Исследование модулирующих эффектов гемолизата эритроцитов на активность Na,K-АТФазы

Кыров, Дмитрий Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование модулирующих эффектов гемолизата эритроцитов на активность Na,K-АТФазы
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование модулирующих эффектов гемолизата эритроцитов на активность Na,K-АТФазы"

На правах рукописи

КЫРОВ Дмитрий Николаевич

ИССЛЕДОВАНИЕ МОДУЛИРУЮЩИХ ЭФФЕКТОВ ГЕМОЛИЗАТА ЭРИТРОЦИТОВ НА АКТИВНОСТЬ >'а,К-АТФазы

03.00.04 БИОХИМИЯ

АВТОРЕФЕРАТ дисссрташш на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Тюмень - 2006

Рабата выполнена на кафедре анатомии и физиологии человека и животных ГОУ ВПО «Тюменский государственный университет»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Александр Дмитриевич Шалабодов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Ирина Викторовна Ральченко

кандидат биологических наук, старшин научный сотрудник Татьяна Дмитриевна Журавлева

Ведущая организация

Государственное общеобразовательное учреждение высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия»

Защита состоится «22» декабря 2006 г. в 13м часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.274.07 в ГОУ ВПО «Тюменский государственный университет» по адресу: 625043, г.Тюмень, ул. Пирогова, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тюменского государственного университета.

Автореферат разослан «? X» 2006г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор / Е.А. Чирятьев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. ШД-АТФаза является олиго мерным интегральным белком плазматической мембраны клеток. Основная функция фермента заключается в сопряженном с гидролизом АТФ переносе ионов натрия из клетки, а ионов калия в клетку (Skou, 1988; Scheiner-B ob is, 2002). В настоящее время На,К-АТФаза рассматривается не только как система активного транспорта ионов, яо и как система рецепции и передачи сигналов в клетку (Лопика ОД, 2005; Xie et al., 2002).

Существуют кратковременные и долговременные пути регуляции активности фермента (Therien et al., 2000), Эритроциты, являясь высокоспециализированными клетками, не могут реализовывагь долговременные механизмы регуляции, так как не имеют в зр&пом состоянии белок-синтезирующих систем, поэтому ключевыми становятся кратковременные механизмы регуляции, связанные с уже существующими структурами и метаболическими путями эритроцита. Важная роль в регуляции Ыа,К.-АТФазы эритроцитов принадлежит ионам кальция и магния, которые участвуют в реакционном цикле фермента (Skou, 1988). Рядом авторов выявлено присутствие в мембране эритроцитов белка FXYD-2, который способен влиять на сродство Ка,К-АТФазы к одновалентным катионам (Hoffman et al., 2002). Следует отметить, что активность фермента может регулироваться белками цитоскелетаэритроцитов (Казенное A.M. и соавт., 1996).

Результатом работы разных авторов явилось обнаружение в эритроцитах веществ, обладающих как активирующим, так и ингибирующим эффектом на активность фермента из различных тканей. В работах Yingst (1985, 1992) было показано, что ингибирующее действие нонов кальция на активность фермента усиливалось присутствием мембранного белка кальнакгина, позднее идентифицированного как фрагмент кальмодулина - регулятора активности Са-АТФазы. В работах других авторов отмечались активирующие эффекты гемолизата, которые зависели от соотношения ионов магния и кальция в средах определения и используемых гемолизирующих растворах (Петруняка АЛ. и соавт, 1990).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение модулирующих эффектов гемолизата эритроцитов на активность Ка,К-АТФазы головного мозга крысы. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать активность №,К-АТФазы в гомогенате головного мозга крысы после предиикубации с гемолизэтом эритроцитов.

2. С помощью гель-фильтрации фракционировать гемолизах эритроцитов и исследовать влияние полученных фракций на активность Ыа,К-АТФазы гомогената головного мозга крысы.

3. Оценить зависимость модулирующего эффекта гемолизата эритроцитов и его отдельных фракций на активность ИаД-АТФазы гомогената головного мозга крысы от содержания в среде определения ферментативной активности ЭДТА и ионов магния и кальция.

Научная новизна. Показано, что гемолизат эритроцитов обладал выраженным ингибирующим влиянием на активность ЫаД-АТФазы гомогената головного мозга крысы. Степень проявления модулирующего эффекта гемолизата зависела от содержания ЭДТА и соотношения ионов магния и кальция в среде определения ферментативной активности.

Проведено разделение с помощью гель-фштьтрации гемолизата эритроцитов на отдельные фракции, три из которых модулировали активность Ка,К~АТФазы гомогената головного мозга крысы в зависимости от соотношения двухвалентных ионов в среде инкубации. Впервые показано, что одна из трех модулирующих фракций обладала магний- и кальций-зависимым ингибирующим эффектом на активность №,К-АТФазы, а активирующий эффект двух других фракций гемолизата эритроцитов в отношении фермента являлся кальций-зависимым.

модулирующим эффектом на активность Ш,К-АТФазы могут обладать как белки мембранного скелета эритроцитов (вероятно, спектрин), так и белковые компоненты с приблизительной молекулярной массой 60-70 кДа или низкомолекулярные полипептиды.

Полученные данные расширяют представления о путях регуляции Ыа,К-АТФазы, что важно в плане понимания механизмов контроля гомеостаза клетки.

Результаты проведенного исследования используются при чтении специализированного курса «Структуры и функции ферментов» студентам Тюменского государственного университета.

Положения, выносимые на защиту:

- Гемолизат эритроцитов, полученный с использованием гемолизирующего раствора, не содержащего ЭДТА, вызывает снижение активности Ка,К-АТФазы головного мозга крысы.

- Разделение гемолизата эритроцитов с помощью гель-фильтрации на сефадексе С-50 показало наличие в полученных фракциях модуляторов, обладающих ингибирующим и активирующими эффектами в отношении ЫаД-АТФазы головного мозга крысы.

- Проявление ингабирующего и активирующих эффектов факторов, содержащихся в гемшшзате, на активность Ыа,К-АТФазы головного мозга определяется наличием и соотношением ионов магния и кальция в среде определения ферментативной активности.

Апробация диссертации. Основные положения диссертации доложены на V Общероссийской научной конференции "Успехи современного естествознания" (Сочи, 2004), Всероссийской конференции молодых исследователей "Физиология и медицина" (С.-Петербург, 2005), IX Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология-наука XXI века" (Пущино, 2005), Всероссийской конференции "Менделеевские чтения" (Тюмень, 2005), I Съезде физиологов СНГ (Дагомыс, 2005).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов, результатов исследований и их обсуждения, заключения и выводов. Список цитируемой литературы включает 208 источников, в том числе 168 на иностранных языках. Работа изложена на 120 страницах, иллюстрирована 25 рисунками и 2 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследование проводилось на крысах-самцах линии Wistar в возрасте 13-14 недель с массой тела 220-240 г. Предварительно оценивали двигательную активность крыс методом «открытого поля» (Меркель АЛ., 1976). Для дальнейших экспериментов использовались только «активные» крысы.

Смешанную венозно-артернадьную кровь получали после декапитации животных. В качестве антикоагулянта использовали гепарин (150-200 ед/мл). Все исследования проводились в день забора крови. Для получения эритроцитов кровь центрифугировали при 1700 об/мин в течении 5 минут, затем удаляли плазму и лейкоцитарную пленку. Эритроциты трижды промывали охлажденным 0,145 М NaCl на 10 мМ трнс-HCI буфере (рН 7,4 при 25°С).

Мозг после декапитации извлекали, на холоду быстро освобождали от оболочек и удаляли белое вещество. Ткань мозга гомогенизировали в 9-кратном объеме 0,25 М сахарозы на 0,02 М трис-HCl буфере (рН 7,4 при 25°С). Ядра и неразрушенные клетки удаляли путем центрифугирования при 3000 об/мин в течении 10 минут. Над осадочную жидкость, представляющую собой грубую микросомал ьно-мнтохондр иальную фракцию, отбирали и в дальнейшем использовали для определения активности Ка,К-АТФазы.

Для получения гемолизата эритроцитов использовали гипотонический гемолизирующнй раствор, представляющий собой 10 мМ трис-HCl буфер (рН 7,4 при 25'С). Промытые эритроциты помещали в охлажденную колбу с гемоли энрующим раствором и выдерживали в течении 10 минут при 5°С. Соотношение объемов упакованных эритроцитов и гемолизирующего раствора составляло 1:4.

Для фракционирования белков гемолизата эритроцитов использовали метод гель-фильтрации на сефадексе G-50. Гемолизат эритроцитов в объеме 1,9 мл наносили на колонку (высота - 200 мм, диаметр - 20 мы), заполненную сефадексом, уравновешенным 10 мМ трис-HCl буфером (рН 7,4 при 25°С). Белки элюировали из колонки раствором 10 мМ трис-HCl буфера (рН 7,4 при 25°С) со скоростью 0,4 мл в минуту.

Прединкубация гомогената головного мозга крысы с полученными фракциями и гемолизатом эритроцитов проводилась при 20°С в течении 30 минут в соотношении 1:19. Контроль представлял собой гомогенат головного мозга после прединкубашш с гемолизирующим раствором.

Для определения активности Na^C-АТФазы 0,1 мл исследуемого образца гомогената головного мозга после соответствующей прединкубация вносили в инкубационную среду объемом 0,3 мл. Инкубацию образцов проводили при 37°С в течение 30 минут. Стандартная среда для определения ферментативной активности NaJi-АТФазы содержала в мМ: NaCl — 100, KCI — 20, трис-HCl буфер— 50 (рН 7,6 при 25°С), MgCt, - 3, CaClj - О, ЭДТА — 0,5 и АТФ — 3. При необходимости в условиях эксперимента варьировались концентрации ЭДТА, MgCIj и СаС12. Реакцию останавливали добавлением 0,2 мл охлажденного 15 % раствора трихлоруксусной кислоты. Осаждение денатурированных белков осуществляли при 3500 об/мин в течении 10 минут.

Содержание неорганического фосфора определяли по методу Чена в модификации Казеннова A.M. и соавт. (1984). Активность N а, К-АТФ азы определяли по разности между содержанием неорганического фосфора в отсутствие и присутствии в инкубационной среде 1мМ уабаина и выражали в мкмоль Фн в час на мг белка в гомогенате головного мозга крысы.

Содержание белка определяли по методу Lowry et al (1951).

Электрофоретическое разделение белков проводили в камере для вертикального электрофореза по L&mmli (1970), а окрашивание геля - с использованием цинк-имидазольного метода (Hardy et al., 1996). В качестве

маркерных белков использовали ß-лактоглобин - 18,4 кДа, бычий альбумин — 66 кДа, мышечную фосфорилазу кролика — 97,4 кДа.

В работе были использованы уабаин, АТФ, ЭДГА, MgClj, KCl, NaCl, SnCh, СаС12, трис-HCI буфер, сефадекс G-50, реактивы для проведения электрофоретического разделения белков и маркерные белки фирмы Sigma, реактив Фолина фирмы Merk, молнбдат аммония, аскорбиновая кислота, ТХУ, HCl, H2SO4 и гепарин отечественного производства (чд.а.)

Полученные данные были обработаны с помощью методов вариационной статистики, сравнение показателей проводилось с использованием t-критерия Стьюдснта (Лакин Г.Ф., 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Влияние гемолизата эритроцитов на активность Na,K-ATOajbi головного мозга крысы.

Согласно литературным данным в эритроцитах млекопитающих присутствует ингибитор Ка,К-АТФазы {Yingst, 1988), а также возможно наличие активатора фермента (Петруняка В .В., Панюшкина Е.А., 1994). Высказывались предположения о том, что модуляторы активности могут обладать магний- и кальций-зависимыми свойствами. Учитывая это, изучали влияние гемолизата эритроцитов на активность Ыа,К-АТФазы гомогената головного мозга крысы в зависимости от содержания в среде определения ферментативной активности ЭДТА, MgClj и CaClj. NatK-АТФаза головного мозга крысы была выбрана в качестве объекта исследования, поскольку обладает высокой активностью по сравнению с ферментом эритроцитов, что, как предполагалось, позволит более выражено выявить модулирующие эффекты гемолизата эритроцитов.

Результаты исследования показали, что гемолизат эритроцитов, полученный при соотношении упакованных эритроцитов к гемолизируюшему раствору 1:4, ингибировал Ыа,К-АТФазу головного мозга на 40%, в то время как при соотношениях 1:9 и 1:19 не влиял на активность исследуемого фермента (рис.1).

