Исследование механизмов проникновения вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей в клетку в реальном времени

Колокольцов, Андрей Алексеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование механизмов проникновения вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей в клетку в реальном времени
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование механизмов проникновения вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей в клетку в реальном времени"

□0305737Э

и - На правах рукописи

Колокольцов Андрей Алексеевич

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ ПРОНИКНОВЕНИЯ ВИРУСА ВЕНЕСУЭЛЬСКОГО ЭНЦЕФАЛОМИЕЛИТА ЛОШАДЕЙ В КЛЕТКУ В

РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ

03.00.04 - биохимия 03.00.06 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 2007

003057379

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте молекулярной биологии и биофизики СО РАМН (Новосибирск, Россия) и Университете Техаса, Медицинское Отделение (Галвестон, США)

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор

кандидат биологических наук

Гуляева Л.Ф Давэй P.A.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Усынин И.Ф.

кандидат биологических наук Плясунова O.A.

Ведущая организация:

ГУ НИИ Вирусологии имени Д.И. Ивановского РАМН (Москва).

Защита диссертации состоится «_»_2007 г. в _ часов на

заседании диссертационного совета Д.001.034.01 в ГУ Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН (630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2; тел. 8 (383) 333-54-81).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научно-исследовательского института биохимии СО РАМН.

Автореферат диссертации разослан « 16 » апреля 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Русских Г.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Вирус венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВВЭЛ) входит в состав семейства Тогавирусов, рода альфавирусов. Наши знания об альфавирусах получены в основном при исследованиях вирусов леса Семлики (SFV) и Синдбис (SINV), в то время как мало известно о высоко вирулентном ВВЭЛ, особенно о его вхождении. Так как существует много примеров, когда родственные вирусы используют разные пути проникновения, (так, пикорновирусы используют как клатрин-зависимый эндоцитоз, так и кавеола), то необходимо определить, какой из этих механизмов работает у альфавирусов. К тому же было предположено, что аминокислотные различия в оболочечных белках ВВЭЛ и SFV определяют зависимость слияния от содержания холестерина в мембране, но это никогда не было проверено на клетках млекопитающих.

Целью настоящей работы было изучение механизмов проникновения вируса ВЭЛ в клетки 293 НЕК человека.

Для достижения цели решались следующие задачи:

1. Подобрать способ включения в вирусную частицу люциферазы, как наиболее подходящего фермента для определения слияния вируса.

2. Проверить разработанный метод на псевдотипах VSV и MLV.

3. Получить псевдотип ВВЭЛ и проверить его функциональность.

4. Адаптировать разработанный метод к ВВЭЛ псевдотипу.

5. На основании анализа люциферазной активности выяснить роль мембранного холестерина и ранних и поздних эндосом при вхождении ВВЭЛ в клетки.

Научная новизна работы

В работе впервые разработан метод специфичного включения фермента люциферазы в вирусную частицу. Было показано, что модифицированный вирус функционален, а люцифераза находится внутри вируса и защищена от контакта с субстратом вирусной мембраной, поэтому фермент может получить доступ к субстрату только после слияния вируса с клеткой.

Впервые разработан метод наблюдения проникновения вируса в клетку в реальном времени. Показано, что связывание вируса является рецептор-специфичным, так как сигнал был получен только на клетках,

экспрессирующих рецептор. Использование ингибиторов эндосомального закисления доказало пригодность разработанного метода для изучения эффекта ингибиторов на проникновение вирусов, причем эффект специфичен для каждого псевдотипа тестируемого вируса и зависит от используемого оболочечного белка.

Впервые получен ВВЭЛ псевдотип, обладающий высоким титром и несущий на своей поверхности нативные оболочечные белки ВВЭЛ. Таким образом, псевдотип повторяет путь проникновения вируса дикого типа, что позволяет использовать его для определения факторов, необходимых для проникновения в клетки ВВЭЛ дикого типа. В результате данного исследования была показана необходимость наличия функциональных поздних эндосом для эффективного проникновения ВВЭЛ в клетки, а также независимость проникновения ВВЭЛ от мембранного холестерина.

Научно-практическая значимость

Результаты, полученные при изучении способов проникновения вируса ВЭЛ в клетку хозяина, имеют существенное значение для фундаментальной науки. Исследование механизмов транспорта вирусных частиц через клеточную мембрану важно для современной биохимии, изучающей мембранный транспорт. Эта проблема позволяет также подойти к пониманию механизмов инфицирования, что важно для изучения природы самого вируса и вирусного патогенеза. Так, необходимость в функциональных поздних эндосомах говорит о том, что для слияния вирусу нужен более низкий рН, либо ему необходимы дополнительные, неизвестные факторы, которые присутствуют в поздних эндосомах, такие, как протеазы, корецепторы, или изменение плотности рецептора. Показана независимость проникновения вируса ВЭЛ в клетки от мембраного холестерина, что говорит о наличии принципиальной разницы между такими близкородствеными вирусами, как ВВЭЛ и ЗБУ.

Работа имеет также практическое значение, так как разработанный метод определения проникновения вируса в клетки в реальном времени позволяет определить точную кинетику этого процесса и ее изменение под действием различных факторов. Проведение измерений в реальном времени дает возможность исполнения эксперимента в присутствии токсичных ингибиторов на протяжении всего эксперимента. Разработанный метод позволяет также однозначно ответить на вопрос об эффекте ингибиторов на проникновение вируса в клетку. Это его выгодно отличает от классических экспериментов с инфицированием, где ингибитор добавляется в течение определенного времени, после чего удаляется, и вирус может проникать в клетку с задержкой, которой не будет видно на фоне продолжительной инфекции, что может быть причиной ложно негативного результата. Данный метод отражает специфические условия проникновения псевдотипированного вируса в зависимости от используемого оболочечного белка, что позволяет определять ключевые клеточные факторы, необходимые вирусу для инфицирования. Это дает возможность определять мишени для рационально разрабатываемых

препаратов, что позволит в будущем создавать эффективные, высоко специфичные противовирусные препараты.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Слияние люциферазы светлячка с оболочечным белком вируса обеспечивает специфичное включение фермента в вирусную частицу.

2. Включение люциферазы приводит к получению вируса с интактной мембраной, выполняющей функцию барьера, предохраняющего фермент от субстрата до момента слияния вируса с клеткой.

3. Разработанный метод отражает специфичное проникновение вируса в клетки, зависимое от оболочечного белка псевдотипа.

4. Полученный псевдотип ВВЭЛ содержит оболочечные белки вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей в нативной конформации и проникает в клетки по механизму, специфичному для ВВЭЛ.

5. Для проникновения вируса ВЭЛ в клетки требуется наличие функциональных поздних эндосом.

6. Для слияния с клеткой ВВЭЛ не нуждается в мембранном холестерине.

Апробация работы:

Результаты работы были представленны и обсуждены на XXIII конференции Американского общества вирусологии (ASV), Montreal, Canada, 2004; на конференции регионального центра превосходства (RCE) в биозащите и возникающих инфекционных заболеваниях, Galveston, USA, 2004; на XXV конференции Американского общества вирусологии (ASV), Madison, Wisconsin, USA, 2006; на ежегодном коллоквиуме товарищества McLaughlin, Galveston, USA, 2007.

Публикации. По материалам диссертации имеется б печатных работ.

Структура работы. Диссертационная работа изложена на 110 страницах машинописного текста с полуторным интервалом, содержит 6 таблиц и 16 рисунков и состоит из 5 разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения результатов, выводов, а также списка цитируемой литературы, содержащего 273 источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для оценки зависимости вирусов от рН использовались ингибиторы эндосомального закисления. Хлорохин (100 мкМ), бафиломицин А1 (50нМ), моненсин (1 мкМ) и хлорид аммония (20 мМ) были использованы в качестве ингибиторов в указанных концентрациях, если были использованы другие концентрации, то они указаны в тексте. Хлорохин, моненсин и хлорид аммония были растворены в DMEM и добавлены за час до инкубации с вирусом. Бафиломицин А1 сначала растворяли в DMSO для получения стокового раствора 50 мкМ, а затем растворяли в DMEM перед использованием. Для определения эффекта ингибиторов эндосомального закисления на инфекцию после 1 часа преинкубации с препаратом в клетки добавляли вирус и инкубировали в течение 3 часов, при температуре 37° С,

после чего культуральную среду удаляли и заменяли на новую, не содержащую ингибиторов. После этого клетки инкубировали еще в течение 2-х дней и подсчитывали вирусный титр. При определении эффекта ингибиторов эндосомального закисления на сливание вирусов с клеткой, ингибитор присутствовал на протяжении всего эксперимента.

Проникновение вирусов определялось на 293 клетках для всех вирусов, кроме MLV, для которого проникновение измерялось на 293-САТ клетках, экспрессирующих его рецептор. Обычно для каждого образца использовали 105 клеток, которые инкубировали с вирусом, содержащим люциферазу, в течение 1 часа (за исключением случаев, когда указано обратное) при множественности заражения (MOI) от 0,1 до 0,5. После этого клетки отмывали от излишнего вируса путем осаждения центрифугированием при 200 g в течение 5 минут, осадки клеток ресуспендировали в DMEM. Затем клетки осаждали снова и ресуспендировали в 100 мкл люциферазного буфера. Люциферазную активность измеряли в Turner Designs TD 20/20 люминометре в единицах света в секунду.

Для изучения кинетики проникновения вирусов в клетки указанный выше метод был модифицирован следующим образом: вирус добавляли к клеткам на короткое время, отмывали избыток вируса и затем наблюдали за проникновением связанного вируса. Это было достигнуто инкубированием клеток с вирусом в течение 1 минуты при М01=Ю инфекционных частиц на клетку. В течение этого времени <5% вируса успевало связаться с клеткой, а не связавшийся вирус был отмыт коротким двукратным центрифугированием и ресуспендированием в DMEM. Клетки и оставшийся связанный вирус инкубировали в течение указанного времени, отбирали образцы и измеряли люциферазную активность, как описано выше.

Для демонстрации активности экспресированных мутантных генов (Rab и Epsl5) и измерения клатрин-зависимого эндоцитоза был использован захват трансферрина. Для измерения захвата трансферрина клетки сначала инкубировали в DMEM с 1 % БСА и без сыворотки в течение часа, а потом к ним на 5 минут добавляли трансферрин в концентрации 50 мкг/мл, меченный Alexafluor594, после чего излишки трансферрина дважды отмывали в DMEM, и клетки зафиксировали параформальдегидом.

Для удаления холестерина клетки инкубировали в DMEM без сыворотки в течение часа, затем к ним добавляли нистатин до конечной концентрации 60 мкг/мл. Эта концентрация являлась минимальной, при которой нарушается поглощение токсина холеры, указывающее на то, что холестерин эффективно удален. Это было определено с помощью добавления к клеткам токсина холеры, меченного Alexaflour568 (Molecular Probes, США). Окрашенные клетки визуализовались при помощи инвертированного микроскопа Leica DM IRB и Optronics Magnafire camera. Проникновение вируса определяли с помощью измерения люциферазной активности, как было описано выше.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Excel 2003. Результаты представлены в виде М ± т, где М - среднее, т -стандартное отклонение. Для оценки достоверности различий между выборками использовали t -критерий Стъюдеита.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Специфическое включение люциферазы и вироплазму с помощью слияния с оболочечным белком

Для направленной доставки люциферазы в вирус был использован обол очечный белок. Оболочечный белок MLV синтезируется как полипептид, который быстро расщепляется в эндоплазматическом ретикулуме на две субъединицы SU (70 кДа) и ТМ (15 кДа), которая заякорнвает комплекс в клеточной и затем в вирусной мембране. Непосредственно до или сразу после отночковывания от клеточной поверхности ТМ далее расщепляется вирусной протеазой, высвобождая С-концезой лептвд р2е. Тогда присоединение белка к С-концу ТМ обеспечило бы новый метод доставки ре комби на нтн ого белка в вирус между мембраной и матриксом. Расщепление белка вирусной протеазой после отночковывания освободило бы люциферазу, позволив ей диффундировать в клеточную цитоплазму после слияния. Чтобы проверить это предположение, мы сделали две конструкции env-Iucl и env-luc2, которые присоединяют Friend 57 MLV оболочечный белок к N-концу люцифер аз наго гена (рис. 1 А).

MLV оболиечяия белок Тр у Люцифер»!

I- su TWi I

Рисунок 1. Схематическое изображение конструкции оболочечный бела гелю цифе раза (env-luc) MLV. Открытой стрелкой отмечено место расщепления фурином (SU-TM соединение), а закрытой стрелкой — место расщепления вирусной протеазой (ТМ-р2е соединение).

Созданные конструкции различались по длине линкерного пептида между С-концом оболочечного белка и N-концом люциферазы, так env-luc 1 линкерная последовательность состояла из Gki-Phe, a env-luc2 - из Glu-Phe-Gly-Ser, Следующим этапом была сборка MLV с добавлением плазмиды, кодирующей env-lucl и env-liic2. В этом случае плазмида pFB-luc была заменена на рц/EGFP, что позволило определять вирусный тигр с помощью инфицирования клеток и количественно учитывать колонии, экспрессирующие белок EGFP. Мы обнаружили, что в случае использования обеих конструкций люцифераза присутствовала в супернатанте, но большая часть ее активности регистрировалась в осадке, полученном центрифугированием при 50000g, что говорит о прохождении люциферазы через 20%-ую сахарозу, а это характерно для интактных MLV частиц. Осажденный материал также с о осаждался с инфекционным вирусом и имел титр ЗхЮ3 и 4х)04 к.ф.е./мл для env-luc 1 и env-1пс2, соответственно.

Сравнение целостности полученных вирусных частиц

Для того, чтобы измерить проникновение вируса в клетки, люцифераза должна быть заключена вовнутрь частиц и недоступна для субстрата. MLV обычно непроницаемы для маленьких молекул, таких как dNTPs (Mothes et al, 2000a), но могут стать проницаемыми с помощью добавления детергентов, таких как, например, 1%-й NP-40, который разрушает вирусную липидную мембрану и оболочечные белки (Pinter et al., 1997). Для того, чтобы определить, заключена ли люцифераза в интактный вирион, люциферазную активность измеряли в присутствии или отсутствии 1%-го NP-40. Вирус, собранный с env-lucl, показал люциферазную активность в 3 раза выше, чем вирус с env-luc2. Добавление 1%-го NP-40 существенно увеличило сигнал в случае env-lucl, JI/HJI равнялось 15, в то время как для env-luc2, JI/HJI равнялось 1. Эти результаты показали, что хотя обе конструкции успешно направляли люциферазу в вирус, включение env-luc2 было более разрушительным, что приводило к большому количеству нарушений мембраны. В большинстве случаев вирус, собранный с env-lucl, был интактным. В последующем мы использовали лишь вирус, собранный с env-lucl.

Следующим шагом работы была попытка увеличить титр вируса, собранного с env-lucl, до титра вируса дикого типа, для которого этот показатель составлял 10б к.ф.е./мл. Эта проблема решалась добавлением в смесь для трансфекции плазмиды, кодирующей оболочечный белок дикого типа. Было изменено соотношение env-luc к дикому типу и были измерены соотношение

Рисунок 2. Оптимизация производства вируса. Показана зависимость между количеством ДНК, используемым для трансфекции (нижняя ось), между люциферазной активностью и титром вируса. Все вирусы были осаждены через 20%-ую подушку сахарозы и люциферазная активность (левая ось) была определена для неповрежденного вируса (■) или лизированного вируса (•; 1% был добавлен ЫР-40). Вирусный титр - правая ось.

Соотношение 1:4 плазмид, кодирующих епу-1ис и дикий тип, улучшило вирусный титр до 106 к.ф.е./мл (титр, близкий к дикому типу), а соотношение Л/НЛ было 10:1. В 6-ти других независимых экспериментах это соотношение было 11,2±3,7. Суммируя эти результаты, можно заключить, что использование 1 мкг епу-1ис и 4 мкг еп\' обеспечивает оптимальные условия, при которых вирусный титр близок к таковому для дикого типа, а высокое значение соотношения Л/НЛ (более 10) говорит о целостности полученых вирусов, что позволяет использовать этот метод для определения слияния.

Исследование специфичности полученных вирусных частиц на клетках, не содержащих вирусный рецептор

Для проникновения в клетку вирусу необходим специфичный клеточный рецептор, без которого вирус не в состоянии инфицировать клетку. Поэтому следующим шагом исследования была проверка специфичности полученного сигнала на клетках, не экспрессирующих рецептор. Наличие сигнала на негативных клетках означало бы, что люциферазный сигнал отражает неспецифические процессы поглощения клеткой люциферазы, а не рецептор-зависимое проникновение вируса.

Клетки 293 не инфицируются экотропным МЬУ до тех пор, пока в них не экспрессируется рецептор. Поэтому эти клетки служили негативным контролем, а клон 293-САТ, экспрессирующий рекомбинантный тСАТ-1 рецептор, использовался в качестве позитивного конроля. Было обнаружено, что клетки 293 не давали сигнала выше фоновых значений люминометра (около 10 относительных световых единиц в секунду). В клетках, экспрессирующих рецептор, регистрировали сигнал, который достигал своего максимума в интервале от 1 до 1,5 часов, а величина сигнала составляла 5000 о.е.с./сек (рис. 3).

Время (мин)

Рисуиок 3. Люциферазная активность вируса, инкубированного разные промежутки времени с клетками 293, несущими (293-САТ; ▲) или не несущими рецептор (293; •).

В других экспериментах мы обнаружили, что величина сигнала прямо пропорциональна количеству рецептор-содержащих клеток (в интервале от 104 до 107) или количеству вируса на клетку (М01 от 0,01 до 10). Эти результаты указывают на то, что частицы, содержащие люциферазу, успешно

направляются в рецептор-со держащие клетки, а полученный сигнал -рецептор-зависим ый.

Исследование влияния Т471Р мутации на слияние вирусных частиц с

Для дальнейшего доказательства того, что люциферазная активность отражает специфичное проникновение в клетку вирусных частиц, был сконструирован обол очечный белок, содержащий единичную мутацию Т471Р в пептиде слияния. Ранее было показано, что такой вирус может связываться с клетками, содержащими рецептор, но не инфицировать их (21ш еЛ а!., 1998). Мутация была введена в обе конструкции, кодирующие обол очечный белок и епу-Кю. После одного часа инкубации с клетками мутант Т471Р дал сигнал, который был близок к фоновому значению и в 20 раз ниже, чем для вируса дикого типа (рис, 4, левая панель). Для того, чтобы выявить спрятанную люциферазу и определить количество вируса, ассоциированного с клеткой, был использован детергент. При добавлении 1%-го раствора детергента ЫР-40 значение люциферазной активности для дикого типа и для Т471Р мутанта сравнялись (рис. 4, правая панель). Таким образом было показано, что мутант Т471Р связался с клеткой, но не слился с ней. Это доказывает, что использованный метод в полной мере отражает поведение вируса. Более того, после специфического связывания вируса с рецептором клетки не происходит неспецифического поглощения люциферазы. Это свидетельствует о возможности использования данного подхода для независимого измерения рецептор-зависимого связывания вируса с клеткой и для измерения слияния вируса с клеткой.

Рисунок 4, Анализ единичной мутации Т471Р в пептиде слияния с помощью люцифсратного метода определения проникновения вируса. Люцифер азную активность измеряли через 1 час инкубании на интактных клетках (левая панель) или в присутствии 1%-го ЫР-40 (правая панель), * Достоверность различий с вирусом дикого типа (рО,01).

клеткой

Исследование экспрессии и включения оболочечных белков ВВЭЛ в

вирусную частицу

Известно, что высокий уровень экспрессии оболочечных белков вируса на поверхности клетки является важным фактором для эффективного формирования псевдотипа (Sanders, 2002). Поэтому в первую очередь нами были сконструированы плазмиды, экспрессирующие оболочечные белки. Сначала были сконструированы плазмиды на основе штамма Trinidad donkey, как наиболее охарактеризованного в литературе. В одной из конструкций была использована часть гена, кодирующая капсид RRV как лидерную последовательность (рис 5А, верхняя конструкция). Эта стратегия ранее использовалась для эффективной экспрессии оболочечных белков родственного SINV (Frolov et al., 1997). Вторая конструкция содержала дополнительный кодон инициации трансляции в начале последовательности ЕЗ (рис. 5А, нижняя конструкция). Эта стратегия ранее использовалась для получения псевдотипов RRV и SINV. Обнаружено, что конструкция с частью капсида обеспечивала высокий уровень экспрессии оболочечных белков в клетке (рис 5В, дорожка 3), поэтому эти белки плохо включались в частицы MLV (дорожка 10). Так как моноклональными антителами против Е2 1АЗВ-7 была детектирована только одна полоса (дорожка 3, нижняя панель), то лидерный кусок капсида был отрезан правильно. Вторая конструкция дала основную широкую полосу такого же размера при использовании поликлональной сыворотки против ВЭЛ (рис. 5В, дорожки 1 и 2, верхняя панель). Но, в отличие от оболочечных белков, синтезированных с лидерной последовательностью капсида, эти белки включались в состав вирусных частиц (дорожки 6-9). Эти результаты предполагают, что лидерная последовательность капсида может усиливать производство оболочечных белков, и они либо не правильно складываются и не достигают клеточной мембраны, либо лидерный пептид капсида сам мешает включению оболочечных белков в MLV частицы. Белки El и Е2 мигрировали близко друг от друга в геле из-за гетерологичного гликозилирования и не могли быть разделены по размерам. Однако Е2 белок детектировался с помощью моноклональных антител против Е2. Так как для правильного процессинга Е2 необходима экспрессия El, должны быть экспрессированы оба белка. Для конструкции безлидерного пептида было проверено включение оболочечного белка в интактные и дефектные частицы. Для этого были сравнены осадки до центрифугирования с осадками после центрифугирования через 20%-й раствор сахарозы, который исключает дефектные частицы из осадка. Было обнаружено, что большинство оболочечных белков, представленных в культуральном супернатанте (рис. 5В, дорожка 6), было осаждено через подушку сахарозы (дорожка 7), а их количество было соизмеримо с количеством, полученным центрифугированием без подушки (дорожка 8). Эти результаты показывают, что большая часть оболочечных белков была эффективно включена в частицы.

Е1

. I

Ndel Xhoi 1 '

BamHi Nsil

kDa 1 2 3

kDa 1 2 3 4 5 6 7 8 91011

6248-

48-

33-

Политональные анпггепа

62-

48-

48- У V

33-

1А38-7

Рисунок 5. Дизайн конструкции и экспрессия VEEV оболочечных белков в 293 НЕК клетках. (А). Было сделаны две конструкции. Первая (верхняя) содержит С-концевой домен RRV капсида как лндерный пептид для инициации трансляции открытой рамки считывания. Вторая (нижняя) содержит искусственный кодон инициации трансляции, который предшествовал открытой рамки считывания кодирующей от ЕЗ до El. (В) Всстерн б л от анализ экспрессии оболочечных белков в 293 клетках, трансфецированных экспрессной ными конструкциям для VEEV Trinidad donkey оболочечных белков (левая панель) или анализ отфильтрованного культур ал ьн ого супсрнатанта (правая панель) с помощью поликлональных антител против VEEV (АТСС VR-1249AF) или с помощью моноклонального антитела 1АЗВ7 реагирующего с Е2. Дорожка 1 и 2, лизаты клеток, экс премирующих VEEV Trinidad donkey с конструкции без капсида в нормальной среде и в среде с добавлением 5мМ бнтурата натрия, соответственно; дорожка 3, конструкция с капсидным лидерпым пептидом; дорожка 4, VSV-0 экспресснонный вектор; дорожка 5, лизат очищенного 'ГС-83 вируса. Супсрнатанты в правой панели представляют неконцентрированный материал (дорожка 6), вирус осажденный через 20% подушку сахарозы (дорожка 7 и 9), вирус осажденный без сахарозы (дорожка 8), осадок с конструкции с капсидным лидером (дорожка 10), и VSV-G псевдотип осажденный через сахарозу (линия i I). (С) Частицы, осажденные через сахарозу, псевдотнпированные с VSV-G (дорожка 1) или с VEEV штамм 3908 (дорожка 2) или Trinidad donkey (дорожка 3) оболочечным белком. Каждый был окрашен с использованием тех же антител, что были описаны для панели В.

Изначальная характеристика была сфокусирована на конструкциях, экспрессирукощих оболочечные белки от Trinidad donkey штамма ВЭЛ члена 1ДВ серогруппы. Затем было решено проверить возможность получения частиц, содержащих оболочечные белки от 3908 штамма ВЭЛ, который

является типичным членом недавних полевых изолятов 1С серогруппы и инфекционным для людей и лошадей. Было обнаружено, что оболочечные белки Trinidad donkey и 3908 штаммов имеют близкий уровень включения в частицы (рис. 5С).

Определение инфекционности полученных псевдотипов ВВЭЛ

Для определения инфекционности псевдотипов ВВЭЛ была использована линия 293 НЕК фибробластов человека (таблица 1).

Таблица 1. Титры псевдотипированных MLV, определенные с помощью последовательных разведений"

Оболочечный белок Титр (кфе/мл) на:

НЕК 293 клетки 293-CAT клетки

VEEV капсидный лидер (1 ± 0.6) X 103 Н.о.

VEEV ЕЗ-1 TRD (2.0 ± 0.5) X 105 Н.о.

VEEVE3-1 3908 (1.0 ± 0.2) X 103 Н.о.

VSV-G (1 ±0.5)х 107 107

MLV 0 106

Без оболочечного белка 0 Н.о.

" Вирус был собран с использованием трансфецированных 293 НЕК клеток. Н.о. - не

определено.

Обнаружено, что конструкция с лидерным участком капсида обеспечивала низкий уровень включения оболочечного белка, и этот вирус мог инфицировать клетки с низким титром 103 кфе/мл. Напротив, конструкции без лидерной последовательности давали титр в 100 раз выше для обоих Trinidad donkey и 3908 штаммов. Фоновая инфекция, вирус, собранный без добавления оболочечных белков, или титрование на клетках без рецептора, не давали сигнала.

В некоторых экспериментах использование бутирата натрия (5 мМ бутират натрия добавлялся в среду за 12 часов до собирания вируса) повысило титр до 10 раз. Этот реагент известен способностью увеличивать экспрессию белков с цитомегаловирусного промотора через активацию энхансерного элемента промотора. Однако это соединение оказывало эффект только в случаях неоптимальной трансфекции, из чего можно сделать вывод о том, что использование бутирата натрия имеет смысл только тогда, когда плазмида лимитирована. Подтверждением этого являются эксперименты, в которых трансфекция была оптимизирована, а анализ экспрессии оболочечного белка (рис. 5Б, дорожка 2) и его включения в частицы (дорожка 9) в клетках, обработанных бутиратом натрия, показал отсутствие изменений или незначительные изменения в уровне экспрессии.

Нейтрализация псевдотипов с помощью ВВЭЛ реактивной сыворотки

Для определения входят ли псевдотипированные частицы в клетки с помощью механизма зависимого от оболочечных белков ВВЭЛ, был проведен эксперимент по ингибированию инфицирования с помощью моноклональных антител против Trinidad donkey штамма ВВЭЛ. В данном случае нейтрализация псевдотипа специфичными моноклональными антителами, узнающими различные эпитопы, доказывает наличие этих эпитопов на поверхности псевдотипа, тем самым доказывая конформацию оболочечных белков сходную с вирусом дикого типа.

Ранее было показано, что три вида моноклональных антител реагировали с различными эпитопами на Е2 (1АЗВ-7, 1А2А-9 и 1А2В-10) и одно антитело узнавало эпитоп на El (1А4В-6) (Roehrig and Mathews, 1985; Hunt and Roehrig, 1995). Поэтому мы использовали эти антитела вместе с нейтрализующей поликлональной кроличьей сывороткой, реагирующей со всем вирусом, для нейтрализации полученного псевдотипа. Моноклональные антитела были использованы при конечном разведении 1:200 (конечная концентрация 5 мкг/мл). Поликлональные антитела были использованы при разведении 1:100. 200 инфекционных единиц псевдотипорованного вируса на лунку 24-луночного планшета инкубировались в присутствии или в отсутствии антител. VSV-G псевдотип использовался как негативный контроль неспецифичного ингибирования антителами. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2. Ингибирование инфицирования ВВЭЛ штамма Trinidad псевдотипированного MLV с помощью нейтрализующих моноклональных и поликлональных антител.

Антитела Специфичность % уменьшения титра (относительно не нейтрализованного вируса)

VEEV псевдотип VSV-G псевдотип

Моноклональные

1А4В-6 El 97 0

1АЗВ-7 Е2 44 0

1АЗА-9 Е2 100 0

1А2В-10 Е2 29 0

Поликлональные Вирус 100 2

Как видно из таблицы, выделяется три наиболее эффективных антитела: 1А4В-6, 1АЗА-9 и поликлональная сыворотка, которые блокировали инфекцию. В подтверждение специфичности полученных результатов УБУ-О псевдотип не был нейтрализован. Моноклональное антитело 1АЗВ-7 уменьшило инфекцию лишь наполовину, а 1А2В-10 обеспечило только 29%-ое ингибирование инфекции. Важным заключением является то, что результаты по нейтрализации ВВЭЛ оболочечных белков псевдотипа совпадали с

таковыми для вируса дикого типа, полученными ранее (Hunt and Roehrig, 1995; Roehrig and Mathews, 1985). Исключение составила реактивность антитела против El. В случае вируса дикого типа это антитело взаимодействует с защищенным эпитопом. Скорее всего, этот факт свидетельствует о том, что El белок в альфавирусных частицах обычно расположен у уснования Е2 и защищен от взаимодействия с антителами через стерические ограничения плотно упакованных Е1-Е2 гетеродимеров (Paredes et al, 2001; Pletnev et al., 2001). По данным электронной микроскопии псевдотипированные частицы имеют меньше оболочечных белков на своей поверхности и, таким образом, El оболочечный белок становится доступным для антител. Однако, как минимум для Е2, было показано, что псевдотип несет нативный набор эпитопов на своей поверхности и эффективно нейтрализуется подходящими антителами. Таким образом, эти данные говорят о том, что ВВЭЛ оболочечные белки были ответственны за проникновение псевдотипа в клетки.

Включение фермента люцнферазы в ВВЭЛ псевдотип Клеточные процессы, которые ведут к проникновению оболочечного вируса, плохо изучены, в основном из-за отсутствия количественного и чувствительного метода, который бы измерял проникновение вируса в реальном времени. Для альфавирусов основная часть работ была сфокусирована на изучении вирусов SFV и SINV, так как каждый из них растет до высоких титров и не патогенен для человека. Оба вида сливаются с мембраной клеток с помощью понижения рН, что показано методом смешивания липидов. Этот метод измеряет дисперсию флуоресцентно меченой пробы после слияния вирусной мембраны с клеточной или искусственной мембранами (Smit et al., 1999; White and Helenius, 1980). Однако из-за высокого фона этого метода требуется большое количество очищенного вируса, что является не физиологичным и трудно выполнимым для таких высоко патогенных вирусов, как ВВЭЛ, а для синхронизации процесса слияния и увеличения сигнала требуется понижение рН. Кроме того, этот метод не применим к рН-независимым вирусам, так как их слияние не возможно стимулировать, что приводит к тому, что сигнал практически не отличим от фоновых значений. Другим недостатком является то, что понижение рН заставляет весь вирус перейти в стадию слияния, независимо от места нахождения вируса, что делает невозможным изучение транспорта вируса и физиологичных условий его слияния с клеточными мембранами. В связи с вышесказанным было решено адаптировать метод, разработанный ранее для экотропного MLV к ВВЭЛ. По аналогии с этим методом так же, как и в случае MLV, люцифераза была включена в состав псевдотипированной частицы. Для этого С-конец El белка ВВЭЛ был модифицирован таким образом, чтобы присоединить к нему люциферазу (рис. 6А). Для получения люциферазы, связанной с вирусом, оказался необходим удлиненный линкер, состоящий из трех копий последовательностей, кодирующих НА-эпитоп (рис. 6А). Более

того, наличие этого эпитопа позволило детектировать Е1 белок методом Вестерн блота (рис. 6В открытая стрелка). Как видно из картины Вестерн блота, комплекс Е1-люцифер аз а соответствовал полосе 100 к Да для клеточного лизата (дорожка 3) и вирусных частиц (дорожка 6, заполненная стрелка).

