Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование оптимальных условий культивирования бактерий рода Pseudomonas-продуцентов биологически активных веществ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Исследование оптимальных условий культивирования бактерий рода Pseudomonas-продуцентов биологически активных веществ"

На правах рукописи

АСАБИНА ЕЛЕНА АНТОНОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ ОПТИМАЛЬНЫХ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ РОДА Pseudomonas -ПРОДУЦЕНТОВ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

03.00.23 -биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

20G9

OQ34öbuoa

Уфа 2009

003486089

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологии Уфимского научного центра РАН и ГУП «Опытный завод Академии Наук Республики Башкортостан»

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Логинов Олег Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор биологичеких наук, профессор Чемерис Алексей Викторович доктор биологических наук, профессор Супрунова Ольга Борисовна

Ведущая организация:

Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности Россельхозакадемии

Защита состоится «18» декабря 2009 г. в 14 часов на заседании Объединенного совета по защите докторских и кандидатских диссертаций ДМ 002.136.01 при Институте биологии Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г. Уфа, Проспект Октября, 69, тел/факс: 8 (347) 235-62-47, e-mail: ib@anrb.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра РАН и на официальном сайте АН РБ по адресу: http://www.anrb.ru/inbio/dissovet

Автореферат разослан ноября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, / кандидат биологических наук, доцент [

Р.В.Уразгильдин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Биологические средства защиты растений являются единственной альтернативой химическим фунгицидам с точки зрения природоохранного земледелия. Наиболее подробно изученными бактериями-антагонистами фитопатогснных грибов, обладающими способностью стимулировать рост растений и повышать их устойчивость, являются представители рода Pseudomonas (Рубан, 1986; Смирнов, Киприанова, 1990; Мордухова и др., 1991; Холмецкая и др.,1996; Воронин, 1998; Логинов, 2005; Weller, 1988; Dowling & O'Gara, 1994; Whipps, 2001; Garg et al„ 2005).

Широкомасштабное использование в сельском хозяйстве биопрепаратов на основе ризосферных бактерий рода Pseudomonas сдерживается отсутствием стандартных технологий их производства. При производстве биопрепаратов на основе бактерий рода Pseudomonas для практического использования в агробиогехнологии основной проблемой является высокая стоимость питательной среды.

При подборе питательных сред и условий культивирования с целью повышения выхода биомассы или накопления определенных продуктов обмена веществ микроорганизмов, таких как антибиотики или ростстимулирующие вещества, широкое применение нашли методы математического планирования эксперимента (Максимов, Фёдоров, 1969; Егорова, 1976; Бойченко и др., 2002; Автономова и др., 2006; Flavia et al., 2006; Mandai et al., 2007; Narajana et al., 2008; Sharma et al., 2009). Которые позволяют не только одновременно изучить действие нескольких факторов на интересующий исследователей процесс, но и количественно оценить степень этого влияния.

Учитывая, что потребность сельского хозяйства в средствах защиты растений увеличивается с каждым годом, проблема совершенствования технологии биологической защиты растений представляется актуальной.

Цель и задачи исследования. Целью исследований являлась оптимизация питательных сред и условий для культивирования штаммов

бактерий Pseudomonas chlororaphis ИБ 51 - основы биопрепарата "Елена",

> {

Р. putida ИБ 17 и Р. chlororaphis ИБ 6, продуцирующих антибиотики и ростстимулирующие вещества.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить степень влияния компонентов питательной среды на накопление биомассы и антигрибной активности при культивировании штаммов Р. chlororaphis ИБ 51, Р. chlororaphis ИБ 6 и Р. putida ИБ 17.

2. Определить оптимальный состав ферментационных сред для культивирования штаммов Р. chlororaphis ИБ 51, Р. chlororaphis ИБ 6 и Р. putida ИБ 17, с максимальной антигрибной активностью и высоким титром клеток.

3. Изучить закономерности синтеза цитокининов, штаммом бактерий Р. chlororaphis ИБ 6, в зависимости от состава питательной среды.

4. Оптимизировать условия периодического и непрерывного промышленного культивирования штаммов Pseudomonas.

Научная новизна. Разработаны технологии промышленного культивирования бактерий рода Pseudomonas для производства биопрепаратов сельскохозяйственного назначения с высокой антигрибной и ростстимулирующей активностью.

Практическая значимость. Разработаны новые, экономичные питательные среды и подобраны оптимальные условия для промышленной наработки биопрепаратов на основе бактерий рода Pseudomonas, что может быть использовано при производстве биопрепарата "Елена", предназначенного для защиты сельскохозяйственных растений от грибных фитопатогенов.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на IV Всероссийской научной INTERNET-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био-и органической химии и биотехнологии» (Уфа, 2005), XIX международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии Реактив-2006» (Уфа, 2006), I Всероссийской научно-практической конференции «Питательные среды и методы культивирования клеток для биологии, медицины и биоиндустрии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Пущино,

2007), П съезде микологов России «Современная микология в России» (Санкт-Петербург, 2008).

Публикации. По материалам работы опубликовано 11 научных работ, в том числе шесть статей в рецензируемых журналах, входящих в Перечень ВАК, рекомендованных для соискателей ученой степени кандидата биологических наук и 1 патент Российской Федерации.

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, описание объектов и методов исследований, экспериментальную часть (4 главы), заключение, выводы, список цитируемой литературы, содержащий 139 ссылок и приложение. Работа изложена на 100 страницах машинописного текста и содержит 14 рисунков и 12 таблиц.

Благодарности

Автор выражает глубокую благодарность всем сотрудникам лаборатории микробиологии ОТК ГУП «Опытный завод», лаборатории БАВ Учреждения РАН Института биологии Уфимского научного центра РАН за постоянную поддержку при выполнении данной работы. Автор благодарит заведующего контрольно - аналитической лабораторией ЗАО НПП «Биомедхим» к.б.н. Четверикова С.П. за помощь в обсуждении результатов и консультации.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами изучения являлись штаммы бактерий Pseudomonas chlororaphis ИБ 51 (Патент РФ № 2203945, 2003), Р. chlororaphis ИБ 6 (Патент РФ № 2260951, 2005) и Р. pulida ИБ 17 (Патент РФ № 2213774, 2003) из Коллекции микроорганизмов Учреждения РАН Института биологии Уфимского научного центра РАН, проявляющие антагонистические свойства в отношении ряда грибов - возбудителей болезней растений.

Культуры выращивали при 28°С и п=180 мин"1 на воздушно-термостатирусмой качалке УВМТ-12-250 в жидкой питательной среде Кинг В (King et al., 1954). Односуточный посевной материал объёмом 1 мл пересевали в колбы емкостью 250 мл со 100 мл среды, состоящей из следующих

компонентов: глицерин, дрожжевой автолизат, №2НР04х12Н20, КН2Р04х2Н20, 1^804><7Н2С), РеСЬ, в количестве, согласно плану эксперимента, и культивировали в течение трех суток при температуре 28°С.

Оптимизацию состава ферментационной питательной среды проводили с применением метода математического планирования эксперимента (Максимов, Федоров, 1969) в два этапа:

- построение адекватной математической модели процесса путем связывания выходного параметра системы (антигрибная активность, титр клеток) с входными - концентрациями компонентов (факторов) питательной среды в полных факторных экспериментах (ПФЭ) по плану 24 с их варьированием на двух количественных уровнях (верхнем "+" и нижнем "-");

- нахождение собственно оптимального состава среды по схеме "крутого восхождения".

В качестве 4 факторов варьирования были взяты глицерин (Х|), дрожжевой автолизат (Х2), Ыа2НР04х|2Н20 (Х3), КН2Р04х2Н20 (Х4). Уровни варьирования представлены в табл. 1, содержание остальных компонентов ферментационной среды было зафиксировано на постоянном уровне.

Таблица 1

Компоненты питательной среды и их уровни варьирования в ПФЭ 24

Компонент среды Фактор Средний уровень «0» Нижний уровень «-» Верхний уровень «+» Единица варьирования

Глицерин, г/л X, 11,00 2,00 20,00 9,00

Дрожжевой автолизат, л/л х2 0,13 0,01 0,25 0,12

Ыа2НР04х 12Н20, г/л Хз 5,50 1,00 10,00 4,50

КН2Р04х2Н20, г/л Х4 1,50 0,50 2,50 1,00

Мв804х7Н20, г/л Постоянный уровень - 1,50

БеСЬ, г/л Постоянный уровень - 0,01

Оптимизацию условий культивирования проводили в ферментерах АК-210 (СКБ БП, Пущино) с рабочим объемом 6 л, количество посевного материала 2% по объему, аэрация - 0,5 объема воздуха в 1 мин на 1 объем среды также с применением метода математического планирования эксперимента на вновь

разработанных средах. Для изучаемых штаммов были проведены полные факторные эксперименты по плану 23.

В качестве 3 факторов варьирования были взяты аэрация (X,1), температура (Хп1) и продолжительность культивирования (Х3'), уровни варьирования представлены в табл. 2.

Таблица 2

Условия культивирования и их уровни варьирования в ПФЭ 23

Условия культивирования Фактор Средний уровень «0» Нижний уровень «-» Верхний уровень «+» Единица варьирования

Перемешивание, об/мин X,1 160 140 180 20

Температура, °С- Х2' 28 26 30 2

Продолжительность культивирования Х3' 72 48 96 24

Для получения автолизата отработанные пивные дрожжи подвергали термической обработке при 100 °С в течение 1 часа. Затем дрожжевой автолизат фильтровали и доводили рН до 6,8-7,2.

Титр жизнеспособных клеток определяли методом предельных разведений на агаризованной среде Кинг В (King et al., 1954).

В качестве тест-объекта использовали фитопатогенный гриб Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoemaker (= Helminthosporium sativum Pam., King et Bakke). Антигрибную активность низкомолекулярных (HM) фракций метаболитов (< 3 кДа) определяли методом разведений (Широков и др., 2002). В пробирки вносили 0,5-3,0 мл препарата фракции метаболитов, добавляли 1 мл суспензии спор тест-гриба, 1 мл шестикратно концентрированной среды Чапека (Теппер и др., 1972) и дистиллированную воду до общего объема 6 мл. Засеянные пробы оставляли при 28°С на 7 сут. Подавление роста гриба оценивали визуально относительно контроля, представляющего собой вышеописанную систему, но без внесения метаболитов. В качестве единицы активности принимали такое количество фракции метаболитов, при котором подавляется рост гриба в течение 7 сут.

В качестве тест-объектов для определения аптифунгальной активности штаммов псевдомонад методом лунок служили также следующие мицелиальные грибы: Fusarium gibbosum ВКМ 848, F. culmorum ВКМ 844, F. graminearum ВКМ 1668, F. nivale ВКМ 3106, F. oxysporum BKM 137, F. avenaceum BKM 132, F. semitectum BKM 1938, F.solani BKM 142, Alternaría alternate из Коллекции микроорганизмов Учреждения РАН Института биологии Уфимского научного центра РАН. В чашки Петри со средой ГГ1А, с предварительно внесёнными в неё спорами тест-грибов, в лунки диаметром 9 мм вносили по 100 мкл бактериальной суспензии. О величине антифунгального эффекта, по результатам пяти повторностей, судили по диаметру зон ингибирования грибного роста вокруг лунок после инкубирования чашек при 28 °С в течение 4 сут.

Выделение и хроматографическое разделение низкомолекулярных фракций культуральных жидкостей на компоненты проводили, согласно (Логинов, Четвериков, 2003).

Фитогормональную активность определяли при помощи иммуноферментного анализа (Кудоярова и др., 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Определение оптимального состава питательных спед для культивирования бактерий пода Pseudomonas. Для создания оптимальной среды, состав которой мог бы полностью удовлетворять пищевые потребности культуры и способствовать максимальному накоплению антигрибной активности, целесообразно использовать методы математического планирования эксперимента, включающие план полного факторного эксперимента и опыт по методу крутого восхождения.

Ранее для штамма P. chlororaphis ИБ 51 было показано, что природа источников углерода и органического азота в среде существенно влияет на продукцию ими ингибиторов роста фитопатогенов. Оптимальным источниками являются глицерин и равнозначная смесь дрожжевого экстракта и пептона

(Логинов, Четвериков, 2003). Эти же источники являются оптимальными и для других штаммов, изучаемых нами Р. chlororaphis ИБ 6, Р. putida ИБ 17.

Но при широкомасштабном производстве биопрепаратов на основе бакгерий рода Pseudomonas для практического использования в агробиотехнологии основной проблемой является высокая стоимость питательной среды, содержащей в своем составе такие дорогостоящие компоненты, как пептон и дрожжевой экстракт. С целью удешевления состава питательной среды заменили смесь дрожжевого экстракта и пептона на автолизат отработанных пивных дрожжей. При выборе этого компонента питательной среды мы руководствовались, прежде всего, низкой стоимостью, доступностью и технологичностью сырья.

Отработанные дрожжи трёх разных производителей пивной продукции проанализировали на содержание различных форм азота. Результаты анализа автолизатов пивных дрожжей и пептона представлены в табл. 3.

Таблица 3

Характеристика пептона и полученных дрожжевых автолизатов различных

пивоваренных производств

Показатель «ПИТ», г. Новотроицк «Шихан Хайнекен», г. Стерлитамак «Amstar-Efes», г. Уфа Пептон

Азот общий, % в пересчете на АСВ* 5,9±0,3 5,4±0,3 5,2±0,3 7,6±0,4

Азот аминный, % в пересчете на АСВ 2,0±0,1 1,5±0,1 1,6±0,1 3,6±0,2

Белок по Лоури, % в пересчете на АСВ 45,2±2,3 40,7±2,0 41,3 ±2,1 61,7±3,1

* абсолютно сухие вещества

Из приведённых данных видно, что отработанные дрожжи завода «ПИТ» г. Новотроицк по анализируемым показателям превосходят дрожжи остальных пивоваренных производств, что и послужило основанием для дальнейшей работы с ними по оптимизации питательных сред для культивирования бактерий рода Pseudomonas.

Согласно составленной матрице планирования, было проведено 16 экспериментов по каждому штамму бактерий Pseudomonas с различным варьированием изучаемых факторов (табл. 2). Эксперименты проводились с трёхкратной повторностыо.

В результате экспериментов (таб. 4-6) были вычислены коэффициенты уравнений регрессии - математических моделей зависимости функций Yt (антигрибиая активность) и Y2 (титр клеток) от концентрации в ферментационной среде компонентов Xi, Х2, Х3, Х4. На основании коэффициентов были получены математические модели зависимости антигрибной активности (Y|) и титра клеток (Y2) от концентраций в ферментационной среде компонентов. Полученные модели по накоплению биомассы и антигрибной активности при 95 % доверительном интервале дают основание утверждать, что статистически значимое действие в изученном диапазоне концентраций для разных штаммов оказывают разные компоненты.

ПФЭ и его результаты для штамма Р. chlororaphis ИБ 51

Таблица 4

Вариант Фактор Y,, ед/мл КЖ Y2. млрд КОЕ/мл КЖ

X, X, Х3 х4

1 - - - ■ - 2,0±0,1 0,79±0,04

2 + - - - 2,0±0,1 0,95±0,05

3 - + - - 2,0±0.1 1.42±0.07

4 + + - - 2,0±0,1 0,55±0,03

5 - - + - 5,0±0,25 1,0±0,05

6 + - + - 9,0±0,45 0,95±0,05

7 - + + - 4,8±0,24 24,7±1,23

8 + + + - 7,0±0,35 17,57±0,88

9 - - - + 5,8±0,29 0,97±0,05

10 + - - + 7,0±0,35 1,27±0,06

11 - + - + 2,0±0,1 2,8+0,14

12 + + - + 2,3±0,12 4,72±0,24

13 - - + + 8,0±0,4 0,94±0.05

14 + - + + 3,7±0,18 0,84±0,04

15 - + + + 6.ftt0,3 23,33±1,17

16 + + + + 5,0±0,25 20,67±1,03

17 0 0 0 0 7,0±0,35 16.4±0.82

Таблица 5

ПФЭ и его результаты для штамма Р. сЫогогарЫя ИБ 6

Вариант Факторы Уь ед/мл КЖ У2, млрд КОЕ/мл

X, Хо Хз Х4

1 - - - - 2,0±0,1 1,21±0,06

2 + - - - 2,0±0.1 1,43±0,07

- - - 2.3±0,1 1,28±0.06

4 + + - - 2,0±0,1 1,41±0,07

5 - - + - 2,2±0,1 2.04±0,1

6 + - + - 2,3±0,11 1,5±0,07

7 - + + - 2,2±0,11 7,73±0,39

8 + + + - 10,0±0,5 8,5±0,42

9 - - - + 3,5±0,17 1,19±0,06

10 + - - + 4,5±0,22 1,88±0,09

11 - + - + 2.3±0,11 2,43±0,12

12 + + - + 2,7±0,13 5,33±0,27

13 - - + + 9,0±0,45 1,83±0,09

14 + - + + 9,0±0,45 1,1 ±0.06

15 - + + 5,0±0,25 7,67±0,38

16 + + + + 6,0±0,3 8,0±0,4

17 0 0 0 0 8,0±0,4 6,05±0,3

Таблица 6 ПФЭ и его результаты для штамма Р. ри1к1а ИБ 17

Вариант Факторы Уь ед/мл КЖ У2, млрд КОЕ/мл

X, X, Хз х4

1 - - - - 2,0±0.1 1.38±0,07

2 + - - - 2,0±0.1 0,06±0,0

3 - + - - 2,0±0.1 5,57±0,28

4 + + - - 2,0±0Д 2,87±0,14

5 - - + - 2,3±0,12 1,69±0,08

6 + - + - 2,2±0,11 0,05±0,0

7 - + + - 2.8±0,14 3,23±0,16

8 + + + - 5,0±0,25 2,07±0,1

9 - - - + 3,0±0,13 0,01±0,0

10 + - - + 3.0±0,13 0,64±0,03

11 - + - + 6,0±0,26 6,77±0,34

12 + + - + 7,0±0,35 3,53±0,18

13 - - + + 6,0±0,26 0,14±0,01

14 + - + + 4,0±0,2 0,22±0,01

15 - + + + 9,0±0,45 3,17±0,16

16 + + + + 5,5±0,27 2,35±0,12

17 0 0 0 0 7,0±0,35 4,80±0,24

Уравнения регрессии, с учетом значимости коэффициентов, выглядят следующим образом:

для штамма Pseudomonas chlororaphis ИБ 51

Y, =4,60 +0,15Х,+ 1,46Х3, Y2 = 6,47 + 5,50X2 + 4,78Х3; для штамма Pseudomonas chlororaphis ИБ 6

Y, = 4,19+0,63Xi+l,52Хз+1,06Х4, Y2 = 3,41+1,89Х2+1,39Хз; для штамма Pseudomonas putida ИБ 17

Y,=3,99+0,93Х2+0,62Xj+l,48X4, Y2=2,l 1+0,64Х,-1,59Х2+0,49Х3.

Основное положительное влияние на антигрибную активность двух штаммов вида Р. chlororaphis оказывает увеличение концентраций глицерина (Xi) и Na2HP04xl2H20 (Х3), причем на штамм ИБ 6 дополнительное положительное влияние оказывает увеличение концентрации КН2Р04х2Н20 (Х4), а концентрация дрожжевого автолизата (Х2) соответствует оптимальному значению для штамма этого вида (т.е. изменение его концентрации в выбранных пределах не вызывает заметное, статистически значимое, изменение антигрибной активности). Несколько иначе ведет себя штамм вида Р. putida, где положительное влияние на увеличение антигрибной активности оказывает увеличение концентраций автолизата (Х2), Na2HP04*12H20 (Х3) и КН2Р04х2Н20 (Х4).

На основании полученных данных в ПФЭ-24 были поставлены опыты по плану крутого восхождения, в котором осуществляли одновременное изменение концентраций всех значимых факторов по алгоритму, рассчитанному точно в соответствии с величинами коэффициентов регрессии. Восхождение было начато от исходного состава среды (средний уровень ПФЭ-24). Таким образом, были установлены оптимальные составы питательных сред (табл. 7).

Антигрибная активность выращенных на данных средах штаммов Pseudomonas в 1,5 раза выше, чем в среднем варианте, в то же время титр клеток

на данной среде составил 2,20*Ю10,1,46* 10'° и 5,00 *109 КОЕ/мл культуральной

жидкости соответственно для штаммов ИБ 51, ИБ 6 и ИБ 17.

Таблица 7

Оптимизированные составы питательных сред

Компонент среды Оптимальное содержание для штамма

Р. chlororaphis ИБ 51 Р. chlororaphis ИБ 6 Р. putida ИБ 17

Глицерин, г/л 11,30 11,53 11,00

Дрожжевой автолизат, л/л 0,11 0,13 0,16

ЫазНРОдх 12Н20, г/л 6,96 6,14 6.23

КН2Р04х2Н20, г/л 1,58 1,60 1,89

Р^804х7Н20, Г/Л 1,50

БеСЬ, г/л 0,01

Оптимизация условий культивирования штаммов Pseudomonas.

Оптимизацию условий культивирования штаммов-продуцентов проводили в ферментерах на средах выше приведённого состава (табл. 7).

Результаты ПФЭ 23 показали, что все три исследуемые культуры проявляют максимальную антигрибную активность в рамках выбранной системы ее определения вне зависимости от условий культивирования. Рассчитанные коэффициенты для уравнений регрессии, описывающих зависимость титра клеток от условий культивирования, оказались статистически незначимыми. Однако по результатам ПФЭ 23 были выявлены параметры культивирования, позволяющие повысить титр клеток исследуемых штаммов бактерий рода Pseudomonas в культуральной жидкости, которые мы приняли за оптимальные параметры культивирования штаммов-продуцентов (табл. 8).

Таблица 8.

Оптимальные условия культивирования

Условия культивирования Оптимум для штамма

Р. chlororaphis ИБ 51 Р. chlororaphis ИБ 6 Р. putida ИБ 17

Перемешивание, об/мин 180 160 160

Температура, °С 26 26 30

Продолжительность культивирования, ч 48 48 48

Таким образом, результаты оптимизации условий культивирования штаммов Pseudomonas показывают, что всем исследуемым штаммам для накопления максимальной антигрибной активности и высокого (3,42*Ю10, 1,50* 10ю и 1,25*Ю10 КОЕ/мл КЖ соответственно для штаммов ИБ 51, ИБ 6 и ИБ 17) титра клеток при культивировании в ферментёрах достаточно 48 ч, в условиях пониженной аэрации и перемешивания, при температуре 26 °С для двух штаммов вида P. chlororaphis, а для штамма P. putida необходимо 30 °С. Полученные данные согласуются с исследования в работе Логинов О.Н. и Четвериков С.П. (2003) о способности изучаемых штаммов к активному росту при пониженных температурах и данными литературы по биосинтезу антибиотических веществ псевдомонадами.

Исследование цитокининовой активности. Все образцы ПФЭ 24 штамма бактерий Pseudomonas chlororaphis ИБ 6 в виде низкомолекулярных фракций были проверены на наличие в них веществ цитокининовой природы. Данные иммуноферментного анализа показали, что в условиях проведенного эксперимента штамм ИБ 6 способен синтезировать цитокинины, максимальный выход которых составляет 1117,1 нг/мл культуральной жидкости. Хроматографический профиль низкомолекулярной фракции образца с максимальной фитогормональной активностью представлен тремя компонентами (рис. 1а).

Покомпонентный анализ показал, что фунгицидной активностью обладает лишь один компонент из НМ фракции метаболитов. При хроматогафическом разделении этот компонент первым элюирует с колонки и не имеет ярко выраженного максимума поглощения в УФ- области. Остальные компоненты фракции имеют максимумы УФ- поглощения в интервале от 255 до 280 нм, характерные для регуляторов роста растений, что и было подтверждено данными иммуноферментного анализа (рис. 2). Причем максимум поглощения одного из исследуемых компонентов находился при длине волны 267 нм, можно было предположить, что это цитокинин зеатин, а максимальная абсорбция другого компонента цитокининовой природы наблюдалась при 257,5 нм.

Рис. 1. Хроматографические профили низкомолекулярных фракций культуральных жидкостей штамма Р. сЫогогарЫя ИБ 6 (ВЭЖХ, 254 нм, колонка гогЬах-ООв (250x4,6 мм, "вЫтасЬи", Япония), элюент - вода), выращенного (а) - на среде варианта № 6 ПФЭ, (б) - на среде Кинг В. Компоненты фракций: 1 — с антигрибной активностью, 2, 3, 6, 7 - с фитогормональной активностью.

Вреся элтшш. мин

Рис. 2. УФ - спектры компонентов с фитогормональной выделенных из НМ фракции КЖ штамма Р. сЫогогарЫь ИБ 6: а -из рис. 1а, б - компонента 3 из рис. )а.

активностью, компонента 2

0 3 в 9 ±г 15 ±в

Вре./кг элюш<н, мм«

При культивировании же на среде Кинг В вышеуказанный исследуемый штамм продуцировал по данным хроматографии семь компонентов (рис. 16). Дальнейший анализ показал наличие у одного из них антигрибной активности, у четырех - фитогормональной активности цитокининовой природы. При этом выход цитокининов не превышал 680 нг/мл культуральной жидкости.

Таким образом, в результате проведенных экспериментов с использованием метода математического планирования были выявлены условия максимальной продукции штаммом Pseudomonas chlororaphis ИБ 6 веществ цитокининовой природы, позволяющие получать культуральную жидкость этих бактерий с концентрацией цитокининов свыше 1100 нг/мл.

Оценка антигрнбной активности штаммов выращенных на новых питательных средах. Исследуемые штаммы Р. chlororaphis ИБ 51, Р. chlororaphis ИБ 6, Р. putida ИБ 17, выращенные в оптимальных условиях на оптимизированных средах, проверили на антигрибную активность. Спектр антагонистической активности был оценён зонами подавления гриба в сравнении с зонами подавления фитопатогенов штаммами, выращенными на классической среде Кинг В. По полученным результатам антигрибной активности исследуемых штаммов Pseudomonas видно (рис. 3), что бактерии, выращенные в оптимизированных условиях, по фунгицидной активности не уступают микроорганизмам, выращенным на классической среде Кинг В в тех же условиях.

Рис. 3. Спектр антигрибной активности штаммов Р. chlororaphis ИБ 51 (а), Р. chlororaphis ИБ 6 (б), Р. putida ИБ 17 (в), выращенных на оптимизированной среде и среде Кинг В, в сравнении.

Выявлено, что антигрибная активность, в отношении почти всех исследуемых тест-грибов штамма Pseudomonas pulida ИБ 17, выращенного на оптимизированной среде (рис. 4), превышает активность двух других штаммов, выращенных также на оптимизированных средах.

Таким образом, штамм-антагонист Pseudomonas pulida ИБ 17 может стать основой микробиологического препарата нового поколения, обладающего широким спектром антагонистической активности в отношении фитопатогенных грибов р. Fusarium, Alternaria и Helminthosporium.

В. sorokiniaria АИ. alternata Г

F. graminearum F, culmórum F. semjtectum F.. gibbosum

Зона лодзилония, мм

Рис. 4. Спектр антигрибной активности штаммов Р. chlororaphis ИБ 51, Р. chlororaphis ИБ 6 и Р. putida ИБ 17, выращенных на оптимизированных средах, в сравнении.

Изучение параметров культивирования штамма Pseudomonas chlororaphis ИЬ 51 в периодических и непрерывных условиях. На основе штамма Р. chlororaphis ИБ 51 ранее был разработан биопрепарат «Елена» (Логинов и др., 2003), наработка которого производится в периодическом режиме культивирования. Учитывая увеличивающуюся потребность в биологических препаратах в сельском хозяйстве, исследовали возможность

наработки биопрепарата «Елена» в непрерывных условиях. Для определения максимальной удельной скорости роста рабочего штамма Р. сМогогарЫэ ИБ 51 в непрерывном режиме провели серию ферментации в периодическом режиме культивирования. Кривая роста штамма Р. сЫогогарЫь ИБ 51 представлена на на рис. 5.

О ----,--------,........-т- —г----г-—,---тг—-г-----1-----— О

О 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48

время культивирования, н

♦ гш р клеток — аш'игрионая активност ь;

Рис. 5. Динамика периодического роста и накопления антибиотических веществ культурой Р. сЫогогарЫя ИБ 51.

Культивирование в оптимальных условиях позволяет штамму интенсивно накапливать метаболиты с антигрибной активностью на завершающей стадии экспоненциального роста к 12-14 ч культивирования. В дальнейшем антигрибная активность культуры Р. сЫогогарМя ИБ 51 практически не изменяется до окончания культивирования.

Переход от периодического процесса культивирования к непрерывному провели при помощи графоаналитического метода. Были определены скорости разбавления для нескольких состояний динамического равновесия путем сопоставления зависимости накопления биомассы от времени культивирования с данными о продуктивности процесса по выходу биомассы.

Далее провели серию наработок культуры штамма Р. chlororaphis ИБ 51 в режиме непрерывного культивирования в условиях, определенных расчетно-графически при скоростях разбавления D=0,26; 0,34; 0,5; 0,7 ч"1.

В ходе эксперимента было установлено, что при значении скорости разбавления D=0,7 ч"1 наблюдалось вымывание культуры из ферментера, так как соответствовало максимальной удельной скорости роста штамма (|imax). При установлении скорости разбавления D=0,26 ч"1; 0,34 ч~1; 0,50 ч"1 система достигает стационарного режима при концентрации клеток в интервале от 4*109 до 1,2 *Ю10 КОЕ/мл КЖ (максимум при D=0,5 ч'1). Дальнейшее увеличение скорости протока вызывает уменьшение урожая клеток.

Таким образом, были аналитически рассчитаны и экспериментально подтверждены параметры для промышленного культивирования штамма Pseudomonas chlororaphis ИБ 51 в условиях хемостата с высокой производительностью процесса накопления биомассы.

Питательные среды для промышленного культивнрования псевдомонад и экономический эффект от использования новых сред. Исследовав параметры культивирования бактерий па среде с автолизатом отработанных пивных дрожжей, получили технологическое решение производства биопрепарата с использованием вторичного сырья.

Для того чтобы, не быть зависимыми в своем производстве от какой-то одной области промышленности, была предпринята успешная попытка перенести разработанные условия культивирования для производства биопрепарата на родственный субстрат - пекарские дрожжи и его автолизат. Автолизат пекарских дрожжей не уступает по своим характеристикам, таким как, содержание незаменимых аминокислот, аминного (4,47 %, АСВ) и общего азота (5,74%, от АСВ), автолизату пивных дрожжей.

Внедрение в технологический процесс новых питательных сред значительно сократит технологические расходы на стадии приготовления питательной среды, что крайне необходимо в условиях развивающейся агробиотехнологии.

Данные экономического расчета (табл. 9) затрат на питательные среды (в ценах 2009 г.), показали, что наиболее дешёвой питательной средой является оптимизированная среда на основе автолизата пивных дрожжей. Экономический эффект от использования разработанной среды по сравнению с Кинг В составил 146275 руб за один цикл наработки целевого продукта в объёме 10 т. Таким образом, использование оптимизированной среды на основе автолизата пивных дрожжей значительно сокращает долю производственных затрат на питательную среду в себестоимости готового продукта с 22% до 3,6%.

Таблица 9

Экономический эффект использования питательных сред за один цикл наработки (10 т) биопрепарата «Елена»

Варианты сред Стоимость среды, руб. Себестоимость продукта, руб. Доля среды в себестоимости продукта

Модифицированная Кинг В 168763,21 765000 22%

Оптимизированная на автолизате пекарских дрожжей 23738,18 619975 3,8%

Оптимизированная на автолизате пивных дрожжей 22488,18 618724 3,6%

Нами показана целесообразность использования разработанных оптимизированных питательных сред на основе автолизата пивных дрожжей при производстве биопрепаратов на основе бактерий-продуцентов рода Pseudomonas, которые обеспечивают высокую антагонистическую активность в сочетании с экономической и технологической приемлемостью. В то же время, исходя из соображения соответствия цены и качества в сравнении со средой Кинг В, автолизат пекарских дрожжей, как и сами дрожжи, также могут быть использованы как компонент питательной среды в производстве биопрепарата «Елена».

22

ВЫВОДЫ

1. Показано, что антигрибная активность и накопление биомассы при культивировании штаммов Р. chlororaphis ИБ 51, Р. chlororaphis ИБ 6 и Р. putida ИБ 17 главным образом зависят от содержания дрожжевого автолизата и фосфатов в ферментационной среде.

2. Разработаны новые экономичные ферментационные среды на основе автолизатов отработанных пивных дрожжей, пекарских дрожжей для промышленной наработки биопрепаратов на основе бактерий рода Pseudomonas для защиты сельскохозяйственных растений от грибных фитопатогенов с максимальной антигрибной активностью и высоким титром клеток.

3. Выявлены условия максимальной продукции штаммом Pseudomonas chlororaphis ИБ 6 веществ цитокининовой природы, позволяющие получать культуральную жидкость этих бактерий с концентрацией цитокпнинов свыше 1100 нг/мл.

4. Подобраны оптимальные условия периодического и непрерывного промышленного культивирования биопрепарата «Елена» и аналогичных биопестицидов на основе бактерий рода Pseudomonas.

5. Показано, что антигрибная активность штамма Р. putida ИБ 17, выращенного в оптимальных условиях, максимальна среди исследуемых штаммов псевдомонад.

Список опубликованных работ по теме диссертации Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1. Четвериков С.П., Асабнна Е.А., Логинов О.Н. Оптимизация состава питательной среды для промышленного производства биопрепарата «Елена» // Башкирский химический журнал.-2006. - Т 13. - №2. - С.10-13.

2. Асабина Е.А., Четвериков С.П., Логинов О.Н. Сравнительный анализ математических моделей биосинтеза ингибиторов роста фитопатогенов псевдомонадами // Вестник Оренбургского государственного университета- 2008. - №5(86). - С.122-124.

3. Сулейманова Л.Р., Асабина Е.А., Дубинина О.Н., Лопшов О.Н., Четвериков С.П., Галимзянова Н.Ф., Черняева Н.Ю., Хуснаризанова Р.Ф., Снлищев H.H. Микроорганизм

Pseudomonas aureofaciens ИБ 51 и биопрепарат «Елена» // Токсикологический вестник,-

2008,-№3,-С. 39-41.

4. Асабина Е.А., Четвериков С.П., Логинов О.Н. Отработанные пивные дрожжи -компонент для промышленного производства биопрепаратов // Аграрная Россия - 2009,-Специальный выпуск - С. 115.

5. Асабина Е.А., Четвериков СЛ., Логинов О.Н. Оптимизация биосинтеза ингибиторов роста фитопатогенов бактериями рода Pseudomonas // Биотехнология,-

2009,-№3,- C.67-7I.

6. Четвериков С.ГТ, Асабина Е.А. Цитокининподобные вещества Pseudomonas chlororaphis ИБ 6 /У Вестник Оренбургского государственного университета — 2009.- №10-С.512-513.

Публикации в других изданиях

7. Асабина Е.А., Четвериков С.П., Логинов О.Н. Оптимизация состава питательной среды для культивирования Pseudomonas aureofaciens ИБ 51- продуцента БАВ // Сборник тезисов IV Всероссийской научной INTERNET-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био-и органической химии и биотехнологии», Уфа. -2006,-С. 109.

8. Асабина Е.А., Четвериков СП., Логинов О.Н. Оптимизация состава питательной среды для культивирования Pseudomoms aureofaciens ИБ 6- продуцента БАВ // Сборник тезисов XIX Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии Реактив-2006», Уфа. - 2006. - С.48.

9. Асабина Е.А., Четвериков С.П. , Логинов О.Н. Оптимизация состава питательных сред для культивирования бактерий рода Pseudomonas- продуцентов БАВ // Материалы I Всероссийской научно-практической конференции «Питательные среды и методы культивирования клеток для биологии, медицины и биоиндустрии: фундаментальные и прикладные аспекты», Пущино 24-25 мая. - 2007,- С.7.

10. Патент РФ № 2303061, 2007. Питательная среда для культивирования бактерий рода Pseudomonas // Логинов О.Н., Силищев H.H., Коршунова Т.Ю., Четвериков С.П., Асабина Е.А.

Л. Асабина Е.А., Четвериков С.П., Логинов О.Н Отработанные пивные дрожжи компонент сред для промышленного производства биопрепаратов - фунгицидов // Современная микология в России. Том 2. материалы второго Съезда микологов России М.: Национальная академия микологии. - 2008. - С.286.

Отпечатано с готового оригинал-макета в ООО «Типограф-У» 450098, г.Уфа, ул .Комсомольская, 2 Заказ №101, т.110,2009, Формат 60x90 1/16. Уч. п.л. 1,5, усл. печ. л. 1,4 Бумага офсетная. Отпечатано методом ризографии

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Асабина, Елена Антоновна

Введение.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Бактерии рода Pseudomonas - PGPR.

1.1.1. Антагонистическая активность PGPR Pseudomonas.

1.1.2. Синтез фитогормонов PGPR Pseudomonas.

1.1.3. Биопрепараты на основе бактерий рода Pseudomonas.

1.2. Оптимизация культивирования бактерий рода Pseudomonas.

1.2.1.Условия культивирования, питательные среды для бактерий рода Pseudomonas — продуцентов метаболитов с антигрибной активностью.

1.2.2. Математическое моделирование в оптимизации условий культивирования микроорганизмов.

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Объекты исследований.

2.2. Условия хранения бактерий р. Pseudomonas.

2.3. Условия хранения и культивирования фитопатогенных грибов.

2.4. Условия культивирования бактерий р. Pseudomonas.

2.5. Оптимизация условий культивирования бактерий р. Pseudomonas

2.6. Определение антигрибной активности метаболитов Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью.

2.7. Определение спектра антагонистического действия культур Pseudomonas.

2.8. Определение фитогормональной активности метаболитов Pseudomonas.

2.9. Приготовление автолизата пивных дрожжей.

2.10. Приготовление автолизата пекарских дрожжей.

2.11. Определение содержание белка в дрожжевом автолизате.

2.12. Определение массовой доли азота аминогрупп аминокислот и низших пептидов в дрожжевом автолизате.

2.13. Определение массовой доли общего азота в дрожжевом автолизате.

2.14. Статистическая обработка результатов.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1. Оптимизация питательных сред при культивировании бактерий рода Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью.

3.1.1. Дрожжевой автолизат — компонент питательной среды.

3.1.2. Получение математических моделей для трёх штаммов Pseudomonas.

3.1.3. Определение оптимального состава питательных сред для культивирования бактерий Pseudomonas.

3.2. Штамм Pseudomonas chlororaphis ИБ 6 — продуцент цитокининов.

3.3. Культивирование бактерий рода Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью.

3.3.1. Оптимизация условий культивирования трех штаммов Pseudomonas.

3.3.2. Оценка антигрибной активности штаммов Pseudomonas, выращенных в оптимальных условиях.

3.3.3. Изучение параметров культивирования штамма Pseudomonas chlororaphis ИБ 51 в периодических и непрерывных условиях.

3.4. Питательные среды для промышленного культивирования псевдомонад и экономический эффект от использования новых сред.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование оптимальных условий культивирования бактерий рода Pseudomonas-продуцентов биологически активных веществ"

Актуальность проблемы. Бактерии рода Psendomonas - одна из наиболее изученных групп микроорганизмов с точки зрения объектов биологического контроля почвенных фитопатогенов (Рубан, 1986; Смирнов, Киприанова, 1990; Воронин, 1998; Логинов, 2005; Weller, 1989; Dowling & O'Gara, 1994; Whipps, 2001; Garg et al., 2005) и обладающих совокупностью полезных для растений свойств. В настоящее время такие бактерии принято обозначать PGPR - Plant Growth-Promoting Rhizobacteria (ризобактерии, способствующие росту растений).

Следует также отметить, что PGPR Pseudomonas являются потенциальными объектами агробиотехнологий для разработки на их основе биологических средств защиты растений от фитопатогенов.

Актуальность выбранного направления исследований обусловлена необходимостью разработки новых биопестицидов и создания соответствующих новых технологий их производства. Известные до сих пор среды для культивирования ризосферных бактерий рода Pseudomonas слишком дорогостоящие. Для производства же средств защиты растений необходимо разработать более простые и дешевые технологии. Одним из путей снижения себестоимости целевого продукта является уменьшение производственных затрат на питательные среды при сохранении продуктивности и антагонистической активности штаммов-продуцентов.

При подборе питательных сред и условий культивирования с целью повышения выхода биомассы или накопления определенных продуктов обмена веществ микроорганизмов, таких как антибиотики или ростстимулирующие вещества, широкое применение нашли методы математического планирования эксперимента (Максимов, Фёдоров, 1969; Егорова, 1976; Бойченко и др., 2002; Автономова и др., 2006; Flavia et al., 2006; Mandal et al., 2007; Narajana et al., 2008; Sharma et al., 2009). Которые позволяют не только одновременно изучить действие нескольких факторов на интересующий исследователей процесс, но и количественно оценить степень этого влияния.

Цель исследования. Целью исследований являлось оптимизировать питательные среды и условия культивирования штаммов бактерий Pseudomonas chlororaphis ИБ 51 (Патент РФ № 2203945, 2003) - основы биопрепарата «Елена», Pseudomonas putida ИБ 17 (Патент РФ № 2213774, 2003), Pseudomonas chlororaphis ИБ 6 (Патент РФ № 2260951, 2005) продуцирующих антибиотики и ростстимулирующие вещества.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить степень влияния компонентов питательной среды на накопление биомассы и антигрибной активности при культивировании штаммов Pseudomonas chlororaphis ИБ 51, Pseudomonas chlororaphis ИБ 6 и Pseudomonas putida ИБ 17.

2. Определить оптимальный состав ферментационных сред для культивирования штаммов Р. chlororaphis ИБ 51, Р. chlororaphis ИБ 6 и Р. putida ИБ 17, с максимальной антигрибной активностью и высоким титром клеток.

3. Изучить закономерности синтеза цитокининов штаммом бактерий Pseudomonas chlororaphis ИБ 6 в зависимости от состава питательной среды.

4. Оптимизировать условия периодического и непрерывного промышленного культивирования штаммов Pseudomonas.

Научная новизна. Разработаны технологии промышленного культивирования бактерий рода Pseudomonas для производства биопрепаратов сельскохозяйственного назначения с высокой антигрибной и ростстимулирующей активностью.

Практическая значимость. Разработаны новые, экономичные питательные среды и подобраны оптимальные условия для промышленной наработки биопрепаратов на основе бактерий рода Pseudomonas, что может быть использовано при производстве биопрепарата "Елена", предназначенного для защиты сельскохозяйственных растений от грибных фитопатогенов.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на IV Всероссийской научной INTERNET-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био-и органической химии и биотехнологии» (Уфа, 2005), XIX Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии Реактив-2006» (Уфа, 2006), I Всероссийской научно-практической конференции «Питательные среды и методы культивирования клеток для биологии, медицины и биоиндустрии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Пущино, 2007), II съезде микологов России «Современная микология в России» (Санкт-Петербург, 2008).

Публикации. По материалам работы опубликовано 11 научных работ, в том числе шесть статей в рецензируемых журналах, входящих в Перечень ВАК, рекомендованных для соискателей учёной степени и 1 патент Российской Федерации.

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, описание объектов и методов исследований, экспериментальную часть (4 главы), заключение, выводы и список цитируемой литературы, содержащий 139 ссылок. Работа изложена на 100 страницах машинописного текста и содержит 14 рисунков и 12 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Асабина, Елена Антоновна

ВЫВОДЫ

1. Показано, что антигрибная активность и накопление биомассы при культивировании штаммов Р. chlororaphis ИБ 51, Р. chlororaphis ИБ 6 и Р. putida ИБ 17 главным образом зависят от содержания дрожжевого автолизата и фосфатов в ферментационной среде.

2. Разработаны новые экономичные ферментационные среды на основе автолизатов отработанных пивных дрожжей, пекарских дрожжей для промышленной наработки биопрепаратов на основе бактерий рода Pseudomonas для защиты сельскохозяйственных растений от грибных фитопатогенов с максимальной антигрибной активностью и высоким титром клеток.

3. Выявлены условия максимальной продукции штаммом Pseudomonas chlororaphis ИБ 6 веществ цитокининовой природы, позволяющие получать культуральную жидкость этих бактерий с концентрацией цитокининов свыше 1100 нг/мл.

4. Подобраны оптимальные условия периодического и непрерывного промышленного культивирования биопрепарата «Елена» и аналогичных биопестицидов на основе бактерий рода Pseudomonas.

5. Показано, что антигрибная активность штамма Р. putida ИБ 17, выращенного в оптимальных условиях, максимальна среди исследуемых штаммов псевдомонад.

Заключение

Современное сельское хозяйство характеризуется высокой степенью использования пестицидов. На сегодняшний день экологические нарушения, вызванные применением химических средств защиты растений, настолько велики, что все более острым становится вопрос о снижении количества используемых синтетических пестицидов. В качестве альтернативы или дополнения к химическим препаратам выступают биологические методы борьбы с фитопатогенными организмами. Одним из направлений биологической защиты растений, является использование микроорганизмов или продуктов их жизнедеятельности в качестве биопестицидов.

Наиболее подробно изученными бактериями-антагонистами фитопатогенных грибов являются представители рода Pseudomonas, что относит их к числу наиболее перспективных объектов для использования в сельскохозяйственной практике. Так как они обладают различными механизмами положительного влияния на растения, одними из которых являются синтез антифунгальных антибиотиков и ростстимулирующих веществ.

Одним из ключевых этапов внедрения новых биопрепаратов является разработка технологий их производства. Одной из проблемы промышленного производства биопрепаратов на основе бактерий рода Pseudomonas, предназначенных для использования в растениеводстве, является высокая стоимость питательной среды, которая неизбежно приводит к удорожанию целевого продукта.

В ходе работы были разработаны новые экономически приемлемые ферментационные среды на основе отработанных пивных дрожжей, на основе автолизата пекарских дрожжей и самих пекарских дрожжей, обеспечивающие высокие титр клеток и антигрибную активность. Полученные среды вполне успешно могут применяться при промышленном производстве биопрепаратов - фунгицидов на основе бактерий рода Pseudomonas.

Разработаны технологии периодического и непрерывного промышленного культивирования штаммов Pseudomonas для производства биопрепаратов сельскохозяйственного назначения с высокой антигрибной и ростстимулирующей активностью.

Один из исследуемых штаммов, а именно, Р. chlororaphis ИБ 51, является основой биопрепарата «Елена», прошедшего Государственную регистрацию биопестицида и (или) агрохимиката в Министерстве сельского хозяйства РФ. Испытания биопрепарата «Елена» в лабораторных и полевых условиях показали его эффективность для защиты пшеницы от корневых гнилей, альтернариоза. Кроме того, данный препарат в вегетационных опытах показал возможность его применения для защиты пшеницы от поражения твердой головней. Также он может быть использован для подавления развития бактериоза огурцов, корневых гнилей фасоли, некоторых болезней картофеля, моркови, сои и др.

В результате проведенных экспериментов с использованием метода математического планирования были выявлены условия максимальной продукции штаммом Pseudomonas chlororaphis ИБ 6 веществ цитокининовой природы, позволяющие получать культуральную жидкость этих бактерий с концентрацией цитокининов свыше 1100 нг/мл.

Установлено, что антигрибная активность в отношении почти всех исследуемых тест-грибов штамма Pseudomonas putida ИБ 17, выращенного на оптимизированной среде, превышает активность двух других штаммов, выращенных также на оптимизированных средах. Таким образом, штамм -антагонист Pseudomonas putida ИБ 17 имеют полное право для создания и на его основе микробиологического препарата нового поколения, обладающего высокой антагонистической активности в отношении широкого спектра фитопатогенных грибов р. Fusarium, Alternaria и Helminthosporium.

Экономический эффект от использования разработанной среды на основе автолизата пивных дрожжей по сравнению с Кинг В составил 146275 руб за один цикл наработки целевого продукта в объёме 10 т. Что значительно сократило себестоимость биопрепарата «Елена» с 760000 руб. до 619975 руб. за 10 т. Таким образом, использование оптимизированной среды на основе автолизата пивных дрожжей значительно сокращает долю технологических затрат на питательную среду в себестоимости готового продукта с 22% до 3,6%.

85

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Асабина, Елена Антоновна, Уфа

1. Автономова А. В., Краснопольская Л. М., Максимов В. Н. Оптимизация состава питательной среды для погруженного культивирования Canoderma lucidum II Микробиология. — 2006 — том 75, №2 — С. 186-192.

2. Багдасарян З.Н., Алексанян Г. А., Гукасян Г. С., Мирзоян А. М. Оптимизация среды и условий культивирования продуцента фумаразы и аспартазы Erwinia sp // Прикладная биохимия и микробиология. 2000. - том 36, №5.- С. 545-548.

3. Воронин А.М. Ризосферные бактерии рода Pseudomonas, способствующие росту и развитию растений // Соросовский образовательный журнал.-1998.-№ Ю.-С. 25-31.

4. Ветрова А.,А., Нечаева И., А., Игнатова А., А., Пунтус И.,Ф., и др. Влияние катаболических плазмид на физиологические параметры бактерий рода Pseudomonas и эффективность биодеструкции нефти // Микробиология. 2007.-№3,-С. 354-360.

5. Волчатова И. В., Медведева С. А., Бабкин В. А. Оптимизация состава питательной среды как способ регуляции синтеза лигниназы грибом Coriolus villosus II Прикладная биохимия и микробиология. — 1997- том 33, №1 — С.94-97.

6. Гущина Ю.А., Евдокимов E.B. Формальдегидрезистентные бактерии рода Pseudomonas как агенты биоконтроля и биостимуляции льна // Экология сегодня. 2001.- № 1.- С.65-67.

7. Додзин М. Е., Виноградова К. А., Котова И. Б. Новые продуценты L-глутаматоксидазы Streptomyces litmocidini и Streptomyces cremeus II Антибиотики и химиотерапия. - 1998 - №4.- С.7-13.

8. Долгова Е.М., Манько О.П., Зубко И .Я. и др. Препараты псевдобактерин-2 и псевдобактерин-3 против болезней пшеницы // Химия в сельском хозяйстве. 1997- №1.- С. 13-14.

9. Дурынина Е. П., Пахненко О. А., Злотников А. К., Злотников К. М. Влияние биопрепарата альбит на продуктивность ячменя и содержание биофильных элементов в урожае // Агрохимия. 2006 - №1- С. 49-54.

10. Егорова Н.С. Практикум по микробиологии Учебное пособие. М, 1976. 307с.

11. Ермакова H.H., Штерншис М.В. Новый биопрепарат РИЦ против болезней растений // Защита растений. 1994- № 12.- С. 18.

12. Квасников Е. И., Айзенман Б.Е., Соломко Э.Ф. и др. Рост и образование антибиотиков бактериями рода Pseudomonas на средах с низкомолекулярными н-алканами // Микробиология. 1975- Т. 44, № 1- С. 55-60.

13. Кравченко JI.B., Шапошников А.И., Макарова Н.М. и др. Динамика численности антифугальных штаммов Pseudomonas в ризосфере огурцов, выращиваемых в условиях гидропоники на минеральном тепличном субстрате // Микробиология. 2006. - Т.75, №3. - С.404-409.

14. Климова В. А. Основные микрометоды анализа органических соединений. М.: Химия, 1967. - 208 с.

15. Кондратьева Т. Ф., Лобачёва Н. А. Оптимизация состава питательной среды методом математического планирования с целью увеличенияколичества синтезируемого Pitlliilaria pulliilans пуллулана // Микробиология. 1990. - Т. 59, Вып 6. - С. 1004-1009.

16. Королёва О.В., Степанова Е. В., Гаврилова В. П. и др. Оптимизация условий глубинного культивирования базидиомицета Coriolus hirsutus -продуцента внеклеточной лакказы // Прикладная биохимия и микробиология . 2000. - том 36, №1. - С. 30-36.

17. Коршунова Л.Ю., Силищев H.H., Галимзянова Н.Ф., Логинов О.Н. Биофунгицид Елена для протравливания семян ячменя ярового и его влияние на урожайность и устойчивость к болезням // Башкирский химический журнал. 2007. - Т. 14, № 4. - С. 92-94.

18. Кочетков В.В., Чигалейчик А.Г., Петрикевич С.Б. и др. Биопрепарат псевдобактерин-2 для защиты растений от широкого спектра фитопатогенов // Химия в сельском хозяйстве. 1997. - №1. - С. 15-16.

19. Кудоярова Г.Р., Веселов С.Ю., Каровайко Н.И. и др. Иммуноферментная система для определения цитокининов // Физиология растений. 1990. - Т. 37, вып. 1. - С. 193-199.

20. Кудоярова Г.Р., Веселов С.Ю., Еркеев М.И. и др. Иммуноферментное определение содержания индолилуксусной кислоты в семенах кукурузы с использованием меченых антител // Физиология растений. 1986. - Т. 33, вып. 6.-С. 1221-1227.

21. Кузнецова М.А., Филиппов A.B. Ризоплан и фитофтороз картофеля // Защита растений. -1995. -№ 8. С. 19-20.

22. Кузнецов Л. Е., Ховрычев М. П. Оптимизация синтетической среды для культивирования Bacillus thuringiensis II Микробиология. — 1984. — Т.53 вып.1 С. у54-57.

23. Кулаева О.Н. Как регулируется жизнь растений // Соросовский образовательный журнал. — 1995. — № 1. — С. 20-27.

24. Куликов С.Н., Алимова Ф.К., Захарова Н.Г., Немцев C.B., Варламов В. П. Биопрепараты с разным механизмом действия для борьбы с грибнымиболезнями картофеля // Прикладная биохимия и микробиология. — 2006. №1 - С. 86-92.

25. Логинов О.Н., Свешникова Е.В., Исаев Р.Ф., Силищев H.H., Галимзянова Н.Ф., Бойко Т.Ф. Биопрепараты против твердой головни пшеницы // Защита и карантин растений. 2002. - № 9. - С. 39.

26. Логинов О.Н., Пугачева Е.Г., Исаев Р.Ф., Силищев H.H., Бойко Т.Ф., Галимзянова Н.Ф. Биологические средства защиты картофеля от болезней // Аграрная наука. 2003. - № 7. - С. 24.

27. Логинов О.Н., Четвериков С.П. Биосинтез низкомолекулярных метаболитов бактериями Pseudomonas aureofaciens ИБ 51// Биотехнология. — 2003.-№5.-С. 22-25.

28. Логинов О.Н., Силищев H.H., Погосова C.B. Технологические аспекты опытно-промышленного производства биопрепарата на основе бактерий рода Pseudomonas II Башкирский химический журнал.-2003.-Т. 10, № 4.-С. 73-75.

29. Логинов О.Н. Бактерии Pseudomonas и Azotobacter как объекты сельскохозяйственной биотехнологии.- М.: Наука. — 2005. 166 с.

30. Максимов В.Н., Федоров В.Д. Применение методов математического планирования эксперимента при отыскании оптимальных условий культивирования микроорганизмов. М, 1969; — 126 с.

31. Максимов В. Н., Федоров В. Д., О математическом планировании биологических экспериментов // Известия АН СССР, сер. биол. 1966. - №6, С. 864-877.

32. Межераупе В. А. Использование картофельного сока для выращивания микроорганизмов. В кн.: Продуценты аминокислот и ферментов. Рига: Зинатие, 1987, С. 124-177.

33. Мелентьев А. И. Аэробные спорообразующие бактерии Bacillus Cohn в агроэкосистемах. — M.: Наука, 2007. — 147 с.

34. Методы общей бактериологии. Под ред. Ф. Герхард Т. 2. — М: Мир,1984. С. 293-295, 356-358.

35. Мишке И. В. Микробные фитогормоны в растениеводстве. — Рига: Зинатне, 1988.- 151 с.

36. Мишке И. В., Тевелева М. К., Миклашевиче Э. П. Некоторые свойства микробных цитокининов из Pseudomonas stützen II Микробиология. 1985.-вып.5-С. 774-777.

37. Монахова О. Ф. и Чернядьев И.И. Протекторное влияние цитокининовых препаратов на фотосинтетический аппарат растений пшеницы при водном дефиците // Прикладная биохимия и микробиология. -2007. -Т. 43, №6. -С. 720-729.

38. МордуховаЕ. А., Скворцова Н. П., Кочетков В. В., Дубейковский А. Н., Воронин А. М. Синтез фитогормона Индол-3- уксусной кислоты ризосферными бактериями рода Pseudomonas // Микробиология. 1991. -выпЗ.-С. 494-499.

39. Мордухова Е.А., Кочетков В.В., Поликарпова Ф.Я. и др. Синтез индолил-3-уксусной кислоты ризосферными псевдомонадами: Влияние плазмид биодеградации нафталина // Прикладная биохимия и микробиология. 1998. - Т.34, № 3. - С.287-292.

40. Назарова J1.H., Наговицин В.А., Черемисина В.Г. Против комплекса болезней озимой ржи // Защита растений. 1995. — № 8. — С. 18-19.

41. Назарова JI.H. Агат-25К на зерновых культурах // Защита и карантин растений.-2002.-№ 1.-С. 21-22.

42. Нетрусова А. И., Егорова М.А., Захарчук JI.M. и др. Практикум по микробиологии.-М.: Издательский центр «Академия», 2005. — 608 с.

43. Олюнина J1.H., Шабаев В.П. Продуцирование индолил-3-уксусной кислоты ризосферными бактериями рода Pseudomonas в процессе роста // Микробиология. 1996. - Т.6, №6. - С.813-817.

44. Патент РФ № 2260951, Б.И. № 27, 2005. Штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens ИБ 6 продуцент цитокининов / Логинов О.Н., Мелентьев А.И., Свешникова Е.В., Кузьмина Л.Ю., Четвериков С.П., Васильева Н.С., Силищев H.H.

45. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М.: Мир, 1978.-С. 331.

46. Рубан Е.Л. Физиология и биохимия представителей рода Pseudomonas. -М.: Наука, 1986.-200 с.

47. Сидоренко О.Д., Стороженко В., Кухаренкова О. Применение бактериальных препаратов при выращивании картофеля // Междунар. с-х. ж. 1996. — № 6. -С.36-38.

48. Силищев H.H., Коршунова Т.Ю., Логинов О.Н. Биопрепарат Елена для защиты тепличных овощей от грибных фитопатогенов и повышения урожайности // Картофель и овощи. 2008. - № 2. — С. 28-30.

49. Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas. Киев: Наук, думка, 1990. - 264 с.

50. Струнникова О. К., Шахназарова В., Ю., Вишневская Н., А., Чеботарь В., К., Тихонович И. А. Развитие и взаимоотношения Fusarium culmorum и Pseudomonas fluorescens в почве // Микробиология. 2007 - №5. - С. 675-681.

51. Сторожук С.В., Сидоров И.А., Соколов М.С. Высокое качество биопрепарата — залог успеха // Защита растений. 1995. - № 8. - С. 17.

52. Титаренко Л.Н., Вяткина Г.Г., Алещенко М.Н. Применение ризоплана на Северном Кавказе // Защита растений. 1995. - № 8. - С. 17.

53. Холмецкая М.О., Лобанок Е.В., Чернин Л.С. Синтез индолилуксусной кислоты некоторыми фитопатогенными и непатогенными бактериями // Докл. АН Беларуси. 1996. - Т.40, № 2. - С. 80-83.

54. Цевкелова Е. А., Климова С. Ю., Чердынцева Т. А., Нетрусов А. И. Микроорганизмы продуценты стимуляторов роста растений и их практическое применение (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология. - 2006. - том 42, №2. - С. 133-143.

55. Цевкелова Е. А., Климова С. Ю., Чердынцева Т. А., Нетрусов А. И. Гормоны и гормоноподобные соединения мокроорганизмов (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология. 2006. - том 42, №3. - С.261-268.

56. Четвериков С.П., Логинов О.Н. Триглицеридпептиды псевдомонад — новые агенты биологического контроля фитопатогенных грибов // Прикладная биохимия и микробиология. 2005. - том 41,№1. - С.90-94.

57. Шабаев В.П., Олюнина Л.Н., Смолин В.Ю. Функциональная активность корней кукурузы при инокуляции стимулирующими рост растений ризосферными бактериями рода Pseudomonas II Изв. РАН.Сер. биол.- 1999.-№1.-С.39-46.

58. Шабаев В. П. Влияние инокуляции сахарной свеклы ростстимулирующими ризосферными бактериями рода Pseudomonas на урожай и качество растений // Агрохимия. 2008. - №4. - С. 35-42.

59. Широков A.B., Логинов О.Н., Мелентьев А.И., Актуганов Г.Э. Белковые и пептидные факторы Bacillus sp. 739 — ингибиторы ростафитопатогенных грибов // Прикладная биохимия и микробиология. — 2002. — Т. 38,№2.-С. 161-165.

60. АН Siddiqui I, S.Ehetshamul-Haque, S. Shahid Shaukat. Use of rhizobacteria in the control of root rot-root knot disease complex of mungbean // J.Phytopathol. 2001. -N 6. - P.337-346.

61. Becker J.O., Cook R.J. Role of siderophores in suppression of Pythium species and production of increased growth response of wheat by fluorescent pseudomonas // Phytopathology. 1988. - V. 78. - P. 778-782.

62. Becker J.O., Hepfer C.A., Yuen G.V. et al. Effect of rhizobacteria and metham-sodium on growth root microflora of celery cultivars // Phytopathology — 1990. Vol. 80, N 2. - P. 206-211.

63. Box G. E. P., Wilson К. B. On the experimental attainment of optimum conditions // J. Roy. Stat.Soc., ser.B. 13.1951, N1

64. Box G. E. P., Hunter J. S. Multifactor experimental designs for exploring response surfaces // Ann. Math. Stat., 28, 1957, N1, 195

65. Budzikiewicz H. Secondary metabolites from fluorescent pseudomonads // FEMS Microbiol. Rev. 1993. - V. 104. - P. 209-228.

66. Budzikiewicz H. Siderophores of fluorescent pseudomonads // Z. Naturforsch. 1997.-V. 52,-P. 713-720.

67. Canesan P., Gnanamanickam S.S. Biological control of Sclerotium rolfsii Sacc. in peanut by inoculation with Pseudomonas fluorescens II Soil Biol. Biochem.- 1987.-Vol. 19, N l.-P. 35-38.

68. Chin-A-Woeng T.F.C., Bloemberg G.V., Lugtenberg B.J.J. Phenazines and their role in biocontrol by Pseudomonas bacteria // New Phytologist. 2003. - V. 157. - P. 503-523.

69. Clarke P., Ornston N. Metabolic pathways and regulation. Pt 1. In: Geneties and biochemistry of Pseudomonas N. Y.;L., — 1975. - P.366.

70. Cornells P., Matthiis S. Diversity of siderophore-mediated iron uptake systems in fluorescent pseudomonads: not only pyoverdines // Environ. Microbiol. 2002. - V. 12. - P. 787-798.

71. Dowling D.N., O'Gara F. Metabolites of Pseudomonas involved in the biocontrol of plant disease // Trends Biotechnol. 1994. - V. 12. - P. 133-141.

72. Elsherif M., Grossmann F. Versuche zur biologischen Bekämpfung einiger phytopathogener Pilze durch fluoreszierende Pseudomonaden unter Anwendung verschiedener Applikationsverfahren HZ. Pflanzenkrankh. und Pflanzenschutz-1991.- Bd. 98, N 3. S. 236-249.

73. Flavia P. D., Franga F.P., Lopes M. A.Optimization of culture conditions for exopolysacharides production in Rhizobium sp. using the response surface method // Electronic Journal of biotechnology. 2006. - Vol. 9, N4, July 15. - P. 391-399.

74. Garg S. K., Kumar Y.N., Kumar J. Gold-tolerant fluorescent Pseudomonas isolates from Garhwal Himalayas as potential plant growth promoting and boicontrol agents in pea // Current science. 2005. - Vol. 89, N12, 25, December. -P. 2151-2156.

75. Guo Ying, Pu Wang et al. Medium optimization for enzymatic production of 1-Cysteine by Pseudomonas sp.Zjwp-14 using response surface methodology // Food Technology Biotechnology. 2008.- 46(4). -P. 395-401.

76. Gordon-Lennox G., Walther D., Gindral D. Utilisation d'antagonistes pour l'enrobage des semences: efficacité et mode d'action contre les agents de la fonte des semis//Bull. OEPP. Oxford etc. 1987.- Vol.17, N 4.-P. 631-637.

77. Gould W.D., Hagedorn C., Bardinelli T.R., Zablotowicz R.M. New selective media for enumeration and recovery of fluorescent pseudomonads from various habitats // Appl. Environ. Microbiol. 1985. - V. 49. - P. 28-32.

78. Hader R. J., Harward H. E., Mason D. D., Moore D. P. An investigation of some of relationships between copper, iron and molybdenum in the growth and nutrition of lettuce // Proceeding of Am. Soil Sei. Soc.21. 1957.- N 1,59.

79. Hasegawa S., Kodama F., Kaneshima H. et al. Biological control of Fusarium diseases, isolation of antagonistic microorganisms and seed bacterization on the control for Fusarium wilt of adzuki-bean // J. Pharmacobic-Dyn. 1987. -Vol. 10, N3.-P. 57.

80. He Li, Xu Y., Zhang X.H. Medium factor optimization and fermentation kinetics for phenazine-l-carboxylic acid production by Pseudomonas sp. M-18GII Biotechnol. Bioeng. 2008. - 100. - P.250-259.

81. James D.W., Gutterson N. I. Multiple antibiotics produced by Pseudomonas fluorescens HV37a and their differential regulation by glucose // Appl. Environ. Microbiol. 1986,-V. 52.-P. 1183-1189.

82. Joseph B., Patra R.R., Lawrence R. Characterization of plant growth promoting rhozobacteria associated with chickpea (Cicer arietinum L.) // International Journal of Plant Production. 2007. - 1(2), September. - P. 141-152.

83. Karakos S., Aksoz N. Some optimal cultural parameters for gibberilic acid biosyntesis by Pseudomonas sp. II Turkey Journal Biology. 2006. - 30. - P. 8185.

84. Katoh K., Itoh K. New selective media for Pseudomonas strains producing fluorescent pigment // Soil Science and Plant Nutrition. 1983. - V. 29. - P. 525532.

85. MacDonald J.C. Pyocyanine. Antibiotics. V. 2. Biosynthesis. London; New York: Springer Verl., 1967. - P. 52-65.

86. Martin J. Control of antibiotic synthesis by phosphate // Adv. Biochem. Eng. 1977. - V. 6, N 1. - P. 105-127.

87. Mao G.H., Cappellini R.A. Postharvest biocontrol of gray mold of pear by Pseudomonas gladioli: Abstr. Present. 1989 Annu. Meet. Amer. Phytopathol. Soc., Richmond, Va, Aug. 20-24, 1989 //Phytopathology.-1989.-Vol. 79, N 10.-P. 1153.

88. Mc Laughlin R.J., Sequeira L., Weingartner D.P. Biocontrol of bacterial wilt of potato with an avirulent strain of Pseudomonas solanacearum: Interactions with root-knot nematodes // Am. Potato J. 1989. - Vol. 67, N 2. - P. 93-107.

89. Mc Laughlin R.J., Sequeira L. Evaluation of an avirulent strain of Pseudomonas solanacearum for biological control of bacterial wilt of potato // Am. Potato J. 1988. - Vol. 65, N 5. - P. 255-268.

90. Mew T.W. Bacterization of rice plants for control of sheath blight caused by Rhizoctonia solani / T.W Mew., A.M.Rosales //Phytopathology. 1986. - Vol. 76, N 11.-P. 1260-1264.

91. Narajana K. J., Vijayalakshmi M. Optimization of antimicrobial metabolites production by Streptomyces albidoflavus I I Research Journal of Pharmacology — 2008.-2(1).-P.4-7.

92. Neilands J.B., Leong S.A. Siderophores in relation to plant growth and disease // Ann. Rev. Plant Physiol. 1986. - V 37. - P. 187-208.

93. Neilands J.B. Siderophores: structure and function of microbial iron transport compounds // J. Biol. Chem. 1995. - V. 270. - P. 26723-26726.

94. Novotnä J. Antagonisticky vliv bakteric Pseudomonas fluorescens na nektere patogenni i saprofyticke druhy hub fepky a Tnu // Ochr. rostl. 1990. -Vol.26, N 2. - P. 113-122.

95. Osburn R.M., Schroth M.N., Hancook J.G. et al. Dynamics of sugar beet colonization by Pythium ultimum and Pseudomonas species: effects on seed rot and damping-off// Phytopathology. 1989. -Vol. 79, N 6. - P. 709-716.

96. Paulitz T., Nowak-Thompson B., Gamard P., Tsang E., Loper J. A novel antifungal furanone from Pseudomonas aureofaciens, a biocontrol agent of fungal plant patogens //J. Chem. Ecol. 2000. - V. 26. - P. 1515-1524.

97. Pietr S.J., Kempa R.Cucumber rhizosphere pseudomonads as antagonists of Fusarium // Interrelationships Between Microorganisms and Plants Soil: Proc. Int. Symp., June 22-27, 1987. -Praha, 1989. P. 411-417.

98. Raaijmakers J.M., Weller D. M., Thomashow L. S. Frequency of antibiotic-producing Pseudomonas spp. in natural environments // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - V. 63.-P. 881-887.

99. Renato de Freitas J., Germida J.J. Pseudomonas cepacia and Pseudomonas putida as winter wheat inoculants for biocontrol of Rhizoctonia solani II Can. J. Microbiol. 1991. -Vol. 37, N 10. - P. 780-784.

100. Rhodes D.J., Logan C. Effects of fluorescent pseudomonads on the potato blacked syndrome // Ann. Appl. Biol. 1986. - Vol. 108, N 3. - P. 511-518.

101. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning. New York: Cold Spring Harbor Press; 1989. p. A1-A2.

102. Savithiry S., Gnanamanickam S.S. Bacterization of peanut with Pseudomonas fluorescent for biological control of Rhizoctonia solani and for enhanced yield //Plant and Soil.- 1987. -Vol. 102,N1.-P. 11-15.

103. Sharma A., Bardham D., Patel R. Optimization of physical parameters for lipase production from Arthrobacter sp. BGCC# 490 // Indian Journal of Biochemistry and Biophysics.- 2009. -Vol. 46, April-P. 178-183.

104. Sobiczewski Piotr., Bryk Hanna Mozliwosci i ograniczenia biologicznej ochronny jablek bakteriami Pantoea agglomerans i Pseudomonas sp. przed szara plesnia i mokra zgnilizna // Post. ochr. rosl. 1999. -NI. - P. 139-147.

105. Sorensen D., Nielsen T.H., Christophersen C., Sorensen J., Gajhede M. Cyclic lipoundecapeptide amphisin from Pseudomonas sp. strain DSS73 // Acta Crystallographica. 2001. - Section C: Crystal Structure Communications C57. -P. 1123-1124.

106. Sugimoto E.E., Hoitink H.A.J., Tuovinen O.H. Oligotro phic pseudomonads in the rhizosphere: Suppressiveness to Pythium damping-off of cucumber seedlings (Cucumis sativus L.) // Biol, and Fert. Soils -1990. Vol. 9, N 3. - P. 231-234.

107. Tosi L., Zazzerini A. Evaluation of some and bacteria for potential control of safflower rust // J. Phytopathol. 1994. -N 2. -P.131-140.

108. Tsuyumu S., Tsuchida S., Nakano T. et al. Antifungal activiti in cell-free culture fluid of Pseudomonas solanacearum II Ann. Phytopathol. Soc. Japan. — 1989.-Vol. 55, N l.-P. 9-15.

109. Yan Wang DAG, Peigen Zhou PhD, Jianxing Yu MS, Xiaorong Pan MS, et al. Antimicrobial effect of chitooligosaccharides produced by chitosanase from Pseudomonas CUY // Asia Pac J Clin Nutr -2007.-16 (Suppl 1). C. 174-177.

110. Yuan LL, Li YQ, Wang Y., Zhang XH, Xu YQ. Optimization of critical medium components using response surface methodology for phenazine-1-carboxylic acid production by Pseudomonas sp. M-18Q II Journal Biosci. Bioeng. -2008. March. 105(3). - P. 232-237.

111. Weller D.M., Thomashow L.S. Antibiotics: Evidence for their operation and sites where they might by produced // J. Cell. Biochem. 1989. - Suppl. 13A. -P. 154.

112. Wilson C.L., Chalutz E. Postharvest biological control of Pénicillium rots of citrus with antagonistic yeasts and bacteria // Sc. hortic. 1989. - Vol. 40, N 2. — P. 105-112.

113. Whipps J.M. Microbial interactions and biocontrol in the rhizosphere // J. Exp. Bot. 2001. - V. 52. - P. 487-511.

114. Zaspel J. Isolierung und Selektion fluoreszierender Pseudomonas-Arten als Antagonisten gegen Gaeumannomyces graminis (Sacc.) Arx et Olivier II Arch. Phytopathol. Pflzschutz. 1989. - Bd. 25, H. 2. - S. 123-130.

115. Zheng Y., Yanful E., Bassi A. Investigation of effects of culture medium components on polyurethane (Impranil DLM) biodégradation by Pseudomonas chlororaphis II GPEC. 2004. - Paper Abstract #31.

116. Утверждаю Зам. генерального директора по развитию и экономике ГУИхЮпытныйзавод» Академий Наук РБа*1. Е. В. Кислина1. АКТиспытания оптимизированной среды на основе автолизата пивных дрожжей.

117. Произвели испытания оптимизированной среды на основе автолизата пивных дрожжей для наработки биопрепарата «Елена».

118. ОП-1 1*Ю10 КОЕ/мл ОП-2 2*1010 КОЕ/мл ОП-3 1,5* Ю10 КОЕ/мл ОП-4 9*109 КОЕ/мл ОП-5 1,2* Ю10 КОЕ/мл

119. Зам. директора по качеству Начальник цеха Инженер-микробиолог

120. Пигильцова С. А. Каттахужаев А.Т. Асабина Е.А.