Исследование прионных свойств белка PrP в дрожжах Saccharomyces cerevisiae

Рубель, Александр Анатольевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование прионных свойств белка PrP в дрожжах Saccharomyces cerevisiae
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Исследование прионных свойств белка PrP в дрожжах Saccharomyces cerevisiae"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

РУБЕЛЬ Александр Анатольевич

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРИОННЫХ СВОЙСТВ БЕЛКА РгР В ДРОЖЖАХ БАССНАНОМУСЕБ СЕЛЕУШАЕ

специальность: 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

о 2 опт 2003

Санкт-Петербург 2008

003447502

Работа выполнена в лаборатории генетики животных Санкт-Петербургского государственного университета.

Научный руководитель: профессор, доктор биологических наук

Инге-Вечтомов Сергей Георгиевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Тер-Аванесян Михаил Давидович

доктор биологических наук Сойдла Тыну Рихович

Ведущее учреждение: Московский государственный

университет им. М.В. Ломоносова

Защита состоится 0К\<Л-2008 г. в часов на заседании совета

Д.212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан " "_2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Л.А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Целая группа неизлечимых смертельных заболеваний лекопитающих связана с накоплением в тканях головного мозга высокомолекулярных грегатов белка, получившего название РгР (от Prion Protein). К этой группе относятся: -бчатая энцефалопатия крупного рогатого скота или «Коровье бешенство», «скрэпи» овец, шзнуряющая болезнь» лосей и оленей, а также такие болезни человека, как «Куру», болезнь рейцфельдта-Якоба, фатальная семейная бессонница, болезнь Герстманна-Штрауслера-1ейнкера и другие заболевания. Прионные заболевания могут возникать спонтанно, для екоторых форм выявляется наследственная предрасположенность, кроме того, выделяют нфекционные формы заболеваний (по: Prusiner, 1995).

Согласно гипотезе, выдвинутой Стенли Прусинером, причиной прионных заболеваний является изменение мономерной изоформы белка РгРс (от cellular) на олигомерную изоформу PrPSc (от scrapie). PrPSc является своеобразной матрицей для вновь синтезируемых молекул и может наследоваться (по: Prusiner, 1998). Несмотря на то, что гипотеза Прусинера получила кспериментальные подтверждения и является общепризнанной, факторы, контролирующие прионизацию РгР или блокирующие болезнетворные агрегаты, до сих пор не охарактеризованы. В настоящий момент исследования проводятся в основном на абораторных животных, с использованием клеточных культур, или в системе in vitro, едостатком систем in vivo является значительная длительность, высокая стоимость роводимых экспериментов, и, главное, невозможность проводить масштабный поиск акторов, контролирующих процесс прионизации и амилоидогенеза. В свою очередь, данные, олученные в системе in vitro, не всегда отражают процессы, реально происходящие в живой ierae.

В 1999 году в работе Ма и Линдквист было показано, что продукция мышиного РгР в итоплазме дрожжей приводит к образованию агрегатов, сходных по биохимическим арактеристикам с агрегатам PrPSc, которые выявляются в мозге больных млекопитающих (Ма nd Lindquist, 1999). Дрожжи, как один из самых простых и наиболее изученных генетических бъектов, предоставляют уникальные преимущества для поиска факторов, регулирующих рионнную конверсию РгР. К сожалению, сама по себе агрегация РгР в дрожжах не имеет идимого фенотипического проявления, что существенно затрудняет исследования. Остаётся ткрытым вопрос, проявляют ли полимеры РгР прионные свойства в гетерологичной системе, о есть, способны ли они передавать свою конформацию в ряду клеточных поколений, или бразуются в клетке de novo. В нашей работе мы показали, что агрегаты РгР, а также химерных елков, содержащих последовательность РгР, обладают типичными свойствами амилоидных олимеров. Более того, гибридный белок PrP-GFP формирует в дрожжевых клетках несколько ипов агрегатов, различающихся по морфологическим и физическим свойствам. Для анализа шследования различных типов PrP-содержащих агрегатов нами была разработана система, озволяющая выявлять конформационные изменения РгР на фенотипическом уровне. Мы юказали, что химерный белок, содержащий последовательность РгР, а также репортерную рожжевую последовательность Sup35MC, может быть представлен в дрожжах в двух тьтернативных изоформах [PrPv~] и [prps~], которые стабильно наследуются в ряду еточных поколений. Белок PrP-Sup35MC в изоформе [PrPs~] соответствует всем основных арактеристикам дрожжевого приона. Показано, что шаперон Hspl04, который контролирует лигомеризацию всех известных дрожжевых прионов, не расщепляет РгР-содержащие милоидные агрегаты на олигомерные зёрна. Вместе с тем, выявлена новая функция Hspl04 -частие в регуляции экспрессии генов на посттранскрипционном уровне.

Работа выполнена в лаборатории генетики животных СПбГУ. Отдельные эксперименты ыполнены в Техническом университете Атланты (г. Атланта, США) в лаборатории, озглавляемой Ю.О. Черновым.

Цель н задачи исследования. Целью данной работы является анализ агрегации и оценк прионных свойств белка РгР млекопитающих в дрожжевой системе.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Проанализировать биохимические и физические характеристики агрегатов формируемых белками РгР и PrP-GFP в дрожжах Saccaromyces cerevisiae;

2. Провести цитологический анализ агрегатов PrP-GFP в дрожжевой клетке;

3. Оценить «токсичность» PrP-содержащих агрегатов для дрожжевых клеток;

4. Разработать систему для фенотипического анализа агрегации РгР в дрожжах исследовать возможность прионной конверсии этого белка в гетерологичной системе;

5. Оценить эффекты дрожжевого шаперона Hspl04 на агрегацию белка РгР и РгР содержащих гибридных белков в дрожжевой клетке.

Научная новизна работы. Показано, что при продукции белков РгР и PrP-GFP в дрожж S. cerevisiae образуются высокомолекулярные белковые агрегаты, сходные по биохимически! характеристикам с агрегатами белка РгР в мозге больных млекопитающих (устойчивость действию высоких концентраций протеиназы-К и детергентам (SDS и саркозилат натрия)) Выявлено, что в клетках дрожжей могут формироваться агрегаты, различающиеся п морфологии и динамике восстановления. Агрегаты PrP-GFP имеют цитоплазматическу локализацию и не колокализуются с клеточными компартментами: ядром, митохондриями вакуолью, эндосомами, аппаратом Гольджи, ЭПС. Показано, что агрегаты PrP-GFP, как агрегаты РгР, не токсичны для дрожжевых клеток. Впервые показано, что РгР сохраня прионные свойства в гетерологичной системе. На основании этого можно заключить, что либ факторы, контролирующие прионную конверсию РгР, представлены у эволюционн удалённых эукариотических организмов, либо стабильное воспроизведение прионно" изоформы не требует наличия дополнительных факторов. Продемонстрировано, что Hspl04 н расщепляет агрегаты РгР, PrP-GFP и PrP-Sup35MC на олигомерные зёрна. Вместе с тем, выявлена новая функция дрожжевого шаперона Hspl04 - участие в регуляции экспрессии генов на посттранскрипционном уровне.

Практическая значимость. Использование химерного белка PrP-GFP даёт возможность оценивать с помощью флуоресцентной микроскопии эффект действия отдельных агентов, способствующих или препятствующих агрегации белка РгР. Получена система, позволяющая на фенотипическом уровне (рост - отсутствие роста дрожжей на селективной среде без аденина) наблюдать конформационные переключения последовательности РгР. Данная тест-система может быть использована для масштабного поиска факторов, взаимодействующих с белком РгР или регулирующих его конформационные переключения в системе in vivo. Результаты, представленные в диссертационной работе, могут быть использованы при чтении курсов лекций: «Молекулярная биология», «Молекулярная генетика», «Белки теплового шока», «Прионы», входящих в учебный план кафедры генетики и селекции СПбГУ.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на международных конференциях по прионной биологии (Хингстон, Великобритания, 2005; Турин, Италия, 2006; Эдинбург, Великобритания, 2007); Международных конференциях по генетике и молекулярной биологии дрожжей (Гётеборг, Швеция, 2003; Мельбурн, Австралия, 2007); 3-ем съезде генетиков и селекционеров России «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития», (Москва, 2004); 2-ой конференции Московского общества генетиков и селекционеров «Актуальные проблемы генетики» (Москва, 2003).

Диссертация апробирована на научных семинарах лабораторий генетики животных и физиологической генетики кафедры генетики и селекции СПбГУ.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из «Введения», «Списка сокращений», «Обзора литературы», «Материалов и методов», «Результатов и обсуждения», «Выводов», «Списка литературы», состоящего из 269 источников. Работа изложена на 167 страницах машинописного текста и содержит 39 рисунков и 13 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Штаммы. Характеристика штаммов дрожжей S. cerevisiae, использованных в работе, приведена в табл. 1. В работе были использованы штаммы бактерии Escherichia coli XL1-Blue (Sambrook et al, 19B9) и DH5a (Hanahan, 1985).

Таблица 1. Штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae, использованные в работе

Штамм Генотип Источник

BY4742 MA Ta; his3\-l leu2\-0 lys2\-0 ura3\-0 "1пУ11гокеп" (США)

BY4742(hspl04ü) MATa; his3S-l leu2\-0 lys2\-0 игаЗЛ-0 hsplOr KAbT "¡отйгс^еп" (США)

GT109 ШТаШ1а; SUP35 sup35A~ HIS3; adel-14 adel-14; his3A h¡s3A; leu2-3. 122 leu2-3, Î12; Iys2 lys2, ura3-52 ura3-S2; trpl-289 trpl-289; [PS/"1 [W*l Сметой« о/, 2001

GT111 Производный от GT109 [psi'l |№»П ОмоЯ е! а1,2001

GT113 Производный от GT109 fps;'l \pin~ 1 СЬегпой'его/, 2001

GT159 MATa, ade 1-14; his3A. Ieu2-3,!12, lys2. trplA; ura352. fps/'l [ÍW1 Окто^ « а1,1999

lA-GTlll ШТа, sup35d-:HIS3; adel-14; his3J, Ieu2-3,1I2; lys2, ura3-52, Atrpl-289, [Pcupi-SUP35MC1, [Я/ДГ1, (гаплоидный сегрегаяг штаммаGTlll) Штамм получен в ходе данной работы

1U-1A- GT111 MATa, sup35¿¡ '.HIS3, adel-14, ША; leu2-3,112; fys2, ura3-52; Atrpl-289, [pU-PmP-SUP35MCl, ГЯ/ЛП, (дериват штамма 1A-GTU1) Штамм получен в ходе данной работы

1U-1A-GT111 [PrP*~ ] ШТа, sup35A H1S3, adel-14; his3A, leu2-3,112; fys2; ura3-52, Jtrpl-289, ÍpU-PmP-SUP35MC], [PW'l, (дериватштамма Ш-1А- GTlll) Штамм получен в ходе данной работы

lU-lA-GTlll[prç>'-] ШТа, sup35A:-HlS3, adel-14, his3A; Ieu2-3,1I2, lys2, ura3-52; Atrpl-289, [pU-PmP-SUP35MC], iprp' ] (получен при пассировании штамма 1 U-1 A-GT 111 [PrPs~ ]на среде с ГТХ) Штамм получен в ходе данной работы

I-IU-IA-GT111 {PrPs'\ ШТа, sup3SA H1S3; adel-14; his3A; !eu2-3,I12, 1уь2, ura3-52, Atrpl-289, [pU-PmP-SUP35MC], [РПГ], [PrPs-] (дереват ÎU-IA-GTIII^F5"], полученный за счёт переключения типа спаривания) Штамм получен в ходе данной работы

1 - 1U-1 A-GT 111 [prp"] ШТа, sup35A :HIS3, adel-14, his3A, Ieu2-3,112, tys2; ura3-52, Atrpl-289; [pU-PmP-SUP35MC], Iprp*"] (получен при пассировании штамма 1-lU-lA-GTl 11ГЯ/-ГП на среде с ГГХ) Штамм получен в ходе данной работы

l-lL-lA-GTUl(prp!-] ШТа. sup35A:.HIS3 adel-14 his3A, leu2-3,112, lys2; ura3-S2; Atrpl-289, fpL-PrnP-SUP35MC1, [prp*l Штамм получен в ходе данной работы

7Б-Д901 ШТа, ade2-28, his3A, lys 9-A21, ura3-52; trpl-289, сук", karl-1 Петергофские генетические линии

1Б-Д910 ШТа, sup35A HIS3, adel-14; his3A, Ieu2-3,112; LYS; ura3-52, Atrpl-289, cyh"; karl-1, \rho°l [pU-PmP-SUP35MCl, \PIN~], [prp"] Штамм получен в ходе данной работы

Д920 MATala, uip35A.;H!S3, adel-14 adel-14, hii3d hn3A; leu2-3, 122 leu2-3, 112. Iys2 fys2; ura3-52 ura3-52; trpl-289 trpl-289; [pU-PmP-SUP35MC] [pL-PrnP-SUP35MCl Штамм получен в ходе данной работы

2Г-П2345 ШТа his5 Петергофские генетические линии

78А-П2345 MATahisS Петергофские генетические линии

Плазмиды. Для проведения исследований были использованы коммерческие плазмиды серий pFL (Bonneaud et al, 1991) и pRS (Sikorski and Hieter, 1989). Плазмиды, предоставленные их авторами и полученные в ходе данной работы, представлены в табл. 2.

Среды и условия культивирования. Для культивирования дрожжей использовали стандартные дрожжевые среды (Захаров и др., 1984; Rose et al., 1990; Kaiser et al., 1994). Для элиминации митохондриальной ДНК штаммы пассировали на среде YAPD, содержащей EtBr (200 мг/л). Для отбора цитодуктантов использовали селективные среды YPE или ME, в которых глюкоза заменена на 96° этанол (20 мл/л) и добавлен циклогексимид в концентрации 1мг/л. Для экспрессии конструкций, находящихся под контролем индуцибельного промотора CUP1, в среды добавляли CuS04 в концентрациях от 3 до 150 мкМ. Для культивирования бактерий использовали жидкую и твёрдую среды LB с добавлением ампициллина (50 мкг/мл) (Sambrook et al., 1989).

Дрожжевые штаммы культивировали при температуре 30°С, штаммы бактерий при 37°С.

Название плазчиды Дрожжевой промотор Белок Тип/Маркер Источник

pYEp-Ho НО HO 2 и LLU2 Parentela/ 1985

pcDNA3-3F4 PrP CL\ Naruaand Harris, 1999

pFL39-G AL-HSP104-КТ GAU Hspl04-KT-218,620 ( EN TR PI Wegrzyn et al 2001

PLH105 GPD Hspl04 2ß LF.U2 Lmdquist lab

pmCupl CUPI CBN URA3 Undquist lab

pRS316-Sup35MC SUP35 Sup35MC CF.N URA3 Lewitin

pRS315-Sup35MC SUP35 Sup35MC CEN LFU2 1 evvitin

pRS316CG CUP1 GFP CEN URA3 Liu and Lindciuist, 1999

pFL39-GPD GPD C£V TRI Получена в данной работе

pFL39-GPD-HSP 104-KT GPD Hsp 104 -KT-218,620 CENITRP1 Получена в данной работе

pCUPl-SUP35MC CUP1 Sup35MC ChN URA3 Получена в данной работе

pU-PmP-SUP35MC CUP1 PrP( 90-23 l)-Sup35MC CEN URA3 Получена в данной работе

pL-PmP-SUP35MC CVP1 PrP(90-231 )-Sup35MC CENLCU2 Получена в данной работе

Pcupi -PrP-GFP( LEU2) CUPI PrP(90-231)-GFP 2u LEU2 Получека в данной работе

Pcipi-PrP-GFP(URA3) CUPI PrP(90-231)-GFP 2ß URA3 Получена в данной работе

pL-CUP-PrnP(23-231) CUPl PrP(23-231) 2u Ш12 Получена в данной работе

pRS425CG CUP! GFP 2цШГ2 Получена в данной работе

Pcupi -GFP(URA3) CUPI GFP 2ß URA3 Получена в данной работе

PGPr>-PrP-GFP(URA3) GPD PrP(90-23I)-GFP 2ц URA3 Получена в данной работе

Pc,pd-GFP(URA3) GPD PrP(90-231)-GFP 2u URA3 Получена в данной работе

Примечания СЛ'А^цектромерная пдазмида), 2fi (многокопийная плазмида)

Генетические и микробиологические методы. В работе применял» стандартные методы используемые при работе с дрожжами S cerevisiae (Инге-Вечтомов, 1971, Захаров и др., 1984; Rose с al., 1990). Для элиминации прионоподобных детерминантов и [PSJ] штаммы пассировали

раза на среде YAPD, содержащей 5 мМ гуанидин гидрохлорид.

Цитодукцию проводили дважды согласно методике (Инге-Вечтомов и Карпова, 1984) с рядод небольших модификаций, описанных в диссертации. В обоих случаях штамм-реципиент 1Б-Д91 [f>rp~\, несуший мутацию karl-1, скрещивали со штаммом-донором цитоплазмы 1U-1A-GT111 [РгР ' или, для контроля, со штаммом 1U-1A-GT11 \[prps'\ на среде YAPD. Все среды, использованные данном эксперименте, содержали 100 мкМ CuS04.

Тетрадный анализ проводили под микроскопом '"Carl Zeiss" (Германия), использу микроманипулятор Ergaval Series 10 "Carl Zeiss" (Германия) Трансформацию дрожжей проводили п стандартной методике с использованием ацетата лития (Rose et al., 1990).

Молекулярно-биологическне методы. В работе использовали стандартные методы генной инженерии (Маниатис и др , 1984). Выделение плазмидной ДНК из дрожжей S cerevisiae проводили по стандартной методике (Kaiser, et al., 1994). Амплификацию фрагментов мышиного гена Ргп проводили методом полимеразной цепной реакции (Sambrook et al., 1989) в термоциклере Ампли-24П "ШОКОМ S.J." (Польша), используя термостабильн) ю полимеразу Pfü Последовательности праимеров к фрагментам гена РгпР приведены в табл. 3.

Название Нуклеотидная последовательность

PrnP(90-231)BamHIF 5'-gttcatggatcctatatgtctcaaggagggggtacccat

PrnPBamHIR 5cccggatccttatcagctggatcttctcccgtcgta

PrnPSaclIR 5'-gggccgcggttatcagctggatcttctcccgtcgta

PrnPSacíR 5'-gcttaggggagctcttatcagctggatcttctcccgtcg

PrnP(23-231 )BamHIF 5'-gcgtacccggatcctatatgtctaaaaa.gc

РНК выделяли с использованием реагента Тризол (TRI Reagent) "Sigma" (США), согласно протоколу прои ¡водителя. Реакцию обратной транскрипции со случайными гексануклеотидными праймерами проводили по протокол} производителя, используя набор реактивов РЕВЕРТА (ФГУН ЦНИИЭ Рослотребпадзора). В качестве контрольной последовательности использовался фрагмент гена ADH1. амплифнцированный с помощью праймеров. ADH1-F 5'-cggtggtcacgaaggtgcc: ADH1-R 5'-gagcggcttgaacagcgtca. Для анализа динамнкп амплификации в режиме реального времени использовали праймеры к участку последовательности GFP. sGFP-F 5'-ccaacacttgtcactactttcacttatggt; sGFP-R 5' -gtgcccaagaatgtttccatcttct. В качестве зондов TaqMan использовали последовательности ДНК, комплементарные участкам внутри амплифициру емых последовательностей ADH1-Cy5 5'-

tcgtgggtgtaaccagacaagtcagcgtga (флуорохром Cy5, i аситель RTQ-2), sGFP-ROX 5'-tttcaagagtgccatgcccgaaggttatgt (фл%орохром ROX, гаситель BHQ2). Реакцию проводили в устройстве «АНК-16» ИАнП РАН (Россия).

Выделение белков проводили по методу, описанному (Patiano et al, 1996), с модификациями (Newnam et al, 1996). Клеточный лизат разделяли на осадочную (нерастворимую) и надосадочную фракции центрифугированием при 12000g в течение 30 минут. Оценку размера агрегатов белков PrP-GFP и PrP-Sup35MC, а также анализ их устойчивости к действию SDS, осуществляли с помощью метода полуденатурирующего белкового электрофореза в агарозном геле (Kryndushkin et al., 2003) с модификациями (Bagriantsev et at,, 2006). Для анализа устойчивости белков к действию протеиназы-К (ПК) из дрожжей выделяли суммарный белок, используя буфер TNE (150 мМ NaCl, 50 мМ Трис-НС1, рН7,5,2 мМ ЭДТА). Образцы суммарного белка с ПК, а также контрольный образец без протеиназы К, инкубировали 30 минут при 37°С с добавлением и без добавления 2% саркозилата натрия.

Выравнивание количества суммарного белка в геле, окрашенном «Coommassie blue», и измерение интенсивности специфического сигнала на рентгеновской плёнке проводили с помощью денситометрического анализа, используя программу ImageJ 1.37а. Выравнивание количества суммарного белка, выделенного из ¡Ргг] и [ргр^] штаммов для полу денатурирующего электрофореза, осуществляли согласно протоколу, предложенному Брэдфордом (Bradford, 1976).

Иммунохимическую реакцию осуществляли с использованием первичных моноклональных антител, представленных в таблице 4, и вторичных моноклональных антител к иммуноглобулинам мыши (или к иммуноглобулинам кролика, в случае использования Anti-Sup35C антител), конъюгированными с пероксидазой хрена фирмы "Amersham" (Великобритания). Вторичные антитела детектировали с использованием наборов реактивов "ESL" и "ESL-advanced" фирмы "Amersham" (Великобритания), согласно прилагающейся инструкции.

Таблица 4. Описание антител, использованных в работе

Название антител Источник Концентрация антител, использованная для иммунодетекции

Anti-GFP ЗА9 Любезно предоставлены НС Егоровой «Институт 1 10000

Биоорганической химии» (Россия)

Antl-PrP 6Н4 "Pnonics" (Швейцария) 1 6000

Anti-PrP 3F4 "Sigma" (США) 1 10000

Anti-Sup35C Любезно предоставлены Д Бедвелом (University of 1 2000

Alabama at Birmingham) (США)

Флуоресцентная микроскопия. Флуоресцентный анализ белков, слитых с GFP (Green Fluorescent protein), проводили под флуоресцентным микроскопом Leica DM6000B (Германия). Флуоресценцию анализировали, используя комплект фильтров «GFP» (Leica). Подсчет частоты клеток с агрегатами PrP-GFP проводили на третий день роста трансформантов на твёрдой синтетической среде с необходимыми добавками. Подсчёт осуществляли у восьми независимых трансформантов, для каждого из которых анализировали не менее 400 клеток.

Для детального анализа агрегатов PrP-GFP, их колокализации с клеточными компартментами, а также анализа динамики восстановления флуоресцентного сигнала после фотовыжигания (FRAP), использовали лазерный сканирующий конфокальный микроскоп Leica TCS SP5. Для детекции флуоресценции DAPI и эндосом, окрашенных Liso-tracker Blue, использовали Ar UV лазер 405 и детектировали сигнал в пределах 425-475 нм. Дня детекция вакуолярных мембран, окрашенных SynaptoRed, использовали лазеры DPSS 561, HeNe 633 и 594. Сигнал детектировали в пределах 615758 нм. Для детекции флуоресценции GFP использовали свет длиной волны 488 нм. Размер изменяющегося отверстия конфокальной диафрагмы (Pinhole) устанавливали равный 1 Эйри для каждой длины волны. Дрожжевые вакуоли окрашивали с помощью красителя FM4-64 "Invitrogen" (США) (Meriin et al., 2002). Окраску ядерной и митохондриальной ДНК проводили, используя краситель DAPI "Invitrogen" (США) (Hasek and Streiblova, 1996). Окраску эндосом осуществляли с омощью красителя Liso-tracker Blue "Invitrogen" (США), согласно протоколу производителя.

Анализ токсичности агрегатов белка PrP-GFP для дрожжевых клеток проводили с помощью еста на разведение. Для оценки влияния агрегатов белка PrP-GFP на жизнеспособность дрожжей, етки, содержащие агрегаты и без агрегатов, сортировали при помощи микроманипулятора Micro ideo Instruments, Inc., (США), установленного на флуоресцентный микроскоп Olympus ВХ41 (США).

Статистическая обработка результатов. Частоту передачи фактора [PrPs ] при цитодукции, а акже долю клеток, содержащих агрегаты PrP-GFP, рассчитывали при помощи стандартных методов атематической статистики (у\ «ошибка процента») (Терентьев и Ростова, 1977). Достоверность

отличий частот передачи фактора [PrPs ] путём цитодукции оценивали с помощью критерия Фишера (Плохинский, 1967). Достоверность отличий числа клеток, содержащих агрегаты PrP-GFP на фоне сверхпродукции Hspl04 и в контроле, оценивали при помощи непараметрического критерия Вилкоксона-Мана-Уитни, используя компьютерную программу StatSoft STATISTICA, 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Биохимический анализ агрегатов белков РгР(23-231) и PrP-GFP. Для анализа агрегации белков РгР и PrP-GFP штаммы GT113 \psi~] |pin] и GT109 [РЖ] [PSÍ ] трансформировали плазмидой Р.с up i -PrP-GFP(URA3 ), или плазмидой pL-CUP-PrnP(23-231). В качестве контроля использовали трансформантов, несущих плазмиду с конструкцией Рcupr GFP. Во всех использованных для трансформации плазмвдах экспрессируемые последовательности находились под контролем промотора CUP1. Уровень экспрессии последовательностей под контролем данного промотора зависит от концентрации CuS04 в питательной среде. Для активации промотора CUP1 в селективную среду добавляли 100 мкМ CuSO,.

Белковый экстракт, выделенный из штаммов, продуцирующих белок РгР, PrP-GFP или GFP, разделяли методом дифференциального центрифугирования на надосадочную (растворимую) и осадочную (нерастворимую) фракции. Как видно из рисунка (рис. 1 А,Б)' большая часть белков РгР и PrP-GFP представлена в осадочной фракции, тогда как белок GFP, как и следовало ожидать, детектировался только в растворимой фракции (рис. 15). Следует. отметить, что продукция белков РгР и PrP-GFP привела к формированию агрегатов как в штамме GT113 [psi] [pin], так и в штамме GT109 [PIN'] [PSÍ]. Таким образом, агрегация [ исследуемых белков не зависит от [PIN ] и [PSI ] статуса штаммов.

л г> в Рисунок 1. Анализ агрегации белков (A) PrP-GFP, (Б) РгР, (В)

ргретр w GFP методом дифференциального центрифугирования. Н -

„ о я0 но надосадочная (растворимая) фракция; О - осадочная

(нерастворимая) фракция

Мы провели анализ устойчивости белков РгР и PrP-GFP к действию протеиназы-К. Для этого из штаммов, продуцирующих эти белки, были выделены клеточные лизаты и обработаны протеиназой-К в различных концентрациях (рис. 2А, Б). В качестве контроля протеиназой-К обрабатывали лизаты, содержащие белок GFP (рис. 25). Как видно из данных, представленных на рисунке 2, белок GFP чувствителен к действию ПК в низких концентрациях (5-10 мкг/мкл), тогда как белки РгР и PrP-GFP остаются устойчивыми к действию ПК даже в концентрации 40 мкг/мл. Сходную устойчивость к ПК проявляют агрегаты белка РгР, выявляемые в мозге больных млекопитающих (по: Prusiner et ai, 1998). Устойчивость белков РгР и PrP-GFP к протеиназе К не меняется и в присутствии 2% саркозилата натрия (данные не представлены).

А Б В 1 Рисунок 2. Анализ устойчивости

пк III..... ищи щц linn • ir-.....uro----- «Чф*i белков (А) РгР, (Б) PrP-GFP, (В) GFP к

" г м i i) lb ,у I I . ' ( - 10 ¡ действию протеиназы К (ПК).

Следует отметить, что в работе Ма и Линдквист обработка ПК дрожжевых лизатов, содержащих агрегаты белка РгР(23-231), приводила к образованию протеазоустойчивого фрагмента РгР размером 19-20 кДа (Ma and Lindquist, 1999). Сходный по размеру протеазоустойчивый фрагмент РгР обычно образуется при обработке ПК гомогенатов, выделенных из мозга млекопитающих в случае прионных инфекций (по: Prusiner, 1998). Полученные нами результаты свидетельствуют об устойчивости к ПК полноразмерных белков РгР и PrP-GFP, при этом мы не выявили протеазоустойчивого 19-20 кДа фрагмента РгР. Выявленные отличия могут быть связаны со штаммоспецифическими особенностями дрожжей, например, различиями в активности эндогенных дрожжевых протеаз.

С помощью метода полуденатурирующего электрофореза в агарозном геле и иммуноблотинга с использованием антител к GFP мы показали, что белок PrP-GFP формирует в дрожжевой клетке высокомолекулярные белковые полимеры, устойчивые к действию 2%

SDS. Следует отметить, что полимеры PrP-GFP не детектировались при использовании антител 3F4 против белка РгР. которые, как указано в описании фирмы "Sigma", распознают растворимую изоформу белка РгР и не распознают РгР в протеазоустойчивой прионной конформации (данные не представлены).

Таким образом, белки РгР и PrP-GFP формируют в дрожжевых клетках агрегаты, проявляющие свойства амилоидных белков: устойчивость к действию протеиназы К, саркозилату натрия и SDS.

Цитологическая характеристика агрегатов PrP-GFP. С помощью флуоресцентной микроскопии мы показали, что продукция белка PrP-GFP приводит к формированию в дрожжевых клетках детектируемых, флуоресцирующих гранул (рис. ЗА), в то время как для клеток, содержащих белок GFP, характерно равномерное зелёное свечение (рис. ЗК). При культивировании дрожжей в течение трёх дней на твёрдой селективной среде со 100 мкМ C11SO4 цитологически видимые агрегаты PrP-GFP были отмечены в 17-27% от общего числа проанализированных клеток (табл. 8) (Rubel et al., 2005; Рубель и др., 2008). Выявленные в клетках агрегаты можно разделить по размеру и форме на несколько типов: небольшие агрегаты - «точки», крупные глобулярные структуры - «глобулы», агрегаты в виде колец -«кольца» и лентовидные структуры - «ленты» (рис. ЗА).

А Б

V. о -у V

гпобупы кольцо точки точки/ глобулы лента

щ щ.

Рисунок 4. Колокализация PrP-GFP с вакуолью (красный) и эндосомами (синий).

Рисунок 3. Флуоресцентный анализ белков: (А) РгР-ОРР; (Б) вРР в дрожжах X сетеушае.

При культивировании дрожжей в жидкой селективной среде со 100 мкМ СиЗСЦ количество клеток с агрегатами и тип агрегатов сильно варьировали в зависимости от стадии роста клеточной культуры. Наибольшее количество клеток с агрегатами было выявлено в логарифмической фазе роста культуры (0,5-1 СЮ.595.), при этом встречались преимущественно «точки» и комбинации «точек» и глобулярных структур, тогда как в стационарной фазе роста культуры доля клеток с агрегатами была заметно снижена, и в основном выявлялись клетки, содержащие крупные глобулярные структуры. В нескольких клетках вне зависимости от фазы роста культуры были обнаружены «кольца» или лентовидные структуры (рис.ЗЛ).

Используя флуоресцентные красители, специфичные к отдельным клеточным компартментам, в сочетании с конфокальной микроскопопией мы показали, что агрегаты РгР-ОРР вне зависимости от их морфологии имеют цитоплазматическую локализацию и не ко-локализуются с ядром, митохондриями, эндосомами и вакуолью. В качестве примера на рисунке 4 приведена колокализация РгР-ОРР с эндосомами и вакуолью.

Анализ токсичности агрегатов белка РгР-вГР. Показано, что агрегаты или олигомеры белка РгР в прионной изоформе являются токсичными для нейронов центральной нервной системы и культур клеток нейробластомы млекопитающих (по: е1 я/., 2007). Мы

предположили, что агрегаты белка РгР-ОРР могут оказывать негативный эффект на темпы роста дрожжевых культур или жизнеспособность содержащих их клеток, то есть, проявлять токсический эффект. Токсичность агрегатов белка РгР-ОРР для дрожжей оценивали двумя способами: с помощью теста на разведение и анализа потомства, полученного от индивидуальных клеток, содержащих видимые агрегаты (см. «Материалы и методы»).

Для анализа токсичности агрегатов РгР-ОРР штамм ОТ159 [ртГ^Р/Л^] трансформировали плазмидой РСиР1 -РгР-ОРР(ЬЕШ), или, для контроля, вектором рЯ8425. Полученных трансформантов культивировали в жидкой селективной среде со 100 мкМ Си304 до оптической плотности СЮ.595.=1, после чего делали пять последовательных десятикратных разведений культур в иммунологической планшетке и с помощью репликатора переносили на

селективную среду со 100 мкМ CuS04. Чтобы исключить ошибку разведения, эксперимент1 проводили в четырёх повторностях. Из рисунка 5 видно, что отличий по размеру клонов, а в опытном и контрольном экспериментах не наблюдалось.

РгР GFP

Рисунок 5. Анализ токсичности агрегатов белка PrP-GFP в дрожжах. РгР-Контроль ~ «ерхпродукция белка PrP-GFP; контроль - вектор pRS425.

Во втором эксперименте оценивали способность клеток, содержащих агрегаты белка PrP-GFP, формировать колонии. Штамм GT159 [psï][PIN' ] трансформировали плазмидой Рсирг PrP-GFP(LEU2). Полученных трансформантов культивировали в жидкой селективной среде,: содержащей 100 мкМ C11SO4, до оптической плотности (Ю^.ЮД Затем с помощью микроманипулятора на полную органическую среду со 100 мкМ C11SO4 было отобрано 27 отдельных клеток с видимыми агрегатами PrP-GFP и, для контроля, 35 клеток без видимых агрегатов. В опыте все 27 клеток, содержавшие видимые под микроскопом флуоресцентные гранулы, сформировали в дальнейшем колонии. Из 35 клеток без видимых агрегатов колонии; образовали 32 клетки. Таким образом, двумя различными способами показано, что агрегаты белка PrP-GFP не являются токсичными для дрожжевых клеток.

Поскольку агрегация PrP-GFP не имеет собственного фенотигшческого проявления и, в отличие от поли<3-ОРР и Sup35NM-GFP, не характеризуется токсическим эффектом, мы разработали альтернативную систему, которая позволяет детектировать наследуемые конформационные изменения РгР на фенотипическом уровне (см. следующий раздел).

