Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование механизмов флуоресцентного взаимодействия комплексов ДНК-лигандов бензимидазольного и фенилиндольного рядов

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Исследование механизмов флуоресцентного взаимодействия комплексов ДНК-лигандов бензимидазольного и фенилиндольного рядов"

РГб од

- 3 МДИ 1995

На правах рукописи

СИБИРЦЕВ СлЛ-уЭ

Вдадиккр Станиславович

ИССЙЕДОВЛНИЕ МЕХАНИЗМОВ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ КОМПЛЕКСОВ ДИК-ЛИГАНДОВ БЕчЗИМИДАЗОЛЬНОГО Н ФЕННЛИНДОЛЬНОГО РЯДОВ.

Специальность 03.00.23 - оиотехнологаа

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Санкт-Петербург 1995

Работа выполнена в лаборатории биотестиров.^ма токсических факторов окруваадей среды Центрального научно-исследовательского рентгено-ради-ологического института МЗНП РФ и на кафедре молекулярной биотехнологии Санкт-Петербургского государственного тохнологичеи.ого института.

Научные рукивод,,тели: доктор биологических наук, стараий научный сотрудник доктор химических наук, доцент A.B. ГЙРЙБЙДНИУ

Официальные оппоненту* доктор биологических наук, профессор, академик РАЕН доктор химических наук, профессор E.H. Мин -

Вещая организация: институт токсикологии МЗМП РФ (Санкт-Петербург).

Задета состоится на* 1993 г. в Ml часов на заседании длссетрационного Совета й 063.23.09 Санкт-Петербургского технологического института (198013, Санкт-Петероург, Московский щ>.. 20, СПбГШ.

С диссертацией моано ознакомиться в библиотеке института.

Отзывы и замечания по данной работе в одной экземпляре, эаверенном гербовой печатью, просим направлять по адресу: 198013, Санкт-Петербург. Московский пр., 26, Санет-Летербургский государственный технологический институт, Ученый Совет.

Автореферат разослан JJL апреля 1995 г.

С.Д. ИВАНОВ

В.А. ФШ10В

Ученый секретарь диссертационного совета: кандидат технических наук

Т.Б. ШИШ.

Актуальность проблею, В последние десятилетия сфотироиалось и активно сей £ развивается научное направление, которое связано с исследованием и 1-оиском путсй создания соединений, специфически связывавшихся с определенны« последовательностями нуклеотидов в геноме, с которыми зкже взаимодействуй днк- и РНК-полимераэы. репрессогы и т. д. (Заседателев А. с. " др., 1976. т; Иванов с д и др. . 1989. 1991: Zirrmer с.. Wahnert У., 1986 и т. д. ). это позволяет, с одной стороны, получить эксягессные и сравнительно простые способы диагностики наследственных, злокачественных, инфекционных заболеваний, радиационных воздействий, на основе анализа патологии с точки зрения изменения содержания и структуры нуклеиновых ююлот при различных Физиологических состояниях орг.. лзма. с яругой стороны, таи« соединения могут сыть использованы непосредствен в качестве радиопротекторов (Deiuson L et dl.. 1992! Martin R. F.. Deni-on L, 1992). противоопухолевых. антибактериальных. антивирусных препаратов (PJura Р. et al., ige?; Wilson w. Di et al.. 1990). Подобные соединения также могут выть использованы в качестве ДКК-трошшк зондов, применение которых основано на присоединении специальной метки или паркера, позволяющего следшъ - ■ состоя-ирм оеьеота в динамике, без разрушения, в обычных для него условиях, и т. а эли вопросам в отечественной и зарубежной литературе посвяшено достаточно большое количество работ (Кп.хкий г. А.. Александров С. а, 19ТЗ; Уланов С Д . 1992; Morgan A. R. et"'., l9T9i TanaKaSh., 1990 и т. п. ).

При использовании в диагностических целях, такие соединения, помимо достаточно высокой специфичности, доланы обладать удобньии для регистрации свойствами Например, способностью Фго дрессировать и резко изменять интенсивность своего свечения при взаимодействии с определенным субстратами. Так, ьаьлино-з-наФгалин-сульФонат является меткой на белок (/одошч Дх. 1966), бромид этапия - на нуклеиновые кислота <ье-Ресч J.C.. Paoletti с. 1966; ftorean A.R, et al., 19Т9). DAPI - на -при ат-пагы нуклеотипов в жк (KaFUi''insKi J.. S2er w,. 1979). Hoechst Ь3256 - на три AT- и одну ni-пару нуклеотипов (PJura Р. Е. et ai.. 190Т) ,1 т. д. вэ всех этих случаях происходит многократное возрастание интенсивности Флуоресценции красителей при взажсоейтгаи их с определенной ниагньа Простота акокая -¡увстнггелъность и избирательность

Пришлые сокгаиеяя: а - оптическое поглощение; I - интенсивность флуоресшнши m - ДЛИНПОВСЯНОМ» KB - юэротюэволиоеый.

«доресоет»« способов икпикаши симулируют >:опьт<и поиска принципиально новых ясшнесцентаьос мязсителей для анализа нуклеиновых кислот (Эеленж А я и №. 1967; Иванов с А и др.. 1989. 1991; Gausalh Е etal.. 1978; HironsCT, etal., 1994 ит.д).

однако, несмотря на то, что взаимосвязь структуры субстрата и характера взатэдейспзя в системах подобного класса изучена ухе достаточно хода». ■ настояаее вреня. практически отспствукгг основные положения. позволяю, г достаточно полно ойьясютгь механизма изменения «луореспен-пш свойств и. исходя из эгопо. принципы кон^туировэния ♦луоресие.тоьи кюнплексонов ДК с заданньми свойствами 'Так. для сольоого числа неиитегкалягоров возрастание их . .iyopecnemrax с связывает с изменением гтенеивности процессов роташюнной диффузии в молекуле днк-лиганда (заседахелев АС и др.. 1970; KaruscinsKl J.. SKoczrias в, 1978). Енестс с тем. известны и другие механизм), иоэво-лжвие объяснить позьшение свечения подобных соединений (Каотор Ч. вм<ел а, J 984! Лакович Дк.. 1986 Добренов Г. Б. 1999; Сибиргав в С и др.. I9W. сшамэ, взажоотасшения между вывеназванныки механизмаж пракгочески не изучены. Кроме того, отсутствует и достаточно теоретически обоснован«« метод расчета химической структуры потенциально актов»« луореспентаых »«ток на нуклеиновые юклоти с требуемыми свойств»«. да решения поставлен"'.« вопросов, в настотей работе исследо-1' шось взажодейс-гвие с нуклеинс-«и кислотами ряда как коьмегчеаис. так и вновь синтезированшх /ш-литаьдоа

Цея> исследования: комплексная спекгральн?" харакгерилика влияю« структуры молекул лиганпов яа характер их специфического вэажодея: та :: с л К. с пелью сФоишы. .зать требования для целенаправленного конструирования за ношя эффект хных Флуоресшгшьи меток на нуклеиновые юкяя»

Задачи исследования

1 Провести опенку спектральных и комплексообразуксих свойств исследуема соединений в завиглюсти от и,, хжической структуры и усдо-ал взажодейстаия с ДОК.

£. Ооенигь влияние на свечение потенциально активных лкминофоров характера их микроокружения и других условий среди

3L Сфощулировать адекрятаую недель, объясняющую изне.^ния Флуорес-иенпых свойств енешесвязыватосся ДЯ-спе^иФичных красителей и. на основании ее. принципы кон тодаования новых потепетльно активных ♦луороФоров на нуклеинови .' кислота с запанньни свойствами.

Научен новизна пояученшх результатов. Пги исследовании взато-л четая с ДК '.ь.пнесвязываюаася флуоресцентных мраатгелей в водных средах различного состава впервые осуществлена количественная опенка сгаосигел'чого вкг;в него водородных и дамьл связей Показано, что

наличие элекхгостатаческой составдяадей играет значите...лую роль не только дг.' слабого, но и для сильного, специфичного тала взажодейс-твия выпеу. данных соединений с ВДК.

Впервые предложена модель, г'ьединяотая язе основные ранее известные п ут ;ы, объяснять юзможный механизм повышения Флуоресценции при специфическом чэаимодеиста' с ДНК внеанесвязываюшхся красителей по отношений к. их свеченю в родных средах я несвязанной состоянии. СФогмулированы условия применимости вьшеназванных гипотез для прогнозирования повеления азличных тагов соединений. В ракках одной из тсс. доногаоакцептдаюй г"чотезы. предножен ряд тегникалыгьи злектроно-до-норных •• элеотоно- акцепторных заместителей, полезньй при объяснении изменения люкг-есиетных свойств лигандов ДНК, исходя из их ^«ическоя структуры Для соединений бисбензк.. ддзольного ряда (гае вероятность протекания процессов внути. .¿пекулярной ротационной диффузии значительно более велика, чем в случае аналогичных ж моно-производных) проведена количественная опенка сяносигельных вкладов процессов внутримолекулярного донорно-акцепторного взаимодействия и ротационной диффузии в измене, .к их флуоресцентных свойств при связывании <• полинук-лесжаем.

Научно-практическая значимость иссл .ования и формы внедрения работы. Разработан и апробирован на исслед анньк в настояпей работе соединениям метод позволяющий количественно оценить относительный вклад и^.яых и водоролнь^ связей в специфическое взаимодействие в системе лигаяд-ДНК.

Разработан и апробирован на исследованных в настоящей работе соединениях бисбензимиоазольного ряда способ оценки относительных вкладов процессов внутримолекулярного доношо-акиеиторного взашодейсгеия и ротационной диффузии р изменение свечения Флуоресцентных даеснесвязы-вакдахся Д®-спеииФичныл красителей.

разработаны и представлены <в виде конкретных текстов модулей, написанных на язисе Тигьо-Ы^са! 5.0) программ* комплексы для расчета параметров комплексообразования хслектш систем лиганд-дж. а также для вывода графических зависимостей (в том числе, с использованием глобг. и»ной кубической сплаян-интерполяши) на экран и печать.

На базе двух основных ранее известных ро7Шглнно-диффуз«зниой и до-норно-акцешогаои гипотез. разрае /тан алгоипм оценки относительного изменения флуоресцентных свойств внешнесвязывангихся сусстрат-спепи-Фичных красителей, исходя из их химической структуры. При этом, для соединенна в изменении свечения иэтогых доиинирушм является механизм внута*юлекулярного доносно-акиепторного взатооейстшя активных групп, входящих в состав их молекулы, предложен ряд терю»"льли зле кгроно-до норных к алекпроно-акиегпорных заместителей для аеле1лп-

- б -

решенного конструирования новых Флуоро<юров : \ Ш и сформулированы •требования по его пгшенегаю к различит классам соединений. Пштокетч, выносимые на зациту.

1. предлагается метод для келичественной оценки относительного вклада ионных и водородных связей в образование актвно Флуоресцирующего комплекса в системе лиганд-ДНК.

г. В рамка:- теории внутримолекулярного д»^огио-акцептотого взаимодействия активных групп, входящих в состав исследуемых соединен, л предлагается ряд терминальных электрон*, доногеых и злеютоно-акшптор-кых заместителей для оценки спектральных свойств таковых соединений и конструирования новых флуороФоров на ДНК с зада; гии свойствами

3. предлагается способ количественной оценки относительных вкладов процессов внутримолекулярного докорно-акиепторного взаимодействия и роташюннои диффузии в не: яизм изменения Флуоресиеипых свойс_з красителей при специфическом связывании их с полинуклеотаоом и. на основании полученных данных, модель, объединяющая две основные ранее извести гипотезы, объясняйте влияние вышеупомянутых процессов на таковой механизм Формулируются уел«.и пииенимости для каждой из названных гипотез, их соотношение в рамках единого предлагаемого механизма. г такяе подход для оценки относительного изменения Флуоресцентна. свойств внешесвязывашкся "НК-спешФичных гасителей, жходя из их - лчической струкхуш

Апробация диссертащюнного катс.иала. натериалы диссертации сыпи представлены на Vil Всесоюзной конференции по спеютоскопии биополимеров (Харьков. 199!). Российской научной конференции 'Создание лекаv-тг нных средств" (Носква. 1992) и научно-пракютеской конференции молодых специалистов "Нэше медгинские тс:шологии в области лучевой диагностики. терапии и интервенционной радиологии" (Санет-Летербург. 1994).