Контроль 1:4 1 У 1:1 У соотношение упакованных

эритроцита» к гемолизирующвму раствору

Рис. 1 Активность Ма,К-АТФазы гомогената головного мозга крысы после предин кубации с гемолизэтом эритроцитов

Примечание: ***-р<0,001 - достоверность различий по сравнению с контролем

Среда определения ферментативной активности содержала в мМ: NaCI-100; KCl- 20; трио

HCl- 50 (pH 7,6 при 25°Q; MgCJj - 3; CaCli - 0; ЭДТА- 0,5; АТФ- 3 (t=37°C) (r=6).

Также было показано, что увеличение содержания ЭДТА в среде определения ферментативной активности приводило к снижению ингибирующего эффекта гемолизата эритроцитов с 40% при 0,5 мМ до 22% при 2 мМ (табл.1).

Таблица I

Активность Na,К-АТФазы гомогената головного мозга крысы (мкМ Фн/мг белка/ч) в зависимости от концепграцни ЭДТА в среде определения ферментативной активности до

ЭДТА мМ контроль опьгг

0,5 4,91±0,25 2,93±0,28«*

1,0 4,14*0,25 2,87*0,26«

2,0 3,57±0,26## 2,78*0,23*

контролем

## - jKO,01 - достоверность различий по сравнению С активностью фермента в среде; содержащей 0,5 мМ ЭДТА

Среда определения фер метативной активности содержала в мМ: NaCt-100, KCl- 20: трис-HCI- 50 {pH 7,6 при 25'С); MgCt2 - 3; CaCI2 - 0; ЭДТА- (0,5; 1^); АГФ- 3 (t=37X) (n=7).

Следует отметить, что в контроле увеличение концентрации ЭДТА приводило к снижению активности Na,K-ATOa3U гомогената головного мозга, что, скорее всего, связано с хелацией двухвалентных ионов магния, который является важным регулятором активности фермента. Однако в опыте связывание ионов магния ЭДТА не приводило к изменению активности фермента, что, по-

видимому, обусловлено тем, что в гемолизате эритроцитов присутствуют факторы, которые снижают чувствительность фермента к низким концентрациям но нов магния.

На следующем этапе исследовали влияние высоких концентраций М$С12 в бескальциевой среде на иягибиро ванне ОДК-АТФазы гомогената головного мозга крысы гемолизатом эритроцитов при 0,5 мМ ЭДТА (табл. 2).

Таблица 2

Активность Ма,К-АТФа1ы гомогената головного мозга крысы (мкМ Фн/мг белка/ч) в за висим остн от концентрации \lgC1] в среде определения ферментативной активности до

н после пред инкубации с Гемолизатом эритроцитов, (М±т)

месь.мМ контроль ОПЫТ

3 4,91*0,25 2,93±0,28 ***

6 4,80±0,27 2,71±0,2б •••

12 4,23*0,27 2,5б±0,25 ***

Примечание: *** - р<0,00] - достоверность различий по сравнению с контролем

Среда определения ферментативной активности содержала в мМ: ЫаСИОО; КО- 20; трис-На- 50 (РН 7,6 при 25"С); МёС12 - (3,6,12); Саа2 -0; ЭДГА- 0,5; АТФ- 3 <^37°С) (п-7)

Результаты исследования показали, что ингибирующий эффект гемолизата эритрошгтов на активность фермента сохранялся при всех исследованных концентрациях Ь^СЬ в среде определения ферментативной активности.

Таким образом, гемолизат эритроцитов ннгиб провал Ма,К-АТФазу гомогената головного мозга крысы как при низких, так и при высоких концентрациях М§С1г в среде определения ферментативной активности.

Изучение влияния различных концентраций СаСЦ на активность Ыа,К-АТФазы гомогената головного мозга после прединкубации с гемолизатом эритроцитов показало, что при высокой концентрации СаСЬ (1 мМ) в среде определения ферментативной активности ингибирующий эффект гемолизата эритроцитов отсутствовал (табл.3).

Активность NirK-АТФазы гсжоггнята головного мозга крысы (мкМ Фн/мг белка/ч) в завися мосты от концентрации СаСЬ в с раде определения ферментативной активности до

СаС12,мМ контроль опыт

0 4,91*0,25 2,93*0,28"*

0,1 4,63*0,26 2,80*0,24»**

1,0 2,63*0,21Ш 2,05*0,26*

Примечание: ***-р<0,001 - достоверность различий по сравнению с контролем # - р<0,05;### • р<0,001 — достоверность различий по сравнению с активностью фермента в бескальцисвой среде.

Среда определения ферментативной активности содержала в ыМ: NaCUIOO; KCI- 20; трис-НС1- 50 (рН 7,6 при 25°С); MgClj-3; CaClj-(0;0,l;l); ЭДГЛ- 0,5; АТФ- 3 (С-37°С) (п=7).

В связи с отсутствием ингибнрующего эффекта гемолизата эритроцитов на активность Ыа,К-АТФазы гомогената головного мозга при высокой концентрации CaC!j, исследовали влияние содержания MgCK & среде определения ферментативной активности при разных концентрациях СаС1г на ингибирование фермента гемоллзатом эритроцитов. Известно, что ионы кальция конкурируют с ионами магния с образованием кальций* фосфоф ер мента (Post, 1984). Показано, что в среде, содержащей 0,1 мМ СаС1г, иягибирующий эффект гемолизата эритроцитов на активность Ыа,К-АТФазы гомогената головного мозга сохранялся при всех исследованных концентрациях MgCb в среде определения ферментативной активности (табл. 4), в то время как при высокой концентрации СаС1г (1 мМ) ингибирующиЙ эффект проявлялся только при увеличении содержания MgCb ДО б мМ и 12 мМ (табл. 5).

Таблица 4

Активность Ма.К-ЛТФазы гомогената головного мозга крысы (мкМ Фа/нг белка/ч) в зависимости от коп центра о нн MgClj в среде определения ферментативной активности,

СаР^мМ MgC1j.MM контроль опыт

0,1 3 4,63*0,26 2,80±0,24 **•

6 4,44*0,30 2,50*0,23 ***

12 3,97*0,27 2,44*0,23 **

Примечание: **-р<0,0|; *** - р<0,001 - достоверность различий по сравнению с контролем Среда определения ферментативной активности содержала в мМ: №0-100; КС]- 20; трнс-НС1- 50 (рН 7,6 при 2 5 "С); МЁС1г-(3,6,12); СаСЬ - 0,1; ЭДТА- 0,5; АТФ- 3 Н7'С) (п-7).

Активность 1Ч»,К-АТФаэы гомогснатя головного мозг* крысы (мкМ Фк/мг белка/ч) в зависимости от концентрации M{Qi в среде определения ферментативной активности,

СаОьмМ MgCIi, мМ контроль опыт

1.0 3 2,63±0,21 2,05*0,26

6 3.13±<Ш 2Д4±0,24*

12 3,57±0,22## 2,69±0,27*

Примечание: *-р<0,05 - достоверность различий по сравнению с контролен

UW - р<0,01 — достоверность различий па сравнению с активностью фермента я среде, содержащей 3 мМ MgCfe.

Среда определения ферментативной активности содержала в мМ: NaCI-100; КС1- 20;трис-НС1- 50 (рН 7.6 при 25"С); MgCl2- (3,6,12); CaClj - I; ЭДТЛ- 0,5; АТФ- 3 (t=37'Q (n=7).

Кроме того, обращает внимание тог факт, что в контроле при высоких концентрациях CaClj в среде определения ферментативной активности с увеличением содержания MgCh от 3 до 12 мМ происходило повышение активности Na,K-AT0a3ti гомогената головного мозга. Ионы кальция и магния, а также их комплексы с АТФ конкурируют за центры связывания с ферментом. Согласно данным Post (1984) кальций относительно легко диссоциирует из комплекса с фосфоферментом. По-видимому, увеличение содержания MgCh в среде определения ферментативной активности приводит к вытеснению ионов кальция ионами магния из центров связывания фермента, в результате чего активность №,К-АТФазы головного мозга повышается.

Таким образом, ингибируюшнй эффект гемолизата эритрощггов на активность Ка,К-АТФазы гомогената головного мозга крысы проявлялся при низкой концентрации СаСЬ в среде определения ферментативной активности, а при высокой концентрации CaClj проявление эффекта зависело от соотношения концентраций ионов магния и кальция.

Полученные результаты позволяют предположить, что ингнбированне Na,K-АТФазы головного мозга крысы гемолизатом эритроцитов обусловлено присутствием в гемолизате факторов, действие которых зависит от соотношения двухвалентных ионов в среде определения ферментативной активности. В следующей серии экспериментов было поведено разделение гемолизата эритроцитов на отдельные фракции с помощью гель-фильтрации на сефадексе G-

50 м изучено влияние этих фракции на активность Ма,К-АТФазы гомогената головного мозга крысы.

2. Разделение гемолизата эритроцитов на отдельные фракции с помощью гель-фильтрации.

В результате проведенного фракционирования гемолизата эритроцитов было получено 11 фракций. Данные по исследованию влияния отдельных фракций после элюцни гемолизата эритроцитов на активность ИаД-АТФазы гомогената головного мозга крысы представлены на рис.2.

Зг

ар

«if ■■'■Ж

л <л

N1 фракции

Рис.2 Активность NaJC-АТФазы гомогената головного мозга крысы до и после прединкубации с фракциями, полученными в результате элюции гемолизата эритроцитов

Примечание: *-р<0,05;"-р<0>0] - достоверность различий дю сравнению с контролем

Среда определения ферментативной активности содержала в мМ: NaCMOO; KCI-20, ipnc-HCI- 50 (pH 7.6 при 25 °С); MgCtz- 3; CaCIi - 0; ЭДТА- 0,5; АТФ- 3 (р-ЗГС) (п=7).

Видно, что после прединкубации гомогената головного мозга крысы с фракцией Xsl активность Ка,К-АТФазы снижалась на 18%, а после прединкубации с фракциями ХаЗ и №6 активность фермента, напротив, повышалась на 31% н 35% соответственно.

Результаты электрофоретического анализа отдельных модулирующих фракций представлены на рнс.З.

6 змМг.ЧО-'кДа

25» 2И 1« 1М

М •

V 3

0.1 0,2 0.3 0.4 0.5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0

Рис.3 Схемы электрофореграмм модулирующих фракций гемолизата эритроцитов (а) и калибровочный график для определения молекулярной массы белков после электрофореза в ПААГ (б)

Примечание: маркерные белки: р-пактогяобнн — 18,4 кДа (1), бычий альбумин - 66 кДа (2), мышечная фосфорилаза кролика — 97,4 кДа (3).

При использовании маркерных белков было определено, что во фракции содержались белки с примерной молекулярной массой 230-260 кДа (предположительно, субъединнцы спектрина), белок с молекулярной массой 6070 кДа и низкомолекулярные белки. Во фракции отмечено присутствие только белков с примерной молекулярной массой 230-260 кДа. Во фракции №6 с помощью электрофореза белков не выявлено, что, скорее всего, связано с низким содержанием белка в данной фракции. Таким образом, полученные отдельные фракции гемолизата различались не только по модулирующим эффектам на активность Ыа,К-АТФазы головного мозга, но и имели разный набор белков.

На следующем этапе исследования было изучено влияние полученных фракций гемолизата эритроцитов на активность Ка,К-АТФазы гомогената головного мозга крысы.

3. Влияние отдельных фракции гемолизата эритроцитов па активность №>К-АТФазы головного мозга крысы.

В табл. 6 представлены результаты исследования зависимости активности №,К-АТФазы гомогената головного мозга после прединкубации с полученными

фракциями от концентрации ЭДТА в среде определения ферментативной активности.

Показано, что фракции ХаЗ и №6 активировали Ыа,К-АТФаэу головного мозга при определении активности фермента в средах, содержащих 0,5 мМ и I мМ ЭДТА.

