Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование перекисного окисления липидов ядерных мембран гепатоцитов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование перекисного окисления липидов ядерных мембран гепатоцитов"

ЕРШЗЯ^К^1Х)СУД11ГС1ВЕ!ПШИ УНИВЕРСИТЕТ

л/\ . V йд \у ! у| Д ;- «гл На правах рукописи

V , т*^'-1 Т-1 Л / 1 г» с-!'

^--ЙОГОС/ЭД¿1&ИЕ АДАЯК01Ж

> V Г> 600^ •

- чК ' 2ПЧХ .

ИССЛЕДОВАНИЕ 11ЕРЕКЖНОГО ОКЖЛШЯ ЛШЩОВ ЯДЕРНЫХ Ш3.1БРАН ГЕПЛТОЦИТОВ

03,00.02 - Биофизика

. АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой стапзди кандидата биологических наук

Ереван - 1934

Работа выполнена ни кафедре биофизики биологического факультета Ереванского государственного университета

I

На\'чш;а руководители: доктор биологических наук, профессор

Г. А. 1Ш10СШ

кандидат биологических наук, доцент

а..е. злкарян

асоциальные оппоненты: доктор биологических наук

СЛ. ЕЛДОШ1

кандидат биологических наук, старший научный'сотрудник

'цл. ава1шн

Водущоо учреждение - Научно-нсследонатольскш центр Ереванского

медицинского института

Заилта диссертации состоится " Л19У5 г„ н

часов на заседании Специализированного Совета К.055.0I.C3 по при-сидаипо ученой сгссела кйдкцдата биологических наук при Ереванском государственного ушазерситето (375049, Ереван, ул. Алика 1Ла-нукяна I, Ереванский государственный ушшерситет, биологически!! факультет, кафедра биохимии.

С диссертацией моаио ознакомиться в библиотеке университета

'Автореферат разос

лай "Ж<с а'ГуЫ1524 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, кандидат биологических наук -

«/«—А-Л.Г. АНАШН

ом шашиютика. РАБОШ

Алщ/дльность про^логли. .Бияснонио механизмов Фупкциолпропа-пня биологических мембран открывает иирокле возможности для управления биологическими процессами. Одним из основных факторов, приводящих к изменению структурной целостности и функциональной: активности биологических мембран, является процесс порокленого окисления липидов (ПОЛ). Известно, что яерекисное окисление ли-шздоп, сопровождающееся накопленном гидроперекисей липздоь, альдегидов, кетонов, существенным образом влияет на состояние и функционирование мембранных структур, приводя к разилгип различных клеточных патологий. Шюгочнслсннши исследованиями установлено, что .процесс порокленого окисления липлдоц приводит к нарушению структуры самого баслоя с изменением таких параметров, как проницаемость, текучесть, электрические свойства, к инактивации мембранных ферментов, а такна к эффекта«, связапнш с регуляцией ■ клеточного деления к генетического аппарата клетки в целом.

Ванную роль е изучении механизма свободнорадикалышх реакций пероксядации липидов сыграло- открытие хемнлшинесценцин, сопровождающей этот процесс. Тесная корреляция мегду интенсивностью хемялшинесцепции и уровнем ПОЛ, измеренным пряглыма .методами, по- • зволяет использовать непрерывное наблюдение хсмидл.::1несценции для анализа кинетики процессов ПОЛ. Метод хемилга/пшесценцин выгодно отличается от других химических и физических методов исследования ПОЛ-высокой чувствительностью, практически безыкерционностьэ и ' быстротой получаемого отзета.

Вопроси тароксидациз в мембранах различного происхождения (плазматические мембраны, митохондрии, эндоплазматическии ретп-кулум, лиз ос омы и др.) достаточно изучены. Однако в научной литературе почти отсутствуют работы по изучении процесса переписного окисления липидов з ядрах и"ядерно;: мембране, несмотря на ваяную роль последней в жизнедеятельности клетки.

Недостаточная изученность этой проблемы делает вполне актуальной необходимость проведения исследований процесса перекнено-го окисления лишщов ядерных мембран.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было проведение изучения процесса перекисного окисления лищ!дов ядерных мембран гепатоцатов крысы в норме а при воздействии различных физических факторов и биологически активных веществ.

В работо были поставлены следующие основные задачи:

1. Провести сравнительное изучение спонтанной хомилшшюс-цонцнн препаратов гепатоцитов по сравнению с другими субклоточными фракциями.

2. Исследовать влияние температуры и кислорода на интенсивность процесса НОЛ ядерных мембран.

3. Изучить механизм спонтанного сверхслабого свечения препаратов ядорных мембран с примононием специальных свободноради-кадышх ингибиторов.

4. Провести изучение механизма и кинотики 1е^+-кццударованного НОЛ адерних мембран. Определить зависимость интенсивности хомилюминесценция от концентрации инициатора.

5. Последовать изменения процесса ЛОЛ адерних моыбран при гормональной активации генома.

{¡гц'Чцдя новизну работы. Впервые обнаружено и проведено изучение спонтанно;! хем51лшинесценции ядерных мембран гепатоцитов крыс, сопровождающей процесс ПОЛ,

Установлена двухфазная температурная зависимость интенсивно ста хомнлш'инссцонцни ядерных мембран при ПОЛ без праокеццантов,

Впервые выявлена и изучена кислородная зависимость интонеш ности спонтанном хешшсшнесценщи препаратов ядерных мембран,

С применением специальных свободнорадикалышх ингибиторов -<А-нафтола я -токоферола- установлен свободнорадикальшш цепной механизм реакций, лекаща в основе- процесса ПОЛ ядерных мембран.

Подробно изучена кинетика Ге"+-индуцированного ПОЛ ядерных мембран. Установлены значения критической концентрации Ро"*+ для различных концентрации ядерных .мембран.

Впэрвыо методом хемшхшинесценцил показана связь меэду интенсивностью процесса ПОЛ ядерных мембран 'и функциональной актш кость» адра при стероидной активации генома. Обнарунено наличие сезонной зависимости воздействия эстрадиола на хемилшянесценцт адерних мембран.

фактическая значимость работа. Изложенные в диссертационн работе экспериментальные данные, их обсуздениэ и сделанные выво' ды позволили блияе подоПти к пониманию механизма регуляции процесса перекисного окисления липицов в биологических мембранах. Выявленные изменения интенсивности процесса ПОЛ ядерных мембран

при воздействии различных физических факторов и биологически актив них веществ показали возможность применения метода регистрации хекклюмииосцснцни для определения сдв:1Гон в фпзико-хпмичос-кой структуре мембран, лсмилжипесцонтное исследование пчракислого окисления лишщов как окспросс-метод может дать интегральную информацию о модификациях липидних структур мембран, что, в свою очородь, означает наличие возможности контролирования и регулирования этих процессов. Исследование хем:1л:омнкесценцпн кло— точных ядер открывает новые возможности для изучения Функционального состояния генетического аппарата и применения метода xe.vui-люминесценции как экспресс-теста при решении практических задач биологии и медицины.

Апробация работа. Отделышо рэздолн диссертационно.'! рлботы. • были представлены на годичных научных конференциях ИГУ (Ереван, I988-IS24), на 2-ой конференции молодых ученых ИГУ (Ереван,1282), на L Республиканской конференции "Достижения физико-хиютшегаи биологии и биотехнологии и пути их внедрения" (Ереван, 19Ь2), ' / 5-ом съезде Армянского физиологического общества (Ереван, 1994).

Работа апробирована на заседании кафедрн биофизики биологического факультета Ереванского государственного университета от 14 октября ISS4 г.

Дублдкацип. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 132 страницах машинописного текста, содергдт 3 таблицы,27 рис.и состоит . из Введения, трех глаз: I - Обзор литературы, П - Материалы и методы исследования, Ш - Результаты а их обсугдание, а так~.е выло- ' дов и указателя литературы, вклвчаэдего 161 наименование отечест^-венной и зарубе;.шон литературы,

гШЗРШЫ И ;,1ЕТ0ДЫ лССЛ££0БА1Ш

При выполнении данной работы в .качестве экспериментального объекта использовали печень п мозг белых лабораторных беспородных крыс. Антпокпслнтельпую активность некоторых субклеточных фракций исследовали на препарате желточных липсНротепдов куранот-го яйца. ' I

Ядра выделяли из печени методой Блобеля и ¡др. ( В1оЪв1 ц. et ai., IS66). Из чистых ядер получали препараты'ядерных мембран по методу (Berezney н. et al., IS7Q), а ¡такие ядерного матрнкса (Blobel G. et al., 1966).

Митохондрии из клеток печени крыс выделяли по известному методу (Скулачев B.II., 1962), микросош - по методике, описанной (Betes Е. et al., 1979).

Контроль чистоты фракции ядор осуществляли с помощью фазо-K0HTpacTH0;i микроскопии. Выделенные дцра имели округлую форму с неновраздешшми мембранами. Препарат практически не содержал ци-топлазматичоских примесей. Об отсутствии загрязнения митохондриями судаяи по нечувствительности реакции образования радикалов 0+ к добавко сукцината в присутствии антишцина А.

Пз полученных субклеточных фракций клеток печени крыс брали пробы для биохимического анализа. Белок определяли по Лоури lowry o.ii. et al., IS5I). Экстракцию и гидролиз нуклеиновых кислот проводили по методу (Burton к., 1968 ). РНК определяли спектрофотометрпчоскп ПО методу ( Schmielt G., et el., 1245).

Суспензию ядер анализировали на содержание ДНК и белка. Отношение болок/Д1К составляло 2,85+0,16 , что соответствует литературном данным (Tata J., 1974).

Исследование процесса ПОЛ проводили двумя методами - по химическому определению продуктов ПОЛ и по регистрации хемилшиие-сцекцил, сопровоэдаэдеп пороксцдащга.

Определение одного из конечных продуктов ПОЛ - малонового дкальдегэда (LULA.).- осуществляли по описанной методике (Gray J., 1978), ПОЛ ядор л ядерных мембран in vitro инициировали добавлением двух прооксидантных систем - нефермонтативной (Ре~+-ас-корбат) и ферментативной (Ре~+-НДДШ-АДФ).

Регистрации хемиламиносценции исследуемых Фракции осуществлял;: на собрано:: йамл установке (Закарян А .12. и др., 1920), как описано (Владимиров Ю.А. и др., 1SV2).

Антнокислителькую активность препаратов ядерных мембран оценивали по изменению интенсивности хемилшинесценцип келточных ли-попротеидов куриного яГща, согласно (керстнев Ы.П. и др., IS85).

Концентрация Fo"*+ определяли в аляквотах в ходе измерения хемиломинесцоиции по поглощению окрашенных комплексов с 0-фенан-тролином при X =510 им с учетом калибровки по обычной методике.

Полученные экспериментальные данные обрабатывали статиста-чески с учетом критерия Стьвдента-Ф:шера (Рокицкии П.Ф., I9S7). Определяли средне-арифметическое, ошибку средней, среднеквадратичное отклонение, достоверность, коэффициент вариации.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОИЗУЙДЕНИЕ

1. Спонтанная хсмилшиноспеиция ядерных мембран печени крис

После обнаружения Б.II. Тарусовым спонтанного сверхслабого свечения биологических объектов (Тарусов Б.II. я др., 1061) изучению хемилюминесценции биологических мембран посвящены многочисленные работы. Однако и в настоящее время сведения относительно процесса перекисного окисления липидов ядер и ядерных мембран являются весьма малочисленными (Вартииян Л.С. и др.й989» Vaca С.Е. et al.,. I9BU, Scott H.O. et al., 1991). Лостаплен-Hue нами эксперименты по изучению процесса иороксидаилл ллнл-дов ядерных мембран позволили впервые регистрировать спонтанное сверхслабое свечение препаратов ядерных мембран гепатоци-тов интенсивности 120-150 шли/сек, что превышало фон установки в 2,5-3 раза (Закарян А.Е. и др., IS&9, Погосян Г.А. и др., IS89). Ядерные мембраны (конечная концентрация 3-3,5 мг/мл по белку), суспензированные в 50 r.í.l Трис-IIGI, 25 u.I KGI, 5 ц.1 %ci2 , pH 7,4 буфере при 39°С обладали достоверно регистрируемой хемилюминесценции. О свечении ядерных мембран такой ке интенсивности сообщалось в работе японских авторов ( Scott И.О. et al., 1991). Данные регистрации интенсивности спонтанной хемилюминесценции различных фракций гомогенатов печени и мозга крыс просуммированы в таблице I. Как следует из приведенных результатов наблюдается существенная разница между лятен-сиеностями хемилюминесценции различных фракций на мг белка образца. Так, супернатант гомогената мозга обладает более высоким уровнем спонтанной хемилюминесценции, чем супернатант гомогената печени, что, наверное, обусловлено как енсоким содержанием фосфолипадов, так и высоким уровнем аоробного метаболпз:ла в мозгу (Кагава Я., IS65). Супернатант гомогената печени, со-деркащий суммарную фракцию микросом и митохондрий, а -также свободных лииядов, обладает интенсивностью свечения &Ü имп/сек'мг белка. Эта характерная интенсивность спонтанного свечения су-пернатанта была наибольшей, по сравнению с таковой у ядер -24+3 имп/сек'мг белка, ядерных мембран - 40+5 имп/сек'мг белка и ядерного матрикса - 34+4 имп/сек'мг белка.

Наблюдаемые различия в интенсивности спонтанной хемплюми-

I

Таблица I

Интенсивность спонтанной хемшпоминесценции Некоторых фракций пачеии и мозга крисы .

Фракция

Концонтра- Интенсив- Интенсив-ция белка, ность ХЛ, ность

С1/МЛ

мп/сок

УГГ7»/аитт

белка имп/сек'мг

Супернатант гомогената печени 10-12 600+60 80

Ядра 5,5-7 145+16 24

Ядерная мембрана 3,5 150+20 40

ЛдерниП матрикс 2,5 86+4,6 35

Митохондрии 65 ' 2400+110 45

Супернатант гомогената мозга 2,5 1290+95 515

Спнаптосомы 1,5-2,5 220+15 НО

несценции субклеточных фракции мы связываем не только с разным количеством связанного липида с № белка в образцах, но и с известными различиями лмидного состава этих фракций (Кагава Я., 1985).

2. Влияние температуры на интенсивность спонтанной хемилшялесценцни ядерных мембран

Влияние температуры на интенсивность спонтанной хемилюми-несценцпи ядерных мембран исследовали в пределах от 25°С до 60°С. Результаты, представленные на рис.1, отражают возрастание интенсивности спонтанно!: хемилшинесценции с похтеняем те; пера!уры. При температуре 25°С излучение исследуемых объектов практически лехат в области чувствительности установки и достоверно не отличается от уровня фона. Далее, начиная с 30°С, достоверно регистрируется' хемилшинесценция образцов с последующи почти экспоненциальным возрастанием до 40-42°С. Ближе к этой области при 42-43°С нами был обнаружен некоторый спад интенсивности, после чего рост хемилшинесценции снова возобновлялся с .зайетным ускорением реакции до 60°С и далее. Следует отметить, что интенсивность хемшпоминесценции ядерных мембран быстро из-

< 1

9

I

I

Рис Л Зависимость интенсивности спонтанной хеьшпссли-

несценции (ймц/сек) ядерных мембран от температуры

Рис.2 Температурная зависимость интенсивности спонтанной хемидсманесценцЕИ ядерных мембран в аарениусовых координатах

■ \ • К

1

10

X

моняотся с изменением температуры, но при каздом значении температуры остается постоянной.

Некоторый ^пад интенсивности хемилюминесценции ядерных мембран в области 42-43°С, вероятно, можно объяснить розкпм изменением компактности мембранных структур вследствие фазового перехода липидов н денатурации белкового компонента. Наше предположение подкрепляется литоратуршши данными о том, что для би-слойных лапэдних мембран температурный фазовый переход локлт'э области '10-15°С (Кагава Я,, 1005). Для подтверждения факта наличия фазового перехода лишщов ядерных момбран при 42-43°С, полученная зависимость интенсивности хемилюминесценции от температуры нами была представлена такие в координатах Аррепиуса-1п I - 1/1 (рис.2). Как видно из принадепного рисунка, кривая зависимости I от 1/Т (К)хЮ3 имеет чуть выраненный перегиб, . который соответствует темпоратуро фазового перехода липидов и составляет 43-44°С. Лз графика в аррониусовых координатах мы рассчитали также энергию активации свободнорэдикальных ценных реакций при перекисном окислонии лишщов ядерных мембран боз проокевдантов ниже и выше температуры фазового перехода. Эти значения составляли 19,05 ккал/моль и 42,54 ккал/моль соответ- • ственно. Нами были подсчитаны и значения коэффициента Бант-Гоф-фа (0цо ) для пределов температур 25-60°С. Так, сц0 =2,07 в интервале ЗОг-40°С и =1,63 в интервале 40-50°с. Полученные значения Ч10 указывают на наличие физического процесса, лежащего в основе хемилюминесценции.

\

3. Влияние кислорода на интенсивность спонтанной хемилюминесцещдии ядерных мембран

' Известно, что присутствие и парциальное давление кислорода играет Еаглую роль в кинетике процесса ПОЛ. Этому вопросу посвящены многочисленные работы (Лукьянова Л.Д. и др., 1982; Беляков В.А.., 1909; ?г1с1оу1ск I., 1986; 1>е Сго^ еЪ а1., 1987). Результаты изучения елияния концентрации кислорода на интенсивность спонтанной хемилюминесценции ядерных мембран показывают, что продувание кислорода в суспензию ядерных мембран заметно усиливает интенсивность свечения. Так, если в контроле,-интенсивность свечения составляла 150 ими/сек при фоне 50 имп/сек,-то при продувании через суспензию 100^-ного кислорода количество импульсов доходило до 1200 имп/сек. Полученные ре-

зультаты хорошо согласуются с данными работа ( Scott R.c. et al., 1991). 13 дополнитолышх экспериментах нами било обпгггдсс-но, что замена продуваемого кислорода азотом приводят к резко- . му ТУ1Л9Ш1Ю хешшминесцсцции, хотя но снижает ее до уровня контрольного свечония ядерных мембран. с

4. Влияние некоторых антиоксэдантов на хемилшилеецшщию . ядерных мембран

В работах по изучению пероксидации биологических субстратов большое внимание уделено влиянию антиоксэдантов на этот процесс. В первую очередь, это связано с поиском механизмов защити от процесса ПОЛ, приводящего к различным патофизиологическим изменениям. Это особенно ва;кно в случае ядерной мембраны,' близость которой к генетически,iy аппарату клетки создаст'потен-циальную опасность для повреждения генома продуктами свободно-радикального окисления.

В результате наших исследований выяснилось, что введений в суспензию ядерных мембран (к -нафтола приводит к снимонию интенсивности спонтанной хемплюмдаесценцпя (рис.3). Следует отметить, что существует некоторый промежуток времени мо;.д7 моментом внесения ингибитора и началом его деПствия на хе:.п1Л1',мпне-сцепцию. Нам удалось выявить приблизительно прямо пропорциональную зависимость мэад продолхитолыюстьэ латентного периода?и кощентрацией et-нафтола (рис.4). Полученные результаты еннме--ния интенсивности спонтанной хемилзоминесценции ядерных мембран

-нафтолом дают основание указывать на свободнорздика.тьнии. характер реакций в ядерной мембране, приводящих к хем:аюм;;не-сценции. Результаты, представленные-на рис.-4, говорят о том,'' что эффективность действия антпоксиданта, т.е. мера сним-зния интенсивности хемилюмлнесценцил, зависит от его концентрации -чем выше концентрация ингибитора, тем сильнее эффект ингибиро-вания. Концентрация сК -нафтола, приводящая к уменьшению 'интенсивности хемиляминесценцип вдвое, составляет 5*I0-3i.I.

Аналогичная серия экспериментов была проведена по изучению действия <к -токоферола. Полученные данные свидетельствуют, о • том, что интенсивность спонтанной хемилюминесценции препаратов ядерных мембран снижается для всех концентраций, d-токоферола, но в разной мере и через различные сроки инкубации. Концентра-

Рас .3. В.тляиле сС -нафтола на спонтанную ХЛ

ядерных мембран (3 мг/мл по белку)'при 39°С

Стрелкой указан момент введения оС -нафтола Цифры у кривых - концентрация о(. -нафтола в М

концентрация -нафтола, М

Ряс.4. Зависимость интенсивности (имп/сек) и продолжительности латентного периода (мин) спонтанной хвмллюмлнесцеЕцш! от концентрации <к -нафтола (М)

I

13

ция oC -токоферола, приводящая к 507i—nor.TV иигибиропапип. интеи-" сивности хомшюминесцецции ядорных мембран, била па 2 порядка шею, чем соответствующая - для Л-нафтола и составляла

Наши данные хорошо согласуются с литературными (Хра-пова Н.Г., 1991), указывающими, что антирадикальная активн&сть природных токоферолов в сто раз выше, чем у синтетических фенолов.

При анализе полученных данных и сопоставлении их с литературными становится очевидно, что биоантиоксиданты достаточно универсально защищают все типы биомембран. Действие .-токоферола, типичного ингибитора свободнорадикальных процессоп, ещо раз подчеркивает, что в основе х_емяшоминесцснции ядерных мемб- „ ран легат свободнорадпкальпый процесс ПОЛ. С поглодаю хомилши- ■ несцентного метода получается интегральная информация о соотно-■тонны интенсивности ПОЛ е биоструктурах и активности биоантяок-свдантной системы организма.

5. Индуцированная ионами яелеза хомилюминесцешлдя ядерных мембран

Представленные на рис.5 результаты изучения Ге^+-:шдуцнро-ваниого ПОЛ суспензии ядерных глембран говорят о том, что кинетика Ре^+-шщуцированном хемилшинесценции отличается большой сло;шостыо. На кривой (рис.5, кр.1) можно выделить 4 характер ные стадии кинетики процесса - быстрая вспышка ХЛ, латентный период, медленная вспышка и стационарное сЕечение. .lento замег тять, что кр;шая накопления ЦДД. (рис.5, кр.2) имеет двухступенчатый характер. Первоначальный! прирост концентрации ;,1ДА. при введении Ре"+ связан с разложением лпплдных перекисей, содержащихся в ядерных мембранах, что сопровождается быстрой вспышкой ХЛ. Затем в течение достаточно продолжительного латентного периода наблюдается низкий уровень ХЛ, а ¡.1ДА остается практически постоянным. Развитие медленной вспышки ХЛ сопровождается Еторой ступенькой накопления ГЩ. Сравнение с кинетикой окисления Ге"+ (рис.5, кр.З), подтверждает, что развитие медленной вспышки XI и основное накопление продуктов ПОЛ возникает .после того, как

о. I „

происходит снижение концентрации Fe до некоторой величины, условно называемой критической концентрацией ров Ю.А., 1972; Vladimirov Ju.A., 1986). i

Fe? й (Владими-

a

. I i

время, мил

Ряс .5. Кинетика келезоиндуцированной хемшиалинесцендш дцерних мембран, накопления МДА и-окисления Ре +

Стрелкой указан момент введения 40 глкМ Ге

.2+

14' о

к

Е-1 О

Я

30

т0,2

медленная вспышка

-0,1

о о со

к

ентныи период

ог со

IX)

О 20 40 60 80 100 120 начальная концентрация Ре2+,

Рис.6. Зависимость амплитуды медленной вспышки №

ядерных мембран, латентного периода и кинетики'

накопления ИДа от исходных концентраций Ре'

2+

?+

Важным параметром, характеризующим триггориуга роль Го и конкретно!'! момбраиной системе, являотся величина критцчоскоГ концентрации форрононоп, при повышении которой реакции обрыва цепей на ионах начинают преобладать над реакциями с участием Го2+, ведущими к образованию новых радикалов ( У1я41.а1-- гоу Ли.А., 1986). Вследствие итого, килотика ПОЛ прм добанло-Ш1и железа в концентрациях, кышо критической, отличается наличием латентного периода в развитии РООН-зависимого окисления липидов.

ГЛы провели подробное измерение зависимостей параметро- кинетики ХЛ-латентного периода, амплитуды медленной вспныки и кинетики накопления продуктов ПОЛ в ядерных мембранах от исход- . ной концентрации добавленного (рис .6). Как видно из рис.6, зависимость величины латентного периода от начальной концентрации железа близка к линейной, а точка пересечения этоП кривой с осью абсцисс указывает величину критической концентрации около 40 ш£Д, шгаэ которой латентный период отсутствует, а мед-/' ленная всшпака слипается с быстрой. При начальных концентрациях Ре* выше 40 мйЛ амплитуда медленной вспышки практически ос-• тавалась постоянной, а при более низких начальных концентрациях яелеза обособленная медленная вспышка отсутствовала. Концентрационная зависимость максимального уровня накопления МДА имела перегиб такко при значении начальной концентрации Ге^*,близкой к 40 мкМ. Все три приведенные зависимости указывают на одну и ту же величину |Ре"+]к. Поэтому в дальиойием мы иппользо-вали метод определения величины Ре по пересечения зависимости величины латентного периода кинетики ХЛ от начальной' концентрации келеза с осью абсцисс, не прибегая к измерении кинетики ' накопления ОДА.»

Танам образом, данные исследований, представленные в этом разделе, показывают, что кинетика ХЛ дает полное представление о протекании процесса Ре^+-нщстцпрованного ПОД в ядерных мембранах. Действительно, кинетика ХЛ позволяет в реальном масита-. бе времени увидеть по величине латентного периода, насколько быстро исходная концентрация Ре2+ снижается до, критической ве-' личины, по достижении которой развивается процЬсс свободноради-кального окисления липидов, сопровождающийся мрдлешюй еспшкой

ХЛ. Сравнение с кинетикой накопления Г.1ДА показ ное образование продуктов ПОЛ происходит на ст

¿вает, что основ-ддни медленной

вспышки XI и прекращается после ее завершения. Если ке не рассматривать всю картину процесса до полного окисления феррононов ц окончания медленной вспышки, ограничиваясь измерением накопления продуктов ПОЛ через фиксированное время инкубации, монно получить значения концентрации МДА, отличающиеся от максимальной .

G. Влияние 1?£>-остраднола и гидрокортизона на порокисноо окислшпш лшпщов ядерных мембран

В литературе очень мало работ по изучению влияния стероидных гормонов на процесс ПОЛ in vivo (Гукасов В.LI. и др., 1974; Гукасов В.1.1. и др., 1977; Саксопов П.П., 1978; Uukhcr-jee s. et al., 1986), а работы, посвященные изучению действия стероидных гормонов на пероксидацшо лшпщов ядерных мембран, практически отсутствуют.

Наии эксперименты показали, что' введение 17^ -эстрадиола _ крысам за 4 часа до забоя отражается на интенсивности процесса ПОЛ различных субклеточных фракции (рис.7). Следует подчеркнуть, что влияние гормона на хемнламинесценцию ядерных мембран имеет четко Еырах:екнин сезонный характер. Как явствует из рис.

7 Б, введение крысам в осенний сезон (октябрь-декабрь) эстрадиола приводит к шестикратному ¡усилению интенсивности спонтанно!; ХЛ. Лз других фракций только во фракции ядерного матрикса регистрируется увеличение интенсивности ХЛ почти в 2,5 раза. В супзрпатаатах гомогенатов печени и мозга изменения не столь значительны. Даннке, полученные в аналогичных экспериментах весной (рис.7 А), достоверно отличаются от вышеприведенных осенних результатов. В этом случае эстрадиол не только не увеличивает уровень ХЛ, но, наоборот, заметно снижает ее интенсивность. Сезонный характер влияния эстрадиола на ПОЛ ядерных мембран мы связываем с известными данными об изменении активности анти-окислителькоп системы организма в связи с сезонностью поступления антиоксидантов с пищей (Родионова Е.Н. и др., 1987). Нами было установлено, что антиокислительная активность ядерных мембран печени крыс неодинакова осенью и гесной. Так, препараты ядерных мембран, выделенные в осенний сезон из интактных животных, снапали амплитуду медленной вспышки ХЛ желточных липояро-теидов е 2 раза, а ядерные мембраны, выделенные из печени ин-тактных крыс весной, - в 1,33 раза. Однако-следует объяснить,

900 -

600 -

300 -

I

§

J

1-ядер/ше мембраны

2-ядерныЯ матрикс

3-суиернатант гомо-гената печени

4-супернатант гомо-гената мозга

1200-,

900 -

600

300 .

I

Л

%

□ -контроль ЕЗ -17£-эстрадиол

Й

Ж

1

1

Рис. 7. Интенсивность спонтанной хемилюминесценции /имп/сек/ различных фракций гомогената печени и мозга крысы в контроле и при воздействии 17£ -эстрадиола в весенние /А/ и осенние сезоны /Б/.

I

почему не разная антиокислительная активность ядерных мембран осенью и весной на. отра>;;ается на интенсивности их спонтанной >ji. Из литератур;! известно (Бурлакова Б.11., 1969), что изменение антнокиолцтельноИ активности лашщов мембран взаимосвязано с изменением не только состава, но и количества фосфолипццов. Так, показано, что фосфолшпщы мембран митохондрий при повышенна антпокподительной активности обогащаются минорными фракциями - фосфатвднлсераном и фосфатодилпнозатом, которые окисляются легче всего, что, в свою очередь, приводит к ускорению утилизации антноксидантов.

Полученные нами данные об увеличении интенсивности спонтанно!'. ХЛ ядерных мембран под воздействием зстрзднола в осенний с о зон совпадает с результатами работы ( Mukherjee et- al., 1985). Вместе с тем, согласно (Геворкян Э.С. и др., 1966; Геворкян O.G. и др., 1988), введение стероидов крысам приводит к увеличению количества фосфолппидов в ядерных мембранах печени на oü:', а фосфатидклинозитола - от 38,2+2,2 мкг/мг белка до 57,5+4,5 мкг/мг белка. Следовательно, в осенний сезон . повышению содержания этих фракций в ядерных мембранах способствуют п высокая А.0А ддорных мембран, и воздействие эстрдциола на геном, следствием чего является высокий уровень спонтанной ХЛ. Весной же, когда пул антиоксидантов в организме истощен, вводимые животному стероццы, очевидно, используются скорее как химические вещества антиокевдантной природы, нежели как активаторы генома.

Таблица 2

Интенсивность некоторых'фракций печени и мозга крыс пои действии гидрокортизона С,1+ю )

Фракция Контроль- Гидрокортизон

Ядерная мембрана ■ ■ 155+18 180+25

Ядерны;'; матрикс - 93+8 122+20

Супернатант гомогената печени 687+70 617+58

Супернатант гомогената мозга ' 935+125 857+95

Полученные результаты изучения in vivo действия гидрокортизона на интенсивность спонтанной 2UI и образование 1.Щ в различных фракциях печени и мозга крыс суммированы в табл.2 и 3,

Таблица 3

Влияние гидрокортизона на образование 1.1ДА (имоль/мг белка) в дцоргшх мембранах печени крыс (Ll+m )

а

Вариант опыта Время инкубации, мин

10 20 30 40 50

Контроль 11,60+2,61 17,6+1,87 18,2+2,6"20,2+2,7 22,2+2,8 Гидрокортизон 33,6+9,5 41,6+9,9 43,4+10 45,2+10 49,6+10,8

Следует подчеркнуть, что в отличие от'эстрздпола воздействие гидрокортизона'но связано с сезоном.-Введение ишотиому глжо-кортикоида слабо отражается на интенсивности спонтанной ХЛ супе рнатантов гомогената печени'и мозга. В адерных фракциях гепа-тоцитов - препаратах ядерных мембран и ядерного матрикса - просматривается некоторая тенденция к увеличению интенсивности спонтанной ХЛ..Такого порядка изменения параметров ПОЛ мембран митохондрии наблюдали и другие авторы ОЛатшпна Н.В. к др., 1982: Саксонов ПЛ., 1978). Полученные нами данные по вондеКст-вам in vitro гидрокортизона на параметры Ре -индуцированного ПОЛ ядерных мембран, проявляющиеся в удлинении латентного периода и уменьшении скорости нарастания медленной вспышки ХЛ, находятся в согласии с литературным представлением о гидрокортизоне как о "структурном" антиоксиданте.

ВЫВОДЫ

1. Впервые наш обнаружено сверхслабое спонтанное свечение препаратов ядерных мембран и ядерного ыатрйкса клеток-печени крыс, сопровождающее процесс перекисного окисления липидов в • этих фракциях.

2. Установлена температурная зависимость интенсивности хе-милшинесценции ядерных мембран. Показано, что'она имеет двухступенчатый характер с точкой! перегиба при 42-43°С.

Предполагается, что точка перегиба связана с фазосым' переходом липидов мембранного бислоя при данной температуре, а также с возмомюй денатурацией мембранных белков, приводящей к повышению текучести липидов мембран, тем самым -' к интенсифиЫцни процесса пероксидации.

3. Установлена прямо пропорциональная зависимость интенсивности спонтанной хемплшшюсцопцип цдоринх мембран от концентрации кислорода. IIa основании применения свободнорадикаль-них ингибиторов ^-нафтола и -токоферола и расчета коэф«1,и-цпонта Вант-РофОа ( ^ю ^ для Раз!шх температурных диапазонов предполагается, что изучаемая хемилюминесцонция ядерных мембран имеет липццнуа природу, и в оо основе лежат свободноради-кальпке цепные реакции.

•1. Изучена кинетика Ре^+-индуцированного перекисного окисления липпдов ядерных мембран. Показано, что параметры индуцированной хе:,гллвм!шесценцнп завпеят от концентрации ионов двухвалентного >;;елеза. Рассчитаны значения критической концентрации г.одоза -[г«Т+]х - для разных концентраций мембран. Установлена корреляция меэд параметрами хшплшикссценцпп^ образованием малонового дпалъдегида и степенью окисления Fo'J+.

5. Выявлены изменения процесса парекисного окисления липи-довя ядерных мембран при воздействии in. vivo 17^-эстрадиола и гидрокортизона. Установлен сезонный характер влияния I?/' -эс-традиола на хемилшпнесценцию и скорость пероксидации липпдов ядерных мембран п ядерного матрпкеа. Предполагается возможное • существование гормональной регуляции процесса свободнорцдпкалъ-ного окисления лшхидов ядерных мембран гепатоцптов крыс.

6. Хеишралинесценцая дает интегральную информацию о кинотике процесса перекисного окисления липидов, о соотношении интенсивности ПОЛ и активности антиокислительиой системы организма. Определение хемилюминесценцпи макет служить существенной характеристикой физиологического состояния и еозмокных патологических изменений, мембранных структур организма.

' CILIG0K РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕ,IE ДИССЕРТАЦИИ

1. Закарян А.Е., Погосян Г.А., Цагикян А.Р., Товмасян H.G., Паносян Г.А. Спонтанная хемилюминесценция клеточных структур после действия 17^>-эстрадиола / Тез.докл.Ы Респ.конф."Достижения физико-химической биологии и биотехнологии и пути их внедрения". Ереван, 1989.-С.70-71.

2. Погосян P.A., Цагикян А.Р., Тепоян Р.Г. Перекисное окисление липидов и спонтанная хемилюминесценция в ядерных мембранах печени крыс / Тез.докл.Ы Респ.кокф."Достижения физико-хими-

ческой биологии и биотехнологии и пути их внедрения". Ереван, I989.-C.47. .

3. Закарян А.Е,, Цагикян А.Р., Погосян Г.А., Наносил Г.А. Установка для регистрации сворхслабо!! хемилшинесц'шпии биологических объектов // Биолог.ж.Армении, I990.-T.43, )Ь 1.41.51-54.

4. Закарян А.Е., Погослп Г.А. Сезонная зависимость воздействия 17,^-эстрадиола на хомилшиносценцшо ядерных мембран клеток печени крыс / Тез. докл. 5-го съезда Арм.физиолог.обм-ва.

'Ереван, 1994.-С.39-40.

5. Погосян Г.А., Закарян А.Е., Паносян Г.А. Влияние эстра-диола и гидрокортизона на перекисиое окисление липедов щврних мембран печени крыс // Биолог«ж.Армении (в печ.).

6. Погосян Г.А., Закарян А.Е., Паносян Г.А. Кинотика Ре2+-индуцированного переписного окисления липпдов ядерных мембран. Концентрационные эффекты Ре2+ и мембран // Биолог.к.Армении

(в печ.).

1

Заказ 75 Тираж 50

Цех "Ротапринт" Ереванского госуниверситета. Ереван, ул. Ал.Манукяна й I.