Анализ эффектов продукции химерного белка PrP-Sup35MC в дрожжах S. cerevisiae. Для получения фенотипического проявления PrP-опосредованной агрегации, а также изучения характера наследования таких агрегатов, мы сконструировали плазмиду, несущую гибридный ген, в котором последовательность, кодирующая мышиный белок РгР с 90 по 231 а.к., слита с последовательностью, кодирующей домены M и С дрожжевого белка Sup35.

На первом этапе работы был получен гаплоидный дрожжевой штамм 1U-1A-GT111, который содержит плазмиду с химерным геном PrnP-SUP35MC под контролем промотора CUP1 на фоне делеции хромосомной копии гена SUP35. Штамм 1U-1A-GT111 несёт нонсенс-мутацию adel-14 и ряд других маркерных мутаций (см. "Материалы и Методы"). Известно, что делеция гена SUP35 приводит к летальным последствиям. Жизнеспособность полученного нами штамма указывает на то, что гибридный белок PrP-Sup35MC способен играть роль фактора терминации трансляции и функционально компенсировать отсутствие нативного белка Sup35. Мы провели анализ уровня супрессии нонсенс-мутации adel-14 в штамме 1U-1A-GTI11. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что эффективность терминации трансляции зависит от уровня продукции химерного белка PrP-Sup35MC. Эффективность терминации трансляции оценивали по темпам роста дрожжей на селективной среде без аденина с добавлением CuS04 в концентрациях 3, 50, 100, 150 мкМ. Результаты анализа приведены в таблице 5.

Таблица 5. Рост штаммов на среде без аденина с различной концентрацией (и8().у

штамм плазмида]

Концентрация 1U-1A-GT111 GT109

CuS04 в [pU-PrnP-SUP35MC] [-]

питательной среде (в мкМ) Начало роста штаммов (в сутках) на среде без аденина

3 2 2

50 5-6 2

100 10-12* 2-3

150 8-10** 2-3

Примечания. *- слабый рост отдельных колоний вторичного роста; ** - активный рост колоний вторичного роста.

Как видно из представленных данных, на среде без аденина с низкой концентрацией Си304 (3 мкМ) штамм Ш-1А-СТ111 демонстрирует рост уже на 2-й день (рис. 6А), что, по-видимому, связано с недостаточным уровнем экспрессии последовательности РгР-811Р35МС

также их количеству,

под контролем промотора CUP1. В этих условиях химерный белок PrP-Sup35MC не может полностью компенсировать функции фактора терминации трансляции Sup35, и нонсенс-кодон adel-14-uoA прочитывается как значащий. При увеличении концентрации CuS04 до 50 мкМ слабый подрост штамма 1U-1A-GT111 на среде-Ade начинается только на 5-6 сутки, при этом клоны приобретают красный цвет, который коррелирует с недостатком в клетке белка Adel (рис. 6Б). При повышении концентрации CuS04 до 100 мкМ рост не наблюдается даже после культивирования на чашках в течение 10 дней (рис. 6В). С помощью «Вестерн-блот» гибридизации мы показали, что увеличение концентрации CuS04 с 3 до 150 мкМ в питательной среде ведёт к закономерному увеличению уровня продукции белка PrP-Sup35MC (Рис. 75). Таким образом, можно заключить, что повышение уровня продукции белка PrP-Sup35MC приводит к повышению эффективности терминации трансляции. Следует также отметить, что замедление темпов роста на среде без аденина связано именно с повышением эффективности терминации трансляции, а не токсическим эффектом CuS04. Как видно из таблицы 5, увеличение концентрации CuS04. с 3 до 150 мкМ не влияет на темпы роста штамма GT109 [PS7+] [PIN*] на селективной среде без аденина.

50 мкМ__А Б В

Ade" Ade,'. Ade* Ade,

• « • • •

• « Ф « ♦

e» & $ <3

Рисунок 6. Рост штамма 1U-1A-GT111 Asup35:\HIS3, несущего плазмиду pU-PrnP-SUP35MC, на селективной среде без аденина содержащей: (А) 3 мкМ CuS04; (Б) 50 мкМ CuS04; (В) 100 мкМ CuS04; (Г) 150 мкМ CuS04.

I 6.S Hi.я 15'

Рисунок 7. (А) Рост дериватов колоний Ade>„ и Ade-на среде без аденина содержащей 100 мкМ CuS04. (Б) Иммунохимический анализ суммарного белка выделенного из колоний Ade ( J и Ade*. (В) изменение уровня продукции белка PrP-Sup35MC в зависимости от концентрации CuS04 в питательной среде. 3, 50, 100 и 150 - концентрация CuS04 в мкМ.

При увеличении концентрации CuS04 до 150 мкМ на среде без аденина на 8-10 день отмечался активный рост отдельных колоний белого и светло-розового цвета (далее обозначаемых Ade cu) (рис. 6Г). Колонии Ade+cu. были отобраны со среды без Ade и клонированы истощающим штрихом на полной среде YAPD, содержащей 100 мкМ CuS04, после чего отсеяны на такую же среду и перенесены методом отпечатков на селективную среду без аденина со 100 мкМ меди. Рост был отмечен на вторые сутки (рис. 7 А). Следует заметить, что на среде со 100 мкМ CuS04 уровень продукции белка PrP-Sup35MC в производных Ade+cu., был таким же, как и в исходных штаммах Ade" (рис. 7Б). Таким образом, отличия по росту на среде без аденина не связаны с изменением уровня продукции белка PrP-Sup35MC. Исходя из полученных результатов, можно заключить, что временное увеличение концентрации CuS04 в 1,5 раза приводит к индукции наследуемой прототрофности по аденину.

Индукция прототрофности по аденину была отмечена и в том случае, когда гаплоидные сегреганты были получены из штаммов GT109 [PST"][WAT1'] и GT113 [psi~]\pin] (результаты не представлены). На основании этих результатов можно сделать вывод, что данный феномен не зависит от присутствия дрожжевых прионов [Р5/+] и [PIN*].

Для объяснения причин появления прототрофности по аденину в колониях Ade*Cu было выдвинуто три предположения.

Индукция прототрофности по аденину вызвана:

1. мутацией, приводящей к нарушению точности терминации трансляции;

2. реверсией нонсенс-мутации adel-14\

3. прионоподобной агрегацией химерного белка PrP-Sup35MC, что приводит к супрессии нонсенс-мутации adel-14.

Для проверки выдвинутых предположений был проведён эксперимент, схема которого

Рисунок 8. Схема последовательных замен плазмид в клонах Л<1е'(и (объяснения в тексте)

приведена ниже (рис. 8).

На первом этапе восемь дериватов колоний' AdeT.Cu трансформировали плазмидой

pRS315-Sup35MC, несущей последовательность! SUP35MC под контролем промотора SUP35. Далее,' на селективных средах были отобраны клоны, несущие плазмиду pRS315-Sup35MC, и. утратившие плазмиду pU-PrnP-SUP35MC. Такие' клоны были протестированы на селективной среде, без аденина. Дериваты четырёх из восьми колоний. Ade+cu, трансформированных плазмидой pRS315-Sup35MC, утратили способность к росту на среде без аденина. Следует упомянуть, что если! бы прототрофность по аденину в колониях Ade <>; была вызвана мутацией в генах, контролирующих точность терминации трансляции, то описанная замена плазмид не повлияла бы на характер; роста штаммов на среде без аденина. Таким образом, наблюдаемая в этих колониях прототрофность по аденину зависит только от присутствия гибридного гена PrnP-SUP35MC и не связана с какой-либо мутацией в геноме. Тем не менее, оставалась вероятность того, 4Toj мутация, приводящая к росту на среде без аденина, проявляется лишь на фоне продукции химерного белка PrP-Sup35MC, или прототрофность по аденину в колониях Ade+Cu связана с мутацией в гибридном гене PrnP-SUP35MC. Для проверки данной возможности мы выделили плазмиду pU-PrnP-SUP35MC из дериватов Ade .Cu. и трансформировали ею гаплоидные штаммы, несущие плазмиду pRS315-Sup35MC. После этого на селективных средах были отобраны клоны, несущие плазмиду pU-PrnP-SUP35MC, и утратившие плазмиду pRS315-Sup35MC. Темпы роста исходных клонов Ade+cu и клонов, полученных в результате эксперимента с заменой плазмид, были проанализированы на селективной среде без аденина со 100 мкМ CuS04.. Рост клонов Ade+cu на среде без аденина, как и следовало ожидать, отмечался уже на вторые сутки, тогда как дериваты, полученные в ходе эксперимента с заменой плазмид, демонстрировали небольшой подрост только на десятые сутки. Полученные в результате замены плазмид колонии генетически идентичны исходным колониям Ade+.CuJ они несут одну и ту же плазмиду pU-PrnP-SUP35MC, однако темпы роста на среде без аденина у этих колоний резко различаются. На основании этих данных можно сделать вывод, что рост на среде без аденина не связан с возникновением мутации в последовательности гибридного гена PrnP-SUP35MC. Исходя из полученных результатов, можно предположить, что возникновение колоний Ade+.Cu связано с прионоподобной агрегацией химерного белка РгР-Sup35MC.

Все известные дрожжевые прионоподобные факторы изгоняются при пассировании штаммов на среде, содержащей 5 мМ гуанидин гидрохлорид (ГГХ) (по: Eaglestone et а!., 2000). В этой связи мы решили проверить эффект ГГХ на прототрофность по аденину в нашей системе. Для этого клоны Ade+<;u. из четырёх независимо полученных колоний три раза пассировали на среде YAPD, содержащей 5 мМ ГГХ, и параллельно на среде YAPD без добавления данного агента. Чтобы убедиться в эффективности работы ГГХ, на тех же средах пассировали штамм GT109 [JP5'/+ ][JP/7V+ ]. После пассирования Ade+cu и штамм GT109 клонировали на среде YAPD, содержащей 100 мкМ CuS04, отбирали клоны и определяли их супрессориый фенотип по способности к росту на селективной среде без аденина с медью.

Пассирование штамма GT109 на среде с ГГХ привело к изгнанию фактора [-РЯ+] примерно у 90-95% клонов, в то время как частота элиминации нонсенс-супрессии у клонов Ade+.Cu, составила 70-90% (Рис. 9).

[PrPst] до пассирования на среде с ГГХ

lprps] a после пассирования на среде с ГГХ

Рисунок 9. Рост дериватов колоний Ас1е+.си на среде без аденина, содержащей 100 мкМ СиЗСЦ, до и после пассирования на среде с гуанидин

гидрохлоридом (ГГХ) (седьмой день роста).

Следует отметить, что при длительном культивировании клонов Ade+Cu эффективность изгнания нонсенс-супрессии на среде с ГГХ значительно снижалась, вплоть до полного отсутствия. По-видимому, это связано с тем, что в клонах AdeT<;u. накапливаются различные супрессорные мутации, приводящие к росту на среде без аденина и, как следствие, маскирующие эффект действия ГТХ. Мы показали также, что при повторной сверхпродукции |белка PrP-Sup35MC в штаммах, обработанных ГГХ и утративших после этого способность расти на среде без аденина, наблюдается повторная индукция колоний Ade+Cu. На основании полученных данных мы предположили, что рост гаплоидов на среде без аденина обусловлен наличием в клетках прионной изоформы белка PrP-Sup35MC, названной нами [PrPs ] ("S+" -suppression plus). Обработка ГТХ приводит к элиминации прионных агрегатов и возникновению альтернативной конформации [prps"\ ("s-" - suppression minus), которая наследуется в ряду клеточных поколений.

Биохимический анализ белка PrP-Sup35MC из |/,г/>—I и \vw~I штаммов. Одним из 'свойств прионов, и, в частности, белка РгР в прионной изоформе, является способность формировать высокомолекулярные агрегаты, которые, в большинстве случаев, проявляют (повышенную устойчивость к действию протеиназы К (по: по Prusiner, 1998). Если наше предположение о взаимосвязи нонсенс-супрессии в штаммах [PrPs+] с прионоподобной агрегацией белка PrP-Sup35MC верно, то следовало ожидать, что в штаммах [РгР%+\ и [ргр%~] 1белок PrP-Sup35MC будет отличаться по уровню агрегации и (или) по устойчивости к действию протеиназы-К. Чтобы сравнить уровень агрегации белка PrP-Sup35MC в штаммах ÎPrJ°s+] и \prps'] было использовано два подхода - метод дифференциального центрифугирования и анализ агрегатов с помощью метода полуденатурирующего электрофореза в агарозном геле (см. «Материалы и методы»). Суммарный белок из штаммов [РгР ] и |ргр^] разделили с помощью метода дифференциального центрифугирования на |растворимую надосадочную и нерастворимую осадочную фракции. Методом «Вестерн-блот гибридизации» с моноклональными антителами к белку РгР мы показали, что в штаммах [/Y/*^] и \prps'\ белок PrP-Sup35MC представлен как в осадочной, так и надосадочной фракциях. Различий по соотношению белка PrP-Sup35MC в осадочной, так и надосадочной фракциях выявлено не было: большая часть химерного белка в обоих штаммах находилась в надосадочной, а меньшая - в осадочной фракции (рис. ¡0.4). В то же время, анализ лизатов, выделенных из штаммов [РгР3 ] и [prps~], с помощью метода полуденатурирующего электрофореза в агарозном геле позволил выявить отличия в агрегации между двумя штаммами (рис. 1ОБ). Как видно из рисунка 10£ в штамме [PrPs'] выявляются как зысокомолекулярные так и низкомолекулярные агрегаты, тогда как в штамме \prps'] тетектируются преимущественно небольшие полимеры PrP-Sup35MC.

н о н о

au о

полимеры

S+ ». s+

Рисунок 10. Биохимический анализ белка РгР-ЭирЗбМС, выделенного из штаммов [РгР^] и [ргр'~]. (А) Иммунохимический анализ белка РгР-5ир35МС, выделенного из штаммов [РгРи [ргр'~] и разделённого методом дифференциального

центрифугирования. Н - надосадочная фракция; О -осадочная фракция. (Б) Иммунохимический анализ суммарного белка, выделенного из штаммов [РгР*~] и [ргр*~] и разделённого методом полуденатурирующего электрофореза в агарозном геле. (В) Иммунохимический анализ суммарного белка, вьиеленного из штаммов [РгР5'] и [ргр'~] и обработанного различными концентрациями протеиназы-К (ПК). 0, 5, 10, 20 -концентрация ПК; Э+ - белок из гаплоидного штамма [РгР5 ]; - белок из гаплоидного штамма [ргр'~].

•мономеры

Для сравнения устойчивости белка PrP-Sup35MC из штаммов [ргр5'] и [PrPs] к действш нротеиназы-К были выделены клеточные лизаты и обработаны протеиназой-К концентрациях 5, 10, 20 мкг/мл (см. «Материалы и методы»). После этого лизаты был исследованы с помощью «Вестерн-блот» гибридизации. Полученные результаты показали, чт белок PrP-Sup35MC из штамма [PrPs~ ] более устойчив к действию протеиназы-К в сравнени с PrP-Sup35MC из штамма [ргр ] (Рис. 105).

Характер наследования Фактора \РгРЩ в мейозе и возможность его передачи путё цитодукции. Одной из важнейших характеристик прионов, отличающей их от други амилоидных белков, является способность передавать свою конформацию и поддерживать её ряду клеточных поколений (Prusiner 1982; Wickner, 1994). Мы предположили, что агрегат* белка PrP-Sup35MC в штамме [PrPs] обладают прионными свойствами и в этой связи, как все известные дрожжевые прионы, должны передаваться путём цитодукции и проявлят неменделевское наследование при расщеплении в мейозе.

Для анализа характера наследования фактора [PrPi+] в мейозе штамм [PrPs+], содержащш плазмиду pU-PmP-SUP35MC, скрестили со штаммом [ргр*~], несущем плазми ■ pL-PrnP-SUP35MC. Полученные диплоиды в большинстве случаев демонстрировали слабы рост на среде без аденина, в присутствии 100 мкМ C11SO4, но утрачивали нонсенс-супресси после нескольких последовательных пассажей. Этот результат свидетельствует нестабильной передаче фактора [/VPS] в ряду клеточных поколений у диплоидных штаммов Поскольку белок PrP-Sup35MC образует различные по биохимическим характеристика агрегаты в штаммах [РгР ] и [ргр*'), мы полагаем, что митотическая нестабильность нонсенс супрессии в диплоидном штамме связана с конкуренцией между изоформами [PrPs+] и [ргр*' белка PrP-Sup35MC и частичным доминированием изоформы [prps']. Сходная картин наблюдается при скрещивании сильного и слабого вариантов [PSI~]. В диплоидных клетках полученных от такого скрещивания, доминирующей является более стабильный - сильны" вариант [Р5Г] (Bradley et al., 2002).

Учитывая высокую нестабильность наследования фактора [PrPs+] в присутствии изоформы [ргр*'], диплоидные штаммы, полученные от скрещивания гаплоидов [/WSf] и [ргр5'], сразу пересевали на среду для споруляции. Полученных гаплоидных сегрегантов анализировали с помощью тетрадного анализа. Как видно из данных, представленных в таблице 6, в тетрадах с высокой частотой происходит гибель аскоспор. Так, среди 42 проанализированных тетрад все четыре клетки выжили в 6, а три клетки - в 15 случаях. Среди 105 проанализированных аскоспор только 18 росли на среде без аденина, содержащей 100 мкМ C11SO4, то есть проявляли [РгР^-фенотип (табл. 6). В тетрадах с 4 жизнеспособными аскоспорами соотношение Ade+:Ade" {[PrPs ]'.[prps~]) было 0:4 или 1:3 (табл. 6), что указывает на нехромосомный характер наследования фактора Низкая эффективность передачи

фактора вероятно, связана с частичным доминированием изоформы [ргр*~\ в

цитоплазме диплоидных клеток.

Таблица 6. Тетрадный анализ диплоидных штаммов, полученных путем скрещивания штаммов [РгР~] и |ргр"]

Количество аскоспор 8 тетраде Общее количество гетрад Соотношение Ade* Ade" б тетрадах Количество Ade+ Lei/ Ura" аскоспор

4 3 04 0

4 3 1 3 1

3 5 03 0

3 9 1 2 2

3 1 2 1 1

2 3 1 1 0

2 12 02 0

1 1 1 0 0

1 5 0 I 0

Среди 18 аскоспор с Аёе+ фенотипом четыре содержали плазмиду рЬ-РгпР-8иР35МС, полученную от гаплоидного штамма [ргр'"]. Кроме того, в Ade+Leu+Ura+ клонах, содержащих плазмиды от обоих родителей, элиминация плазмиды р1!-РгпР-5иР35МС не приводила к элиминации Айе+ фенотипа. Эти данные ещё раз подтверждают то, что фенотип [РгР5'] не обусловлен мутацией в плазмиде ри-РтР-5иР35МС.

В контрольном эксперименте диплоидные клетки, полученные от скрещивания двух

штаммов [ргр4"], не демонстрировали роста на среде без аденина. В тетрадном анализе таких диплоидов среди 120 проанализированных, аскоспор не было выявлено ни одной с фенотипом Ade . Таким образом, наши данные подтверждают нехромосомный .характер наследования фактора [PrPs ] в мейозе.

Одним из характерных свойств дрожжевых лрионов является возможность их передачи путём цитодукции - передачи цитоплазмы без переноса ядра в результате слияния клеток (Захаров и др.. 1977; Conde and Fink, 1976). Для исследования возможности цитоплазмагической передачи фактора [РгР4 ] мы провели два независимых эксперимента по цитодукции с рядом методических модификаций.

В первом эксперименте было поставленно 123 независимых скрещивания донорного штамма [РгР5 ] с реципиентным штаммом [ргр*~]. О переносе цитоплазмы в штамм-реципиент свидетельствовало появление дыхательной компетентности на селективной для цитодуктантов среде. Продукты каждого скрещивания были клонированы истощающим штрихом. Для анализа использовали по четыре субклона, полученных в результате каждого независимого скрещивания. Из 123 независимых цитодуктантов семь демонстрировали рост на селективной среде без аденина, содержащей 100 мкМ CuS04 (табл. 7 и рис. 11).

Цитодуктант Ade

Контроль [PrP's ]

цитодуктанты

¡Контроль \ргр'~]

Рисунок 11. Анализ роста на среде -Ade + 100 мкМ CuSOj цитодуктантов, полученных от скрещивания реципиентного штамма [ргр""] с донорным штаммом [РгР' ].

Для того чтобы подтвердить, что Ade^-фенотип цитодуктантов обусловлен передачей фактора [РгР'' ], дрожжи пассировали на среде с добавлением гидрохлорида гуанидина. Было показано, что после пассирования на данной среде шесть цитодуктантов утратили способность к росту на среде без аденина (рис. 12). Мы выдели суммарный белок у одного из шести Ade+ цитодуктантов и обработали его протеиназой-К. Белок PrP-Sup35MC, выделенный из Ade' цитодуктанта, так же как и белок PrP-Sup35MC из штаммов [РгР*]. обладал повышенной устойчивостью к действию протеиназы К (данные не представлены).

Во втором эксперименте из 300 независимо полученных цитодуктантов 17 демонстрировали рост на среде без аденина со 100 мкМ CuS04 (табл. 7). Таким образом, данные, полученные в ходе двух независимых экспериментов, позволяют сделать заключение о том, что фактор [РгР ] передаётся при цитодукции с частотой примерно 5-6% (табл. 7).

до пассирования на среде с ГГХ

после пассирования на среде с ГГХ

Рисунок 12. Анализ роста [Р/-Р'у"]-цитодуктантов на среде без аденина до и после пассирования на среде с ГГХ

В контрольном эксперименте анализировали цитодуктантов, полученных от скрещивания

штамма-реципиента [prpy | представленных в табл. 7,

фенотипом Ade'. Эти данные свидетельствуют передачей, а не индукцией фактора [РгРь~ ] de novo.

с донорным штаммом [ргрКак видно из данных, среди полученных цитодуктантов не выявлено ни одного с

о том, что Ade'-фенотип обусловлен

Эксперимент № Штамм- Суммарное Количество Частота передачи

донор количество 1Штод\'Ктантов фактора[РгР~ ] путём

цитодуктантов \РгР*" 1 ЦИТОДУКЦИИ в (°'о)

Í/VPS*I 123 б 4.9 t 1.95

i ГРФП 108 0 0

\РгР»\ 300 17 5,7±1,34

2 [ргр"] 298 0 0

Тот факт, что фактор [РгР* | наследуется как неменделевский детерминант и передаётся

при цитодукции, подтверждает нашу гипотезу о его прионной природе.

Влияние сверхпродукции и инактивации дрожжевого шаперона Hspl04 на факто \РгР~\. В ходе данной работы мы показали, что нонсенс-супрессия в штаммах \PrP~~ элиминируется при пассировании на среде с гидрохлоридом гуанидина - агенто\ способствующим элиминации дрожжевых прионных агрегатов (Eaglestone et al., 2000 Эффект ГГХ на дрожжевые прионы, по всей вероятности, обусловлен ингибированием АТФ азной активности Hspl04, необходимой для расщепления прионных агрегатов (Ferreira et al 2001). Из литературных данных известно, что инактивация или деления шаперона HsplO приводит к элиминации дрожжевых прионов [-PST], [Ш*] и [URA3] (Chernoff et al., 199' Moriyama et al., 2000; Derkatch, 2001). Сверхпродукция Hspl04 также приводит к элиминаци1 фактора [PSP] (Chernoff et al., 1995). Мы решили оценить влияние инактивации сверхпродукции Hspl04 на фактор [PrPs ].

Для изучения влияние инактивации шаперона Hspl04 на агрегацию белка PrP-Sup35M(j штамм [PrPs ] был трансформирован плазмидой pFL39-GAL-HSP104-KT, содержаще; мутантный вариант гена HSP104 под контролем промотора GALI. Мутация Hspl04-KT-218,62. имеет доминантный эффект и приводит к инактивации всего клеточного пула Hspl04 (Chernoi et al., 1995). Индивидуальные трансформанты были отобраны на селективной среде, поел; чего, для активации промотора GAL1, выросшие клоны были перенесены методом отпечатко, на селективную среду, содержащую галактозу и 100 мкМ CuS04. После трез последовательных пассажей на указанной среде с галактозой клоны были перепечатаны н; среду без аденина, содержащую 100 мкМ CuS04. В контрольном эксперименте оценивалоа влияние экспрессии мутантного белка Hspl04 на штамм [PSI J. Временная инактиваций Hspl04 привела к практически полной элиминации [PSF] (результат не представлен), тогд; как влияния Hspl04 на фактор [PrPs' ] отмечено не было (рис. 13).

Рисунок 13. Рост гаплоидного штамма [PrPs~ \ на селективной среде без аденина содержащей 100 мкМ CuS04, до (А) и после (Б) временной инактивации белка HspI04.

Для оценки влияния сверхпродукции шаперона Hspl04 на фактор [РгР ' ] мь трансформировали штамм [РгР ] плазмидой pLH105, несущей ген HSPI04 под контролер конститутивного промотора GPD. В качестве контроля штамм [PrPs~\ трансформировал!-: плазмидой pRS315, не содержащей HSPI04. Чтобы убедиться в эффективности работы плазмиды pLH105, мы трансформировали данной плазмидой штамм GT109 [PS! ]. Эффекты сверхпродукции Hspl04 оценивали в соответствии с темпами роста штаммов [РгР 1 и [PST] на среде без аденина, содержащей 100 мкМ CuS04. В контрольном эксперименте, как и ожидалось, в большей части проанализированных клонов была отмечена элиминация фактора [/'S/-], в то время как в опыте сверхпродукция Hspl04 привела к незначительному снижению темпов роста штамма [PrPs~\ на среде без аденина с медью (рис. 14А,Б). После потери плазмид pLH105 и pRS425 темпы роста дериватов [PrPs~\ выравнивались (рис. 145). Таким! образом, сверхпродукция шаперона Hspl04 не приводит к изгнанию фактора [/V/'5"], однако' на фоне продукции данного шаперона происходит незначительное снижение темпов роста штамма [PrPs~ ] на селективной среде без аденина с медью.

Рисунок 14. Рост гаплоидного штамма [PrPs"\ на селективной среде без аденина, содержащей 100 мкМ CuSOi, на фоне (А), до (Б) и после (В) сверхпродукции белка Hspl04.

Таким образом, мы показали, что ни инактивация, ни сверхпродукция шаперона Пэр 104 не приводят к элиминации нонсенс-супрессии в штамме [РгР5 ].

Эффекты шаперона Н8р104 на агрегацию белков РгР и РгР-ОРР в дрожжах.

Проведённые нами эксперименты показали, что на фоне сверхпродукции шаперона Нзр104 отмечается незначительное снижение уровня нонсенс-супрессии в штамме [РгР5"\. Для более детального исследования эффектов шаперона №р104 на РгР-опосредованную агрегацию было

решено использовать конструкцию, содержащую ген РгР-йБР под контролем промотора С1]Р1. Такой подход позволяет визуализировать агрегаты на фоне изменения уровня продукции шаперона.

Штамм, продуцирующий белок РгР-ОРР под контролем промотора С11Р1, был трансформирован плазмидой рШ105 для сверхпродукции шаперона НБрКМ. В контрольном эксперименте штамм, продуцирующий белок РгР-вРР, трансформировали плазмидой рЯ5425, несущей соответствующий маркерный ген, но не содержащей НБР104. С помощью флуоресцентной микроскопии (см. «Материалы и методы») было подсчитано число клеток с агрегатами РгР-ОРР в опытном и контрольном штаммах. Как видно из таблицы 8, на фоне сверхпродукции НэрКМ доля клеток с цитологически видимыми агрегатами РгР-СРР увеличилась примерно в два раза. Достоверность отличий оценивалась с помощью критерия Вилкоксона-Мана-Уитни, значение которого составило 3,36 (р=0,00078).

Таблица 8. Частоты клеток с агрегатами PrP-GFP при сверхпродукции Hspl04 и в контроле

№ трансформанта Сверхпродукиия HsplQ4 Норма

Всего проанализиро-вано клеток % клеток с агрегатами Всего проанализировано клеток % клеток с агрегатами*

1 418 43 06±2,42 725 20 97±1,51

т 764 38 74±1,76 699 18 31±1,46

3 985 31 98±1,49 655 18 67±1,52

4 872 37 84±1,64 793 17 78±1,36

5 527 5029±2,18 580 27 59±1,86

6 473 46 94±2,29 538 21 93±1,78

7 1134 47 88±1,48 412 20 15±1,98

8 1122 55 35±1,48 730 23 56±1,57

Примечание/ - % клеток с агрегатами указан с учётом ошибки процента.

С помощью биохимического анализа мы показали, что сверхпродукция Hspl04 приводит к увеличению количества белка PrP-GFP в дрожжевой клетке (рис. 15/1). Увеличение количества белка PrP-GFP на фоне сверхпродукции Hspl04 стабильно воспроизводится при разном уровне активации промотора CUP1 (рис. 15Г). Важно отметить, что соотношение белка в растворимой и осадочной фракции существенно не меняется (рис. 15А) и, следовательно, Hspl04 не расщепляет полимеры PrP-GFP на олигомеры или мономеры. Сходным образом сверхпродукция Hspl04 позитивно регулирует продукцию белков GFP и РгР под контролем промотора CUP1 (рис. 15/1). Белок GFP, в отличие от РгР и PrP-GFP, не способен к агрегации в дрожжах и, таким образом, можно заключить, что эффект действия шаперона не связан со способностью исследуемых белков к агрегации. Этот результат выглядит неожиданно, так как в современной литературе Hspl04 принято рассматривать исключительно как белок, обеспечивающий расщепление неструктурированных белковых конгломератов, а также, прионных агрегатов (по: Jones and Tuite, 2005).

Далее мы оценили влияние сверхпродукции белка Hspl04 с нарушенной АТФ-азной активностью (далее Hspl04-KT) и делеции HSP104 на белок PrP-GFP. Увеличение экспрессии мутантной копии шаперона, также как и сверхэкспрессия интактной последовательности HSPI04, привело к увеличению количества белка PrP-GFP примерно в два раза, в сравнении с контролем (рис. 155). Таким образом, Hsp 104-опосредованная позитивная регуляция кспрессии не зависит от АТФ-азной активности шаперона. Как видно из рисунка 155, на фоне елеции HSP104 происходит снижение количества белка PrP-GFP. Сходные эффекты свехпродукция Hspl04-KT и делеция HSPJ04 оказывают и на белок GFP под контролем промотора CUP1 - свехпродукция Hsp 104-KT увеличивает, а делеция HSP104 снижает его оличество (данные не представлены). Таким образом, Hspl04 позитивно регулирует родукцию белков PrP-GFP и GFP при экспрессии соответствующих последовательностей под онтролем промотора CUP1. Из этого следует, что незначительное снижение темпов роста в гамме [РгР при сверхпродукции Hsp 104 может быть связано с увеличением количества белка rP-Sup35MC при его продукции под контролем промотора CUPI, а не с влиянием данного аперона на агрегацию.

Рисунок 15. Анализ эффектов Hspl04 при экспрессии последовательное! ей PrP-GFP и (.-/*'/' под контролем промотора СИР! Для активации промотора CUP/ во всех экспериментах (кроме рис. 15.Г1 в среду добавляли ЮОцМ CuS04- (Л) Влияние сверхпродукции Hspl04 на количество белков PrP-GFP, РгР и GFP в дрожжевой клетке. (Б) Влияние сверхпродукции мутантного варианта шалерона Hspl04KT218,620 с инактивированной АТФ-азной активностью на концентрацию белка PrP-GFP. (В) Влияние делеции гена HSP104 на количество белка PrP-GFP. wt -штамм с нормальным уровнем продукции Hspl04; |Hspl04 и |Hspl04KT218,620 - свехпродукция Hspl04 или его мутантной копии Hspl04K.T218,620; Hspl04A - деления гена! HSP104. (Г) Эффект сверхпродукции Hspl04 при разном! уровне экспрессии последовательности PrP-GFP под! контролем промотора CUPL j

На следующем этапе исследования мы решили проверить, будет ли Hspl04 оказывать! влияние на уровень экспрессии тех же последовательностей под контролем другого! промотора GPD, или эффекты специфичны только для последовательностей под контролем1, промотора CUP1. Иммунохимический анализ показал, что при экспрессии) последовательностей PrP-GFP или GFP под контролем промотора GPD сверхэкспрессия гена| HSP104, или его мутантной копии с инактивированной АТФ-азной активностью, вызывает' уменьшение количества исследуемых белков (рис. 16А и 165). Делеция HSP104 приводит к увеличению количества белка PrP-GFP в случае экспрессии этой гибридной последовательности под контролем промотора GPD (рис. 165). Можно предположить, что I влияние Hspl04 на регуляцию уровня продукции белков связано с наличием ионов меди в питательной среде, однако добавление в питательную среду 3-х, 100 и 150 мкМ CuS04 не влияет на результат (данные не представлены). На основании полученных результатов можно заключить, что Hspl04 регулирует количество исследуемых белков в дрожжевой клетке, причём позитивная или негативная направленность действия шаперона зависит исключительно от того, под контролем какого промотора находятся кодирующие их гены.

Рисунок 16. Анализ эффектов Hspl04 при Pri -GFP экспрессии последовательностей PrP-GFP и GFP т ««с-« под контролем промотора GPD. (А) Влияние сверхпродукции Hspl04 на количество белков ¡.с 1 a PrP-GFP и GFP в дрожжевой клетке. (Б) Влияние тшт щнг сверхпродукции мутантного варианта шаперона Hspl04KT218,620 с инактивированной АТФ-азной активностью на концентрацию белка PrP-GFP. (В) Влияние делеции гена IISP104 на количество белков PrP-GFP и GFP.

Исходя из полученных результатов, можно было допустить, что Hspl04 контролирует) уровень транскрипции последовательностей, находящихся под контролем промоторов CUP 1 и ( GPD. Для проверки этого предположения с помощью метода ПЦР в реальном времени был ; проведён сравнительный анализ количества мРНК PrP-GFP и GFP на фоне нормального уровня продукции Hspl04 и при сверхпродукции этого шаперона. Соотношение количества копий исследуемых мРНК в контроле и опыте не различается (табл. 9).

Таблица 9. Сравнительный анализ количества мРНК последовательностей PrP-GFP и GFP при изменении уровня j продукции шаперона Hspl04____

промотор ген да' ЛДСГ 2-.ua"'

Сверхпродукция Hspl04 норма

CUP1 PrP-GFP 0.18±0,141 0.25±0,069 0.07 1.050

GFP 0.34±0,!34 0.30±0,035 0,03 1.021

GPD PrP-GFP 1,23±0,796 1.28±0,835 0,05 1.035

ДО - разница значений пороговых циклов мРНК контрольного гена АОН1 и исследуемого гена ДДО - разница значений Л С! в норме и на фоне сверхпродукции 11ьр 104

2 иа _ соотношение количества копий исследуемых мРНК в норме и на фоне сверхпродукции Н5рЮ4

* л'! * .

Л !\

PfP-OfP

С у SO,

f VA f HSDK« fT. 'f rHpH^

Относи ren ьк» ciifwana

PrP-GFP GFP PrP-GFP

wt f Nsp>04 wt f Н5Ы04 ^ fHip!04

I КТ21Ш0

IS 03 10 0.3 1,0 04

интенсивность

О ткосите пьиая

итемеман! сигнала

но но

Из представленных в таблице данных следует, что сверхпродукция Hspl04 не влияет на количество мРНК последовательностей PrP-GFP и GFP, транскрибирующихся под контролем промоторов CUP 1 и GPD.

Таким образом, Hspl04 регулирует экспрессию исследуемых последовательностей на стадии трансляции или на посттрансляционном уровне, но не расщепляет амилоидные агрегаты РгР и PrP-GFP, которые, в отличие от дрожжевых прионов, не содержат аспарагин-глутамин обогащенных последовательностей.

Заключение. На основании полученных результатов можно заключить, что нами впервые показана прионоподобная агрегация белка РгР в гетерологичной системе, разработаны подходы для анализа факторов, регулирующих конформационные изменения приона млекопитающих, и охарактеризована новая функция дрожжевого шаперона Hspl04 -регуляция экспрессии генов на посттранскрипционном уровне.

ВЫВОДЫ

1. Белки РгР и PrP-GFP формируют в дрожжах амилоидоюдобные агрегаты, сходные по биохимическим характеристикам с агрегатами PrPSc в мозге больных млекопитающих.

2. Белок PrP-GFP формирует в дрожжах несколько типов агрегатов, которые различаются по физическим и морфологическим свойствам, имеют цитоплазматическую локализацию, и не ко-локализуются с вакуолями, эндосомами, митохондриями и ядром.

3. Агрегаты РгР и PrP-GFP не токсичны для дрожжевых клеток.

4. Разработана система для фенотипического анализа PrP-опосредованной агрегации химерного белка PrP-Sup35MC, который выполняет функции фактора терминации трансляции eRF3.

5. Химерный белок PrP-Sup35MC может быть представлен в дрожжах в двух альтернативных изоформах [РгР5*] и [рф1], которые стабильно наследуются в ряду клеточных поколений. Белок PrP-Sup35MC в изоформе [PrPs~\ соответствует всем основным характеристикам дрожжевого приона и имеет повышенную устойчивость к воздействию протеиназы-К.

6. Дрожжевой шаперон Hspl04 не расщепляет агрегаты РгР, PrP-GFP и PrP-Sup35MC на олигомерные зёрна и не контролирует передачу прионного фактора [РгР5*] в ряду клеточных поколений.

7. Вьивлена новая функция шаперона Hspl04 - регуляция экспрессии генов на посттранскрипционном уровне.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Галкин А П, Марков А В , Рубель А.А , Наволоцкая В В Создание тест системы для скрининга факторов блокирующих агрегацию белка РгР // Материалы 2-й конференции московского общества генетиков и селекционеров им НИ Вавилова,Москва, 2003 Т 2 С 111-112

2 Рубель A.A. Поиск белков и химических агентов, регулирующих и блокирующих прионизацию белка РгР // Девятая СПб ассамблея молодых ученых и спец-в Тез докл конф СПб, 2004 С 38

3 Рубель А.А, Сайфитдинова А Ф, Лада А Г, Нижников АА, Инге-Вечтомов С Г, Галкин АП Дрожжевой шаперон Hsp 104 регулирует экспрессию генов на посттранскрипционном уровне//Мол биол,2008 T 42 №1 С. 123-130

4 Цапонина О, Галкин А , Рубель А, Наволоцкая В, Лада А , Петрова И , Марков А, Смирнов А, Инге-Вечтомов С Исследование амилоидных белков млекопитающих в дрожжевой системе // III съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров России «Генетика в ХМ веке современное состояние и перспективы развития» Тез докл конф Москва, 2004 Т 2 С 372

Galkin А Р , Rubel А.А, Navolotskaya V V , Markov А V., Chernov Y О, Inge-Vechtomov S G, Smimov A F The test-system for phenotypic detection of PrP aggregation in yeast // Abstracts of the XXI International Conference on Yeast Genetics and molecular Biology, Yeast, 2003 20(S1) P 18-19 б Nizhnikov AA, Rubel AA, Saifitdmova AF, Lada AG, Urazalinov MM The chaperone Hsp 104 new (Unction changing the protein amount //18 European Student's Conference, 7-12 October, 2007 Europ J of med research, 2007 V 12 S4 P 23

Rubel A , Saifitdmova A, Lada A , Petrova I, Chernoff Y, Inge-Vechtomov S , Galkin A Chaperone Hsp 104 affects the mammalian amyloids aggregation m yeast // Joint Cold Spring Harbor LaboratoryAVellcome Trast Conference Prion Biology Hinxton, UK, 2005 P 71

Saifitdmova A, Rubel A, Lada A , Inge-Vechtomov S , Galkin A Evidance of amyloid nature of Aß-GFP and PrP-GFP fusion proteins expressing m yeast // Materials of XXIII international confirence on yeast genetics and molecular biology, Melbourne, Australia, 1-6 July 2007, Yeast, 24 SI-SI 75 P S124

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рубель, Александр Анатольевич

Список сокращений.

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Прионы млекопитающих.

1.1.1. История открытия прионов и прионная концепция.

1.1.2. Экспериментальные данные, подтверждающие прионную концепцию.

1.1.3. Механизм прионизации.

1.1.4. Структурные особенности и функции белка РгР.

1.1.5. Формы прионных заболеваний.

1.1.6. Штаммы PrPSc.

1.1.7. Механизмы транспорта PrPSc.

1.1.8. Механизм, лежащий в основе нейродегенерации.

1.1.9. Детекция прионных заболеваний на ранних стадиях.

1.1.10. Подходы к терапии и потенциальные лекарства от прионных болезней.

1.2. Прионоподобные факторы низших эукариот.

1.2.1. Белок Ure2 - Фактор [ URE3].

1.2.2. Белок Sup35 - фактор

1.2.3. Структурные особенности прион-формирующих доменов дрожжевых прионов.

1.2.4. Фактор [PZ/V4"] и взаимодействие прионов.

1.2.5. Варианты дрожжевых прионов.

1.2.6. Влияние шаперонов и других белков на дрожжевые прионы.

1.3. Дрожжи как модель для исследования амилоидозов млекопитающих.

2. Материалы и методы.

2.1. Штаммы и плазмиды, использованные в работе.

2.1.1. Штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae и бактерии Escherichia coli.

2.1.2. Плазмиды.

2.2. Среды и условия культивирования.

2.3. Генетические методы.

2.4. Молекулярно-биологические методы.

2.5. Выделение белка из дрожжей.

2.6. Дифференциальное центрифугирование.

2.7. Анализ устойчивости белков к действию протеиназы-К.

2.8. Белковый электрофорез и «Вестерн-блот» гибридизация.

2.9. Флуоресцентная микроскопия.

2.9.1. Метод флуоресцентного анализа агрегатов PrP-GFP.

2.9.2. Окраска компартментов дрожжевой клетки флуоресцентными красителями.

2.9.3. Восстановление флуоресценции после фотовыжигания (FRAP).

2.10. Анализ токсичности агрегатов PrP-GFP.

2.11. Статистическая обработка результатов.

3. Результаты.

3.1. Анализ агрегации белков РгР и PrP-GFP в дрожжах.

3.1.1. Биохимический анализ агрегатов белков РгР(23-231) и PrP-GFP.

3.1.2. Цитологическая характеристика агрегатов белка PrP-GFP.

3.1.3. Расчет доли мобильной фракции (Mf) для агрегатов PrP-GFP.

3.1.4. Анализ токсичности агрегатов белка PrP-GFP.

3.2.1. Конструирование дрожжевого штамма, продуцирующего химерный белок PrP-Sup35MC, на фоне делеции хромосомной копии гена SUP35.

3.2.2. Анализ эффектов продукции химерного белка PrP-Sup35MC в дрожжах S.cerevisiae.

3.2.3 Биохимический анализ белка PrP-Sup35MC из штаммов [РгР5"1"] и prps'].

3.2.4. Влияние сверхпродукции белков РгР и PrP-GFP на агрегацию РгР-Sup35MC.

3.2.5. Характер наследования фактора [РгР54] в мейозе и возможность его передачи путём цитодукции.

3.3. Эффекты дрожжевого шаперона Hspl04 на РгР-опосредованную агрегацию в дрожжах.

3.3.1. Влияние сверхпродукции и инактивации дрожжевого шаперона Hspl04 на фактор [РгР*+].

3.3.2. Эффекты шаперона Hspl04 на агрегацию белков РгР и PrP-GFP в дрожжах.

4. Обсуждение.

4.1. Характеристика агрегатов белков РгР и PrP-GFP.

4.2. Биохимический и фенотипический анализ агрегации и характер наследования PrP-Sup35MC в дрожжах S. cerevisiae.

4.3. Новая функция шаперона Hsp 104.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование прионных свойств белка PrP в дрожжах Saccharomyces cerevisiae"

Актуальность проблемы. Целая группа неизлечимых смертельных заболеваний млекопитающих связана с накоплением в тканях головного мозга высокомолекулярных агрегатов белка, получившего название РгР (от Prion Protein). К этой группе относятся: губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота или «Коровье бешенство», «скрэпи» овец, «изнуряющая болезнь» лосей и оленей, а также, такие болезни человека как «Куру», болезнь Крейцфельдта-Якоба, фатальная семейная бессонница, болезнь Герстманна-Штрауслера-Шейнкера и другие заболевания. Прионные заболевания могут возникать спонтанно, для некоторых форм выявляется наследственная предрасположенность, кроме того, выделяют инфекционные формы заболеваний (по: Prusiner, 1995).

Согласно гипотезе выдвинутой Стенли Прусинером, причиной прионных заболеваний является превращение мономерной протеазочуствительной конформации белка РгРс (от cellular) в олигомерную PrPSc (от scrapie) изоформу, устойчивую к воздействию температуры, химических агентов и протеолитических ферментов. Такая аномальная конформация белка является своеобразной матрицей для вновь синтезируемых молекул и может наследоваться (по: Prusiner, 1998). Несмотря на то, что гипотеза Прусинера получила экспериментальные подтверждения и является общепризнанной, факторы, контролирующие прионизацию РгР или блокирующие болезнетворные агрегаты, до сих пор не охарактеризованы. В настоящий момент исследования проводятся в основном на лабораторных животных, с использованием клеточных культур или в системе in vitro. Недостатком вышеперечисленных подходов, проводимых в системе in vivo, является значительная длительность, высокая стоимость проводимых экспериментов, и, главное, невозможность проводить масштабный поиск факторов, контролирующих процесс прионизации и амилоидогенеза. В свою очередь, данные, полученные в системе in vitro, не всегда отражают процессы, реально происходящие в живой клетке.

В 1999 году в работе Ма и Линдквист, было показано, что продукция мышиного РгР в цитоплазме дрожжей приводит к образованию агрегатов, сходных по биохимическим характеристикам с агрегатами РгР, выявляемыми в мозге больных млекопитающих (Ma and Lindquist, 1999). Дрожжи, как один из самых простых и наиболее изученных генетических объектов, предоставляют уникальные преимущества для поиска факторов, регулирующих прионнную конверсию РгР. К сожалению, сама по себе агрегация РгР в дрожжах не имеет видимого фенотипического проявления, что существенно затрудняет исследования. Остаётся открытым вопрос, проявляют ли полимеры РгР прионные свойства в гетерологичной системе, то есть, способны ли они передавать свою конформацию в ряду клеточных поколений, или образуются в клетке de novo.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы является анализ агрегации и оценка прионных свойств белка РгР млекопитающих в дрожжевой системе.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. проанализировать биохимические и физические характеристики агрегатов, формируемых белками РгР и PrP-GFP в дрожжах Saccharomyces cerevisiae;

2. провести цитологический анализ агрегатов PrP-GFP в дрожжевой клетке;

3. оценить «токсичность» PrP-содержащих агрегатов для дрожжевых клеток;

4. разработать систему для фенотипического анализа агрегации РгР в дрожжах и исследовать возможность прионной конверсии этого белка в гетерологичной системе;

5. оценить эффекты дрожжевого шаперона Hspl04 на агрегацию белка РгР и PrP-содержащих гибридных белков в дрожжевой клетке.

Научная новизна работы. Показано, что при продукции белков РгР и PrP-GFP в дрожжах S. cerevisiae образуются высокомолекулярные белковые агрегаты, сходные по биохимическим характеристикам с агрегатами белка PrPSc в мозге больных млекопитающих (устойчивость к действию высоких концентраций протеиназы-К и детергентам (SDS и саркозилат натрия)). Показано, что агрегаты PrP-GFP различаются по размеру и морфологии. Установлено, что в клетках дрожжей могут формироваться агрегаты, различающиеся по морфологии и динамике восстановления. Агрегаты PrP-GFP имеют цитоплазматическую локализацию и не колокализуются с клеточными компартментами: ядром, митохондриями, вакуолью, эндосомами. Показано, что агрегаты PrP-GFP, как и агрегаты РгР, не токсичны для дрожжевых клеток. Впервые показано, что РгР сохраняет прионные свойства в гетерологичной системе. На основании этого можно заключить, что: либр факторы, с контролирующие прионную конверсию РгР, представлены у эволюционно удалённых эукариотических организмов, либо стабильное воспроизведение прионной изоформы не требует наличия дополнительных факторов. Показано, что Hspl04 не расщепляет агрегаты РгР, PrP-GFP и PrP-Sup35MC на

V. олигомерные зёрна. Вместе с тем, выявлена новая функция дрожжевого шаперона Hspl04 — участие в регуляции экспрессии генов на посттранскрипционном уровне.

Практическая значимость. Использование химерного белка PrP-GFP даёт возможность оценивать с помощью флуоресцентной микроскопии эффект действия отдельных агентов, способствующих или препятствующих агрегации белка РгР. Получена система, позволяющая на фенотипическом уровне (рост -отсутствие роста дрожжей на селективной среде без аденина) наблюдать конформационные переключения последовательности РгР. Данная тест-система может быть использована для масштабного поиска факторов, взаимодействующих с белком РгР или регулирующих его конформационные переключения в системе in vivo. Выявлена новая функция дрожжевого шаперона Hspl04. Результаты, представленные в диссертационной работе, могут быть использованы при чтении курсов лекций: «Молекулярная биология», «Молекулярная генетика», «Белки теплового шока», «Прионы», «Механизмы модификаций», входящих в учебный план кафедры генетики и селекции СПбГУ.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на международных конференциях по прионной биологии (Хингстон, Великобритания, 2005; Турин, Италия, 2006; Эдинбург, Великобритания, 2007); Международных конференциях по генетике и молекулярной биологии дрожжей (Гётеборг, Швеция, 2003; Мельбурн, Австралия, 2007); 3-ем съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития», (Москва, 2004); 2-ой конференции Московского общества генетиков и селекционеров «Актуальные проблемы генетики» (Москва, 2003).

Диссертация апробирована на научных семинарах лаборатории генетики животных и лаборатории физиологической генетики кафедры генетики и селекции СПбГУ.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из «Введения», «Списка сокращений», «Обзора литературы», «Материалов и методов», «Результатов» «Обсуждения», «Заключения», «Выводов», «Списка литературы», состоящего из 269 источников. Работа изложена на 167 страницах машинописного текста и содержит 39 рисунков и 13 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Рубель, Александр Анатольевич

выводы

1. Белки РгР и PrP-GFP формируют в дрожжах амилоидоподобные агрегаты, сходные по биохимическим характеристикам с агрегатами PrPSc в мозге больных млекопитающих.

2. Белок PrP-GFP формирует в дрожжах несколько типов агрегатов, которые различаются по физическим и морфологическим свойствам, имеют цитоплазматическую локализацию, и не ко-локализуются с эндосомами, вакуолями, митохондриями и ядром.

3. Агрегаты РгР и PrP-GFP не токсичны для дрожжевых клеток.

4. Разработана система для фенотипического анализа РгР-опосредованной агрегации химерного белка PrP-Sup35MC, который выполняет функции фактора терминации трансляции eRF3.

5. Химерный белок PrP-Sup35MC может быть представлен в дрожжах в двух альтернативных изоформах - [РгР^] и \prps~~[, которые стабильно наследуются в ряду клеточных поколений. Белок PrP-Sup35MC в изоформе соответствует всем основным характеристикам дрожжевого приона и имеет повышенную устойчивость к воздействию протеиназы-К.

6. Дрожжевой шаперон Hspl04 не расщепляет агрегаты PrP, PrP-GFP и РгР-Sup35MC на олигомерные зёрна и не контролирует передачу прионного фактора [РгР5"1"] в ряду клеточных поколений.

7. Выявлена новая функция шаперона Hspl04 - регуляция экспрессии генов на посттранскрипционном уровне.

БЛАГОДАРНОСТИ

В заключение хотел бы выразить искреннюю признательность научным руководителям Сергею Георгиевичу Инге-Вечтомову и Алексею Петровичу Галкину за неоценимую помощь в выполнении работы на всех этапах, всем сотрудникам, студентам и аспирантам лаборатории генетики животных и кафедры генетики и селекции, в целом, за создание дружественной атмосферы и помощь в работе, особенно, Алсу Сайфитдинову, Викторию Наволоцкую, Сергея Задорского, Юлию Сопову, Елену Андрееву, Артёма Ладу, Вениамина Старцева, Ирину Петрову, Антона Нижникова, а также, сотрудника Технического Университета (Атланта, США) - Юрия Олеговича Чернова за плодотворное сотрудничество.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В нашей работе мы показали, что агрегаты РгР, а также химерных белков, содержащих последовательность РгР, обладают типичными свойствами амилоидных полимеров. Более того, гибридный белок PrP-GFP формирует в дрожжевых клетках несколько типов агрегатов, различающихся по морфологическим и физическим свойствам. Для анализа наследования различных типов PrP-содержащих агрегатов нами была разработана система, позволяющая выявлять конформационные изменения РгР на фенотипическом уровне. Мы показали, что химерный белок, содержащий последовательность РгР, а также, репортерную дрожжевую последовательность Sup35MC, может быть представлен в дрожжах в двух альтернативных изоформах [PrPs+] и \prps~\, которые стабильно наследуются в ряду клеточных поколений. Белок РгР-Sup35MC в изоформе [PrPS+] соответствует всем основных характеристикам дрожжевого приона. Показано, что шаперон Hspl04, который контролирует олигомеризацию всех известных дрожжевых прионов, не расщепляет РгР-содержащие амилоидные агрегаты на олигомерные зёрна. Вместе с тем, выявлена новая функция Hspl04 - участие в регуляции экспрессии генов на посттранскрипционном уровне.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рубель, Александр Анатольевич, Санкт-Петербург

1. Галкин А.П., Миронова Л.Н., Журавлева Г.А., Инге-Вечтомов С.Г. Прионы дрожжей, амилоидозы млекопитающих и проблема протеомных сетей. // Генетика. 2006. - Т. 42. № 11. - С. 1-13.

2. Завалишин И.А., Шитикова И.Е., Жученко Т.Д. Прионы и прионные болезни // Клин, микробиол. и антимикроб, химиотерап. 2000. — Т. 2. - №2. - С. 12— 19.

3. Захаров И.А., Кожин С.А., Кожина Т.Н., Фёдорова И.В. Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов. Л.: Наука. 1984. - 143 с.

4. Зуев В.А. Прионы новый класс возбудителей инфекционных заболеваний // Антибиотики и химиотерапия. - 1999. - №10. - С. 33-38.

5. Инге-Вечтомов С.Г. Идентификация некоторых групп сцепления у Петергофских генетических линий дрожжей // Генетика. 1971. - Т. 7. - С. 113-124.

6. Инге-Вечтомов С.Г. Цитогены и прионы: цитоплазматическая наследственность без ДНК? // Соросовский образов, журнал. 1996. - №5. -С. 11-18.

7. Инге-Вечтомов С.Г., Андрианова В.М // Рецессивные суперсупрессоры у дрожжей // Генетика. — 1970. Т. 6. — С. 103-116.

8. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Молекулярное клонирование: Перевод с англ. М: Мир. 1984. - 479 с.

9. Плохинский Н.А. Алгоритмы биометрии. М.: изд-во МГУ. — 1967. 26 с.

10. Ю.Рубель А.А., Сайфитдинова А.Ф., Лада А.Г., Нижников А.А., Инге-Вечтомов

11. С.Г., Галкин А.П. Дрожжевой шаперон Hspl04 регулирует экспрессию генов на посттранскрипционном уровне // Мол. биол. 2008. - Т. 42. - №1. — С. 123-130.

12. Телков М.В., Сургучев А.П. Характеристика транскриптов генов supl и sup2 у дрожжей сакхаромицетов // Докл. Акад. Наук СССР. 1986. — Т. 290. -№4.

13. Терентьев П. В., Ростова Н.С. Практикум по биометрии. JL: изд-во ЛГУ. — 1977.-152 с.

14. Шкундина И.С., Тер-Аванесян М.Д. Прионы // Успехи биол. химии. 2006. -Т. 46.-С. 3-42.

15. Штейн Г.И. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия: методическое пособие микроскопия СПб: ИНЦ РАН. - 2004. - 32 с.

16. Abid К., Soto С. The intriguing prion disorders // Cell. Mol. Life Sci. 2006. -Vol. 63.-P. 2342-2351.

17. Aguzzi A., Heppner F.L. Pathogenesis of prion diseases: a progress report // Cell Death Differ. 2000. - Vol. 7. - №10. - P. 889-902.

18. Aguzzi A., Polymenidou M. Mammalian prion biology: one century of evolving concepts // Cell. 2004. - Vol. 116. - №2. - P. 313-327.

19. Aguzzi A., Sigurdson C., Heikenwalder M. Molecular mechanisms of prion pathogenesis // Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis. 2008. - Vol. 3. - P. 11-40.

20. Alper Т., Cramp W.A., Haig D.A., Clarke MC. Does the agent of scrapie replicate without nucleic acid? // Nature. 1967. - Vol. 214. - P. 764-766.

21. Apetri A.C., Maki К., Roder H., Surewicz W.K. Early Intermediate in Human Prion Protein Folding As Evidenced by Ultrarapid Mixing Experiments // J. Am. Chem. Soc.-2006.-Vol. 128.-P. 11673-11678.

22. Apetri A.C., Surewicz W.K. Kinetic intermediate in the folding of human prion protein // J. Biol. Chem. 2002. - Vol. 277. - P. 44589-44592.

23. Apodaca J., Kim I., Rao H. Cellular tolerance of prion protein PrP in yeast involves proteolysis and the unfolded protein response // Biochem Biophys Res Commun. -2006. Vol. 347. - №1. - P. 319-326.

24. Bagriantsev S., Liebman S.W. Specificity of prion assembly in vivo. PST^. and [PIPt] form separate structures in yeast // J Biol Chem. 2004. - Vol. 279. -№49.-P. 51042-51048.

25. Bagriantsev S.N., Kushnirov V.V., Liebman S.W. Analysis of amyloid aggregates using agarose gel electrophoresis // Methods Enzymol. — 2006. Vol. 412. - P. 33-48.

26. Bainbridge J., Walker K.B. The normal cellular form of prion protein modulates T cell responses // Immunol. Lett. 2005. - Vol. 96. - №1. - P. 147-150.

27. Bartz J.C., Dejoia C., Tucker Т., Kincaid A.E., Bessen R.A. Extraneural prion neuroinvasion without lymphoreticular system infection // J. Virol. 2005. - Vol. 79. — P. 11858-11863.

28. Bartz J.C., Kramer M.L., Sheehan M.H., Hutter J.A., Ayers J.I., Bessen R.A., Kincaid A.E. Prion interference is due to a reduction in strain-specific PrPSc levels. J. Virol. 2007. - Vol. 81. - P. 689-697.

29. Baskakov I.V. The reconstitution of mammalian prion infectivity de novo I IFEBS J. 2007. - Vol. 274. - P. 576-587.

30. Bate C., Salmona M., Diomede L., Williams A. Squalestatin cures prion-infected neurons and protects against prion neurotoxicity // J. Biol. Chem. 2004. - Vol. 279.-№15.-P. 14983-14990.

31. Bessen RA, Marsh RF. Distinct PrP properties suggest the molecular basis of strain variation in transmissible mink encephalopathy // J Virol. 1994. - Vol. 68. -№12.-P. 7859-7868.

32. Blattler Т., Brandner В., Raeber A.J. Klein M.A., Voigtlander Т., Weissmann C., Aguzzi A. PrP-expressing tissue required for transfer of scrapie infectivity from spleen to brain // Nature. 1997. - V. 389. - P. 69-73.

33. Bolton D.C., Bendheim P.E., Marmorstein A.D., Potempska A. Isolation and structural studies of the intact scrapie agent protein // Arch Biochem Biophys. — 1987 Vol. 258. - №2. - P. 579-590.

34. Bonneaud N., Ozier-Kalogeropoulos O., Li G.Y., Labouesse M., Minvielle-Sebastia L., Lacroute F. A family of low and high copy replicative, integrative and single-stranded S. cerevisiae/E. coli shuttle vectors // Yeast. 1991. - Vol. 7. - P. 609-615.

35. Bons N., Mestre-Frances N., Belli P., Cathala F., Gajdusek D.C., Brown P. Natural and experimental oral infection of nonhuman primates by bovine spongiform encephalopathy agents // Proc Natl Acad Sci USA. 1999. - Vol. 96. -P. 4046-4051.

36. Borchsenius A.S., Wegrzyn R.D., Newnam G.P., Inge-Vechtomov S.G., Chernoff Y.O. Yeast prion protein derivative defective in aggregate shearing and production of new "seeds" // EMBO J. 2001. - Vol. 20. - №2. - P. 6683-6691.

37. Bosl В., Grimminger V., Walter S. The molecular chaperone Hspl04 a molecular machine for protein disaggregation // J Struct Biol. - 2006. - Vol. 156. -№1. - P. 139-148.

38. Brachmann A., Baxa U., Wickner R.B. Prion generation in vitro: amyloid of Ure2p is infectious // EMBO J. 2005. - Vol. 24. - №17. - p. 3082-3092.

39. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. - Vol. 72. - P. 248-254.

40. Bradley M.E., Edskes H.K., Hong J.Y., Wickner R.B., Liebman S.W. Interactions among prions and prion "strains" in yeast // Proc Natl Acad Sci USA. 2002. -Vol. 99.-P. 16392-16399.

41. Bradley M.E., Liebman S.W. Destabilizing interactions among PSf. and [P/TV*] yeast prion variants //Genetics. 2003. - Vol. 165. - №4. - P. 1675-1685.

42. Brown D.R, Qin K, Herms J.W., Madlung A., Manson J., Strome R., Fraser P.E., Kruck Т., von Bohlen A., Schulz-Schaeffer W., Giese A., Westaway D., Kretzschmar H. The cellular prion protein binds copper in vivo // Nature. 1997. -Vol. 390.-P. 684—687.

43. Brown D.R., Hafiz F., Glasssmith L.L., Wong B-S., Jones I.M., Clive C., Haswell S.J. Consequences of manganese replacement of copper for prion protein function and proteinase resistance // EMBO. 2000. - Vol. 19. - P. 1180-1186.

44. Brown D.R., Nicholas R.S., Canevari L. Lack of prion protein expression results in a neuronal phenotype sensitive to stress // J. Neurosci. Res. — 2002. Vol. 67. — P. 211-224.

45. Brown J.C., Lindquist S.L. GAR+.: a novel type of prion involved in glucose signaling and environmental sensing // Yeast genetics and molecular biology meeting University of Toronto, Ontario, Canada. 2008. — P. 73.

46. Buchholz C.J., Bach P., Nikles D., Kalinke U. Prion protein-specific antibodies for therapeutic intervention of transmissible spongiform encephalopathies // Expert Opin Biol Ther. 2006. - Vol. 6. - №3. - P. 293-300.

47. Bueler H., Fischer M., Lang Y., Bluethmann H., Lipp H.P., DeArmond S.J., Prusiner S.B., Aguet M., Weissmann C. Normal development and behavior of mice lacking the neuronal cell-surface PrP protein // Nature. 1992. — Vol. 356. — P. 577-582.

48. Caramelli M., Ru G., Acutis P., Forloni G. Prion diseases: current understanding of epidemiology and pathogenesis, and therapeutic advances // CNS Drugs. — 2006. Vol. 20. - № 1. - P. 15-28.

49. Castilla J., Saa P., Hetz C., Soto C. In vitro generation of infectious scrapie prions //Cell. 2005. - Vol. 121.-№2. -P. 195-206.

50. Caughey B, Raymond GJ, Bessen RA. Strain-dependent differences in beta-sheet conformations of abnormal prion protein // J Biol Chem. 1998. -V. 273. - №48. -P. 32230-32235.

51. Caughey В., Baron G.S. Prions and their partners in crime // Nature. 2006. - Vol. 443.-№19.-P. 803-810.

52. Caughey В., Caughey W.S., Kocisko D.A. Lee K.S., Silveira J.R., Morrey J.D. Prions and Transmissible Spongiform Encephalopathy (TSE) Chemotherapeutics: A Common Mechanism for Anti-TSE Compounds? // Acc. Chem. Res. 2006. -Vol. 39.-P. 646-653.

53. Caughey B.W., Dong A., Bhat K.S. Ernst D., Hayes S.F., Caughey W.S. Secondary structure analysis of the scrapie-associated protein PrP 27-30 in water by in-frared spectroscopy // Biochemistry. 1991. - Vol. 30. - P. 7672-7680.

54. Chernoff Y.O. Amyloidogenic domains, prions and structural inheritance: rudiments of early life or recent acquisition? Curr Opin Chem Biol. 2004. - Vol. 8.-P. 665-671.

55. Chernoff Y.O. Mutation processes at the protein level: Is Lamarck back? // Mutat Res. 2001. - Vol. 488. - P. 39-64.

56. Chernoff Y.O., Galkin A.P., Lewitin E., Chernova T.A., Newnam G.P., Belenkiy S.M. Evolutionary conservation of prion-forming abilities of the yeast Sup35 protein // Mol Microbiol. 2000. - Vol. 35. - №4. - P. 865-876.

57. Chernoff Y.O., Lindquist S.L., Ono В., Inge-Vechtomov S.G., and Liebman S. W. Role of the chaperone protein Hsp 104 in propagation of the yeast prion-like factor PST. // Science. 1995. - Vol. 268. - P. 880-884.

58. Chernoff Y.O., Newnam G.P., Kumar J., Allen K., Zink A.D. Evidence for a protein mutator in yeast: role of the Hsp70-related chaperone ssb in formation, stability, and toxicity of the PS7. prion // Mol.Cell Biol. 1999. - Vol. 19. - P. 8103-8112.

59. Choi C. J., Kanthasamy A., Anantharam V., Kanthasamy A.G. Interaction of metals with prion protein: Possible role of divalent cations in the pathogenesis of prion diseases // NeuroToxicology. 2006. - Vol. 27. - P. 777-787.

60. Ciechanover A., Brundin P. The ubiquitin proteasome system in neurodegenerative diseases: sometimes the chicken, sometimes the egg // Neuron. 2003. - Vol. 40. - №2. - P. 427-446.

61. Cohen F.E., Pan K.M., Huang Z. Structural clues to prion replication // Science. -1994.-Vol. 264.-P. 530-531.

62. Cohen F.E., Prusiner S.B. Pathologic conformations of prion proteins // Annu. Rev. Biochem. 1998. - Vol. 67. - P. 793-819.

63. Collin P., Beauregard P.B., Elagoz A., Rokeach L.A.A non-chromosomal factor allows viability of Schizosaccharomyces pombe lacking the essential chaperone calnexin // J Cell Sci. 2004. - Vol. 117. - P. 907-918

64. Conde J., Fink G.R. A mutant of Saccharomyces cerevisiae defective for nuclear fusion // Proc Natl Acad Sci USA. 1976. - Vol. 73. - №10. - P. 3651-3655.

65. Coustou V., С. Deleu, S. Saupe and J. Begueret. The protein product of the het-s heterokaryon incompatibility gene of the fungus Podospora anserina behaves as a prion analog // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - Vol. 94. - P. 9773-9778.

66. Cox B.S. PS7., a cytoplasmic suppressor of super-suppressor in yeast // Heredity. 1965. - Vol. 20. - P. 505-521.

67. Cuille J., Chelle P.L. Experimental transmission of trembling to the goat // C. R. Seances Acad. Sci. 1939. - Vol. 208. - P. 1058-1060.

68. Cuille J., Chelle P.L. Pathologie animale. La maladie dite tremblant du mouton estelle inoculable? // Compt. Rend. Acad. Sci. 1936. - Vol. 203. - P. 1552-1554.

69. Dandoy-Dron F., Bogdanova A., Beringue V., Bailly Y., Tovey M.G., Laude H., Dron M. Infection by ME7 prion is not modified in transgenic mice expressing the yeast chaperone Hspl04 in neurons // Neurosci Lett. 2006. - Vol. 405. - №3. -P.181-185.

70. Deleault N.R., Lucassen R.W., Supattapone S. RNA molecules stimulate prion protein conversion // Nature. 2003. - Vol. 425. - №6959. - P. 717-720.

71. DePace AH, Santoso A, Hillner P, Weissman JS. A critical role for amino-terminal glutamine/asparagine repeats in the formation and propagation of a yeast prion// Cell. 1998. - Vol. 93. -№7. - P. 1241-1252.

72. Derkatch I.L, Chernoff Y.O., Kushnirov V.V., Inge-Vechtomov S.G., Liebman S.W. Genetics and variability of PSI. prion factors in Sacchoromyces cerevisiae II Genetics. 1996. - Vol. 144. -P. 1375-1386.

73. Derkatch I.L., Bradley L., Zhou M.P., Chernoff Y.O., S.W. Liebman. Genetic and environmental factors affecting the de novo appearance of the PSI*. prion in Saccharomyces cerevisiae И Genetics. 1997. - Vol. 147. - P. 507-519.

74. Derkatch I.L., Bradley M.E., Hong J.Y., Liebman S.W. Prions affect the appearance of other prions: the story of Р/Л^. // Cell. -2001. Vol. 106. - №2. -P. 171-182.

75. Derkatch I.L., Bradley M.E., Masse S.V., Zadorsky S.P., Polozkov G.V., Inge-Vechtomov S.G., Liebman S.W. Dependence and independence of PST4". and [PIN*]: a two-prion system in yeast? // EMBO J. 2000. - Vol. 19. - №9. - P. 1942-1952.

76. Derkatch I.L., Liebman SW. Prion-Prion interactions, edited by Chernoff Y.O. // Medical Intelligence Unit/ Landes Bioscience. Protein-based inheritance. 2007. -P. 39-46.

77. Dickinson A. G., Meikle V. M. H., Fraser H. Identification of a gene which controls the incubation period of some strains of scrapie in mice // J. Сотр. Path. 1968. - Vol. 78. - P. 293-299.

78. Eaglestone S.S., Ruddock L.W., Cox B.S., Tuite M.F. Guanidine hydrochloride blocks a critical step in the propagation of the prion-Hke determinant P57 . of Saccharomyces cerevisiae // Proc Natl Acad Sci USA. 2000. - Vol. 97. - P. 240-244.

79. Fai Мок S.W., Thelen K.M., Riemer C., Baier M. Simvastatin prolongs survival times in prion infections of the central nervous system // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006. - Vol. 348. - №2. - P. 697-702.

80. Fernandez-Bellot E., Guillemet E., Baudin-Baillieu A., Gaumer S., Komar A.A., Cullin C. Characterization of the interaction domains of Ure2p, a prion-like protein of yeast // Biochem J. 1999. - Vol. 338. - Pt.2. - P. 403-407.

81. Fernandez-Bellot E., Guillemet E., Cullin C. The yeast prion URE3. can be greatly induced by a functional mutated URE2 allele // EMBO J. 2000. - Vol. 19.-№13.-P. 3215-3222.

82. Ferreira P.C., Ness F., Edwards S.R., Cox B.S., Tuite M.F. The elimination of the yeast PS/ . prion by guanidine hydrochloride is the result of Hspl04 inactivation // Mol.Microbiol. 2001. - Vol.40. - P. 1357-1369.

83. Frolova L., Le Goff X., Zhouravleva G., Davydova E., Philippe M., Kisselev L. Eukaiyotic polypeptide chain release factor eRF3 is an eRFl- and ribosome-dependent guanosine triphosphatase // RNA. 1996. - Vol. 2. - №4. - P. 334341.

84. Gabriel J.M., Oesch В., Kretzschmar H., Scott M.? Prusiner S.B. Molecular cloning of a candidate chicken prion protein // Proc Natl Acad Sci USA. 1992. -Vol. 89.-№19.-P. 9097-9101.

85. Gajdusek D.C. Transmissible and non-transmissible amyloidoses: autocatalytic post-translational conversion of host precursor protein to beta-pleated sheet configurations // J. Neuroimmunol. 1988. - Vol. 20. - P. 95-110.

86. Gajdusek D.C., Gibbs C.J., Alpers M. Experimental transmission of a kuru- like syndrome to cnimpanzees // Nature. 1966. - Vol. 209. - P. 794-796.

87. Gajdusek D.C., Zigas V. Degenerative disease of the central nervous system in New Guinea: The endemic occurrence of "kuru" in the native population //N Engl J Med. 1957. - Vol. 257. - P. 974-978.

88. Gallie D.R., Sleatl D.E., Watts J.W., Turner P.C., Wilsonl M.A. The 54eader sequence of tobacco mosaic virus RNA enhances the expression of foreign genetranscripts in vitro and in vivo // Nucleic Acids Research. 1987. - V. 15. - P. 3257-3273.

89. Ganusova E.E., Ozolins L.N., Bhagat S., Newnam G.P., Wegrzyn R.D., Sherman M.Y., Chernoff Y.O. Modulation of prion formation, aggregation, and toxicity by the actin cytoskeleton in yeast // Mol Cell Biol. 2006. - Vol. 26. -№2.-P. 617-629.

90. Gibbs C.J., Bolis C.L. Normal isoform of amyloid protein (PrP) in brains of spawning salmon // Mol Psychiatry. 1997. - Vol. 2. - №2. - P. 146-147.

91. Gibbs C.J., Gajdusek D.C., Asher D.M., Alpers M.P., Beck E., Daniel P.M., Matthews W.B. Creutzfeldt-Jakob disease (spongiform encephalopathy): transmission to the chimpanzee // Science. 1968. - Vol. 161. - №839. - P. 388389.

92. Glover J.R., Kowal A.S., Schirmer E.C., Patino M.M., Liu J.J., Lindquist S. Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of PS71"., a heritable prion-like factor of Saccharomyces cerevisiae // Cell. 1997. - Vol. 89. - P. 811— 819.

93. Glover J.R., Lindquist S. Hspl04, Hsp70 and Hsp40: a novel chaperone system that rescues previously aggregated proteins // Cell. 1998. - Vol. 94. - №1. — P. 73-82.

94. Goldring E.S., Grossman L.I., Krupnick D., Cryer D.R., Marmur J. The petite mutation in yeast. Loss of mitochondrial deoxyribonucleic acid during induction of petites with ethidium bromide // J Mol Biol. 1970. - Vol. 52. - №2. - P. 323335.

95. Griffith J.S. Self-replication and scrapie // Nature. 1967. - Vol. 215. - P. 1043-1044.

96. Hadlow W. J. Scrapie and kuru // Lancet. 1959. - Vol. 2. - P. 289-290.

97. Hanahan D., Techniques for Transformation of E. coli, DNA cloning: a practical approach . Glover, D.M., ed., IRL Press Limited, Oxford, England 1985. - Vol. l.-P. 109-135.

98. Harrison P.M., Gerstein M. A method to assess compositional bias in biological sequences and its application to prion-like glutamine/asparagine-rich domains in eukaryotic proteomes // Genome Biol. 2003. - Vol. 4. - №6. - P. R40.

99. Hasek, Streiblova Yeast Protocols I.H. Evans Methods in cell and molecular biology, edited by I.H.Evans // Humana Press Inc., Totowa NJ. 1996. - P. 391— 405.

100. Heikenwalder M., Julius C., Aguzzi A. Prions and peripheral nerves: a deadly rendezvous // J Neurosci. 2007. - Vol. 85. - P. 2714-2725.

101. Hill A.F., Joiner S., Linehan J. Desbruslais M., Lantos P.L., Collinge J. Speciesbarrier-independent prion replication in apparently resistant species // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - Vol. 97. - P. 10248-10253.

102. Horiuchi M., Priola S.A., Chabry J., Caughey B. Interactions between heterologous forms of prion protein: binding, inhibition of conversion, and species barriers // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - Vol. 97. - P. 5836-5841.

103. Inoue H., Nojima H., Okayama H. High Efficiency transformation of Esherichia coli with plasmids. Gene. 1990. - Vol. 96. - P. 23-28.

104. Jensen R, Sprague GF Jr, Herskowitz I. Regulation of yeast mating-type interconversion: feedback control of HO gene expression by the mating-type locus // Proc Natl Acad Sci USA. 1983. - Vol. 80. - №10. - P. 3035-3039.

105. Jones G.W., Tuite M.F. Chaperoning prions: the cellular machinery for propagating an infectious protein? // Bioessays. 2005. - Vol. 27. - №8. - P. 823-832.

106. Jung G., Masison D.C. Guanidine hydrochloride inhibits Hspl04 activity in vivo: a possible explanation for its effect in curing yeast prions // Curr.Microbiol. -2001.-Vol. 43. — P. 7-10.

107. Kaiser C., Michaelis S., Mitchell A. Methods in yeast genetics. N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press. 1994. - 234 p.

108. Kimberlin R.H., Hall S.M., Walker C.A. Pathogenesis of mouse scrapie. Evidence for direct neural spread of infection to the CNS after injection of sciatic nerve // J Neurol Sci. 1983. - Vol. 61. - №3. - P. 315-325.

109. King C.Y., Diaz-Avalos R. Protein-only transmission of three yeast prion strains // Nature. 2004. - Vol. 428. - №6980. - P. 319-323.

110. Kitamoto Т., Muramoto Т., Mohri S, Doh-Ura K., Tateishi J. Abnormal isoform of prion protein accumulates in follicular dendritic cells in mice with Creutzfeldt-Jakob disease // J Virol. 1991. - Vol. 65. - № 11. - P. 6292-6295.

111. Kocisko D.A., Caughey В. Mefloquine, an antimalaria drug with antiprion activity in vitro, Lacks Activity in vivo II J. Virol. 2006. - Vol. 80. - №2. - P. Ю44-1046.

112. Kocisko D.A., Come J.H., Priola S.A. Chen J., Caughey B. Cell-free formation of protease-resistant prion protein // Nature. 1994. - Vol. 370. - P. 471^474.

113. Kocisko D.A., Vaillant A., Arnold K.M. Bertholet N., Race R.E., Olsen E.A., Juteau J.M., Caughey B. Potent antiscrapie activities of degenerate phosphorothioate oligonucleotides // Antimicrob. Agents Chemother. 2006. -Vol. 50. -№3. - P. 1034-1044.

114. Korth C., May B.C., Cohen F.E., Prusiner S.B. Acridine and phenothiazine derivatives as pharmacotherapeutics for prion disease // Proc Natl Acad Sci USA. 2001. - Vol. 98. - P. 9836-9841.

115. Krobitsch S., Lindquist S. Aggregation of huntingtin in yeast varies with the length of the polyglutamine expansion and the expression of chaperone proteins // Proc Natl Acad Sci USA. 2000. - Vol. 97. - №4. - P. 1589-1594.

116. Kryndushkin D.S., Alexandrov I.M., Ter-Avanesyan M.D., Kushnirov V.V. Yeast PS74". prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hspl04 // J Biol Chem. 2003. - Vol. 278. - №49. - P. 49636^19643.

117. Kunzi V., Glatzel M., Nakano M.Y., Greber U.F., Van Leuven F., Aguzzi A. Unhampered prion neuroinvasion despite impaired fast axonal transport in transgenic mice overexpressing four-repeat tau // J Neurosci. 2002. - №22. - P. 7471-7477.

118. Kushnirov V.V., Kryndushkin D.S., Boguta M., Smirnov V.N., Ter-Avanesyan M.D. Chaperones that cure yeast artificial PS7+. and their prion-specific effects // Curr Biol. 2000. - Vol. 10. - №22. - P. 1443-1446.

119. Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D. Structure and replication of yeast prions // Cell. 1998. - Vol. 94. - P. 13-16.

120. Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D., Surguchov A.P., Smirnov V.N., Inge-Vechtomov S.G. Localization of possible functional domains in sup2 gene productof the yeast Saccharomyces cerevisiae II FEBS Lett. 1987. - Vol. 215. - №2. -P. 257-260.

121. Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D., Telcov M.V., Surguchov A.P., Smirnov V.N., Inge-Vechtomov S.G. Nucleotide sequence of the SUP2 (SUP35) gene of Saccharomyces cerevisiae II Gene. 1988. — Vol. 66. — P. 45-54.

122. Lacroute F. Non-Mendelian mutation allowing ureidosuccinic acid uptake in yeast // J Bacterid.- 1971. -Vol. 106.-№2.-P. 519-522.

123. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. - Vol. 227. - P. 680-685.

124. Lansbury P.T., Caughey B. The chemistry of scrapie reaction: the "ice 9" metaphor // Chem. Biol. 1995. - Vol. 2. - P. 1-5.

125. Legname G., Baskakov I.V., Nguyen H.O., Riesner D., Cohen F.E., DeArmond S J., Prusiner S.B. Synthetic mammalian prions // Science. 2004. - Vol. 305. - P. 673-676.

126. Liebman S.W., Sherman F. Extrachromosomal psi+ determinant suppresses nonsense mutations in yeast // J Bacteriol. 1979. - Vol. 139. - №3. - P. 1068- * 1071.

127. Lind K., Stahlberg A., Zoric N., Kubista M. Combining sequence-specific probes and DNA binding dyes in real-time PCR for specific nucleic acid quantification and melting curve analysis // BioTechniques. 2006. - Vol. 40. - P. 315-318.

128. Liu J.J., Lindquist S. Oligopeptide-repeat expansions modulate "protein-only" inheritance in yeast // Nature. 1999. - Vol. 400. - P. 573-576.

129. Ma J., Lindquist S. De novo generation of a PrPSc-like conformation in living cells // Nat Cell Biol. 1999. - Vol. 1 - P. 358-361.

130. Ma J., Lindquist S. Wild-type PrP and a mutant associated with prion disease are subject to retrograde transport and proteasome degradation // Proc Natl Acad Sci USA.-2001.-Vol. 98.-№26.-P. 14955-14960.

131. Maddelein M.L., Dos Reis S., Duvezin-Caubet S., Coulaiy-Salin В., Saupe S.J. Amyloid aggregates of the HET-s prion protein are infectious // Proc Natl Acad Sci USA. 2002. - Vol. 99. -№11. - P. 7402-7407.

132. Maddelein M.L., Wickner R.B. Two prion-inducing regions of Ure2p are nonoverlapping // Mol Cell Biol. 1999. - Vol. 19. - №6. - P. 4516-4524.

133. Madore N., Smith K.L., Graham C.H. Jen A., Brady K., Hall S., Morris R. Functionally different GPI proteins are organized in different domains on the neuronal surface // EMBO J. 1999. - Vol. 18. - P. 6917-6926.

134. Manson J., West J.D., Thomson V., McBride P., Kaufman M.H., Hope J. The prion protein gene: a role in mouse embryogenesis? // Development. 1992 - Vol. 115.-№1.-P. 117-122.

135. Manuelidis L. Vaccination with an attenuated Creutzfeldt-Jakob disease strain prevents expression of a virulent agent // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. -Vol. 95.-P. 2520-2525.

136. Marella M., Lehmann S., Grassi J., Chabry J. Filipin prevents pathological prion protein accumulation by reducing endocytosis and inducing cellular PrP release // J. Biol. Chem. 2002. - Vol. 277. - №28. - P. 25457-25464.

137. Masison D.C., Maddelein M.L., Wickner R.B. The prion model for URE3. of yeast: spontaneous generation and requirements for propagation // Proc Natl Acad Sci USA. 1997. - Vol. 94. - №23. - P. 12503-12508.

138. Masison D.C., Wickner R.B. Prion-inducing domain of yeast Ure2p and protease resistance of Ure2p in prion-containing cells. Science. 1995. - Vol. 270. - P. 93-95.

139. Mayer MP, Bukau B. Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism // Cell Mol Life Sci. 2005. - Vol. 62. - №6. - P. 670-684.

140. McEwen B.S., Grafstein B. Fast and slow components in axonal transport of protein // J Cell Biol. 1968. - Vol. 38. - №3. - P. 494-508.

141. Meriin A.B., Zhang X., He X., Newnam G.P., Chernoff Y.O., Sherman M.Y. Huntington toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnql // J Cell Biol. 2002. - Vol. 157. - №6. -P. 997-1004.

142. Michelitsch M.D., Weisman J.S. A census of glutamine/asparagines-rich regions: implications for their conserved function and the prediction of novel prions//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - Vol. 97.-P. 11910-11915.

143. Miele G., Alejo Blanco A.R., Baybutt H., Horvat S., Manson J., Clinton M. Embryonic activation and developmental expression of the murine prion protein gene // Gene Expr. 2003. -Vol. 11.-№1.-P. 1-12.

144. Montrasio F., Frigg R., Glatzel M., Klein M.A., Mackay F., Aguzzi A., Weissmann C. Impaired prion replication in spleens of mice lacking functional follicular dendritic cells // Science. 2000. - Vol. 288. - P. 1257-1259.

145. Morales R., Abid K., Soto C. The prion strain phenomenon: molecular basis and unprecedented features // Biochim Biophys Acta. 2007. - Vol. 1772. - №6. - P. 681-691.

146. Moriyama H., Edskes H.K., Wickner R.B. URE3. prion propagation in Saccharomyces cerevisiae: requirement for chaperone Hspl04 and curing by overexpressed chaperone Ydjlp // Mol Cell Biol. 2000. - Vol. 20. - P. 89168922.

147. Mastrangelo P., Westaway D. The prion gene complex encoding PrP and Doppel insights from mutational analysis // Gene — 2001. — Vol. 275. P. 1—18.

148. Narwa R., Harris D.A. Prion proteins carrying pathogenic mutations are resistant to phospholipase cleavage of their glycolipid anchors // Biochemistry. 1999. -Vol. 38. - P. 8770-8777.

149. Nasmyth K. Regulating the HO endonuclease in yeast // Curr Op in Genet Dev. — 1993.-Vol. 2.-P. 286-94.

150. Nelson R.J., Ziegelhoffer Т., Nicolet C., Werner-Washburne M., Craig E.A. The translation machinery and 70 kd heat shock protein cooperate in protein synthesis //Cell. 1992. -Vol. 71.-№1.-P. 97-105.

151. Newnam G.P., Wegrzyn R.D., Lindquist S.L., Chernoff Y.O. Antagonistic interactions between yeast chaperones Hspl04 and Hsp70 in prion curing // Mol Cell Biol. 1999. - Vol. 19. - №2. - P. 1325-1333.

152. Nicotera P. A route for neuroinvasion // Neuron. 2001. - Vol. 31. - P. 345-348.

153. Oesch В., Westaway D., Walchli M., McKinley M.P., Kent S.B., Aebersold R., Barry R.A., Tempst P., Teplow D.B., Hood L.E., et al. A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein // Cell. 1985. - Vol. 40. - P. 735-746.

154. Palmer M.S., Mahal S.P., Campbell T.A., Hill A.F., Sidle K.C., Laplanche J.L., Collinge J. Deletions in the prion protein gene are not associated with CJD // Hum. Mol. Genet. 1993. - Vol. 2. - P. 541-544.

155. Parsell D.A., Sanchez Y., Stitzel J.D., Lindquist S. Hsp 104 is a highly conserved protein with two essential nucleotide-binding sites // Nature. 1991. - Vol. 353. -P. 270-283.

156. Patel B.K., Liebman S.W. "Prion-proof' for PIN*.: infection with in vitro-made amyloid aggregates of Rnqlp-(132-405) induces [PIN*] II J Mol Biol. 2007. -Vol. 365. - №3. - P. 773-782.

157. Patino M.M., Liu J.J., Glover J.R. end Lindquist S. Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast // Science. 1996. - Vol. 273. - P. 622-626.

158. Paushkin S.V., Kushnirov V.V., Smirnov V.N. and Ter-Avanesyan M.D. Propagation of the yeast prion-like psi*. determinant is mediated by oligomerization of the St/Pii-encoded polypeptide chain release factor // EMBO J. -1996. -Vol. 15.-P. 3127-3134.

159. Perrier V., Kaneko K., Safar J., Vergara J., Tremblay P., DeArmond S.J., Cohen F.E., Prusiner S.B., Wallace A.C. Dominant-negative inhibition of prion replication in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci USA. 2002. - Vol. 99. -№20.-P. 13079-13084.

160. Perutz M.F., Windle A.H. Cause of neural death in neurodegenerative diseases attributable to expansion of glutamine repeats // Nature. — 2001. Vol. 412. - P. 143-144.

161. Piccardo P., Manson J.C., King D., Ghetti В., Barron R.M. Accumulation of prion protein in the brain that is not associated with transmissible disease // PNAS. 2007. - Vol. 104. - №11. - P. 4712-4717.

162. Polymenidou M., Stoeck K., Glatzel M., Vey M., Bellon A., Aguzzi A. Coexistence of multiple PrPSc types in individuals with Creutzfeldt-Jakob disease // Lancet Neurol. 2005. - Vol. 4. - P. 805-814.

163. Prado M.A., Alves-Silva J., Magalhaes A.C., Prado V.F., Linden R., Martins V.R., Brentani R.R. PrPc on the road: trafficking of the cellular prion protein // J. Neurochem. 2004. - Vol. 88. - P. 769-781.

164. Priola S.A., Raines A., Caughey W.S. Porphyrin and phthalocyanine antiscrapie compounds // Science. 2000. - Vol. 287. - №5457. - P. 1503-1506.

165. Prusiner S.B. Molecular biology of prion diseases //Science. 1991. - Vol. 252. -P. 1515-1522.

166. Prusiner S.B. Novel proteinaceous infections particles cause scrapie // Science. -1982. Vol. 216. - P. 136-144.

167. Prusiner S.B. Prions // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - Vol. 95. - №23. -P.13363-13383.

168. Prusiner S.B. Scrapie prions // Am. Rev. Microbiol. 1989. - Vol. 43. - P. 345374.

169. Prusiner S.B. The prion diseases // Sci Am. 1995. - Vol. 272. - P. 48-57.

170. Prusiner S.B., McKiniey M.P., Bowman K.A. Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods // Cell. 1983. - Vol. 35. - P. 349-358.

171. Prusiner S.B., Scott M.R. Genetics of prions // Annu Rev Genet. 1997. - Vol. 31.-P. 139-175.

172. Prusiner SB. Shattuck lecture-neurodegenerative diseases and prions // N Engl J Med. 2001. - Vol. 344. - №20. - P.l516-1526.

173. Raychaudhuri S., Fontanes V., Banerjee R., Bernavichute Y., Dasgupta A. Zuotin. A DnaJ molecular chaperone, stimulates cap-independent translation in yeast // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2006. - Vol. 350.-P. 788-795.

174. Riek R., Hornemann S., Wider G., Billeter M., Glockshuber R., Wuthrich K. NMR structure of the mouse prion protein domain PrP(121-321) // Nature. 1996. -Vol. 382.-P. 180-182.

175. Riek R., Hornemann S., Wider G., Glockshuber R., Wiithrich K. NMR characterization of the full-length recombinant murine prion protein, mPrP(23-231) //FEBS Lett. 1997. - Vol. 413. -№2.-P. 282-288.

176. Ripaud L., Maillet L., Cullin C. The mechanisms of URE3. prion elimination demonstrate that large aggregates of Ure2p are dead-end products // EMBO J. -2003. Vol. 22. - №19. - P. 5251-5259.

177. Rivera-Milla E., Stuermer C.A., Malaga-Trillo E. An evolutionary basis for scrapie disease: identification of a fish prion mRNA // Trends Genet. 2003. -Vol. 19.-№2.-P. 72-75.

178. Roberts B.T., Moriyama H., Wickner R.B. URE3. prion propagation is abolished by a mutation of the primary cytosolic Hsp70 of budding yeast // Yeast. -2004.-Vol. 21.-№2.-P. 107-117.

179. Roberts B.T., Wickner R.B. Heritable activity: a prion that propagates by covalent autoactivation // Genes Dev. 2003. - Vol. 17. - №17. - P. 2083-2087.

180. Rose M.D., Winstone F., Hieter P. Methods in yeast genetics // CSHL Press. -1990.-198 p.

181. Ross ED, Edskes HK, Terry MJ, Wickner RB. Primary sequence independence for prion formation. Proc Natl Acad Sci USA. 2005. - Vol. 102. - №36. - P. 12825-12830.

182. Rossi G., Salmona M., Forloni G., Bugiani O.m Tagliavini F. Therapeutic approaches to prion diseases // Clin. Lab. Med. 2003. - Vol. 23. - №1. - P. 187208.

183. Saborio G.P., Permanne В., Soto C. Sesitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding // Nature. 2001. - Vol. 411. -P. 810-813.

184. Sachs A.B., Sarnow P., Hentze M.W. Starting at the beginning, middle, and end: translation initiation in eukaryotes // Cell. 1997. - Vol. 89. - P. 831-838.

185. Safar J, Wille H, Itri V, Groth D, Serban H, Torchia M, Cohen FE, Prusiner SB. Eight prion strains have PrPSc molecules with different conformations // Nat Med. 1998. - Vol. 4. - №10. - P. 1157-1165.

186. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory manual // New York: Cold Spring Harbor Lab. Press. 1989. - 1626 p.

187. Santuccione A., Sytnyk V., Leshchyns'ka I., Schachner M. Priori protein recruits its neuronal receptor NCAM to lipid rafts to activate p59fyn and to enhance neurite outgrowth // J. Cell. Biol. 2005. - Vol. 169. - P. 341-354.

188. Schirmer E.C, Lindquist S. Interactions of the chaperone Hspl04 with yeast Sup35 and mammalian PrP // Proc Natl Acad Sci USA. 1997. - Vol. 94. - P. 13932-13937.

189. Schlumpberger M., Prusiner S.B., Herskowitz I // Induction of distinct URE3. yeast prion strains // Mol Cell Biol. 2001. - Vol. 21. - №20. - P. 7035-7046.

190. Schwimmer C., Masison D.C. Antagonistic interactions between yeast PSt. and [URE3] prions and curing of [URE3] by Hsp70 protein chaperone Ssalp but not by Ssa2p // Mol Cell Biol. 2002. - Vol. 22. - P. 3590-3598.

191. Schwimmer C., Masison D.C. Antagonistic interactions between yeast PSI+. and [URE3] prions and curing of [URE3] by Hsp70 protein chaperone Ssalp but not by Ssa2p // Mol Ceil Biol. 2002. - Vol. 22. - №11. - P. 3590-3598.

192. Sherman F., Fink G.R., Hancks J.B. Methods in yeast genetics // N.Y.Cold Spring Harbor Lab. Press. 1986. - 367 p.

193. Shorter J., Lindquist S. Destruction or potentiation of different prions catalyzed by similar Hspl04 remodeling activities // Mol Cell. 2006. - Vol. 23. - №3. - P. 425-438.

194. Shorter J., Lindquist S. Hspl04 catalyzes formation and elimination of self-replicating Sup35 prion conformers // Science. 2004. - Vol. 304. - №5678. - P. 1793-1797.

195. Shyng S.L., Huber M.T., Hams D.A. A prion protein cycles between the cell surface and an endocytic compartment in cultured neuroblastoma cells // J Biol Chem. 1993. - Vol. 268. -№21. - P. 15922-15928.220. Sigurdsson, 1954

196. Sikorski R.S., Hieter P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae // Genetics. 1989. - Vol. 122. - P. 19-27.

197. Silveira J.R., Raymond G.J., Hughson A., Race R.E., Sim V.L., Hayes S.F., Caughey B. The most infectious prion protein particles // Nature. 2005. - Vol. 437.-P. 257-261.

198. Simonic Т., Duga S., Strumbo В., Asselta R., Ceciliani F., Ronchi S. cDNA cloning of turtle prion protein // FEBS Lett. 2000. - Vol. 469. - №1. - P. 33-38.

199. Sondheimer N., Lopez N., Craig E.A., Lindquist S. The role of Sisl in the maintenance of the RNQ+. prion // EMBO J. 2001. - Vol. 20. - №10. - P. 2435-2442.

200. Stockel J., Safar J., Wallace A.C., Cohen F.E., Prusiner S.B. Prion protein selectively binds copper(II) ions // Biochemistry. 1998. - Vol. 37. - P. 7185— 7193.

201. Strumbo В., Ronchi S., Bolis L.C., Simonic T. Molecular cloning of the cDNA coding for Xenopus laevis prion protein // FEBS Lett. 2001. — Vol. 508. - №2. -P. 170-174.

202. Supattapone S., Wille H., Uyechi L., Safar J., Tremblay P., Szoka F.C., Cohen F.E., Prusiner S.B., Scott M.R. Branched polyamines cure prion-infected neuroblastoma cells // J. Virol. 2001. - Vol. 75. - №7. - P. 3453-3461.

203. Tanaka M., Chien P., Naber N., Cooke R., Weissman J.S. Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences // Nature. -2004. Vol. 428. - №6980. - P. 323-328.

204. Taneja V., Maddelein M.L., Talarek N., Saupe S.J., Liebman S.W. A non-Q/N-rich prion domain of a foreign prion, Het-s., can propagate as a prion in yeast // Mol Cell. 2007. - Vol. 27. - № 1. - P. 67-77.

205. Taylor K.L., Cheng N., Williams R.W., Steven A.C., Wickner R.B. Prion domain initiation of amyloid formation in vitro from native Ure2p // Science. -1999. Vol. 283. - №5406. - P. 1339-1343.

206. Thual C., Komar A.A., Bousset L., Fernandez-Bellot E., Cullin C., Melki R. Structural characterization of Saccharomyces cerevisiae prion-like protein Ure2 // J Biol Chem. 1999. - Vol. 274. - №19. - P. 13666-13674.

207. Tobler I., Gaus S.E., Deboer Т., Achermann P., Fischer M., Rulicke Т., Moser M., Oesch В., McBride P.A., Manson J.C. Altered circadian activity rhythms and sleep in mice devoid of prion protein // Nature. 1996. - Vol. 380. - P. 639-642.

208. Treiber C., Simons A., Multhaup G. Effect of copper and manganese on the de novo generation of protease-resistant prion protein in yeast cells // Biochemistry. -2006.-Vol. 45.-№21.-P. 6674-6680.

209. Tuite M.F. Yeast prions and their prion-forming domain // Cell. 2000. - Vol. 100.-№3.-P. 289-92.

210. Tuite M.F., Cox B.S. The Genetic Control of the Formation and Propagation of the PSI+. Prion of Yeast, edited by Chernoff Y.O. // Medical Intelligence Unit/ Landes Bioscience. Protein-based inheritance. 2007. — P. 14—30.

211. Tuite. M., Mundy, C.R., Cox, B.S. Agents that cause a high frequency of genetic change from psi+. to [psi-] in Saccharomyces cerevisiae // Genetics. 1981. — Vol. 98.-P. 691-711.

212. Turoscy V., Cooper T.G. Ureidosuccinate is transported by the allantoate transport system in Saccharomyces cerevisiae // J Bacteriol. 1987. - Vol. 169. — №6.-P. 2598-2600.

213. Uptain S.M., Lindquist S. Prions as protein-based genetic elements // Annu Rev Microbiol. 2002. - Vol. 56. - P. 703-741.

214. Vana K., Zuber C., Nikles D., Weiss S. Novel Aspects of Prions, Their Receptor Molecules, and Innovative Approaches for TSE Therapy // Cell. Mol. Neurobiol. -2007.-Vol. 27. -№1. P. 107-128.

215. Warner R.G., Hundt C., Weiss S., Turnbull J.E. Identification of the heparan sulfate binding sites in the cellular prion protein // J Biol Chem. 2002. - Vol. 277.-P. 18421-18430.

216. Wegrzyn R.D., Bapat K., Newnam G.P., Zink A.D., Chernoff Y.O. Mechanism of prion loss after Hspl 04 inactivation in yeast // Mol.Cell Biol. 2001. - Vol. 21. - P. 4656-4669.

217. Weissmann C. Molecular genetics of transmissible spongiform encephalopathies // J Biol Chem. 1999. - Vol. 274. - P. 3-6.

218. Weissmann С. The state of the prion // Nat Rev Microbiol. 2004. - V. 2. -№11.-P. 861-871.

219. Weissmann C., Aguzzi A. Approaches to therapy of prion diseases // Annu Rev Med. 2005. - Vol. 56. - P. 321-344.

220. Weissmann C., Enari M., Klohn P.C., Rossi D., Flechsig E. Transmission of prions // PNAS. 2002. - Vol. 99. - №4. - P. 16378-16383.

221. Whatley S.A., Powell J.F., Politopoulou G., Campbell I.C., Brammer M.J., Percy N.S. Regulation of intracellular free calcium levels by the cellular prion protein // Neuroreport. 1995. - Vol. 6. - №17. - P. 2333-2337.

222. White A.R., Hawke S.H. Immunotherapy as a therapeutic treatment for neurodegenerative disorders // J Neurochem. 2003. - Vol. 87. - №4. - P. 801808.

223. Wickner R.B. URE3. as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae I I Science. 1994. - Vol. 264. - P. 566-569.

224. Wickner R.B., Edskes H.K., Roberts B.T., Baxa U., Pierce M.M., Ross E.D., Brachmann A. Prions: proteins as genes and infectious entities // Genes Dev. — 2004. Vol. 18. - №5. - P. 470^185.

225. Wickner R.B., Edskes H.K., Shewmaker F. How to find a prion: URE3., [PS7*] and p // Methods. 2006. - Vol. 39. - №1. - P. 3-8.

226. Wickner R.B., Edskes H.K., Shewmaker F., Nakayashiki T. Prions of fungi: inherited structures and biological roles // Nat Rev Microbiol. 2007. - Vol. 8. -P. 611-618.

227. Winklhofer K.F., Tatzelt J. Cationic lipopolyamines induce degradation of PrPSc in scrapie-infected mouse neuroblastoma cells // Biol Chem. 2000. - Vol. 381.-P. 463-469.

228. Yang W., Yang H., Tien P. In vitro self-propagation of recombinant PrPSc-like conformation generated in the yeast cytoplasm // FEBS Lett. 2006. — Vol. 580. — №17.-P. 4231^1235.

229. Zhou P., Derkatch I.L., Uptain S.M., Patino M.M., Lindquist S., Liebman S.W. The yeast non-Mendelian factor ETA+. is a variant of [PS7*], a prion-like form of release factor eRF3// EMBO J.- 1999. -Vol. 18.- №5. -P. 1182-1191.

230. Zhou W., Edelman G.M., Mauro V.P. Transcript leader regions of two Saccharomyces cerevisiae mRNAs contain internal ribosome entry sites that function in living cells // Proc Natl Acad Sci USA. 2001. - Vol. 98. - P. 15311536.

231. Zou W., Zheng J., Gray D.M., Gambetti P., Chen S.G. Antibody to DNA detect scrapie but not normal prion protein // Proc Acad Natl Sci USA. 2004. - Vol. 101.-P. 1380-1385.

Информация о работе

Рубель, Александр Анатольевич
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2008
ВАК 03.00.15

Диссертация

Исследование прионных свойств белка PrP в дрожжах Saccharomyces cerevisiae - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы