Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование лектинов при раневом стрессе у сортов винограда с разной степенью тканевой совместимости

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Исследование лектинов при раневом стрессе у сортов винограда с разной степенью тканевой совместимости"

российская академия наук

ОРДЕНА ТРУД030Г0 КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИИ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи

\

ТИТОВ Евгений Викторович

ИССЛЕДОВАНИЕ ЛЕКШЮВ ПРИ РАНЕБОМ СТРЕССЕ У СОРТОВ ВИНОГРАДА

• С РАЗНОЙ СГГЕПЕНЬй ТКАНЕВОЙ СОВМЕСТИМОСТИ

СОЗ. 00.12 - физиология растений)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических каутс

ч

Москва, 1932

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знамени Институте физиологии растений им. К. А, Тимирязева РАН

научный руководитель:

кандидат биологических наук А. Д. Володарский

официальные оппЬненты:

доктор сельскохозяйственных наук, профессор К. В. Смирнов -кандидат биологических -наук Э.И.Выскребенцева

Ведущей учреждение -|

Украинский аграрный университет

Защита состоится '^C'J^-^yVlSS2 года, в

/9*°

Г*, ча

(7

часов -

на заседании Специализированного совета ко присуждении ученой степени кандидата биологических наук CK 002.45.013 при Институте йгзиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН по адресу: Россия, 127276 Москва, ул.' Ботаническая, 35.

С диссертацией цосно ознакомиться в библиотеке Института физиологии'растений им. К.А.Тимирязева РАН. Автореферат разослан " " 1932 года.

Ученый секретарь Специализированного совета канд.биол.наук

.4L

JI. И. Сергеева .

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Лектинаы уделяется значительное, внимание в связи с проблемой межклеточных взаимодействий. Их роль активно исследуется при изучении морфогенеза, оплодотворения, симбиоза, паразитизма и ряда частных вопросов физиологии растений С Королев ,1984', Семенов, Внстребенцева, 1985; Clarke, 1985; Lis,Sharon, 1985*, Hoson,Masuda, 1997; Jahnen, 1989; Moerschacher, 1990', Ильинская,Озерецковская,1991* Watanabe, 1991}. Не менее вазной, как с теоретической так и с практической точек, зрения, представляется проблема взаимодействия соматических клеток при трансплантациях растительных тканей. Однако зта. область практически не разработана. Икептся лишь гипотетические соображения о механизмах мех-клеточного узнавания (Уеотгп, 1984", Гродзикский, 1985}. Они основаны, главным образом, на физколого-бисхимических к анатоио-морфологических данных,•полученных в связи с изучением совместимости и несовместимости растительных тканей при трансплантация^Kollmann,1985; Vaathcrhsad.Barnett, 1936; Holden, 1987; Gebhardt,Goldbach, 1988; ЕулахД938; Teidenann, 1939}. При этом исследователи совершенно сЗсшлк вниканием этап,предшествующий непосредственному взаякздэйствчп трансплантатов, а именно, зтап воздействия предтрансплантацион-ного поранения ка неповрежденные пркранэвш клетки.

Известно, что поранение стимулирует отзетную реакцию, следствием которой являются структурные я функциональные. изменения з клетках CVan Sleveninck, 1973; kronen-aid,Hanson, 1532; Neumann, 1989}. В число веществ, изменением активности которых .клетка реагирует на раневой стресс, входят лектины СЛгхЗкыова.ЩэрбухЕН, 19913. Именно этот класс вецестз представляется адекватным для оценки судьба взаимодействия тканей при трансплантации. Тем не менее, отсутстзувт работы,, посвященные нзучс-шш влияния предтраЕсплантациоквого раневого стресса 5? изменение активности летткнов в тканях трансплантатов. Это привело нас к выводу о необходимости исследования г.талов, предшествующих непосредственному пзал-кодейстзил трансплантатов, а именно, влияем предтрансплан-тационпого рапегого стресса на активность гпктипов.

Изучение различных аспектов трансплантологии у растений представляется затакм как в плане. фундаментальных исследо-

ваний, связанных с проблемой взаимодействия соматических клеток при дифференциаций, так и при решении чисто прикладных задач привитого виноградарства. Последнее кал раз и обусловило выбор объекта, учитывая, что под привитыми виноградниками находится около 70% от общей площади виноградников, расположенных на территории стран - членов СНГ.

Цель и задачи работы. Целью работы явилось изучение лектинов тканей стеблей прквойно-подвоСши комбинаций винограда с различной степенью гистосовместимости для получения информации об участии этих белков в ответной реакции, тканей на предтрансплантационный раневой стресс.

В связи с этим в задачу настоящей работы входило:

- исследовать распределение лектинов, их активность и содержание белка дифференцированно по- тканям стеблей привой-ного и подбойных сортов винограда, различавшихся по степени тканевой совместимости;

- провести сравнительный анализ активности лектинов по субклеточным фракциям разных тканой стеблей привойного и под-войнкх сортов винограда;

- изучить активность лектинов и содержание белка в динамике предтранслантационного раневого стресса у разных сортов винограда;

- исследовать влияние раневого стресса на активность лектинов и содержание белка в субклеточных фракциях разных тканей стеблей привойного и подвойвых сортов винограда, различающихся по степени тканевой совместимости.

Научная новизна. Получены новые результаты о распределении лектинов по субклеточным фракциям тканей стеблей различных сортов винограда. Показано, что все ткани стебля винограда на предтрансплантационзый раневой стресс отвечают увеличением активности лектинов к уменьшением содержания в них белка. Установлено, что в результате предтрансплантационно-го поранения содержание белка в стеблях винограда изменяется в соответствии с кривой Селье. Высказано предположение о возможности участия растворимых лектинов,разрушенных в процессе поранения клеток^и лектинов периферических компонентов плазыалемш неповрежденных прираневых клеток перидермы, флоэмы и камбия в процессах межклеточного узнавания на

- s -

начальных этапах взаимодействия трансплантатов, в результате которого осуществляется адгезия и репрограммирование специализированных клеток стебля на каллусогенез. Теоретическая и практическая значимость работы. Проведенные исследования создают основу для более углубленного изучения начальных зталов взаимодействия трансплантатов, а именно, исследования процесса адгезии и репрограммирования специализированных клеток тканей стебля привойно-подвойных комбинаций на каллусогенез. Результаты по изучению ответной реакции хлеток на предтранспяантационный раневой стресс могут быть исполъзозаны при разработке технологии получения привитого материала. Показатель отношения активности лектинов периферических компонентов к гктивности лектинов интегральных компонентов плазмалеммы из клеток перидермы, йлоэш и камбия монет быть попользовал при разработке прогноза совместимости привойно-подвойных компонентов. Полученные данные расширяют современные представления о физиологических процессах, протекающих при трансплантациях у растений и ьсогут найти применение при изучении молекулярных и клеточных сскоб узнавания не только при трансплантации растительных тканей, но и в более широком аспекте бкокнгьнерных работ.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на IV Всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии растительной клеткиСМинск,1390), на 8-м Конгрессе Европейского общества фазкологов растений САмстердам,1992). Результаты работы были доложены на совместном семинаре Группы иммунохимии .растительных клеток, Лаборатории транспорта метабояи-тоз и Лаборатории роста и развития Ш>Р РАК С19Э2Э. Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, з том числа 2 патента на изобретался. Структура н объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, язлозсе^ия полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованной литературы. Диссертационная работа изложена на 136 страницах машинописного текста, содержит 38 рисунков. Слисок ис-лользсзаякых источников вклпчаег 153 яаикэнованнй, из которых 121 - на иностранных языках.

- 6 -

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Объектом исследования служили ткани стеблей винограда Vitis vinifera L. привойного сорта Ркацители и подвойяых сортов: Vitis berlandieri х Viíis riparia Кобер 5ББ, Vitis berlan-dieri x Vitis riparia Кречунел 2, Vitis rupestris x Vitis riparia 3306, Vitis solonis x Vitis riparia Соление. Под-войные сорта были подобраны с учетом степени их совместимости к привойному сорту. Для анализа использовали зеленые побеги с маточных кустов в возрасте 43 дней от начала вегетации, выращенные в опытном хозйстве НПО "Виерул"*СМолдо-ваЭ и на Гянжийской опытной станции*Азербайдяанского института виноградарства и виноделия САзербайджан). Материал фиксировали жидким азотом, используя для этого специальное устройство СТитов,Володарский,1S92). Ткани стебля препарировали визуально. В первув группу тканей входили перидерма, флоэма, камбий. Вторая группа включала ксилему и «ротокси-леыу. Третья группа была представлена сердцевинной паренхимой. Кроме того, в опытах использовали также стебли растений винограда тех же-сортов, выращенных in vitro, в возрасте 43 дней. Ткани идентифицировали под микроскопом, окрашивая фиксированные срезы сафронином и гематоксилином по Прозиной СI960).

Ткани стебля винограда разрушали в гомогенизаторе Н-305 СПолыпаЗ, оснаценным специальным устройством, позволяющим использовать жадкий азот СТитов, Володарский, 19S2). В работе была использована методика получения субклеточных фракций (Алехсидзе, Выскребенцева и др., 1983} с некоторыми изменениями, связанными с особенностями изучаемого объекта. В частности, при экстракции лектинсв была изменена концентрация некоторых компонентов среды выделения, а также соотношение между экстрагентом и навеской растительного материала. Материал экстрагировали средой следующего состава: 20 мМ калий-фосфатный буфер СрН 7,43; 6 мМ дитиотрейтол; 0,5 мМ фенилметилсульфонилфгорид; 0,35 М сахароза (буфер A3. Получение суммарной фракции органелл. Гомогенат ткани пропускали через двухслойный хлопчатобумажный фильтр, а затем ли при тех же условиях. Полученный осадок суммарной фракции

* автор и руководитель работы выражают признательность А. И. Литваку и Н.Г. Талыблы за предоставленный материал

- 7 -

I ТКАНЬ I

гомогенизация фильтрация центрифугирование

|ОСАЛОК

гоооод

нлдаАичш шшкоаъ гоооод

ресуспендирование в гипотоническом

растворе (осмотический шок)

ультрацентав

шутир1 Шзя

ювание

ЖИДКОСТЬ

гоооод

|20000д

надосадичная жидкость юоооод осадок юооооч

1

ресуспен-

дирование ^^-

центрифугирование в градиенте сахарозы

ОСАДи.К. 33^-45%

ЖГЕ= ГРАЛЬКЫЕ ком-ты ШГ—

► |АШ1й ФРАКЦИИ НА АКТШ0С1Ь МуТИШе) I <-

Рис.1. Схема получения субклеточных фракцЕЗ, облалакцих

лекткнозоЯ активностью, из тханэй стеблей винограда.

. ■ - 8 -центрифугировали 40 минут при 20000 д. Полученные в осадке органеллы Сядра я их фрагменты, пластиды и митохондрии) ре-• суспендировала в среде выделения и повторно центрифугирова-т оРР^неЖ 'дх^^вделения растворимых и мембран-

носвязанных лектянов.

Получение растворимой фракции клеток. Надосадочную жидкость, полученную после центрифугирования при 20000д центрифугировали в течение часа при 1СЮ000д. Полученная надосадочная жидкостьС ЮООООд) содержала растворимые клеточные компоненты и использовалась для определения активности лектинов.. Получение фракции плазмалеммы. Осадок, полученный после скоростного центрифугирования С100 000дЭ и содержащий кик-росомалъную фракции клеток, ресуспендировали в 17% раствора сахарозы и затем центрифугировали в ступенчатом градиенте сахарозы. Осадок, полученный на границе 38 к 45% сахарозы, представлял собой микросомальную фракции, обогащенную на 60% везикулами плазмалеммы. Этот осадок отбирали и исполь-' зовали для дальнейшего анализа. Чистоту этой фракции, проверяли электронно-микроскопическим методом после окраски препаратов цитратом свинца СТихая и др., 1976). Получение эгстрактов. обладающих лектиновой активностью. Для извлечения мембранносвлзанных компонентов органелл и интегральных компонентов цитоплазматических мембран использовали буфер, содержащий 1% растьор неионного детергента тритона Х-100. Растворимые компоненты органелл извлекали осмотическим шоком, используя гипотонический раствор буфера А. Периферические компоненты плазмалеммы извлекали буфером, содержащий хелатобразующий агент ЭДТА в концентрации ЮмМ.

Определение активности лектинов в экстрактах из субклеточных фракций. Активность лектинов в экстрактах, полученных из субклеточных фракций определяли методом микротитрования, используя 2,5% раствор трипсинизированных кроличьих эритроцитов СЛуцик,19815. Активность лектиновСР) определяли по следующей формуле: Р = 1 / А,

где А - активность лектинов, которая равна минимальному количеству белка, способному вызвать агглютинацию, в пересчете на грамм навески сырой ткани.

Содержание белка определяли по методу СВгабГогс1,1976).

Условия получения тканей для проведения опытов по изучению влияния раневого стресса.

Для изучения влияния раневого стресса на активность лектинов и содержание белка стебли винограда нарезали в стерильных условиях на диски толщиной 2-3 ш и помещали в чашки Петри на фильтровальную бумагу, пропитанную деионизованной водой. Чашки со свеженарезанными дисками помещали в герметично закрытый сосуд и выдерживали при естественном освещении и температуре +21°С. Отбор материала проводили через 4, 8, 12, 16, 20 и 24 часа. Вес отбираемых проб составлял около 250 1С. Опыты проводили в 3-5 кратных биологических повторностях. Статистическая обработка проводилась на персональном компьютере фирмы IBM с использованием программы Statgraphiks, версия 2,6.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЗДЕШЕ. Распределение лектинов и содержание белка в тканях стебля привойного и подвойных сортов винограда.

Учитывая, что лектины неравномерно распределены по тканям растений, а их количество изменяется в онтогенезе (Потапов, 19703, мы выбралл для анализа вегетирующие Сзеленыэ) стебли винограда. Это состояние тканей стебля дает возможность определить потенциальную способность их участия в процессах клеточной адгезии, так как клетки тканей на этой стадии.развития обладают наибольшей способностью к росту.

5 технологическом процессе получения привитого материала стебли винограда подвергаются рассечению, в результате которого образуется раневая поверхность. Сигнал о повреждении распространяется вглубь тканей, вызывая изменения в метаболизме неповрежденных прираневых клеток СБайдербек,19313.

Известно, что действие внешних повреждающих факторов оказывает влияние на белковые компоненты клетки САлександров, 1585). Очевидно также, что различные по своим функциям ткани, составлявщлэ стебель, будут отличаться и по реакции на предтрансплантационное поранение. В связи с этим было важно определить содержание белка и активность лектинов в различных тканях стебля винограда.до поранения.

Анализ тканей•стебля показал, что сердцевинная паренхима винограда у всех сортов отличается наибольшим содержали-

ем белка растворимой фракции С рис. 23. Возможно, это связано с тем, что сердцевинная паренхима была полностью представлена неодревесневшими клетками, что, е сбою очередь, является косвенным свидетельством ростовой активности клеток сердцевинной паренхимы.

белок,мг/г ткани

Рис.2. Распределение белка в растворимой фракции клеток* тканей. стеблей привой--С ного и подвойкых сортов винограда« : Рк- Ркацители, Ко-Кобер, Кр- Крэчунел, 33- 3306, Со- Соло-нис. Ткани: П- пери-•П дерма с флоэмой и камбием, К- ксилема, С- сердцевина.

* на этом рисунке и далее подвойные сорта: Кобер 5ББ, Кре-чунел 2, 3306 и Солонис расположены по степени совместимости к привойному сорту Ркацители от совместимого н не-совместмоыу слева направо.

По содержанию белка, извлеченного из плазмалеммы, ткани исследованных сортов существенных отличий не имели. Это может быть объяснено структурным подобием цитоплазматических мембран клеток тканей, составляющих стебель.

Распределение активности лектинов по сравнению с распределением белка носило более выраженный характер. Подтверждением этому -является высокая активность лектинов из растворимой фракции клеток перидермы, флоэмы и камбия Срис.3) и фракции интегральных згошюкснтов ксилемы (рис. 4) у всех исследованных сортов винограда. Исходя из данных Байдербека (19813 о диффузии клеточного экссудата, образующегося при поранении тканей, а также наших данных об активности лектинов, можно предположить, что между трансплантатами создаются условия для взаимного обмена водорастворимыми лектинами.

Это дает основание предполагать, что группа тканей, содержащих камбий, в рассматриваемом процессе занимает доминирующее положение, так как у всех сортов она отличается наибольшей активностью лектинов (рис.33.

- И -

активность лектинов.отн. ед.

Рис. 3. Распределение активности лектинов растворимой фракции клеток стеблей ■ привойного и подбойных сортов винограда: Рк- Ркацители, Ко--С Кобер, Кр- Кречунел, -К 33- 3306', Со- Соло-нис.Ткани: П- пери--П дерма с флоэмой и камбием, К- ксилема, С- сердцевина.

Одним из свойств цитоплазматической мемб{заны является ее способность к адгезии, которая реализуется посредством участия в этом процессе мембранносвязанных лектинов. Известно также, что неспецифическая адгезия играет существенную роль при формировании контакта трансплантатов СУеотап,19843. Наиболее высокая активность лектинов фракции интегральных компонентов плазмалеммы была отмечена нами в клетках ксилемы Срис. 4), которая, как показал Недетапп С1989), в случае совместимости трансплантатов образует наибольшее число плаз-модесм на единицу площади по сравнению с другими тканями стебля. С другой стороны можно предположить, что именно лек-тины цитоплазматической мембраны клеток являются наиболее вероятными рецепторами растворимых углеводсодержащих моле-

активность лектинов, отн .■ ед. 801-

Рис. 4. Распределение активности лектинов во фракции интегральных компонентов плазмалеммы.

Сорта винограда: Рк- Ркацители, Ко-Кобер, Кр- Кречунел, 33- 3306, Со- Соло-нис. Ткани: П- пери-П дерма с флоэмой и камбием, К- ксилема, С- сердцевина.

- 12 -

кул,которые могут диффундировать по апопласту вглубь тканей.

• На наш взгляд, соотношение показателей активности лектинов периферических компонентов и активности лектинов интегральных компонентов может служить мерой функциональной активности плазмалеммы с учетом ее адгезивных свойств. В этом смысле наиболее активной была плазмалемма клеток перидермы, флоэмы и камбия привойного и совместимых подвойных сортов винограда (табл. 1).

Таблица 1.

Отношение активности лектинов из фракции периферических компонентов к активности лектинов из фракции интегральных компонентов плазмалеммы до раневого стресса. •

Ткани стебля Отношение активности лектинов по сортам С в 50

Ркацители Кобер Кречунел 3305 Солонис

перидерма с флоэмой и камбием 30 43 35 19 7

ксилема 20 2 8 4 6

сердцевина 11 11 ■ 2 21 21

Существенных тканевых и сортовых различий в распределении по тканям иембранносвязанного белка на уровне сухарной фракции органелл нами не было обнаружено. Так, соотношение между содержанием белка из растворимой части органелл и содержанием белка, извлеченного из мембран органелл, колебалось от 1-2 до 5-7% в клетках всех тканей исследованных сортов.

Помимо сходных показателей в распределении белка и активности лектинов по тканям стеблей у исследованных сортов винограда были выявлены и черты отличия.Так, сорт Кобер отличался от других сортов наибольшим содержанием белка растворимой фракции клеток сердцевинной паренхимыСрис. 2) и наибольшей активностью лектинов растворимой фракции клеток перидермы, флоэмы и камбия (рис.3). Аналогичные, показатели у сорта Солонис были наименьшими. Для сорта Ркацители была характерна наименьшая суммарная активность лектинов из фракций плазмалеммы клеток всех групп тканей Срис.З).

Таким образом, на первом этапе исследования были охарак-

теризованьг ткани стеблей привойного и полвойных сортов винограда по распределению в них активности лектинов и содержания белка по субклеточным фракциям до воздействия раневого стресса,что позволило в дальнейшем оценить влияние пред-трансплантанионлого поранения Hi- адгезивные свойства тканей. Влияние раневого стресса на изменение содержания белка з стеблях винограда. Предтрансплантациокное поранение можно рассматривать в качестве стрессового фактора, под действием которого в неповрежденных приракевых клетках тканей стебля изменяется метаболизм (Glass,1978, Neumann, 1989, Гордон,1S92). Кроме того, поранение вызывает процесс адаптивного старения клеток, изменяя их структуру и функции CVan Steveninck,1975).Нами било установлено, что в ответ на предтрансплантационное поранение в стеблях винограда изменяется содержание белка, которое имеет фазный характер в соответствии с кривой-Селье (рис.5). Так, уменьшение содержания белка в первые 12 часов после поранения, с минимумом, приходящимся на 8 часов после поранения, мотао идентифицировать как реакции тревоги (Селъе,1972). Адаптация наступала, в среднем, через 14 часов после поранения.В этот момент величины содержания белка выходили на плато, приближаясь к исходным значениям. Подобная реакция наблюдалась как для водорастворимых,- так и для мембранносвязанных белков.

содержание белка, мг/г ткани-- Рис_ s_ Изменение

содержания . водорастворимого белка из стеблей винограда _Р в первые сутки после поранения. v Сорта винограда: Рк- Ркацители, Ко- Кобер 5ББ, Кр- Кречунел 2, 33- сорт 3306, Со- Солонис. (в иг/г веса сырой ткани).

время после поранения,часы

Таким образом, на основании этих . результатов был выбран временной интервал, соответствующий 14 часам после

рассечения стеблей на сегменты, для изучения влияния пред-трансплантационного поранения на активность пектинов и содержание белка в субклеточных фракциях тканей стеблей при-войкого и подвойных сортов винограда.

Влияние поранения на активность лектинов и содержание белка в субклеточных фракциях тканей стеблей привойного и подвойных сортов винограда. Известно, что переход клеток в "возбужденное" состояние при стрессе сопровождает ,зя изменением белкового 'Состава САлександров, 1985, \'1ег51.га,1989). Анализ тканей стеблей винограда, проведенный нами, также показал, что под влиянием раневого стресса происходит изменение содержания белка растворимой фракции Срис. 6). %

20

10

О

-10 -20

Рис.6. Влияние поранения на содержание белка С в- процентах к контролю - "О'") растворимой фракции клеток тканей стеблей сортов винограда: Рк - Ркацители, Ко - Ко^ер 5ББ, Кр - Кречунел 2, 33 - 3306, Со - Соление.

Неодинаковое изменение содержания белка растворимой фракции клеток у разных групп тканей является косвенным свидетельством различной скорости адаптационных процессов, протекающих в этих тканях. Возможно, что такая асинхронность ответа тканей, составляющих стебель, является наиболее оптимальным вариантом адаптации органа в целом на внешний раздражитель.

перидерма ксилема_ сердцевина

Рк Ко Кр Со Рк Ко Кр .33 Со Рк Ко'Кр 33 Со

- 15 -

Оценивая изменение содержания белка растворимой фракции клеток сердцевинной паренхимы через 14 часов после поранения, можно предположить, что ткань, содержащая наибольший процент неодревесневших клеток, способна к наиболее быстрому ответу на предтрансплантационное поранение С рис. 63.

Изменение содержания белка интегральных компонентов плазмалеммы клеток всех тканей стебля позволяет предпола-тать, что цитоплазматическая мембрана является относительно стабильной клеточной структурой Срис.73. Это предположение не противоречит данным, полученным другими исследователями

С Любимова и др. ,1988, Sussman,Harper,1989D. %

40

20

0

-20 -40

Рис.7. Влияние поранения на содержание белка Св процентах к контролю ~"0"3 периферических компонентов и белка интегральных компонентов плазмалеммы клеток тканей стеблей у сортов винограда: Рк- Ркацители, Ко- Ко-бер 5ББ, Кр - Кречунел 2, 33 - 3306, Со- Солонис.

ПШ1 - интегральные, | I - периферические компоненты

* - процент неодревесневших клеток.

Интересно, как изменение содержания белка фракции периферических компонентов плазмалеммы соотносится б .данными о процентном содержании клеток, способных к росту, в исследуемых тканях, полученными в нашей лаборатории.0.С. Соколовой. Так, перидерма с флоэмой и камбием состояла на'11-18й из неодре-

перидерма

ксилема

11-18%*

15-205«*

йл

Ж

сердцевина

100%*

ш

шг

Рк Ко Кр ЗУ Со Рк Ко Кр УЗ Со Рк Ко Кр Со

- 16 -

весневших клеток, ксилема - на 15-20%, а сердцевинная паренхима была полностью представлена клетками, способными к активному росту. Поскольку периферия цитоплазматичсской мембраны является ее наиболее мобильной частью, представ-' ленные данные можно считать косвенным показателем степени активации обменных процессов, вызванных предтрансплантаци-онным поранением.

Известно, что увеличение биосинтеза растворимых пектинов является ранней реакцией тканей в ответ на действие повреждающего фактора (Троицкий,1989). В этом случае становится понятным наибольшее увеличение активности растворимых лектинов из клеток сердцевинной паренхимы по сравнению с активностью растворимых лектинов из других тканей (рис.8).

У.

80

70 60 50 40 30 20 10 0 -10 -20 -30

Рис.8. Влияние поранения на активность лектинов Св процентах к контролю - "0") растворимой фракции клеток тканей стеблей винограда сортов: Рк - Ркацители, Ко - Кобер 5ББ, Кр - Кречунел 2, 33 - 3306, Со - Солонис.

Раневой стресс увеличивает зкспонированность лектинов на поверхности цитоплазматической мембраны (Любимова и др., 1988). Подтверждением этому может служить также увеличение

перидерма__ксилема

сердцевина

Рк Ко Кр 33 Со Рк Ко Кр 33 Со Рк Ко Кр 33 Со

активности лектинов периферических компонентов плазмалеммы клеток перидермы с флоэмой и камбием и клеток ксилемы С рис. 9.) Это увеличение мохет быть следствием-снижения уровня синтетических процессов в ответ на повреждающее действие предтрансплангационного поранения (Мелехов,1985, Александров, 19853. Доводом в пользу этого предположения может быть снигение активности лектинов периферических компонентов плазмалеммы клеток сердцевишюй паренхимы подвойных сортов винограда Срис.93.

Образование плазмодесм между контактирующими клетками

54

80 70 60 50 40 30 20 10 0 -10 -20 -30 -40 -50 -60 -70

перидерма

ксилема

Рк Ко Кр '¿'А Со

Рк до Кр 33 Со

сердцевина

Рк Ко Кр 33 Со

Рис.9. Влияние поранения на активность лектинов Св процентах к контролю - "0"3 периферических'и интегральных компонентов плазмалеммы клеток тканей стеблей у сортов винограда: Рк - Ркацители, Ко - Кобер 5ББ, Кр -Кречунел 2 , 33 - 3306, Со- Соление?.

|;."31 - интегральные,[ I - периферические компоненты

ксилеш трансплантатов (один из наиболее достоверных критериев их совместимости [Булах, 1988, Пебетапп, 1989]) является важным событием при формировании общей сосудистой системы. С этой точки зрения представляется интересным изменение активности лектинов, интегральных компонентов плазмалеммы клеток ксилеш у подвойных сортов в диапазоне от совместимого к несовместимому Срис.9).

Анализ активности лектинов периферических компонентов и активности лектинов интегральны}: компонентов показал, что в плазмалемме клеток перидермы, флоэмы и камбия раневой стресс увеличил эти соотношения между ними: у сорта Ркацители - на 50%, у сорта Кобер - на 28%, у сортов Кречунел и 3306 - на 7-9%. У сорта Солонис эти соотношения не измени' лись. Соотношения этих величин у исследованных сортов бино-града могут быть показателем различной скорости ответа тканей в ответ на поранение.

Итак, предтрансплантационное поранение, являясь фактором стресса, изменяет адгезивные свойства лектинов, полученных из субклеточных фракций тканей.стеблей исследованных сортов винограда.

заключение

Формирование спмбнотических отношений между трансплантатами (траксплантосимбиоз) является сложным процессом, который исследователи СБулах, 1983) условно делят на два этапа.

Первый этап протекает однотипно как в • случае совместимых комбинаций трансплантатов, так и для несовместимых и характеризуется индукцией репарационных процессов, направленных на заживление раневой поверхности с последующим отторжением деструктурированных клеток.

На втором этапе происходит репрограммирование специализированных клеток на каллусогенез. Образующиеся каллусные клетки прорывают феялоген-пробковкй слой, изолирующий раневую поверхность, и заполняют пространство между трансплантатами.

При совместимой комбинации каллусные клетки обоих трансплантатов образуют общий симпласт, где в последующем закладываются элементы проводящей системы. Если же на уровне каллусных клеток не происходит образования плазмодесм,

- 19 -

то это считается первым признаком несовместимости трансплантатов СКо11тапп,С1осктапп,19853.

Анализ■литературы, посвященный исследованиям указанных этапов взаимодействия трансплантатов показал, что их изучение на молекулярном и клеточном уровне невозможно без понимания тех процессов, которые происходят непосредственно после предтрансплантационнсго поранения.

Как показали наши исследования, предтраксплаятационпый раневой стресс изменяет метаболизм прираневых неповрежденных клеток. Следствием переориентации метаболических процессов является изменение количества белка в клетках. Общая динамика этого процесса в ходе раневого стресса соответствует кривой Селье. Что же касается активности лектинов, то она возрастает. Особенно следует отметить сильное увеличение активности лектинов, связанных с мембранными структурами клетки, что позволяет говорить о возможном усилении их рецепторных свойств.

Полученные данные пока не позволяют сделать определенных выводов относительно того, как реализуются адгезивные свойства лектинов после начала взаимодействия трансплантатов и как они влияют на совместимость. Вместе с тем было установлено, что отношение активности лектинов периферических компонентов плазмалеммы к активности ее интегральных лектино-вкх компонентов из клеток перидермы, флоэмы и камбия увеличивалось у подвойных сортов'от несовместимого к совместимому. Под влиянием раневого стресса эти сортовые различия сохраняются и усиливаются.

Не менее важным представляется тах же предположение о возможном взаимодействии растворимых лектинов разрушенных клеток и лектиновых компонентов плазмалеммы неповрежденных прираневых клеток в процессе индукции репрограммирова-ния специализированных клеток стеблевых трансплантатов на кал.1гусогенез. Эти данные, наряду с цитологическими исследованиями, проведенными в налей лаборатории О.С.Соколовой, подтверждают вероятность этой гипотезы.

Таким образом, на основании полученных результатов представляется целесообразным дальнейшее изучение роли лектинов периферических компонентов плазмалеммы и лектинов растворимой фракции клеток в процессах межклеточного

- 20 -

взаимодействия при трансплантациях у высших растений.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружены изменения активности лектинов при предтракс-плантационном раневом стрессе у сортов винограда с разной степенью тканевой совместимости. Показано, что общей реакцией тканей стеблей винограда на предтраксплантационный раневой стресс' является увеличение активности лектинов и уменьшение содержания белка.

2. Установлено, что в ответ на предтранспдантационное поранение содержание белка в стеблях винограда изменяется в соответствии с кривой Селъе. "Фаза тревоги" характеризуется уменьшением содержания бэлка в тканях стеблей винограда, минимальное значение которого наблюдается в .интервале от 4 до 8 часов после поранения. "Фазе адаптации" предшествует увеличение содержания белка, которое приближается к исходному значению через 16 часов после поранения.

3. Сравнительный анализ тканей стеблей винограда показал, что группа тканей, включающая перидерму, флоэму и камбий, отличается наибольшей активностью лектинов, содержащихся в растворимой клеточной фракции. Клетки ксилеш отличаются высокой активностью лектинов интегральных кошопентов плаз-малеммы. Клетки сердцевины характеризуются высоки« содержанием белка растворимой клеточной фракции к увеличением содержания белка в интегральных к периферических компонентах плазмалеммы под влиянием раневого стресса.

4. Показано, что клеточные органеллы отвечают на прэдтранс-плантационный раневой стресс снижением содержания белка и увеличением активности лектинов.

3. Отношение активности лектинов периферических компонентов к активности лектинов интегральных компонентов плаг;иалемш кз клеток перидермы, флоэмы и камбия увеличивалось у под-войных сортов от несовместимого к совместимому. Под влиянием раневого стресса эти сортовые различия сохраняются и усиливаются.

6. Высказано предположение о том, что лектины растворимой фракции разрушенных клеток и лектины периферических компонентов плазыалеьшы неповрежденных прираневых клеток перидермы, флоэмы и камбия участвуют на начальных этапах

межклеточного узнавания,. обеспечивая адгезии и репрограмми-розание клеток на каллусогенез.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Титов. Е.В. Выделение белков, обладавших пектиновой активностью из стеблей винограда. //Тезисы докл. IV Всесосз! конф. г.-ол. уч. по физиологии раст. клетки С Минск, 1990). С. 52.

2. Титов Е. В., Соколова 0. С., Володарский А. Д. Распре-ление активности лектинов ,по тканям стебля винограда. //Физиология растений. 1992. Т. 39. В. 1. С. 40-47.

3. Титов Е.В., Володарский А. Д. Устройство для замораживания и хранения биологических объектов.

//Заявка на патент 5027958, приоритет 12.02.92.

4. Титов Е. В., Володарский А. Д. Устройство для гомогенизации биологических проб в жидком хладоагекте. //Заявка на патент 5028281, приоритет 19.02.92.

5. E.V. Titov, A. D.Volodarsky. Influence of the wound stress cn the proteins content in grapes stem tissues. //8th Congress of the FESPP.Antwerpen.August 23-28.1992.

6. A.D.Volodarsky, E.V.Titov. Pretransplantation wound stress and problem of tissue compatibility.

//8Lh Congress of the FESPP. Antwerpen. August 23-28.1992.