"^бликаши: по теме диссертации опубликовано # работ (в.том чжле, статьи - Í, телков в матетзлах и с борщках - 3).

Объем и структура досертадеи. Диссертационная работа состоят из введения и з глав; из которых первая посвяпена Обзору литературы: вторая - описаний методов, в том числе и вновь разработанных, а такие материалов. использованных в провоомых исследованиях; третья - результатам собствен»« спеюргмшных исследзаний рассматиазаедах красителя ь несвязанном состоянии и при взатмействии с ДЖ в средах различного состава: чевергая - опи шж> результатов, полученных при расчете параметров компленсообразования исследованных гасителей, а также сопоставления их с re тветстеуит! спектеальньми характеристика^« голая -обсуждению полученных данных о меха, гонах изменения Флуоресцентных свойств исследовании красителей и пимене» j их для Формулировки по-

ложения, связываших химическую структуру внеанесвязывасшидся Флуорес-пекшых дх-спеиифичнда красителей с их потенциальными спектралыши свойствами, диссертация завершается заклшением и швэдами, диссертация, кроне того, имеет прияоже - :е, где приведены конкретные текста . прогрг ьв. комплексов, ис--\пьзованкых для расчета параметров конплек-сообразования и ir-троения гра :<ов зависимостей для спеюрагчных и комплексообразукших свойств исследованных в настоящей работе соединений: а также обтая совокупность экспериментальных данных по спектраль-ньм характеристикам, определенном для исследованных соединении в присутствии ДНК в водны^ средах различного состава.

Работг изложена на 2i 1 страницах машинописного текста, содержит 56 рисунков и 8 т^злин. Библиографический указатель Еклкчает 257 работ, в том числе 92 на русской языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В качестве материала для настоящего исследования было взято ю коммерческих'и вь^вь синтезированных внешнесвязывашихся Флус- ^сиентаых г. ^-специфичных красителей нонофенипбензимидазольного, монофенилин-дольного и бисбензимидазольного рядов сом. рис. 1). При зтом, коммерческие ФлуороФоры DAPI. DIPI, Hoechst 33^'jS и Hoechst 33342 (соединения (IV), (V), (Vi) и (VIII), соответстаекп) были получены от фирмы Serva (ФРГ), синтез соединения (I) описан а работе (Preston I. et al., ■ 1969). соединения (II), (III), (VID, (IX) и (X) синтезированы на кафедре молекулярной биотехнологии Санкт-Петербургского технологического института (Склярова и. Е и др.. 19SS; Соколова a ia и др.. 1990; Иванов С Д и ДР.. 1991).

В гачестве субстрата •-спользовалась ДНК тимуса теленка фирмы Serva (фрг) [ 58z АТ-пар; средняя молекулярная масса на один нуклеотид. использовавшаяся при вычислении молярных соотношений концентраций Сдкк/ Скрас. 326 .0. е. м.; коэффициент молярной экстиннии £260 = 6600 М"*'см",< (Barceilona ML et al., 1966) 1. Для гомогенизации и Уменьшения светорассеяния перед использованием ДНК предварительно обрабатывали ультразвуком на аппарате уздн-2 в течение 15 сек при сипе тока 0,3 л на резонансной частоте 22 кГц ¡после этого, срелля масса молекулы /пк составила 3500 Да), Все остальные Реакшвы имели маркировку "..'-Г или "ССЧ" и дополнительной очистке не подвергались.

Все измерения проводились при постоянной величине Скрао 1 6,4*10" М и различных значениях С лнк (Н) пш 20-25 'С. Во из бе лани? эффектов разбавления, к "нулевому" растгору, содержащему буфер с красителем заданной концентрации. добавляли апиквоты (по 0.02 мл) расгеора, с держащего буфер ♦ краситель заданной концентрации ♦ ДНК в такой когахеиг-

"0X5-

(I) B-R'sNHj nh

(ii) r o —¿' ; r'a— nh2

nh2

nh

(hi) h a —df/ ; r'«=—no2 \h2

nh

(IV) я = —ri^

\ж2

(v) r =

-"<J

(vi) и

—-CH3 ; R'= —ОН

(vii) r = —n \)h ; r' =

\мм/

(viii)

—t

■OH

ch3 j r' = —0—ch2—ch3

r

r

(IX)

r = v—

CH-j

(x)

R = — V—fi—гн->—

II о

CH,-CH-

-N<T XCH3

Рис.1 Струит l'une éopuuns исспедоl ,hhhx соединенны.

.____ . - 9 - — - - ----------рации, чтобы обеспечить соотношение Слкк/Скрао = 200 моль/лаль. Спекг-га поглсе.яия исследуемых растворов регистрировали на спектрофотометре Фирмы "Веек an" (Австрия) , Model 35. Флуоресценцию проб анализировали на спеютоФяуорииетре Фирмы "Hit'~hl" (Япония), Model 350. um записи спеют n i Флуордаетре и^ти монохроматоров возбуждения и эмиссии устанавливали по 3 ну скорость сканирования - 120 нм/мин, время отклика

- 2 с. усиление ФЭУ - нормальное. Запись спектров возбуждения проводили тки длинах волн, соответствующих максимумам эмиссии, а спектров эмиссии - при длинах запн, соотеетстеуотвг максимумам ДВ-ликов возбуждения исследуемых соединений.

Так ктч перекрывание спеюров поглощения и Флуоресценции у исследуемых соединен i практически отсутствовало, то расчет соотношения квантовых выходов ¡рднх/фо осушесгаля и исходя из максимальных величин поглощения и Ьлуоресцетли яш соотаетствуших соотношениях Сднк/ Скрао в системе, по Формуле: = (12-Й1) / (Ií'A2) <1)

(Иванов ад. и др. , 1969¡ KapuscinsKi J. ■ scoczttas В , 1978). При этом. для расчета ijtoax/ijb ■- максимально ьозмсяшого относительного квантового шхояа крааггеля в присутствии ДНК, значения Imax и Г лазе комп-л.чса ДНК-краситель определяли путем э'"-трапаяядаи зависимостей I и (I от Скрас/Сднк к значению Скрас/Сднк = 0.

' спектры флуокснениш корректировали с» с использованием счетчика квянтоь на основе стандартного спиртового "аствора родамина в, в соответствии с руководством по эксплуатации к спектрофлуориметру "Hitachi", •Hödel 550. Нулевые ¡свантовые выходы Флуоресценции (фо) исследуемых красителей определялись относительным методом с использованием в качестве стандарта раствора сульфата хинина в i М серной кислоте (Iß = 0,55) ' (Паркер С, 1972).

Вещества анализировались в буферах следгапего состава:

- 0,01 И НаС1, 0,01 М Ka2EDTA и 0,01 И трис (рн7,4) (A) i

- буфер А. содержащий, допешм-ггельно 4M мочевину (FHT, б) (Б);

- гм Нась 0,1 Н Ла2ШГА. 0.01 Н тоис (FH6.0) (В), помимо этого, анализировались спектральные характеристики соединений (1)-(Х) в растворе изопропанола (с диэлектрической пронинаемостио среды Е' s го. 1) в отсутствие ДНК. а также в низкосолевом буфере А с добавлением неионного детергента Тритон X-ioo до конечного соотношения концентраций Стрит/Скрас = 50 моль/моль.

Поскольку известно, что в растворе с высокой ионной силой ингибиру-ются ионные (Barcellona м. L. et al., 19&&), а в растворе с 4 м мочевиной при низкой ионной сипе - водородные (Georeiev G. р., 1969) связи и системе дк-лиганю то относительные вклады данных видов связей (X й ft соо"тетст^еннс>) в образование активно Фяуоресцируппего компекса исследуемых красителе!» с полинуклеогадом определяли по сл^дукшим ívp-

мулам: X = ( - 1) / (у/Що - 1) 3 • 100% (г)

и Н = I - 1) / Су/фо - 1) 1' 100% ¡3),

где ф/фо , у'/фо и - максимальные относительные квантовые

выходы в присутствии ДНК для данного к. асигеля в буферах А. бив соответственно.

спеютольш" характеристик соединений бисбензимидазсльного ряда (уп-(х) анализирс шись таюке в 50/- растворе сахарозы, ингибирушем. как известно, процессы ротационной ди, .узки в молекулах подобных соединений (кагизс1пзк1 л, Бсос2У1аз Е. 1976). Такой раствор готовился добавлением одной весовой доли сахарозы к одно: доле стандарт»- ~о ./-Фера л при этом, относительные вклады процессов внутримолекулярного доногао-акцегсгорного взаимодействия и ротационной диффузий в изменение свечения исследуемых соеди ний при их специфическом связываю... с ДНК (Е и И соответственно) определялись как:

В = I (1?сх/фо - 1) / (фявх/фо - 1) 1 • 100% (5)

и Е = 100 - Я. X (6),

где фо и Щах - квантовые выходы I ашгеля в отсутствие ш. в буфере А и 50*-растворе сахароза а фмх - максимальный квантовый выход данного красителя в буфере А в присутствии днк, соответственно.

Коэффициент чувствительности Ц*), отражайте величину отирашения интенсивности Флуоресценции исследуемого красителя на единицу концентрации /ПК при соотношении монцеютацй Слнк/Скрас = 5, вычислялись по Фожуле: = (1»«1 - 1»-1) / 2-Скрао (7),

гае Ь+1 и Ь-1 - интенсивность Флуоресценции исследуемого красителя (i опт ед ) при соотношениях к .шентралий Слкк/Скр*с = !>+1 и 5-1 моль/ мопц, соответственно.

Параметры комплекс ообразования: К - константу Скэтчарда и п - число мест связывания в расчете на одну пару оснований далинуклеотида. - определяли из уравнения: Г/* = К* (¡1 - Г) (8) (Колосова й О . 1991; Бсагсьатаа. вагсеПстН.1. ег а1..

свяэ

1966), в области, допустимой для г~о пшменения. Здесь г = Скрас/Едт<|

с»об с»ов свяэ ивяэ

I = Схрас, Скрас = Скрас-Скрас, а Скрао = (1г-1о)/(1пах-1о)*Скр«с.

Для построения графических зависимостей использовалас .. с некоторыми очевидным ограничениями, глобально кубическая сплайн-интерполяция Дш1ных. полученных экспеилеигальнж путем для отгульных соединений (Калитою Н. Н. , 1976; I яконов В Л . 190Т1.

Результаты исследования и их обсуждение

Оптическое поглощение (А) исследоь-чных в настоящей работе сое дине-

- и -

ний с увеличением соотношения кошен "мши Сднк/Скрао в ■ ютеме с низ-коеолевьм буфером а менялось неоднозначно, подобная неоднозначность поведения оптического noi ошения системы пи- чаличии двух и^обестж.с-ких точек свидетельствовала, как уже отмечалось ранее в paoorav 'Колосова о. ю.. 1991; Вчгг°попа н L. et ai., 1986; PJura P. Е. et al., 1987), о наличии двух типов а ъшания рассматгик ш лигэндог z ДЪ. Причем, если слабый неспешФичесьий тип комплекса исследованных красителей с полинукпеот.дом С1_ошизиРовался исключит ,ьно за счет электростатических взаимояестеий; то сильный специфический активно-ч..уорес-цирукший тип комплекса ДНК-крастъяь характеризовался наличием в своем составе как ионных, так и водородных связей. Это, в частности, можно видеть из табл. 1, где приведены основные спектральные и комппексообра-зушие характеристики, пслученньг в ходе настоящего иссле .за., .ля д t соединений (1>-(Х) в стандартном низкосолевом буфере А (исключение составляют величины ч X i. R. для п.чэтения котогчх использовались растворы иного, чем буфер А состава; си материалы и методы).

при увеличении концентрации ДНК в системе для большинства исследованных соединений имело место монотоное ш тичение лтенсивности Флуоресценции; причем, с довольно вые .<км относительны« квантовым выходом (см. табл. 1). law этом, у ых на&гаоаалось , за тг5;а возбуждения (положение i .ксимумов которых совпадало с положением соотеетствуших максг-■мумов на спектрах поглощения исследованных красителей) и один пик <,.у-орескеьгной эмиссии, максимум которого испытывал значительный гипсо-Флорн"ч сдвиг о увеличением соотношения Слнк/Скрао у соединен}"'' бис-бензимипазольного ряда (Vi)-(IX) (40-53 нм) и сс-чмквния (V, Dlti) (15 нм), в тоже время, практически не меняя своего положена. у остальных рассматривавшихся в настоягя работе соединений, исключение составили соединение (I), имевшее единственный электростатический тип связывания с ДНК и взаимодействовавшее с i.mc .меныгением своей Флуоресценции; и соединение (X). демонстрирозанге* вследствие слоя:: го Хсмастера своих терминальных заместителей, тонкую .структуру чиесионньк спектров и при Сднк/Скрв1 > 160 также начинавшее уменьшать интенсивность свечения с увеличением Сднк в системе.

Флуоресцентная чувствительность ^.'следованных красителей по отасие-нио к полинукш j-гиду с изменением соотношения кондет-тшй Сднх/Скр«о в системе тоже существенно изменяла.ь (см. табл. 1). v бол^линства со-.динениа при этом, величина взятая в абсолютном ее выражении (т. е. i-Jsi), с увеличением соотношения Сднх/Скрас в системе уменг-злась. однако. в Различной степени Исключение составили соединения Ш). (V) й (x). у которых j® в диапазоне Сднк/Скрао » '-10 моль/моль несколько увеличивалась, вследствие шпесказ . яого, в К13личнь« диапазонах соот-нсоений ¿лнх/Скрас в системе соотношение величин коэффициентов Флуо-

Таблица 1.

Основные спектрам ыа и комплексоовразуютие свойства и ;лвпоеэнных соединений при свг^ывани.. к с ДНК.

J флуоро-фс 1 I II III IV V VI VII VIII IX X 66,8

lfo'103 193,7 2,0 5,1 12,7 10,7 8,1 17,2 5,0

* „ р /<р го го 0, 3 0,.I 0,75 0,63 0,98 0,96 0,95 0,d0 0,88

^тах?' о о,в 21,6 23,4 27,1 35,4 41,6 39,6 39,1 38,8 13,8

-l,5f*l 0,54 0,7" 5,95 1,45 4,90 6,06 4,23 2,13 1,16

Ï10 •ID"6 -1.56 0,72 0,43 4,67 3,59 4,07 2,45 3,57 1,34 4,31

ïlOo • ю-6 -0.39 0,3Í. 0,23 0,50 0,59 1,69 1,18 2,85 0,44 1,52

к- ю-6, м-1 13,6 7,8 7,9 4,9 8,4 8.а 10,9 Ь.О 16,3 8,4

п-103 4,06 6,4В 6,62 26.0 6,85 4,55 4,61 4,57 4,15 7,18

ч, % 0 а 15 37 90 . 51 57 48 44 29

X. % 94 86 56 6 43 37 45 jO 65

Е, X — 14,8 15,3 14,2 19,6 7,8

R, % --- 85.2 8й ,7 85,8 80,4 92,2

' 1, '

Примечания: ^í. ^io и fyoo (от i-tt'1)'- коэффициента флуоресцентной чу>лтвйгель^сто исс яованных соединен";! пот соотношении ' кови-н-Тиаций Сднк/Скрас в системе: 1, 10 и 100 моль/: ;оль, соответственно!

ifb - величина нулевого квантового выхода' пш кв-возбуждении исследованных краотге.^я (все другие указанные в таблице параметры определялись для ДВ-пика возбуждения).

Опальное, • см. материалы и методы. , •

ресцентной чувствительности по отношений к поли,.уклеотиду (¿в 1 для исследованных ккиигелей 'б"ао i-азлично. изменялось это соотнесение и в зависимости от состава среды, в которой производит"ъ измерения. Так. присутствие в сред^ мочевины ингибировало комгиексообразование с /Ш фаотгелей, преимущественно образукош в ходе этого процесса водородные связи i соединение (V, DIPT ' ] ; а наличие высокой ионной. сипы -краа.ллей с преобладанием toi связывании с «нк сип •'шекп? статачес-

- 13 -

кого взаимодействия [ соединения (I)-'III) J.

спектральные характеристики поглощения и Флуоресценции соединений в несвязанном состояли t изопропансле в Г -области воэбу^дешя t_»M близки к таковым при высоких соотношениях Сднк/Св-рас в еодиых ' "едах. исключение составило лишь соединение (I). взаимодействующее с ДНК с уменьшением своей ФЛ/оресденпи;' в кв-области> oztoko, пики пилоте "ия, а сестЕетстшаю и Флуоресцентного возбуждения, 7 исследованных ■ соединен: .,ь поиеаенн -. в cl ;товую среду, пропала ■ , что не было характерно шн спектров данных соединений в водных средах. Э1 может быть свидетельством .величения г.лроФобного взаимодействия молекул рассматриваемых красителей, помешенных в спиртовую среду, с их микр^ окрузке; юм; то» было отмечено недавно в работе других авторов (Yorna J. к. et al., 1992).

дх явление в буферный раствор неионного детергента тритон x-iod оказывало на спеюты "с-ледуе jx соединркчй сход"ое воздействие. Пи4 этом, также увеличивалась интенсивность ДВ-пика возбуждения (а соответственно, и эмиссии! рассматриваемого красителя, а КВ-пик возбуждения не появлялся даже в присутствии ДНК.

сумма вкладов водородных Ш) и ' ~>нных (X) связей в образование спе-к-йического активно Флусреа;-ругапего комплег га с "чк для всех рассматриваема соединена была близка к icox (см. табл. i), соотношение м^жт' н- и х-составляшими при этом существенно изменялось в зависимости >т характера терминальных радиксов и структуры ядра молекулы красителя. Однако, величин максимального относительного квантового выхода (фпах/. i|ol исследованных соединений в присутстаии ДНК. резке возрастая /же при небольшом удельном весе водородных связей ), в дальне лем, с увеличением доли такого связывания. изменялась «ало (см. рис. 2) и зависела скорее от структуры молекулы красителя, чей от характера его взаимодействия с ДНК. сшутамое вяитше на свечение исследованных соединений величины Них оказывали тгь в средах, ингибиг -лих зкую-либо из шпелгомянутах составляющих связывания в системе лиганд-пешиежлеотиа Прочие, наиболее показательные с нап^й точки зрения, зависимости между спектральными и комплексообуазжвими свойствами исследованных соединений, приведены на гас. 3. Заагимостиот константа Скзтчарда (Я) коэффициентов Флуоресцентной чувствительности'(■¿в) при других соотношениях Слнк/Скрас были аналогичны наведенным на рис. 3, В для 10. Зависимости п (числа мест связывания в расчете на одну пар/ оснований) от величин дьмю/flo и были обратил приведенным на рис. ? в и в для константы связывания (К), непосредственной связи между другими спектральными и комплексооеразукшими параметрами для исследованных в настоящей работе соединений найдено не было.

изменение флуоресцентных свойств при взаимодействии с дж иссдада-

- -------^

*

«

N

\

л. „. I,, )

17 ЭЭ в! аэ н,х

.Рис. 2 Зависимость логаиша максимального относительного квантового Еыхода исследованных соединений i присутствии ДНК iOmax = lgl^li»«/ фо!) от величины относительного жлада водородных срязей в их специфическое взаимодействие с полшжлеотидом (Н).

' Условные обозначение: точками 1-х показаны данные д-я соединений (I) - (X). соответственно; к шая 1 показывает величину квантового выхода красителей (I)-(IX) в отсутствие ДНК р изопропаноле ■ по отаошенио к их квантовому шходу в б;' ?ре А < lgt^cn/ijlo] ); крийые 2-4 соответствует данным. полученньи для соединений U)-(IX) в буферах А-в ' соответственно: криьая 5 -• аналог кривой 4. но включая и соединение (X).

ванных в настоящее работе соединен. моноФенилбензимидазольного и морс'энилиндольного ряда могло быть уновлетвор^.'ельно объяснено, исходя из положений теории Енутримопекулярного доно. ..о-акцеторнопо взаимодействия (Иванов с д и др.. 1989; сибирцев а с и др.. 1994). - сна предполагает нал: .чие, помимо потенциально способного к флуоресценции "ядра", акг'яных тегнинальных группировок лиганда. способа :< подавлял, свечение упомянутого ядра в свободном состоянии молекулы красоте--л. пш с врывании же этих группировок с фрагментами шк. ингибирукшее влияние их на Я-элеюронную систему молекулы кг лсигеля в целом ослабляется и. в рез"пьтате. соедигние восстанаь.лвает свои Флуоресцентные свойства, при этом, увеличение элек.^но-акдегггорной акшшости указанных групп будет способствовать уменыпенш а уменьшение таковой активности - наоборот, увеличений свече .и соединений, в состав которых они входят, от одинаковом характере ядра их молекулы

П'103

■ iS~-й

м - I

Ж - 11

V - ш

о - I •

а - и

Ь - V

Т - VII

♦ - ит

к - I"

А - X

•к

м

6.3

V-

к, >210'^'

.....ч-

' 10

-6

-3 «— 4

К'10"

гас. 3 зависимость числа мес'- свяг лвания в расчете на одну пару оснований (п) (рис. А), логагафма максжального относи-адно-"} квантового выхода в пгасутствии дж в ьизкосолевом буФег= А <<&»«) (рис. Б) и коэффициента Флуоресцентной чувствигелы ста исследованных соединений при соотношении концентраций Сднн/Скрю » 10 мпь/нояь Щи» (р Б) от величины их константы скэтчарда <к>.

Условные обозначения: точками 1-х показаны данные для соединений (1)-(Х); ютвая 1 соответствует танньм для соедмени* (1)-(1У)! •тивая 2 - данньи для соединений бисбензимидазольного ряда (У1)-(Х): кствая 3 - нулевому уровню Фи^х. На пк. А кривые 1 и г совпадают,

Исходя из этих принципов, был построен ре" терминальных заместителей. уп<">яд0ченных по их относигешюй доноию-акпешстной активности

(си пс. 4). в соотвртггаии ним, в частноем можно еыпо олдать. та> специально синтезированное на каФедре ИНГ СПбПИ (см. материалы и к-тоды. соединение (II}, имешее агатото эг^'сгрово-ис-гшорнуо амиии-новую группу, вместо одной из электрода -данорных терминальных амино-грурт соедине..я (I) (см. рис. 1). будет иметь меньшую* по сравнен» с кип величину нулегого квантового выхода Ч^о) и. соответственно, золь-шую величину максимального относительного квантогоге выхода в присутствии ДК а соединение ш.» будет 1мегъ ете мен~лую, по сравнегою с соединением (П., величину ¡}с. Это подтвердилось на практике (1-л ,5л.:). однако, величины ^о, а соответствен и - коэффициентов Флуоресцентной чз^ствггельности по отношение к ДЖ. у соединения (II) и (Ш) оказались слишком малы для практического их исполь-эс .лния. Таким образом. очевидно, что ошишьньк. с точш зрения практичг чого применения ыновь с.ягезируемых соединен'"г как флуорофо-ров на дак, является дйор для более слабого "ядра" их молекул ' например. монофени ^нзимидааольного фрагкг ча у соединений (II) и (III), по сравнению с моноФенилинлольнш у соеак .Ш (IV) I. (V) ) и менее активных . терминальных элеютоно-р-цепторшх заместителей (шлиимер. имидавдшовых групп, как у соединения (V). по сравнение» с амиаиновы-ми. как у соединений (II) и (IV) ) из ряда, пкдетавленного на рис. ' Еиесте с пен. в мег лизме изменения флуо!?есцентных св^ ¡ста соединений бисбензимидазодьноп* у,.да значительную роль играли «эк .дал рас- -сматаивае»ые ротэдошно-диффуэионной тес ей (Заседателев а. а и лр.'. »981; /вкоеии 'ль-. 1<73б; „аризешяц л.. агосгпаз а. 19/6). ока йс-ходит ю того, .то лнтенсивно луореспироватъ моги- толы» достаточно жесткие, плоскиэ сопряженные элеютонные систем. вели струюура моле-куш красителя не обладает требуемое жесткостью, то. даже при наличии в ее а таве способных к наивной флуореспенхши Фрагеентов. в несвязанном состоянии в водных растворах она бупг- светиться слабо, поскольку для нее в этом случае значительной будет вероятность безизлуча-тельных переходе- электронов из возбужденного состояния в основное за счет протекзша внутри рассматриваемой молекулы проиессоь Ротационной диффузии в случае, специфического взажедейетвия с субстратом происходит стабилизация рассматриваемой молекулы (перевод ёе в более плоское состоят®) , исклечактая для нее возможность совершать колебатегные движения, вследствие этог , доля радиационных алеюронных переходов, а с ответствен» и кчангоньй выход, у нее будут увеличиваться а в пределе. оупут зависеть только от "возбу ;(моста", нэторая определяется числом и хгг^акгером взгшш в молекулу потенциально спосо^чых к Флуо-реси -шии фрагментов.

однако, дг1 соединений иьмупп, .вследствие достаточно близкой степени жесткости планг^ной структуры их молекул, такие необходим был

\ \ \ V \

п2м=сн— у о2; — у ц=с - у Р— У / (Сп-0,7в>/(вп-0,вв) /(бпНв0о,4и) /

V- \ \ "V у

НЫУ

/ /

н

н

(6ПШ0,24)

но

(б

—сн2—А н— \и н—сна-\ нэс— у

п = 0,03)/(бп-0) / / (в„ш-0, 17)

Нм\ \ \ \ ны \

о— \ но— \ \ "^ъ— к— \

/ (б„ = -Ь,37)/ " / I Н /

Н2Н—■ \ И —НН— Л Н|/ \

(бп = -0,68) / / ^-' /

„3с-гГЛ-\ С- )

Рис. 4 Ряд о лосотельной электродной донорно-акпег.торнол активности терминальных заместителе''. влияси».* на лвминесцешше свойства внеш-несеизываюшихся субстрат-спеш-чшных красителей Последовательность ряда определяется величиной Убывания элеютоно-акцепт- рног I увеличения (при 6п<0» элекрроно-донорной активности вхояядах в него групп.

Условные обозначения: бп - значение консташы гажета. отаажагаей влияние лместигсля на ядро соединения.

учет Факторов, расскр-'оивае» х вывеуказанной теорией внутримолекулярного доногао-аклепторног.- взаимодействия. Подтверждают предположение о д-Лгп. .шом характере механизма изменения Ф"/оресцентаьк свойств соединений бисбензждаазольного г--да (VI)-(X) и санные, полученные для них " 50г рас. ope сахарозы, ингтшруюлем. как известно (KaiuscinsKl J.. scoczvias а . l^ö;, процессы ротационной диффузии в модеютс.. подобных красителей характер свечения, при этом, бьш проиежуточньн мег-ду таковым. '-"блсди лимся для рассот. иных соединений в стандартном буфере А в несвязанном состс.шии и при максимальном насыпении полинж-леотчаж ж и адекватность системе лиганд-днк наблшапась как по Д8-. так и по кч-пикам возмещения исследованных красителей

Такда образом, при объяснении совокупного изменения спектральных се .ютв Флуоресцешных рнешнесвязывакдахея шк-спешшаш красителей необхош' 1 учишвать следующие осноиие Факторы. Вэ-первых. следует обратил, витание на t эдаческое соответстше молекулы красителя субстрату и возможность специфического взажг действия между ними. Во-вторых. должен быть учтен характер потенциально пособных .. Флуоресценции фрагмекюа входящих в состав иоггчул рассматеиваемых соединений, при равном характере таких фрагмекюа Следует обратить внимание на различие в жесткости и планарноста структур сравниваемые красип...ей Бели Различия имеются, то для прогнозирования ' относите льне -о изменения спектеальйых свойств та*"х красителей следует, - в перрую очеядь, ноль- • зоватъея теорией ротационной 'диффузии, ê ти же сравниваемые соединения имеют примерно равную, степень жесткости и шикарности химических структур своих к лекул, либо иеют в своем состав, единственный. способный к активной Флуоресценции фрагмент, как а случае рассмотренных в настоящей работе ' соединений Ш-(\л. :то для прогнозирования относительно! изменена,! rix Фпу-^эспентных Свойств ■-ледует. пользоваться Tto-рией шутримолекулярного донорда-акце торного взаимодействия.

В u в оды■

I. V большинства исследованных в настоящей работе соединений зарегистрирован^ наличие -вух, пико возбужпенда (совпадаютих по своему положенно . с'аналогичньми пиками на спектрах поглощения) пга одном твое Флуореснэнтной эмиссии При этом, можно полагать что кв-ослоса на спектрах поглошиния (а соотвр-ттлвенно. и озбуждения) рассмотренных красителей обусловлена характером хромофорных групп, входяшх в состав ядра их молекулы, а дв-полоса - обтей структурой молекулы красителя и. в том числе, характерен входяшх в ее состав тернинальных радикалов

г. Данш? по изменен,» спектральных характеристик исследованных со-

единений в изопроганоле по стюте~:о к их свеченяо г т>втх стелах свидетельствуют о том, что создание для внешнесвязываидихся ДНК-спетш-Фичных кра'"••гелей в узк.л бороздке полиня .'отида условна подоъпых гидрофобному микроокружешаа является одним га Факторов, обесп лваю-ших увеличение Флуор"сг-кции в рассматриваемой системе лиганд-дак. Таким образом, система лиганд-сп. л. при наличии ои .деленных 01 шиче-гш мс-гг сшить спектральной модель» комплекса рассматриваемого1 красителя с полинэтик. стадом.

3. для большинства исследован^« красителей отпечено наличие двух типов связывания с полинуклеотедом. при этом, установлено, что изменение свечения в рассмотренных системах лимтирует линь сиганый. специфический тип такого взаимодействия.

4. На основе анализа экспегимет альных данных, разработал Ьсгод к^ • личественной опенки относительного вклада водородных и данных связей в специфическое взаимо; I. гвие улуорофоро^. с ШК. те: -мотоенных системах наличием этих двух типов связей практически полностью определялось образование аюивно флуоресиируипего комплекса красителя с ДНК. Соотношение между величинами вкладов водорода.. и ион. .л связей в таковой процесс существенно изменялось, ь зависимости от характера термина пь-ных групп и структуры ядра кллекулы красителя, г тако. собствен?"- на величин максимального относительного квантового выхода в плтсутстр- I 'ШК в буфере с низкой юнно'- силой, не имешем в своем составе примесей. способны: инпюировать обрчзование водородных связей в системе лигачд-днк, природа сил сь ;ывания исследовании кра ••гелей прак ччес-ки не влияла.

5. установлено, что в рассмотренных система« южигель-д« тело место увеличение специфичности по отнсоенмо к субстрату (величина, обратно. числу мест связывания - 1/п; при увеличении сродства к нему (выражаемого величиной константы скэтчарда - I) рг -сматт- заеного красителя; причен. тем в меньшей мер«.' чем вы? величина к

& Пок; ано, что способность красителя сыть эФФектвон гоорофорон на требуемый субстрат, помимо его специфичности л селеотивноста определяется не столько "статичесюии" »например. - максинадьмл относительный квантошй выход в пгигуклвии /ПК), ско ко "«амичесж-чи (напржер. - коэФФ"аиент Флуоресцентной чувствительности по отношен» к ДК) его хараотерисг 'ками, Важное значение, при этом, теет выбор оптимального диапазона соотношений кондапрашй СдшТСкрас. а также огпжального состава среды измерения.

7. сгтечено, что многие зависает межю теэтралым« и нстлек-сообразуками параметрами исследованных красителей мели разят« ха-

. » . ■ V » í'if

рактер для соединен;"' са ржайиих УЬ составе "ядра" своей молекулы один и два (бисбензимидг "ольные прбизвй&ные) гетеро'тиклических хромофорных .рагмента. коммерческий краситель dir-: (соединение V). пги этом, по значениям таковых пар- гетров занимал промежуточное положение межг- вьаеназ1--нньш рядами исследованных соединений. Очевидно, это явилось следствием ча;и«ия в составе его молекулы трех гетерошйоюв. входящих в единую сопряженную систему.

е. Разрабог \н сш. „об оценки оту-ситольных вкладов в изменение свечения .пигандов днк пронесся внутримолекулярного донорно-акцепторного взаимодействия роташюнной диффузии На основании полученных экспериментальных данных предлс лна модель, вкпшашая в себя совместное , рассмотрение; выюназ ванных процессов и позволяшая проводить адекват-ну. опенку Флуореснеотных своялв внешнесвязываюшхся субстрат-специФичных i кителей, исходя их ик химической структуры

9, В рамках механи а внутржолекулярного донорно-акиептошого взаимодействия аюгвных групп, входящих в .хтав исследуемых соединений, предложен ряд терминальных заместителей, коте. ьй тоже к-жет бьпъ полезен при оценке спекгеальных свойст красителей и пда конструировании новых ФлуороФоров на ДНК с заданньми свойствами.

■ СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Иванов а д. Гагабаг -и к а. Сибирцев ц а , Фомина Е ч. спектральные свойства монобек^имидазолов при взаимодействии с днк / тех докл. VII конференции пг спеюроскопии июполимероа Харьков. 1991. -С 117-119. ' .

г. абирцев ЕС.' Иванов а д механизмы взажодействия с ДЕ фармакологических 'препаратов бензимшшольного и Фенилиндольного ряда / Тез. докл. российской научной кон<* ^рениии ' "Создание лекарственных СРЕДСТВ". Н.. 19Ä -С 170-171.

3. Сйбираев а с, гарабадаиу а. в. ' Иванов с. Д • неханизмы взаимодействия красителей Фетшбензжиоазольнфго и Фенилиндольного ряда с д®. //Бйооргаг хжия. -1994. -тга не. -а650-666.

4. аюиртев Е С поиск новых Флуоресцентных красителей для диагностом низких доз рвдиашкодых поражении. / тез. докл. научно-пракш-ческой конференции молодых специалистов «новые медицински? технологш Э области лучевой диагностики, терапии и интер. .чшюнной рздиологуи". СПб.. 199». -с 167-169. _

14.04.95 Зак 62-65 УТЛ ИХ СлЛТЕЗ, Московский тф., 26