Д ЕЗ Е2 6к Е1 НА Люцпфд.щча 11 м ■■■■ ■ 13

52 кДа

112кДа

В Клетки Вирус

кДа 1 2 3 4 5' 6 175- IX

«м

93- - - * _

62- £ * 9 щ

47-

Рисунок 6. Дизайн конструкции и экспрессия епУ-1ис. (Л) Рекомбинантный оболочечный ген был сделан в экепрессионном векторе рСОЫАЗ ([п\'Нго§еп). Единственная рамка считывания кодировала оболочечные белки ВВЭЛ от ЕЗ до Е1, как и ранее, за исключением того, что кодон терминации был удален и слит с геном, кодирующем три копии НА эпитопа (НА), который, в свою очередь, был соединен с геном люниферазы светлячка. (В) Вестерн б л от анализ рекомбинантного оболочечного белка ВВЭЛ лизата трансфецированных клеток (слева) и осажденного вируса (справа). Клетки трансфецированы для производства МЬУ частиц, гтеевдотвпированных с оболочечными белками от есо-МЬУ (дорожки 1 и 4), ВВЭЛ с НА-Ш^ (дорожки 2 и 5) или ВВЭЛ епу-1ис конструкцией (дорожки 3 и б). Открытая и сплошная стрелки показывают предсказанный размер ВВЭЛ НА-1а^ес1 Е1 белок и Е1-1нс белок, соответственно.

Определение целостности полученного вируса

Для определения целостности вирусных частиц они были разделены центрифугированием в градиенте сахарозы. В каждой фракции был определен вирусный титр, люциферазная активность и измерено содержание белка Е1. Максимальное значение исследуемых параметров было зарегистрировано во фракции 4, где концентрация сахарозы была около 40% {рис. 7). Соотношение люциферазной активности лизнрованного вируса к нелизированному для ВЭЛ составило >10. Вместе с данными о том, что измеряемые активности находятся в одной и той же фравдин, которая соответствует плотности чат явного вируса, эти результаты говорят о том, что ВВЭЛ псевдотипированные частицы были неповрежденными, инфекционными и готовыми для использования в Измерении проникновения вируса.

Рисунок 7. Анализ вирусных частиц, содержащих люциферазу, в непрерывном градиенте сахарозы (0 -60%). Фракции были проанализированы на Е1-НА-люциферазу методом Вестерн блота с применением моноклональных антител против НА.

Определение кинетики проникновения вируса

Преимуществом использования псевдотипов, является то, что разные псевдотипы имеют одинаковую сердцевину, а единственным отличием являются разные оболочечные белки. Это позволяет, с одной стороны, изучать особенности проникновения вирусов в клетки (определяются оболочечиыми белками), и, с другой стороны, позволяет разным псевдотипам выполнять функцию контролен друг для друга в случае неспецифических эффектов, В настоящей работе в качестве контролен использовались эко-МЬУ и \'г3 \г псевдотипы. Известно, что У5У входит в клетки с использованием клатрин-зависимого эндоцитоза, в то время как эко-МЬУ, как считается, входит через клеточную поверхность (МоШеэ е! а!., 2000а). Клетки инкубировались с вирусными частицами ВВЭЛ еп\'+ВВЭЛ спу-1ис, еш-МЬУ епу+есо-МЬУ еп\'-1ис и УЭУ-С епу+ есо-МЬУ епу-!ис, содержащими люциферазу, разное время при М01, равной 0,5, Для определения кинетики проникновения вируса на первом этапе проведено быстрое связывание вируса, когда вирус инкубировался с клетками в течение одной минуты, после чего свободный вирус отмывался дважды в среде ОМЕМ. Далее клетки инкубировались при 37° С в разные промежутки времени, после чего была измерена люциферазная активность. Частицы, покрытые есо-МЬУ епч, тестировались на клетках 293, экспрессирующих рекомбинантный есо-МЬУ рецептор. Для других вирусов использовались нативные 293 клетки. Так как измерение кинетики проводилось в реальном времени, было обнаружено, что даже небольшие изменения условий инкубации могут существенно влиять на показания. Так, например, использование воздушного инкубатора на 37° С обеспечивало плохую передачу тепла, что привело к замедлению процесса проникновения в

клетки МЬУ и период проникновения половины вируса удлинился до 40 мин (данные не приведены) вместо 20 мин при применении водяной бани. Проникновение УБУ-в и ВВЭЛ псевдотипов было более быстрым, половина времени проникновения всего вируса для них составляла 15 и 10 мин соответственно и не столь заметно зависело от температуры (рис. 8). Эти результаты хорошо согласуются с быстрым путем проникновения ВВЭЛ, возможно, с помощью клатрин-зависимого эндоцитоза.

М1Д'

Рисунок 8. Кинетика проникновения разных вирусных частиц. По оси абсцисс -люциферазная активность (103 о.е.с./сек), по оси ординат - время инкубирования клеток с вирусом (мин).

Исследование эффекта нейтрализующих антител на проникновение

ВВЭЛ псевдотипа

Для подтверждения специфичности метода перед добавлением к клеткам вирусные частицы были предварительно инкубированы с антителами против ВВЭЛ. Как показали результаты, для ВВЭЛ частиц сигнал снижался более, чем на 80%, в то время как УБУ частицы были не затронуты (рис 9, верхняя часть). Этот факт говорит о том, что ВВЭЛ частицы входят в клетки через механизм, опосредованный ВВЭЛ-оболочечными белками.

¡е . , □ ввая X

IЖ И ^ ■ в

■ 5 щьплг ■ ■ п

О , I I 1. ——■

Ьлф[пощпвп1 МН^СЬ Моненчтн

Рисунок 9. Нейтрализация вирусных частиц специфичными антителами и эффект ингибиторов эндосомального за кислен и я. По оси абсцисс - Люцифера зная активность (относительно контроля), по оси ординат - используемые антитела и ингибиторы. * Достоверность различий с контролем (р<0,01).

Влияние ингибиторов эндосомального закисления на проникновение

вируса

Ранее нами было показано, что ВВЭЛ псевдотип, для инфицирования клеток, нуждается и понижении рН. Для того чтобы, с одной стороны, проверить функциональность нового метода, и, с другой стороны, определить необходимость низкого рН для проникновения вируса (условия для инфицирования могут отличаться от условий слияние вирусной с клеточной мембраной), были использованы ингибиторы закисления эндосом. Клетки были обработаны бафиломицином, хлоридом аммония, хлорохином и моненсином, после чего была измерена активность люциферазы. Каждый из этих ингибиторов блокировал проникновение УБУ-С (рН-зависимый вирус) и ВВЭЛ, но не есо-МЬУ (рис 9, нижняя часть). Суммируя эти результаты, можно заключить, что ВВЭЛ частицы входят в клетки с помощью рН-зависимого механизма, а анализ проникновения вируса, основанный на Определении активности люциферазы, отражает путь проникновения, используемый инфекционным вирусом. Кроме того, существенная разница между сигналом, полученным от вируса с добавлением ингибитора и без него, указывает на низкие фоновые значения и широкий диапазон сигнала, что делает метод идеальным для изучения эффекта других ингибиторов.

Влияние Eps 15 ЕД95/295 на поглощение трансферрина н проникновение

вируса

Применение доминантно-негативных мутаций в генах, кодирующих белки, регулирующие эндоцитоз, позволяет изучать их роль в проникновении вируса. Для подтверждения функциональности таких белков, был проверен их эффект на поглощение трансферрина, которое проходит исключительно через клатрин-зависимый эндоцитоз. Первым был проверен эффект доминантно-негатнвного мутанта Eps 15 ЕД95/295, который блокирует кпатрин-зависимый эндоцитоз. Клетки инкубировались с А1ехаАиог594-трансферрин, фиксировались, после чего с помощью конфокального микроскопа было оценено распределение продукта гена и меченного трансферрина (рис. 1ОА).

RabS T22N

Рисунок 10. Влияние мутантных форм белков эндоцитоза на проникновение вируса, определенное по поглощению трансферрина с использованием конфокального микроскопа (Л) или по вхождению вируса (В). По оси ординат: активность люциферазы, * Достоверность различий по сравнению с контролем (р<0.05).

Видно, что в клетках, инфицированных вирусом с вектором без вставки, меченый трансферрин захватывался клетками, что приводило к точечному окрашиванию цитоплазмы (рис, 10, контроль). Напротив, в клетках, инфицированных лентивирусом, кодирующим ЕА95/295, продукт трансгена

был слабо экспрессирован, но равномерно распределен в цитоплазме, а трансферрин был обнаружен только на поверхности клетки и в небольшом районе около ядра. Такое распределение указывает на то, что клатрин-зависимый эндоцитоз был эффективно заблокирован. После этого было измерено проникновение ВВЭЛ, VSV и eco-MLV псевдотипированных вирусов. ВВЭЛ и VSV вели себя одинаково: проникновение ингибировалось более чем на 70% (рис. 10В открытая и заштрихованная колонка), в то время как проникновение eco-MLV практически не менялось (рис. 10В, полосатая колонка). Таким образом эти данные подтвердили, что для проникновения ВВЭЛ и VSV необходим клатрин-зависимый эндоцитоз.

Роль ранних и поздних эндосом в проникновении ВВЭЛ

Известно, что клатрин-зависимые пузырьки транспортируются и сливаются с ранними и поздними эндосомами, становясь все более закисленными (Gruenberg and Maxfield, 1995). Потому следующим шагом было определение роли ранних и поздних эндосом в проникновении ВВЭЛ. Для этой цели были использованы доминантно-негативные формы Rab5 (S34N) и Rab7 (T22N) и конститутивно активная форма Rab5 Q79L. Так же как и в случае с ЕА95/295, каждый из них был слит с GFP для контроля экспрессии (рис. 10А). Для подтверждения влияния каждого мутанта на клатрин-зависимый эндосомальный транспорт был также использован захват меченого трансферрина. Экспрессия Rab5 дикого типа не ингибировала захват трансферрина и, как ожидалось, меченый трансферрин колокализовался с точечным Rab5-GTP сигналом. Экспрессия доминантно-негативных Rab5 и Rab7 привела к нарушению этого распределения. Так, экспрессия Rab5 S34N приводит к уменьшению захвата трансферрина подобно наблюдаемому в случае ЕА95/295, тогда как Rab7 T22N вызывает накопление трансферрина в пузырьках, больших по размерам и меньших по количеству в сравнении с пузырьками, замеченными в случае экспрессии Rab5 дикого типа (рис. 10А). Подобное распределение трансферрина было ранее описано во время экспрессии Rab7 T22N в Hela клетках (Feng et al., 2001). В нашем случае влияние конститутивно активного мутанта Rab5 Q79L было наиболее выделяющимся, его экспресссия приводила к формированию крупных пузырьков, содержащих трансферрин. Эти крупные пузырьки, скорее всего, являются результатом аккумулирования эндоцитозных пузырьков, находящихся на стадии созревания ранних эндосом, которые остались связанными с мутантным Rab5 (Roberts et al., 1999). В каждом случае анализ проникновения трансферрина показал, что экспрессионные вектора обеспечивали достаточный уровень экспрессии каждого доминантно-негативного гена, необходимого для получения ожидаемого фенотипа.

Проникновение ВВЭЛ в клетки было измерено с использованием псевдотипов VSV и eco-MLV в качестве контроля. Псевдотип SFV, модифицированный для использования люциферазы, был взят для сравнения

проникновения ВВЭЛ с проникновением вирусов Старого Света. Ранее было показано, что VSV и SFV выходят из клатрин-зависимого эндодитозного пути в ранних эндосомах, a eco-MLV, как считается, входит в клетки через плазматическую мембрану. Так как единственным отличием между псевдотипами является оболочечный белок, находящийся на их поверхности, различия в кинетике проникновения могут быть результатом функционирования оболочечных белков. Для каждого экспрессируемого гена проникновение MLV оставалось неизменным (рис. 10В снизу), что свидетельствует о том, что клетки оставались чувствительными к вхождению вируса, а экспрессия мутантных генов не повлияла на активность люциферазы. Напротив, экспрессия ЕА95/295, Rab5 (S34N) и Rab5 (Q79L) уменьшала проникновение ВВЭЛ, SFV и VSV на 80-90%. Способность Rab5 Q79L ингибировать проникновение вируса, скорее всего, означает, что для слияния мембран вирус был задержан в аккумулированных ранних эндосомах близко до достижения требуемой кислотности. Сверхэкспрессия Rab5 дикого типа уменьшила проникновение ВВЭЛ и SFV на 30%, но не изменила кинетики проникновения VSV. Влияние эктопичной экспрессии Rab5 дикого типа на ВВЭЛ и SFV может отражать усиленный транспорт вируса в непродуктивный КаЬ5-зависимый путь, который является продуктивным для VSV. Экспрессия Rab7 T22N имела разный эффект на ВВЭЛ и SFV. Так, проникновение ВВЭЛ было занижено с помощью Rab7 T22N, как это отмечалось и для доминантно-негативного Rab5 и ЕД95/295. В противоположность этому, проникновение SFV и VSV было снижено лишь на 20%. Эти данные говорят в пользу проникновения ВВЭЛ с помощью эндоцитоза через клатрин-зависимый эндоцитоз, причем проникновение вызывается в поздних эндосомах.

Зависимость проникновения псевдотипа ВВЭЛ от холестерина

Открытие того факта, что ВВЭЛ выходит из поздних эндосом, говорит о том, что механизмы проникновения этого вируса могут отличаться от альфавирусов Старого Света. Использование модельных систем с недостатком холестерина в мембранах показало, что для эффективного слияния SFV и SINV с клеточной мембраной необходим холестерин (Kielian and Helenius, 1984; Lu et al., 1999). Также были идентифицированы аминокислотные остатки, ответственные за взаимодействие с холестерином (Lu et al., 1999; Vashishtha et al., 1998).

Удивительно, но некоторые идентифицированные аминокислотные замены уже присутствовали в Е1-оболочечном белке ВВЭЛ. Предположение о том, что ВВЭЛ входит клетки с помощью холестерин-независимого эндоцитоза может указывать на дополнительную фундаментальную разницу между путями проникновения альфавирусов Старого и Нового Света и на необходимость прохождения к эндоцитозному компартменту, где холестерин отсутствует. Для проверки этого предположения был использован нистатин, который связывает клеточный холестерин. Недавно было показано, что обработка клеток нистатином блокировала холестерин-зависимое проникновение вируса Эбола

(Empig and Goldsmith, 2002), В нашем исследовании была проведена модификация метода включения люциферазы (не показано), которая позволила использовать псевдотип Эбола вируса в качестве контроля. Ранее было показано, что В-субъединица токсина холеры проникает в клетку с помощью холестерин-зависимого пути (Orlandi and Fishman, 1998). Это позволило нам подобрать минимальную концентрацию нистатина (60 мкг/мл), которая нарушала захват субъединицы токсина холеры без влияния на выживаемость клеток (токсин присутствовал на поверхности клетки, но практически отсутствовал внутри клетки). При этой концентрации проникновение Эбода было заблокировано более чем на 90%. Проникновение VSV и SFV также было заметно ингибировано: на 55% и 65% соответственно (рис. 11), что существенно отличало их от ВВЭЛ, который показал значительную устойчивость к обработке клеток нистатином, а проникновение было ингибировано лишь на 20%. Эти данные указывают на то, что ВВЭЛ входит в Клетки с помощью механизма, независимого от свободного холестерина, что делает данный вирус отличным от альфавирусов Старого Света.

Рисунок 11. Роль клеточного холестерина в механизме проникновения ВВЭЛ. (А) Фотография флюоресцентно меченной Б-субъединицы токсина холеры с 293 клетками, слева без нистатина, справа с нистатином. (Б) Проникновение вируса было измерено в необработанных (открытые столбики) или в клетках обработанных нистатином (сплошные столбики) с помощью измерения яюциферазной активности. Значения были нормализованы к контрольным клеткам обработанным СМЗО. * Достоверность различии между ВВЭЛ и ЭРУ (р<0,05).

Заключение

Изучение механизмов проникновения вирусных частиц в клетку хозяина является одной из актуальных проблем современной биохимии и вирусологии. Известно, что существует множество разнообразных механизмов проникновения, причем все они высоко специфичны для каждого конкретного вируса. Поэтому изучение специфичных потребностей вируса в клеточных факторах имеет огромное значение как для фундаментальной науки, изучающей патогенез вирусов, так и для прикладной науки, где важно выявление мишеней для рационально разрабатываемых противовирусных препаратов.

Результаты по использованию ингибиторов эндосомального закисления показали, что ВВЭЛ входит в клетки с помощью рН-зависимого механизма. Каждый из использованных в работе ингибиторов проникновения: хлорид аммония, хлорохин, моненсин и Бафиломицин А1 блокировал развитие вирусной инфекции ВВЭЛ и VSV псевдотипов, тогда как для eco-MLV эффекта не было. Экспрессия доминантно-негативных генов показала, что для проникновения ВВЭЛ, так же как и для VSV, необходим клатрин-зависимый эндоцитоз и формирование ранних эндосом. Однако ВВЭЛ отличался от VSV и от близкородственного SFV тем, что для него было необходимым еще и функционирование поздних эндосом, что делает ВВЭЛ более похожим на вирус гриппа, нежели на SFV или VSV.

Различия могут быть обусловлены более низким рН, необходимым для слияния мембран, или зависимостью от вторичных факторов, присутствующих в поздних эндосомах. Вторым отличием от близкородственного SFV оказалась зависимость от холестерина. Различия в чувствительности к холестерину могут отражать различия в композиции мембран пузырьков, с которыми вирус сливается, и из которых выходит в цитоплазму. Действительно, было показано, что поздние эндосомальные компартменты почти не содержат мембранного холестерина, в то время как ранние эндосомы и рециклинговые пузырьки

обогащены холестерином (КоЬауаэЫ е/ а1, 1998; КоЬауаБЫ е/ а1, 2002). Роль холестерина в проникновении БРУ может отражать необходимость выхода вируса из ранних эндосом, в то время как ВВЭЛ адаптировался к меньшему количеству холестерина из-за необходимости выхода из поздних эндосом, содержащих мало холестерина. В дополнение к рН, холестерин может обеспечивать для вируса новый механизм определения состояния эндосомального пузырька в процессе созревания для оптимизации условий вирусной репликации.

ВЫВОДЫ

1. Присоединение люциферазы к С-концу оболочечного белка МЬУ вируса через линкерный пептид С1и-РЬе обеспечивает эффективное включение люциферазы в вирусную частицу, что позволяет использовать эту конструкцию для измерения проникновения вируса в клетку в реальном времени.

2. Для проникновения вируса МЬУ в клетку необходим оболочечный белок дикого типа, так как добавление этого белка к белку, слитому с ферментом, приводит к получению интактного вируса с целостной мембраной и повышает его титр до титра вируса дикого типа.

3. Разработан новый, универсальный и чувствительный метод, с помощью которого подтверждено, что вирусы УБУ и МЬУ входят в клетку через специфичный рецептор-зависимый механизм.

4. При использовании искусственного кодона инициации трансляции, который предшествовал открытой рамке считывания, кодирующей белки ЕЗ-Е1, впервые получен псевдотип вируса ВЭЛ, имеющий высокий титр (106 к.ф.е./мл) и несущий на своей поверхности нативные эпитопы, узнаваемые моноклональными антителами к вирусу дикого типа.

5. Впервые установлено, что присоединение люциферазы к оболочечному белку вируса ВЭЛ с помощью удлиненного полилинкера, состоящего из 3-х копий НА-эпитопа, позволяет включить люциферазу в псевдотип вируса ВЭЛ. Добавление оболочечного белка дикого типа оказалось необходимым для получения вируса с ненарушенной мембраной и позволило количественно измерять проникновение ВЭЛ псевдотипа в клетку в реальном времени.

6. Впервые показано, что ВВЭЛ проникает в клетки с помощью клатрин-зависимого эндоцитоза и нуждается в функционально активных ранних и поздних эндосомах, причем процесс проникновения не зависит от холестерина.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Тикунова Н. В., Колокольцов А. А. и Чепурнов А. А. (2001) Рекомбинантные моноклональные человеческие антитела против вируса Эбола// Доклады Академии Наук, 378, 195-197.

2. Kolokoltsov, A. A. and Davey, R. A. (2004) Rapid and sensitive detection of retrovirus entry by using a novel luciferase-based content-mixing assay// Journal of Virology, 78, 5124-5132.

3. Kolokoltsov, A. A., Weaver, S. C. and Davey, R. A. (2005) Efficient functional pseudotyping of oncoretroviral and lentiviral vectors by Venezuelan equine encephalitis virus envelope proteins// Journal of Virology, 79, 756-763.

4. Kolokoltsov, A. A., Fleming, E. H. and Davey, R. A. (2006a) Venezuelan equine encephalitis virus entry mechanism requires late endosome formation and resists cell membrane cholesterol depletion// Virology, 347, 333-342.

5. Kolokoltsov, A. A., Wang, E., Colpitts, Т. M., Weaver, S. C. and Davey, R. A. (2006b) Pseudotyped viruses permit rapid detection of neutralizing antibodies in human and equine serum against Venezuelan equine encephalitis virus// The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 75, 702-709.

6. Saeed, M. F., Kolokoltsov, A. A. and Davey, R. A. (2006) Novel, rapid assay for measuring entry of diverse enveloped viruses, including HIV and rabies// Journal of Virological Methods, 135, 143-150.

Список используемых сокращений:

ВВЭЛ - вирус венесуэльского энцефаломиелита лошадей ВИЧ - вирус иммунодифицита человека к.ф.е. - колонию формирующая единица

Л/НЛ — соотношение люциферазной активности лизированного вируса к активности нелизированного о.е.с. - относительная единица света ПЦР — полимеразная цепная реакция 293 НЕК - эмбриональные клетки почки человека env - оболочечный белок вируса

env-luc - оболочечный белок вируса, слитый с люциферазой

GFP - зеленый флюоресцирующий белок

luc - люцифераза

MLV - вирус лейкоза мышей

MOI - множественность заражения

RRV - вирус долины реки Росс

SFV - вирус леса Семлики

SINV- вирус Синдбис

ТМ - трансмембранный фрагмент

VSV - Вирус Везикулярного Стоматита

Соискатель А.А. Колокольцов

Подписано к печати 12 апреля 2007 г. Тираж 100 экз. Заказ №1743 Отпечатано «Документ-Сервис», 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 335-66-00

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Колокольцов, Андрей Алексеевич

Введение.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Эндоцитоз в клетках млекопитающих.

1.1.1. Фагоцитоз.

1.1.2. Клатрин-зависимый эндоцитоз.

1.1.2.1. Основные белки, участвующие в формировании клатриновой почки.

1.1.2.2. Рекрутирование мембранных белков в клатрин покрытые районы.

1.1.2.3. Отщепление клатрин покрытых пузырьков.

1.1.2.4. Слияние и сортировка рецепторов в ранних эндосомах.

1.1.3. Клатрин-нсзависимый эндоцитоз

1.1.3.1. Липидные рафты.

1.1.3.2. Кавеола.

1.1.3.3. Функции кавеолина-1.

1.1.3.4. Кавеосомы.

1.1.4. Rab ГТФ-азы - регуляторы мембранного транспорта.

1.1.4.1 ГТФ-азный цикл Rab белков.

1.1.4.2. Эндосомальные Rab белки.

1. 1.4.2.1. Rab5 - регулятор слияния эндосом.

1.1.4.2.2. Rab7 и Rab9 в регуляции поздних эндосом.

1.2. Проникновение вирусов в клетки.

1.2.1. Клеточная мембрана и вирусные рецепторы.

1.2.2 Клатрин-зависимый путь проникновения вирусов в клетку.

1.2.3. Кавеола/рафт-зависимое проникновение вирусов.

1.2.4. Макропиноцитоз.

1.3. Вирус венесуэльского энцефаломиелита лошадей.

1.3.1. Классификация ВЭЛ.

1.3.2. Структура вируса ВВЭЛ и его проникновение в клетку.

1.3.3. Выход Альфавирусов из клетки.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование механизмов проникновения вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей в клетку в реальном времени"

Борьба с вирусными инфекциями является одной из серьезных проблем современной биологии и медицины. В настоящее время в получении противовирусных препаратов задействованы огромные человеческие ресурсы. Каждый год расширяется список используемых препаратов и способов их действия. Результатом более детального изучения и понимания вирусов и факторов, необходимых для их распространения, явилось добавление к препаратам широкого действия, таким как, например, интерферон, все более и более специфичных препаратов, направленных против конкретного вируса и против конкретного процесса. Например, для лечения ВИЧ используются как специфичные ингибиторы обратной транскриптазы и протеазы, так и ингибиторы проникновения вируса в клетку (Reeves and Pietcr, 2005). Успех лечения во многом определяется нашими знаниями природы вируса, включая особенности геномной организации, биохимического аппарата, а также способа проникновения вируса в клетку хозяина. Последнее гораздо хуже изучено из-за отсутствия количественных методов определения проникновения вируса в реальном времени.

Детальное исследование процессов проникновения вирусов в клетки и выявление факторов, необходимых для этого, имеет огромное значение не только для понимания природы вируса, по и для разработки новых противовирусных препаратов и диагностических методов. К сожалению, существующие методы определения проникновения вирусов имеют множество ограничений и не всегда применимы. Методы, основанные на измерении высвобождения содержимого вируса в клетку, обладают наибольшим потенциалом. Для ретровирусов распространенный метод основывается на факте, что синтез вирусной кДНК ограничен доступом к дезоксирибоиуклсотидам. После проникновения вируса и разборки капсида, вирусная полимераза может получит!, доступ к dNTPs, тогда синтез будет продолжен. Транскрипты могут быть детектированы с помощью ПЦР, обычно через 4 часа после контакта вируса с клеткой (Mothes el al., 2000а). Но этот метод не дает ответа на вопрос, в какое время происходит открытие генома и собственно контакт полимеразы с dNTP. Другой метод основан на присоединении фермента fJ-лактомазы к VPR белку вируса иммунодефицита человека (Cavrois et al., 2002), который пакуется в ВИЧ частицы во время сборки вируса. Это обеспечивает попадание фермента во внутрь частицы, который высвобождается в клетку после слияния вируса. По на практике этот метод не обладал достаточной чувствительностью, так как для получения адекватного количества продукта ферментативной реакции требовалось до 12 часов. Для уменьшения времени необходимо от 10 до 100 инфекционных частиц на клетку, что не является физиологичным. Таким образом. задача количественною определения вирусных частиц в клетке-хозяине после инфицирования остается нерешенной.

Вирус венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВВЭЛ) входит в состав семейства Тогавирусов, рода альфавирусов и имеет структуру и геномную организацию сходную с другими альфавирусами, включая Sindbis, Ross River, Eastern Equine Encephalitis и Semliki Forest (Paredes et al., 2001; Paredes et al., 2005). Наши знания об альфавирусах получены в основном при исследованиях Semliki Forest и Sindbis вирусов, в то время как мало известно о высоко вирулентном ВВЭЛ, особенно о его проникновении в клетку. Гак как существует много примеров, когда родственные вирусы используют разные нуги проникновения, (так. пикорновирусы используют как клатрин-зависимый эндоцитоз, так и кавсола). то необходимо определить, какой из этих механизмов работает у альфавирусов. К тому же было предположено, что аминокислотные различия в оболочечиых белках ВВЭЛ и SFV определяют зависимость слияния от содержания холестерина в мембране, но это никогда не было проверено на клетках млекопитающих. Для оболочечных вирусов, оболочечные белки вируса связываются со специфичными клеточными рецепторами и определяют клеточный тропизм и путь проникновения в клетки. В настоящее время общепринято, что псевдотипы используют механизм проникновения и путь донора оболочечиых белков, но не реплицируются, что позволяет изучать проникновение в клетки опасных вирусов в лабораториях с низким уровнем защиты. Использование хорошо изученных псевдотипов VSV (pH-зависимый вирус, использует клатрин-зависимый эндоцитоз) и MLV (pFI-независимый вирус, не нуждается в эндоцитозе и сливается с плазматической мембраной), позволяет оптимизировать метод измерения проникновения вируса и проверить метод на пригодность и чувствительность.

Целыо настоящей работы было изучение условий проникновения вируса ВЭЛ в клетки 293 НЕК человека.

Для достижения цели решались следующие задачи:

2. Проверить разработанный метод па псевдотипах VSV и MLV.

3. Получить нсевдотип ВВЭЛ и проверить его функциональность.

4. Адаптировать разработанный метод к ВВЭЛ псевдотипу.

5. На основании анализа люциферазной активности определить значение мембранного холестерина и ранних и поздних эндосом при проникновении ВВЭЛ в клетки.

Научная новизна работы

Впервые разработан метод наблюдения проникновения вируса в клетку в реальном времени. Показано, что связывание вируса является рецептор специфичным, так как положительный сигнал был получен только на клетках, экспрессирующих рецептор. Использование ингибиторов эндосомального закисления доказало пригодность разработанного метода для изучения эффекта ингибиторов на проникновение вирусов, причем эффект специфичен для каждого псевдотипа тестируемого вируса и зависит от используемого оболочечного белка.

Впервые получен ВВЭЛ исевдотип, обладающий высоким титром и несущий на своей поверхности нативпые оболочечные белки ВВЭЛ. Таким образом, псевдотип повторяет путь проникновения вируса дикого типа, что позволяет использовать его для определения факторов, необходимых для проникновения в клетки ВВЭЛ дикого типа. В результате данного исследования показана необходимость наличия функциональных поздних эндосом для эффективного проникновения ВВЭЛ в клетки, а также независимость проникновения ВВЭЛ от мембранного холестерина.

Научно-практическая значимость

Результаты, полученные при изучении способов проникновения вируса ВЭЛ в клетку хозяина, имеют существенное значение для фундаментальной науки. Исследование механизмов транспорта вирусных частиц через клеточную мембрану важно для современной биохимии, изучающей мембранный транспорт. Эта проблема позволяет также подойти к пониманию механизмов инфицирования, что важно для изучения природы самого вируса и вирусного патогенеза. Так. необходимость в функциональных поздних эндоеомах говорит о том, что для слияния вирусу нужен более низкий рН, либо ему необходимы дополнительные, неизвестные факторы, которые присутствуют в поздних эидосомах, такие, как протеазы, корецепторы, или изменение плотности рецептора. Показана независимость проникновения вируса ВЭЛ в клетки от мембраного холестерина, что говорит о наличии принципиальной разницы между такими близкородствспыми вирусами, как ВВЭЛ и БРУ.

Работа имеет также практическое значение, так как разработанный метод определения проникновения вируса в клетки в реальном времени позволяет определить точную кинетику этого процесса и ее изменение под действием различных факторов. Проведение измерений в реальном времени дает возможность выполнения эксперимента в присутствии токсичных ингибиторов на протяжении всего эксперимента. Разработанный метод позволяет также однозначно ответить на вопрос об эффекте ингибиторов на проникновение вируса в клетку. Это его выгодно отличает от классических экспериментов с инфицированием, где ингибитор добавляется в течение определенного времени, после чего удаляется, и вирус может проникать в клетку с задержкой, которой не будет видно на фойе продолжительной инфекции, что может быть причиной ложно негативного результата. Данный метод отражает специфические условия проникновения псевдотипированного вируса в зависимости от используемого оболочечного белка, что позволяет определять ключевые клеточные факторы, необходимые вирусу для инфицирования. Это дает возможность определять мишени для рационально разрабатываемых препаратов, что позволит в будущем создавать эффективные высоко специфичные противовирусные препараты.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Слияние люциферазы светлячка е оболочечным белком вируса обеспечивает специфичное включение фермента в вирусную частицу.

3. Разработанный метод отражает специфичное проникновение вируса в клетку, зависимое от оболочечного белка пссвдотипа.

4. Полученный псевдотип ВВЭЛ содержит оболочечпые белки вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей в нативной конформации и проникает в клетки по механизму, специфичному для ВВЭЛ.

5. Для проникновения вируса ВЭЛ в клетки требуется наличие функциональных поздних эпдосом.

6. Для слияния с клеткой ВВЭЛ не нуждается в мембранном холестерине.

Апробация работы:

Результаты работы были представленны и обсуждены на XXIII конференции Американского общества вирусологии (ASV), Montreal, Canada, 2004; На конференции регионального центра превосходства (RCE) в биозащите и возникающих инфекционных заболеваниях, Galveston, USA, 2004; на XXV конференции Американского общества вирусологии (ASV), Madison, Wisconsin, USA, 2006; на ежегодном коллоквиуме товарищества McL.aughlin. Galveston, USA, 2007.

Благодарности:

Автор выражает глубокую благодарность заведующей лабораторией молекулярных механизмов канцерогенеза, доктору биологических наук, Гуляевой Людмиле Федоровне и доктору биологических наук, профессору Robert Davey, за руководство работой на всех ее этапах.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Колокольцов, Андрей Алексеевич

ВЫВОДЫ

1. Присоединение люциферазы к С-концу оболочечного белка MLV вируса через линкерный пептид Glu-Phc обеспечивает эффективное включение люциферазы в вирусную частицу, что позволяет использовать эту конструкцию для измерения проникновения вируса в клетку в реальном времени.

2. Для проникновения вируса MLV в клетку необходим оболочечный белок дикого типа, так как добавление этою белка к белку, слитому с ферментом, приводит к получению интактпого вируса с целое гной мембраной и повышает его титр до титра вируса дикого типа.

3. Разработан новый, универсальный и чувствительный метод, с помощью которого подтверждено, что вирусы VSV и MLV входят в клетку через специфичный рецептор-зависимый механизм.

4. При использовании искусственного кодона инициации трансляции, который предшествовал открытой рамке считывания, кодирующей белки E3-EI, впервые получен псевдотип вируса ВЭЛ, имеющий высокий титр (I06 к.ф.е./мл) и несущий на своей поверхности нативные эпитопы, узнаваемые моноклональными антителами к вирусу дикою типа.

5. Впервые установлено, что присоединение люцифсразы к оболочсчному белку вируса ВЭЛ с помощью удлиненного полилинкера, состоящего из 3-х копий ПА-эпитопа, позволяет включить люциферазу в псевдотип вируса ВЭЛ. Добавление оболочечного белка дикого типа оказалось необходимым для получения вируса с ненарушенной мембраной и позволило количественно измерять проникновение ВЭЛ псевдотипа в клетку в реальном времени.

Заключение

В настоящей работе для измерения слияния вирусной и клеточной мембран разработан новый метод. Этот метод основан на идее, что люцифераза, заключенная внутри вирусной оболочки, остается неактивной до того момента, пока не произойдет слияния клеточной и вирусной мембран, а люциферазный субстрат (люциферин, АТР и кислород) не получит доступ к ферменту. Такой подход имеет большое преимущество по сравнению с предыдущими методами, которые нуждаются в добавлении флюоресцентных красителей к вирусной и/или клеточной мембране, обнаружении освобождения вирусного генетического материала и прямом микроскопическом обнаружении процессов слияния. Предложенный метод является высокочувствительным, позволяющим количественно измерять процессы ранней инфекции и обеспечивающим измерение кинетики в реальном времени процесса проникновения. Кинетика проникновения VSV и ВВЭЛ, измеренная данным способом, соответствует результатам, полученным для VSV, SFV и SINV общепринятым методом подавления флюоресценции флуорофора, половина времени проникновения которых составляло 15 мин (Blumenthal el al., 1987). Так как М01, использованное в наших экспериментах, было <1, по сравнению с 10-100 для методов подавления флюоресценции, то одинаковая кинетика говорит об отсутствии кооперативное™ в проникновении альфавирусов, когда проникновение одной вирусной частицы помогает проникновению другой вирусной частицы, например с помощью привлечения необходимых для слияния факторов.

Полученные результаты показали, что метод может быть использован для изучения проникновения вирусов со вторым классом оболочечных белков. Такие вирусы, включающие флавивирусы и альфавирусы, имеют оболочечные белки со структурой, драматично отличающейся от вирусов с первым классом оболочечных белков, таких как MLV, для которых изначально был разработан метод. Для адаптации метода к альфавирусам потребовалось изменить линкер соединяющий 3' конец Е1 гена

ВВЭЛ и 5' конец гена люциферазы на линкер, кодирующий 3 копии НА эпитопа. Использование нового линкера позволило получить частицы, изначально непроницаемые для субстратов люциферазы. Эффективность использования такого линкера доказало 10-кратное увеличение люциферазиой активности после лизиса частиц в детергенте. Дополнительным преимуществом использования такого пептида являлось определение экспрессии Е1 методом иммунохимического анализа белков е использованием коммерчески доступных моноклональиых антител против НА эпитопа. Суммируя вышесказанное, можно предположить, что для приложения метода к новым вирусам необходимо учитывать три важных фактора. Во-первых, пептид, присоединяющий люциферазу к оболочечиому белку, требует оптимизации в первую очередь длины, а возможно и состава аминокислотной последовательности. Во-вторых, после специфичного попадания люциферазы, слитой с оболочечным белком, в состав вирусной частицы, продукт слияния частично гидролизовывался неидентифицированными протеазами. высвобождая свободную люциферазу и оболочечный белок. Это, в свою очередь, давало несколько преимуществ: с одной стороны люцифераза специфично попадала в состав вирусной частицы, а с другой стороны, свободно отделялась от вирусной мембраны после слияния, тем самым попадая в ци топлазму, где и получала доступ к субс трату. В-третьих, при производстве вируса важно добавлять рскомбинаптиую env-luc конструкцию вместе с избытком конструкции env дикого типа в примерном соотношении 1:5. В одиночку env-luc приводит к формированию дефективных частиц, которые имеют низкий титр и могут быть проницаемы для люциферина. С учетом всех этих факторов систему можно использовать для измерения проникновения многих других типов оболочечных вирусов.

Еще одним важным аспектом изучения механизма проникновения вирусов является использование их псевдотипов. Такой подход имеет ряд преимуществ.

Так, псевдотипы не реплицируются, поэтому они безопасны и могут быть использованы в лабораториях с низким уровнем защиты. Оболочечные белки таких вирусов не адаптируются к культуре клеток, как это часто происходит в случае вирусов дикого типа. Адаптация делает проблематичным изучение рецепторов и, как следствие, путей проникновения вирусов дикою типа, так как рецептор зачастую определяет путь проникновения. Хорошо известна адаптация ВВЭЛ в культуре клеток к использованию гепарин сульфата в виде рецептора (Bernard et al., 2000). Еще одним важным преимуществом является возможность использования псевдотипов других вирусов в качестве контролен, так как они имеют идентичную сердцевину, но разные оболочечные белки. Это позволяет изучать взаимодействия с рецептором и проникновение вируса независимо от процессов, необходимых после проникновения, как, например, репликация вирусов.

К настоящему времени получено множество вирусных псевдотипов, и в каждом случае они повторяли тропизм вируса, являющегося донором оболочечпого белка. Псевдотип ВВЭЛ, полученный в настоящей работе, был тщательно охарактеризован с помощью нейтрализующих антител и ингибиторов проникновения. Показано, что он инфицировал клетки так же, как и родительский вирус. Кинетика проникновения ВВЭЛ псевдотипа была схожей с таковой для дикого типа, что подтверждает проникновение псевдотипа в клетку с помощью механизмов, идентичных вирусу дикого типа. Полученные данные указывают, что ВВЭЛ проникает в клетку очень быстро и достигает плато в течение 20 минут после контакта с клетками. Для всех вирусов, взятых в исследование, сигнал обнаруживался с 10 минутной задержкой. Гак как все измерения кинетики были произведены с использованием клеток, предварительно нагретых до 37°С, и вирус был связан с клетками в течение первой минуты, то задержка должна отражат ь важные процессы, необходимые для прохождения вируса.

Интересно отметить, что есо-МЬУ тоже имел задержку перед слиянием с клеткой. Так как этот вирус проникает в клетку через плазматическую мембрану, что делает его не зависимым от эндосомального транспорта, такая задержка предполагает либо необходимость активации нескольких рецепторов, либо проникновение в преэндосомальный мембранный микродомен. Факт, что экспрессия домипаптпо-негативных ЯаЬ5 и Ерэ 15 мутантов не оказывала влияния па проникновение есо-М1.У, говорит в пользу такого предположения.

Результаты по использованию ингибиторов эндосомального закисления показали, что ВВЭЛ проникает в клетки с помощью рН-зависимого механизма.

Каждый из использованных в работе ингибиторов проникновения: хлорид аммония, хлорохин, моненсин и Бафиломицин А1 блокировал развитие вирусной инфекции ВВЭЛ и УБУ псевдотипов, тогда как для есо-МЬУ эффекта не было.

Для более точного определения эндосомального пути, необходимого для проникновения ВВЭЛ и места его проникновения, была использована экспрессия доминантно негативных форм генов, ответственных за эндосомальный транспорт. Так как метод измеряет проникновение вируса в популяцию клеток, было важно получить равномерную экспрессию достаточного уровня в большинстве клеток. Для этой пели были использованы лентивируспые экспрессионные вектора, обеспечивающие стабильную интеграцию трапегепа I? клеточную хромосому, поячерживающие высокий уровень экспрессии с помощью сильных промоторов. Таким образом, с помощью изменения MOI можно тщательно контролировать уровень экспрессии трансгена и получать воспроизводимые результаты. Экспрессия доминантно негативных генов показала, что для проникновения ВВЭЛ, так же как и для VSV, необходим клатрин-зависимый эндоцитоз и формирование ранних эндосом. Однако ВВЭЛ отличался от VSV и от близкородственного SFV тем, что для пего было необходимым еще и функционирование поздних эндосом. что делает ВВЭЛ более похожим на вирус гриппа, нежели на SFV или VSV.

Различия могут быть обусловлены более низким рН, необходимым для слияния мембран, или зависимостью от вторичных факторов, присутствующих в поздних эндосомах. Вторым отличием от близкородственного SFV оказалась зависимость от холестерина. Ранее было показано, что слияние мембран альфавирусов Старого Света существенно зависит от холестерина и сфииголипидов в мембране клеток-мишеней (Lu el al., 1999; Phalen and Kiclian, 1991). Эти исследования были проведены с использованием искусственных мембран и клеток насекомых, в которых с помощью метил-(]-циклодекстриiia был удален холестерин. На клетках млекопитающих до сих пор подобных исследований не проводилось. Более того, был изолирован мутантный SFV, который оказался менее зависимым от холестерина. Аминокислотные замены, ответственные за чувствительность к холестерину, оказались в Е1 оболочечпом белке (Vashishtha el al., 1998). ВВЭЛ El оболочечный белок уже содержит аминокислотные остатки, которые предположительно дслаюг вирус нечувствительным к холестерину. Использование нистатина для связывания холестерина показало, что это вещество блокирует проникновение чувствительного к холестерину вируса Эбола (Empig and Goldsmith, 2002) и захват токсина холеры, который тоже является холестерин зависимым (Orlandi and Fishman, 1998). Проникновение SFV было также чувствительно к связыванию холестерина, хотя и в пс такой степени, как в случае с вирусом Эбола. Мы обнаружили, что проникновение ВВЭЛ было относительно независимо от холестерина. Этот вывод указывает па то, что результаты, полученные с использованием модельных мембран и клеток насекомых, применимы и к клеткам млекопитающих. Различия в чувствительности к холестерину могут отражать различия в композиции мембран пузырьков, с которыми вирус сливается, и из которых выходит в цитоплазму. Действительно, было показано, что поздние эндосомальные компартменты почти не содержат мембранного холестерина, в то время как ранние эндосомы и рециклинговые пузырьки обогащены холестерином (Kobayashi el al., 1998; Kobayashi el al., 2002). Роль холестерина в проникновении SFV может отражать необходимость выхода вируса из ранних эндосом, в то время как ВВЭЛ адаптировался к меньшему количеству холестерина из-за необходимости выхода из поздних эндосом, содержащих мало холестерина. В дополнение к рП, холестерин может обеспечивать для вируса новый механизм определения состояния эндосомального пузырька в процессе созревания для оптимизации условий вирусной репликации.

Помимо изучения условий проникновения вируса люциферазный метод был использован в диагностике вируса ВЭЛ по наличию нейтрализующих антител. В отличие от обычного теста на нейтрализующие антитела, который требует нескольких дней и использования опасного вируса дикого тина, люциферазный метод был относительно безопасен и давал возможность получения результатов в течение 2-х часов. Кроме скорости анализа, он был еще и очень удобен, благодаря наличию автоматизированных систем определения люциферазной активности. Разработанный метод также обладал схожей специфичностью и чувствительностью с обычным методом, основанным на подсчете вирусных бляшек (данные не приведены).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Колокольцов, Андрей Алексеевич, Новосибирск

1. Бондаренко Е. П., Протопопова Е. В. Суровцев И. В., Швалов А. Н., Локтев В. Б. (20046) Ингибирование репликации вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей поликлональными антителами к ламининсвязывающему белку. Вопросы вирусологии,5,32-37.

2. Acheson, N. П. and Tamrn, 1. (1967) Replication of Semliki Forest virus: an electron microscopic study. Virology, 32, 128-143.

3. Alexandrov. K„ Horiuchi, I I., Steele-Mortimer, O., Seabra, M. C. and Zerial, M. (1994) Rab escort protein-1 is a multifunctional protein that accompanies newly prenylatcd rab proteins to their target membranes. Embo J, 13, 5262-5273.

4. Ali, B. R., Wasmcier, C. Lamorcux, L, Strom. M. and Scabra, M. C. (2004) Multiple regions contribute to membrane targeting of Rab GTPases. J Cell Sci, 117, 6401-6412.

5. Andersen, К. B. and Nexo, B. A. (1983) Entry of murine retrovirus into mouse fibroblasts. Virology, 125, 85-98.

6. Anderson, H. A., Chen, Y. and Norkin, L C. (1996) Bound simian virus 40 translocates to caveolin-enriched membrane domains, and its entry is inhibited by drugs that selectively disrupt eaveolae. Molecular Biology Of The Cell, 7, 1825-1834.

7. Aridor, M. and Traub, L. M. (2002) Cargo selection in vesicular transport: the making and breaking of a coat. Traffic, 3, 537-546.

8. Barbieri, M. A., Roberts, R. L„ Mukhopadhyay, A. and Stahl, P. D. (1996) Rab5 regulates the dynamics of early endosome fusion. Bioccll, 20, 331-338.

9. Barth, B. U., Wahlberg, J. M. and Garoff. I I. (1995) The oligomerization reaction of the Semliki Forest virus membrane protein subunits. .1 Cell Biol, 128, 283-291.

10. Benmerah, A., Bayrou, M., Cerf-Bensussan, N. and Dautry-Varsat, A. (1999) Inhibition of clathrin-coated pit assembly by an Epsl5 mutant. J Cell Sci, 112 ( Pt 9), 1303-1311.

11. Bergcr, E. A., Murphy, P. M. and Farber, J. M. (1999) Chemokine receptors as IIIV-1 coreceptors: roles in viral entry, tropism, and disease. Annual Review Of Immunology, 17,657-700.

12. Bernard, K. A., Klimstra, W. B. and Johnston, R. E. (2000) Mutations in the E2 glycoprotein of Venezuelan equine encephalitis virus confer heparan sulfate interaction, low morbidity, and rapid clearance from blood of mice. Virology, 276, 93-103.

13. Bernard, K. A., Klimstra, W. B. and Johnston, R. E. (2000) Mutations in the E2 glycoprotein of Venezuelan equine encephalitis virus confer heparan sulfate interaction, low morbidity, and rapid clearance from blood of mice. Virology, 276, 93-103.

14. Blumenthal, R., Bali-Puri, A., Walter, A., Covell, D. and Eidelman, O. (1987) pH-dependent fusion of vesicular stomatitis virus with Vcro cells. Measurement by dequenching of octadecyl rhodamine fluorescence. J Biol Chem, 262, 13614-13619.

15. Bock, J. B., Matern, II. T„ Peden, A. A. and Scheller, R. H. (2001) A genomic perspective on membrane compartment organization. Nature, 409, 839-841.

16. Brault, A. C., Powers, A. M. and Weaver, S. C. (2002) Vector infection determinants of Venezuelan equine encephalitis virus reside within the E2 envelope glycoprotein. J Virol, 76,6387-6392.

17. Brown, D. A. and London, F. (1998) Structure and origin of ordered lipid domains in biological membranes. J Membr Biol, 164, 103-114.

18. Brown, D. A. and London, E. (2000) Structure and function of sphingolipid- and cholesterol-rich membrane rafts. J Biol Chem, 275, 17221-17224.

19. Bucci, C., Thomsen, P., Nicoziani, P., McCarthy, J. and van Deurs, B. (2000) Rab7: a key to Iysosome biogenesis. Mol Biol Cell, 11,467-480.

20. Byrnes, A. P. and Griffin, D. E. (2000) Large-plaque mutants of Sindbis virus show reduced binding to heparan sulfate, heightened viremia, and slower clearance from the circulation. Journal Of Virology, 74, 644-651.

21. Callaghan, J., Nixon, S. Bucci, C. Toh, B. II. and Stenmark, H. (1999) Direct interaction of EEAI with Rab5b. European journal of biochemistry / FEBS, 265, 361366.

22. Campadelli-Fiume, G., Cocchi, F. Mcnotti, L. and Lopez, M. (2000) The novel receptors that mediate the entry of herpes simplex viruses and animal alphaherpesviruses into cells. Rev Med Virol, 10,305-319.

23. Canonieo, P. G., Kendc, M., Luscri, B. J. and Muggins, J. W. (1984) In-vivo activity of antivirals against exotic RNA viral infections. J Antimicrob Chemother, 14 Suppl A, 2741.

24. Cantalupo, G., Alifano, P., Roberti, V., Bruni, C. B. and Bucci, C. (2001) Rab-interacting lysosomal protein (RILP): the Rab7 effector required for transport to lysosomes. Embo J, 20, 683-693.

25. Carbonc, R., Fre, S., Iannolo, G., Belleudi, F., Mancini, P., Pclicci, P. G., Torrisi, M. R. and Di Fiore, P. P. (1997) epsl 5 and epsI5R are essential components of the endocytic pathway. Cancer Res, 57, 5498-5504.

26. Cavrois, M., De Noronha, C. and Greene, W. C. (2002) A sensitive and specific enzyme-based assay detecting III V-1 virion fusion in primary T lymphocytes. Nat Biotechnol, 20, 1151-1154.

27. Ceresa, B. P. and Schmid, S. L. (2000) Regulation of signal transduction by endocytosis. CurrOpin Cell Biol, 12, 204-210.

28. Chamberlain, R. W„ Sudia, W. D„ Coleman, P. H. and Work, T. H. (1964) Venezuelan Equine Encephalitis Virus from South Florida. Science, 145, 272-274.

29. Chandran, K„ Sullivan, N. J. Felbor, U„ Whelan, S. P. and Cunningham, J. M. (2005) Endosomal proteolysis of the Ebola virus glycoprotein is necessary for infection. Science, 308, 1643-1645.

30. Chang, H. C., Newmyer, S. L, Hull, M. J., Ebersold, M., Schmid, S. L. and Mellnian, I. (2002) Hsc70 is required for endoeytosis and elathrin function in Drosophila. J Cell Biol, 159,477-487.

31. Chavrier, P., Parton, R. G., Hauri, H. P., Simons, K. and Zerial, M. (1990) Localization of low molecular weight GTP binding proteins to exocytic and endocytic compartments. Cell, 62, 317-329.

32. Chen, C. and Okayama, H. (1987) High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol Cell Biol, 7, 2745-2752.

33. Chen, II., Fre, S., Slepnev, V. I., Capua, M. R., Takei, K„ Butler, M. H„ Di Fiore, P. P. and De Camilli, P. (1998) Epsin is an EH-doniain-binding protein implicated in clathrin-mediated endoeytosis. Nature, 394, 793-797.

34. Chin, L. S., Raynor, M. C„ Wei, X., Chen, II. Q. and Li, L. (2001) Hrs interacts with sorting nexin 1 and regulates degradation of epidermal growth factor receptor. J Biol Chem, 276, 7069-7078.

35. Conner, S. D. and Schmid, S. L. (2003) Regulated portals of entry into the cell. Nature, 422, 37-44.

36. Craig, F. F., Snnmonds, A. C., Watmore, D„ McCapra, F. and White, M. R. (1991) Membrane-permeable luciferin esters for assay of firefly luciferase in live intact cells. Biochem J, 276 ( Pt 3), 637-641.

37. Cupers, P., ler Haar. E., Boll, W. and Kirchhausen, T. (1997) Parallel diniers and antiparallel tetraniers formed by epidermal growth factor receptor pathway substrate clone 15. J Biol Chem, 272, 33430-33434.

38. Daecke, J., Fackler, O. T., Dittmar, M. T. and Krausslich, II. G. (2005) Involvement of clathrin-mediated endoeytosis in human immunodeficiency virus type 1 entry. J Virol, 79,1581-1594.

39. Desjardins, M., Huber, L. A., Parton, R. G. and Griffiths, G. (1994) Biogenesis of phagolysosomes proceeds through a sequential scries of interactions with the endocytic apparatus. J Cell Biol, 124, 677-688.

40. Di Fiore, P. P. and De Camilli. P. (2001) Endoeytosis and signaling, an inseparable partnership. Cell, 106, 1-4.

41. Di Fiore, P. P. and Gill, G. N. (1999) Endoeytosis and mitogenic signaling. Curr Opin Cell Biol, 11,483-488.

42. Dirac-Svejstrup, A. B„ Soldati, T., Shapiro, A. D. and Pfeffer, S. R. (1994) Rab-GDI presents functional Rab9 to the intracellular transport machinery and contributes selectivity to Rab9 membrane recruitment. J Biol Chem, 269, 15427-15430.

43. Dirac-Svejstrup, A. B„ Suniizawa, T. and Pfeffer, S. R. (1997) Identification of a GDI displacement factor that releases endosomal Rab GTPases from Rab-GDI. Embo J, 16, 465-472.

44. Dohner, K. and Sodeik, B. (2005) The role of the cytoskelelon during viral infection. Current Topics In Microbiology And Immunology, 285, 67-108.

45. Doxsey, S. J., Brodsky, F. M., Blank, G. S. and Helenius, A. (1987) Inhibition of endoeytosis by anti-clalhrin antibodies. Cell, 50, 453-463.

46. Drake, M. T., Downs, M. A. and Traub, L M. (2000) Epsin binds to clathrin by associating directly with the clathrin-terminal domain. Evidence for cooperative binding through two discrete sites. J Biol Chem, 275, 6479-6489.

47. Earp, L. J., Delos, S. E., Netter, R. C„ Bates, P. and White, J. M. (2003) The avian retrovirus avian sarcoma/lcukosis virus subtype A reaches the lipid mixing stage of fusion at neutral pi I. J Virol, 77, 3058-3066.

48. Ebert, D. H„ Deussing, J., Peters, C. and Dermody, T. S. (2002) Cathepsin L and cathepsin B mediate reovirus disassembly in murine fibroblast cells. The Journal Of Biological Chemistry, 277, 24609-24617.

49. Ehrlich, M., Boll, W., van Oijen, A., Hariharan, R., Chandran, K., Nibert, M. L. and Kirchhausen, T. (2004) Endocytosis by Random Initiation and Stabilization of Clathrin-Coated Pits. Cell, 118, 591-605.

50. Empig, C. J. and Goldsmith, M. A. (2002) Association of the caveola vesicular system with cellular entry by filoviruscs. J Virol, 76, 5266-5270.

51. Fackler, O. T. and Peterlin, B. M. (2000) Endocytic entry of HIV-1. Curr Biol, 10, 10051008.

52. Feng, Y., Press, B. and Wandinger-Ness, A. (1995) Rab 7: an important regulator of late endocytic membrane traffic. J Cell Biol, 131, 1435-1452.

53. Feng, Y., Press, B., Chen, W., Zimmerman, J. and Wandinger-Ness, A. (2001) Expression and properties of Rab7 in endosome function. Methods Enzymol. 329, 175187.

54. Foster, L. J., De Hoog, C. L. and Mann, M. (2003) Unbiased quantitative proteomics of lipid rafts reveals high specilicity for signaling factors. Proc Natl Acad Sci U S A, 100, 5813-5818.

55. Fra, A. M., Williamson, E., Simons, K. and Parton, R. G. (1995) De novo formation of caveolac in lymphocytes by expression of VIP21-caveolin. Proc Natl Acad Sci U S A. 92,8655-8659.

56. Fredericksen, B. L., Wei, B. L„ Yao, J., Luo, T. and Garcia, J. V. (2002) Inhibition of endosomal/lysosomal degradation increases the infectivity of human immunodeficicncy virus. J Virol, 76, 11440-11446.

57. Frolov, I., Frolova, E. and Schlcsinger, S. (1997) Sindbis virus replicons and Sindbis virus: assembly of chimeras and of particles deficient in virus RNA. J Virol. 71, 28192829.

58. Ganley, I. G„ Carroll, K. Bittova. L. and Pfeffer, S. (2004) Rab9 GTPase regulates late endosome size and requires effector interaction for its stability. Mol Biol Cell, 15, 54205430.

59. Garner, J. A. (2003) Herpes simplex virion entry into and intracellular transport within mammalian cells. Advanced Drug Delivery Reviews, 55, 1497-1513.

60. Garoff, H., Sjoberg, M. and Cheng, R. H. (2004) Budding of alphaviruses. Virus Res, 106, 103-116.

61. Gaullier, J. M., Simonsen, A. D'Arrigo, A., Bremnes, B., Stenmark, Fl. and Aasland, R. (1998) FYVE fingers bind PtdIns(3)P. Nature, 394,432-433.

62. Gilbert, J. M. and Benjamin, T. L. (2000) Early steps of polyomavirus entry into cells. Journal Of Virology, 74, 8582-8588.

63. Glickman, J. N., Conibear, E. and Pearse, B. M. (1989) Specificity of binding of clathrin adaptors to signals on the mannose-6-phosphate/insulin-like growth factor 11 receptor. Embo J, 8, 1041-1047.

64. Gorvel, J. P., Chavrier, P., Zerial, M. and Gruenberg, J. (1991) rab5 controls early endosome fusion in vitro. Cell, 64,915-925.

65. Green, J., Griffiths, G., Louvard, D., Quinn, P. and Warren, G. (1981) Passage of viral membrane proteins through the Golgi complex. J Mol Biol, 152, 663-698.

66. Greenberg, S. (1995) Signal transduction of phagocytosis. Trends Cell Biol, 5, 93-99.

67. Greenberg, S., Chang, P. and Silverstein, S. C. (1993) Tyrosine phosphorylation is required for Fc rcceptor-niediated phagocytosis in mouse macrophages. J Exp Med, 177, 529-534.

68. Greenberg, S., Chang, lJ. and Silverstein, S. C. (1994) Tyrosine phosphorylation of the gamma subunit of Fc gamma rcceptors, p72syk, and paxillin during Fc receptor-mediated phagocytosis in macrophages. J Biol Chem, 269, 3897-3902.

69. Greenberg, S„ Chang, P., Wang, D. C„ Xavier, R. and Seed, B. (1996) Clustered syk tyrosine kinase domains trigger phagocytosis. Proc Natl Acad Sci USA. 93, 1103-1107.

70. Greene, B., Liu, S. H„ Wilde, A. and Brodsky, F. M. (2000) Complete reconstitution of clathrin basket formation with recombinant protein fragments: adaptor control ofclathrin self-assembly. Traffic, 1, 69-75.

71. Gruenberg, J. and Maxficld, F. R. (1995) Membrane transport in the endocytic pathway. CurrOpin Cell Biol, 7, 552-563.

72. Harder, T. and Simons, K. (1997) Caveolae, DIGs, and the dynamics of sphingolipid-cholesterol microdomains. Curr Opin Cell Biol, 9, 534-542.

73. Harding, C. V. and Geuze, II. J. (1992) Class II MHC molecules arc present in macrophage lysosomes and phagolysosomes that function in the phagocytic processing of Listeria monocytogenes for presentation to T cells. J Cell Biol, 119,531-542.

74. Hawley, R. J. and Eitzen, E. M., Jr. (2001) Biological weapons-a primer for microbiologists. Annu Rev Microbiol, 55. 235-253.

75. Helenius, A., Kartenbeck, J„ Simons. K. and Fries, F. (1980) On the entry of Semliki forest virus into BI IK-21 cells. .1 Cell Biol, 84, 404-420.

76. Helenius, A., Mellman, I. Wall, D. and Hubbard. A. (1983) Endosomes. Trends in Biochemical Sciences, 8, 245-250.

77. Hofmann, K. and Falquet, L. (2001) A ubiquitin-interacting motif conserved in components of the protcasonial and lysosomal protein degradation systems. Trends Biochem Sci, 26, 347-350.

78. Hogle, J. M. (2002) Poliovirus cell entry: common structural themes in viral cell entry pathways. Annual Review Of Microbiology, 56, 677-702.

79. Hu, Y., Chuang, J. Z., Xu, K„ McGraw, T. G. and Sung, C. H. (2002) SARA, a FYVE domain protein, affects Rab5-mediated endocytosis. .1 Cell Sci, 115,4755-4763.

80. Hunziker, W., Harter, C„ Matter, K. and Mellman, I. (1991) Basolateral sorting in MDCK cells requires a distinct cytoplasmic domain determinant. Cell, 66, 907-920.

81. Hutt, D. M„ Da-Silva, L. F„ Chang, L. II., Prosser, D. C. and Ngsce, J. K. (2000) PRA1 inhibits the extraction of membrane-bound rab GTPase by GDI I. J Biol Chem, 275, 18511-18519.

82. Itoh, T., Koshiba, S., Kigawa, T., Kikuchi, A., Yokoyama, S. and Takenawa, T". (2001) Role of the ENTH domain in phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate binding and endocytosis. Science. 291. 1047-1051.

83. Jekely, G. and Rorth, P. (2003) Hrs mediates downregulation of multiple signalling receptors in Drosophila. EMBO reports, 4, 1163-1168.

84. Jin, M., Park, J., Lee, S„ Park, B„ Shin, J., Song, K. J., Ahn, T. I., Hwang, S. Y„ Ahn, B. Y. and Ahn, K. (2002) Hantaan virus enters cells by clathrin-dependent receptor-mediated endocytosis. Virology, 294, 60-69.

85. Johnson, K. M., Shelokov, A., Peralta, P. II., Dammin, G. J. and Young, N. A. (1968) Recovery of Venezuelan equine encephalomyelitis virus in Panama. A fatal case in man. Am J Trop Med Hyg, 17, 432-440.

86. Joiner, K. A., Fuhrman, S. A., Miettinen, H. M„ Kasper, L. I I. and Mellman, I. (1990) Toxoplasma gondii: fusion competence of parasitophorous vacuoles in Fc receptor-transfected fibroblasts. Science, 249, 641-646.

87. Kalthoff, C„ Alves, J., Urbanke, C„ Knorr, R. and Ungewickell, E. J. (2002) Unusual structural organization of the endocytic proteins API 80 and epsin 1. J Biol Cliem, 277, 8209-8216.

88. Kasamatsu, H. and Nakanishi, A. (1998) How do animal DNA viruses get to the nucleus? Annual Review Of Microbiology, 52, 627-686.

89. Khosravi-Far, R., Clark, G. J., Abe. K. Cox. A. D., McLain, T„ Lutz, R. J., Sinensky, M. and Der, C. J. (1992) Ras (CXXX) and Rab (CC/CXC) prenylation signal sequences are unique and functionally distinct. J Biol Cliem. 267, 24363-24368.

90. Kielian, M. C. and Cohn, Z. A. (1980) Phagosome-lysosome fusion. Characterization of intracellular membrane fusion in mouse macrophages. J Cell Biol. 85, 754-765.

91. Kielian, M. C. and Helenius, A. (1984) Role of cholesterol in fusion of Semliki Forest virus with membranes. J Virol, 52, 281-283.

92. Klimstra, W. B., Ryman, K. D. and Johnston, R. E. (1998) Adaptation of Sindbis virus to BHK cells selects for use of heparan sulfate as an attachment receptor. Journal Of Virology, 72, 7357-7366.

93. Laemmli, U. K. (1970) Cleavage ofstructural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227. 680-685.

94. Lakadamyali, M., Rust, M. J., Babcock, II. P. and Zhuang, X. (2003) Visualizing infection of individual influenza viruses. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America, 100, 9280-9285.

95. Lamaze, C., Dujeancourt, A., Baba, T., Lo, C. G., Benmerah, A. and Dautry-Varsat, A. (2001) Interleukin 2 receptors and detergent-resistant membrane domains define a clathrin-independent endocytic pathway. Mol Cell, 7, 661-671.

96. Lamb, R. A. (1993) Paramyxovirus fusion: a hypothesis for changes. Virology, 197, 11.

97. Lanzetti, L., Rybin, V., Malabarba, M. G., Christoforidis, S., Scita, G., Zerial, M. and Di Fiore, P. P. (2000) The Eps8 protein coordinates EGF receptor signalling through Rac and trafficking through Rab5. Nature, 408, 374-377.

98. Le Blanc, L, Luyet, P.-P., Pons, V., Ferguson, C., Emans, N., Petiot, A., Mayran, N., Demaurex, N., Faure, J. and Sadoul et, a. (2005) Endosonie-to-cytosol transport of viral nucleocapsids. Nature Cell Biology, 7, 653-664.

99. Le, P. U. and Nabi, 1. R. (2003) Distinct caveolae-niediated cndocytic pathways target the Golgi apparatus and the endoplasmic reticulum. J Cell Sci, 116, 1059-1071.

100. Le, P. U., Guay, G., Altschuler. Y. and Nabi, I. R. (2002) Caveolin-1 is a negative regulator of caveolae-mediated cndocytosis to the endoplasmic reticulum. J Biol Chem, 277,3371-3379.

101. Lee, S„ Zhao, Y. and Anderson, W. F. (1999) Receptor-mediated Moloney murine leukemia virus entry can occur independently of the clathrin-coated-pit-mediated endocytic pathway. J Virol, 73, 5994-6005.

102. Levy-Mintz, P. and Kielian, M. (1991) Mutagenesis of the putative fusion domain of the Semliki Forest virus spike protein. J Virol, 65. 4292-4300.

103. Lisanti, M. P., Tang, Z. L. and Sargiaconio, M. (1993) Caveolin forms a hetero-oligomeric protein complex that interacts with an apical GPI-linked protein: implications for the biogenesis of caveolae. .1 Cell Biol, 123, 595-604.

104. Liu, P., Rudick, M. and Anderson, R. G. (2002) Multiple functions of caveolin-1. J Biol Chem, 277,41295-41298.

105. Liu, S. II., Wong, M. L, Craik, C. S. and Brodsky, F. M. (1995) Regulation of clathrin assembly and trimerization defined using recombinant triskclion hubs. Cell, 83, 257-267.

106. Lloyd, T. E., Atkinson, R„ Wu, M. N„ Zhou, Y„ Pennetta, G. and Bellen, H. J. (2002) Firs regulates cndosome membrane invagination and tyrosine kinase receptor signaling in Drosophila. Cell, 108, 261-269.

107. Lu, Y. E., Cassese, T. and Kielian, M. (1999) The cholesterol requirement for sindbis virus entry and exit and characterization of a spike protein region involved in cholesterol dependence. J Virol, 73,4272-4278.

108. Ludwig, G. V., Kondig, J. P. and Smith, J. F. (1996) A putative receptor for Venezuelan equine encephalitis virus from mosquito cells. J Virol, 70, 5592-5599.

109. Machleidt, T., Li, W. P., Liu, P. and Anderson, R. G. (2000) Multiple domains in caveolin-1 control its intracellular traffic. J Cell Biol, 148, 17-28.

110. Marechal, V., Prevost, M. C„ Petit, C„ Perret, E., Heard, J. M. and Schwartz, O. (2001) Human immunodeficiency virus type 1 entry into macrophages mediated by macropinocytosis. J Virol, 75, 11166-11177.

111. Marsh, M. and Flelenius, A. (1989) Virus entry into animal cells. Advances In Virus Research, 36, 107-151.

112. McBride, H. M., Rybin, V., Murphy, C„ Giner, A., Teasdale, R. and Zerial, M. (1999) Oligomeric complexes link Rab5 effectors with NSF and drive membrane fusion via interactions between EEA1 and syntaxin 13. Cell, 98, 377-386.

113. McClure, M. 0., Sommcrfelt, M. A., Marsh, M. and Weiss, R. A. (1990) The pH independence of mammalian retrovirus infection. J Gen Virol, 71 ( Pt 4), 767-773.

114. McDonald, D., Vodicka, M. A., Lucero, G., Svitkina, T. M., Borisy, G. G. Emerman, M. and Hope, T. J. (2002) Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells. J Cell Biol, 159,441-452.

115. Meier, 0., Boucke, K., Hammer, S. V., Keller, S„ Stidwill, R. P., Henimi, S. and Grebcr, U. F. (2002) Adenovirus triggers macropinocytosis and endosonial leakage together with its clathrin-mediated uptake. J Cell Biol, 158, 1119-1131.

116. Meier, O., Boucke, K„ Hammer, S. V., Keller, S„ Stidwill, R. P., Henimi. S. and Greber, U. F. (2002) Adenovirus triggers macropinocytosis and endosonial leakage together with its clathrin-mediated uptake. J Cell Biol, 158, 1119-1131.

117. Melancon, P. and Garoff, H. (1987) Processing of the Semliki Forest virus structural polyprotein: role of the capsid protease. J Virol, 61, 1301-1309.

118. Mellman, I. (1996) Endocytosis and molecular sorting. Annu Rev Cell Dev Biol, 12, 575-625.

119. Mellnian, I. S„ Plutner, 11., Steinman, R. M„ Unkeless, J. C. and Colin, Z. A. (1983) Internalization and degradation of macrophage Fc receptors during rcccptor-mediated phagocytosis. J Cell Biol, 96, 887-895.

120. Mettenleitcr, T. C. (2002) Brief overview on cellular virus receptors. Virus Res, 82, 3-8.

121. Mettenleiter, T. C. (2002) Brief overview on cellular virus receptors. Virus Res, 82, 3-8.

122. Mishra, S. K., Keyel, P. A., 1 lawryluk, M. J., Agostinelli, N. R., Watkins, S. C. and Traub, L. M. (2002) Disabled-2 exhibits the properties of a cargo-selective endocytic clathrin adaptor. Embo J, 21, 4915-4926.

123. Monier, S„ Parton, R. G., Vogcl, F., Belilke, J., Henske, A. and Kurzchalia, T. V. (1995) VIP2l-caveolin, a membrane protein constituent of the caveolar coat, oligomerizes in vivo and in vitro. Mol Biol Cell, 6, 911-927.

124. Morris, S. M. and Cooper, J. A. (2001) Disabled-2 colocalizes with the LDLR in clathrin-coated pits and interacts with AP-2. Traffic, 2, 111-123.

125. Mothes, W., Boerger, A. L., Narayan, S., Cunningham, J. M. and Young, J. A. (2000a) Retroviral entry mediated by rcceptor priming and low pH triggering of an envelope glycoprotein. Cell, 103, 679-689.

126. Mothes, W., Boerger, A. L., Narayan, S., Cunningham, J. M. and Young, J. A. T. (2000b) Retroviral Entry Mediated by Receptor Priming and Low pll Triggering of an Envelope Glycoprotein. Cell, 103, 679-689.

127. Muller, W. A., Steinman, R. M. and Cohn, Z. A. (1983) Membrane proteins of the vacuolar system. III. Further studies on the composition and recycling of endocytic vacuole membrane in cultured macrophages. J Cell Biol, 96, 29-36.

128. Mundy, D. I., Maehleidt, T„ Ying, Y. S„ Anderson, R. G. and Bloom, G. S. (2002) Dual control of caveolar membrane traffic by microtubules and the actin cytoskeleton. J Cell Sci, 115,4327-4339.

129. Murata, M., Peranen, J., Sehreiner, R., Wieland, F., Kurzchalia, T. V. and Simons, K. (1995) VIP21/caveolin is a cholesterol-binding protein. Proc Natl Acad Sci USA, 92, 10339-10343.

130. Nabi, I. R. and Lc, P. U. (2003) Caveolae/raft-dependent endocytosis. J Cell Biol, 161, 673-677.

131. Naldini, L., Blomer, U., Gage, F. H„ Trono, D. and Verma, I. M. (1996) Efficient transfer, integration, and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector. Proc Natl Acad Sci USA, 93, 11382-11388.

132. Naslavsky, N., Boehm, M., Backlund, P. S., Jr. and Caplan, S. (2004) Rabenosyn-5 and EHD1 interact and sequentially regulate protein recycling to the plasma membrane. Mol Biol Cell, 15,2410-2422.

133. Nemerow, G. R. (2000) Cell receptors involved in adenovirus entry. Virology, 274, 1-4.

134. Nichols, B. J. (2002) A distinct class of endosome mediates clathrin-independent endocytosis to the Golgi complex. Nat Cell Biol, 4, 374-378.

135. Nichols, B. J. and Lippincotl-Schwartz, .1. (2001) Endocytosis without clathrin coats. Trends Cell Biol, 11,406-412.

136. Nichols, B. J., Kenworthy, A. K„ Polishchuk, R. S„ Eodge, R„ Roberts, T. H„ Hirschberg, K., Phair, R. D. and Lippineott-Schwartz, .1. (2001) Rapid cycling of lipid raft markers between the cell surface and Golgi complex. J Cell Biol, 153, 529-541.

137. Nossal, R. (2001) Energetics of clathrin basket assembly. Traffic, 2, 138-147.

138. Oldstone, M. B., Ilomann, D„ Lewicki, 11. and Stevenson, D. (2002) One, two, or three step: measles virus receptor dance. Virology, 299, 162-163.

139. Oleinikov, A. V., Zhao, J. and Makker, S. P. (2000) Cytosolic adaptor protein Dab2 is an intracellular Iigand of endocytic rcccptor gp600/megalin. Biochem J, 347 Pt 3, 613-621.

140. Olkkonen, V. M. and Stcnmark, H. (1997) Role of Rab GTPases in membrane traffic. Int Rev Cytol, 176, 1-85.

141. Orlandi, P. A. and Fishman, P. H. (1998) Filipin-depcndent inhibition of cholera toxin: evidence for toxin internalization and activation through caveolae-like domains. J Cell Biol, 141,905-915.

142. Owen, D. J. (2004) Linking endocytic cargo to clathrin: structural and functional insights into coated vesicle formation. Biochem Soc Trans. 32, 1-14.

143. Owen, D. J., Vallis, Y. Noble, M. E„ Hunter, J. B., Daflbrn, T. R„ Evans, P. R. and McMahon, I I. T. (1999) A structural explanation for the binding of multiple ligands by the alpha-adaptin appendage domain. Cell, 97, 805-815.

144. Pagano, A., Crottet, P., Prescianotto-Baschong, C. and Spiess, M. (2004) In vitro formation of recycling vesicles from endosomes requires adaptor protein-1/clathrin and is regulated by rab4 and the connector rabaptin-5. Mol Biol Cell, 15, 4990-5000.

145. Page, L. J. and Robinson, M. S. (1995) Targeting signals and subunit interactions in coated vesicle adaptor complexes. J Cell Biol, 131,619-630.

146. Paredes, A., Alwell-Warda, K„ Weaver, S. C., Cliiu, W. and Watowich, S. .1. (2001) Venezuelan equine encephalomyelitis virus structure and its divergence from old world alphaviruses. J Virol, 75, 9532-9537.

147. Paredes, A., Weaver, S., Watowich, S. and Chiu, W. (2005) Structural biology of old world and new world alphaviruses. Archives of virology, 179-185.

148. Parker, J. S. and Parrish, C. R. (2000) Cellular uptake and infection by canine parvovirus involves rapid dynamin-regulated clathrin-mediated endocytosis, followed by slower intracellular trafficking. J Virol, 74, 1919-1930.

149. Parton, R. G. (1996) Caveolae and cavcolins. Curr Opin Cell Biol, 8, 542-548.

150. Parton, R. G. and Richards, A. A. (2003) Lipid rafts and caveolae as portals for endocytosis: new insights and common mcchanisms. Traffic, 4, 724-738.

151. Parton, R. G., Joggcrst, B. and Simons, K. (1994a) Regulated internalization ofcavcolae. The Journal Of Cell Biology, 127, 1199-1215.

152. Parton, R. G., Joggerst, B. and Simons, K. (1994b) Regulated internalization of caveolae. J Cell Biol, 127, 1199-1215.

153. Paternostre, M. T„ Lowy, R. J. and Blumenthal, R. (1989) pH-dependent fusion of reconstituted vesicular stomatitis virus envelopes with Vero cells. Measurement by dequenching of fluorescence. FEBS Lett, 243, 251-258.

154. Pearse, B. M. (1988) Receptors compete for adaptors found in plasma membrane coated pits. EmboJ, 7,3331-3336.

155. Pearse, B. M. F., Smith, C. J. and Owen, D. J. (2000) Clathrin coat construction in endocytosis. Current Opinion in Structural Biology, 10, 220-228.

156. Pelkmans, L. and Helenius, A. (2002) Endocytosis via caveolae. Traffic, 3, 311-320.

157. Pelkmans, L., Fava, E„ Grabner, H., Hannus, M. Habermann, B., Krausz, E. and Zerial, M. (2005) Genome-wide analysis of human kinases in clathrin- and caveolae/raft-mediated endocytosis. Nature, 436, 78-86.

158. Pelkmans, L., Kartenbeck, J. and Helenius, A. (2001) Caveolar endocytosis of simian virus 40 reveals a new two-step vesicular-transport pathway to the ER. Nat Cell Biol, 3, 473-483.

159. Pelkmans, L., Puntencr, D. and Helenius. A. (2002) Local actin polymerization and dynaniin recruitment in SV40-induced internalization of caveolae. Science, 296, 535539.

160. Peter, M., Chavrier, P., Nigg, E. A. and Zerial. M. (1992) Isoprenylation of rab proteins on structurally distinct cysteine motifs. J Cell Sci, 102 ( Pt 4), 857-865.

161. Petiot, A., Faure, J., Stenmark, H. and Gruenberg, J. (2003) PI3P signaling regulates receptor sorting but not transport in the cndosomal pathway. .1 Cell Biol, 162, 971-979.

162. Pfeffer, S. and Aivazian, D. (2004) Targeting Rab GTPases to distinct membrane compartments. Nat Rev Mol Cell Biol, 5, 886-896.

163. Pfeffer, S. R. (2001) Rab GTPases: specifying and deciphering organelle identity and function. Trends Cell Biol, 11, 487-491.

164. Pfeifer, J. D„ Wick, M. J., Harding, C. V. and Normark, S. J. (1993) Processing of defined T-cell epitopes after phagocytosis of intact bacteria by macrophages. Infect Agents Dis, 2, 249-254.

165. Pietiainen, V., Marjomaki, V. Upla, P., Pelkmans, L., Helenius, A. and Hyypia, T. (2004) Echovirus 1 endocytosis into caveosonies requires lipid rafts, dynamin II, and signaling events. Molecular Biology Of The Cell, 15, 4911-4925.

166. Prior, I. A., Harding, A., Yan, .1. Sluimer, J., Parton. R. G. and Hancock, J. F. (2001) GTP-dcpendent segregation of H-ras from lipid rafts is required for biological activity. Nat Cell Biol, 3,368-375.

167. Que, X., Kim, D., Alagon, A., l lirata, K., Shike, H., Shimizu, C., Gonzalez, A., Burns, J. C. and Reed, S. L. (1999) Pantropic retroviral vectors mediate gene transfer and expression in Entamoeba histolytica. Mol Biochem Parasitol, 99, 237-245.

168. Rabinowitz, S., Horstmann, 11., Gordon, S. and Griffiths, G. (1992) Immunocytochemical characterization of the endocytic and phagolysosomal compartments in peritoneal macrophages. J Cell Biol, 116. 95-112.

169. Racaniello, V. R. (1996) Early events in poliovirus infection: virus-receptor interactions. Proc Natl Acad Sci USA, 93, 11378-11381.

170. Raiborg, C., Bremnes, B., Mehlum, A., Gillooly, D. .!., D'Arrigo, A., Stang, E. and Stenmark, H. (2001) FYVE and coiled-coil domains determine the specific localisation of Hrs to early endosomes. J Cell Sci, 114, 2255-2263.

171. Reeves, J. D. and Piefer. A. .1. (2005) Emerging drug targets for antiretroviral therapy. Drugs, 65, 1747-1766.

172. Roberts, R. L., Barbieri, M. A., Pryse, K. M., C'hua, M„ Morisaki, J. H. and Stahl, P. D. (1999) Endosome fusion in living cells overexpressing GKP-rab5. J Cell Sci, 112 ( Pt 21), 3667-3675.

173. Roehrig, J. T. and Mathews, J. II. (1985) The neutralization site on the E2 glycoprotein of Venezuelan equine encephalomyelitis (TC-83) virus is composed of multiple conformationally stable epitopes. Virology, 142, 347-356.

174. Rohde, G., Wcnzel, D. and Haucke, V. (2002) A phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate binding site within mu2-adaptin regulates clathrin-mediated endocytosis. J Cell Biol, 158,209-214.

175. Rothberg, K. G., Heuser, J. E., Donzell, W. C., Ying, Y. S., Glenney, J. R. and Anderson, R. G. (1992) Caveolin, a protein component of cavcolae membrane coats. Cell, 68, 673682.

176. Rothberg, K. G., Ying, Y. S„ Kamen, B. A. and Anderson, R. G. (1990) Cholesterol controls the clustering of the glycophospholipid-anchored membrane receptor for 5-methyltctrahydrofolate. J Cell Biol, 111, 2931 -2938.

177. Royle, S. J. (2006) The cellular functions of clathrin. Cell Mol Life Sci, 63, 1823-1832.

178. Russell, P. K. (1999) Vaccines in civilian defense against bioterrorism. Emerg Infect Dis, 5,531-533.

179. Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F. and Zhuang, X. (2004) Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nature Structural & Molecular Biology, 11, 567-573.

180. Salcini, A. E„ Chen, H„ lannolo, G., De Camilli. P. and Di Fiore, P. P. (1999) Epidermal growth factor pathway substrate 15, lips 15. Int J Biochem Cell Biol, 31, 805-809.

181. Salonen, A., Ahola, T. and Kaariainen, L. (2005) Viral RNA replication in association with cellular membranes. Current Topics In Microbiology And Immunology, 285, 139173.

182. Sanders, D. A. (2002) No false start for novel pseudotyped vectors. Curr Opin Biotechnol, 13,437-442.

183. Sanguinetti, A. R. and Mastick, C. C. (2003) c-Abl is required for oxidative stress-induced phosphorylation of caveolin-1 on tyrosine 14. Cell Signal, 15, 289-298.

184. Scherer, W. F., Dickerman, R. W., Chia, C. W., Ventura, A., Moorhouse, A. and Geiger, R. (1964) Venezuelan Equine Encephalitis Virus in Veracruz, Mexico, and the Use of Hamsters as Sentinels. Science. 145, 274-275.

185. Schmid, S. L. (1997) Clathrin-coated vesicle formation and protein sorting: an integrated process. Annu Rev Biochem, 66, 511-548.

186. Schmidt, C. W. (2000) Bordering on environmental disaster. Environ Health Perspect, 108, A308-315.

187. Seabra, M. C. (1998) Membrane association and targeting of prenylated Ras-like GTPases. Cell Signal, 10, 167-172.

188. Seabra, M. C. and Wasmeier, C. (2004) Controlling the location and activation of Rab GTPases. Curr Opin Cell Biol, 16,451-457.

189. Segev, N. (2001) Ypt and Rab GTPases: insight into functions through novel interactions. Curr Opin Cell Biol, 13, 500-511.

190. Shope, R. E„ Causey, O. R. and De Andrade, A. I I. (1964) The Venezuelan Equine Encephalomyelitis Complex of Group a Arthropod-Borne Viruses, Including Mucambo and Pixuna from the Amazon Region of Brazil. Am J Trop Med llyg, 13, 723-727.

191. Shukla, D„ Liu, J., Blaiklock, P., Shworak. N. W., Bai, X., Esko, J. D„ Cohen, G. I I., Eisenberg, R. J., Rosenberg. R. I), and Spear. P. G. (1999) A novel role for 3-O-sulfated heparan sulfate in herpes simplex virus 1 entry. Cell, 99, 13-22.

192. Sieczkarski, S. B. and Whittaker. G. R. (2002) Influenza virus can enter and infect cells in the absence of clathrin-mediated cndocytosis. J Virol, 76, 10455-10464.

193. Sieczkarski, S. B. and Whittaker, G. R. (2002) Influenza virus can enter and infect cells in the absence of clathrin-mediated cndocytosis. J Virol, 76, 10455-10464.

194. Silvcrstein, S. C., Steinman, R. M. and Cohn, Z. A. (1977) Endocytosis. Annu Rev Biochem, 46, 669-722.

195. Simons, K. and Toomre, D. (2000) Lipid rafts and signal transduction. Nat Rev Mol Cell Biol, 1,31-39.

196. Simonsen, A., Gaullier, J. M„ D'Arrigo. A. and Stenmark, H. (1999) The Rab5 effector EEA1 interacts directly with syntaxin-6. .1 Biol Chem, 274, 28857-28860.

197. Sivars, U., Aivazian, D. and Pfetter, S. R. (2003) Yip3 catalyses the dissociation of endosomal Rab-GDI complexes. Nature, 425, 856-859.

198. Smart, E. J., Ying, Y., Donzell. W. C. and Anderson, R. G. (1996) A role for caveolin in transport of cholesterol from endoplasmic reticulum to plasma membrane. J Biol Chem, 271,29427-29435.

199. Smit, J. M., Bittman, R. and Wilschut, J. (1999) Low-pH-dependent fusion of Sindbis virus with receptor-free cholesterol- and sphingolipid-containing liposomes. J Virol, 73, 8476-8484.

200. Soldati, Т., Rancano, С., Geissler, H. and Pfeffer, S. R. (1995) Rab7 and Rab9 are recruited onto late endosomes by biochemically distinguishable processes. J Biol Chem, 270,25541-25548.

201. Soldati, Т., Riederer, M. A. and Pfeffer, S. R. (1993) Rab GDI: a solubilizing and recycling factor for rab9 protein. Mol Biol Cell, 4, 425-434.

202. Sonisel Rodman, J. and Wandinger-Ness, A. (2000) Rab GTPases coordinate endocytosis. J Cell Sci, 113 Pt 2, 183-192.

203. Sonnichsen, В., De Renzis, S., Nielsen, E„ Rietdorf, J. and Zerial, M. (2000) Distinct membrane domains on endosomes in the recycling pathway visualized by multicolor imaging of Rab4, Rab5, and Rab 11. J Cell Biol, 149, 901-914.

204. Stahl, P. D. and Barbieri, M. A. (2002) Multivesicular bodies and multivesicular endosomes: the "ins and outs" of cndosomal traffic. Sci STKE, 2002, PE32.

205. Stang, E., Kartenbeck, J. and Parton, R. G. (1997) Major histocompatibility complex class I molecules mediate association of SV40 with caveolae. Molecular Biology Of The Cell, 8, 47-57.

206. Steinman, R. M., Mellman, I. S„ Muller. W. A. and Colin, Z. A. (1983) Endocytosis and the recycling of plasma membrane. J Cell Biol. 96, 1-27.

207. Stenmark, H„ Valencia, A., Martinez, O. Ullrich, 0., Goud. B. and Zerial, M. (1994) Distinct structural elements of rab5 define its functional specificity. The EMBO journal, 13, 575-583.

208. Stroupe, C. and Brunger, A. T. (2000) Crystal structures of a Rab protein in its inactive and active conformations. J Mol Biol, 304, 585-598.

209. Swanson, J. A. and Watts, C. (1995) Macropinocytosis. Trends in Cell Biology, 5, 424428.

210. Takai, Y„ Kaibuchi, K„ Kikuchi, A., Sasaki, T. and Shirataki, H. (1993) Regulators of small G TPases. Ciba Foundation symposium, 176, 128-138; discussion 138-146.

211. Takai, Y., Sasaki, T. and Matozaki, T. (2001) Small GTP-binding proteins. Physiological reviews, 81, 153-208.

212. Tall, G. G„ Barbieri, M. A., Stahl, P. 1). and Horazdovsky. B. F. (2001) Ras-activated endocytosis is mediated by the Rab5 guanine nucleotide exchange activity of RINI. Developmental ccll, 1, 73-82.

213. Thomsen, P., Roepstorff, K., Stahlhut, M. and van Dcurs, B. (2002) Caveolae are highly immobile plasma membrane microdomains, which are not involved in constitutive endocytic trafficking. Mol Biol Cell, 13, 238-250.

214. Trigatti, B. L., Anderson, R. G. and Gerber, G. E. (1999) Identification of caveolin-l as a fatty acid binding protein. Biochem Biophys Res Commun, 255, 34-39.

215. Trowbridge, I. S., Collawn, J. F. and Hopkins, C. R. (1993) Signal-dependent membrane protein trafficking in the endocytic pathway. Annu Rev Cell Biol, 9, 129-161.

216. Tsai, В., Gilbert, J. M., Stehle, Т., Lencer, W., Benjamin, T. L. and Rapoport, T. A. (2003) Gangliosides are receptors for murine polyoma virus and SV40. The EMBO Journal, 22,4346-4355.

217. Ugolini, S„ Mondor, I. and Sattentau, Q. J. (1999) 1-1IV-1 attachment: another look. Trends in Microbiology, 7, 144-149.

218. Uittenbogaard, A. and Smart, E. J. (2000) Palmitoylation of caveolin-l is required for cholesterol binding, chaperone complex formation, and rapid transport of cholesterol to caveolae. J Biol Chcm, 275, 25595-25599.

219. Vashishtha, M., Phalen, T., Marquardt, M. I'., Ryu, .1. S., Ng, A. C. and Kielian, M. (1998) A single point mutation controls the cholesterol dependence of Semliki Forest virus entry and exit. J Cell Biol, 140, 91-99.

220. Vlasak, M., Goesler, I. and Blaas, D. (2005) Human rhinovirus type 89 variants use heparan sulfate proteoglycan for cell attachment. Journal Of Virology, 79, 5963-5970.

221. Vonderheit, A. and Ilelenius. A. (2005) Rab7 associates with early endosomes to mediate sorting and transport of Semliki forest virus to late endosomes. PLoS Biol, 3, e233.

222. Wahlberg, J. M., Boere, W. A. and Garoff, H. (1989) The heterodimeric association between the membrane proteins of Semliki Forest virus changes its sensitivity to low pH during virus maturation. J Virol, 63,4991-4997.

223. Wang, E., Brault, A. C„ Powers, A. M., Kang, W. and Weaver, S. C. (2003) Glycosaminoglycan binding properties of natural Venezuelan equine encephalitis virus isolates. J Virol, 77, 1204-1210.

224. Warnock, D. E. and Schmid. S. L. (1996) Dynamin GTPasc, a force-generating molecular switch. Bioessays, 18, 885-893.

225. Weaver, S. C., Ferro, C„ Ban-era. R„ Boshell, J. and Navarro, J. C. (2004) Venezuelan equine encephalitis. Annu Rev Entomol. 49, 141-174.

226. Weaver, S. C., Salas, R„ Rico-llesse. R. Ludwig, G. V., Oberste, M. S., Boshell, J. and Tesh, R. B. (1996) Re-emergence of epidemic Venezuelan equine encephalomyelitis in South America. VEE Study Group. Lancet. 348, 436-440.

227. White, J. and Helenius, A. (1980) pH-dependcnt fusion between the Semliki Forest virus membrane and liposomes. Proc Natl Acad Sci USA, 77, 3273-3277.

228. Xiao, G. H„ Shoarinejad, F„ Jin, F„ Golemis, E. A. and Yeung, R. S. (1997) The tuberous sclerosis 2 gene product, tubcrin, functions as a Rab5 GTPase activating protein (GAP) in modulating endocytosis. J Biol Chem, 272, 6097-6100.

229. Yamada, E. (1955) The line structure of the gall bladder epithelium of the mouse. J Biophys Biochem Cytol, I, 445-458.

230. Yanagi, Y., Ono, N., Tatsuo, H., Hashimoto, K. and Minagawa, H. (2002) Measles virus receptor SLAM (CD 150). Virology, 299, 155-161.

231. Ybc, J. A., Greene, B„ Liu. S. 11., Plcy. U„ Parham, P. and Brodsky, F. M. (1998) Clathrin self-assembly is regulated by three light-chain residues controlling the formation of critical salt bridges. Embo J. 17. 1297-1303.

232. Young, N. A. and Johnson, K. M. (1969) Antigenic variants of Venezuelan equine encephalitis virus: their geographic distribution and epidemiologic significance. Am J Epidemiol, 89, 286-307.

233. Zaratc, M. L., Scherer, W. F. and Dickerman, R. W. (1970) Venezuelan equine encephalitis virus as a human infection determinant. Description of a fatal case occurring in Jaltipan, Ver., in 1965. Rev Invest Salud Publica. 30, 296-302.

234. Zerial, M. and MeBride, H. (2001) Rab proteins as membrane organizers. Nat Rev Mol Cell Biol, 2, 107-117.

235. Zhong, Q., Lazar, C. S., Tronchere, H., Sato, T., Meerloo, T., Yeo, M., Songyang, Z., Emr, S. D. and Gill, G. N. (2002) Endosomal localization and function of sorting nexin 1. Proc Natl Acad Sci USA, 99, 6767-6772.

236. Zhu, G., Zhai, P., Liu, J., Terzyan, S., Li, G. and Zhang, X. C. (2004) Structural basis of Rab5-Rabaptin5 interaction in endocytosis. Nat Struct Mol Biol, 11, 975-983.

237. Zhu, N. L„ Cannon, P. M„ Chen, D. and Anderson, W. F. (1998) Mutational analysis of the fusion peptide of Moloney murine leukemia virus transmembrane protein pI5E. J Virol, 72, 1632-1639.

Информация о работе

Колокольцов, Андрей Алексеевич
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2007
ВАК 03.00.04

Диссертация

Исследование механизмов проникновения вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей в клетку в реальном времени - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы