Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование мобильных hobo-элементов в геноме родственных, длительно селектируемых линий DROSOPHILA MELANGASTER

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Исследование мобильных hobo-элементов в геноме родственных, длительно селектируемых линий DROSOPHILA MELANGASTER"

Санкт-Петербургский государственный университет

ИССЛЕДОВАНИЕ МОБИЛЬНЫХ ИоНо-ЭЛЕИЕНТОВ В ГЕНОМЕ РОДСТВЕННЫХ. ДЛИТЕЛЬНО СЕЛЕКТИРУЕМЫХ ЛИНИЙ

ВЯОБОРВИА МЕШОЕАЗТЕЯ

03.00.15 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

на правах рукописи УДК 575.24:595.773.4.

Галкин Алексей Петрович

Санкт-Петербург 1996г.

Работа выполнена в лаборатории генетики животных Биологического института Санкт-Петербургского государственного университета.

Научный руководитель: доктор биологических на>

профессор Л. 3. Кайданов.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Шварцман П.Я., доктор биологических наук, профессор Томилин Н.В.

Ведущее • учреждение: Санкт-Петербургский институт ядерной физию

Защита состоится " ^ " июня 1996г. в /200ча.со1 на заседании диссертационного совета Д.063.57.2: по защите диссертаций на соискание ученой степе! доктора биологических наук в Санкт-Петербургск( государственном университете по адресу : 19903*

г. Санкт-Петербург, Университетская набережна;

д. 7/9, СПбГУ.

С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан " 6 " </¿¿^3 199бг

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат биологических наук Л. А. Мамон

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Проблема непостоянства генома в различных аспектах - одна из актуальных проблем современной генетики. Откры-! мобильных генетических элементов ( МЭ ) привело к качестенному пегому в представлениях об источниках и тешах наследственной изменчи-:ти в популяциях.

Для Drosophila melanogaster отмечены случаи, когда транспозиции ¡ильных элементов и связанные с ними мутации и хромосомные аберрации :ят взрьшной характер. В первую очередь это касается явления гибрид-■о дисгенеза (ГД), которое наблюдается в определенных типах меали-шх скрещиваний (Kidwell, Kidwell, 1975 ; 1976 ). В настоящее время I Drosophila melanogaster известны три системы гибридного дисгенеза: I (Kidwell et al.,1977) ; i-fi (Bucheton et al., 1987 ) и H-E ( Yan-loulos et al., 1987 ; Blakman et al., 1987 ). Комплекс генетических >ушений, характернных для этих систем ГД, определяется массовым пе-1ещением дисгенных элементов Р, I и hobo соответственно. При скрещи-¡ии самцов, в геноме которых представлены дисгенные мобильные эле-ггы, с самками, у которых они отсутствуют, у гибридного потомства шюдаются высокие частоты мутаций и хромосомных аберраций, нерасхож-[ие хромосом в мейозе, отклонение в соотношении полов от 1:1, знойно высокие частоты рекомбинации как у самок, так и у самцов, и фильнссть, вызванная атрофией гонад.

Высокие частоты транспозиций МЭ в геноме Drosophila melanogaster >актерны также для различных систем нестабильности, не связанных с юнием ГД ( см. Berg, How. 1989 ). Важно отметить, что дестабилиза-1 МЭ мокет наблюдаться как в межлинейных, так и во внутрилинейных ющивачиях. Установлено, в частности, что мобильные генсгwecwo »ленты могут активно перемещаться в геноме инбредных линий LrosophL-metanogaster ( Blemont et al.,1987;1989; Lim et al., 1988 ; Kaida-' al.. 1991 ).

Уникальной модель» для исследования источников генетической г*-1чивости в условиях жесткого инбридинга является коллекция родствен--< высокоинбредных линий Drosophila melanogaster, полученных - лабо-гории генетики животных БиНИИ СПбГУ. Из природной популяции ''Ессен-■си" в результате длительного отбора на низкую половую активность щов была получена высокоинбредная низкоактивная линия ( в дальнл;-л НА). Возвратный отбор на повышение адаптивной ценности , несмотря

на тесный инбридинг, привел к получению высокоактивных линий ВА и Высокоактивные линии отличаются от исходной НА по целому компл адаптивно ваяных признаков. Все эти линии к маю 1996г. прошли б 730 поколений тесного инбридинга.

Линия НА характеризуется чрезвычайно высокой скоростью спонта го мутирования. Установлено, что в ее геноме представлены дисге мобильные hobo-элементы ( Kaldanov et al., 1991). Мы предполагаем, hobo-элементы являются источником нестабильности в геноме линии родственных ей инбредных линий. Сравнительный анализ локализаци состава фракций ЬоЬо-элементов. а также дисгенных характеристик ис дуемых линий в Н-Е системе гибридного дисгенеза позволяет прове эту гипотезу.

Цели и задачи исследования. Цель исследования заключается в ведении сравнительного анализа дисгенных характеристик родственных ний Drosophi1л melanogaster и их отводок в Н-Е системе гибридного генеза.

Основные задачи исследования состоят в следующем :

1. Охарактеризовать способность исследуемых линий индуцировать и рессировать Н-Е гибридный дисгенез.

2. Выявить локализацию и состав фракций ЬоЬо-элементов при помощи тодов in situ и Саузерн-блот гибридизации.

3. Оценить влияние отбора по адаптивно важным признакам на статус ний в Н-Е системе гибридного дисгенеза.

4. Путем дисгенных скрещиваний провести изогенизацию хромосом лини с целью дестабилизации ЬоЬо-элементов. Исследовать динамику измек дисгенных характеристик полученных изогенных сублиний.

5. Провести сравнительный анализ горячих точек транспозиции hobo-ментов в хромосомах линии НА и в ее изогенных сублиниях и проанаг ровать факторы, влияющие на направленность транспозиции.

Научная новизна работы. Благодаря использованию уникальной лекции родственных высокоинбредных линий Drosophita melanogaster е вые удалось показать , что в ходе отбора по адаптивно вазкным приз? происходит массовое перемещение hobo-элементов и закономерное изк ние характеристик линий в Н-Е системе ГД.

Предложена система скрещиваний, позволяющая изменять дисгс характеристики линий и проследить динамику этих изменений.

Отмечено, что транспозиция ЬоЬо-элементов при изогенизации х{ сом линии НА носит неслучайный, направленный характер.

При помощи метода гибридизации in situ установлено, что hobo-эле-знты активно перемещаются в геноме линии НА не только в межлинейных лсгённых скрещиваниях (при изогенизации хромосом линии НА), но и во .-¡утрилинейных скрещиваниях. Направленность транспозиции во внутрили-эйных и в межлинейных скрещиваниях в хромосомах линии НА различается, первые описано явление активации новых горячих точек транспозиции, зязанное, как мы предполагаем, с изменением структуры хроматина.

Научно-практическая ценность работы. Представленные в диссертации анные и обобщения существенны , на наш взгляд , для исследования ис-очников изменчивости в условиях жесткого инбридинга и отбора.

Полученные результаты подтвеждают гипотезу, согласно которой МЭ вляются источником генетической гетерогенности в инбредных линиях.

Доказанный нами факт увеличения индукционного потенциала сублиний результате изогенизации хромосом линии НА свидетельствует о принци-иальной возможности направленного изменения потенциала генетической зменчивости селектируемых объектов.

Особенность hobo-элементов, связанная с высокими частотами транс-озиции в межлинейных и во внутрилинейных скрещиваниях, позволяет ассматривать их как уникальную модель для исследования факторов, сп-еделящих направленный характер транспозиции.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представшим на 13й Европейской конференции по генетике дрозофилы (Ираклион, .Крит, Греция, 1Э94), на первом съезде ВОГиС (Саратов, 1994) и на вто-ом Балтийском генетическом конгрессе (Рига,1995).

Публикации. По теме диссертации опубликовано три статьи и трое •езисов.

Структура работы. Диссертация изложена на 129 стр., включая 12 •аблиц и 5 рисунков, и состоит из следующих разделов: введения, об£ара итературы, материалов и методов, результатов, обсуздения, выводив и ¡писка литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Линии Droscphtla mctanogaster, используемые в работе.

Высокоинбредная низкоактивная линия (НА), а также родственные ей ¡ысокоактивные линнии ВА и НА+, подробно охарактеризованы в работах 1.3. Кайданова с соавторами (Кайданов и др. ,1994; Кайданов и др. ,1996).

Линия HApas является отводкой от исходной линии НА, аналогична ей

по адаптивно важным характеристикам, но с 1986г поддерживается в » совой культуре.

665 и 665spa - комбинированные линии. Содержат хромосомы X линии НА. Тестерные линии:

. Base; Sml.al2 Су cn2sp2 , Pm; Tm2,Ubx130 es , Sb; spapo1 (в далы шем балансерная линия);

. In (2L+2R)Cy, CyL/ In (2LR)Pm (в дальнейшем CyL/Pm); охарактеризованы в работе Линдсли и Зимм (Lindsley, Zimm. 1990).

23.5 MRF/ CyL4 - линия Я-цитотипа. В её геноме представлено : чительное количество КоЬо-элементов. Индуцирует Н-Е ГД и использу! в качестве тестерной при определении цитотипов линий в тесте на а-фию гонад (Yannopoulos et al.,1987). Линия предоставлена професо X. Луисом (ИМББ, Ираклион, Греция).

Harwich"hlte (Hariri ch") - линия была выделенна из природной ш ляции в 1976г. Мутация white индуцирована впоследствии облучением ; трафиолетом. Содержит в геноме большое количество полноразмерных и летированных копиий Р-элементов и является линией Р-цитотипа. Обла, высоким индукционным потенциалом в Р-Н системе ГД. Линия предостав, профессором М. Кидвелл (университет штата Аризона, США).

Изогенные сублинии, полученные из исходной линии НА. Изогениз; линии НА по всем хромосомам была проведена по стандартной мето, (Кайданов и др. ,1972). Самцы линии НА. в геноме которой представ. hobo-элементы, скрещивались с самками балансерной линии, хромосомы торой несут инверсии, запирающие кроссинговер, и содержат лишь неск ко дефектных копий hobo. Вновь синтезированные изогенные субл: НА4-1, НА13-1, НА13-6 и НА111 содержат все хромосомы исходной л НА. Сублиния HAspa несет хромосому 4 балансерной линии, маркирова рецессивной мутацией spa.

Тест на атрофию гонад в Н-Е системе ГД. Атрофия гонад у гибри, го потомства Fj, полученного в результате дисгенных скрещиваний, я ется одной из основных характеристик Р-М и Н-Е систем гибридного , генеза. На основании этого для определения способности линий индуц вать и репрессировать Н-Е гибридный дисгенез разработан тест на а фию гонад.

Тест на атрофию гонад проводили по стандартной методике (Yann ulos,1978; Kaidanov et al.,1991) при 25°С для максимальной инду Н-Е гибридного дисгенеза.

А) Определение цитотипов* линий в Н-Е системе ГД. Виргинные самки j исследуемых линий скрещивались с самцами тестерной линии ii. 5MRF/CyL4 Я-цитотипа. У гибридных самок Ft диссектировали яичники и визировали частоты атрофии гонад.

Самки из линий Е-цитотипа, в геноме которых hobo-элементы отсутс-зуют, не способны репрессировать Н-Е ГД и при скрещивании с самцами 5. 5 MRF/CyL4 у гибридных самок Ft наблюдаются частоты атрофии гонад 1 уровне 70-100% (Yannopoulos et al.,1987). Чем ниже % атрофии гонад гибридных самок F1. тем выше репрессорный потенциал исследуемой ли-;да в Н-Е системе ГД.

Б) Определение индукционного потенциала линий в Н-Е системе ГД. пя определения индукционного потенциала самцов из исследуемых линий крещивали с виргинными самками тестерных линий Е-цитотипа. В качестве естерных использовались самки из линий Harwich* и CyL/Pm. Дальнейшие роцедуры соответствуют описанию в разделе А.

Принято считать, что исследуемая линия индуцирует Н-Е гибридный исгенез, если в тестерном скрещивании у гибридных самок Fi атрофия онад превышает 5% (Louis, Yannopoulos,1989).

Частоты АГ определяли по формуле:

А+2В количество атрофированных яичников

% АГ ----= -

2СА+В+С) общее число яичников

где : А - число самок с односторонней АГ; В - число сачок с двусторонней АГ; С - число самок с нормальной морфологией гонад.

Ошибку процента высчитывали по стандартной формуле (Лакин, 1990).

* Примечание: Термин "цитотип" характеризует наличие или отсутст вие ! цитоплазме яйцеклеток самок исследуемых линий факторов, репрессирую-»их транспозицию дисгенных МЭ. В Н-Е системе ГД принято выделять линии 'И" и "Е"-цитотипа. При скрещиваниии самок из линий Я-цитотипа с самими. обладающими индукционным потенциалом в Н-Е системе гибридного ?исгенеза,у самок отмечается полная или частичная репрессия атрофии лонад, В геноме линий Н-цитотипа представлено значительнее количество толноразмерных и дебетированных копий коЬо-элементов. Самки из линии З-цитотипа не репрессируют Н-Е ГД. В геноме линий Е-цитотипа НоЬо-эле-иенты либо отсутствуют вовсе, либо имеется несколько нефункциональных копий.

Гибридизация in situ. Гибридизацию -in situ проводили по методу описанному Боннером и Пардыо (Bonner, Pardue,1976) с меченной 3Н плазмидой pHcSac (см.: Stamatls et al.,1989), гидролизованной рестрии тазой Xhol. Плазмида содержит полноразмерный hobo-элемент, а так* последовательность, которая гибридизуется в районах 38С хромосомы 2 96С хромосомы 3.

Саузерн-блот гибридизация. Саузерн-блот гибридизацию проводили г стандартной методике (см.: Маниатис и др. ,1984) с небольшими изменен! ями. В качестве зонда использовали фрагмент hotio-элемента, выделена из гтлазмиды pHcSac.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Определение состава фракций ТшТю-элементов в геноме исследуемых линий

При помощи метода Саузерн-блот гибридизации установлено, что геноме линии НА и родственных ей линий представлены полноразмерные к пии hobo-элементов. Состав делетированных фракций hobo в геноме иссл дуемых линий различается.

В геноме линии НА наряду с полноразмерными копиями, которым соо ветствует фрагмент 2,6 т. п. н.. выявляется фракция делетированных h Ъо-элементов (1,6 т.п.н.). В геноме линии HApas фракция делетированн копий, характерных для НА, отсутствует, но возникает новая, близкая полноразмерным элементам.

Возвратный отбор в плюс направлении приводит к изменению соста делетированных hobo-элементов. В геноме высокоактивных линий НА* и обнаружены специфические делетированные производные hobo-элементоЕ так называемые Th-элементы размером 1,5 т.п.н. (с учетом гидрол* Xhol рестриктазой им соответствует фрагмент 1,1 т.п.н.). ГК-элеме? широко представлены в природных популяциях Drosophila metanogaster возможно, играют важную роль в негативной регуляции транспозиции f Ьо-элементов (Periquet et al.,1989).

Линии 665 и 665spa являются комбинированными и содержат хромосс X и 3 исходной линии НА. В их геноме методом Саузерн-блот гибридизаг выявляются только полноразмерные копии hobo-элементов.

2. Локализация hotoo-элементов в хромосомах родственных инбредных линий и их комбинированных отводок.

В хромосомах линии НА методом гибридизации in situ выявляется сайтов гибридизации hobo-элементов ( от 11 до 17 сайтов у отдель

;обей) (табл.1). Только 6 сайтов имеют общую локализацию у всех про-1ализированных личинок, остальные сайты гибридизации копий hobo варь->уют. Исходя из этих данных,можно заключить, что в геноме инбредной ',нии НА наблюдается высокая гетерогенность локализации hobo-элементов габл.15. Доля копий hobos локализация которых варьирует, соствляет 70%. ги данные свидетельствуют о том, что hobo-элементы активно перемеща-гся и являются источником генетической гетерогенности з геноме высо-зинбредной линии НА.

Предполагается, что, в негативной регуляции транспозиции ho-з-элементов принимают участие факторы, которые кодируются геномом "osophíta melanogaster (Yannopoulos et al., 1334). Вероятно, рецесив-¿e мутации в генах, осуществляющих негативный контроль транспозиции, условиях жесткого инбридинга, могут выходить в гомозиготу, что, в зою очередь, должно приводить к активации транспозиции во внутрили-зйных скрещиваниях.

Полученные нами результаты доказывают, что активация транспозиции э является непосредственным следствием инбридинга. Низкоактивная ли-ля HApas представляет собой отводок от исходной линии НА и на протя-энии 10 лет поддерживается в массовой культуре, однако полиморфизм экализациии hobo-элементов в геноме этой линии столь же высок, как и геноме инбредной линии НА. В хромосомах линии HApas обнаружено 21 айтов гибридизации hobo-элементов. У всех проанализированных осойей игналы гибридизации отмечены в сайтах 3D, 6А, ÍOA. 17А, 38Е и 12D. ги ае сайты (за исключением 38В) выявляются во всех препаратах линии А. Таким образом, линии НА и НАраз имеют сходный рисунок локализации опий hobo.

Экстремально высокое количество копий ЬоЬо-элементов содержится в еноме высокоактивной линии ВА (6!сайт гибридизации ). В хромосомах одственных линий ВА и НА пять копий имеет общую локализацию, и три из их в Х-хромосоме- 3D, 6А, 17А. Доля копий, локализация которых варь-pver в геноме инбредной линии ВА, значительно ниже, чем в низкожтив-ой /-.янии и составляет всего 12%.

Обобщая данные, полученные при помоаи гибридизации m sUu и Cay -ерн-блот гибридизации, можно заключить, что в результате собора í люс направлении от исходной низкоактивной линии происходи', массово?, еремещение ЬоЬо-элементов, увеличение общего количества копий и з?ко--омерное изменение состава полноразмерных и делетированных Фракций, ак уже отмечалось, при отсутствии отбора hobo-элементы в геноме линии

- а -

Локализация копий ьоьо-элеыентов в хромосомах лиши НА

хромосомы плечи хр-м сайты локализации ьоь о-элементов в геноме линии НА (по результатам анализа ? личинок число сайтов полимор-

в отд. плечах всего физм локализации (B2)

X - 30,6А„10Й„10В<2>,12В(1>, 12Я <1),17Д 7

L 22С < 1 > * 24Р < 2 > ,25Я(6) 3

2 20 70+10,2

R 420<6>.440(3?„50С<2>,56В<1>, 57В<4) 5

3 L 67А,71А<1>,,73Й<1> 3

R в5В.95й<5> 2

Примечание г в скобках указано число личинок, имеющих копию hobo в в данном сайте ; отсутствие скобок означает, что в геноме всех проанализированных личинок в данном сайте представлены ьоьо-элементы.

'акте перемещаются, но среднее количество копий на геном варьирует ¡о и состав фракций hobo-элементов остается неизменным, результаты свидетельствуют в пользу гипотезы, в. соответствии с кода негативная регуляция транспозиции не является полностью автоном-процессом и контролируется геномом Drosophila metanogaster.

В комбинированных линиях 665 и 665spa, которые содержат хромосомы { 3 линии НА, проводили анализ локализации hobo-элементов только в юмосомах (в дальнейшем ХНА-хромосомы). Как уже было отмечено, в эме этих линий обнаружены только полноразмерные копии hobo. В -хромосоме линии 665 hobo-элементы локализованы в сайтах 3D, 6А, , и 17А. Для линии 665spa характерен несколько иной рисунок локали-т полноразмерных копий - 6А, 10А, 12Е и 17А. Отметим, что сайты 3D.

10А и 17А. в которых сохранились полноразмерные элементы в -хромосомах комбинированных линий, выявляются также у всех проана-ированных особей линии НА. Мы считаем, что полноразмерные копии ho-элементов в данных сайтах Х-хромосом комбинированных линий сохрани-ь от исходной линии НА, поскольку вероятность эксцизии hobo из всех х районов с последующей заменой другими копиями крайне мала.

Относительно более высокая стабильность локализации полноразмер-копий по сравнению с делетированными производными уже отмечалась ее Р. К. Елзкманом и В. М. Гелбертом для hobo-элементов (Blackman, Gel-t,1987) и Спардлингом с соавторами для Р-элементов (Spardling et ,1986). Причины зависимости частот транспозиции от размера копий :а не ясны. Предполагается, что это может быть связано с конфсрмаци-ши особенностями транспозазы, которая с большей эффективностью вы-taeT укороченные копии, чем полноразмерные.

з. Направленность процесса транспозиции при изогенизации хромосом линии НА.

В результате изогенизации хромосом линии НА происходят массо-i,направленные перемещения hobo-элементов в хромосомах этой линнии. 33 сайтов гибридизации hobo-элементов, возникших de novo, 75% явля-;я общими для двух сублиний и более 25% совпадают у всех трех незг-зимо полученных изогенных сублиний. Столь жестко детермшгироваш эемещения МЭ по геному отмечены впервые, хотя сам факт существования эячих точек транспозиции МЭ можно считать доказанным (см.: У.с-i, 1984; Berg, Howe, 1989).

Предложенная наш схема эксперимента впервые позволила провести авнительный анализ сайт-специфичности транспозиции МЭ в хромосомах

одной и той же линии, но в различных условиях - во внутрилиней скрещиваниях и в межлинейных скрещиваниях (при изогенизации хрома линии НА). Во всех трех проанализированных изогенных НА-сублиниях с; ты гибридизации НоЬо-элементов выявляются в районах 5А, 13А, 13Б, 2! 35Р, 36Б, 82Е и 840. В хромосомах исходной линии НА инсерций в ; сайты не происходит, несмотря на то, что ЬоЬо-злементы активно пере) щаются и во внутрилинейных скрещиваниях. Иными словами, те хромосом локусы, которые не являются горячими точками транспозиции во внутри, нейных скрещиваниях, становятся реципиентными для действия транспоз в дисгенном скрещивании. Мы считаем, что активация горячих то транспозиции в процессе изогенизации происходит в результате измене: структуры хроматина в тех районах, которые являются потенциальн сайтами-мишенями для инсерций НоЬо-элеыентов. Такое изменение струк ры хроматина может иметь место в гетерозиготе в результате транс-ак вации транскипции под действием факторов хромосом балансерной лин Как уже упоминалось, в линии НА нарушена нормальная экспрессия цел ряда генов, в том числе регуляторных (Кайданов, 1994). Известно, чт процессе транскрипции происходит декомпактизация хроматина (Геор ев, 1985), что, вероятно, делает транскрибируемые районы ДНК доступн для действия транспозазы.

4.Цитотипы исследуемых линий в Н-Е системе гибридного дисгенеза Линия НА и все родственные ей линии репрессируют Н-Е ГД (табл. однако уровень репрессии для низкоактивных и высокоактивных линий з чительно различается.

При скрещивании самок высокоактивных линий ВА и НА+ с самц 23.5 Ш/СуЬ4 атрофия гонад у гибридных самок Р, не превышает (табл.2). Это свидетельствует о том, что линии ВА и НА* являются ли ями строгого Я-цитотипа.

Низкоактивные линии НА и НАраз, а также изогенные НА-субли имеют ослабленный Я-цитотип. При скрещивании самок из этих линий самцами 23.5 ММ7СуЬ4 у гибридных самок отмечаются частоты атрс гонад в интервале от 36 до 58%.

Наблюдаемые различия репрессорных потенциалов высокоактивных низкоактивных линий носят достоверный характер (р<0,01).

Комбинированные линии 665 и бббэра, которые содержат хромосом и 3 исходной линии НА, также лишь частично репрессируют Н-Е гибрщ дисгенез. В тестерном скрещивании для гибридных самок ?! характе частоты АГ на уровне 45 и 25% соответственно (табл.2).

РЕПРЕССИЯ Н-Е ГИБРИДНОГО ДИСГЕНЕЗА

Результаты теста на атрофию гонад у гибридных самок , полученных от скрещивания самцов тестерной линии

Л

2з,5мяя/суь <н-цйтотапа) с санками исследуемых линий

Материнская линия Всего проанализировано самок fi Частоты пттрофт гонад (в у самок г* Еитопш лшшй в Н-Е системе ГД

НА 94 50,5+3,6 Н'

НА4-1 68 44,1±4,3 н*

НА13-1 67 38,2+4,3 Н'

ШЗ-6 51 36,3+4,8 Н'

НА III 56 44,6+4,7 Н-

НАзра 71 43,О+4,2 н-

ВА 62 13,7+3,1 н

НА+ 64 о,а±о,з ¡1

НЛра^ 56 37,3+4,6 Н'

665 53 45,3+4,8 ¡Г

91 23,5+3,2 Н'

суь/рга 100 99,0+0,7 е

ВёЛёйсбрййй линия 53 89,6+3,О е

Примечание г н- ослабленный н-цнтоттп ( т.д. сймки исследуемой линии лишь частично репрессируют н-е ГД).

5. Индукционный потенциал исследуемых линий в Я-Е системе ГД

Для определения индукционного потенциала в Н-Е системе ГД самум исследуемых линий скрещивали с тестерными самками £-цитотипа и у гибридных самок Fj анализировали частоты атрофии гонад. Атрофия гонад наблюдается у гибридов Fj как при индукции Н-Е, так и Р-Н ГД. Для тоге чтобы дифференцировать эти две системы, мы использовали тестерных само? двух линий - CyL/Pm М-Е-цитотипа (1-й тип скрещиваний) и Harwich* р-Е-цитотипа (2-й тип скрещиваний). Самки линии Harwich* полностью репрессируют Р-М ГД, но не обладают репрессорным потенциалом в H-f системе ГД. Такой подход позволяет оценить индукционный потенциал исследуемых линий именно в Н-Е системе ГД.

Самцы линии НА индуцируют АГ у гибридных самок Fj на уровне 305 (табл.3). Такой же уровень индукционного потенциала в Н-Е системе гибридного дисгенеза характерен и для самцов линии HApas.

Высокоактивные линии НА+ и ВА, полученные от исходной линии НА i результате возвратного отбора на повышение адаптивной ценности, не индуцируют АГ при скрещивании с самками из линий £-цитотипа и, следовательно, не обладают индукционным потенциалом в Н-Е системе гибридногс дисгенеза (табл. 3). На основании полученных нами данных можно заключить, что в результате отбора на повышение адаптивной ценности происходят неслучайные, направленные изменения характеристик исследуемы) линий в Н-Е системе ГД.

Комбинированные линии 665 и 665spa, как видно из данных представленных в таблице 3, также не способны индуцировать Н-Е ГД. При скрещивании самцов этих линий с самками Е-цитотипа у гибридных самок Fj частоты атрофии гонад не превышает 5% (табл. 3).

Индукция Н-Е ГД сопровождается возникновением множественных мутаций у гибридного потомства. Блэкман и Гелберт показали, что в случае Н-Е гибридного дисгенеза имеют место высокие частоты возникновения летальных мутаций. При скрещивании самцов Н на самок Е-цитотипа мутацт возникали кластерами и их частота (7%) была в два раза выше, чем в ре-ципрокном направлении скрещиваний (Blakman, Gelbart, 1987). Аналогичные результаты получены и в нашей лаборатории 0. В. Иовлевой и 0. В. Кузнецовой. При скрещивании самцов линии НА (Н-цитотипа) с самками из линю CyL/Pm (Е-цитотипа) 12% вторых хромосом несли летальные мутации, которые возникали кластерами. В реципрокном направлении частота летальныз мутаций была достоверно ниже (р<0,01) и составила 4% (Иовлева, Кузнецова, неопубликованные данные).

ИНДУКЦИЯ Н-Е ГИБРИДНОГО ДИСГЕНЕЗА

Результаты теста на атрофию гонад у гибридных самок Р1, полученных от скрещивания самцов исследуемых линий с самками тастврных линяй Е-цитотипа

отцовская линия материнская линия "W----- говтар- ноети ricero проанализировано самок Fi Атрофия гонад (В*) у СОМОН Fl спосооность линии иидуци-ровять Н-Е ГД

НА CyL/Pm l 212 33,5+2,3 " + "

2 123 32,9+3,О

3 121 31,2+3,0

Harwich" 1 109 29,8+3,1

HApas CyL/Pm 1 115 36,1+3,2 М f. и

2 57 36,8+4,5

Harwich" 1 - -

ВА CyL/Pm 56 0+0,3

2 60 0+0,3

3 61 0 + 0,3

KarwichW I 54 0+0,3

НА+ CyL/Pm 1 132 0+0,2

2 75 0 + 0,3

ы Harwich 1 50 0 + 0,3

665 CyL/Pra 1 64 4,6+1,9 II_м

SO 1,0+1,0

Harwich" 1 67 2,3+1,7

G65spa CyL/Pm 1 66 з,ац,7 н_н

2 SO 3,0+1,7

Harwich** 1 77 1,4+0,9

При изогенизации хромосом линии НА в результате межлинейных скре щиваний, которые носили дисгенный характер, наблюдается массовое перс мещение hobo-элементов и выявляются видимые мутации, которые затрагивг ют локусы yelow и white Х-хромосомы. Мы предполагаем, что эти мутащ вызваны инсерцией ЬоЬо-элементов в соответствующие локусы ( в изога ной сублинии 13-6 обнаружена инсерция hobo-элемента в сайт 1В Х-хромс сомы, в котором локализован ген yellow).

Определение индукционного потенциала изогенных сублиний, получе! ных от исходной линии НА, проводилось дважды - в 4-м и в 26-м поколе нии после изогенизации. В четвертом поколении после изогенизации сам! всех пяти независимо полученных НА-сублиний при скрещивании с самка» Е-цитотипа индуцировали АГ у гибридных самок Fj на уровне 70-9С (табл. 4), что достоверно превышает индукционный потенциал исходнс линии НА (р<0,01). К 26-му поколению индукционный потенциал всех пят изогенных сублиний заметно понизился. При скрещивании самцов из иссле дуемых сублиний с самками из линий Е-цитотипа у гибридных самок I частота атрофии гонад составляла 20-4055, что примерно соответствуЕ индукционному потенциалу исходной низкоактивной линии (табл.,4).

Таким образом, в результате изогенизации хромосом линии НА npoi зошло повышение индукционного потенциала, однако затем, в ряду поколе ний этот показатель вновь снизился до исходного уровня. Исходя из да! ных, полученных нами в пяти независимо проведенных экспериментах, mos но заключить, что в геноме Drosophita metanogaster функционируют мех. низмы, контролирующие стабильный уровень индукционного потенциала Н-Е системе ГД.

Заключение

Проведенные исследования доказывают, что в геноме всех родстве! ных линий, включенных в исследование, представлены мобильные hobo-эле менты. В хромосомах низкоактивных линий НА и HApas отмечена высок, гетерогенность локализации копий hobo, однако их перемещения огранич< ны определенным набором сайтов-мшеней. Возвратный отбор на повышен! адаптивной ценности сопровождается активной транспозицией hobo-элеме) тов и закономерными изменениями дисгенных характеристик линий в Н-системе ГД. При изогенизации хромосом линии НА наблюдается массов; транспозиция ЬоЬо-элементов, которая носит неслучайный, направлена характер. Направленность транспозиции ЬоЬо-элементов в хромосомах л1 нии НА во внутрилинейных скрещиваниях и в межлинейных скрещивали: (при изогенизации хромосом линии НА) не совпадает.

Таблица 4.

ИНДУКЦИЯ Н-Б ГИБРИДНОГО ДЙСГЕНКЗА Атрофия гонад у гибридных самок полученных от скрещивания самцов изгенных НА сублиний с самками тестерных линий Е-цитотша

отцовская линия материнская линия эксперимент

1 2

^анализировано самок pi Атрсхдая гонад (В*> У СЕМОК проанализировано самок fi частота атрсфа гонад (*) у самок Р1

ксход, линия НА Су1./Рш 212 33,5+2,3 123 32,9+3,О

Harwich" - - Ю9 29,3+3,1

НА4-1 CyL/Ря 104 77,9+2,9 62 25,8+4,О

HarwichW - - 69 29,0+3,9

НА13-1 CyL/Ри 66 72,0+3,9 62 37,1+4,3

Harm chw - - 90 22,2+З.Л

НА13-6 Cyl./Pm 95 7&,а+з,б 65 40,0^,3

Harwich" - - 99 " ----- ■-- ЗО,8+3,3

НАШ CyL/P» 73 72,6+3,7 73 29,2+3,8

Harwi chw - - 74

Г'-пл 1 CyL/P» 106 90,6+2,0 70 28,6+3,8

Hлг ui ch - - 61 :><>,;•••.

выводы

1. Методом Саузерн-блот гибридизации установлено, что в генома всех родственных линий Drosophila melanogaster, включенных в исследо вание, представлены полноразмерные и делетированные копии hobo-элемен тов. Состав делетированных фракций ЬоЬо-элементов в геноме этих лини различается.

2. hobo-элементы активно перемещаются и являются источником гене тической гетерогенности в геноме высокоинбредной линии НА.

3. При отборе по адаптивно важным признакам происходят закономер ные изменения характеристик исследуемых линий в Н-Е системе гибридног дисгенеза :

- низкоактивные линии НА и HApas индуцируют Н-Е гибридный дисгенез имеют ослабленный Н-цитотип ;

- высокоактивные линии ВА и НА+ не способны индуцировать Н-Е гибридны дисгенез и являются линиями строгого Н-цитотипа.

4. Смена вектора отбора по адаптивно важным признакам вызывае массовое перемещение ЬоЬо-элементов и изменение качественного и коли чественного состава фракций hobo в геноме исследуемых линий.

5. В результате изогенизации линии НА по всем хромосомам наблэда ется массовая транспозиция hobo-элементов, которая носит неслучайный направленный характер. Более 25% сайтов гибридизации ЬоЬо-элементов возникших йе поуо^совпадают у всех трех проанализированных сублиний включенных в анализ, а 7556 вновь возникших сайтов являются общими дл двух из трех проанализированных сублиний.

6. Эксперименты по изогенизации хромосом линии НА путем дисгеннь скрещиваний доказывают, что в геноме линий Drosophila meianogaste функционируют механизмы, контролирующие стабильный уровень индукциои ного потенциала в Н-Е системе гибридного дисгенеза.

7. Горячие точки транспозиции ЬоЬо-элементов в хромосомах лини НА во внутрилинейных и в межлинейных скрещиваниях (при изогенизации различаются. Описано явление активации новых горячих точек транспозк ции в межлинейных скрещиваниях.

Список публикаций по теме диссертации

Список статей:

1. Bol shako V V. N.. A.P.Galkin, L. Z. Kaldanov, V.A.Gvozdev, Ch.Lois. 1994. Closely related Drosophila rneianogaster strains with alteed fitness also depict chenges in their hobo element properties/' Ge-iet. Sel. Evol. 26: 205-216.

2. Кайданов Л.З., С.В.Мыльников, Û.В. Иовлева. А.П.Галкин. Направленный характер генетических изменений при длительном отборе линий rosophita rneianogaster по адаптивно важным признакам//ГснетикаУТ. 30. !3. С. 1085-1096.

3. Кайданов Л. 3., А.П.Галкин, 0. В. Иовлева, 0. Г.Силелева. Напонн-юнный характер транспозиций мобильного hobo - элемента в длительно :електируемой линии НА Drosophila rneianogaster// Цитология и генетика. 996. Т. 30 . N 1. С. 23-30.

Список тезисов:

1. Bolshakov V.N., A.P.Galkin.O.V.Iovleva, L.Z.Kaldanov, Ch.Lo-iis. Closely related Drosophila rneianogaster strains with altered fit-iess also depict changes in their hobo element properties// 13th Euro-

>ean Drosophila Research Conference. Abstract and programme. Poster ;ession B. Mobile genetic elements. 1993. Anhia Pelaghia, Crete. P. .35.

2. Kaidanov L. Z. , A. P. Galkin , 0. V. Iovleva. Non-randca trans-)osition of hobo elements during long-term selection of Drosophilc rneianogaster strains/^Procecdings of the Latvian Acad . of Sci . 1995. J:5/6. Section B: Natural sciences. Abstracts from the 2nd Baltic Ge-îetlcal Congress. P. A4.

3. Кайданов Л. 3., А. П. Галкин, 0. В. Иовлева. Направленный характер "енетических изменений в длительно селектируемых линиях Drosophila ;-,q-Lanogaster//Генетика. 1994. T. 30. Приложение. Материалы 1- го оъйда ЗОГиС. Саратов. С. 63.

Отпечатано в полграфической мастерской Санкт-Петербург, ул. Коломяги, 3-я линии,д.10А

Тир. 50

Усл. печ.л. 1,0.