Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование методом конфокальной микроскопии динамики светозависимой продукции H2O2 в протопластах фотосинтезирующих клеток высших растений

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование методом конфокальной микроскопии динамики светозависимой продукции H2O2 в протопластах фотосинтезирующих клеток высших растений"

На правах рукописи

Найдов Илья Александрович

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТОДОМ КОНФОКАЛЬНОЙ МИКРОСКОПИИ ДИНАМИКИ СВЕТОЗАВИСИМОЙ ПРОДУКЦИИ н202 В ПРОТОПЛАСТАХ ФОТОСИНТЕЗИРУЮЩИХ КЛЕТОК ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 3 НОЯ 2011

Пущино — 2011

4858397

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте фундаментальных проблем биологии РАН, г. Пущино.

Научный руководитель доктор биологических наук

Иванов Борис Николаевич

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор

Мошков Дмитрий Алексеевич

доктор биологических наук Любимов Валерий Юрьевич

Ведущая организация Филиал Учреждения Российской

академии наук Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Защита состоится$М ноября 2011 г. в (О'ООна заседании диссертационного совета Д 002.066.01 при Учреждении Российской академии наук Институте фундаментальных проблем биологии РАН по адресу: Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, д. 2, ИФПБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИФПБ РАН.

Автореферат разослан октября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Н. Назарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В процессе метаболизма растений в кислородной атмосфере, неизбежно образуются активные формы кислорода (АФК). К таким формам кислорода относятся: синглетный кислород ('Ог), супероксидный анион-радикал (02"), гидроксильный радикал ('ОН), пероксид водорода (Н202). АФК образуются во всех компартментах клетки - цитоплазме, хлоропластах, митохондриях, пероксисомах и на наружной стороне плазмалеммы (Foyer, Noctor, 2009). Предполагается, что основным источником АФК в растениях на свету является фотосинтетическая электрон-транспортная цепь (ФЭТЦ) хлоропластов. При взаимодействии триплетных молекул кислорода с молекулами хлорофиллов в триплетном состоянии возникают молекулы синглетного кислорода. В результате переноса электрона на кислород от компонентов ФЭТЦ (реакция Мслера) происходит образование супероксидного анион-радикала (0¡"), который при последующем восстановлении или дисмутации превращается в перекись водорода - Н202. АФК имеют высокую реакционную способность и могут повреждать внутриклеточные компоненты. В настоящее время АФК рассматривают не только как деструктивные молекулы, но и как важные сигнальные молекулы, играющие роль первичных и вторичных сигналов в системе клеточной регуляции.

Система регуляции с участием АФК контролируется процессами их образования и утилизации. Многие, если не все, внешние воздействия смещают баланс между двумя этими процессами, что сказывается как на стационарной концентрации разных видов АФК, так и на окислительно-восстановительном состоянии основных низкомолекулярных компонентов антиоксидантной системы - аскорбата и глутатиона (Mittler et al., 2004). Обнаружены протеинкиназы, факторы транскрипции и фосфатазы, активность которых напрямую регулируется АФК (Desikan, 2001).

В настоящее время считается доказанным участие АФК в процессах апоптоза, запрограммированной гибели клеток (Gadjev, 2008). Было показано участие АФК в протекании защитных реакций, таких как образование поперечных связей между гликопротеинами клеточной стенки, реакции гиперчувствительности (Thordal-Christensen et al., 1997; Wojtaszek, 2007) и системной устойчивости (Ryals et al., 1996). Имеются данные о совместном

Принятые сокращения АФК - активные формы кислорода; ФЭТЦ - фотосинтетическая электрон-транспортная цепь; BSA - бычий сывороточный альбумин; DCF - дихлороф-луоресцеин; DCMU - 3-(3,4-дихлорфенил)-1,1-диметилмочевина (диурон); FDA - флуоресцеин диацетат; H2DCF-DA - дигидродихлорофлуоресцеин диацетат; H2DCF - дигидродихлорофлуоресцеин.

действии АФК с абсцизовой кислотой при закрытии устьиц (Zhang et al., 2001) и с ауксином в гравитропической реакции корня (Joo et al., 2001).

До сих пор нет однозначных данных о скорости образования и количестве разных АФК в клетках растений in vivo. На свету в хлоропластах по разным источникам в норме до 30% электронов, проходящих по ФЭТЦ, переносится на кислород с образованием Oj~ и затем Н202. Скорость дисму-тации молекул О'" супероксиддисмутазами близка к скорости их поступления в каталитический центр в процессе диффузии (2X109 M_1s_1). Все молекулы 02~, появляющиеся в строме хлоропластов, преобразуются в Н202 супероксиддисмутазами, находящимися в большом количестве на поверхности тилакоидных мембран (Asada, 2000). Н202 обладает меньшей реакционной способностью, более длительным временем жизни и способна перемещаться на большее расстояние от места своего образования, чем другие АФК. Для предотвращения деструктивного действия Н202 в хлоропластах и в целой клетке действуют несколько антиоксидантных систем. Основными компонентами антиоксидантной системы хлоропластов являются аскорбат и аскорбатпероксидазы, растворимые и мембраносвязанные (Asada, 1999). Передача сигнала может происходить рядом с местом образования Н202 в мембране или строме хлоропласта, но Н202 может также выйти из хлоропластов и инициировать сигнальные пути в цитоплазме. Молекулы Н202, образованные в разных компартментах клетки, могут инициировать разные сигнальные пути (Mullineaux, 2006).

В связи с малым временем жизни АФК в клетке в присутствии анти-оксидантов, не существует надежных методов определения их концентрации в живых клетках (Queval et al., 2007, Swanson et al., 2011). Исследования процессов, в том числе процессов метаболизма АФК, происходящих в зеленых клетках растений, с помощью микроскопии с применением цветных и флуоресцентных красителей затруднены тем, что эти клетки содержат вещества как поглощающие свет, так и способные флуоресцировать, прежде всего, хлорофилл. Поэтому в качестве объектов чаще используют клетки и ткани растений не содержащие хлоропластов, такие как корни и эпидермис. Большинство исследований с использованием цветных или флуоресцентных индикаторов АФК показывают относительное количество АФК до и после воздействия. В настоящей работе предпринята попытка наблюдения динамики образования АФК в зеленых, фотосинтезирующих клетках листьев растений в процессе освещения.

Цель и задачи работы

Основная цель работы - выяснить динамику образования и распределения Н202 в фотосинтезирующих клетках высших растений на свету. В ходе выполнения диссертационной работы решали следующие задачи:

1. Разработать методические приемы измерения в протопластах и хлоропластах листьев высших растений светоиндуцированной динамики

флуоресценции DCF, продукта реакции красителя H2DCF-DA с пероксидом водорода.

2. Установить, какие процессы, помимо реакции H2DCF-DA с пероксидом водорода, влияют на уровень флуоресценции DCF и ее динамику.

3. Измерить кинетику продукции Н202 в протопластах и выявить процессы, влияющие на распределение Н202 между хлоропластами и цитоплазмой.

4. В опытах с протопластами, выделенными из листьев мутантов араби-допсиса с нарушенным биосинтезом аскорбата выявить роль этого антиок-сиданта в метаболизме Н202 в хлоропластах ш vivo.

Научная новизна работы

Разработаны методические приемы наблюдения в реальном времени светоиндуцированного образования Н202 внутри протопластов фотосин-тезирующих клеток растений с помощью конфокальной микроскопии. Показана возможность применения прижизненного флуоресцентного красителя H2DCF-DA для сравнительных исследований динамики образования Н202 в протопластах и выявлены ограничения этого метода. Впервые показана динамика образования Н202 в компартментах живых растительных клеток и обнаружены свидетельства выхода образующейся на свету Н202 из хлоропластов. Подтверждена ведущая роль аскорбат-пероксидазной системы клетки в утилизации Н202, образующейся в хлоропластах при освещении.

Практическая значимость работы

Разработанные методические подходы, позволяющие изучать динамику накопления и распределения перекиси водорода, основной АФК фотосинтезирующих клеток листьев, в процессе освещения, могут быть использованы для оценки устойчивости растений разных видов и сортов, к неблагоприятным изменениям окружающей среды, воздействию патогенов, гербицидов, удобрений. Они могут применяться при разработке способов направленной регуляции фотосинтеза. Результаты работы могут быть также использованы в лекциях и практических занятиях по ботанике, биохимии и физиологии растений, экологии.

Апробация работы

Основные положения работы представлены на годичном собрании общества физиологов России (г. Екатеринбург, 2008 г.), 19-х Пущинских чтениях по фотосинтезу и Всероссийской конференции "Фотохимия хлорофилла в модельных и природных системах" (г. Пущино, 2009 г.), Всероссийской научной конференции "Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды" (г. Иркутск, 2009 г.), 14-й международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (г. Пущино, 2010 г.), 10-й

международной конференции по активным формам кислорода и азота в растениях (г. Будапешт, Венгрия, 2011 г.)

Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано 9 печатных работ, из них 4 статьи в реферируемых журналах, включая международные.

Структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, разделов, где представлены основные результаты и их обсуждение, заключения, выводов и списка цитируемой литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы

В обзоре литературы изложены современные представления о структуре ФЭТЦ. Часть обзора посвящена проблеме образования и утилизации АФК в клетках растений. Описаны современные представления об участии АФК в качестве сигнальных молекул во внутриклеточной регуляции, в частности, в ретроградной регуляции у растений. Представлено краткое описание принципов флуоресцентной и конфокальной микроскопии и основных флуоресцентных соединений, используемых в настоящее время для регистрации процессов образования разных видов АФК.

Объекты и методы исследования

Основным объектом исследования были протопласты, выделенные из листьев арабидопсиса (Arabidopsis thaliana, сорт Columbia). Часть экспериментов проводили на протопластах из листьев гороха (Pisum sativum) и кукурузы (Zea mays), а также на целых листьях и нижнем эпидермисе листьев гороха. Протопласты выделяли с помощью ферментов 1% целлюлазы (Sigma) и 0,2% пектиназы (Macerozyme RIO, Serva) в среде, содержащей 0,5 M сорбит, 5 мМ СаС12, 5 мМ MgCl2, 20 мМ NaCl и 15 мМ MES-КОН, рН 5,5, а также дополнительные добавки, обеспечивающие высокую жизнеспособность получаемых протопластов: 5 мг/мл поливинилпирролидон, 0,2% BSA, 0,25 мМ EDTA и 10 мМ аскорбат натрия. После выделения протопласты хранили при комнатной температуре в базовой среде, содержащей 0,5 M сорбит, 5 мМ СаС12,5 M MgCl2,20 мМ NaCl и 25 мМ HEPES-KOH, рН 7,6, либо 15 мМ MES-КОН, рН 5,5.

Интактные хлоропласты выделяли из листьев шпината (Spinacia oleráceo) путем центрифугирования в градиенте перколла. Среда с 40% перколлом содержала: 3,33 мМ ЭДТА, 1,66 мМ MgCl2, 83,3 мМ Hepes (рН 7,6) и 0,55 M сорбит. Среда с 80% перколлом содержала: 10 мМ ЭДТА, 5 мМ MgCl2,

250 мМ Hepes (рН 7,6) и 1,65 М сорбит. После центрифугирования брали хлоропласты из внутренней части нижнего слоя. Хлоропласты отмывали от перколла в среде инкубации и оценивали долю интактных органелл. В экспериментах использовали суспензии с долей интактных хлоропластов близкой к 100%. Базовая среда инкубации для хлоропластов содержала 0,4 М сорбит, 5 мМ MgCl2,20 мМ NaCl, 25 мМ HEPES-KOH, рН 7,6.

Раствор H2DCF-DA готовили в базовой среде в концентрации 100 мкМ. На покровное стекло наносили 4 мкл суспензии протопластов и добавляли 4 мкл 100 мкМ раствора H2DCF-DA; конечная концентрация красителя составляла 50 мкМ. Суспензию закрывали покровным стеклом и помещали под микроскоп. Чтобы избежать разрушения протопластов вследствие сдавливания при наложении покровного стекла, по краям суспензии предварительно наклеивали на предметное стекло две полоски ленты толщиной около 30 мкм. Чтобы не индуцировать перенос электронов по ФЭТЦ и, как следствие, образование АФК до начала наблюдения флуоресценции DCF, во время предварительного поиска объекта в проходящем свете использовали зеленый светофильтр (ЗС-11).

В форме диацетата H2DCF-DA свободно проникает через мембраны клеток. Внутри клетки краситель деэстерифицируется неспецифическими внутриклеточными эстеразами до H2DCF, который хуже проникает через мембраны и преимущественно остается внутри компартментов. H2DCF необратимо реагирует с Н202 образуя сильно флуоресцирующий продукт -DCF. Реакция катализируется внутриклеточными пероксидазами, которые присутствуют в большом количестве в строме и люмене хлоропластов (Miyake and Asada, 1992), в митохондриях и в цитоплазме всех клеток растений. Таким образом, процесс образования Н202 в разных компар-тментах клетки проявляется как увеличение в них интенсивности флуоресценции DCF. Производные H2DCF-DA, образующиеся внутри клетки, -H2DCF и DCF - плохо проникают через мембраны и преимущественно остаются в том компартменте, где произошла их деэстерификация, но они не задерживаются внутри клеток и органелл, наружная мембрана которых была повреждена, что позволяло контролировать целостность исследуемых объектов в ходе эксперимента. Следует учитывать, что H2DCF конкурирует с аскорбатом за активный центр пероксидазы, однако, поскольку используемая нами концентрация H2DCF-DA (50 мкМ) на два порядка ниже, чем концентрация аскорбата (-4 мМ; Conklin et al., 2000), мы предполагаем, что H2DCF-DA не изменяет состояние аскорбат-пероксидазной системы клетки.

После поиска протопласта в проходящем свете, динамику флуоресценции хлорофилла и DCF регистрировали в конфокальном режиме. Параметры для наблюдения флуоресценции хлорофилла: возбуждение 635 нм, регистрация в диапазоне 640-750 нм; флуоресценции DCF: возбуждение 488 нм, регистрация в диапазоне 504-543 нм. Интервал между

сканированиями различался в зависимости от режима регистрации. В отдельных экспериментах наблюдали флуоресценцию FDA, Hoechst33258, MitoTracker RED и динамику флуоресценции резоруфина - продукта реакции AmplexRed с Н202. Параметры для наблюдения флуоресценции FDA: возбуждение 488 нм, регистрация в диапазоне 504-543 нм; флуоресценции Hoechst33258: возбуждение 405 нм, регистрация в диапазоне 410-480 нм; флуоресценции MitoTracker RED: возбуждение 488 нм, регистрация в диапазоне 550-605 нм; флуоресценции резоруфина: возбуждение 488 нм, регистрация в диапазоне 540-600 нм.

В процессе наблюдения происходит постепенное испарение жидкости из под покровного стекла, что приводит к уменьшению толщины слоя жидкости между предметным и покровным стеклом, и, как следствие, к сдавливанию протопласта. Испарение среды в процессе эксперимента ограничивает время наблюдения несколькими минутами, а герметизация приводит к изменению газообмена - в малом объеме пробы, в присутствии живых клеток, может быстро исчерпываться С02 или 02. Испарение среды также приводит кувеличению расстояния между покровным стеклом и объективом, и смещению верхней границы протопласта, прилегающей к покровному стеклу. При регистрации одного оптического среза в виде XYT-серии (XY -измерения в плоскости оптического среза, Т- время), необходимо вручную корректировать положение фокуса по мере смещения верхней границы протопласта, ориентируясь на изображение флуоресценции хлорофилла. Регистрация только одного оптического среза позволяет регистрировать динамику флуоресценции с высоким временным разрешением, но движение хлоропластов, изменение площади их проекции в поле зрения и возможные ошибки при ручной корректировке фокуса оказывают большое влияние на регистрируемую динамику флуоресценции DCF. Используя процедуру автоматической корректировки фокуса в интервале времени между кадрами, можно исключить случайные возмущения. При этом микроскоп производит несколько поисковых сканирований флуоресценции хлорофилла около предыдущего положения фокуса и выбирает новое положение фокуса для следующего кадра, имеющее наиболее контрастное изображение. При таком способе регистрации исключается влияние случайных ошибок наблюдателя, но движение хлоропластов внутри протопласта оказывает влияние на регистрацию динамики флуоресценции DCF.

При сканировании XYZT-серии (Z - измерение вдоль оптической оси объектива), изображения флуоресценции хлорофилла и DCF регистрировали группами по 10 оптических срезов на расстоянии 0,5 мкм по оси Z, при этом интервал времени между этими группами составлял около 30 секунд. За 10 минут наблюдения регистрировали 20 групп кадров по 10 оптических срезов, охватывающих слой толщиной 5 мкм, содержащий хлоропласта, прилегающие к покровному стеклу (рис. 1а). В интервале между группами

3 Рис. 1. а - вид сбоку сканиру-

Покровное стекло емой час™ протопласта, приле-

1 гающей к покровному стеклу; б - схема этою изображения, где

Хлора пласты \ г-

, \ ооковые штриховые дуги показы-

вают границу протопласта.

оптических срезов осуществлялся автоматический поиск плоскости лучшего фокуса (на рис. 16 отмечена стрелкой) и корректировался диапазон сканирования по оси Ъ для компенсации смещения протопласта за время предыдущего сканирования. Поскольку хлоропласта в процессе смещения верхней границы протопласта и движения внутри протопласта всегда попадали в сканируемую область, их движение не вызывало возмущения регистрируемой динамики флуоресценции ЭСБ, как это происходит в случае с регистрацией только одного оптического среза.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Особенности наблюдения фотосинтезирующих объектов

Зеленые клетки растений содержат хлоропласты, поглощающие свет в широком спектральном диапазоне, в том числе и свет, возбуждающий флуоресценцию многих красителей, используемых во флуоресцентной и конфокальной микроскопии. Хлорофилл флуоресцирует в красной области спектра, что позволяет легко визуализировать хлоропласты, но одновременно с этим делает невозможным использование в экспериментах флуоресцентных красителей, флуоресцирующих в той же области спектра. Во всех экспериментах лазеры микроскопа (635 нм и 488 нм) были также и источником действующего света. Учитывая специфику работы конфокального микроскопа, сложно оценить интенсивность света, падающего на объект в течении каждого конкретного наблюдения. При высокой интенсивности действующего света может происходить образование синглетного кислорода и разрушение реакционного центра ФС2. Чтобы снизить вероятность протекания фотодеструктивных процессов, интенсивность лазеров устанавливали на минимальном уровне, при котором можно регистрировать динамику флуоресценции DCF.

Наблюдаемые протопласты всегда имели разное количество и расположение хлоропластов в поле зрения, поэтому динамика флуоресценции, усредненная по произвольно выбранной зоне интереса, сильно зависела от расположения этой зоны. Чтобы иметь возможность сравнивать разные протопласты между собой, необходимо выбирать в каждом из сравнива-

Рис. 2. а - изображение флуоресценции хлорофилла в одном из оптических срезов верхней части протопласта; б - бинарная маска, построенная по участкам изображения "а", где флуоресценция хлорофилла составляет не менее 25% от максимума; в - производная маска в которую входят пиксели на расстоянии до 1 мкм от маски "б".

емых протопластов зону интереса, динамика флуоресценции в которой не зависит от количества и расположения хлоропластов в поле зрения.

Благодаря регистрации флуоресценции хлорофилла в сериях микроскопических изображений можно было определить внутренний объем хлоропластов, что позволило измерить там уровень флуоресценции DCF. Для определения скорости роста флуоресценции DCF отдельно в хлоро-пластах и в прилегающем к ним слое цитоплазмы, был написан макрос для программы ImageJ: Для каждого кадра на основании изображения флуоресценции хлорофилла (рис. 2а) строили двоичную маску, в которую входили пиксели с интенсивностью флуоресценции хлорофилла выше 25% (рис. 26). Затем, на основании маски для хлоропластов строили производную маску, в которую входили пиксели на расстоянии в пределах 1 мкм от границы маски хлоропластов (рис. 2в). Далее рассчитывали среднюю интенсивность флуоресценции DCF для пикселей, входящих в каждую из масок. Использование такого подхода вместе с регистрацией флуоресценции в виде XYZT-серии с компенсацией движения протопласта помогает избежать влияния на регистрируемые значения флуоресценции DCF, как перемещения самого протопласта в поле зрения микроскопа, так и перемещения хлоропластов внутри протопласта и изменения площади их видимой проекции в процессе длительного наблюдения.

2. Исследование объектов разной степени интактности

При окрашивании целых листьев путем погружения в раствор H2DCF-DA (или FDA) или вакуумной инфильтрации флуоресценция наблюдалась преимущественно в местах повреждений эпидермиса, вдоль проводящих пучков и в замыкающих клетках устьиц. Эпидермис и кутикула препятствуют проникновению красителей внутрь клеток, поэтому нельзя гарантировать равномерное окрашивание клеток в толще листа. Механическое удаление эпидермиса вызывает образование большого количества

и

АФК в процессе раневой реакции. Аналогично, при использовании цветных красителей - нитросинего тетразолия (NBT) и диаминобензидина (DAB) -окрашивание листьев наблюдали преимущественно вдоль проводящих пучков, вдоль срезов и в местах повреждений листьев. Эффект раневой реакции проявлялся сильнее, чем действие света, что затрудняло наблюдение светоиндуцированных процессов.

В интактных хлоропластах, выделенных из листьев шпината, наблюдалось увеличение интенсивности флуоресценции DCF при освещении, но длительное наблюдение этого процесса было невозможно из-за постепенного нарушения целостности оболочки хлоропластов - за 3 минуты наблюдения хлоропластов под микроскопом менее половины хлоропластов в поле зрения сохраняли целостность наружной мембраны. Во время наблюдения некоторых протопластов происходило их разрушение и высвобождение интактных хлоропластов в среду. Так же, как и изолированные хлоропласта шпината, хлоропласты из разрушенных протопластов некоторое время демонстрировали увеличение интенсивность флуоресценции DCF, но со временем целостность их внешней оболочки нарушалась, и происходил выход накопленного DCF в окружающий раствор.

Протопласты - клетки, лишенные клеточной стенки - являются удобным объектом для исследований с помощью флуоресцентной и конфокальной микроскопии, поскольку клеточная мембрана относительно легко проницаема для большинства красителей и добавок. Протопласты длительное время сохраняют способность к фотосинтезу и фиксации С02 и представляют собой удобный объект для изучения светоиндуцированных процессов, происходящих в клетках листа in vivo. Протопласты, использовавшиеся в наших экспериментах, демонстрировали характерную индукционную кривую флуоресценции хлорофилла, измеренную с помощью РАМ-флуориметрии, а рассчетные параметры индукционной кривой, такие как qP, NPQ, RFD, были близки таковым у целых листьев. Однако процесс выделения протопластов с использованием ферментов является стрессом для клеток растений, аналогичным реакции на поражение патогенными грибами, ферменты которых (целлюлаза и пектиназа) используются для разрушения клеточной стенки. Процесс выделения протопластов может индуцировать защитные реакции клетки, окислительный взрыв и апоптоз. Одним из признанных методов определения апоптоза является наблюдение конденсации хроматина и фрагментации ядра. Используя флуоресцентный краситель Hoechst33258, мы наблюдали в используемых нами протопластах округлые ядра с четкой границей, характерные для живых клеток. Во многих протопластах, выделенных без использования дополнительных добавок (см. методы), мы наблюдали фрагментированные ядра, что говорит о протекании апоптоза, вызванного процессом выделения протопластов. Другим характерным признаком таких протопластов были неподвижные округлые

* г-* » • »

б V ,. , Л ЩщШ*

В ?© © 1 «.: а я.' V ЩГ'.* 4? $

Рис. 3. Сопоставление расположения флуоресценции хлорофилла (слева, красный цвет), и ОСБ (справа, зеленый цвет) в протопластах через 5 мин освещения, а - арабидопсис, б - горох и в - кукуруза. V - вакуоль. Шкала 10 мкм.

а б / »

-

Рис. 5. Идентификация ярко-зеленых областей внутри хлоропластов как крахмальных зерен. Флуоресценция ОСБ (зеленый цвет) через 5 мин освещения протопластов из листьев растений арабидопсиса, находившихся или 2 суток при непрерывном освещении (а), или 2 суток в темноте (б). Шкала 10 мкм.

митохондрии, собранные в группы. Поскольку митохондрии всегда были видны по флуоресценции в них DCF, их форма и движение были удобным признаком для определения жизнеспособности протопластов в ходе эксперимента.

3. Флуоресценция PCF в протопластах в процессе освещения

Рост флуоресценции DCF зависел от света и почти не наблюдался в протопластах находящихся за пределами поля зрения микроскопа, и, следовательно, не освещавшихся. При освещении только половины протопласта путем расположения его на границе поля зрения наблюдали быстрый рост флуоресценции DCF в хлоропластах только освещаемой половины. При освещении скорость образования Н202 возрастает в несколько раз, что позволяет сделать вывод о том, что хлоропласта являются основным источником АФК в фотосинтезирующих клетках растений. При добавке к суспензии протопластов 12 мкМ DCMU, препятствующего переносу электронов от ФС2, светоиндуцированный рост флуоресценции DCF внутри хлоропластов не наблюдался, что указывает на то, что основным источником АФК, реагирующих с HZDCF является ФЭТЦ хлоропластов. Эффект DCMU указывает также на то, что в условиях, использованных в работе, не происходит фотодинамическое образование АФК.

Рост флуоресценции DCF практически никогда не наблюдался внутри вакуоли, что можно объяснить отсутствием в вакуоли источников Н202 и низкими значениями рН, при которых снижается квантовый выход флуоресценции DCF. Характер распределения флуоресценции DCF в процессе освещения был одинаков в протопластах, выделенных из разных видов растений: арабидопсиса, гороха и кукурузы (рис. 3).

Во время наблюдения распределения флуоресценции DCF в освещаемом протопласте его флуоресценция всегда была видна в быстро движущихся с током цитоплазмы вытянутых органеллах размером около 1 мкм. То, что наблюдаемые органеллы являются митохондриями, было показано с использованием флуоресцентного красителя MitoTracker RED, который избирательно накапливается в матриксе митохондрий. К сожалению, этот краситель проявляет фотосенсибилизирующее действие и не может быть использован одновременно с регистрацией образования Н2Ог Рост флуоресценции DCF в митохондриях на свету можно объяснить функционированием цепи фотодыхания: метаболизм глицина в митохондриях сопряжен с генерацией НАДН со скоростью, превышающей таковую в цикле Кребса. Увеличение продукции Н202 в митохондриях, а также, возможно, и в перок-сисомах, происходящее вследствие изменения потока метаболитов в цепи фотодыхания, может нести информацию о состоянии метаболизма хлоропластов. При разрушении протопласта, которое иногда происходило в процессе наблюдения, мы наблюдали округление и вздутие митохондрий, сопровождающееся быстрым увеличением в них интенсивности флуорес-

Т 1

1 Рис. 4. Динамика роста флуо-

ресценции ИСБ в хлоропластах внутри протопласта в контроле (1) и в присутствии 12 мкМ ОСМи (2). Кривые представляют собой результат усреднения динамики флуоресценции ОСБ в 10 протопластах в контроле и 3 протопластах в случае добавки ОСМи.

4 ' 6 ' 8

Время (мин)

ценции DCF. Возможной причиной этого явления может быть нарушение переноса электронов и увеличение продукции Н202 в ЭТЦ митохондрий.

4. Кинетика флуоресценции PCF в хлоропластах при освещении

В большинстве протопластов флуоресценция DCF в хлоропластах, после небольшого лаг-периода, росла практически линейно (рис. 4). Примерно одинаковая кинетика процесса в первые минуты освещения наблюдалась в хлоропластах, находящихся внутри протопластов и в изолированных хлоропластах Низкая скорость роста флуоресценции в начале освещения, очевидно, связана с постепенным ростом концентрации Н202 в хлоропластах и увеличением скорости ее реакции с H,DCF. Скорость роста флуоресценции DCF в хлоропластах немного уменьшалась после 5-6 минут наблюдения, при этом скорость роста флуоресценции DCF в цитоплазме и митохондриях оставалась постоянной или увеличивалась. Мы не можем исключить утечку DCF из хлоропластов в цитоплазму и его выгорание под действием возбуждающего света, но, учитывая свойства DCF, а также данные контрольных экспериментов, мы считаем, что в течение 10 минут наблюдения эти процессы не играют существенной роли в выбранных условиях экспериментов. Снижение скорости роста флуоресценции DCF в хлоропластах через несколько минут освещения может поэтому отражать либо снижение скорости образования Н202 в хлоропластах в процессе адаптации к условиям освещения, либо возрастание ее утечки в цитоплазму.

5. Крахмальные зерна в хлоропластах

Часто можно было наблюдать зоны с интенсивной флуоресценцией DCF внутри хлоропластов (рис. 5а). Такие зоны не наблюдались в хлоропластах растений арабидопсиса, выдержанных 2 суток в темноте (рис. 56), а также в хлоропластах протопластов кукурузы. Это указывало на то, что

зоны с интенсивной флуоресценцией представляют собой крахмальные зерна внутри хлоропластов. Вероятно, крахмал адсорбирует молекулы DCF, что приводит к увеличению их локальной концентрации и более высоким абсолютным значениям флуоресценции DCF, чем в хлоропластах без крахмальных зерен. Этот факт следует учитывать при сравнении между собой протопластов, хлоропласта которых могут либо содержать крахмальные зерна, либо не иметь их.

6. Изменение соотношения флуоресценции PCF в цитоплазме и хлоропластах

Было обнаружено явление быстрого изменения характера распределения флуоресценции накопленного DCF при включении света после периода темноты. В первые моменты после периода темноты наблюдалась высокая интенсивность флуоресценции DCF в цитоплазме, которая по мере освещения уменьшалась при одновременном росте флуоресценции DCF внутри хлоропластов. Такой же эффект наблюдали при использовании близкого по свойствам к DCF флуоресцентного красителя FDA, флуоресценция которого не зависит от присутствия Н202. Таким образом, явление быстрого перераспределения флуоресценции DCF не связано с образованием АФК. Квантовый выход флуоресценции FDA зависит от рН среды: Величина рК моноанионной формы этого красителя близка к 5,0, а диани-онной - к 6,4, причем флуоресцируют именно эти формы (с более высоким квантовым выходом у дианионной формы), но не полностью протониро-ванная. Следовательно, заметное изменение уровня флуоресценции за счет изменения ее квантового выхода может происходить при понижении рН до величин ниже 7,7 (когда концентрация дианионной формы становится менее 95%). Величина рК DCF ниже, чем FDA, и его флуоресценция заметно зависит от рН при рН ниже 7,3.

а б

V

Рис. 6. Флуоресценция ОСБ через 10 минут освещения протопласта арабидоп-сиса без дополнительных добавок (а) и при добавке 1 мкМ нигерицина (б). Шкала 10 мкм.

с ©

0

Cl

О

g 30-

Рис. 7 Динамика роста флуоресценции ОСБ внутри хлоропла-стов (■, о) и в прилегающем к ним слое цитоплазмы (•, о) в присутствии 1 мкМ нигерицина (□, о), и в контроле (■, •). В каждом случае представлены средние значения наблюдения 6 протопластов.

0 2 4 6

8

10

Время (мин)

Добавка DCMU полностью предотвращала светоиндуцированное изменение соотношения флуоресценции FDA в хлоропластах и прилегающем к ним сдое цитоплазмы. Аналогичным образом действовал нигерицин, но не валиномицин. Таким образом, наблюдаемый эффект может быть связан с локальными изменениями рН в тонком слое цитоплазмы вокруг хлоропластов, зависящими от функционирования ФЭТЦ, и наблюдаемые изменения флуоресценции FDA и DCF вблизи хлоропластов могут быть объяснены снижением рН в этой зоне.

7. Выход НХХ из хлоропластов

При добавке 1 мкМ нигерицина общая скорость роста флуоресценции DCF в хлоропластах и цитоплазме была ниже, чем в контроле (рис. 6). Изменение характера распределения флуоресценции DCF при включении света не происходило. Скорость роста флуоресценции DCF в цитоплазме была выше, чем в хлоропластах, в течение всего времени наблюдения (рис. 7). В условиях, когда светоиндуцированные изменения рН не оказывают влияния на наблюдаемые значения флуоресценции DCF, это может достоверно указывать на выход молекул Н202 из хлоропластов. Учитывая величины рК молекулы DCF, более низкий уровень флуоресценции в хлоропластах в присутствии нигерицина трудно объяснить только влиянием рН на квантовый выход флуоресценции DCF. Возможно, что более низкий уровень флуоресценции DCF, как в хлоропластах, так и в цитоплазме, в присутствии нигерицина отражает более низкую скорость образования Н202 в хлоропластах в этих условиях.

Для того чтобы показать выход молекул Н202 из хлоропластов мы также использовали интактные изолированные хлоропласты шпината и флуоресцентный краситель AmplexRed. Этот краситель отличается от H2DCF-DA тем что не проникает через мембраны. В результате его реакции с Н202 образуется сильно флуоресцирующий продукт - резоруфин. Для протекания этой реакции снаружи хлоропластов необходима пероксидаза,

которую добавляли в среду. Степень интактности хлоропластов составляла более 95%. Интактные хлоропласта не пропускали внутрь себя Атр1ех11ес1 и резоруфин, и, таким образом, интактность можно было контролировать в процессе наблюдения: если наружная мембрана хлоропласта разрушалась в процессе наблюдения, это можно было видеть как быстрое появление флуоресценции резоруфина внутри хлоропласта. Под микроскопом в конфокальном режиме был зарегистрирован светоиндуцированный рост флуоресценции резоруфина в растворе, окружающем интактные хлоропласты, что свидетельствовало о выходе молекул Н202 из хлоропластов в среду. Скорость роста флуоресценции резоруфина снижалась до нуля при добавке ОСМи или каталазы и значительно увеличивалась при добавке метилвиологена.

8. Скорость фиксации СО, не влияет на накопление Н;Р2

При нарушении процесса фиксации С02 может происходить перевосстановление пула НАДФ, перевосстановление компонентов ФЭТЦ и увеличение скорости переноса электронов на кислород. Однако, добавка к протопластам 10-25 мМ глицеральдегида не вызывала увеличения скорости образования Н202 в хлоропластах. Добавка к протопластам 100 мкМ СОг (1,9 мМ КНСОэ) также не оказала влияния на скорость образования Н2Ог Вероятно, вне зависимости от состояния системы фиксации С02, за время наблюдения соотношение НАДФН/НАДФ* не увеличивается настолько, чтобы повлиять на перенос электронов в ФЭТЦ к кислороду и, таким образом, на процесс образования АФК в хлоропластах.

9. Влияние концентрации аскорбата на скорость накопления Н2Р2 в хлоропластах

Скорость роста флуоресценции ОСБ показывает результат взаимодействия процессов образования Н202 и ее утилизации антиоксидантными системами. В хлоропластах преобладающая роль в детоксикации Н202

140-

о

\Лс2-2

\rtc2-2

сиса ук2-2 (■), листьев арабидописа дикого типа (•), и мутанта ук2-2

Рис. 8. Динамика роста флуоресценции ОСБ в протопластах, выде-

ленных из листьев мутанта арабидоп-

в присутствии 10 мМ аскорбата (□).

2 3 4 5 Время (мин)

принадлежит аскорбат-пероксидазной системе, а концентрация аскорбата может достигать у некоторых видов растений 40 мМ и более. Основная доля аскорбата расположена в хлоропластах и препятствует накоплению Н202 в строме на свету, поскольку даже низкие концентрации Н202 (10 мкМ) инактивируют ферменты цикла Кальвина (Kaiser, 1976). Мутанты арабидоп-сиса с нарушенным биосинтезом аскорбата являются удобным объектом для изучения роли аскорбата в метаболизме АФК в клетках растений in vivo. Скорость роста флуоресценции DCF в протопластах, выделенных из листьев мутанта арабидопсиса vtc2-2, концентрация аскорбата в которых составляет до 10% от уровня аскорбата в растениях дикого типа (Conklin et al., 2000), оказалась значительно выше, чем в хлоропластах дикого типа (рис. 8). При добавке 10 мМ аскорбата к суспензии протопластов скорость роста флуоресценции DCF снижалась до уровня дикого типа (рис. 8). В протопластах мутанта vtc2-3, содержащего 30% аскорбата от уровня дикого типа, скорость роста флуоресценции DCF отличалась от дикого типа незначительно (не показано). Это позволяет заключить что аскорбат является основным регулятором уровня Н202 в растениях и находится в клетках в избытке.

10. Эффект остановки циклозиса

Важным признаком живых протопластов служит движение цитоплазмы, циклозис, который в наших условиях наблюдался как движение митохондрий. В некоторых протопластах во время наблюдения происходило округление митохондрий и остановка их движения, что совпадало по времени с резким увеличением скорости роста флуоресценции DCF

Рис. 9. Изменение кинетики роста флуоресценции ОСБ в хлоропластах (1) и прилегающем к ним слою цитоплазмы (2) после остановки движения цитоплазмы в процессе наблюдения (отмечено стрелкой).

в цитоплазме и митохондриях, а также снижением скорости роста флуоресценции в хлоропластах (рис. 9). Явление циклозиса подробно исследовано (обзор Nagai, 1993). Известно, что циклозис не происходит в темноте и активируется только на свету, при этом спектр действия повторяет спектр фотосинтетически активной радиации. Перемещение органелл происходит вдоль актиновых микрофиламентов с участием внутриклеточных миозинов и сопряжено с гидролизом АТФ. Остановка движения может происходить вследствие истощения пула АТФ в клетке. Также в литературе имеются свидетельства регуляции циклозиса путем изменения с участием АФК окислительно-восстановительного состояния актиновых микрофиламентов (Dalle-Donne et al., 2001).

Округление и вздутие митохондрий считается одним из ранних проявлений процесса апоптоза. С движением цитоплазмы связан также феномен возникновения около освещенного участка клетки харовой водоросли зон с высокой проводимостью плазмалеммы, причем только в участках, расположенных по направлению движения цитоплазмы, но не с противоположной стороны (Булычев, 2011). Механизмы обнаруженного феномена, а именно, процессы, приводящие к увеличению накопления Н2Ог в цитоплазме при остановке циклозиса, пока не выявлены. Тем не менее, данный результат показывает важную роль Н202, образующейся в клеточных органеллах', в системе внутриклеточной регуляции, в которой циклозис может играть интегрирующую роль.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Использование прижизненных флуоресцентных индикаторов АФК обещало большие возможности для наблюдения образования АФК in vivo. Эти красители в настоящее время широко используются для наблюдения процессов с участием АФК в клетках животных в процессах апоптоза, иммунных реакциях, однако применение этих индикаторов на растительных клетках встречает трудности. В первую очередь, клетки растений, в отличии от клеток животных, исходно содержат много флуоресцирующих веществ, и в первую очередь хлорофилл. Широкие спектры поглощения и флуоресценции хлорофилла накладывают ограничения на ассортимент применимых флуоресцентных красителей, либо же ограничивают возможности подобных исследований в растениях клетками и тканями, не содержащими хлорофилл. Именно поэтому большинство исследований проводятся на корнях растений и эпидермисе.

Используемый метод, хотя и не позволяет определить абсолютные значения концентрации или скорости образования Н202 в живых клетках, но дает возможность регистрировать кинетику процесса накопления и расходования этой АФК в разных компартментах клетки. Поскольку квантовый

выход флуоресценции ОСБ зависит от рН, в представленной работе предприняты попытки выделить явления, зависящие от образования Н202 на фоне светозависимого изменения рН в разных компартментах клетки при освещении.

Было обнаружено, что БСБ образующийся в хдоропластах преимущественно накапливается внутри крахмальных зерен. Поскольку свет, возбуждающий флуоресценцию ЮСБ, не экранируется в крахмальных зернах хлорофиллом, протопласты, содержащие крахмальные зерна, показывают более высокие значения скорости роста флуоресценции ОСЕ Эту особенность следует учитывать при проведении любых флуориметрических измерений на протопластах зеленых клеток растений.

В протопластах, выделенных из листьев мутантов арабидопсиса с пониженным уровнем аскорбата, были зарегистрированы более высокие скорости накопления Н202 в хдоропластах. Было обнаружено, что скорость роста флуоресценции ОСР, отражающая процесс накопления Н202, снижалась до уровня дикого типа при добавке аскорбата извне. Скорость роста флуоресценции БСР в клетках мутанта, содержащего 30% аскорбата от уровня дикого типа, не отличалась достоверно от скорости в клетках дикого типа.

Обнаружено, что под действием света скорость накопления Н202 увеличивается не только в хдоропластах, но и в митохондриях. Источником АФК в митохондриях может являться дыхательная электрон-транспортная цепь, которая активируется при повышении продукции НАДН в митохондриях при активации фотодыхания на свету.

Обнаружено явление увеличения скорости образования Н202 в цитоплазме, либо выхода ее из хлоропластов, совпадающее по времени с остановкой движения цитоплазмы.

С использованием двух флуоресцентных красителей, детекторов Н202 -Н^СБ-ОА и Атр1ехКес1 - был показан выход Н202 из хлоропластов при освещении.

ВЫВОДЫ

1. С помощью регистрации методом конфокальной микроскопии флуоресценции красителя ОСБ, образующегося в реакции, зависимой от Н202, выявлена динамика светоиндуцированного накопления Н202 в протопластах фотосинтезирующих клеток растений. Используемый метод позволил показать, что фотосинтетическая электрон-транспортная цепь хлоропластов является основным источником этой АФК в фотосинтезирующих клетках растений на свету.

2. Обнаружено явление светоиндуцированного перераспределения флуоресценции ОСБ, не связанное с продукцией и утилизацией Н202. Было найдено, что при освещении происходит быстрое изменение распределения

флуоресценции DCF и FDA между хлоропластами и прилегающем к ним слоем цитоплазмы. Показано, что это явление связано с индуцируемыми при функционировании фотосинтетической электрон-транспортной цепи изменениями pH в этом слое, влияющими на квантовый выход флуоресценции DCF и FDA.

3. Обнаружено, что скорость накопления Н202 в клетках листьев мутанта арабидопсиса с нарушенным биосинтезом аскорбата значительно превышает эту скорость в клетках дикого типа. Это свидетельствует о том, что аскорбат является основным регулятором уровня Н202 в хлоропластах in vivo.

4. Показано, что Н202 может выходить из интактных хлоропластов в среду и из хлоропластов, находящихся внутри протопласта, в цитоплазму.

5. Обнаружено, что одновременно с остановкой циклозиса увеличивается скорость накопления Н202 в цитоплазме вблизи хлоропластов.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в реферируемых журналах

1. Козулева М. А., Мубаракшина М. М., Найдов И. А., Иванов Б. Н. (2007) Участие ферредоксина в восстановлении кислорода в фотосинтетической электрон-транспортной цепи. Биофизика, 52 (4), 650-656.

2. Найдов И. А., Мудрик В. А., Иванов Б. Н. (2010) Динамика содержания пероксида водорода на свету в протопластах из листьев арабидопсиса и его мутанта с нарушенным биосинтезом аскорбата. Доклады академии наук, 432 (6), 834-837.

3. Mubarakshina М. М., Ivanov В. N., Naydov I. A., Hiller W., Badger М. R., Krieger-Liszkay А. (2010) Light-Induced Hydrogen Peroxide Dynamics in Protoplasts from Leaves of Both Wild-Type Arabidopsis and Its Mutant Deficient in Ascorbate Biosynthesis. Journal of Experimental Botany, 63 (13), 3577-3587.

4. Найдов И. А., Мубаракшина M. M., Иванов Б. Н. (2011) Кинетика образования и распределение Н202 в хлоропластах и протопластах фотосин-тезирующих клеток листьев высших растений при освещении. Биохимия, (принято к печати)

Тезисы на конференциях

5. Найдов И. А., Иванов Б. Н. Светоиндуцируемое образование активных форм кислорода в протопластах мезофильных клеток гороха и арабидопсиса. Тезисы докл. Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений; годичное собрание общества физиологов растений России (г. Екатеринбург, 6-10 октября 2008 г.) с. 291

6. Найдов И. А., Иванов Б. Н. Образование активных форм кислорода в клетках растений под действием света. Тезисы докл. Фотохимия хлоро-

филла в модельных и природных системах, (г. Пущино, 15-19 июня 2009 г.) с. 44

7. Найдов И. А., Иванов Б. Н. Изменение содержания активных форм кислорода в органеллах клеток листа при освещении. Материалы Всероссийской научной конференции "Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды" (г. Иркутск, 24-28 августа 2009 г.) с. 310

8. Найдов И. А., Иванов Б. Н. Недостаток аскорбата в мутантах араби-допсиса vtcZ-Z ускоряет накопление пероксида водорода в хлоропластах под действием света. Тезисы докл. Биология - наука 21-го века; 14-ая международная Пущинская школа-конференция молодых ученых (г. Пущино, 19-23 апреля 2010 г.) с. 342

9. В. N. Ivanov, S. A. Khorobrykh, М. A. Kozuleva, I. A. Naydov, М. М. Mubarakshina. The mechanisms of oxygen reduction in photosyn-thetic electron transport chain and hydrogen peroxide formation in chloro-plast thylakoid membrane. 10th International Conference on Reactive Oxyden and Nitrogen Species in Plants (Budapesht, Hungary, 5-8 July 2011) p. 103

Подписано в печать:

19.10.2011

Заказ Ха 6070 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Найдов, Илья Александрович

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

Цель и задачи работы

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Строение протопластов и клеток листа

1.2. Кислород и активные формы кислорода

1.3. Процессы образования активных форм кислорода в фотосинтетической электрон-транспортной цепи

1.4. Процессы утилизации активных форм кислорода. Антиоксидантные системы растительных клеток

1.5. Антиоксидантные системы тилакоидной мембраны

1.6. Образование активных форм кислорода в митохондриях

1.7. Защитная роль водно-водного цикла в хлоропластах

1.8. Сигнальная роль активных форм кислорода

1.9. Флуоресцентная и конфокальная микроскопия

1.10. Детекторы АФК

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Выделение протопластов

2.2. Выделение изолированных интактных хлоропластов шпината

2.3. Окрашивание протопластов H2DCF-DA

2.4. Окрашивание Hoechst332582.

2.5. Окрашивание MitoTracker RED

2.6. Окрашивание суспензии изолированных хлоропластов AmplexRed41 2.7 Оценка жизнеспособности протопластов с помощью метода

РАМ-флуориметрии

2.8. Конфокальная микроскопия

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Особенности наблюдения фотосинтезирующих объектов

3.2. Исследование объектов разной степени интактности

3.3. Флуоресценция DCF в протопластах в процессе освещения

3.4. Кинетика флуоресценции DCF в хлоропластах при освещении

3.5. Крахмальные зерна в хлоропластах

3.6. Изменение соотношения флуоресценции DCF в цитоплазме и хлоропластах

3.7. Выход Н202 из хлоропластов

3.8. Скорость фиксации С02 не влияет на накопление Н

3.9. Влияние концентрации аскорбата на скорость накопления Н в хлоропластах

3.10. Эффект остановки циклозиса

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование методом конфокальной микроскопии динамики светозависимой продукции H2O2 в протопластах фотосинтезирующих клеток высших растений"

В процессе метаболизма растений в кислородной атмосфере, неизбежно образуются активные формы кислорода (АФК). К таким формам кислорода относятся: синглетный кислород (Ю2), супероксидный анион-радикал (0~), гидроксильный радикал ('ОН), пероксид водорода (Н202). АФК образуются во всех компартментах клетки — в цитоплазме, хлоропластах, митохондриях, пероксисомах и на наружной стороне плазмалеммы (Foyer and Noctor, 2009). Предполагается, что основным источником АФК в растениях на свету является фотосинтетическая-электрон-транспортная цепь (ФЭТЦ) хл opon ластов. При взаимодействии триплетных молекул кислорода с молекулами- хлорофиллов в триплетном состоянии возникают молекулы синглетного кислорода. На свету в результате переноса электрона на кислород от компонентов ФЭТЦ (реакция; Мелера) происходит образование супероксидного анион-радикала (0~), который при последующем восстановлении или дисмутации превращается-в перекись водорода — Н202. АФК имеют высокую реакционную способность и могут повреждать многие внутриклеточные компоненты. В настоящее время АФК рассматривают не только как деструктивные молекулы, но и как важные сигнальные молекулы, играющие роль первичных и вторичных сигналов в системе клеточной регуляции.

Система регуляции с участием АФК контролируется процессами их образования и утилизации. Многие, если не все, внешние воздействия смещают баланс между двумя этими процессами, что сказывается как на стационарной концентрации разных видов АФК, так и на окислительно-восстановительном состоянии основных низкомолекулярных компонентов антиоксидантной системы - аскорбата и глутатиона (Mittler et al., 2004). К настоящему времени обнаружены протеинкиназы, факторы транскрипции и фосфатазы, активность которых напрямую регулируется АФК (Desikan, 2001).

Научная новизна работы

Разработаны методические приемы наблюдения в реальном времени светоиндуцированного образования Н202 внутри протопластов фотосинтезирующих клеток растений с помощью конфокальной микроскопии. Показана возможность применения прижизненного флуоресцентного красителя Н2БСР-ОА для сравнительных исследований динамики образования Н202 в протопластах и выявлены ограничения этого метода. Впервые показана динамика образования Н202 в компартментах живых растительных клеток и обнаружены свидетельства выхода образующейся на свету Н202 из хлоропластов. Подтверждена ведущая роль аскорбат-пероксидазной системы клетки в утилизации Н202, образующейся в хлоропластах при освещении.

Практическая значимость работы

Разработанные методические подходы, позволяющие, изучать* динамику накопления и распределения перекиси водорода, основной АФК фотосинтезирующих клеток листьев, в процессе освещения, могут быть использованы для оценки устойчивости растений разных видов и сортов, к неблагоприятным изменениям окружающей среды, воздействию патогенов, гербицидов, удобрений. Они могут применяться при разработке способов направленной регуляции фотосинтеза. Результаты работы могут быть также использованы в лекциях и практических занятиях по ботанике, биохимии и физиологии растений, экологии.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Найдов, Илья Александрович

выводы

1. С помощью регистрации методом конфокальной микроскопии флуоресценции красителя DCF, образующегося в реакции, зависимой от Н202, выявлена динамика светоиндуцированного накопления Н202 в протопластах фотосинтезирующих клеток растений. Используемый метод позволил показать, что фотосинтетическая электрон-транспортная цепь хлоропластов является основным источником этой АФК в фотосинтезирующих клетках растений на свету.

2. Обнаружено явление светоиндуцированного перераспределения флуоресценции DGF, не связанное с продукцией и утилизацией Н202. Было найдено, что при освещении происходит быстрое изменение распределения флуоресценции DCF и FDA между хлоропластами и прилегающем к ним слое цитоплазмы. Показано; что это явление связано с индуцируемыми при функционировании фотосинтетической электрон-транспортной цепи изменениями рН в этом слое, влияющими на квантовый выход флуоресценции DCF и FDA.

3. Обнаружено, что скорость накопления Н202 в клетках листьев мутанта арабидопсиса с нарушенным биосинтезом аскорбата значительно превышает эту скорость в клетках дикого типа. Это свидетельствует о том, что аскорбат является основным регулятором уровня Н202 в хлоропластах in vivo.

4. Показано, что Н202 может выходить из интактных хлоропластов в среду и из хлоропластов, находящихся внутри протопласта, в цитоплазму.

5. Обнаружено, что одновременно с остановкой циклозиса увеличивается скорость накопления Н202 в цитоплазме вблизи хлоропластов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Использование, прижизненных флуоресцентных индикаторов АФК обещало большие возможности для наблюдения образования АФК in vivo. Эти красители в настоящее время широко используются^для наблюдения процессов; с участием АФК в клетках животных в процессах апоптоза, иммунных реакциях, однако, применение этих индикаторов на растительных клетках встречает трудности. Вшервую очередь, клетки-растений, в отличии от клеток животных^ исходно содержат много флуоресцирующих веществ; и в первую1 очередь хлорофилл. Широкие спектры, поглощения; и флуоресценции хлорофилла, накладывают ограничения-: на ассортимент применимых флуоресцентных красителей, либо же ограничивают возможности подобных, исследований в растениях клетками,и.тканямй, не содержащими;хлорофилл.Именно поэтому большинство исследований проводятся на корнях растений и эпидермисе.

Разработанный метод, хотя и не позволяет определить абсолютные. значения£ концентрации или скорости образования Н202 в живых клетках, но дает возможность регистрировать кинетику процесса накопления иг расходования этой: АФК в. разных компартментах клетки. Поскольку квантовый выход флуоресценции DCF зависит от рН, в представленной работе предприняты- попытки; выделить явления, зависящие от образования Н202 на фоне светозависимого изменения рН в разных компартментах клетки при . освещении.

Было обнаружено, что DCF образующийся в хлоропластах преимущественно накапливается внутри крахмальных зерен. Поскольку свет, возбуждающий флуоресценцию DCF¿ не экранируется в крахмальных зернах: хлорофиллом, протопласты, содержащие крахмальные зерна показывают более высокие значения скорости роста флуоресценции DCF. Эту особенность следует учитывать при проведении любых флуориметрических измерений на протопластах зеленых клеток растений.

В протопластах, выделенных из листьев мутантов арабидопсиса с пониженным уровнем аскорбата были зарегистрированы более высокие скорости накопления Н202 в хлоропластах. Было обнаружено, что скорость роста флуоресценции DCF, отражающая процесс накопления Н202, снижалась до уровня дикого типа при добавке аскорбата извне. Скорость роста флуоресценции DCF в клетках мутанта, содержащего 30% аскорбата от уровня дикого типа не отличалась достоверно от скорости в клетках дикого типа. На основании этого мы предполагаем, что аскорбат в клетках дикого типа находится в избытке, чтобы компенсировать большие колебания в скорости образования АФК при быстрых изменениях интенсивности света.

Обнаружено, что под действием света скорость накопления Н202 увеличивается не только в хлоропластах, но и в митохондриях. Источником АФК в митохондриях может являться дыхательная электрон-транспортная цепь, которая активируется при активации-фотодыхания на свету. Посредством фотодыхания может осуществляться связь систем редокс-регуляции хлоропластов и митохондрий.

Обнаружено явление увеличения скорости образования Н202 в цитоплазме, либо выхода ее из хлоропластов, совпадающее по времени с остановкой движения цитоплазмы. Какие именно органеллы являются преимущественным источником Н202 в этих условиях пока не было выявлено. Одновременно с остановкой движения цитоплазмы происходило округление митохондрий и увеличение скорости роста флуоресценции DCF в них, что может говорить о разобщении дыхательной электрон-транспортной цепи и начале протекания процесса апоптоза. Однако, мы не можем быть уверены в том, что мембрана митохондрий в условиях апоптоза непроницаема для DCF, поскольку МРТ-пора (Membrane Permeability Transition) в мембране митохондрий, открывающаяся при инициации апоптоза, проницаема для крупных молекул, в том числе и для молекул флуоресцентных красителей.

С использованием двух флуоресцентных красителей, детекторов Н202 — Н2БСР-ОА и АтрЬхЯеё — был показан выход Н202 из хлоропластов при освещении. Когда растение не испытывает стресса и антиоксидантная система хлоропластов успевает перерабатывать образующиеся АФК, клетке не нужно активировать дополнительные защитные процессы в цитоплазме. В этих условиях лишь малая часть Н2©2, образующейся в хлоропластах, выходит из них в цитоплазму. Напротив, в условиях стресса, при повышении продукции АФК или нарушении работы антиоксидантной системы хлоропластов, сигнал, в виде молекул АФК, передается в цитоплазму, где может запускать защитные процессы не только на уровне хлоропластов, но й на уровне целой клетки.

Не обнаружено влияние глицеральдегида и содержания С02 в« среде на скорость образования Н202 при освещении. Образующийся на свету НАДФН используется растениями одновременно для фиксации С02, и для утилизации? АФК. Из литературных данных известно, что* многие ферменты цикла Кальвина инактивируются АФК путем окисления- аминокислотных остатков цистеина и образования' дисульфидных связей в-молекуле белка или между цистеином.в молекуле белка и глутатионом. Последующая.реактивация этих ферментов требует участия тиоредоксинов и глутаредоксинов, которые находятся в клетке в окисленном состоянии в условиях окислительного стресса и восстанавливаются ферредоксином при нормализации состояния клетки. Такой механизм может обеспечивать эффективную работу антиоксидантной системы клетки путем ингибирования процессов, конкурирующих с антиоксидантной системой, за НАДФН и восстановленный Фд. Отсутствие эффекта глицеральдегида и С02 может указывать на то, что в течение 10 минут наблюдения состояние системы фиксации С02 не оказывает влияния на скорость образования АФК в ФЭТЦ, и окислительно-восстановительное состояние пулов ферредоксина и НАДФ+/НАДФН не изменяется значительно в сторону восстановленного состояния, так как Фд и НАДФН в условиях повышенной продукции АФК активно используются для поддержания работы антиоксидантной системы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Найдов, Илья Александрович, Пущино

1. Abramoff MD, Magalhaes PJ, Ram SJ (2004) 1.age Processing with ImageJ. Biophotonics International, vol. 11, pp. 36-42

2. Adam W, Baader WJ, Cilento G (1986) Enols of aldehydes in the peroxidase/• , toxidase-promoted generation of excited triplet species. Biochimica etBiophysica Acta (BBA)-General Subjects, vol. 881, pp. 330-336

3. Allen JF, Hall DO (1973)" Superoxide reduction as a mechanism of ascorbate-stimulated oxygen-uptake by isolated chloroplasts. Biochem Biophys Res Commun, vol 52, pp 856—862

4. Allen JF (1975) Oxygen reduction and optimum production of ATP in photosynthesis. Nature, vol 256, pp 599—600

5. Allen JF, Bennett J, Steinback KE, Arntzen.CJ (1981),Ghloroplast protein-phosphorylation couples plastoquinone redox state to distribution of excitation energy between photosystems. Nature, vol 291, pp 25—29

6. Allen JF, Pfannschmidt T (2000) Balancing the two photosystems: photosynthetic electron transfer governs transcription of reaction centre genes in chloroplasts. Phil Trans R Soc Lond B, vol 355, pp 1351—1359

7. Anh DTV, Olthuis W, Bergveld P (2002),Electroactive gate materials for a hydrogen peroxide sensitive EMOSFET. IEEE Sensors J., vol. 2, pp. 26—33

8. Asada K (1996) Radical production and scavenging in the chloroplasts. In: Photosynthesis and the environment (ed: Baker NR), Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, pp 128-150

9. Asada K (1999) The water-water cycle in chloroplasts: Scavenging'of active oxygens and dissipation-of excess photons. Annu Rev Plant Physiol Plant,Mol Biol, vol 50, pp 601-639

10. Asada K (2000) The water—water cycle as alternative photon and electron sinks. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, vol 355, pp 1419-1431

11. Asada K, Kanematsu S (1976) Reactivity of thiols with superoxide radicals. Agricultural and Bio. Chem., vol. 40, pp. 1891-1892

12. Asada K, Kiso K, Yoshikawa K (1974) Univalent reduction of molecular oxygen by spinach chloroplasts on illumination. J Biol Chem, vol 249, pp 2175-2181

13. Asada K, Takahashi M (1987) Production and scavenging of active oxygen in photosynthesis. In: Photoinhibition (ed: Kyle DJ, Osmond CB, Arntzen CJ), Elsevier, Amsterdam, pp 227—287

14. Asada K, Yoshikawa K, Takahashi M, Maeda Y, Enmanji K (1975) Superoxide dismutase from a blue-green alga, Plectoneme boryanum. J Biol Chem, vol 250, pp 2801-2807

15. Aust SD, Morehouse LA, Thomas CE (1985) Role of metals in oxygen radical reactions. J. Free Rad. Bio. Med., vol. 1, pp. 3—25

16. Badger MR, von Caemmerer S, Ruuska S, Nakano H (2000)Electron flow to oxygen in-higher plants and algae: rates and control of direct photoreduction (Mehler reaction) and rubisco oxygenase. Philos Trans R Soc Lond Biol, vol 355, pp 1433-1446

17. Bast A (1986) Is formation of reactive oxygen by cytochrome P-450 perilous and predictable? Trends in Pharmacological Sciences, vol1. 7, pp. 266—270.

18. Beck CF (2005) Signaling pathways from the chloroplast to the nucleus. Planta, vol 222, pp 743-756

19. Belousov VV, Fradkov AF, Lukyanov KA, Staroverov DB, Shakhbazov KS, Terskikh AV, Lukyanov S (2006) Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nature Methods, vol. 3, pp. 281—286

20. Biteau B, Labarre J, Toledano MB (2003) ATP-dependent reduction of cysteine-sulphinic acid by S. cerevisiae sulphiredoxin. Nature, vol. 425, pp. 980-984

21. Bray RC, Cockle SA, Fielden EM, Roberts PB, Rotilio G, Calabrese L (1974) Reduction and inactivation of superoxide dismutase by hydrogen peroxide. Biochem J, vol 139, pp 43-48

22. Dietz K-J (2008) Redox signal integration: from stimulus to networks and genes. Physiologia Plantarum, vol. 133, pp. 459-468

23. Douce R. (1985) Mitochondria in higher plants: Structure, function, biogenesis. Academic press, New York.

24. Dron M, Clouse SD, Dixon RA, Lawton MA, Lamb CJ (1988) Glutathione and fungal elicitor regulation of a plant defense gene promoter in electroporated protoplasts. Proc Natl Acad Sei, vol 85, pp. 6738-6742

25. Fey V, Wagner R, Bräutigam K, Pfannschmidt T (2005) Photosynthetic redox control of nuclear gene expression. J. Exp. Bot., vol. 56, pp. 1491—1498

26. Filella I, Penuelas J, Llusiä J (2006) Dynamics of the enhanced emissions of monoterpenes and methyl salicylate, and decreased uptake of formaldehyde, by Quercus ilex leaves after application of jasmonic acid. New Phytologist, vol. 169, pp. 135-144

27. Foote CS (1976) Photosensitized oxidation and singlet oxygen: consequences in biological systems. Free Radicals in Biology, Acad. Press, New York,pp. 85-133

28. Foote CS (1979) Detection of singlet oxygen in complex systems: a critique. Biochemical and Clinical Aspects of Oxygen, Acad. Press, New York,pp. 603-626

29. Foyer CH, Rowell J, Walker D (1983) Measurement of the ascorbate content of spinach leaf protoplasts and chloroplasts during illumination. Planta, vol 157, pp 239-244

30. Foyer CH, Noctor G (2009) Redox regulation in photosynthetic organisms: signaling, acclimation, and practical implications. Antioxid Redox Signal, vol 11, pp 861-905

31. Fridovich I (1983) Superoxide Radical: An Endogenous Toxicant. Ann. Rev. of Pharmacology and Toxicology, vol. 23, pp. 239-257

32. Furbank RT, Badger MR, Osmond CB (1982) Photosynthetic oxygen exchange in isolated cells and chloroplasts of C3 plants. Plant Physiol, vol 70, pp 927—931

33. Furbank R, Badger M (1983) Oxygen exchange associated with electron transport and photophosphorilation in spinach thylakoids. Biochem Biophis Acta, vol 723, pp 400-409

34. Gadjev I, Vanderauwera S, Gechev TS, Laloi C, Minkov IN, Shulaev V, Apel K, Inze D, Mittler R, Van Breusegem F (2006) Transcriptomic footprints disclose specificity of reactive oxygen species signaling in Arabidopsis. Plant Physiol, vol 141, pp 436-445

35. Gadjev I, Stone JM, and Gechev TS (2008) Programmed Cell Death in Plants: New Insights into Redox Regulation and the Role of Hydrogen Peroxide. International Review of Cell and Molecular Biology, Vol. 270, pp. 87—144

36. Galvez-Valdivieso G, Mullineaux P (2010) The role of reactive oxygen species in signalling from chloroplasts to the nucleus. Physiol Plant, vol 138, pp 430-439

37. Geigenberger P, Kolbe A, Tiessen A (2005) Redox regulation of carbon storage and partitioning in response to light and sugars. J. Exp. Bot., vol. 56, pp. 1469-1479

38. Greenstock CL, Miller RW (1975) Oxidation of Tiron by superoxide anion: Kinetics of reaction in aqueous solution and in chloroplasts. Biochim Biophys Acta, vol 396, pp 11-16

39. Halliwell B, Gutteridge JMC (1984) Oxygen toxicity, oxygen radicals, transition metals and disease. Biochem J., vol. 219, pp. 1—14

40. Halliwell B, Gutteridge JMC (1985) Free radicals in biology and medicine. Claredon Press, Oxford, pp 1—259

41. Halliwell B, Gutteridge JMC (1986) Oxygen free radicals and iron in relation to biology and medicine: some problems and concepts. Arch Biochem Biophys, vol 246, pp 501-514

42. Harbour JR, Bolton JR (1975) Superoxide formation in spinach chloroplasts: Electron spin resonance detection by spin trapping. Biochem Biophys Res Commun, vol 64, pp 803-807

43. Hendrikse J, Olthuis W, Bergveld P (1998) Characterization of the EMOSFET, a novel one-electrode chemical transducer for redox measurements.

44. J. Electroanal. Chem., vol. 458, pp. 23-29

45. Horton P, Ruban AV, Walters RG (1996) Regulation of light harvesting in green plants. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, vol 47, pp 655-684

46. Hossain MA, Asada K (1984) Inactivation of Ascorbate Peroxidase in Spinach Chloroplasts on Dark Addition of Hydrogen Peroxide: Its Protection by Ascorbate. Plant Cell Physiol., vol. 25, pp. 1285-1295

47. Hundal T, Forsmark-Andree P, Ernster L, Andersson B (1995) Antioxidant activity of reduced plastoquinone in chloroplast thylakoid membranes. Arch Biochem Biophys, vol 324, pp 117—122

48. Inoue S, Ejima K, Iwai E, Hayashi H, Appel J, Tyystjarvi E, Murata N, Nishiyama Y (2011) Protection by a-tocopherol of the repair of photosystem II during photoinhibition in Synechocystis sp. PCC 6803. Biochim Biophys Acta, vol 1807, pp 236-241

49. Ivanov B, Edwards G (2000) Influence of ascorbate and the Mehler peroxidase reaction on non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence in maize mesophyll chloroplasts. Planta, vol. 210, pp. 765—774

50. Ivanov B, Khorobrykh S (2003) Participation of photosynthetic electron transport in production and'scavenging of reactive oxygen species. Antioxid Redox Signal, vol 5, pp 43—53

51. Johnson I, Spence MTZ (2010) Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 11th Edition. Life Technologies, 1076 p

52. Jones DP (1985) The Role of Oxygen Concentration in Oxidative Stress: Hypoxic and Hyperoxic Models. Oxidative Stress, Academic Press, London, pp. 151-195

53. Joo JH, Bae YS, and Lee JS (2001) Role of auxin-induced reactive oxygen species in root gravitropism. Plant Physiol, vol. 126, pp. 1055—1060

54. Kaiser W (1976) The effect of hydrogen peroxide on C02 fixation of isolated intact chloroplasts. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)—Bioenergetics, vol. 440, pp. 476-482'

55. Kaiser W (1979) Reversible inhibition of the Calvin cycle and activation of oxidative pentose phosphate cycle in isolated intact chloroplasts by hydrogen peroxide. Planta, vol 145, pp 377—382

56. Kangasjarvi S, Lepisto A, Hannikainen K, Piippo M, Luomala E-M, Aro E-M, Rintamaki E (2008) Diverse roles for chloroplast stromal and thylakoid-bound ascorbate peroxidases in plant stress responses. Biochem. J., vol. 412, pp. 275-285

57. Kanofsky JR (1983) Singlet oxygen production by lactoperoxidase, evidence from 1270 nm chemiluminescence. J. Biol. Chem., vol. 258, pp. 5991—5993

58. Kanofsky JR (1986) Singlet oxygen production in superoxide ion-halocarbon systems. J. Am. Chem. Soc., vol. 108, pp. 2977-2979

59. Khan AU, Gebauer P, Hager LP (1983) Chloroperoxidase generation of singlet A molecular oxygen observed directly by spectroscopy in the 1- to 1.6-(im region. Proc Natl Acad Sci, vol 80, pp. 5195-5197

60. Khorobrykh SA, Mubarakshina MM, Ivanov BN (2004) Photosystem I is not solely responsible for oxygen reduction in isolated thylakoids. Biochim Biophys Acta, vol 1657, pp 164-167

61. Kiddle G, Pastori GM, Bernard S, Pignocchi C, Antoniw J, Verrier PJ, Foyer CH (2003) Effects of leaf ascorbate on defense and photosynthesis gene expression in Arabidopsis thaliana. Antioxid Redox Signal, vol 5, pp 23—32

62. Kowaltowski AJ, Costa ADT, Vercesi AE. (1998) Activation of the potato plant uncoupling-mitochondrial protein inhibits reactive oxygen species generation by the respiratory chain. FEBS Letters, vol. 425, pp. 213—216

63. Krause GH (1994) The role of oxygen in photoinhibition of photosynthesis. In "Causes of photooxidative stress and amelioration of defense systems in plants". (Eds CF Foyer and PM'Mullineaux) pp. 43-76. (CRC Press: Boca Raton, FL)

64. Kruk J, Jemiola-Rzeminska M, Burda K, Schmid GH, Strzalka K (2003) Scavenging of superoxide generated in photosystemT' by plastoquinol and other prenyllipids in thylakoid membranes. Biochemistry, vol 42, pp 8501—8505

65. Lemaire SD, Michelet L, Zaffagnini M, Massot V, Issakidis-Bourguet E (2007) Thioredoxins in chloroplasts. Current Genetics, vol. 51 pp.- 343—365

66. Li S, Lauri A, Ziemann M, Busch A, Bhave M; Zachgoa S- (2009>Nuclear Activity of ROXY1, a Glutaredoxin Interacting with TGA Factors, Is Required for Petal Development in*Arabidopsis thaliana. The Plant Cell,.vol. 21,pp. 429-441

67. Lichtenthaler HK, Buschmann G, Knapp.M (2005) How to correctly determine the different chlorophyll fluorescence parameters and the chlorophyll fluorescence decrease ratio R™ of leaves with the PAM fluorometer.1. FD

68. Photosynthetica, vol. 43, pp. 379-393

69. Lindahl M, Kieselbach T (2009) Bisulphide proteomes and interactions with thioredoxin on the track towards understanding redox regulation in chloroplasts and cyanobacteria. Journal of Proteomics, vol. 72, pp. 416—438

70. Lindahl M, Yang D-H, Andersson B (1995) Regulatory proteolysis of the major light-harvesting chlorophyll a/b protein of photosystem II by a light-induced membrane-associated enzymic system. Eur J Biochem, vol 231, pp 503-509

71. Link G, Tiller K, Baginski S (1997) Glutathione, a regulator of chloroplast transcription // Regulation of enzymatic systems detoxifying xenobiotics in plants.Ed. Hatzios KK, Springer, pp. 125—137

72. Maeda H, DellaPenna D (2007) Tocopherol functions in photosynthetic organisms. Current Opinion in Plant Biology, vol. 10, pp. 260-265

73. Mahalingam R, Fedoroff N (2003) Stress response, cell death and signaling: the many faces of reactive oxygen species. Physiol Plantarum, vol 119, pp 56—68

74. Mano J, Takahashi M, Asada K (1987) Oxygen evolution from hydrogen peroxide in photosystem II: flash-induced catalytic activity of water-oxidizing photosystem II membranes. Biochemistry, vol 26, pp 2495-2501

75. Mateo A, Funck D, Miihlenbock P, Kular B, Mullineaux PM, Karpinski S (2006) Controlled levels of salicylic acid are required for optimal photosynthesis and redox homeostasis. J. Exp. Bot., vol.- 57, pp. 1795—1807

76. Mehler AC (1951) Studies on reactions of illuminated chloroplasts. I. Mechanism of the reduction of oxygen and other Hill reagents. Arch Biochem Biophys, vol 33, pp 65-77

77. Mittler R, Vanderauwera S, Gollery M, van Breusegem F (2004) Reactive oxygen network of plants. Trends Plant Sci, vol 9, pp 490-498

78. Mittler R, Vanderauwera S, Suzuki N, Miller G, Tognetti VB, Vandepoele K, Gollery M, Shulaev V, Van Breusegem F (2011) ROS signaling: the new wave? Trends in Plant Science, vol. 16, pp. 300-309

79. Miyake C, Cao WH, Asada K (1993) Purification and molecular properties of the thylakoid-bound ascorbate peroxidase in spinach chloroplasts. Plant Cell Physiol, vol 34, pp 881-889

80. Moore AL, Siedow JN (1991) The regulation and nature of the cyanide-resistant alternative oxidase of plant mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) -Bioenergetics, vol. 1059, pp.* 121-140

81. Mubarakshina MM, Ivanov BN, Naydov IA, Hillier W, Badger.MR, Krieger-Lizkay A (2010)^^Productionsandldiffusion of chloroplastic H^O^ and its implication to signaling. J. Exp. Bot, vol 61, pp 3577—3587

82. Mullineaux PM, Karpinski S, Baker NR (2006) Spatial'dependence for hydrogen-peroxide-directed signaling in light-stressed plants. Plant Physiol., vol 141, pp 346-350

83. Mullineaux PM (2009) ROS in Retrograde Signalling from the Chloroplast to the Nucleus. Reactive:Oxygen;Species in Plant Signaling; Signaling and Communication in Plants, Springer Berlin Heidelberg, pp. 221—240

84. Mullineaux P, Karpinski S (2002) Signal transductionin response to excess light: getting out of the chloroplast. Current Opinion in Plant Biology, vol 5, pp 43-48

85. Munne-Bosch S, Alegre L (2002) The function of tocopherols and tocotrienols in plants: Crit Rev Plant Sci, vol 21, pp 31-57

86. Munne-Bosch S, Alegre L (2002) Interplay between ascorbic acid and lipophilic antioxidant defences in chloroplasts of water-stressed'Arabidopsis plants. FEBS Lett, vol 524, pp 145-148

87. Munne-Bosch S, Penueläs J (2003) Photo- and antioxidative protection, and a role for salicylic acid during drought and recovery in field-grown Phil lyrea angustifolia plants. Planta, vol 217, pp 758—766

88. Munne-Bosch S, Falk J (2004)-New insights into the function of tocopherols in plants. Planta, vol 218, pp 323-326

89. Environmental Stimuli. International Review of Cytology, vol. 145 pp. 251—310

90. Nagano T, Fridovich I (1985) Superoxide radical from xanthine oxidase acting upon lumazine. J: Free Rad. Bio. Med; vol. 1, pp 39—42

91. Naqui A, Chance B, Cadenas E (1986) Reactive Oxygen Intermediates in Biochemistry. Anni Rev. Biochem:, vol. 55, pp 137—166;

92. Neubauer C, Yamamoto HY (1994) Membrane barriers and Mehler-peroxidase reaction limit the. ascorbate availäbleifor violäxanthinide-epoxidase activity in intact chloroplasts. Photosynth Res, vol. 39, pp. 137—147 .

93. NoctorG, Veljovic-Jovanovic S, Foyer CH (2000) Peroxide processing . in photosynthesis: antioxidant coupling and; redox signalling:

94. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B; vol: 355, pp: 1465-1475

95. Nott A, Jung H-S, Koussevitzky S, Chory J (2006) Plastid-to-Nucleus: Retrograde Signaling. Ann. Rev. of Plant'Biology, vol. 57, pp. 739—759

96. Park Y-i; Chow WS, Osmond CB, Anderson JM (1996) Electron transport to oxygen mitigates against the photoinactivation of Photosystem II in vivo. Photosynth Res, vol 50, pp 23—32

97. Pastore D, Fratianni A, Di Pede S, Passarella S (2000) Effects, of fatty acids, nucleotides and reactive oxygen species on durum wheat mitochondria. FEBS Letters, vol 470, pp 88-92

98. Patterson CO, Meyers J (1973) Photosynthetic production of hydrogen peroxide by Anacystis nidulans. Plant Physiol, vol 51, pp 104—109

99. Perez-Torres E, Bravo LA, Corcuera LJ, Johnson JN (2007) Is electron transport to oxygen an important mechanism in photoprotection? Contrasting responses from Antarctic vascular plants. Physiol Plant, vol 130, pp 185—194

100. Percival MP, Dodge AD (1983) Photodynamic damage to chloroplast membranes, photosensitized oxidation of chloroplast acyl lipid. Plant Science Letters, vol. 29, pp. 255-264

101. Pfannschmidt T, Nilsson A, Allen JF (1999) Photosynthetic control of chloroplast gene expression. Nature, vol 397, pp 625—628

102. Quesada AR, Byrnes RW, Krezoski SO, Petering DH (1996) Direct Reaction of H202 with Sulfhydryl Groups in HL-60 Cells: Zinc-Metallothionein and Other Sites. Arch. Biochem. Biophys., vol. 334, pp. 241-250

103. Queval G, Hager J, Gakiere B, and Noctor G (2008) Why are literature data for H202 contents so variable? A discussion of potential difficulties in quantitative assays of leaf extracts. J. Exp. Bot., vol 59, pp. 135—146

104. Rabinowitch HD, Fridovich I (1983) Superoxide Radicals, Superoxide Dismutases And Oxygen Toxicity In Plants. Photochemistry and Photobiology, vol. 37, pp. 679-690

105. Remis D, Paulech C (1988) Photoinduced pH changes measured by antimony microelectrode in suspensions of chloroplasts isolated from healthy and powdery mildew-infected barley. Biologia (Czechoslovakia), vol. 43, pp. 219—224

106. Robinson J (1988) Does 02 photoreduction occur within chloroplasts in vivo? Physiol Plant, vol 72, pp 666-680

107. Robinson J, Gibbs M (1982) Hydrogen Peroxide synthesis in isolated spinach chloroplast lamellae. Plant Physiol, vol 70, pp 1249-1254

108. Rodermel S (2001) Pathways of plastid-to-nucleus signaling. Trends in Plant Science, vol; 6, pp. 471-478

109. Satoh K, MurataN (1998) Stress responses of photosynthetic organisms: Molecular mechanisms and:molecular regulations. Elsevier, New York, 260 p.

110. Scheibe R, Backhausen JE,.Vera Emmerlich V, Holtgrefe S (2005) Strategies to maintain redox homeostasis during photosynthesis under changing conditions. J. Exp. Bot., vol. 56, pp. 1481-1489

111. Scheibe R, Dietz K-J (2011) Reduction-oxidation network for flexible adjustment of cellular metabolism in photoautotrophic cells. Plant, .Cell and Environment^ doi: lO.llll/j.1365-3040 2011.02319.x

112. Seemann JR, Sharkey TD.(1987) The Effect of Abscisic Acid and Other Inhibitors on Photosynthetic Capacity and the Biochemistry of C02 Assimilation, Plant Physiol., vol: 84, pp. 696-700

113. Skulachev VP.(1997) Membrane-Linked Systems Preventing Superoxide Formation: Bioscience Reports, vol 17, pp. 347-366

114. SooleKL, Menz IR (1995) Functional molecular aspects of the NADH dehydrogenases of plant mitochondria. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. vol: 27, pp. 397-406

115. Stadtman ER (1986) Oxidation of proteins by mixed-function oxidation systems: implication in protein-turnover, ageing and neutrophil function. Trends in Biochemical Sciences; vol. 11, pp. 11—12

116. Streb P, Feierabend J, Bligny R (1997) Resistance to photoinhibition of photosystem II and catalase and antioxidative protection in high mountain plants. Plant Cell Environ, vol 20, pp 1030-1040

117. Steiger HM, Beck E (1981) Formation of hydrogen peroxide and oxygen dependence of photosynthetic C02 assimilation by intact chloroplasts. Plant Cell-Physiol, vol 22, pp 561-576

118. Suzuki N, Miller G, Morales J, Shulaev V, Torres MA, Mittler R (2011) Respiratory burst oxidases: the engines of ROS signaling. Current Opinion in Plant Biology, doi:10.1016/j.pbi.2011.07.014

119. Swanson S, Choi W.-G, Chanoca A, and Gilroy S (2011) In Vivo Imaging of Ca2+, pHj and Reactive Oxygen Species Using Fluorescent Probes in Plants. Ann. Rev. Plant Biol., vol. 62, pp. 273-297

120. Takahama U (1979) Stimulation of lipid peroxidation and carotenoid bleaching by deuterium oxide in illuminated chloroplast fragments: Participation of singlet molecular oxygen in the reactions. Plant Cell Physiol, vol. 20, pp. 213-218

121. Takahama U, Nishimura M (1975) Formation of singlet molecular oxygen in illuminated chloroplasts. Effects on photoinactivation and lipid peroxidation. Plant Cell Physiol., vol. 16, pp. 737-748

122. Tanaka K, Otsubo T, Kondo N (1982) Participation of hydrogen peroxide in the inactivation of Calvin cycle SH-enzymes in S02-fumigated spinach leaves. Plant Cell Physiol, vol 23, pp 1009-1018

123. Taylor WC (1989) Regulatory Interactions between Nuclear and Plastid Genomes. Ann. Rev. of Plant Phys. and Plant Mol. Biol., vol. 40, pp. 211-233

124. Thordal-Christensen H, Zhang Z, Wei Y, Collinge DB (1997) Subcellular localization of H202 in plants. H202 accumulation in papillae and hypersensitive response during the barley-powdery mildew interaction. Plant J vol. 11,pp. 1187-1194

125. Trebst A, Depka B, Holländer-Czytko H (2002) A specific role for tocopherol and of chemical singlet oxygen quenchers in the maintenance of photosystem II structure and function in Chlamydomonas reinhardtii. FEBS Lett, vol 516, pp 156-160

126. Uno Y, Milla MAR, Mäher E, Cushman JC (2009) Identification of proteins that interact with catalytically active calcium-dependent protein kinases from Arabidopsis. Mol Genet Genomics, vol. 281, pp. 375—390

127. Vernooij B, Uknes S, Ward E, Ryals J (1994) Salicylic acid as a signal molecule in plant-pathogen interactions. Current Opinion in CellBiology, vol. 6,pp. 275-279

128. Vladimirov YA (1986) Free radical lipid peroxidation in biomembrane: mechanism, regulation and biological consequences. Free Radicals, Aging and Degenerative Diseases, Liss, New York, pp. 14—195

129. Wasilewska A, Vlad F, Sirichandra C, Redko Y, Jammes F, Valon C, dit Frey NF, Leung J'(2008) An Update on Abscisic Acid Signaling in Plants and More. . Mol. Plant, vol. 1, pp. 198-217

130. Wasternack C (2007) Jasmonates: An Update on Biosynthesis, Signal Transduction and Action in Plant Stress Response, Growth and'Development. Ann. Bot., vol. 100, pp: 681-697

131. Wefers H (1987) Singlet oxygen in biological systems. Bioelectrochemistry and Bioenergetics. vol. 18, pp. 91-104

132. Went FW, Thimann KV (1937) Phytohormones. Macmillan, New York. 294 p.

133. Wingate VPM, Lawton MA, Lamb CJ (1988) Glutathione Causes a Massive and Selective Induction of Plant Defense Genes. Plant Physiol., vol. 87, pp. 206—210

134. Wojtaszek P (1997) Oxidative burst: An early plant response to pathogen infection. Biochem J, vol. 322, pp 681 -692

135. Zhang X, Zhang L, Dong F, Gao J, Galbraith DW, and Song C-P (2001) Hydrogen Peroxide Is Involved in Abscisic Acid-Induced Stomatal Closure in Vicia faba. Plant Physiology, vol. 126, pp. 1438-1448

136. Булычев A.A., Додонова C.O. (2011) Роль циклозиса в асимметричном формировании щелочных зон на границах освещаемого участка клеток Chara. Физиология растений, т. 58, с. 202—207

137. Владимиров Ю.А., Азизова O.A., Деев А.И. (1992) Свободные радикалы в живых системах. Итоги Науки и Техн., ВИНИТИ, сер. Биофизика, т. 29, с. 1-250

138. Денисов Е.Т. (1971) Окислительно-восстановительные реакции атомов и радикалов с ионами в растворе. Успехи химии, т. 40, с. 43-63

139. Кувыкин И.В., Вершубский A.B., Птушенко В.В., Тихонов А.Н. (2008) Кислород как альтернативный акцептор в фотосинтетической цепи электронного транспорта СЗ-растений. Биохимия, т. 73, с. 1329—1344

140. Ленинджер А. (1985) Основы биохимии в Зх томах, т. 2, пер. с англ., Москва: "Мир", 368 с.

141. Мерзляк М.Н. (1989) Активированный кислород и окислительные процессы в мембранах растительной клетки. Итоги Науки и Техн., ВИНИТИ, сер. Физиология Растений, т. 6, с. 1—168

142. Мерзляк М.Н., Соболев A.C. (1975) Роль супероксидных анион-радикалов и синглетного кислорода в патологии мембран. В кн.: Молекулярная патология мембранных структур //Итоги науки и техники. Биофизика.— т. 5. ВИНИТИ, с. 118

143. Николе Д. (1985) Биоэнергетика. Введение в хемиосмотическую теорию: Пер. с англ. Москва: "Мир", 190 с.

144. Скулачев В.П. (1989) Энергетика биологических мембран. Москва: "Наука", 564 с.

145. Шмелева B.JL, Иванов Б.Н., Битюкова JI.B. (1979) Светозависимое поглощение кислорода изолированными хлоропластами гороха при фотовосстановлении НАДФ+. Биохимия, т. 44, с. 911—916

146. Шугаев А.Г. (1991) Некоторые особенности структурной организациии окислительной активности дыхательной цепи митохондрий растений. Успехи соврем, биологии, т. 52. с. 178—191