (трансмембранный домен белка гликофорин А, 1998). В представленной работе методом гетеро ядерной спектроскопии ЯМР исследован трансмембранный домен белка ВЫ1РЗ в комплексе с бицеллой ДМФХ/ДГФХ. Показано, что ВЫ1РЗ ТМ представляет собой параллельный симметричный днмер Прямыми методами исследован димеризационный интерфейс.

Разработана методика МД-релаксацнн полученных методом спектроскопии ЯМР пространственных структур трансмембранных сегментов. Она позволяет обойти ряд

экспериментальных ограничений, накладываемы к мембранной природой объекта исследования. Методом МД рассчитывается молскулярно-динамичсская траектория для полученной экспериментально ЯМР-структуры трансмембранного домена, которая помешается в явно заданный липидный бислой (ДМФХ), при этом на протяжении всего расчета на протоны белка накладываются экспериментальные пространственные ограничения. Такой комплексный подход позволяет достоверно описать пространственную структуру и структурно-динамические характеристики трансмембранных белков в липидном окружении.

Апробации работы

Основные результаты диссертационной работы были представлены на международных конференциях посвященных спектроскопии ЯМР (Санкт Петербург, 2006 н GOttingen, Германия, 2006); VII] международном семинаре по магнитному резонансу (Ростов-на-Дону, 2006); VIII чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2006); научных семинарах лаборатории структурной биологии ИБХ РАН (Москва, 2003 - 2006).

Публикации

Основные результаты диссертации изложены в 5 тезисах докладов, представленных на российских и международных научных конференциях.

Обмм и структура па боты

Диссертация состоит из введения, трех глав, включая литературный обзор, заключения и выводов. Общий объем работы составляет 91 страницу текста, включая 19 рисунков, 8 таблиц и список литературы, содержащий 107 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введшие

Во введении обоснована необходимость и актуальность определения пространственной структуры трансмембранного домена (ТМ) BNIP3. Кратко изложены имеющиеся на сегодняшний день сведения о функции белка.

Глав» 1,Обюплпттпятуры

В первой главе (литературном обзоре) изложены основные сведения об объекте исследования и других белках семейства BCL-2. Освещены проблемы изучения мембранных белков методом спектроскопии ЯМР, проведено сравнение наиболее распространенных сред, моделирующих мембранное окружение.

Глава 2, Материалы н методы

Во второй главе приведены сведения об использованном в работе оборудовании, веществах, методах получения и обработки ЯМР-спектров, а также условиях, при которых проводились теоретические расчеты методом молекулярной динамики.

Объект исследования — фрагмент BN1P3, включающий в себя трансмембранный домен, как немеченый, так и |5Ы-, "Ы-^С-меченый, был получен и любезно предоставлен сотрудниками лаборатории инженерии белка института биоорганической химик им. М.М. Шемякина н Ю.А. Овчинникова РАН (Я.С. Ермолюком, М.В. Гончарук, Е.Н. Ткач). Также был получен BNIP3 ТМ селективно "N-меченный по азотам амидных групп лейцинов.

Все ЯМР-эксперименты проводились на спектрометре Varían Unity 600 с рабочей частотой на протонах 600 МГц. В качестве среды, моделирующей мембранное окружение, использовали билипидные мицеллы (бицеллы), состоящие из

димирнстоилфосфатидилхолина (ДМФХ) и ди гексаноилфоефатщшл холнна (ДГФХ) (Я-1ДМФХИДГФХ1-=0^5; Cl-5%; [BNIP3 ТМ]/[ДМФХ+ДГФХ]=1/40) в 20мМ ацетатном буфере при рН 5,0 и 40°С.

Отнесение сигналов проводилось на основании гетероядерных спектров 15N-HSQC, I5N-NOESY-HSQC, HNCA, HCCH-TOCSY, "C-HSQC; для расчета структуры использовались ™N- и "C-NOESY-HSQC спектры.

Для изучения динамических характеристик BNIP3 ТМ были измерены параметры иЫ-релаксацни изЯМР-экспериментов T,-líN-HSQC, T2-'5N-HSQC и NOE-líN-HSQC.

Межмономерн ые контакты были получены из ЯМР-спектров гетеродимера (эквимолярная смесь немеченого н |5Ы-'3С-меченого образца) 2D "N/13C-F1 -fílt./F3-sepaj> NOESY-HSQC и 3D 13C-Fl-filt./F3-separ.-NOESY-HSQC.

Доступность трансмембранного домена растворителю и взаимодействие с молекулами воды исследовались с помощью экспериментов по измерению скорости обмена амидного протона на дейтерий растворителя (ряд спектров ISN-HSQC) и двумерным протонным спектрам ROESY и NOESY.

Константы спин-спинового взаимодействия гомоядерная 3Jhhci¡h и гетероядерная 3Jt/cpn оценивались по гетероядерным |5Ь1-спектрам HNHA и HNHB. Если подобным образом константу измерить не удавалось, ограничение на соответствующий двугранный угол рассчитывалось исходя из анализа химических сдвигов N, Со, На и Ср атомов в программе TALOS.

Расчет пространственной структуры трансмембранного домена BNIP3 проводился в программе CYANA 1.01 с использованием ряда стандартных модулей, таких как CALI В A, HABAS, GLOMSA.

Энергетическая минимизация экспериментальных Я М Р-струкгур проводилась в группе молекулярного моделирования лаборатории структурной биологин ИБХ РАН П Е. Волынским в программе GROMACS 3.2.1. Всего было получено 19 молекулярио-динамнчееккх траекторий с разными стартовыми экспериментальными структурами.

Глава 3. Результаты и обсуждение

Гидрофобная природа трансмембранного домена BNIP3 накладывает на возможные методики его исследования ряд ограничений. Необходимость использования липидных бицелл (в нашем случае немеченых) приводит к увеличению размера объекта и, следовательно, к уширению линий. Таким образом, даже для такого небольшого объекта (45 аминокислотных остатков) не представляется возможным использовать методы двумерной 'Н-ЯМР спектроскопии. Использование гетеро ядерных методик и повышение размерности спектра позволяют увеличить разрешение и разделить индивидуальные сигналы протонов в соответствии с химическими сдвигами ковалентно связанных с ними гетеро ядер. При этом одновременно получают важную дополнительную информацию о системе в виде химических сдвигов ядер l5N и |3С. Поскольку гетероядерная спектроскопия ЯМР использует большие КССВ (90-130 Гц) на этапах передачи когерентности, она гораздо менее чувствительна к увеличению ширины линий, обусловленному размером объекта, чем методы, опирающиеся на малые гоыоядерные КССВ.

Отнесение сигналов * спектрах ЯМР ТМ BNIP3

Отнесение сигналов для пептида BN1P3 ТМ в комплексе с лнпидной бицеллой было проведено с использованием спектров HSQC, NOESY и HCCH-TOCSY. Сначала в спектре "N-HSQC были идентифицированы все возможные кросс-пики IJNH/"N (рис. 1), соответствующие сигналам от NH- и NHrrpynn пептида. Затем на основе полученных химических сдвигов ядер азота и ковалентно связанных с ними протонов в спектрах HNCA и riN-NOESY-HSQC были сделаны срезы HN-Ca-N н HN-H-N соответственно. Дм данного объекта не удалось получить приемлемых спектров lsN-TOCSY-HSQC из-за

замедленной подвижности белка в липидном окружении. Поэтому не представляется возможным отнесение сигналов по стандартной методике. В данном случае мы начали работу с последовательного отнесения сигналов амкдных протонов и азотов-15 к определенному положению остатков в первичной структуре. Для начала из анализа спектров '^Ы-ШСЗС, "Ы-ЫОЕЗУ-НЗОС и НЫНА был сделан вывод о возможном разделении всех спиновых систем протонов на остатки соответствующие трансмембранному региону и концевым участкам. Остаткам трансмембранного сегмента соответствуют более широкие (менее интенсивные) сигналы, которые можно легко отличить уже в "Ы-ШОС (рис. 1), Далее были идентифицированы кросс-пики 15ЫН/15Ы пяти остатков глицина, у которых химический сдвиг 15Ы значительно меньше (< 112 м.д.), чем у остальных остатков. Таким образом, однозначно выделили внемебранные остатки глнцинаС1у154 и С1у155, далее в спектре НК1СА нашли цепочку контактов СаО), На рисунке 2 показан участок с последовательным отнесением срезов спектра НМСА. Подобная тактика не только позволила сделать почти полностью последовательное отнесение сигналов, но и определить химические сдвиги сигналов ядер Са, которые имеют характерную зависимость от типа остатка, что помогло в отнесении неоднозначных сигналов. В трансмембранной области сигналы оказались значительно уширены, поэтому сделать описанным выше способом отнесение участка РЬе165-Н15173 не удалось.

"И м.д.

по

120

Рис. 1. Спектр "ы-НЗОС. Красным выделены остатки трансмембранного домена.

Последовательное отнесение сложного участка (остатки 165-175) было продолжено на основании предположения об п-спиральной структуре трансмембранного домена ВЫ1РЗ. На рнсунке 3 показано, что таким образом можно проследить цепочку связей <2цп(М+1) по интенсивным кросс-пикам в ,5Ы-ЫОЕ5У-Н80С спектре. Далее использовалась стандартная методика для отнесения сигналов протонов в ИОЕЗУ спектре на основании соответствия спиновой системы определенному типу аминокислотного остатка. Сразу же удалось отнести сигналы от боковых цепей остатков внемембранной

ШНИ

о о <■

©

(¿■та

с1«0

мм

Оф_"'Ъ #_£

n611,

в,«, ,.т ° О © им „71 шк

пкд

А1'»"

"я© миг * 81»

О *•»

I I I »'тчч 11111111 |'|ч » * * I т ■ * * | I ■ 1 1 Р-Ч»'»"» >111 |"У|'Г

9.0 8.5 8.0 7.5 'Н, М.Д. 7.0

часта пептида с характерными рисунком кросс-пиков и химическими сдвигами. К таким остаткам относятся Thr, Val, Ser, Не, Ala, Phe и Gly.

Отнести сигналы остатков трансмембранного домена, кроме Val 164 и Phe 165, на этом этапе не удалось. Помимо того, что сигналы остатков трансмембранного домена сильно уширены, в нем присутствует несколько наборов остатков одного типа (в основном Leu) сближенных как в первичной, так и во вторичной структуре (расположенных через виток спирали). Для уточнения неоднозначного отнесения участков с несколькими сближенными остатками лейцина использовался спектр l5N-NOESY-HSQC для образца селективно "N-меченного по о-амино группам лейцинов.

м.д.

Рис. 2, Фрагмент "Ш-^Са-1^ срезов е трехмерном спектре ИКСА. Стрелками показаны характерные контакты на Са предыдущего остатка.

Полное отнесение боковых цепей ВЫ1РЗ ТМ проводилось по спектрам НССН-ТОСЙУ с временем смешивания тт-23 мс и |3С-ШЕ5У-Н50С 60 мс в и "С-МОЕЗУ-НЗОС 100 мс в Н2О. Срезы Н-НЧСо) делались дня всех существующих в спектре |ЭС-Н5<ЗС кросс-пиков (рис. 4). После этого удалялись срезы, соответствующие сигналам от атомов липидного окружения (определялись по ]Н спектрам, исходя из их интенсивности), и зашумленные сигналом от воды. Оставшиеся срезы автоматически сравнивались в программе ХЕАЭУ. Таким образом, в спектре НССН-ТОСБУ находились срезы соответствующие одному и тому же остатку. Если значение химического сдвига Са было определено заранее по НИСА спектру, остаток относился однозначно. Оставшиеся остатки (участок РЬе 165-^173, сигналы которого были уширены в спектре НЫСА) относились после с учетом стандартной методики отнесения и анализа значений химических сдвигов НС.

"14, м.Д.

Шв.М 12101 ИМ ifi.11 lis.il |<*КЗ 10).|)0 П7.Я0 116.9» ИГ.««

©

О

н,

ил.

<Лу17Й Ьеи! 79 С1уШ Пе>«1 1}т1 «2 ШШ <ЛуШ АгцШ ЛщШ ¡.еяШ -1--1-1--1--1--1--1--1--1--1-

»,59 «.7» г)0 ».тт 1ЛЧ «.35 ».12 т.7т 7.т4

НГ>1, и.д.

Рнс. 3. Фрагмент "ЛГЯ-//-"ЛГ (резол в трехмерном '^^ОЕЗУ-НЗОС (тт-50мс). Стрелками показаны примеры последовательного отнесения по контактам ЯЭО между протонами соседних остатков. Выделенные контакты наиболее характерны для а-спиральной структуры.

'H, M.JL '

Рис. 4, Вверху: одномерный И ЯЫРчтектр, интенсивные узкие сигналы относятся к протонам шпидных бицеля. Внизу: lsC-HSQC пептида в DjO, спектр "завернут " по иС направлению дня повышения разрешения.

В ходе отнесения сигналов в гетероядерных "С-спектрах возник ряд трудностей:

1. уширение сигналов трансмембранной части пептида как из-за замедленного вращения белка в бицелле, так и из-за релаксации на протоны ацильиых целей липидов;

2. шум от узких интенсивных сигналов от протонов лнпидов перекрывает достаточно большую часть спектра (особенно в области метилов);

3. в случае перекрывания сигналов от остатков трансмембранной части к концевых подвижных участков, более широкие сигналы интересной нам трансмембранной части оказывались сопоставимы с шумом от узких сигналов экспонированных в воду подвижных остатков;

4. небольшая дисперсия сигналов, особенно среди остатков одного типа (например, большинство остатков Leu имеют похожие химические сдвиги протонов боковых цепей).

Наиболее простым решением этих проблем может стать использование липидов, дейтерированных по ацнльным цепям, для мембранного окружения (делать полностью меченные липиды дорого и неэффективно). Это существенно снизит интенсивность кросс-пиков с протонов белка на липиды. Таким образом, сразу же уменьшится ширина линий в |5С-спектрах, за счет уменьшения релаксации на протоны лнпидов, н не будет зашумления от узких интенсивных сигналов мембранного окружения.

Отнесение остатков с ароматическими кольцами (Ptie, Туг, His) было сделано по спектрам nC-HSQC и двумерным гомоядерным TOCSY и NOESY спектрам. Применение 'Н-ЯМР экспериментов было возможно благодаря тому, что область ароматики смещена в сильное поле относительно сильно перекрытой NH области. Таким образом, удалось однозначно определить химические сдвиги протонов имидозольного кольца Hisl73 и боковой цепи Туг] 82. Однако сигналы от ароматических колец трех остатков фснилаланинов оказались значительно перекрыты. Эти остатки располагаются последовательно друг за другом через три аминокислотных остатка и вполне могут быть сближены пространственно.

В итоге были отнесены все 'И, 15N и 13Са атомы основной цепи, кроме Nil Asnl47, который находится на N-конце пептида (2-ой остаток) и из-за ускоренного обмена протона NH с водой уширен в |5Ы-ЯМР спектрах. Среди боковых цепей полное отнесение не было сделано для Leu 170, который находится в сильно перекрытой области как так и "С-ЯМР спектров. 'Н, 1SH и 13С химические сдвиги бьши депонированы в базу данных BMRB (http://www.mol.bmrb. ethz.edu] под идентификационным номером 7288,

150 155 1«0 1«5 170 175 180 18J 190 rmt svmkkgqifsae flkvflp slllshllaiqlqiy13rrltts

я—О

'¿НЖШ ТТТТТТ А ДАЛ

¿сыв./*!) - - - —

^,1+1) - - —

Рис. 5. (1) Н—*0 — время полуобмена солидного протона на дейтерий растворителя. * обозначены остатки с г/.э > 2 часов, • - с 1< Гц < 2, для остальных остатков время полуобмена амидного протона на дейтерий было меньше часа. (2) Гомоядерные константы спин-спинового взаимодействия './/<*г«/.'"

А- КССВ < ¡Гц, Т- 5-6Гц, А -КССВ > 6 Гц. (3) Последовательные и среднего диапазона контакты ЯЭО, характеризующие вторичную структуру ВМРЗ ТЫ, Контакты обозначены как е!лв(ф и соответствуют интенсивности кросс-пиков ЯЭО между протонами А и В остатков /и/ Ы, аи Р обозначают протоны ЫН, С„Н и СрН соответственно. Более толстые линии соответствуют более интенсивным кросс-пикам в спектрах мтаг-даес или "С- №ОЕ8У-Н$0С с т„ =60 мс.

Элементы вторичной структуры

Без предварительных расчетов вторичную структуру белка можно определить исходя из анализа системы контактов ЯЭО (рис, 5), полученных из экспериментов КЮЕЭУ, констант спик-спинового взаимодействия ^ннсан и скоростей обмена амидных протонов с растворителем. Так, участки полипептидной цепи с малыми значениями КССВ ( >'да(м<6 Гц), для которых наблюдаются интенсивные кросс-пики ЯЭО ЫН(/уЫН(|+/) и

полипептнд!юй цепи (р-тяж) и отрицательное - в спиральной конформации. На рисунке б представлены значения вторичного химического сдвига для транс мембранного домена В№РЗ. Из рисунка следует, что пептид, за исключением Ь1-концевой части (остатки 145158), имеет конформацию спирали. Положительные значения вторичного химического сдвига остатков трансмембранного региона можно объяснить особенностями их пространственного окружения. Так Уа1164 находится на №конце трансмембранного домена, где вероятен изгиб спирали. Химический сдвиг сигнала СаН 1~еи1б9 сильно сдвинут в слабое поле, это возможно если учесть, что он пространственно сближен с ароматическим остатком РЬе165, находящимся через виток (4 аминокислотных остатка) а-спирали, Оу 1Я0 тоже имеет нетипичные химические сдвиги а-протонов, вероятно, из-за того, что он входит в димернзационный мотив.

Изложенные выше предположения о вторичной структуре пептида полностью совпадают с данными, полученными из экспериментов по измерению скоростей обмена амндмых протонов на дейтерий растворителя и оценки констант спин-спинового взаимодействия ^нясен (рис. 5).

Таблица 1. Количество пространственных ограничений, использовавшихся в расчете структуры.

Использованные ограничения На один мономер Всего ограничений

Всего Я ЭО контактов 585 1170

11етрнвнальные ЯЭО 304 608

Виутриостаточные 101 202

Последовательные (¡(-Л"!) 131 162

Среднего диапазона (1<|/-,Л54) 70 140

Дальнего диапазона (]/^1>4) 2 4

Водородные связи 19 114*2

Межмоном ерные ЯЭО 14 28

Ограничения на двугранные углы 91 182

<РГ V К 76 152

15 30

Данные 15 N релаксации также позволяют сделать предположения о вторичной структуре ВН1РЭ ТМ. Значения "Ы{'Н} НОЕ, |5Ы Т| и Т2 довольно сильно зависят от расположения остатка в аминокислотной последовательности (рнс. 7). Так участку ЬЫбб-ОуШ соответствуют наибольшие положительные значения '^('Н} ЫОЕ, что говорит о его ограниченной подвижности. Таким образом, можно предположить, что именно этот участок является стабильной трансмембранной а-спиралью, К концам этой а-спирали примыкают более подвижные участки (остатки 159-165 н 185-187), которые, судя по всему, находятся на границе бицелла-вода. С другой стороны, отрицательные значения ^N{'11} N06 для участков Агг 146-Йег 158 и ТЬг188-5ет190 говорят о свободной подвижности и, следовательно, их экспонировании в раствор. По полученным данным для димера ВЫ1РЗ ТМ было рассчитано время вращательной корреляции тц, которое составило примерно 18 не. Этому значению тц соответствует эффективная масса комплекса белок-бнцелла ~ 50 кДа, что составляет сумму масс димера белка (- 10 цЦа) и бнцеллы ДМФХ/ДГФХ, состоящей из 80 молекул липндов (~40кДа). Это говорит о практически отсутствующей подвижности ВМ1РЗ ТМ внутри бицеллы, что, как уже не раз упоминалось, является одной из причин значительного ушнрения сигналов от остатков трансмембранного региона.

Расчет пространственной структуры

Расчет пространственной структуры ВШРЗ ТМ по данным ЯМР-спектроскопнн включал в себя 4 этапа; (I) анализ локальной структуры с помощью модулей программы СУАЫА, (2) расчет пространственной структуры мономера белка и отбор ЯЭО контактов в спектрах «гомодимера», нарушающихся в мономере, (3) поиск межмономерных контактов и (4) окончательный расчет пространственной структуры ли мера.

„ Ш5(ГО1)А17бф) Неодиоан, Р161/П65 У182(е)

С, МД-+ 16.52 22.80 21,58 8.95

На HI 81

HS, О1177

"[177

©нр

«>НТ]1 1177

На Н173

HS, Н173

<о

* * О

$ о

0

% ф* 9 О*

ф *

**

'II

мд.

'II, мд.-» 9.33 1.77 7.20 6.89 6.77

Рис. 8. Примеры срезов из спектров «гетеродимера» с межмономерными ЯЭО контактами и кросс-пиками на протоны липидного окружения (* - на протоны ацилъных цепей, **-на протоны головок липидов).

Локальная структура BNIR3 ТМ была получена на основании контактов ЯЭО из спектра JÍN-NOESY-HSQC (тт=60 мс) и ограничений на торс конные углы *р, <|» н х\ которые рассчитывались при анализе пространственной структуры с учетом стернческн разрешенных величин двугранных углов, констант спнн-спниового взаимодействия Jhhcон и а также результатов программы TALOS. Ka этом этапе было сделано

стереоспецифнческое отнесение Hp-протонов. Предварительное стереоотнесен ие делалось при помощи модуля HABAS программы CYAN А на основании уже имеющихся ограничений на двугранные углы и внутриостаточных ЯЭО контактов. Далее было рассчитано 100 пространственных структур, из которых для дальнейшего анализа выбиралось 10 с наилучшей целевой функцией. Полученные структуры подавались на

вход модуля йЬОМЗА для поиска новых пар стсреоконформеров боковых цепей. Затем цикл повторялся.

Для расчета пространственной структуры мономера были добавлены пространственные ограничения на ЯЭО контакты из 13С-спектров. После нескольких итераций расчетов к анализа полученных структур были введены ограничения на водородные связи. Ряд ограничений на межпротонные расстояния на предполагаемом интерфейсе димеризации нарушался во всех расчетах, что говорит о наличии как внутри-, так и межмономерной составляющей в соответствующих кросс-пиках. Такие контакты были убраны из внутримономерных ограничений н добавлены в межмономерные с приблизительно оцененным расстоянием н большей погрешностью,

Наличие в ЯМР-спектрах только одного набора кросс-пиков и отсутствие в трансмембранном регионе дальних контактов (между протонами удаленных более на чем на 4 остатка в аминокислотной последовательности) позволяют сделать вывод , что димер ВШРЗ ТМ параллелен и симметричен. Поэтому для расчета пространственной структуры димера к С-концу аминокислотной последовательности одного мономера была добавлена такая же последовательность, связанная с первой цепью из 165 подвижных псевдоостатков. Аминокислотные остатки второго мономера получили порядковые номера (+200, для них были продублированы все ограничения на межпротонные расстояния (из ЯЭО контактов), водородные связи н двугранные углы. Ограничения на межмономерные контакты также были взяты в двойном объеме для симметричности димера.

Рис. 9. Стереоизображение 20 лучших ЯМР структур ВЫ1РЗ 11е!$б-5ег190, совмещенных по тяжелым атомам основной цепи трансмембранного домена (1ли166-Оу1&4).

Как говорилось ранее, ограничения на межмономерные контакты были получены напрямую из ЯМР-экспернментов с «сгетеродимером», Так как в эксперименте были использованы немеченые липнаы, то в спектрах присутствовали интенсивные кросс-пики на протоны ацильных цепей ДМФХ и ДГФХ (рис. Е). В результате, для расчета пришлось

выбирать отдельно стоящие сигналы, которые можно было бы однозначно отнести, и правильно оценить объем соответствующих кросс-пиков. Таким образом, было задано по 14 ограничений для каждого мономера в силу симметрии. Более полно днмеризационный интерфейс был исследован после расчета пространственной структуры димера н минимизации конформационной энергии.

Окончательный расчет пространственной структуры ВШРЗ ТМ проводился с учетом всех полученных ранее данных (табл. 1). Из 200 рассчитанных структур было взято 20 (10%) с наилучшей целевой функцией (рис. 9). Анализ результатов был проведен в программе МОЬМОЬ. Пространственная структура трансмембранного домена ВГЛРЗ, как и предполагалось, представляет собой стабильную а-спираль на участке Ьеи1б6-01у184. Введенные в расчет межмономерные контакты не изменяют кон^юрмашио мономера. Трансмембранные а-спнрали пересекаются под углом 0 - -40° (правая закрутка) и образуют параллельный симметричный димср. Расстояние между а-спнралями составило с1~ 6.3А,

Минимизации конформационной энергии экспериментальной структуры

Среда, моделирующая мембрану, позволяет исследовать гидрофобные белки с трансмембранными доменами, методом спектроскопии ЯМР, но вместе с тем имеет собственные недостатки, так как влияет на качество спектров. Кроме того, мы не можем получить точных данных о взаимодействии белка с лнпидным окружением. Несмотря на большое количество ЯЭО контактов между протонами белка и лнпидов, по полученным данным можно только судить о том, какая из групп липида пространственно сближена с тем или иным остатком белка (рис. 8). Из-за идентичности всех молекул ДМФХ и ДГФХ спектроскопия ЯМР позволяет получить только косвенные данные о взаимодействии белка и бицеллы: боковые цепи каких остатков белка экспонированы в лнпндное окружение. Поэтому полученные методом спектроскопии ЯМР-сгруктуры были подвергнуты минимизации конформационной энергии методом молекулярной динамики (МД) в явно заданном бнелое ДМФХ с наложением всех эксперимагтальных ограничений. Моделирование позволило адаптировать структуру к мембранному окружению, при этом ее качество (распределение двугранных углов боковых цепей, конформация основной цепи) улучшилось, а геометрия взаимодействия ТМ фрагментов существенно не изменилась (табл. 2). Более того, расчет 5нс молекулярно-дипамической траектории без ЯМР-ограннченнй не привел ни к изменению структуры димера, ни к «выходу» молекулы из пространства экспериментальных ограничений.

Таблица 2. Сравнение наборов структур до и после МД-ре.чаксации. Среднеквадратическое отклонение рассчитано для участка со стабильной а-

спиралью (Ьеи166-С!у13-1).

Экспериментальные После МД

НМБО (А) ВШРЗ ТМ (остатки! 66-184) тяжелые атомы основной цени все тяжелые атомы

Расстояние межау спиралями </(А) Угол между спиралями © (град.)

0.60+0.19

1.КН0.18

6.1 ±0.4 -39±1.5

0.93+0.31 1.50+0.32

6.3±0.3 ^10*2.0

Всего было получено 16 пространственных структур, минимизированных по конформационной энергии методом МД. Так как методы спектроскопии ЯМР не позволили определить таутомерную форму имидозольного кольца His 173, расчеты проводились для двух конформаций с незаряженным имидазольным кольцом (12 структур для BNIP3 с протонированным Ns Hisl73 м 4 структуры - с Ый). Кроме того, была рассчитана 5нс молекулярно-динамическая траектория для BNIP3 ТМ с положительно заряженным His 173. Использованные Л MP-ограничения и атомные координаты 16 структур димера BNIP3 ТМ были депонированы базу данных PDB (Protein Data Bank) под идентификационным номером 2J5D.

Рис. 10, Пространственная структура трансмембранного домена BNIPS; (а) • белок изображен в явно заданном бислоеДМФХ, (б) -указаны основные участки структуры.

В процессе МД наблюдается общая тенденция изменения структуры мономеров BNIP3 ТМ, определяемая взаимодействием с мембраной. N-концевая область BN1P3 ТМ (остатки 146-15 8), богатая полярными и заряженными остатками, интенсивно взаимодействует с полярными головками липидов и водой. Этот участок неупорядочен -более 90% МД-траектории не образуется каких-либо элементов вторичной структуры (рис. 10), что подтверждается данными "N-релаксацни: малыми значениями lsN{ Н} NOE и локального tr (рис. S). Для них также характерны большие отличия в различных моделях структуры димера. Все эти данные (отсутствие вторичной структуры, большое разнообразие конформаций) указывают на неспецифический характер взаимодействий этого участка с окружением, В то же время, кон формация этого участка стабилизируется взаимодействием с мембраной - значения RMSF (среднеквадратичная флуктуация атомов) по остаткам не превышают 1.5 А.

Следующая часть (остатки 159-165) состоит в основном из гидрофобных остатков, за исключением Glul60 и Lysl63. Вторичная структура на этом участке полипептидной цепи представляет собой о-спираль в более £0% МД траектории. Эта амфнфильная а-спираль находится на интерфейсе липид-вода (рис. 10). Стабильность данного участка белка выше, чем в случае остатков Argl46-Serl58, а конформационная гетерогенность в этом случае существенно меньше. Несколько большее значение RMSD при выравнивании по атомам основной цепи трансмембранного региона указывает на подвижность этих спиралей как целого относительно мембранного ядра. Данные |5Ы-релаксацин и МД

подтверждают существование N-концевой спирали, более подвижной чем трансмембранная а-спнраль. Значение 15Н('и> NOE и локального tr на данном участке (рнс. 8) непостоянно, зависимость имеет вид ступеней (особенно заметных на графике для Т|). Это говорит о нестабильности данного участка; спираль Alal59-Phel65 может «расплетаться» частично (на один виток Alal59-PheI61 - первая ступень) или полностью, так как информация а-спирали энергетически не выгодна богатому на гидрофобные остатки участку в водном окружении. Вторичная структура остатков Alal59-Phel65 стабилизируется за счет нескольких межостаточных контактов: взаимодействие заряженных боковых цепей Glul60 и Lys163 и стэкинговое взаимодействие ароматических колец остатков Fhel57, Phe161 и Phelóí. Влияние боковой цепи Phe157, находящегося дальше всех от трансмембранного региона, слабее всего (участвует только в течении 30% МД-траектории). Взаимодействие ароматических колец Phel61 и Plie165 более сильное: наблюдаются не только внутри-, но и межмономерныс контакты. Во всех случаях боковые цепи остатков фсннлаланина расположены так, что экранируют трансмембранную часть белка от молекул воды.

Следующий участок полнпептидной цени Leul66-GIy 184 представляет собой трансмембранную а-спираль. На этом участке наблюдается наименьшая конформационная гетерогенность н наибольшие значения llN{JH} NOE и локального Тц (Рис. 8). Примыкающие к нему Argl85-LeulS7 находятся на интерфейсе лнпид-вода и, как и подобный N-концевой участок, образуют нестабильную подвижную а-спираль. Длинные заряженные боковые цени ArgI85 и Argl86 взаимодействуют с полярными головками молекул липшюв и надежно закрепляют белок в бииелле. Кроме того, в каждом мономере образуется по паре водородных связей между ароматическим кольцом Туг182 и гуаншшновыми группами Arg186. С-концевой участок Thrl88-Serl90 экспонирован в воду, его структура не упорядочена.

Димеризационный интерфейс BNIP3 ТМ

Сразу заметим, что область межмономерных контактов весьма стабильна, она одинакова во всех полученных структурах и не меняется в течение молекулярно-динамической траектории. На N-конце спирали взаимодействуют только боковыми цепями гидрофобных остатков фенил ал анина, как говорилось ранее, ароматические кольца которых участвуют в сгзкннг-взаимодейсгвии. Скорее всего этот участок функционально важен. Далее взаимодействие между спиралями осуществляется за счет остатков, образующих на поверхности молекулы довольно протяженный гидрофильный участок. На С-коиие трансмембранного домена упаковка спиралей наиболее плотная, за счет остатков с небольшими боковыми цепями, расположенных через виток a-спирали, и составляющих двойной «глнкофориновый» мотив А' KXXXG"aXXXG"'>. Межмономерные контакты, наблюдаемые во всех структурах, включают в себя следующие остатки: Phcl65, Leu 169, Ser 172, Hisl73, Alal76, Ile177, Glyl80, llel8t, Ilel83, Glyl84 и ArgISS. Интересно, что недавно методом направленного мутагенеза было установлено, что остатки Mis 173, Atal76 nGlylSO необходимы для гомодимеризации BNIP3 (E.S.Sulistíjo el al).

В ходе работы было получено большое количество isN-lISQC спектров при различных условиях; температура и рН. Во многих из них можно наблюдать минорную компоненту для сигналов амидных групп остатков Leul69, Scrl72 и А1а176. Анализ ЯМР-спектров при различных температурах (30-55°С) позволяет утверждать, что в районе димернзационного интерфейса наблюдается медленный конформационный обмен. При основных условиях эксперимента (рН 5,0, 4СРС) скорость обмена не превышает 20 Гц и вклад минорной составляющей незначителен (- 10%). Такой обмен может быть связан с небольшой подвижностью мономеров друг относительно друга или медленными локальными конформацнонными изменениями.

Присутствие внутри трансмембранного региона такого остатка как Н|$173 не может не вызывать интерес. Обычно эксперименты проводились при рН 5,0 и то, что при нем имндоэольное кольцо гистидина не заряжено, говорит о сильном смещении рК этого остатка. Проведенный нами ряд экспериментов позволил установить, что значение рК(НЫ73) < 3,5. Понизить рН далее не позволяют особенности бицелл. Низкое значение рК гистидина может служить косвенным признаком того, что его имидозольное кольцо участвует в образовании водородной связи. Из анализа полученных пространственных структур можно сделать вывод, что боковые цепи Бег!72 и №173, а также карбонильные группы основной цепи 5ет168 и 1_еи1б9 (химический сдвиг Са сильна смещен в слабое поле) образуют сложную сеть водородных связей, включающую оба мономера (рис. 11).

Рис, 11. Возможные конформсщии узла Seri 72~Hisl 73.

Анализ молекулярно-динамических траекторий показал, что полученным методом ЯМР-спектроскопии пространственным ограничениям может соответствовать несколько конформаций узла Serl72-His173, зависящих главным образом от таутомерной формы имидозольного кольца гистидина. В спектрах ЛМР, как правило, сигналы от любого из протонов Нб| или Не2 сильно уширены и их невозможно увидеть. Таким образом, сделать однозначный выбор между как возможными конформациями, так и таутомерными формами Hisl73 невозможно. Для случая sHisl73 (протонирован N52 имидозольного кольца) возможны два способа упаковки а-спиралей, В первом случае (рис, 11а) имидоэольные кольца гистидина находятся в сгэкинге, расстояние между ними примерно 3,5-4,0 А. При таком расположении колец возможен, наблюдаемый нами, сдвиг сигналов Hß Hisl73 в сильное поле. Эта конформация стабилизируется межмономерными водородными связями OrtSerl72)-NHej(Hisl73*). Кроме того, в разных структурах ОНу-группа Serl72 образует водородную связь с СО-группой Serl68 или Leu 169. 10 из 12 энергетически минимизированных МД структур относятся к этой категории. В других двух структурах имидоэольные кольца гистидина раздвинуты на -8Ä, а между ними помещены боковые цепи серинов (рис. 116). В этом случае образуются три межмономерные водородные связи; OHy(Ser 172)-Oy(Ser 172'), Oy(Serl72)-NHe(His]73')

и N61 (Н is 173 )-OHy(SeT 172'). На первый взгляд кажется, что такая конформация асимметрична, что должно в свою очередь найти отражение в ЯМР-спектрах, Но если проанализировать всю молекулярно-динамическую траекторию, то можно заметить частые переключения в образовании водородных связей между разными мономерами. Такой конформанионный обмен может привести к усреднению химических сдвигов сигналов и объемов кросс-пиков в ЯМР-спектрах. Заметим еще раз, что на протяжешт всех молекулярно-динамических траекторий полученные экспериментально пространственные ограничения не нарушались.

Для пространственных структур с 6Hisl73 (таутомерная форма нмидозального кольца с лротонированным NSi) получено 4 молекулярно-динамических траектории. Во всех структурах наблюдается сгэкннг имидоэолъных колец (рис. 11 в). Стабилизация взаимодействия происходит за счет внутримономерной водородной связи OUi(Serl72) -Nsj(Htsl73) и межмономерной -NHSi(Hisl73)-CO(Leul69'), Подобная конформациоиная гетерогенность может объяснять наличие минорной компоненты у сигналов амндных групп остатков Leul69 и Serl72 в ^N-HSQC спектрах.

Для оценки влияния роли заряда боковой цепи Hisl73 на структуру димера и свойства мембраны был проведен расчет молекулярно-динамической траектории с заряженным остатком Hisl73 в одном из мономеров. Расчет проводили из равновесной структуры с протоннрованным атомом азота Ncj. На первом этапе (3 не) для адаптации системы к новому зарядовому состоянию фиксировалось положение атомов основных цепей BNIP3, Далее следовал длительный расчет МД (5 не). Результаты моделирования показали, что заряд не оказывает существенного влияния на общую упаковку липидов бнелоя - значительного перераспределения положения липидов не происходит. Однако в этом случае существенно возрастает доступность остатков Ser172 и His 173 для молекул воды. Если в случае незаряженного гисгидина эти остатки взаимодействовали с водой 23% времени МД-траетории, то при появлении заряда время взаимодействия с водой для этих остатков возрастает до 90 %. Взаимное расположение мономеров сохраняется. Существенные изменения происходят только в структуре узла His-Ser (рис. 11 в). В этом случае боковая цепь Serl72 выходит из области взаимодействия. Кольцо заряженного гисгидина располагается параллельно осям спирали и образует водородные связи С боковой иепью незаряженного Hisl73 и молекулами воды. Таким образом, в этом случае образуется цепочка водородных связей, в которую вовлечены несколько молекул воды и остатки His 173.

Взаимодействие BNIP3 ТМ с водой

Эксперименты по измерению скорости обмена амкдных протонов на дейтерий показали, что не все остатки трансмембранного сегмента недоступны воде. 11а рисунке 12 6 наглядно показано, что в N-концевую часть вплоть до Hisl73 между мономерами может проникать вода. Разница между скоростями обмена у остатков, расположенных на интерфейсе димеризацни и экспонированных в липидное окружение, значительна. Так время полуобмена амидного протона на дейтерий у Hisl73 ~ 1 часа, а у Lcu171 > 300 чаоов. В спектре ROESY также присутствует интенсивный кросс-пик на частоте воды и протонов имидозольного кольца гисгидина HSj и Hei, То есть участок белка, состоящий из гидрофильных остатков Ser168, Serl72 н His 173, может не только участвовать в образовании внутри- и межмономерных водородных связей, но и взаимодействовать с молекулами воды. Из анализа молекулярно-динамических траекторий можно установить, что боковая цепь Serl68 взаимодействует с водой примерно 50% всего времени, а боковые цепи Serl72 и Hisl73 - только 2-3%, в основном в переходных состояниях, Конформациоиная гетерогенность, о которой говорилось выше, вполне может соответствовать образованию недолго живущих водородных связей этик остатков с

молекулами воды. Заметим, что на С-конце димера подобная ситуация не наблюдается, там межмономерное взаимодействие более плотное.

Таким образом, встраивание гомодимера ВЮРЗ в мембрану приводит к существенному увеличению проникновения воды в липидный бислой: примерно на 12 А от атомов фосфора заряженных головок липндов, в то время как в бислой ДМФХ вода может проникать всего на 4-5 А. Совокупность экспериментальных данных и результатов МД позволяет утверждать, что подобное проникновение молекул воды вглубь мембраны -уникальное свойство трансмембранного домена ВЬПРЗ.

Рис. 12, (а) Минимизированная по конформационной энергии методом МД структура BNIP3 ТМ. Желтым обозначены атомы фосфора полярных головок липида, красным и белым — молекулы воды, проникающие в липидный бислой. (6) Пространственная структура BNIPS ТМ, на которой цветом показана доступность каждого остатка молекулам растворителя Цвет зависит от времени полуобмена амидного протона соответствующего остатка на дейтерий.

С4язь структурно-динамических свойств трансмембранного домена BNIP3 и проапоптотической функции белка

В данной работе с высоким разрешением установлена пространственная структура трансмембранного домена апоптоэного белка BNIP3 в мембранном окружении и охарактеризована его внутримолекулярная динамика. Совокупность всех полученных экспериментальных (ЯMP) и расчетных данных (молекулярная динамика) позволила на основе обзора литературы предложить механизм биологического действия белка BNIP3 на молекулярном уровне.

Известно, что присутствие в трансмембранном домене остатка His характерно для ионных каналов, особенно протонных. Уникальная структура димера трансмембранного домена BNIP3, способствующая проникновению молекул воды вглубь липилного бислоя, и высокая плотность переключающихся водородных связей на интерфейсе димеризации вокруг узла Ser-His указывают на то, что BNIP3 ТМ может образовывать протонный канал

во внешней мембране митохондрии. Это вполне согласуется с известными на сегодняшний день данными о белке BN1P3, который активируется при сильном ацгщме (понижении рН, велсдствин накопления молочной кислоты — продукта гликолиза), вызванном гипоксией клетки, и встраивается во внешнюю мембрану митохондрии. По нашему мнению, предполагаемый протонный канал понижает pli в митохондрнальном межмембранном пространстве и уменьшает электрохимический потенциалов на внешней мембране митохондрии. Это должно приводить к гииерполярнзацин внутренней мембраны митохондрии, открытию РТ (permeability transition) пор, изменению потоков метаболитов, дестабилизации работы н пространственной организации митохондрии, что в свою очередь инициирует апоптозо-некрозный каскад событий в клетке.

ВЫВОДЫ

1. На основе методов гетероядерной спектроскопии ЯМР и молекулярной динамики разработан комплексный подход для исследования структурно-динамических свойств трансмембранных доменов белков.

2. Методом спектроскопии ЯМР высокого разрешения определена пространственная структура и описана внутримолекулярная динамики трансмембранного домена проапоптозного белка ВШРЗ в комплексе с лнпидной бицеллой ДМФХ/ДГФХ. Показано, что белок образует параллельный симметричный димер. Прямыми методами спектроскопии ЯМР исследован интерфейс димернзации.

3. Методом молекулярной динамики проверена стабильность полученной структуры в явно заданном липндном бнелое ДМФХ, уточнена пространственная структура, исследовано взаимодействие белка с липидным окружением и молекулами растворителя.

4. Предложена модель, связывающая структурно-динамические свойства трансмембранного домена ВЪПРЗ с проапоптозноН функцией этого белка в организме человека

МАТЕРИАЛЫ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

J, Yu.E, Pustovalova, E.V, Bocharov, I.V. Maslennikov, Ya.S. Eimolyuk, M.V. Goncharuk, A.S. Arseniev. NMR study of transmembrane domain of pro-apoptotic protein BNIP3 in lipid bicelles И International Symposium and Summer School in Saint Petersburg Nuclear Magnetic Resonance in Condensed Matter 3rd Meeting "NMR in Heterogeneous Systems", Saint Petersburg, Russia, 2006. Books of Abstracts, p. 79,

2. A.S. Arseniev, E.V. Bocharov, Yu.E. Pustovalova, K.S. Mineev, P.E. Volynsky, R.G. Efremov, Ya.S. Eimolyuk, M.P. Kirpichnikov. Combined use of NMR spectroscopy and molecular modeling techniques to study helix-helix interaction in transmembrane protein (timers // XXlf International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems, Gdttingen, Germany, 2006. Books of Abstracts, p. 84,

3. Ю.Е. Пусговалова, Э.В, Бочаров, И.В, Масленников, Я.С. Ермолюк, М.В. Гокчарук, А.С. Арсеньев. Пространственная структура димера трансмембранного домена проапоптозного белка BN1P3 // VIII международный семинар по магнитному резонансу (спектроскопия, томография и экология), Ростов-на-Дону, 2006. Материалы семинара, стр. 44.

4. Ю.Е. Пусговалова, Э.В, Бочаров, И.В. Масленников, Я.С. Ермолюк, М.В. Гончарук, М.П. Кирпичников, А.С. Арсеньев. Конформация трансмембранного домена проапоптозного белка BNIP3 семейства BCL-2 в комплексе с липидной бнцеллой // VIII чтения, посвященные памяти академика Ю.А. Овчинникова, Москва, 2006. Тезисы докладов, стр. 91.

5. А.С. Арсеньев, Э.В. Бочаров, Ю.Е. Пусговалова, К.С. Минеев, П.Е. Волынский, Я.С. Ермолюк, Р.Г. Ефремов, А.В. Феофанов, М.П. Кирпичников, Структурная биология трансмембранных спираль-спиральных взаимодействий в норме и патологии: комбинированный подход на основе методов молекулярного моделирования, оптической и ЯМР спектроскопии // VIII чтения, посвященные памяти академика Ю.А. Овчинникова, Москва, 2006. Тезисы докладов, стр. 16.

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Пустовалова, Юлия Евгеньевна

введение.з

часть i. обзор литературы.

1.1. роль митохондрий в апоптозе.

1.2. Белки семейства BCL-2.

Антиапоптозные белки.

Проапотозные белки.

1.3.BNIP 3.

Смерть клеток при ишемии сердца.

Современное представление о структуре BN1P3.

Функция BN1P3.

1.4. Исследование мембранных белков методом спектроскопии ЯМР.

Выделение мембранных белков.'.

Выбор окружения моделирующего мембрану.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование пространственной структуры трансмембранного домена проапоптозного белка BNIP3 методом спектроскопии ЯМР"

Актуальность темы

Генетически запрограммированная смерть клеток необходима для нормального развития и жизнедеятельности любого многоклеточного организма. Физиологические механизмы клеточной смерти, запускающиеся в ответ на внеклеточный сигнал, предназначены для удаления зараженных, мутировавших, поврежденных или ненужных клеток [7], а также реконструирования тканей в организме. Нарушение механизма программируемой клеточной смерти (ПКС) может стать причиной серьезных заболеваний. Например, неспособность организма избавиться от поврежденных клеток приводит к раку [2] или аутоиммунным заболеваниям [3], тогда как смерть обычно долгоживущих клеток может стать причиной нейродегенеративного заболевания [4]. Таким образом, исследование механизмов ПКС имеет большое значение, как для молекулярной биологии, так и для клинической медицины.

Наиболее часто встречающийся механизм запрограммированной клеточной смерти - апоптоз. Этот процесс сопровождается рядом специфических морфологических и биохимических изменений в клетке, таких как конденсация и маргинация ядерного хроматина, фрагментация ядра, конденсация и образование выпячиваний цитоплазмы. В результате образуются апоптозные тельца, небольшие клеточные фрагменты, окруженные мембраной. Уничтожение клетки завершается фагоцитозом апоптозных телец макрофагами или их аутолизом.

Медиатором сигнала смерти служит обособленная группа цистеиновых протеаз, часто называемых каспазами. В живых клетках каспазы находятся в цитозоли в неактивной форме предшественника - прокаспазы. Можно выделить два типа каспаз - индукторы и эффекторы. В процессе апоптоза индукторы (например, каспаза-9), принимают апоптатический сигнал и передают его на эффекторные каспазы (например, каспаза-3), которые 3 непосредственно гидролизуют структурные белки клетки. Среди мишеней каспаз: цитоплазматические и ядерные белки, ферменты репарации и репликации, регуляторные белки, ингибиторы эндонуклеаз. Каспазы присутствуют во всех живых клетках, что позволяет быстро индуцировать апоптоз. Хотя надо заметить, что возможен и каспазо-независимый путь апоптоза. В этом случае смерть клетки происходит в результате нарушения функционирования клеточных органелл, чаще всего митохондрий, и сопровождается высвобождением активных форм кислорода (ROS) и возрастанием мембранного потенциала в митохондриях.

Важную роль в процессе программируемой клеточной смерти играют белки семейства BCL-2 - регуляторы активации каспаз и апоптоза. Несмотря на принадлежность к одному семейству, основанную на определенной гомологичности, представители этого семейства мембранных белков обладают широким спектром свойств. Они могут, как вызывать клеточную смерть в ответ на определенный сигнал или стрессовые условия, так и препятствовать ей.

Цель исследования

Объектом исследования данной диссертационной работы является трансмембранный домен человеческого белка BNIP3. Этот белок относится к группе проапоптозных белков "ВНЗ-only" семейства BCL-2 на основании анализа его первичной структуры. Однако, BNIP3 и его ближайшие гомологи обладают рядом уникальных особенностей. Хотя, как и другие "ВНЗ-only" белки они обладают узкой специфичностью к условиям, вызывающим их экспрессию и активацию, механизм их действия отличается от других представителей BCL-2. Клеточная смерть, вызванная BNIP3, происходит без участия каспаз и имеет несколько признаков некроза. Как и многие другие проапоптозные белки BNIP3 может образовывать гетеродимер с антиапоптозными представителями семейства BCL-2. Однако, в отличие от других "ВНЗ-only" белков ассоциация происходит без участия ВНЗ домена, а за счет взаимодействия трансмембранных сегментов. В работе [5] было показано, что посредством трансмембранного домена BNIP3 может образовывать стабильный гомодимер как в мицеллах SDS, так и в мембранах Е. Coli. Поэтому BNIP3 ТМ представляет особый интерес с точки зрения исследования механизма взаимодействия трансмембранных а-спиралей.

Научная новизна и практическая значимость работы

Все результаты, изложенные в данной диссертационной работе, получены впервые.

На сегодняшний день опубликована только одна пространственная структура высокого разрешения димера трансмембранных а-спиралей (трансмембранный домен белка гликофорин А, 1998, [6]). В представленной диссертационной работе методом гетероядерной спектроскопии ЯМР исследован трансмембранный домен белка BNIP3 в комплексе с липидной бицеллой. Показано, трансмембранные а-спирали BNIP3 пересекаются под углом -40° (правая закрутка) и образуют параллельный симметричный димер.

Разработана методика МД-релаксации полученных методом спектроскопии ЯМР пространственных структур трансмембранных сегментов. Она позволяет обойти ряд экспериментальных ограничений, накладываемых мембранной природой объекта исследования. Методом МД рассчитывается молекулярно-динамическая траектория для полученной экспериментально ЯМР-структуры трансмембранного домена, которая помещается в явно заданный липидный бислой, при этом на протяжении всего расчета на протоны белка накладываются экспериментальные пространственные ограничения. Такой комплексный подход позволяет достоверно описать пространственную структуру и внутреннюю динамику трансмембранных белков в липидном окружении.

Полученные в данной работе результаты ЯМР-экспериментов и молекулярного моделирования позволяют сделать предположение о роли

BNIP3 ТМ в качестве ионного (протонного) канала в механизме проапоптозной активности белка.

Работа выполнена в группе ЯМР лаборатории структурной биологии института биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Пустовалова, Юлия Евгеньевна

Выводы

1. На основе методов гетероядерной спектроскопии ЯМР и молекулярной динамики разработан комплексный подход для исследования структурно-динамических свойств трансмембранных доменов белков.

2. Методом спектроскопии ЯМР высокого разрешения определена пространственная структура и описана внутримолекулярная динамики трансмембранного домена проапоптозного белка BNIP3 в комплексе с липидной бицеллой DMPC/DHPC. Показано, что белок образует параллельный симметричный димер. Трансмембранные а-спирали пересекаются под углом - 40°. Образование димера происходит при участии двойного «гликофоринового» мотива А176XXXG180XXXG184, а также полярных остатков Serl72 и His 173.

3. Методом молекулярной динамики проверена стабильность полученной структуры в явно заданном липидном бислое DMPC, уточнена локальная пространственная структура, исследовано взаимодействие белка с липидным окружением и молекулами растворителя.

4. Предложена модель, связывающая структурно-динамические свойства трансмембранного домена BNIP3 с проапоптозной функцией этого белка в организме человека.

Благодарности

Мне хотелось бы выразить глубокую благодарность и признательность моему научному руководителю, профессору, д.х.н. Александру Сергеевичу Арсеньеву, который обеспечил возможность выполнения настоящей диссертационной работы, оказывал своевременную помощь и поддержку и проявлял неустанное благожелательное внимание на протяжении всего времени моей работы в лаборатории.

Хочу поблагодарить весь коллектив нашей лаборатории за помощь в выполнении экспериментальной работы и плодотворные обсуждения. Особую признательность хочу выразить сотрудникам лаборатории Э.В. Бочарову и И.В. Масленникову.

Приношу свою глубокую благодарность сотрудникам Лаборатории инженерии белка ИБХ РАН М.В. Гончарук и Я.С. Ермолюку за предоставление белка для исследований.

Благодарю коллектив группы молекулярного моделирования нашей лаборатории и особенно руководителя группы Р.Г.Ефремова и сотрудников группы П.Е. Волынского и Я.А. Верещагу за неоценимый вклад в работу.

Работа финансировалась грантами Российского Фонда Фундаментальных Исследований и министерства Образования и Науки.

3.9. Заключение

В мембраноподобном окружении BNIP3 ТМ образует право-закрученный параллельный симметричный димер. Плотная упаковка трансмембранных а-спиралей обусловлена остатками с небольшими боковыми цепями А1а176, Gly 180 и Glyl84, входящими в двойной «гликофориновый» мотив на С-конце BNIP3 ТМ. На N-конце трансмембранного домена димер стабилизируется стэкинг-взаимодействием ароматических колец трех остатков фенилаланина Phel57, Phel61 и Phel65. В середине трансмембранного домена взаимодействие мономеров происходит посредством атомов основной и боковых цепей остатков Serl 72 и His 173, участвующих в образовании внутри- и межмономерных связей. Уникальная структура BNIP3 ТМ, обеспечивающая проникновение воды вглубь мембраны, позволяет предположить, что белок при встраивании может вызывать ионную (протонную) проводимость через мембрану.

До сих пор не было найдено ни одного подтверждения того, что гомодимеризация BNIP3 влияет на проапоптозную функцию белка. Хотя показано, что в большинстве клеток, погибших от гипоксии, BNIP3 присутствует в виде гомодимера. Однако, смерть клетки вследствие гипоксии, наиболее тщательно изучаемая в данное время, является не единственным возможным механизмом действия BNIP3. Например, показано, что недимеризующийся мутант белка His 173—>А1а в клетках НЕК293 вызывает клеточную смерть без гипоксии и ацидоза [104]. Кроме

70 того, известно, что гомодимер BNIP3 вызывает лиганд-зависимый апоптоз с признаками некроза в лимфоцитах [105]. Для последнего случая было показано, что на ранних этапах ПКС лимфоцитов наблюдается гиперполяризация митохондрии [106], которая может быть обусловлена способностью BNIP3 проводить протоны.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Пустовалова, Юлия Евгеньевна, Москва

1. Vaux D.L., Korsmeyer S.J. Cell death in development (1999) Cell 96,245254

2. Strasser A., Harris A.W., Bath M.L., Cory S. Novel primitive lymphoid tumours induced in transgenic mice by cooperation between myc and bcl-2 (1990) Nature 348,331-333

3. Bouillet P., Metcalf D., Huang D.C.S., Tarlinton D.M., Kay T.W.H., Kontgen F., Strasser A. Proapoptotic Bcl-2 relative Bim required for certain apoptotic responses, leukocyte homeostasis and to preclude autoimmunity (1999) Science 286, 1735-1738

4. Barr P.J., Tommei L.D. Apoptosis and its role in human disease (1994) Biotechnology 12,487-493

5. Sulistijo E.S., Jaszewski T.M., MacKenzie K.R. Sequence-specific dimerization of the transmembrane domain of the "ВНЗ-only" protein BNIP3 in membranes and detergent (2003) J. Biol. Chem. 278, 51950-51956

6. MacKenzie K.R., Prestegard J.H., Engelman D.M. A transmembrane helix dimer: structure and implications (1997) Science 276, 131-133

7. Rutter G.A., Rizzuto R. Regulation of mitochondrial metabolism by ER Ca2+ release: an intimate connection (2000) Trends Biochem Sci 25, 215221

8. Di Lisa F., Bernardi P. Mitochondrial function as a determinant of recovery or death in cell response to injury (1998) Mol Cell Biochem 184, 379-391

9. Adams J.M., Cory S. Life-or-death decisions by the Bcl-2 protein family (2001) Trends Biochem. Sci. 26, 61-66

10. Zou H., Li Y., Liu X., Wang X. An APAF-1.cytochrome с multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9 (1999) J. Biol. Chem. 274,11549-11556

11. Crompton M., Virji S., Doyle V., Johnson N., Ward J.M. The mitochondrial permeability transition pore (1999) Biochem. Soc. Symp. 66, 167-179

12. Qian Т., Nieminen A.L., Herman В., Lemasters J.J. Mitochondrial permeability transition in pH-dependent reperfusion injury to rat hepatocytes1997) Am. J. Physiol 273, C1783-C1792

13. Petit P.X., Susin S.A., Zamzami N., Mignotte В., Kroemer G. Mitochondria and programmed cell death: back to the future (1996) FEBS Lett. 396, 7-13

14. Ichas F., Mazat J.P. From calcium signaling to cell death: two conformations for the mitochondrial permeability transition pore. Switching from low- to high-conductance state (1998) Biochim. Biophys. Acta 1366, 33-50

15. Zamzami N., Marchetti P., Castedo M., Hirsch Т., Susin S.A., Masse В., Kroemer G. Inhibitors of permeability transition interfere with the disruption of the mitochondrial transmembrane potential during apoptosis (1996) FEBS Lett. 384, 53-57

16. Vander Heiden M.G., Chandel N.S., Schumacker P.T., Thompson C.B. Bcl-xL prevents cell death following growth factor withdrawal by facilitating mitochondrial ATP/ADP exchange (1999) Mol. Cell 3,159-167

17. Adams J.M., Cory S. The Bcl-2 protein family: arbiters of cell survival1998) Science 281,1322-1326

18. Kelekar A., Thompson C.B. Bcl-2-family proteins: the role of the BH3 domain in apoptosis (1998) Trends Cell Biol. 8, 324-330

19. Nguyen M., Millar D.G., Yong V.W., Korsmeyer S.J., Shore G.C. Targeting of Bcl-2 to the mitochondrial outer membrane by a COOH-terminal signal anchor sequence (1993) J. Biol. Chem. 268, 25265-25268

20. Minn A.J., Velez P., Schendel S.L., Liang H., Muchmore S.W., Fesik S.W., Fill M., Thompson C.B. Bcl-x(L) forms an ion channel in synthetic lipid membranes (1997) Nature 385, 353-357

21. Schendel S.L., Xie Z., Montal M.O., Matsuyama S., Montal M., Reed J.C. Channel formation by antiapoptotic protein Bcl-2 (1997) Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A 94, 5113-5118

22. Schlesinger P.H., Gross A., Yin X.M., Yamamoto K., Saito M., Waksman

23. G., Korsmeyer S.J. Comparison of the ion channel characteristics of proapoptotic В AX and antiapoptotic BCL-2 (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 94, 11357-11362

24. Muchmore S.W., Sattler M., Liang H., Meadows R.P., Harlan J.E., Yoon

25. H.S., Nettesheim D., Chang B.S., Thompson C.B., Wong S.L., Ng S.L., Fesik S.W. X-ray and NMR structure of human Bcl-xL, an inhibitor of programmed cell death (1996) Nature 381,335-341

26. Hockenbery D., Nunez G., Milliman C., Schreiber R.D., Korsmeyer S,J. Bcl-2 is an inner mitochondrial membrane protein that blocks programmed cell death (1990) Nature 348, 334-336

27. Nguyen M., Branton P.E., Walton P.A., Oltvai Z.N., Korsmeyer S.J., Shore G.C. Role of membrane anchor domain of Bcl-2 in suppression of apoptosiscaused by EIB-defective adenovirus (1994) J. Biol. Chem. 269,1652116524

28. Shimizu S., Eguchi Y., Kamiike W., Funahashi Y., Mignon A., Lacronique V., Matsuda H., Tsujimoto Y. Bcl-2 prevents apoptotic mitochondrial dysfunction by regulating proton flux (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 95,1455-1459

29. Kluck R.M., Bossy-Wetzel E., Green D.R., Newmeyer D.D. The release of cytochrome с from mitochondria: a primary site for Bcl-2 regulation of apoptosis (1997) Science 275,1132-1136

30. Vander Heiden M.G., Chandel N.S., Williamson E.K., Schumacker P.T., Thompson C.B. Bcl-xL regulates the membrane potential and volume homeostasis of mitochondria (1997) Cell 91, 627-637

31. Yang J., Liu X., Bhalla K., Kim C.N., Ibrado A.M., Cai J., Peng T.I., Jones D.P., Wang X. Prevention of apoptosis by Bcl-2: release of cytochrome с from mitochondria blocked (1997) Science 275, 1129-1132

32. Gross A., Jockel J., Wei M.C., Korsmeyer S.J. Enforced dimerization of BAX results in its translocation, mitochondrial dysfunction and apoptosis (1998) EMBOJ. 17,3878-3885

33. Cheng E.H., Levine В., Boise L.H., Thompson C.B., Hardwick J.M. Bax-independent inhibition of apoptosis by Bcl-XL (1996) Nature 379, 554-556

34. Minn A .J., Kettlun C.S., Liang H., Kelekar A., Vander Heiden M.G., Chang B.S., Fesik S.W., Fill M., Thompson C.B. Bcl-xL regulates apoptosis by heterodimerization-dependent and -independent mechanisms (1999) EMBO J. 18, 632-643

35. Chinnaiyan A.M., O'Rourke K., Lane B.R., Dixit V.M. Interaction of CED-4 with CED-3 and CED-9: a molecular framework for cell death (1997) Science 275, 1122-1126

36. Hu Y., Benedict M.A., Wu D., Inohara N., Nunez G. Bcl-XL interacts with Apaf-1 and inhibits Apaf-1-dependent caspase-9 activation (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 95,4386-4391

37. Desagher S., Martinou J.C. Mitochondria as the central control point of apoptosis (2000) Trends Cell Biol. 10,369-377

38. Wolter K.G., Hsu Y.T., Smith C.L., Nechushtan A., Xi X.G., Youle R.J. Movement of Bax from the cytosol to mitochondria during apoptosis (1997) J. Cell Biol. 139,1281-1292

39. Zha H., ime-Sempe C., Sato Т., Reed J.C. Proapoptotic protein Bax heterodimerizes with Bcl-2 and homodimerizes with Bax via a novel domain (BH3) distinct from BH1 and BH2 (1996) J. Biol. Chem. 271, 7440-7444

40. Wang K., Gross A., Waksman G., Korsmeyer S.J. Mutagenesis of the BH3 domain of BAX identifies residues critical for dimerization and killing (1998) Mol. Cell Biol. 18, 6083-6089

41. Goping I.S., Gross A., Lavoie J.N., Nguyen M., Jemmerson R., Roth K., Korsmeyer S.J., Shore G.C. Regulated targeting of BAX to mitochondria1998) J. Cell Biol. 143,207-215

42. Hsu Y.T., Youle R.J. Nonionic detergents induce dimerization among members of the Bcl-2 family (1997) J. Biol. Chem. 272, 13829-13834

43. Griffiths G.J., Dubrez L., Morgan C.P., Jones N.A., Whitehouse J., Corfe B.M., Dive C., Hickman J.A. Cell damage-induced conformational changes of the pro-apoptotic protein Bak in vivo precede the onset of apoptosis1999) J. Cell Biol. 144, 903-914

44. Inohara N., Ekhterae D., Garcia I., Carrio R., Merino J., Merry A., Chen S., Nunez G. Mtd, a novel Bcl-2 family member activates apoptosis in the absence of heterodimerization with Bcl-2 and Bcl-XL (1998) J. Biol. Chem. 273,8705-8710

45. Inohara N., Gourley T.S., Carrio R., Muniz M., Merino J., Garcia I., Koseki Т., Hu Y., Chen S., Nunez G. Diva, a Bcl-2 homologue that binds directly to Apaf-1 and induces ВНЗ-independent cell death (1998) J. Biol. Chem. 273, 32479-32486

46. Huang D.C., Strasser A. ВНЗ-Only proteins-essential initiators of apoptotic cell death (2000) Cell 103, 839-842

47. Chen G., Ray R., Dubik D., Shi L., Cizeau J., Bleackley R.C., Saxena S., Gietz R.D., Greenberg A.H. The E1B 19K/Bcl-2-binding protein Nip3 is a dimeric mitochondrial protein that activates apoptosis (1997) J. Exp. Med. 186, 1975-1983

48. Bruick R.K. Expression of the gene encoding the proapoptotic Nip3 protein is induced by hypoxia (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 97, 9082-9087

49. Pisarenko O.I. Ischemic preconditioning: from theory to practice (2005) Kardiologiia. 45,62-72

50. Narula J., Hajjar R.J., Dec G.W. Apoptosis in the failing heart (1998) Cardiol. Clin. 16, 691-710, ix

51. Kajstura J., Cheng W., Reiss K., Clark W.A., Sonnenblick E.H., Krajewski S., Reed J.C., Olivetti G., Anversa P. Apoptotic and necrotic myocyte cell deaths are independent contributing variables of infarct size in rats (1996) Lab Invest 74,86-107

52. Williams F.M., Kus M., Tanda K., Williams T.J. Effect of duration of ischaemia on reduction of myocardial infarct size by inhibition of neutrophil accumulation using an anti-CD 18 monoclonal antibody (1994) Br. J. Pharmacol. Ill, 1123-1128

53. Buja L.M., Eigenbrodt M.L., Eigenbrodt E.H. Apoptosis and necrosis. Basic types and mechanisms of cell death (1993) Arch. Pathol. Lab Med. 117, 1208-1214

54. Webster K.A., Graham R.M., Bishopric N.H. BNip3 and signal-specific programmed death in the heart (2005) J. Mol. Cell Cardiol. 38,35-45

55. Graham R.M., Frazier D.P., Thompson J.W., Haliko S., Li H., Wasserlauf B.J., Spiga M.G., Bishopric N.H., Webster K.A. A unique pathway of cardiac myocyte death caused by hypoxia-acidosis (2004) J. Exp. Biol. 207, 3189-3200

56. Chen G., Cizeau J., Vande Velde C., Park J.H., Bozek G., Bolton J., Shi L., Dubik D., Greenberg A. Nix and Nip3 form a subfamily of pro-apoptotic mitochondrial proteins (1999) J. Biol. Chem. 274, 7-10

57. Russ W.P., Engelman D.M. The GxxxG motif: a framework for transmembrane helix-helix association (2000) J. Mol. Biol. 296, 911-919

58. Kubasiak L.A., Hernandez O.M., Bishopric N.H., Webster K.A. Hypoxia and acidosis activate cardiac myocyte death through the Bcl-2 family protein BNIP3 (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 99, 12825-12830

59. Webster K.A., Discher D.J., Kaiser S., Hernandez O., Sato В., Bishopric N.H. Hypoxia-activated apoptosis of cardiac myocytes requires reoxygenation or a pH shift and is independent of p53 (1999) J. Clin. Invest 104, 239-252

60. Webster K.A., Bishopric N.H. Molecular regulation of cardiac myocyte adaptations to chronic hypoxia (1992) J. Mol. Cell Cardiol. 24, 741-751

61. Vande Velde C., Cizeau J., Dubik D., Alimonti J., Brown Т., Israels S., Hakem R., Greenberg A.H. BNIP3 and genetic control of necrosis-like cell death through the mitochondrial permeability transition pore (2000) Mol. Cell Biol. 20, 5454-5468

62. Grisshammer R., Buchanan S.K. (2006) Structural biology of membrane proteins. The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK

63. Arora A., Abildgaard F., Bushweller J.H., Tamm L.K. Structure of outer membrane protein A transmembrane domain by NMR spectroscopy (2001) Nat. Struct. Biol. 8,334-338

64. Fernandez C., Adeishvili K., Wuthrich K. Transverse relaxation-optimized NMR spectroscopy with the outer membrane protein OmpX in dihexanoyl phosphatidylcholine micelles (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 98, 2358-2363

65. Reynolds J.A., Tanford C. Binding of dodecyl sulfate to proteins at high binding ratios. Possible implications for the state of proteins in biological membranes (1970) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 66, 1002-1007

66. Vinogradova O., Sonnichsen F., Sanders C.R. On choosing a detergent for solution NMR studies of membrane proteins (1998) J. Biomol. NMR 11, 381-386

67. Lauterwein J., Bosch C., Brown L.R., Wuthrich K. Physicochemical studies of the protein-Iipid interactions in melittin-containing micelles (1979) Biochim. Biophys. Acta 556, 244-264

68. Кирпичников М.П., Гончарук M.B., Ермолюк Я.С., Гончарук С.А., Шульга А.А., Масленников И.В., Арсеньев А.С. Структурная биология мембранных пептидов (2005) Технология живых систем 2, 20-26

69. Lopukhov L.V., Ponomareva A. A., Yagodina L.O. Inhibition of bacterial pyridoxal-depending enzymes by (aminooxy)-acetic acid improves selective 15N isotope labeling of bacterially expressed protein (2002) Biotechniques 32,1248-1250

70. Sattler M., Schleucher J., Griesinger C. Heteronuclear multidimensional NMR experiments for the structure determination of proteins in solution employing pulsed field gradients (1999) Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectosc. 34,93-158

71. Cavanagh J., Fairbrother W.J., Palmer A.G., Skelton N.J. (1996) Protein NMR spectroscopy: principles and practice. Academic Press, San-Diego, USA

72. Orekhov V.Y., Nolde D.E., Golovanov A.P., Korzhnev D.M., Arseniev A.S. Processing of heteronuclear NMR relaxation data with the new software DASHA (1995) Appl. Magn. Reson. 9, 581-588

73. Plotto M., Saudek V., Sklenar V. Gradient tailored excitation for single-quantum NMR spectroscopy of aquious solutions (1992) J. Biomol. NMR 2, 661-665

74. Lippens G., Dhalluin C., Wieruszeski J.M. Use of a water flip-back pulse in the homonuclear NMR spectroscopy of aqueous solutions (1995) J. Biomol. NMR 5, 327-331

75. Sklenar V. Gradient tailored excitation for single-quantum NMR spectroscopy of aquious solutions (1995) J. Magn. Res. 114,132-135

76. Bartels C., Xia Т., Billiter M., Guntert P., Wuthrich K. The program XEASY for computer-supported NMR spectral analysis of biological macromolecules (1995) J. Biomol. NMR. 6, 1-10

77. Guntert P., Mumenthaler C., Wuthrich K. Torsion angle dynamics for NMR structure calculation with the new program DYANA (1997) J. Mol. Biol. 273,283-298

78. Cornilescu G., Delaglio F., Bax A. Protein backbone angle restraints from searching a database for chemical shift and sequence homology (1999) J. Biomol. NMR 13, 289-302

79. Baker E.N., Hubbard R.E. Hydrogen bonding in globular proteins (1984) Prog. Biophys. Mol. Biol. 44, 97-179

80. Lindahl E., Hess В., van der Spoel D. A package for molecular simulation and trajectory analysis (2001) J. Mol. Mod. 7, 306-31792. van Gunsteren W.F., Berendsen H.J.C. (1987) Gromos-87 manual. Biomos BV, Groningen, the Netherlands

81. Berger O., Edholm O., Jahnig F. Molecular dynamics simulation of a fluid bilayer of dipalmitoylphosphatidulcholine at full hydration, constant pressure and constant temperature (1997) Biophys. J. 72,2002-2013

82. Efremov R.G., Vergoten G. The hydrophobic organization of membrane-spanning -helices as revealed by Monte Carlo simulations and molecular hydrophobicity potential analysis (1995) J. Phys. Chem. 99, 10658-10666

83. Clore G.M., Gronenborn A.M. Application of three and four-dimensional heteronuclear NMR spectroscopy to protein structure determination (1991) Progress in NMR spectr. 23,43-92

84. Wuthrich K. (1986) NMR of Proteins and Nucleic Acids. John Wiley and Sons, New York, USA

85. Wishart D.S., Sykes B.D. Chemical shifts as a tool for structure determination (1994) Methods Enzymol. 239, 363-392

86. Wishart D.S., Sykes B.D., Richards F.M. Relationship between nuclear magnetic resonance chemical shift and protein secondary structure (1991) J. Mol. Biol. 222,311-333

87. Daragan V.A., Mayo K.H. Motional model analyses of protein and peptide dunamics using 13C and 15N NMR relaxation (1997) Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectosc. 31, 63-105

88. Koradi R., Billeter M., Wuthrich K. MOLMOL: a program for display and analysis of macromolecular structures (1996) J. Mol. Graph. 14, 51-32

89. Decoursey Т.Е. Voltage-gated proton channels and other proton transfer pathways (2003) Physiol. Rev. 83, 475-579

90. Kass I., Arkin I.T. How pH opens a H+ channel: the gating mechanism of influenza A M2 (2005) Structure 13,1789-1798

91. Frazier D.P., Wilson A., Graham R.M., Thompson J.W., Bishopric N.H., Webster K.A. Acidosis regulates the stability, hydrophobicity, and activity of the ВНЗ-only protein Bnip3 (2006) Antioxid. Redox. Signal. 8, 16251634

92. Lamy L., Ticchioni M., Rouquette-Jazdanian A.K., Samson M., Deckert M., Greenberg A.H., Bernard A. CD47 and the 19 kDa interacting protein-3 (BNIP3) in T cell apoptosis (2003) J. Biol. Chem. 278, 23915-23921

93. Perl A., Gergely P., Jr., Nagy G., Koncz A., Banki K. Mitochondrial hyperpolarization: a checkpoint of T-cell life, death and autoimmunity (2004) Trends Immunol. 25, 360-367

94. Laskowski R.A., Rullmannn J.A., MacArthur M.W., Kaptein R., Thornton J.M. AQUA and PROCHECK-NMR: programs for checking the quality of protein structures solved by NMR (1996) J. Biomol. NMR 8,477-486