Таблица 6

Активность Мй,К'АТФазы гомогекятя головного мозга крысы (мкМ Фи/мг белка/ч) в зависимости от концентрации ЭДТА в среде определения ферментативной активности до

ЭДТА.мМ контроль после прединкубации с фракцией №1 после гтреаинкубшщм с фракцией №3 после г^жаш геубации с фракцией №6

0.5 4,89±0,22 4,05±0,20 * 6,40*0,46 * 6,61 ±0,49 "

1,0 4,17*0,23 3,68±0,25 5,60±0,32 *• 5,64*0,29 **

2,0 3,59*0,22 т 3,34±0,28 3,57*0,25Ш 3,45±0,23Ш

Примечание: * - р<0,05;**-р<0,01 - достоверность различив по сравнению с контролем ## - рс0,01;### - р<0,001 - достоверность различий по сравнению с активностью фермента в среде, содержащей 0,5 мМ ЭДТА

Среда определения ферментативной активности содержала в мМ: NaCI-lOO; KCl- 20; трис-HCi- 50 (pH 7,6 при 25°С); MgCfe -3; CaCh- 0; ЭДТА- (0,5;1;2); ЛТФ- 3 (t=370C) (п«7).

Ингибирующий эффект фракции №1 на активность Na,K-ATOa3bi гомогената головного мозга проявлялся только при низкой концентрации ЭДТА (0,5 мМ). Поскольку увеличение содержания ЭДГА в среде приводит к снижению концентрации ионов магния в результате хелации, то можно предположить, что отсутствие ингибирующего эффекта фракции №1 в средах, содержащих 1 мМ и 2 мМ ЭДТА, связано с магний-зависимым механизмом ингибирования.

Изучение влияния содержания MgCI2 на модулирующие эффекты полученных фракций гемолизата эритроцитов показало, что повышение концентрации MgCIj в среде определения ферментативной активности приводило к устранению ингибирующего эффекта фракции №1. В тоже время, повышение содержания MgCtj в среде определения ферментативной активности не влияло на активацию фермента головного мозга фракциями №3 к №6 (табл.7).

Активноггь Nа,К-АТФазы гомогената головного мозга крысы (икМ Фн/мг Селка/ч) в зависимости от концентрации MgClz в среде определения ферментатнвной активности до н после предннкубации с полученными фракциями гемолизатя эритроцитов, (M±w)

MgCli, мМ контроль после предннкубации с фракцией №1 после предннкубации с фракцией №3 после Гфецга^убации сф)1аМ1Ией№б

3 4tSSb±0,22 4,05±0.20 * 6,40*0.46* 6,61 ±0,49**

6 4,81 ±0,28 4,53±0Д6 б, 1840,40* 6,I2±0,3S*

12 4,21 ±0,25 4,1S±0,25 6,05*0,34*** 6,01±0,31***

Примечание: * - р<0,05;**-р<0,<Н; *** -p<0,00f - достоверность различий по сравнению с контролем

Среда определения ферментагтивной активности содержала в мМ: NaCl-100; KCl- 20; трие-HCI- SO (pH 7,6 при 2S°C); MgCli-(3,6,12); CaCh - 0; ЭДТА- 0,5; АТФ- 3 (t=37°Q (n-7).

Кроме того, было обнаружено, что модулирующие эффекты фракций №1, и №6 в отношении Na.K-АТФазы гомогената головного мозга не проявлялись при внесении в среду определения ферментативной активности CaClj (табл. 8). Отмечено, что после предннкубации гомогената головного мозга с фракциями №3 и №6 активность фермента снижалась при внесении в среду определения ферментативной активности 0,1 мМ СаС1г по сравнению с активностью в бескальциевой среде. В опыте с фракцией №1 снижение активности Na,K-АТФазы гомогената головного мозга по сравнению с активностью фермента в бескальциевой среде происходило только при высокой концентрации СаС12. Можно предположить, что модуляторы из фракций №3 и №6, активирующие фермент гомогената головного мозга, более чувствительны к присутствию ионов кальция, чем модуляторы из фракции Xsl, обладающие ингибирующим эффектом.

Таблица 8

Активность N»,К-АТФазы гомогената головного мозга крысы (мкМ Фн/мг белка/ч) в зависимости от концентрации CaCIi в среде определении ферментативной активности до

СаСЬ,мМ контроль после предннкубации с фракцией №1 после предннкубации с фракцией №3 нос/к прединкубашш сфракциейХгб

0 4,89*0,22 4,05*0.20 * 6,40±0,46* 6,61 ±0,49**

0,1 4.65*0,26 4¿3±0,29 4,56±0.3Ш 4,57±0ДЗ##

1.0 3,10*0,21 Ш 2,45±0,23 Ш 2,49±0¿2U»№ 2,53±0 лт#

Примечание: * -р<Ь,05;**-р<0,01 - достоверность различий по сравнению с контролем ## - р<0,01;### - р<0,001 - достоверность различий до сравнению с активностью фермента в бескальциевой среде

Среда определения ферментативной активности содержала в мМ: МаСМОО; КС1- 20; трие-НС1- 50 (рН 7,6 при 25°С); МеС1з - 3; СаС12 - (0,0.1,1); ЭДГА- 0,5; АТО- 3 (1=37°С) (п=7).

Согласно литературным данным между кальций-зависимыми активаторами и ингибиторами в эритроцитах существуют конкурентные взаимоотношения, и способность их проявлять свою активность определяется соотношением в цигозоле клетки ионов магния и кальция (Петруняка В.В. и соавт., 1990). В связи с этим, проводили изучение активности Ыа,К-АТФазы гомогената головного мозга крысы после прединкубации с фракциями гемолизата эритроцитов в зависимости от содержания при низких и высоких концентрациях СаСЬ в

среде определения ферментативной активности.

Показано, что при низкой концентрации СаСЬ (0,1 мМ) активирующий эффект фракции №б в отношении Ыа,К-АТФазы головного мозга вновь проявлялся только в среде определения ферментативной активности, содержащей 6 мММеСЬ (табл.9).

Таблица 9

Активность №,К-АТФ»ы гомогенгга головного мсога крысы (мкМ Фн/мг белка/ч) в зависимости от концентрации в срезе определении ферм ентатн в ной активности,

содержащей 0,1 мМ СаС1г, до и после пред инкуба ннн е полученными фракциями

гемолизата эритроцитов, (М±т)

СаОь мМ MgCl2, мМ контроль после прединкубациис фракцией №1 после прелинкубасщн с фракцией №3 после гредннкубаиин с фракштсй№6

0,1 3 4,65±0,2б 4.23±0,29 4,56±0,30 4,57*0,23

6 4,4S±0,29 4,12±0,23 4,52±0,21 5,31 ±0,1?*

12 3,94±0,24 4,01±0,25 4,06±0,28 4,29±0,25

Примечание: *-р<0,05 - достоверность различий по сравнению с контролем Среда определения ферментативной активности содержала в мМ: NaCl-100; KCI- 20; трнс-HCI- 50 (рН 7,6 при 25"С); MgCI2 - (3,6,12); СаСЬ - 0,1; ЭДТА- 0,5; АТФ- 3 (t-37'Q (п-7).

При высокой концентрации СаСЬ (I мМ) в среде определения ферментативной активности модулирующих эффектов фракций №1, №3 и №б на активность N а, К-АТФ азы гомогената головного мозга не наблюдалось (табл.10). Однако в контроле и опыте с фракциями №3 и №6 при увеличении содержания MgCb активность ^К-АТФазы головного мозга повышалась по сравнению с активностью фермента при 3 мМ MgClj. Как было отмечено ранее, при высоких концентрациях ионов кальция в среде возможно образование кальций — фосфофермента (Post, 1984), и увеличение концентрации ионов магния может

приводить к вытеснению ионов кальция из фосфофермента, с чем, по-видимому,

и связано повышение активности ЫаД-АТФазы гомогенага головного мозга крысы.

Таблица 10

Активность Ка,К-АТФя1ы гомогената головного мозг* крысы (мкМ Фн/мг белка/ч) в зависимости ог концентрации М^О] в среде определения ферментативной активности, содержащей 1 мМ СаСЬ.дон после прединкубации с полученными фракциями

СаОг, мМ MgCh. мМ контроль после прединкубации с фракцией №1 после прединкубации с фракцией №3 после прединкубашис фракцией Лоб

1,0 3 2,62*0,22 2,4S±0,23 2,49±0Д2 2,53*0,21

6 3,10±0,21 2,б4±0,19 3,22±0,22ff 3,21±0,22#

12 3,50*0,21 т 2,98±0,22 3,41±0JI5#

Примечание: Я - р<0,05;Й# - р<0,01 - достоверность различий по сравнению с активностью фермента в среде, содержащей 3 мМ MgCli

Среда определения ферментативной активности содержала в мМ: NaCHOO; КО- 20; трнс-HCl- SO (pH 7,6 при 25'С); MgClj -(3,6,12); CaOj -1; ЭДТА- 0,5; АТФ- 3 (Р-37°С) (п=7).

После прединкубации с фракцией №1, как и в опыте с гемолизатом эритроцитов, активность фермента с увеличением содержания MgCb при 1 мМ CäCh в среде определения ферментативной активности не изменялась по сравнению с активностью при 3 мМ MgCl2. Это позволяет предположить, что модуляторы фракции №1, не проявляя ингибируюшего эффекта, оказывают влияние на фермент, которое выражается в изменении чувствительности фермента к действию ионов магния.

Изменение содержания MgCI2 и внесение СаС12 в среду определения ферментативной активности приводило к снятию ингибирующего эффекта фракции №], что позволяет предположить кальций-и магний-зависимые свойства модуляторов. Повышение концентрации MgCU в среде определения ферментативной активности не влияло на активирующие эффекты фракции №3 и №6, тогда как присутствие СаСЬ устраняло модулирующие эффекты, что указывает на кальций-зависимые свойства модуляторов.

Учитывая результаты электрофореза, можно предположить, что ингибирующий эффект фракции №1 обусловлен действием белка с примерным

молекулярным весом 60-70 кДа или низкомолекулярными белками. Активирующий эффект фракции №3, вероятно, обусловлен спектрнном, часть которого, по-видимому, удаляется с цитоплазм этической поверхности мембраны эритроцитов уже в процессе гемолиза. Высказанное предположение хорошо согласуется с литературными данными о кальций-зависимом механизме активации транспортных АТФаз белками цитоскелета (Казенное A.M., и соавт, 1996). Активирующий эффект фракции №6, возможно, связан с присутствием низкомолекулярных кальций-зависимых факторов (Фролова О.В., 1996).

ВЫВОДЫ

1. Активность КаД-АТФаэы в гомогенате головного мозга крысы после прединкубации с гемолизатом эритроцитов снижалась на 40 % по сравнению с ко!гтролем в стандартной среде определения ферментативной активности. Изучение влияния ЭДТА и ионов магния и кальция на процесс ингабирования Ыа,К-АТФазы головного мозга крысы гемолизатом эритроцитов показало, что действие внутриклеточных модуляторов на Ма,К-АТФазу зависит от соотношения двухвалентных ионов в среде определения ферментативной активности.

2. Полученные с помощью гель-фильтрации отдельные фракции гемолизата эритроцитов обладали разнонаправленными эффектами на Na,K-ATФaзy гомогената головного мозга крысы, что указывает на присутствие в гемолизате эритроцитов ингибиторов it активаторов фермента.

3. Результаты исследования влияния отдельных фракций гемолизата эритроцитов на активность Na,K-AT<t>a3bi головного мозга крысы в зависимости от содержания двухвалентных ионов в среде определения ферментативной активности указывают на наличие в эритроцитах модуляторов активности фермента с магний- и кальций-зависимыми свойствами, так и только с кальций-зависимыми свойствами.

4. Совокупность полученных результатов позволяет предположить, что влияние гемолизата эритроцитов на активность Ыа,К-АТФазы гомогената головного мозга крысы и характер зависимости этого влияния от двухвалентных ионов обусловлены взаимодействием внутриклеточных модуляторов фермента.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Дубровский В.Н., Кыров Д.Н., Силиванова Е.А., Шалабодов АД. Активность Ка+,К+-АТФазы и ацетилхолинэстеразы в различных отделах головного мозга крыс при иммобилизационном стрессе различной продолжительности/"/ Материалы 5 Общероссийской научной конференции "Успехи современного естествознания" г.Сочи 27-29 сентября 2004г. Успехи современного естествознания - №8. — 2004. — С.41-42.

2. Кыров Д.Н, Регуляция аетивности Ка,К - АТФазы гемолнзатом эритроцитов Крыс// Сборник материалов Всероссийской конференции молодых исследователей "Физиология и медицина" 14-16 апреля 2005 г., г. Санкт-Петербург. Приложение к журналу "Вестник молодых ученых". Серия "Науки о жизни". - С. 65,

3. Дубровский В.Н., Кыров Д.Н., Силиванова Е.А., Шалабодов АД. Активность Ыа,К - АТФазы головного мозга и эритроцитов крыс при стрессе// Материалы Всероссийской конференции "Менделеевские чтения" 26-28 мая 2005 г., г. Тюмень. - С. 126-129.

4. Кыров Д.Н., Силиванова Е.А., Дубровский В.Н., Шалабодов АД. Исследование действия модуляторов, выделенных из эритроцитов, на активность Ыа,К-АТФазы головного мозга крыс// Научные труды I Съезда физиологов СНГ 19-23 сентября 2005 г., г. Сочи, Дагомыс, Т.2. - С. 52.

5. Кыров Д.Н., Силиванова Е.А., Дубровский В.Н., Шалабодов АД. Влияние гемолизата эритроцитов на активность ЫаД-АТФазы головного мозга крыс// Вестник Тюменского государственного университета, №5 — 2006.— С. 4-12.

Подписано в печать 20.11,2006. Тираж 100 экз. Объем 1,0 уч.-изд. л. Формат 60x54/16. Заказ 677.

Издательство Тюменского государственного университета 625000, г. Тюмень, ул. Семакова, 10. Тел./факс (3452) 45-56-60,46-27-32 E-mail: izdatelstvo@utmn.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кыров, Дмитрий Николаевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Строение биологических мембран.

1.2 Мембранный скелет эритроцитов млекопитающих.

1.3 ЫаД-АТФаза.

1.3.1 Структурная организация Na,K-ATOa3bi.

1.3.2 Реакционный цикл №,К-АТФазы.

1.3.3 Влияние АТФ и ионов магия на конформационное состояние фермента

1.4 Регуляция активности Ыа,К-АТФазы.

1.4.1 Роль липидного окружения.

1.4.2 Влияние белков мембранного скелета эритроцита.

1.4.3 Роль FXYD-белков в регуляции №,К-АТФазы.

1.4.4 Уабаин и эндогенные уабаин-подобные ингибиторы.

1.4.5 Гормональная регуляция.

1.4.6 Механизмы опосредованного фосфорилирования-дефосфорилирования

1.4.7 Действие фосфолипазы 2 и ее метаболитов.

1.4.8 Действие ионов кальция и кальций-связывающих белков.

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Влияние гемолизата эритроцитов на активность №,К-АТФазы головного мозга крысы.

3.1.1 Модулирующий эффект гемолизата эритроцитов на активность Na,K-АТФазы гомогената головного мозга.

3.1.2 Модулирующий эффект гемолизата эритроцитов на активность Na,K-АТФазы гомогената головного мозга при различных концентрациях ЭДТА, MgCl2 и СаС12в среде определения ферментативной активности.

3.2 Разделение гемолизата эритроцитов на отдельные фракции с помощью гель-фильтрации.

3.2.1 Фракционирование гемолизата эритроцитов.

3.2.2 Электрофоретический анализ модулирующих фракций гемолизата эритроцитов.

3.3 Влияние отдельных фракции гемолизата эритроцитов на активность ЫаД-АТФазы головного мозга крысы.

3.3.1 Модулирующие эффекты отдельных фракций гемолизата эритроцитов на активность Ыа,К-АТФазы гомогената головного мозга при различных концентрациях ЭДТА в среде определения ферментативной активности.

3.3.2 Модулирующие эффекты отдельных фракций гемолизата эритроцитов на активность Иа,К-АТФазы гомогената головного мозга при различных концентрациях MgCl2 в среде определения ферментативной активности.

3.3.3 Модулирующие эффекты отдельных фракций гемолизата эритроцитов на активность №,К-АТФазы гомогената головного мозга при различных концентрациях СаС12 в среде определения ферментативной активности.

3.3.4 Модулирующие эффекты отдельных фракций гемолизата эритроцитов на активность №,К-АТФазы гомогената головного мозга при различных концентрациях СаСЬ и MgCb в среде определения ферментативной активности.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование модулирующих эффектов гемолизата эритроцитов на активность Na,K-АТФазы"

Актуальность работы. Ыа,К-АТФаза является олигомерным интегральным белком плазматической мембраны клеток. Основная функция фермента заключается в сопряженном с гидролизом АТФ переносе ионов натрия из клетки, а ионов калия в клетку (Skou, 1988; Scheiner-Bobis, 2002). В настоящее время Ыа,К-АТФаза рассматривается не только как система активного транспорта ионов, но и как система рецепции и передачи сигналов в клетку (Лопина, 2005; Xie et al., 2002).

Существуют кратковременные и долговременные пути регуляции активности фермента (Therien et al., 2000). Эритроциты, являясь высокоспециализированными клетками, не могут реализовывать долговременные механизмы регуляции, так как не имеют в зрелом состоянии белок-синтезирующих систем, поэтому ключевыми становятся кратковременные механизмы регуляции, связанные с уже существующими структурами и метаболическими путями эритроцита. Важная роль в регуляции Ыа,К-АТФазы эритроцитов принадлежит ионам кальция и магния, которые участвуют в реакционном цикле фермента (Skou, Esmann, 1992). Рядом авторов выявлено присутствие в мембране эритроцитов белка FXYD-2, который способен влиять на сродство ИаД-АТФазы к одновалентным катионам (Hoffman et al., 2002). Следует отметить, что активность фермента может регулироваться белками цитоскелета эритроцитов (Казеннов и соавт., 1996).

Результатом работы разных авторов явилось обнаружение в эритроцитах веществ, обладающих как активирующим, так и ингибирующим эффектом на активность фермента из различных тканей. В работах Ингста (Yingst et al., 1985, 1992) было показано, что ингибирующее действие ионов кальция на активность фермента усиливалось присутствием мембранного белка кальнактина, позднее идентифицированного как фрагмент кальмодулина - регулятора активности Са-АТФазы. В работах других авторов отмечались активирующие эффекты гемолизата, которые зависели от соотношения ионов магния и кальция в средах определения и используемых гемолизирующих растворах (Петруняка и соавт., 1990).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение модулирующих эффектов гемолизата эритроцитов на активность Na,K-АТФазы головного мозга крысы. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать активность Ыа,К-АТФазы в гомогенате головного мозга крысы после прединкубации с гемолизатом эритроцитов.

2. С помощью гель-фильтрации фракционировать гемолизат эритроцитов и исследовать влияние полученных фракций на активность Ыа,К-АТФазы гомогената головного мозга крысы.

Научная новизна. Показано, что гемолизат эритроцитов обладал выраженным ингибирующим влиянием на активность №,К-АТФазы гомогената головного мозга крысы. Степень проявления модулирующего эффекта гемолизата зависела от содержания ЭДТА и соотношения ионов магния и кальция в среде определения ферментативной активности.

Проведено разделение с помощью гель-фильтрации гемолизата эритроцитов на отдельные фракции, три из которых модулировали активность Иа,К-АТФазы гомогената головного мозга крысы в зависимости от соотношения двухвалентных ионов в среде инкубации. Впервые показано, что одна из трех модулирующих фракций обладала магний- и кальций-зависимым ингибирующим эффектом на активность Ыа,К-АТФазы, а активирующий эффект двух других фракций гемолизата эритроцитов в отношении фермента являлся кальций-зависимым.

Научно-практическая значимость работы. Показано, что в гемолизате эритроцитов и в его отдельных фракциях присутствуют модуляторы активности Ыа,К-АТФазы гомогената головного мозга крысы, степень влияния которых на активность фермента зависит от соотношения двухвалентных ионов (магния и кальция) в среде определения ферментативной активности. Предполагается, что модулирующим эффектом на активность Na,K-ATOa3bi могут обладать как белки мембранного скелета эритроцитов (вероятно, спектрин), так и белковые компоненты с приблизительной молекулярной массой 60-70 кДа или низкомолекулярные полипептиды.

Полученные данные расширяют представления о путях регуляции Na,K-АТФазы, что важно в плане понимания механизмов контроля гомеостаза клетки.

Положения, выносимые на защиту:

Гемолизат эритроцитов, полученный с использованием гемолизирующего раствора, не содержащего ЭДТА, вызывает снижение активности №,К-АТФазы головного мозга крысы.

- Разделение гемолизата эритроцитов с помощью гель-фильтрации на сефадексе G-50 показало наличие в полученных фракциях модуляторов, обладающих ингибирующим и активирующими эффектами в отношении Ыа,К-АТФазы головного мозга крысы.

- Проявление ингибирующего и активирующих эффектов факторов, содержащихся в гемолизате, на активность Ыа,К-АТФазы головного мозга определяется наличием и соотношением ионов магния и кальция в среде определения ферментативной активности.

Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология-наука XXI века" (Пущино, 2005), Всероссийской конференции "Менделеевские чтения" (Тюмень, 2005), I Съезде физиологов СНГ (Дагомыс, 2005).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов, результатов исследований и их обсуждения, заключения и выводов. Список цитируемой литературы включает 208 источников, в том числе 168 на иностранных языках. Работа изложена на 120 страницах, иллюстрирована 25 рисунками и 2 таблицами.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Кыров, Дмитрий Николаевич

3. Результаты исследования влияния отдельных фракций гемолизата эритроцитов на активность Ыа,К-АТФазы головного мозга крысы в зависимости от содержания двухвалентных ионов в среде определения ферментативной активности указывают на наличие в эритроцитах модуляторов активности фермента с магний- и кальций-зависимыми свойствами, так и только с кальций-зависимыми свойствами.

4. Совокупность полученных результатов позволяет предположить, что влияние гемолизата эритроцитов на активность №,К-АТФазы гомогената головного мозга крысы и зависимость этого влияния от двухвалентных ионов обусловлены взаимодействием нескольких внутриклеточных модуляторов фермента.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Иа,К-АТФаза (Ыа,К-активируемая Mg-зависимая аденозинтрифосфатаза, КФ 3.6.3.9, ранее 3.6.1.37) - фермент наружных клеточных мембран, осуществляющий сопряженный с гидролизом АТФ перенос ионов натрия и калия через мембраны против электрохимического градиента (Лопина, 1999; Болдырев, 2001).

Основной функцией ИаД-АТФазы является установление градиентов ионов натрия и калия на плазматической мембране. Эти градиенты вовлечены в регуляцию объема клетки, поддержание соответствующей среды для синтеза белка, контроль за дыханием и/или гликолизом, регуляцию внутриклеточного значения рН и трансмембранного переноса Сахаров, аминокислот и нейротрансмиттеров. В возбудимых клетках градиент ионов натрия составляет движущую силу для быстрого его тока внутрь клетки при возбуждении, для контроля за внутриклеточным содержанием ионов кальция через Na/Ca -обменный механизм (Аскари, 1990). Таким образом, Na,K

АТФаза является важнейшим регулятором клеточных функций, который обеспечивает способность возбудимых клеток воспринимать, кодировать и передавать сигналы, что необходимо для нормального функционирования нервной системы и организма в целом (Драбкина и соавт., 2004).

Со времени своего открытия Скоу в 1957 г. данный фермент был объектом очистки и реконструкции отдельных функций, предметом интенсивных кинетических исследований, были проделаны опыты с экспрессией фермента. В 60-80-х года прошлого столетия Иа,К-АТФаза привлекала внимание исследователей также в связи с изучением механизма развития артериальной гипертензии и поисками натрийуретического гормона

Bukolew et al., 1998). На сегодняшний день установлена первичная структура субъединиц ИаД-АТФазы, их топография в мембране, открыто семейство изоформ для субъединиц, выявлено участие Ыа,К-АТФазы в реализации межклеточных контактов и её связь с цитоскелетом. Накопленная за последние годы информация представлена в многочисленных обзорах

Модянов и соавт., 1987; Капля, 1997; Лопина, 1999; Болдырев, 2001; Драбкина и соавт., 2004; Koob et al., 1990; Devarajan et al., 1994; Hebert et al., 2001; Segall et al., 2001; Xie et al., 2002,2003; Laughery et al., 2004).

Проведенные в последние годы исследования свидетельствуют о том, что Na,K-ATOa3a является не только насосом, обеспечивающим создание градиентов ионов натрия и калия, но и рецептором, связывающим дигиталис-подобные факторы и передающим сигнал внутрь клетки вплоть до митохондрий и ядра с использованием разнообразных путей (Haas et al., 2000; Schoner, 2002; Xie et al., 2002, 2003). Большое внимание уделяется проблемам регуляции активности №,К-АТФазы (Кравцов и соавт., 2001; Therien et al., 2000; Zouzoulas et al., 2003; Flemming et al., 2003).

Существуют кратковременные и долговременные пути регуляции активности фермента (Therien et al., 2000). В зрелых эритроцитах ключевыми являются кратковременные механизмы регуляции, связанные с уже существующими структурами и метаболическими путями. Важная роль в регуляции ИаД-АТФазы эритроцитов принадлежит ионам кальция и магния, которые участвуют в реакционном цикле фермента (Skou, 1988). Рядом авторов выявлено присутствие в мембране эритроцитов белка FXYD-2, который способен влиять на сродство №,К-АТФазы к одновалентным катионам (Hoffman et al., 2002). Следует отметить, что активность фермента может регулироваться белками цитоскелета эритроцитов (Казеннов A.M. и соавт., 1990).

Согласно литературным данным в эритроцитах млекопитающих присутствует ингибитор №,К-АТФазы (Yingst, 1988), а также возможно наличие активатора фермента (Петруняка и соавт., 1990). Высказывались предположения о том, что модуляторы активности могут обладать магний- и кальций-зависимыми свойствами.

Цель настоящей работы состояла в исследовании модулирующих эффектов гемолизата эритроцитов на активность Ш,К-АТФазы головного мозга крысы. Ма,К-АТФаза головного мозга крысы была выбрана в качестве объекта исследования, поскольку обладает высокой активностью по сравнению с ферментом эритроцитов, что, как предполагалось, позволит более выражено выявить модулирующие эффекты гемолизата эритроцитов.

В предварительной серии экспериментов для получения гемолизата эритроцитов было подобрано соотношение упакованных эритроцитов к гемолизирующему раствору, при котором наблюдалось снижение активности ИаД-АТФазы гомогената головного мозга крысы.

При увеличении содержания ЭДТА в среде определения ферментативной активности отмечено снижение ингибирующего эффекта гемолизата эритроцитов на Иа,К-АТФазу гомогената головного мозга. Следует отметить, что в контроле увеличение концентрации ЭДТА приводило к снижению активности Ыа,К-АТФазы гомогената головного мозга, что, скорее всего, связано с хелацией двухвалентных ионов магния, который является важным регулятором активности фермента. Однако в опыте связывание ионов магния ЭДТА не приводило к изменению активности фермента, что, по-видимому, обусловлено тем, что в гемолизате эритроцитов присутствуют факторы, которые снижают чувствительность фермента к низким концентрациям ионов магния.

На следующем этапе было изучено влияние высоких концентраций MgCl2 в бескальциевой среде на ингибирование Ыа,К-АТФазы гомогената головного мозга крысы гемолизатом эритроцитов при 0,5 мМ ЭДТА. Результаты исследования показали, что ингибирующий эффект гемолизата эритроцитов на активность фермента сохранялся при всех исследованных концентрациях MgCl2 в среде определения ферментативной активности. Таким образом, гемолизат эритроцитов ингибировал №,К-АТФазу гомогената головного мозга крысы как при низких, так и при высоких концентрациях MgCl2 в среде определения ферментативной активности.

Изучение влияния различных концентраций СаС12 на активность Na,K-АТФазы гомогената головного мозга после прединкубации с гемолизатом эритроцитов показало, что при высокой концентрации СаС12(1 мМ) в среде определения ферментативной активности ингибирующий эффект гемолизата эритроцитов отсутствовал. В связи с этим исследовали влияние содержания MgCl2 в среде определения ферментативной активности при разных концентрациях СаС12 на ингибирование фермента гемолизатом эритроцитов. Известно, что ионы кальция конкурируют с ионами магния с образованием кальций-фосфофермента (Vasallo, Post, 1986). Показано, что в среде, содержащей 0,1 мМ СаС12, ингибирующий эффект гемолизата эритроцитов на активность ЫаД-АТФазы гомогената головного мозга сохранялся при всех исследованных концентрациях MgCl2 в среде определения ферментативной активности, в то время как при высокой концентрации СаС12 (1 мМ) ингибирующий эффект проявлялся только при увеличении содержания MgCl2 до 6 мМ и 12 мМ. Кроме того, обращает внимание тот факт, что в контроле при высоких концентрациях СаС12 в среде определения ферментативной активности с увеличением содержания MgCl2 от 3 до 12 мМ происходило повышение активности ИаД-АТФазы гомогената головного мозга. Ионы кальция и магния, а также их комплексы с АТФ конкурируют за центры связывания с ферментом. Согласно данным Post (1984) кальций относительно легко диссоциирует из комплекса с фосфоферментом. По-видимому, увеличение содержания MgCl2 в среде определения ферментативной активности приводит к вытеснению ионов кальция ионами магния из центров связывания фермента, в результате чего активность Na,K-АТФазы головного мозга повышается.

Таким образом, ингибирующий эффект гемолизата эритроцитов на активность ИаД-АТФазы гомогената головного мозга крысы проявлялся при низкой концентрации СаС12 в среде определения ферментативной активности, а при высокой концентрации СаС12 проявление эффекта зависело от соотношения концентраций ионов магния и кальция.

Полученные результаты позволяют предположить, что ингибирование №,К-АТФазы головного мозга крысы гемолизатом эритроцитов обусловлено присутствием в гемолизате нескольких факторов, действие которых зависит от соотношения двухвалентных ионов в среде определения ферментативной активности.

Поэтому в следующей серии экспериментов было поведено разделение гемолизата эритроцитов на отдельные фракции с помощью гель-фильтрации на сефадексе G-50 и изучено влияние этих фракции на активность Na,K-АТФазы гомогената головного мозга крысы. В результате проведенного фракционирования гемолизата эритроцитов было получено 11 фракций. Данные по исследованию влияния отдельных фракций после элюции гемолизата эритроцитов на активность №,К-АТФазы гомогената головного мозга крысы показали, что после прединкубации гомогената головного мозга крысы с фракцией №1 активность ИаД-АТФазы снижалась на 18%, а после прединкубации с фракциями №3 и №6 активность фермента, напротив, повышалась на 31% и 35% соответственно.

В результате электрофоретического анализа отдельных модулирующих фракций при использовании маркерных белков было определено, что во фракции №1 содержались белки с примерной молекулярной массой 230-260 кДа, белок с молекулярной массой 60-70 кДа и низкомолекулярные белки. Во фракции №3 отмечено присутствие только белков с примерной молекулярной массой 230-260 кДа. Во фракции №6 с помощью электрофореза белков не выявлено, что, скорее всего, связано с низким содержанием белка в данной фракции. Предположительно белки с молекулярной массой 230-260 кДа являются субъединицами спектрина, белок с молекулярной массой 60-70 кДа - белок полосы 4.2 мембранного скелета эритроцитов. Таким образом, полученные, отдельные фракции гемолизата различались не только по модулирующим эффектам на активность Ыа,К-АТФазы головного мозга, но и имели разный набор белков.

На следующем этапе исследования было изучено влияние полученных фракций гемолизата эритроцитов на активность №,К-АТФазы гомогената головного мозга крысы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кыров, Дмитрий Николаевич, Тюмень

1. Акимова OA. Выявление белков, взаимодействующих с Na,K

2. АТРазой/ О.А. Акимова, Н.В. Долгова, Н.В. Мает, A.M. Рубцов, О.Д. Лопина // Биохимия. 2003. - Т. 68, вып. 9. - С. 1271-1279.

3. Аскари А. Регуляция Na-Hacoca липопротеидами: механизм и физиологическое значение / А. Аскари // Биологические науки. 1990. - №6. -С.7-15.

4. Болдырев А.А. Роль структуры субстрата в функционировании Na,K-АТРазы/ А.А. Болдырев, О.Д. Лопина, И.А. Свинухова // Биохимия. 1989. -Т. 54, вып. 6. - С. 895-907.

5. Болдырев А А. Введение в биомембранологию. М.: МГУ, 1990. - 180 с.

6. Болдырев А.А. Влияние лигандов на вращательную подвижность Na,K-АТРазы / А.А. Болдырев, A.M. Рубцов, О.Д. Лопина, Д. Макстей, Личунь Янг, П. Дж. Куинн //Биохимия. 1995. - Т. 60, вып. 7. - С. 1171-1178.

7. Болдырев А.А. Na/K-АТРаза как олигомерный ансамбль /А.А. Болдырев // Биохимия. 2001. - Т. 66, вып. 8. - С. 1013-1025.

8. Владимирова Н.М. Изоферменты Ыа+,К+-АТРазы серого вещества и ствола мозга теленка / Н.М. Владимирова, Т.И. Муравьева, Т.В. Овчинникова, Н.А. Потапенко, О.М. Ходова // Биологические мембраны. -1998.-Т.15,№3.-С. 349-352.

9. Геннис Р. Биомембраны: молекулярная структура и функции, пер. с англ./ Геннис Р.- М.: Мир, 1997. 626 с.

10. Драбкина Т.М. От разнообразия молекулярных форм к функциональной специализации олигомерных белков. Никотиновый холинорецептор, ацетилхолинэстераза и Na ,К -АТФаза / Т.М. Драбкина, И.И. Кривой // Цитология. 2004. - Т. 46, № 2. - С. 89-104.

11. Елаев Н.Р. Активация Иа,К-АТРазы микросом нервных клеток ацетилхолином в модельной системе / Н.Р. Елаев // Биохимия. 1980. - Т. 45, вып. 10.-С. 1749-1754.

12. Елаев Н.Р. Эндогенные активаторы и ингибиторы №,К-АТФазы, индуцируемые ацетилхолином / Н.Р. Елаев, В.П. Андреев, Н.В. Шаврина // Бюлл.экспер.биол. и мед. 1983. - Т. 95, № 2. - С. 40-42.

13. Елаев Н.Р. Ингибитор ИаД-АТРазы мембран нервных клеток. Выделение и общая характеристика / Н.Р. Елаев, А.А. Байгильдина // Биохимия. 1994. - Т. 59, вып. 3. - С. 389-394.

14. Кагава Я. Биомембраны: пер. с яп./Кагава Я. М.: Высшая школа, 1985.- 303с.

15. Казеннов A.M. Исследование активности №,К-АТФазы в эритроцитах млекопитающих / А.М.Казеннов, М.Н.Маслова, А.Д. Шалабодов //Биохимия.- 1984. Т.49, вып.7. - С. 1089-1095.

16. Казеннов A.M. Роль мембранного скелета безъядерных эритроцитов в функционировании мембранных ферментов/ A.M. Казеннов, М.Н. Маслова, А.Д. Шалабодов//ДАН СССР. 1990. -Т.312, №1. - С.223-226.

17. Казеннов A.M. Влияние белков мембранного скелета на частные реакции Na,K АТФазы эритроцитов млекопитающих/ A.M. Казеннов, Ф.А. Рустамов, О.В. Фролова, А.Д. Шалабодов//Журн. эвол. физиол. и биох. - 1996.- Т.32. №4. С. 393-401.

18. Капля А.А. Роль ионов магния в регуляции каталитической активности Na+,K+-АТФазы почек / А.А. Капля, А.В. Кравцов, В.В.Кравцова // Укр. биохим. журн. 1988. - Т. 60. № 2. - С. 40-47.

19. Капля А.А. Чувствительность изоформ каталитической субъединицы Na+,K+-ATPa3bi мозга крысы к Ds-Na / А.А. Капля, А.В. Кравцов, В.В. Кравцова // Биохимия. 1995. - Т. 60, вып. 6. - С. 970-975.

20. Капля А.А. Инактивация Ыа+,К+-АТРазы мозга крыс додецилсульфатом натрия: влияние рН, ионов магния, температуры / А.А. Капля, А.В. Кравцов // Украинский биохимический журнал. 1997. - Т. 69, № 4. - С. 3-8.

21. Капля А.А. Структурная организация изоферментов Иа+,К+-АТРазы в плазматической мембране / А.А. Капля// Украинский биохимический журнал. 1997. - Т. 69, № 5-6. - С. 12-23.

22. Капля А. А. Физиологическая и адаптационная значимость изоферментов Na+,K+-ATPa3bi/ А.А. Капля // Украинский биохимический журнал. 1998. - Т. 70, № 3. - С. 3-11.

23. Кравцов А. В. Механизмы регуляции векторных ферментов биомембран/ А. В. Кравцов, И. Р. Алексенко. Киев: Наук. Думка, 1990. -176 с.

24. Кравцов А.В. Регуляция Na+,K+-ATP-a3bi: эффекты ионов Mg и Са/ А.В. Кравцов, В.В. Кравцова // Украинский биохимический журнал. 2001. - Т. 73, №2. -С. 5-27.

25. Лакин Г.Ф. Биометрия. М: Высшая школа, 1990. - 352с.

26. Лопина О.Д. №+,К+-АТФаза: структура, механизм и регуляция активности / О.Д. Лопина // Биологические мембраны. 1999. - Т. 16, №6. -С. 584-603.

27. Лопина О.Д. Взаимодействие каталитической субъединицы Na,K-АТРазы с клеточными белками и другими эндогенными регуляторами /О.Д. Лопина//Биохимия.-2001.-Т. 66, вып. 10.-С. 1389-1400.

28. Лопина О.Д. Иа,К-АТФаза и сердечные гликозиды: новые функции известного белка /О.Д. Лопина// Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 2005. -№2.-С.158-168.

29. Мацкевич Ю.А. Сравнительное исследование внутриклеточной регуляции активности транспортных АТФаз в безъядерных эритроцитах, Автореф. .кан. биол. наук: 03.00.04. Санкт-Петербург, 1994. - 20 с.

30. Меркель А.Л. Метод комплексной регистрации поведенческих и вегетативных реакций у крыс при проведении теста «открытого поля» / А.Л.

31. Меркель, Р.А. Хусаинов // Журнал высшей нервной деятельности. 1976. -Т.26,вып. 6.-С. 1314-1318.

32. Орлов С.И. Об участии свободной формы кальмодулина в регуляции активности Са-насоса эритроцитов/С.И. Орлов, П.П. Покудин, В. И. Бойцов, А. В. Сигожевский, П. В. Гулак// Биохимия. — 1985. — Т.50, вып.6. — С.883-890.

33. Павлов К.В. Электрогенный транспорт ионов Иа+,К+-АТРазой / К.В. Павлов, B.C. Соколов // Биологические мембраны. 1999. - Т. 16, № 6. - С. 604-638.

34. Петруняка В.В. Эндогенный Са2+-зависимый ингибитор Na+,K+-ATPa3bi эритроцитов изменяет чувствительность фермента к уабаину, калию и фурасемиду /В.В. Петруняка, Е.А. Панюшкина // Биологические мембраны. 1994. — Т.11, №1. — С.7-11.

35. Сторожок С.А. Молекулярная структура мембран эритроцитов и их механические свойства/ С.А. Сторожок, А.Г. Санников, Ю.М. Захаров. -Тюмень: Изд-во ТюмГУ, 1997. 140с.

36. Умарова Ф.Т. Влияние сердечных гликозидов на внутримолекулярную динамику Na+,K+-АТфазы / Ф.Т. Умарова, О.В. Белоногова, Г.И. Лихтенштейн // Биологические мембраны. 1995. - Т. 12, № 1. - С. 39-49.

37. Фролова О.В. Механизмы внутриклеточной регуляции активности Na,К-АТФазы эритроцитов крысы. Дис. канд.биол.наук: 03.00.04. Санкт-Петербург, 1996. -25с.

38. Akera Т. Digitalis sensitivity of Na+,K+-ATPase, myocytes and the Heapt / T. Akera, Ng. Yuk-Chow // Life Sciences. 1991. - Vol. 48, № 2. - P. 97-106.

39. Arystarkhova E. The y-subunit modulates Na+ and K+ affinity of the renal Na, K-ATPase / E. Arystarkhova, R.K. Wetzel, N.K. Asinovski, K.J. Sweadner // J. Biol. Chem. 1999. - V. 274. - P. 33183-33185.

40. Azuma K.K. Thyroid hormone specifically regulates skeletal muscule Na+,K+-ATPase alpha2-beta2 isoformes / K.K. Azuma, C.B. Hensley, M.J. Tang, A.A. McDonough // Am. J. Physiol. - 1993. - V.265, № 3. - P. C680-C687.

41. Balzan S. Selective inhibition of human erythrocyte Na+/K+-ATPase by cardiac glycosides and by a mammalian digitalis like factor / S. Balzan, G. DTJrso, S. Ghione, A. Martinelli, U. Montali // Life Sciences. 2000. - № 67. - P. 19211928.

42. Barnard M.L. Dopamine stimulates sodium transport and liquid clearance in rat lung epithelium / M.L. Barnard, W.G. Olivera, D.M. Rutschman, A.M. Bertorello, A.I. Katz, J.I. Sznajder // Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 1997. -V.156.-P. 709-714.

43. Beach R.E. Norepinephrine increases Na+-K+-ATPase and solute transport in rabbit proximal tubules/ R.E. Beach, S.J. Schwab, P.C. Brazy,V.W. Dennis // Am. J. Physiol. Renal Fluid. Electrolyte Physiol. 1987. - V.252. - P.215-220.

44. Beguin P. The y-subunit is a specific component of the Na,K-ATPase and modulates its transport function / P. Beguin, X. Wang, D. Firsov, A. Puoti, D. Claeys, J.D. Horisberger & K. Geering // EMBO J. 1997. - V. 16. - P. 42504260.

45. Bennett V. The spectrin-actin junction of erythrocyte membrane skeleton/V.Bennett//Biochem. Biophys. Acta. — 1989. — V.988, № 1. — P. 107121.

46. Bennett V. Spectrin based membrane skeleton: a miiltipotent adaptor between plasma membrane and cytoplasm /V. Bennett// Physiol. Rev. — 1990. — V.70, № 4. — P.1029-1065.

47. Bennett V. Spectrin and Ankyrin-Based Pathways: Metazoan Inventions for Integrating Cells Into Tissues /V. Bennett, A.J. Baines//Physiol. Rev. 2001. -V.81,№ 3. - P. 1353-1392

48. Beron J. Aldosterone modulates sodium kinetics of Na, K-ATPase containing an subunit in A6 kidney cell epithelia/ J. Beron, L. Mastroberardino, A. Spillmann, and F.Verrey // Mol. Biol. Cell 1995. - V.6. - P.261-271.

49. Bertorello A.M. Phosphorylation of the catalytic a subunit of Na+, K+-ATPase inhibits the activity of the enzyme/ A.M. Bertorello, A. Aperia, S.I. Walaas, A.C. Nairn, P. Greengard // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. -V.88. -P. 11359-11362.

50. Bertorello A. M. Short-term regulation of renal Na-K-ATPase activity: physiological relevance and cellular mechanisms/A. M. Bertorello, A. I. Katz //Am. J. Physiol. 1993. — V.265, № 6 (Pt2). — P.743-755.

51. Blanco G. Isozymes of the Na, K-ATPase: heterogeneity in structure, diversity in function / G. Blanco and R.W. Mercer // Am. J. Physiol. Renal Physiol. 1998. - V.275. - F633-F650.

52. Blaustein M.P. Endogenous ouabain: role in the pathogenesis of hypertension / M.P. Blaustein // Kidney Int. 1996. - V.49. - P. 1748-1753.

53. Blot-Chabaud M. Role of protein phosphatase in the regulation of Na+-K+-ATPase by vasopressin in the cortical collecting duct/ M. Blot-Chabaud, N. Coutry, M. Laplace, J. Bonvalet, and N.Farman// J. Membr. Biol. 1996. - V.153. - P.233-239.

54. Borin M.L. Roles of PKA and PKC in regulation of Na+ pump activity in vascular smooth muscle cells / M.L. Borin // Ann. NY Acad. Sci. 1997. - V.834. -P. 576-578.

55. Bruck R. Vanadyl ions stimulate K+ uptake into isolated perfused rat liver via the Na+/K+-pump by a tyrosine kinase-dependent mechanism/ R. Bruck, Z. Halpern, H. Aeed, Y. Shechter, S J.D. Karlish //. Pflagers. Arch. 1998. - V.435. -P.610-616.

56. Buckalew V.M. Summary of a symposium on natriuretic and digitalis-like factors / V.M. Buckalew, H.C. Gonick // Clin, and Exper. Hypertension. 1998. -V.20, № 5-6. - P. 481-488.

57. Cantiello H.F. Changes in actin filament organization regulate Na+, K+-ATPase activity. Role of actin phosphorylation /H.F. Cantiello// Ann. NY Acad. Sci. 1997. - V.834.-P.559-561.

58. Chen P.S. Microdetermination of phosphorus / P.S. Chen, T.Y. Toribara, H. Warner//Analyt. Chem. 1957. - V.28. - P. 1756-1758.л.

59. Cheng S.X.J. Ca .i determines the effects of protein kinases A and С on activity of rat renal Na+,K+-ATPase / S.X.J. Cheng, 0. Aizman, A.C. Nairn, P. Greengard, A. Aperia // The Journal of Physiology. 1999. - V.518, № 1. - P. 3746.

60. Clausen T. The Na+, K+ pump in skeletal muscle: quantification, regulation and functional significance/ T. Clausen// Acta Physiol. Scand. 1996. - V.156. -P. 227-235.

61. Cohen С. M. Biochemical characterization of complex formation by human erythrocyte spectrin, protein 4.1 and actin/ C.M.Cohen, S.F.Foley// Biochemistry. — 1984. —V.23,№ 31. — P.6091-6098.

62. Dahl K.N. Protein 4.2 is critical to CD47-membrane skeleton attachment in human red cells /K.N. Dahl, R. Parthasarathy, C.M. Westhoff, D.M. Layton, D.E. Discher// Blood. 2004. - V.103, № 3. - P. 1131-1136.

63. Derrickson B.H. Parathyroid hormone inhibits Na+-K+-ATPase through Gq/Gll and the calcium-independent phospholipase А2/ B.H. Derrickson, LJ. Mandel // Am. J. Physiol. Renal Physiol. 1997. - V.272. - P.781-788.

64. Devarajan P. Ankyrin binds two distinct cytoplasmic domains of Na, K-ATPase a-subunit / P. Devarajan, D.A. Scaramuzzino, and J.S. Morrow // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - V.91. - P.2965-2969.

65. Donnet C. Thermal denaturation of the Na+,K+-ATPase provides evidence for a-a oligomeric interaction and y-subunit association with the c-terminal domain /С. Donnet, E. Arystarkova, K.J. Sweadner // J. Biol. Chem. 2001. - V.276. - P. 7357-7365.

66. Doris P.A. Ouabain in plasma from spontaneously hypertensive rats / P.A. Doris // Am. J. Physiology. 1994. - V.266, № 1, part 2. - P. H360-H364.

67. Dorup I. Effects of adrenal steroids on the concentration of Na+-K+ pumps in rat skeletal muscle /1. Dorup, and T. Clausen // J. Endocrinol. 1997. - V.152. -P.49-57.

68. Durell S.R. Does the a subunit from the high affinity K+-translocating P-type Na,K-ATPase have a structure similar to that of K+ channels? / S.R.Durell, E.P. Bakker, H.R.Guy //Biophys. J. 2000. - V.78. - P. 188-199.

69. Efendiev R. PKC- and PKC- mediate opposing effects on proximal tubule Na+, K+-ATPase activity/R. Efendiev, A.M. Bertorello, C.H. Pedemonte // FEBS Lett. 1999.-V.456.-P.45-48.

70. Epstein F.H. The mode of inhibition by calcium of cell-membrane adenosine-triphosphatase activity/ F.H. Epstein, R. Whittam// Biochem. J. 1966. - V.99, №1. -P.232-238.

71. Fairbanks G. Electrophoretic analisis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane / G. Fairbanks, T. L. Steck, D. K.H. Wallach// Biochemistry. 1971. —V. 10, № 13. — P.2606-2617.

72. Favre H. Receptor-assay for endogenous inhibitors of a Na-K ATPase/ H. Favre, G. Siegenthaler, B. Martin, D. Roth, G. Granger, F. Louis // Klin. Wochenschr. 1987. - V. 65 (Suppl VIII). - P.49-52.

73. Fedorova O.V. Marinobufogenin an endogenous a-1-sodium pump ligand in hypertensive Dahl salf-sensitive rats /O.V. Fedorova, N.I. Kolodkin, N.I. Agalakova // Hypertension. 2001. - V.37. - P. 462-466.

74. Feschenko M.S. Phosphorylation of Na,K-ATPase by Protein Kinase С at Serl8 Occurs in Intact Cells but Does Not Result in Direct Inhibition of ATP Hydrolysis / M.S. Feschenko, K.J. Sweadner // J. Biol. Chem. 1997. - V. 272, № 28.-P. 17726-17733.

75. Feschenko M.S. Interaction of Protein Kinase С and cAMP-dependent Pathways in the Phosphorylation of the Na,К-ATPase/ M.S.Feschenko, E.Stevenson, K.J.Sweadner//J. Biol. Chem. 2000. - V. 275. - P. 34693-34700.

76. Flemming С Functional Modulation of the Sodium Pump: The Regulatory Proteins "Fixit" / C.Flemming, A.Yasser//News in Physiological Sciences. 2003. - V.18, №3.-P. 119-124.

77. Forbush B. Characterization of a new photoaffinity derivative of ouabain: labeling of the large polypeptide and of a proteolipid component of the Na, K

78. ATPase/ В. Forbush, J.H. Kaplan, J.F. Hoffman // Biochemistry. 1978. - V.17. -P.3667-3676.

79. Fukushima Y. Binding of divalent cation to phosphoenzyme of sodium- and potassium-transport adenosine triphosphatase/ Y.Fukushima, R.L. Post // J. Biol. Chem. 1978. - V.253, №19. - P.6853-6862.

80. Geering K. FXYD proteins: new tissue- and isoform-specific regulators Na,K-ATPase/K. Geering, P. Beguin, H. Garty, S. Karlish, M. Fuzisi, J.-D. Horisberge, G. Crambert// Ann. NY Acad. Sci. 2003. - V. 986. - P.388-394.

81. Giraud F. The effects of membrane lipid order and cholesterol on the internal and external cationic sites of the Na+, K+-pump in erythrocytes / F. Giraud, M. Claret, K.R. Bruckdorfer, B. Chailley // Biochim. Biophys. Acta. -1981.-V. 647.-P. 249-258.

82. Glynn I. M. All hands to the sodium pump// J. Physiol. — 1993. — V.19, № 3 P.625-638.

83. Goodman S. R. Brain spectrin: of mice and men / S. R. Goodman, W. E. Zimmer, M. B. Clark, I. S. Zagon, J. E. Barker, M. L. Bloom // Brain. Res. Bull. — 1995. — V.36, № 6. — P.593-606.

84. Goto A. Purification of endogenous digitalis-like factors from normal human urin / A. Goto, K. Yamada // Clin, and Exper. Hypertension. 1998. - V. 20, № 5-6.-P. 551-556.

85. Gusev G.P. Activation of the Na+-K+ pump in frog erythrocytes by catecholamines and phosphodiesterase blockers / G.P. Gusev, N.I. Agalakova, A.V. Lapin // Biochem. Pharmacol. 1996. - V. 52. - P. 1347-1353.

86. Haas M. Involvement of Src and epidermal growth factor receptor in the signal-transducing function of Na+/K+-ATPase / M. Haas, A. Askari, Z. Xie // J. Biol. Chem. 2000. - V. 275. - P. 27832-27837.

87. Hardwicke P.M. A proteolipid associated with Na, K-ATPase is not essential for ATPase activity/ P.M. Hardwicke, J.W. Freytag // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1981. V.l02. - P.250-257.

88. Hasler U. Structural and functional features of the transmembrane domain of the Na,K-ATPase (3 subunit revealed by tryptophan scanning/ U.Hasler, G.Crambert, J.D.Horisberger, K.Geering// J. Biol. Chem. 2001. - V.276. -P.16356-16364.

89. Hebert H, Three-dimensional structure of renal Na,K-ATPase from cryo-electron microscopy of two-dimensional crystals / H. Hebert, P. Purhonen, H. Vorum, K. Thomsen, A.B. Maunsbach // J. Mol. Biol. 2001. - V. 314, № 3. - P. 479-494.

90. Hegyvary C. Conformational changes of renal sodium plus potassium ion-transport adenosine triphosphatase labeled with fluorescein/ C. Hegyvary, P.L. Jorgensen// J. Biol. Chem. 1981. - V.256, №12. - P.6296-6303.

91. Herrera V. Development cell-spesific regulation of ai, а2, a3i a4 Na+,K+-ATPase gene expression / V. Herrera, T. Cova, D. Sasson, N. Ruiz-Oparo // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 1994. - V. 266. - P. 1301-1312.

92. Hoffman J.F. Na pump isoforms in human erythroid progenitor cells and mature erythrocytes/ J.F. Hoffman, 0. Potapova, A. Wickreme, D. R. Yingst// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. - V.99, №22. - P. 14572-14577.

93. Hootman S.R. Phorbol esters and A23187 regulate Na+-K+-pump activity in pancreatic acinar cells/ S.R. Hootman, M.E. Brown, J.A. Williams //Am. J. Physiol. 1987. - V.252, №4, Pt 1. - P.499-505.

94. Huang W.H. Interaction of Ca2+ with (Na+ + K+)-ATPase: properties of the Ca2+-stimulated phosphatase activity/ W.H. Huang, A. Askari//Arch. Biochem. Biophys. 1984. - V.231, №2. - P.287-292.

95. Ivanov A.V. Role of the self-association of |3 subunits in the oligomeric structure of Na+/K+-ATPase /A.V. Ivanov, N.N. Modyanov, A. Askari // Biochem. J. 2002. - V. 364, № 1. - P. 293-299.

96. Jordan C. Identification of a binding motif for ankyrin on the а-subunit of Na+, K+-ATPase/ C. Jordan, B. Puschel, R. Koob, and D. Drenckhahn // J. Biol. Chem. 1995. - V.270. - P.29971-29975.

97. Jorgensen P.L. Structure-function relationships of Na+, K+, ATP, or Mg2+ binding and energy transduction in Na,К-ATPase/ P.L. Jorgensen, P.A. Pedersen// Biochim. Biophys. Acta. 2001. - V.1505. - P.57-74.

98. Kansra V. Alterations in dopamine DAI receptor and G proteins in renal proximal tubules of old rats/ V. Kansra, T. Hussain, M.F. Lokhandwala // Am. J. Physiol. Renal Physiol. 1997. - V.273. - P.53-59.

99. Kashgarian M. Na, K-ATPase co-distributes with ankyrin and spectrin in renal tubular epithelial cells/ M. Kashgarian, J.S. Morrow, H.G. Foellmer, A.S. Mann, C. Cianci, T. Ardito // Prog. Clin. Biol. Res. 1988. - 268B. - P.245-250.

100. Kassir S. Abnormal sensitivity of erythrocyte Na/K ATPase of bipolar subjects to inhibition by calmodulin and calcium /S. Kassir, H.L. Meltzer // Biol. Psychiatry. 1991. - V. 30, № 6. - P. 631-634.

101. Kimura M. Calcium adaptation to sodium pump inhibition in a human megakaryocyte cell line/ M. Kimura, X. Cao, A. Aviv// Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2005. - V.289, №4. - P.891-897.

102. Kolbel F. The endogenous digitalis-like factor / F. Kolbel, V.Schreiber // Mol. Cell Biochem. 1996. - V. 111. № 5. - P.160-161.

103. Koob R. Association of kidney and parotid Na+, K+-ATPase microsomes with actin and analogs of spectrin and ankyrin / R. Koob, D. Kraemer, G. Trippe, U. Aebi, D. Drenckhahn // Eur. J. Cell Biol. 1990. - V.53. - P. 93-100.

104. Kraemer D. Two novel peripheral membrane proteins, pasin 1 and pasin 2, associated with Na+, K+-ATPase in various cells and tissues / D. Kraemer, R. Koob, B. Friedrichs, and D. Drenckhahn // J. Cell Biol. 1990. - V.111. - P. 2375-2383.

105. Lammli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage Т4/ U.K. Lammli //Nature. 1970. - V. 227. - P. 680-685.

106. Laughery M. Oligomerization of the Na,K-ATPase in Cell Membranes / M. Laughery, M. Todd, and J. H. Kaplan //J. Biol. Chem. 2004. - V.279, №35. - P. 36339-36348.

107. Lea J.P. Evidence that the inhibition of Na+/K+-ATPase activity by FK506 involves calcineurin / J.P. Lea, J.M. Sands, S.J. McMahon, J.A. Tumlin // Kidney Int. 1994. - V.46. - P.647-652.

108. Li C. Role of the transmembrane domain of FXYD7 in structural and functional interactions with Na,K-ATPase// J. Biol. Chem. 2005. - V.280. - P. 2738-2743.

109. Lichtstein D. Endogenous digitalis-like Na+,K+-ATPase inhibitors, and brain function / D. Lichststein, H. Rosen // Neurochem. Res. 2001. - V.26, № 8/9. - P. 971-978.

110. Lingham R.B. Regulation of rat brain (Na+, K+)-ATPase activity by cyclic AMP/ R.B. Lingham, and A.K. Sen// Biochim. Biophys. Acta. 1982. - V.688. -P. 475-485.

111. Lingrel J.B. Na+,K+-ATPase/ J.B. Lingrel and M. Kuntzweiler//. J. Biol. Chem. 1994. - V. 269, № 31. - P. 19659-19662.

112. Lowry O.H. Protein measurement with the Folin phenol reagent / O.H. Lowry, H.J. Rosebrough, A.K. Farr, P.L. Pandall // J. Biol. Chem. — 1951. — V.193.-P. 265-273.

113. Mansier P. Ca2+-free perfusion of rat heart reveals a (Na+,K+)ATPase form highly sensitive to ouabain/P. Mansier, L.G. Lelievre// Nature. 1982. - V.300. -P. 535-537.

114. Marette A. Insulin increases the Na+-K+-ATPase a-subunit in the surface of rat skeletal muscle: morphological evidence/ A. Marette, J. Krischer, L. Lavoie, C.

115. Ackerley, J.L. Carpentier // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 1993. - V.265. -P.l 716-1722.

116. Molitoris B.A. Dissociation and redistribution of Na+, K+-ATPase from its surface membrane actin cytoskeletal complex during cellular ATP depletion/ B.A. Molitoris, A. Geerdes, J.R. Mcintosh // J. Clin. Invest. 1991. - V.88. - P. 462469.

117. Munzer J.S. Tissue- and isoform-specific kinetic behavior of the Na,K-ATPase / J.S. Munzer, S.E. Daly, R. Blostein // J. Biol. Chem. 1994. - V.269, № 4. - P.16668-16676.

118. Nathanson J.A. The cellular Na+ pump as a site of action for carbon monoxide and glutamate: a mechanism for long-term modulation of cellular activity/ J.A. Nathanson, C. Scavone, C. Scanlon, M. McKee // Neuron. 1995. -V.14. -P.781-794.

119. Nestor N.B. Effects of protein kinase modulators on the sodium pump activities of HeLa cells transfected with distinct isoforms of Na, K-ATPase / N.B.Nestor, L.K. Lane, R.Blostein// Ann. NY Acad. Sci. 1997. - V.834. -P.579-581.

120. Nishi A. Dopamine regulation of renal Na+, K+-ATPase activity is lacking in Dahl salt-sensitive rats/ A. Nishi, A.C. Eklof, A.M. Bertorello, A. Aperia // Hypertension. 1993. - V.21. - P.767-771.

121. Okafor М.С. Evidence for a calmodulin-dependent phospholipase A2 that inhibits the Na,К-ATPase/ M.C. Okafor, R.J. Schiebinger, D.R. Yingst// Am. J. Physiol. 1997. - V.272. - P.1365-1372.

122. Or E. Solubilization of a complex of tryptic fragments of Na, K-ATPase containing occluded Rb ions and bound ouabain/ E. Or, E.D. Goldshleger, D.M. Tal, S.J. Karlish // Biochemistry. 1996. - V.35. - P.6853-6864.

123. Palek J. Red blood cell membrane mutations/ J.Palek, K.E. Sahr// Blood.1992.-V.80.-P.308.

124. Palmer L.G. Regulation of the Na-K pump of the rat cortical collecting tubule by aldosterone/ L.G. Palmer, L. Antonian, G. Frindt // J. Gen. Physiol.1993. V.102. - P.43-57.л .

125. Peines A. Kinetics of Na+, K+-ATPase inhibition by an endogenous modulator (II-A) / A. Peines, С. Pena, G. R. de Lores Arnaiz // Neurochem. Res. -2000. Vol. 25, №1.-P. 121-127.

126. Pierre S.V. Structure/function analysis of Na+-K+-ATPase central isoform-specific region: involvement in PKC regulation / S.V. Pierre, M.-J. Duran, D.L.

127. Carr, and Th.A. Pressley // Am. J. Physiol. Renal Physiol. 2002. - V.283. -F10O6-F1074.

128. Pontiggia L. Inhibition of Na, K-ATPase activity by cGMP is isoform-specific in brain endothelial cells/ L. Pontiggia, K. Winterhalter, S.M. Gloor// FEBS Lett. 1998. - V.436. - P.466-470.

129. Vasallo P. Calcium ion as a probe of the monovalent cation center of sodium, potassium ATPase/ P. Vasallo, R.L. Post//J. Biol. Chem. 1986 -V.261,№36. - P.16957-16962.

130. Post R.L. Phosphorus-31 nuclear magnetic resonance of phosphoenzymes of sodium- and potassium-activated and of calcium-activated adenosinetriphosphatase/ R.L. Post, E.T. Fossel, D.S. O'Hara, T.W. Smith //Biochemistry 1984. - V.20, №25. - P.7215-7219.

131. Pu H.X. Distinct regulatory effects of the Na,K-ATPase у subunit / H.X. Pu, R. Scanzano, Rh. Blostein // J. Biol. Chem. 2002. - V.277, № 23. - P. 2027020276.

132. Ragolia L. Role of serine/threonine protein phosphatases in insulin regulation of Na+/K+-ATPase activity in cultured rat skeletal muscle cells/ L. Ragolia, B. Cherpalis,M Srinivasan, N. Begum//J. Biol. Chem. 1997. - V.272: 23653-23658.

133. Ramirez-Gil J.F. Modifications of myocardial Na+,K+-ATPase isoforms and Na+/Ca2+ exchanger in aldosterone/salt-induced hypertension in guinea pigs/ J.F.

134. Ramirez-Gil, P. Trouve, N. Mougenot, A. Carayon, P. Lechat, D. Charlemagne // Cardiovasc. Res. 1998. - V.38. - P.451-462.

135. Rashed S.M. Regulation of Na+-pump activity by dopamine in rat tail arteries/ S.M. Rashed, E. Songu-Mize// Eur. J. Pharmacol. 1995. - V.284. -P.289-297.

136. Robinson J. D. A model for the reaction pathways of the K'»-dependent phosphatase activity of the (Na+, K+)-dependent ATPase/ J.D. Robinson, G.M. Levine, L.J. Robinson// Biochem. Biophys. Acta. — 1983. — V.731, №3. —■ P.406-414.

137. Rohani F. Effect of calcium concentration on isolated hamster brain Na-K-, Mg-dependent ATPase/ F. Rohani, J.D. Welty, D.F. Hastings //Can. J. Physiol. Pharmacol. 1982. - V.60, №8. - P. 119-124.

138. Satoh T. Different mechanisms of renal Na-K-ATPase regulation by protein kinases in proximal and distal nephron/ T. Satoh, H.T. Cohen, A.I. Katz // Am. J. Physiol. Renal Fluid. Electrolyte Physiol. 1993. - V.265. - P.399-405.

139. Satoh T. Intracellular signaling in the regulation of renal Na-K-ATPase. II. Role of eicosanoids/ T. Satoh, H.T. Cohen, A.I. Katz// J. Clin. Invest. 1993. -V.91.-P.409-415.

140. Scheiner-Bobis G. The sodium pump / G. Scheiner-Bobis // Eur. J. Biochem. 2002. - V.269, № 10. - P. 2424-2433.

141. Schmalzing G. The adhesion molecule on glia (AMOG/P2) and al subunits assemble to functional sodium pumps in Xenopus oocytes/ G. Schmalzing, S. Kroner, M. Schachner, S. Gloor// J. Biol. Chem. 1992. - V.267. - P. 2021220216.

142. Schoner W. Endogenous glycosides, a new class of steroid hormones / W. Schoner // Eur. J. Biochem. 2002. - V. 269, № 10. - P. 2440-2448.

143. Segall L. Mechanistic basis for kinetic differences between the rat al, a2 and a3 isoforms of the Na,K-ATPase / L. Segall, S. E. Daly, Rh. Blostein // J. Biol. Chem. 2001. - V. 276, № 34. - P.31535-31541.

144. Shibayama T. Differential binding activity of erythrocyte ankyrin to the alpha-subunits of Na+, K+-ATPases from rat cerebral and axonal membrane/ T.Shibayama, К.Какауа, Y. Nakamura // Cell. Struct. Funct. — 1993. — V.18, № 1. — P.79-85.

145. Singer S. J.The fluid mosaic model of the structure of cell membrane / S. J.Singer, G. L. Nicolson // Science. — 1972. — V.175, № 4023. — P.720-731.

146. Skou J.C. The influence of some cations on adenosine-triphosphatase from peripheral nerves /J.C. Skou//. Biochim. Biophys. Acta. 1957. - V.23. - P.394-401.

147. Skou J.C. Effect of ATP on the intermediary steps of the reaction of the Na, K-dependet enzyme system. II Effect of a variation in the ATP/Mg ratio / J.C. Skou // Biochim. Biophys. Acta. — 1974. — V.339, № 2. — P.246-257.

148. Skou J.C. Overview: the Na,K-pump/ J.C. Skou // Methods Enzymol. -1988.-V.156.-P.1-25.

149. Skou J.C. The Na,K-ATPase / J.C. Skou, M. Esmann // Bioenerg. Biomembr. 1992. - V.24, № 3. - P.249-261.

150. Srnivasan Y. Mapping the binding site on ankyrin for the voltage-dependent sodium channel from brain/ Y.Srnivasan , M.Lewaiicu , K. J. Angelides // J. Biol. Chem. — 1992. — V.267, № 11. — P.7483-7489.

151. Stewart D.J. Role of cyclic GMP in cholinergic activation of Na-K pump in duck salt gland/ D.J. Stewart, A.K. Sen// Am. J. Physiol. Cell Physiol. 1981. -V.240.-P.207-214.

152. Stewart W.C. Acute and chronic regulation of Na+/K+-ATPase transport activity in the RN22 Schwann cell line in response to stimulation of cyclic AMPproduction/ W.C. Stewart, P.H. Pekala, E.M. Lieberman// Glia. 1998. - V.23. -P.349-360.

153. Suzuki K. Equilibrium of phosphointermediates of sodium and potassium ion transport adenosine triphosphatase: action of sodium ion and Hofmeister effect / K.Suzuki, R.L. Post //J. Gen. Physiol. 1997. - V.109, №5. - P.537-554.

154. Swann A.C. Stimulation of brain Na+,K+-ATPase by norepinephrine in vivo: prevention by receptor antagonists and enhancement by repeated stimulation// Brain Res. 1983. - V.260. - P.338-341.

155. Takeda K. The functional unit of Na+,K+-ATPase is a monomeric a(3 protomer / K. Takeda, M. Kawamura // Biochem. And Biophis. Res, Commun. -2001. V. 280, № 5. - P. 1364-1366.

156. Taniguchi K. The oligomeric nature of Na/K-Transport ATPase / K. Taniguchi, Sh. Kaya, K. Abe, S. Mardh // J. Biochem. 2001. - V.129, № 3. - P. 335-342.

157. Therien A.G. Tissue-specific versus isoform-specific differences in cation-activation kinetics of the Na, К-ATPase/ A.G. Therien, N.B. Nestor, W.J. Ball, R. Blostein// J. Biol. Chem. 1996. - V.271.-P.7104-7112.

158. Therien A.G. Tissue-specific distribution and modulatory role of the y-subunit of the Na, К-ATPase/ A.G. Therien, R. Goldshleger, S.J.D. Karlish, R. Blostein// J. Biol. Chem. 1997. - V.272. - P.32628-32634.

159. Therien A.G. K+/Na+ antagonism at cytoplasmic cation activation sites of Na+-K+-ATPase: a tissue-specific mechanism of sodium pump regulation/ A.G. Therien, R. BlosteMAm. J. Physiol. Cell Physiol. 1999. - V.277. - P.891-898.

160. Therien A.G. Mechanisms of sodium pump regulation / A.G. Therien, Rh. Blostein//Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2000. - V.279. - P. 541-566.

161. Thomas R. Digitalis: its mode of action, receptor, and structure-activity relationships/ R. Thomas, P. Gray, J. Andrews // Adv. Drug Res. 1990. - V.19. -P.311-362.

162. Tobin T. Calcium ion and sodium- and potassium-dependent adenosine triphosphatase: its mechanism of inhibition and identification of the El-Pintermediate/ Т. Tobin, Т. Akera, S.I. Baskin, T.M. Brody //Mol. Pharmacol. -1973. V.9, №3. - P.336-349

163. Tran C.M. Photochemical labeling and inhibition of Na,K-ATPase by 2-azido-ATP. Identification of an amino acid located within the ATP binding site/ C.M.Tran, E.E. Huston, R.A. Farley// J. Biol. Chem. 1994 - V.269. - P.6558-6565.

164. Turi A. Myometrial (Na+,K+)-activated ATPase and its Ca2+ sensitivity/ A. Turi, K. Torok//Biochim. Biophys. Acta. 1985. - V.818, №2. - P. 123-131.

165. Turi A. Possible regulation of the myometrial Na+/K+-ATPase activity byI

166. Ca and cAMP-dependent protein kinase/ A. Turi, J.Somogyi// Biochim. Biophys. acta. 1988. - V. 940, №1. - P. 77-84.

167. Whittam R. Oligomycin and active transport reactions in cell membranes / R. Whittam, K.P. Wheeler, A. Blake//Nature. 1964. - V.203.-P.720-724.

168. Xie Z. Na+/K+-ATPase as a signal transducer / Z. Xie, A. Askari // Eur. J. Biochem. 2002. - V. 269, № 10. - P. 2434-2439.

169. Xie Z. Na+,K+-ATPase-Mediated Signal Transduction: From Protein Interaction to Cellular Function / Z. Xie and Ting Cai //Molecular. Interventions. -2003.-№3.-P. 157-168.

170. Xu Y. H. Association of vanadate-sensiuve Mg +-ATPase and shape change in intact red blood cells / Y. H.Xu, Z. Y.Lu, A. D.Conigrave, M. E.Auland, B. D.Roufogalis //J. Cell. Biochem. — 1991. — V.46, №4. — P.284-290.

171. Yingst D. R. Effect of hemolysate on calcium inhibition of the Na,K-ATPase of human red blood cells/ D. R. Yingst, M. J. Marcovitz// Biochem. Biophys. Res.Commun. — 1983. — V. 111, №3. — P.970-979

172. Yingst D.R. Sensitivity and reversibility of Ca2+-dependent inhibition of the Na+,K+-ATPase of human red blood cells /D.R. Yingst, P.M. Polasek// Biochim. Biophys. Acta. 1985. - V.813, № 2. - P. 282-286.

173. Yingst D.R. Modulation of the Na,K-ATPase by Ca2+ and intracellular proteins// Annu. Rev. Physiol. 1988. - V.50, № 2. - P. 291-303.

174. Yingst D. R. Calmodulin increases Ca2+-depending inhibition of the Na\K+-ATPase in human red blood cells / D. R. Yingst, J. Ye-Hu, H. Chen, V. Barrett //Arch. Biochem. Biophys. — 1992. — V.295, № 1. — P.49-54.

175. Yingst D.R. Binding and elution of EGTA to anion exchange columns: implications for study of (Ca , Mg )-ATPase inhibitors /D. R. Yingst, V. Barrett// Biochim. Biophys. Acta. —1994. —V. 189, №2. —P. 113-118.

176. Yingst D.R. Insights into the mechanism by which inhibition of Na,K-ATPase stimulates aldosterone production /D.R. Yingst, J. Davis, S. Krenz, R.J. Schiebinger // Metabolism. 1999. - № 9. - P.l 167-1171.

177. Yingst D.R. Inhibitors of tyrosine phosphatases block angiotensin II inhibitor of the sodium pump in zona glomerulosa/ D.R. Yingst, J.N. Davis, R.J. Schiebinger// Eur. J. Pharm. 2000. - V.406. - P. 49-52

178. Yu J. Selective solubilization of protein and phospholipids from red blood cell membranes by nonionic detergents / J.Yu , D. A.Eishman , Т. E. Sleek // J. Supramal. Struct. —1973. — V.l, № 2. — P.233-248.

179. Zhang Z. Structure of the ankyrin-binding domain of Na, К-ATPase/ Z. Zhang, P. Devarajan, A.L. Dorfman, J.S. Morrow // J. Biol. Chem. 1998. - V.273. -P.18681-18684.

180. Zouzoulas A. Modulation of Na,K-ATPase by the y-Subunit Studies with transfected cells and transmembrane mimetic peptides / A. Zouzoulas, A. G. Therien, R. Scanzano, Ch. M. Deber, Rh. Blostein // J. Biol. Chem. 2003. - V. 278, №42.-P. 40437-40441.

Информация о работе

Кыров, Дмитрий Николаевич
кандидата биологических наук
Тюмень, 2006
ВАК 03.00.04

Диссертация

Исследование модулирующих эффектов гемолизата эритроцитов на активность Na,K-АТФазы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы