Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование короткоживущих парамагнитных интермедиатов первичной фотохимической реакции в реакционных центрах фототрофных бактерий

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование короткоживущих парамагнитных интермедиатов первичной фотохимической реакции в реакционных центрах фототрофных бактерий"

Кленина Ирина Борисовна

ИССЛЕДОВАНИЕ КОРОТКОЖИВУЩЙХ ПАРАМАГНИТНЫХ ИНТЕРМЕДИАТОВ ПЕРВИЧНОЙ ФОТОХИМИЧЕСКОЙ РЕАКЦИИ В РЕАКЦИОННЫХ ЦЕНТРАХ ФОТОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ

03 00 02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

111111111111«11Н»1111

ООЗ 15857*4

Пущино-2007

Работа выполнена в Институте Фундаментальных Проблем Биологии РАН

Научный руководитель

доктор физико-математических наук Иван Игоревич Проскуряков

Официальные оппоненты

доктор физико-математических наук, профессор Александр Николаевич Тихонов

доктор химических наук, профессор Вадим Иванович Брусков

Ведущая организация

Институт Химической Кинетики и Горения Сибирского отделения РАН

Защита состоится « 24 » октября 2007 года в 13 30 часов на заседании диссертационного совета Д 002 093 01 при Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу 142290, Московская область, г Пущино, ИТЭБ РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН, г Пущино Автореферат разослан « 14 » сентября 2007 года

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат физико-математических наук

НФ Ланина

Общая характеристика работы

Постановка проблемы, ее актуальность

Основным источником энергии для всех живых существ, населяющих нашу планету, служит энергия солнечного света Фотосинтез - это процесс преобразования солнечной энергии в энергию химических связей В результате его протекания энергия солнечного света используется для синтеза органических веществ

Исследования общих принципов структурной организации и механизма первичных реакций фотосинтеза, происходящих в специализированных пигмент-белковых комплексах (реакционных центрах, РЦ) имеют большое значение, т к именно в РЦ происходит стыковка физических, биологических, биохимических процессов, которые и создают энергетическую основу жизни на Земле Эти исследования важны как для понимания самого процесса фотосинтеза, так и для создания высокоэффективных фотопреобразователей, работающих на сходных принципах

Фотосинтетические РЦ остаются объектом пристального внимания исследователей многих стран, и интенсивно изучаются Уже известна структурная организация ряда реакционных центров, но уникальные свойства этого объекта (практически равный единице и не зависящий от температуры квантовый выход первичного фотохимического процесса, асимметрия переноса электрона в РЦ и др ) остаются до конца не объясненными

Современный взгляд на механизм первичных стадий фотосинтеза предполагает, что с электронного возбуждения одной из молекул пигментов, входящих в состав РЦ, начинается цепочка реакций переноса электрона между его компонентами В процессе этого первичного разделения зарядов образуются парамагнитные продукты, такие как свободные радикалы, радикальные пары (РП) и триплетные состояния пигментов Эффективным методом изучения подобных состояний является электронный парамагнитный резонанс (ЭПР) Этот метод позволяет получать информацию о природе парамагнитных молекул, их магнитных взаимодействиях, динамических свойствах и, в конечном счёте, о механизмах реакций, в которых они принимают участие

Надо отметить, что спектры, полученные методом стандартного ЭПР, являются стационарными, в то время как большинство парамагнитных состояний в РЦ - короткоживущие В связи с этим, в качестве методического подхода в диссертационной работе выбран метод электронного парамагнитного резонанса прямого детектирования высокого временного разрешения (ВР-ЭПР) Важным преимуществом данного метода является также то, что он дает возможность регистрации парамагнитных состояний еще до протекания их заметной спин-решеточной релаксации или дезактивации

Из литературы известны многочисленные попытки применения кинетического ЭПР к исследованию фотохимических процессов в РЦ Между тем, при анализе этих работ обнаруживаются определенные проблемы

- существенные детали спектральной формы некоторых сигналов ЭПР препаратов РЦ, приготовленных одинаковым образом, измеренные исследователями разных групп, различаются,

- качество моделирования сигналов короткоживущих состояний РЦ (соответствие модельного спектра экспериментальному) зачастую весьма далеко от удовлетворительного, что вызывает сомнения в правильности интерпретации экспериментальных данных,

- сигналы некоторых парамагнитных состояний, (например, первичной радикальной пары, см ниже), наблюдаемые другими время-разрешенными методиками, методом ЭПР не наблюдаются вовсе

Цель и задачи исследований

Целью настоящей работы являлось исследование короткоживущих парамагнитных интермедиатов первичной фотохимической реакции в РЦ фототрофных бактерий методом ВР-ЭПР, что включало

- поиск сигнала ЭПР первичной радикальной пары (РП1) в реакционных центрах ряда фототрофных бактерий, его анализ с целью выяснения взаимодействий между компонентами РП1,

- исследование спектральных свойств сигнала ЭПР вторичной радикальной пары бактериального фотосинтеза (РП2), анализ зависимости формы сигналов РП2 от условий их регистрации, получение информации о взаимодействиях между компонентами РП2,

- систематическое исследование триплетных состояний бактериальных РЦ и анализ формы полученных спектров,

- разработку программ математического моделирования спектров ЭПР короткоживущих состояний РЦ с целью определения, из экспериментально полученных данных, величин магнитных взаимодействий и ориентации физических (оптических и магнитных) осей парамагнитных молекул

Научная новизна и практическое значение работы

Впервые зарегистрирован спектр ЭПР первичной радикальной пары фотосинтетического реакционного центра В результате разработанных программ спектрального моделирования (в среде ТурбоПаскаль 5 0) наиболее прямьм образом определен знак обменного взаимодействия (1РФ) между радикалами первичного донора и промежуточного акцептора РЦ для ряда фототрофных бактерий Определенный в работе отрицательный знак 1р$ согласуется с механизмом последовательного переноса электрона в первичной фотохической реакции бактериального фотосинтеза

Разработана методика измерения спектров ВР-ЭПР в условиях возникновения магнетофотоселекции (МФС) и разработаны программы математического моделирования полученных спектров

- вторичной радикальной пары бактериального фотосинтеза, с определением ориентации дипольной оси РП2,

- триплетных состояний бактериальных РЦ, с определением ориентации векторов оптических дипольных моментов перехода, 2), ряда

пигментов РЦ-связанного каротиноида сфероидина фототрофной бактерии Rb sphaeroides 2 4 1, а также первичного донора и промежуточного акцептора РЦ пурпурных бактерий

Найденные векторы были совмещены с известной рентгеноструктурной моделью РЦ, в результате были определены ориентации этих векторов по отношению к молекулярной структуре

Показан неизотропный характер возбуждения неполяризованным светом и, таким образом, определен источник ошибок в обработке и интерпретации спектральных данных в работах прошлых лет

Полученные результаты способствуют более глубокому пониманию механизмов переноса энергии и электрона в процессе первичной фотохимической реакции в фотосинтетических РЦ

Апробация работы

Основные результаты диссертации докладывались на международной конференции "Биоэнергетика фотосинтеза" (Пущино, 1996), IV International Symposium on Magnetic Field and Spin Effects m Chemistry and Related Phenomena (Новосибирск, 1996), 5th Joint Colloquium on Photosynthesis m Bacteria, Algae, and Higher Plants (Берлин, 1998), XIth International Congress on Photosynthesis (Будапешт, 1998), TMR meeting 'Molecular mechanisms of photosynthetic energy conversion' (Ноордвайк, 1999), ICP-XX International Conference on Photochemistry (Москва, 2001), Симпозиум "Современная химическая физика" (Туапсе, 2001 - 2007), XVII Pushchino Readings m Photosynthesis and International Conference "Primary Processes of Photosynthesis m Bacteria and Plant Photosystem II" (Пущино, 2002), VI Voevodsky Conference "Physics and Chemistry of Elementary Chemical Processes" (Новосибирск, 2002), International Conference "Primary Processes of Photosynthesis" (Пущино, 2003), International Conference 'Modern development of magnetic resonance' (Казань, 2004), а также на иных конференциях и семинарах

Основные результаты работы изложены в 28 публикациях, в том числе в 10 статьях

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, 5 глав с изложением литературных данных и собственного экспериментального материала, а также заключения с выводами Диссертация содержит 105 страниц, 36 рисунков, 6 таблиц Список литературы включает 166 ссылок на работы отечественных и зарубежных авторов

Содержание работы

Глава 1. Фотосинтез. Общее рассмотрение

Первая глава диссертации представляет собой обзор литературных данных по представленной теме В Разделе 1.1 дано общее описание явления фотосинтеза, при этом особое внимание уделяется первичным стадиям, а

именно, процессу переноса электрона через фотосинтетическую мембрану Раздел 1.2 посвящен фотосинтетическим реакционным центрам (РЦ) пурпурных бактерий, при этом в пункте 1.2.1 представлена информация о структуре РЦ фотосинтезирующей бактерии ЯЬ зркаегспйев 2 4 1 по результатам рентгеноструктурного анализа (СЬшпо е1 а1, 1994, Рис 1) Пункт

1.2.2 посвящен описанию оптических свойств РЦ В пункте

1.2.3 обсуждаются современные представления о первичных процессах фотосинтеза, происходящих в реакционном центре Как известно, первичным донором электронов в бактериальном фотосинтезе является димер молекул бактериохлорофилла Р (см Рис 1), и с его возбуждения в фотосинтетическом РЦ начинается серия реакций переноса электрона, протекающих с участием кофакторов т н активной цепи (А) На первом этапе электрон с возбужденного донора Р переносится на мономерный бактериохлорофилл ВА, формируя через ~3 пс (1-2 пс при криогенных температурах)

состояние [РТЗ \ ], за чем следует быстрый (0 9 пс при комнатной и 0 3 пс при низкой Т) перенос электрона с ВА на молекулу бактериофеофитина ФА с формированием т н первичной радикальной пары (РП1) [Р+Фд ], затем через 200 пс (80 пс при низкой Т) - с ФА на первичный акцептор, молекулу хинона Ра с формированием РП2 [Р+С>а] и, далее, через 100 мкс, на вторичный хиноновый акцептор СЬ При криогенных температурах перенос на <3В блокирован Перенос электрона от возбужденного Р к хиноновым акцепторам происходит трансмембранно, нормально к плоскости фотосинтетической мембраны В Разделе 1.3 обсуждаются парамагнитные состояния, формирующиеся в процессе первичной фотохимической реакции фотосинтеза, и, таким образом, обосновывается выбор используемого экспериментального метода (ЭПР) Раздел 1.4 посвящен описанию явления электронной спиновой поляризации электронов (ЭСП), заключающегося в появлении парамагнитных продуктов с заселенностью спиновых подуровней, отличной от Больцмановской В настоящее время известно, что ЭСП генерируется либо за счет процессов с участием спин-коррелированных радикальных пар (СКРП механизм описан в Пункте 1.4.1), либо путем спин-

Р

Рисунок 1 Схема расположения кофакторов в РЦ фотосинтетической бактерии ЯЬ врЬпегогЛев 2 4 1

селективной синглет-триплетной конверсии электронно-возбужденных молекул, обсуждаемой в Пункте 1.4.2 Регистрация ЭСП с последующим моделированием спектров может дать важную информацию о механизме фотохимической реакции и взаимодействиях между ее реагентами

Глава 2. Объекты и методы их исследования. Обработка измерений

В Разделе 2.1 описаны биохимические методики приготовления исследуемых препаратов выделение РЦ различных пурпурных бактерий, замещение негемового высокоспинового Ре2+ диамагнитным Хп2+, удаление хинона <3д и замещение фотохимически неактивной молекулы бактериофеофитина Фв растительным феофитином а Кроме этого, описано последующее приготовление образцов для ЭПР-измерений, а также процедура восстановления <3д для регистрации триплетных состояний в хинон-содержащих РЦ В Разделе 2.2 описан принцип работы используемого спектрометра ВР-ЭПР Сигнал, возникающий в ответ на короткую (~4 не) вспышку лазера (Рис 1), со сметителя СВЧ поступает на стробоскопический интегратор, длительность входной апертуры которого и её задержка после вспышки (БАР) устанавливает исследователь Таким образом, имеется возможность регистрировать амплитуду кинетики спада сигнала в интересующие нас интервалы времени Выходной сигнал интегратора записывается системой регистрации в процессе развертки магнитного поля с отключенной модуляцией Временное разрешение спектрометра равно ~50 не В Разделе 2.3 обсуждается явление магнетофотоселекции (МФС), возникающее при одновременном присутствии как анизотропии поглощения света, так и магнитной анизотропии возникающих парамагнитных продуктов Анизотропия поглощения света означает зависимость вероятности поглощения от взаимной ориентации электрического вектора возбуждающего света (Е) и оптического дипольного момента перехода Б^Бо (Х>) поглощающих молекул

Метод ВР-ЭПР для регистрации продуктов фотореакции был применен, до нашей работы, только в весьма ограниченном числе МФС-исследований (УатаисЬ ег а1, 1987, АЪуата е1 а1, 1994, Ые§еу ег а1, 1991) Важным преимуществом ЭПР-эксперимента с разрешением по времени является то, что он дает возможность регистрации начальной спиновой поляризации сигнала еще до протекания заметной спин-решеточной релаксации Методика измерения МФС методом ВР-ЭПР описана в Разделе 2.4

Рисунок 1 Диаграмма, поясняющая работу спектрометра ВР-ЭПР А -кинетика сигнала, возникающего под воздействием вспышки света, Б - интервал записи сигнала

Математическое моделирование полученных спектров ЭПР обсуждается в Разделе 2,5 В Пункте 2.5.1 изложены принципы математического моделирования спектров радикальных пар, точнее, описан примененный нами формализм СКРП, впервые введенный для объяснения формы спектра РП2 (С!о58 й а1, Ноге е* а1, 1987) В Пункте 2.5.2 обсуждаются физические факторы, определяющие форму триплетного спектра и математические методы его расчета

Первым шагом спектрального моделирования МФС-спектров ЭПР, описанного в Пункте 2.5.3, является расчет так называемого "изотропного" спектра, получаемого сложением одного Е\}Ве и двух Е1В0 спектров, измеренных при возбуждении образца линейно-поляризованным светом, электрический вектор которого направлен, соответственно, параллельно или перпендикулярно постоянному магнитному полю спектрометра Сконструированный таким образом "изотропный" спектр соответствует случаю равновероятного возбуждения всех ориентаций интересующей нас молекулы пигмента Моделирование "изотропного" спектра позволяет определить ряд параметров исследуемых состояний

сферические координаты

дипольной оси по отношению к системе осей §-хензора Сд в случае РП, а также ширины линий ЭПР и параметры расщепления в нулевом поле (РНП) в случае спектра триплетных состояний Эти параметры используются в последующих расчетах спектров ЭПР с МФО как константы

Следующим шагом

моделирования является расчет Е^Вв и Е1Вв спектров ЭПР Эффекты МФС учитывались введением амплитудных

коэффициентов, равных квадрату косинуса угла между оптическим дипольным моментом перехода И и электрическим вектором Е возбуждающего света (Рис 2) Амплитудные коэффициенты для двух ортогональных ориентаций Е по отношению к направлению магнитного поля Во, как функция углов 9 и ф, задающих ориентацию реакционного центра в магнитном поле, равны

г

используемые при моделировании спектров МФС для случая ЕАЛ0 х, у, г -главные магнитные оси молекулы (оси g-тензора <3д для РП или триплетные оси для триплетной молекулы), В -возбуждаемый переходный момент, Е -электрический вектор возбуждающего света, В0- вектор магнитного поля

для Е\\ Во

cos 2(E,D) = [sin#cos^sin£cosx+ sin#sm^sm<îsm/+ cosöcos^]2 (1)

для EUS о

cos2(£,ö) = (l/2)[(cos#cos0ismt5cos/+ cosösm^sm<5sin^- smöcosS)2 +

(sm^ sin<$cosy- cosфsim?smy)2] (2)

Необходимость моделирования двух независимо измеренных спектров (при Е\\В0 и Е1В0) существенно разной формы с одним и тем же набором угловых параметров {8 vif) приводит к высокой точности определения последних При этом не только соответствие спектральной форме, но и относительные амплитуды двух спектров рассматривались в качестве критерия соответствия модельного спектра экспериментальному

Важно отметить, что из исследований МФС можно определить только абсолютные значения проекций вектора оптического дипольного момента перехода метод магнетофотоселекции не чувствителен к знаку их координат (McGann et al, 1985).

Глава 3. Спектроскопия ВР-ЭПР первичной радикальной пары бактериального фотосинтеза [Р+Ф Ä ]

Как уже упоминалось в главах 1 и 2, первым относительно стабильным состоянием процесса переноса электрона в фотосинтетическом РЦ является первичная радикальная пара [Р+Фд ]• В Разделе 3.1 обсуждается современный уровень исследований РП1 теоретических (Ноге et al, 1993), оптическими методиками с разрешением по времени (Martm et al, 1986), методом РИДМР (Lersch et al, 1989) и с помощью магнитных эффектов MARY (Noms et al, 1982) Сигнал ЭПР РП1 до наших работ не наблюдался из-за короткого времени жизни пары В данной работе, используя адекватное разрешение по времени, удалось зарегистрировать спин-поляризованные спектры ЭПР состояния [Р+Ф Â ] в РЦ фотосинтезирующих бактерий Rb sphaeroides и В viridis с блокированным после феофитина переносом электрона, о чем рассказывается в Разделе 3.2 Упомянутые образцы демонстрируют хорошо известный спектр ЭПР 3Р Дополнительно, при коротких входных апертурах (gate) и малых задержках после вспышки (DAF) во всех исследуемых РЦ мы наблюдали появление неизвестного короткоживущего спин-поляризованного АЕ сигнала (А - поглощение, Е - излучение мощности СВЧ) Примечательно, что ЭСП сигнала типична для РП, рожденной от синглетного предшественника, а исчезновение этого сигнала по времени идет параллельно с нарастанием 3Р, т е А„ = 1 - А^, где Ан и Атр обозначают нормированные амплитуды нового сигнала и триплетного, соответственно Эти свойства однозначно указывают на то, что новый сигнал принадлежит предшественнику 3Р, т е первичной радикальной паре [Р+Ф À ] В Разделе 3.3 описывается моделирование полученных сигналов Теоретические спектры, соответствующие экспериментальным, представлены на Рисунке 3 линиями

Параметры расчета спектров, наиболее точно воспроизводящих экспериментальные, приведены в Таблице 1 В расчетах учитывался также эффект уширения спектров, вызванный коротким временем жизни РП1 (т)

Следует отметить, что рассчитанный сигнал [Р Ф д ] весьма чувствителен к знаку обменного взаимодействия При положительных 1рф, фаза спектра меняется на противоположную (ЕА) при любых значениях оставшихся двух параметров Таким образом, форма спектра ЭПР РП1 дает наиболее прямое указание на то, что 1РФ отрицателен, во всяком случае, в изученных нами РЦ В свою очередь, этот факт подтверждает реализацию механизма последовательного

переноса электрона в первичной фотохимической реакции

бактериального фотосинтеза (В)хоп е1а1,1991)

В Разделе 3.4 рассказывается о наблюдении и моделировании сигнала РП1 в РЦ мутанта ¥М210"\У бактерии КЬ зркаегогЗей, тирозин М210 в активной цепи которой заменен на триптофан (Рис 3, В) В Разделе 3.5 сформулированы краткие выводы третьей главы

В, мТп

320 325 330 335 340 345

Рисунок 3 Экспериментальные (точки) и соответствующие им расчетные (линии) спектры ЭПР РП1 А - В viridis, Ъ-Rb sph R26, В - Rh sph MY210W, DAF = 50 не, gate = 100 не

Joe, мТл Dd®, мТл t, HC

Rb sphaeroides -0 9 ± 0 1 -3 0-+1 5 ~1 5

В viridis -1 7±0 1 -3 0 ± 0 5 -2 4

Rb sphaeroides MY210W -2 4 ± 0 1 -2 8 ± 0 1 ~5

Глава 4. Спектроскопия ВР-ЭПР вторичной радикальной пары бактериального фотосинтеза [Р+(^а ]

Состояние [Р+С> а ] является первым относительно долгоживущим состоянием первичной фотохимической реакции фотосинтеза В нативных РЦ при температуре выше 15 К методом ЭПР наблюдается только сигнал Р+, т к

Qa испытывает сильное магнитное взаимодействие с парамагнитным Fe2+, что приводит к быстрой спин-решеточной релаксации Если разрушить магнитное взаимодействие, например, замещением парамагнитного железа Fe2+ диамагнитным цинком Zn2+, регистрируются спин-поляризованные сигналы РП2 Однако формы спектров ЭПР, полученных разными группами исследователей (к примеру, Hoff, 1994, Thurnauer, 1997), от препаратов РЦ, приготовленных одинаковым образом, существенно различаются Единственным отличием проведенных экспериментов, никогда не считавшимся важным, является длина волны возбуждающего РЦ света Общепризнано, что какой бы пигмент ни поглотил квант света первым, быстрый перенос энергии приводит к тому, что именно 'р* дает начало реакции переноса электрона

Было показано, что форма наблюдаемого спектра ЭПР РП2 претерпевает существенные изменения как при варьировании длины волны возбуждающего света, так и при повороте плоскости его поляризации, что объясняется проявлением магнетофотоселекции и обсуждается в Разделе 4.1 Раздел 4.2 посвящен математическому моделированию спектров РП2 с МФС,

которое дает информацию об ориентации переходного

момента D возбуждаемого пигмента Моделирование, как обсуждалось в Пункте 2.5.3, начинается с расчета "изотропного" спектра, что описано в Пункте 4.2.1 Используя величины

обменного и дипольного взаимодействий (Jpq = 0, DPq = -1 2 Гс), типичные для РГО (Hoff et al, 1997), были определены сферические координаты дипольной оси [P+Qä] по отношению к системе главных осей g-тензора Q;, равные а = 59° ± 3° и ß = 51° ± 3° Эти значения использованы в последующих расчетах спектров РП2 с МФС, которым посвящен Пункт 4.2.2 Свободными

параметрами модели в дальнейшем являлись сферические координаты оптического дипольного момента перехода Si<— So первичного донора электронов, Qy, по отношению к системе осей g-тензора Qa Модельные спектры, наиболее точно воспроизводящие экспериментальные (Рис 4),

329 331 329 33)

Рисунок 4 Экспериментальные (А, В) спектры ЭПР РП2 в Zn-замещенных РЦ Rb sphaeroides R26, Xb036 = 900 нм А - Е1£0, В -Е\\В() и соответствующие модельные (Б, Г) спектоы

получены при сферических координатах вектора 0_у 5 = 7°± 10 и у = 125° ± 3° Полученные в результате измерений МФС ориентации находятся в хорошем соответствии с рассчитанными из рентгеноструктурных данных Высокая точность определения Оу позволяет изучать изменения геометрии РЦ, даже небольшие, в процессе первичной фотосинтетической реакции В Разделе 4.3 сформулированы краткие выводы Главы 4

Глава 5. Спектроскопия ВР-ЭПР триплетных состояний бактериального фотосинтеза

Триплетные состояния не относятся к интермедиатам, которые образуются при функциональном переносе электрона, как, скажем, радикальные пары Между тем, эти состояния локализуются на тех же молекулах пигментов, которые участвуют в первичном разделении зарядов, и несут информацию о свойствах последних В Разделе 5.1 сформулированы условия формирования триплетных состояний в бактериальных РЦ Триплетное состояние донора 3Р заселяется, когда прямой перенос электрона после бактериофеофитина ФА блокирован (фото)химическим восстановлением акцептора <3А или его удалением При криогенных температурах квантовый выход 3Р практически равен единице При повышении температуры до 300 К он падает до ~0 14 В каротиноид-содержащих РЦ при Т > 40 К становится возможен Т-Т перенос энергии с 3Р на молекулу каротиноида (всЬепск е1 а1, 1984)

Т> 40К

'р'ФКар '[Р+ф-]Кар 3[Р+Ф~]Кар -> 3РФКар 'РФ3Кар 'РФКар (3),

и при повышении температуры скорость этого процесса увеличивается В Разделе 5.2 обсуждается современный уровень представлений о физической характеристике молекул пигментов, имеющей отношение и к возбуждению, и к переносу электрона - об ориентации оптических дипольных моментов перехода, 2>, относительно молекулярной структуры пигментов Имеется лишь скудная информация об этом важном свойстве, и любые оценки его являются, чаще всего, только теоретическими В Разделе 5.3 показаны возможности ВР-ЭПР спектроскопии при изучении триплетных состояний РЦ ЯЬ яркаегокЗез И26 и ЯЬ врИагго^ея 2 4 1 , а также, из моделирования полученных спектров соответствующих состояний, определены ориентации оптических дипольных переходных моментов первичного донора и каротиноида Как следует из схемы (3), изменяя температуру, триплетные состояния 3Р и 3Кар можно заселять избирательно и изучать по отдельности. Возбуждая же селективно различные пигменты РЦ и моделируя полученные триплетные сигналы ЭПР, можно определить ориентацию возбуждаемого оптического дипольного момента перехода в магнитных осях наблюдаемого триплета Такие эксперименты были проведены О регистрации магнетофотоселекции методом ВР-ЭПР триплетного состояния первичного донора, 3Р, в образцах РЦ ряда пурпурных бактерий и последующем моделировании полученных сигналов говорится в

Пункте 5.3.1 Полученные в результате моделирования параметры РНП триплетного спектра и сферические координаты вектора оптического

Таблица 2 Параметры моделирования спектра ЭПР 3Р для исследованных РЦ __пурпурных бактерий__

КЬ яркаегокЗея Ю.6 Ш> врИаегоШез 24 1 В1а$ЮсМога шкЬз

5 80и±5и 90" ± 10° 75" ±5"

У 70" ± 5й 90°± 10" 70" ±5"

Б(см-') 0 0188 ±0 0003 0 0188 ±0 0003 0 0156 ±0 0003

Е(см"') 0 0032 ± 0 0003 0 0033 ± 0 0003 0 0040 ±0 0003

дипольного момента перехода первичного донора относительно его триплетных магнитных осей указаны в Таблице 2

Используя существенное различие спектров поглощения Р и Кар (что позволяет осуществлять избирательное возбуждение этих пигментов) и возможность контроля заселения 3Кар и 3Р состояний изменением температуры (схема 3), мы провели 4 типа экспериментов

Тип 1 Прямое возбуждение первичного донора и регистрация сигнала 3Р (^озб = 896 нм, Т = 10 К) позволяет определить ориентацию оптического переходного момента донора (¿у относительно магнитных осей 3Р

Тип 2 Прямое возбуждение Р и регистрация сигнала 3Кар (Козб = 896 нм, Т = 100 К) позволяет определить ориентацию оптического дипольного момента перехода относительно магнитных осей 3Кар

Тип 3 Косвенное возбуждение 3Р, происходящее посредством Б - Б переноса энергии с возбужденного Кар и регистрация сигнала 3Кар =

Рисунок 5 Экспериментальные спектры ВР-ЭПР триплетных состояний в РЦ КЬ sphaeroid.es 2 4 1 (точки) и соответствующие им модельные (линия)

472 нм, Т = 100 К) позволяет определить ориентацию оптического дипольного момента перехода Кар 1> относительно магнитных осей 3Кар

Тип 4 Косвенное возбуждение 3Р, происходящее посредством 8-8 переноса энергии с возбужденного Кар и регистрация сигнала 3Р (Х,^ = 472 нм, Т = 10 К) позволяет определить ориентацию оптического переходного момента Кар I) относительно магнитных осей 3Р

Эксперимент первого типа был подробно рассмотрен в предыдущем Пункте 5.3.1 Что касается остальных трех, спектры ВР-ЭПР с МФС были зарегистрированы и смоделированы (Пункт 5.3.2 и Рис 5) с параметрами, указанными в Таблице 3

Таблица 3 Па раметры моделирования спектра ВР-ЭПР РЦ Rb sphaeroides 2 4 1

Qy относит осей 3Р Qy относит осей 3Кар D относит осей 3Р D относит осей 3Кар

8 90° ± 10й 75° ±3° 26" ±2° 28" ± 2"

У 90й ±10" 75" ±5° 58" ±10" 50и ± 7°

В Пункте 5.3.3 обсуждаются результаты эксперимента по измерению спектров ЭПР 3Р с МФС в РЦ Rb sphaeroides R26, нативная молекула бактериофеофитина в неактивной цепи которых замещена феофитином из высших растений, что, благодаря различиям в спектрах поглощения, позволяет избирательно возбуждать бактериофеофитин в активной цепи Моделирование полученного спектра позволило впервые определить сферические координаты оптического дипольного момента перехода Qf промежуточного акцептора ФА относительно главных магнитных осей 3Р S = 67° ± 3° и у = 27° ± 5°

Ранее, в исследованиях монокристаллов РЦ была определена ориентация системы магнитных осей 3Р по отношению к кристаллографическим координатам (Noms et al, 1989) Используя эту информацию, а также определив направления оптических переходных моментов ряда кофакторов относительно магнитных осей первичного донора и каротиноида РЦ, о чем говорилось в Пунктах 5.3.1 — 5.3.3, и имея кристаллическую структуру реакционного центра (1PSS, 4RCR, Protein Data Bank), представляется естественным рассчитать "абсолютные" ориентации векторов, те их направления в системе структурных координат соответствующих молекул (молекулярной системе) Такой расчет, важный для понимания путей переноса энергии в реакционных центрах, был проведен В Пункте 5.3.4 ориентация вектора Qy первичного донора Rb sphaeroides R26 пересчитана в молекулярную систему димера 6' = 74° ± 5° и у' = 85° ± 5°, что указывает на неполную симметрию (5' ~ 90 в симметричном Р) исследуемого РЦ Пересчет ориентации D молекулы каротиноида РЦ обсуждаемый в Пункте 5.3.5, показывает, что этот вектор соответствует смещению электронной плотности вдоль ядерного остова молекулы (считая, что фотофизические свойства каротиноида в основном определяются атомами, участвующими в двойных связях), и немного, на 8°, выходит из

средней плоскости молекулы Информация об ориентациях двух неколлинеарных векторов (Qy и D) в двух разных системах координат (3Р и Кар, Пункт 5.3.2), позволила впервые рассчитать положение магнитных осей 3Кар в его молекулярной системе

Пересчет ориентации вектора Qy промежуточного акцептора ФА в молекулярную систему координат, изложенный в Пункте 5.3.6, показывает, что исследуемый вектор на 15° выходит из плоскости молекулы, что объясняется, по-видимому, поворотом эффективного Qy за счет взаимодействия с мономерным бактериохлорофиллом ВА

Существует определенная особенность возбуждения образцов, которая до настоящего времени ускользала от внимания ЭПР-спектроскопистов, использующих для возбуждения образцов неполяризованный свет Эта проблема обсуждается в Пункте 5.3.7 на примере спектров ВР-ЭПР триплетного состояния РЦ lib sphaeroides R26 Как правило, возбуждение деполяризованным светом рассматривается как изотропное (Frank et al, 1985, например), и полученные спектры моделируются в предположении равновероятного возбуждения всех ориентаций РЦ Между тем, как видно из Рисунка 6А, моделирование в предположении изотропного возбуждения (пунктир) весьма далеко от эксперимента (точки), и корректным является расчет с учетом МФС (линия) Неизотропность возбуждения

деполяризованным светом легко понять, если учесть, что электрический вектор световой волны

ортогонален направлению ее распространения Вследствие этого,

молекулы образца, чьи оптические дипольные моменты перехода

ориентированы под

малыми углами к лучу света, имеют пониженную или даже нулевую (в случае параллельности лучу) вероятность

возбуждения Таким

образом, возбуждение образца в резонаторе ЭПР неизотропно даже при применении неполяризованного света Делается вывод, что при исследовании фотоиндуцированных магнитно-анизотропных состояний необходимо

310 330 350 310 330 350

Рисунок 6 (А) точками показан экспериментальный спектр 3Р при возбуждении деполяризованным светом, линией - расчет (Е ]| Вц+ Е1Во), пунктиром - расчет изотропно-возбужденного состояния 3Р

(Б) точками показан расчетно-экспериментальный

"изотропный" (£|)2?0+ 2*Е±Во) спектр,

линией показан расчет изотропно-возбужденного 3Р

принимать во внимание неизотропный характер возбуждения образцов В

Разделе 5.4 формулируются краткие выводы пятой главы

выводы

1 Методом ЭПР высокого временного разрешения (BP—ЭПР) впервые получен спектр первичной радикальной пары в реакционных центрах ряда фототрофных бактерий и проведено его математическое моделирование Определённый отрицательный знак обменного взаимодействия между первичным донором и промежуточным акцептором электронов РЦ подтверждает реализацию механизма последовательного переноса электрона в процессе первичной фотохимической реакции бактериального фотосинтеза.

2 Разработана методика измерения спектров ВР-ЭПР в условиях возникновения магнетофотоселекции (МФС) Указанная методика позволяет изучать МФС в случае короткоживущих состояний с быстрой спин-решеточной релаксацией, таких как триплетные состояния и радикальные пары Установлено, что противоречивые данные разных лабораторий о форме спектров ЭПР радикальных пар [P+Qa] бактериальных РЦ вызваны различными условиями МФС, возникающими в этих экспериментах

3 Впервые экспериментально определены ориентации оптических переходных моментов Qy первичного донора и промежуточного акцептора РЦ фототрофной бактерии Rhodobacter sphaeroides R26, а также ориентация D каротиноида сфероидина, входящего в состав РЦ Rhodobacter sphaeroides 2 4 1, относительно структурных систем координат соответствующих молекул Эти данные важны для дальнейших исследований механизма переноса энергии и электрона в реакционных центрах фотосинтеза

4. Впервые удалось определить ориентацию триплетных магнитных осей по отношению к структуре молекулы каротиноида сфероидина, входящего в состав реакционного центра Rhodobacter sphaeroides 2 4 1

5 Показано, что возбуждение образца в резонаторе спектрометра ЭПР не может рассматриваться как изотропное даже при применении деполяризованного света Игнорирование этого обстоятельства приводит к ошибкам в расчетах и интерпретации спектров ЭПР магнитно-анизотропных состояний

Материалы диссертации изложены в следующих публикациях:

1 Proskuryakov 11, Klenina I В, Shkuropatov A Ya, Shkuropatova V A, Shuvalov V A Free-radical and correlated radical-pair spm-polarized signals in Rhodobacter sphaeroides R-26 reaction centers // Biochim Biophys Acta 1993 V 1142 P 207-210

2 Кленина И Б, Проскуряков И И, Шкуропатов А Я, Хофф А Я, Шувалов В А Сигнал ЭПР первичной радикальной пары [Р+Г] в

необработанных и феофитинзамещенных реакционных центрах Rb sphaeroides R26 с восстановленным первичным акцептором /У Докл РАН 1996 Т 347 С 259-263

3 Кленина И Б, Проскуряков ИИ Спин-поляризованный сигнал ЭПР первичной радикальной пары в бактериальных фотосинтетических РЦ наблюдение и моделирование // Тезисы докладов Международной конференции "Биоэнергетика фотосинтеза" Пущино, 1996 С 33

4 Klenina IВ, Proskuryakov 11, Gast Р, Hoff A J, Shochat S Spin-polarized EPR signal of the primary radical pair of bacterial photosynthesis M(Y)210W mutant of Rhodobacter sphaeroides evidence for distribution of the radical pair properties // Abstracts of the IV International Simposium on Magnetic Field and Spin Effects in Chemistry and Related Phenomena Novosibirsk, 1996 P 117

5 HorePJ, Till U, Proskuryakov 11, KlemnalB, BoschMK, GastP, Hoff A J EPR of the spin-polarized primary radical pair m photosynthetic bacteria // Abstracts of the IV International Simposium on Magnetic Field and Spm Effects in Chemistry and Related Phenomena Novosibirsk, 1996 P 70-71

6 Proskuryakov 11, KlemnalB, Bosch MK, GastP, Hoff A J Detection of spin-polarized EPR signals belonging to the primary radical pair m bacterial reaction centers // Abstracts of the IV International Simposium on Magnetic Field and Spm Effects m Chemistry and Related Phenomena Novosibirsk, 1996 P 72-73

7 Proskuryakov 11, Klenina I В, Ноге P J, Bosch M К, Gast P, Hoff A J Electron paramagnetic resonance of the primary radical pair [0+ФА~] m reaction centers of photosynthetic bacteria//Chem Phys Lett 1996 V 257 P 333-339

8 Till U, Klenina I В, Proskuryakov 1 1, Hoff A J, Höre P J Recombination dynamics and EPR spectra of the primary radical pair m bacterial photosynthetic reaction centers with blocked electron transfer to the primary acceptor//J Phys Chem 1997 V 101 P 10939-10948

9 Proskuryakov 11, Klenina IВ, Borovykh IV, Gast P, Hoff A J Photoselection effects m EPR of spm-polarized photomduced states m photosynthetic RCs // Abstracts of the conference "Magnetic Resonance and Related Phenomena" Berlin, 1998 P 937-938

10 Proskuryakov 11, Klenina IВ, Gast P, Hoff A J Effects of photoselection in EPR spectra of transient states of photosynthetic RCs // Abstracts of 5th Joint Colloq-uium on Photosynthesis m Bacteria, Algae, and Higher Plants Berlin, 1998 P 18

11 Borovykh IV, Klenina IВ, Gast P, Hoff A J, Proskuryakov 11 Photoselection m ESP spectra of photosynthetic reaction centers // Abstracts of XIth International Congress on Photosynthesis Budapest, 1998 P 220

12 Proskuryakov 11, KlemnalB, BorovykhlV, GastP, Hoff A J Photoselection effects in EPR-detected triplet states of photosynthetic pigment molecules II Abstracts of XIth International Congress on Photosynthesis Budapest, 1998 P223

13.Proskuryakov I I, Klemna I В, Borovykh IV, Gast P, HoffA J

Photoselection effects in laser flash-mduced spm-polansed EPR spectra of the radical pair state [P+Qa ] m Rhodobacter sphaeroides reaction centers // Chem Phys Lett 1999 V 299 P 566-570

14 Borovykh I V, Klemna 1В, Proskuryakov II, Gast P, HoffA J Structural information on cofactor arrangement m photosynthetic reaction centers obtained from time-resolved EPR spectra with magnetophotoselection // Spectroscopy of Biological Molecules New Directions J Greve GJ Puppels, С Otto, eds KluwerAcad Publ Dordrecht 1999. P 189-190

15 Кленина И Б, Хофф А Я, Проскуряков И И Эффекты магнетофотоселекции в спектрах ЭПР триплетного состояния первичного донора фотосинтетических реакционных центров // сб тезисов IV Пущинской конференции молодых ученых Пущино, 1999 С 34

16 Кленина И Б, Боровых И В, Гост П, Хофф А Я, Проскуряков И И Эффекты магнетофотоселекции в спектрах ЭПР триплетного состояния первичного донора реакционных центров фототрофной бактерии Rb sphaeroides R26 // Докл РАН 2000 Т 370 С 546-550

17 Borovykh I V, Proskuryakov I I, Kleninal В, Gast P, HoffA J Magnetophotoselection study of the lowest excited triplet state of the primary donor in photosynthetic bacteria //J Phys Chem 2000 V 104 P 4222-4228

18 Proskuryakov 11, Kleninal В, BorovykhlV, HoffA J Magnetophotoselection studies with time-resolved EPR // Abstracts of XIth International Conference "Magnetic Resonance in Chemistry and Biology Zvemgorod, 2001 P 38

19 Kleninal В, BorovykhlV, GastP, HoffA J, and Proskuryakov 11 Magnetophotoselection studies of the S=1 states m photosynthetic bacterial reaction centers // Abstracts of ICP-XX International Conference on Photochemistry Moscow, 2001 P 440

20 Кленина И Б, Боровых И В, Хофф А Я, Проскуряков И И Эффекты магнетофотоселекции в спектрах ЭПР фотосинтетических бактериальных реакционных центров // Тезисы докладов XIII Симпозиум "Современная химическая физика Туапсе, 2001 С 61

21 Borovykh I V, Kleninal В, Proskuryakov 11, GastP, HoffA J Magnetophotoselection study of the carotenoid triplet state m Rb sphaeroides reaction centers //J Phys Chem 2002 V 106 P 4305-4312

22 Klemna IВ, Borovykh I V, Proskuryakov 11, and Hoff A J Simulation of spin-polarized EPR spectra of the S=1 states m photosynthetic bacterial reaction centers and structural information obtained from it // Abstracts of XVII Pushchino Readings in Photosynthesis and International Conference "Primary Processes of Photosynthesis in Bacteria and Plant Photosystem II" Pushchino, 2002, P 18

23 Kleninal В, Borovykh I V, Proskuryakov 11, and HoffA J EPR Detection and Spectral Simulation of the RP's State [P+QA"] of Photosynthetic RCs

Excited with Plane-Polarized Light // Abstracts of VI Voevodsky Conference "Physics and Chemistry of Elementary Chemical Processes" Novosibirsk, 2002 P 191

24 Кленина И Б, Боровых И В, Хофф А Я, Проскуряков И И Структурная информация, получаемая из моделирования спектров ЭПР радикальной пары [P+Qa"] фотосинтегических реакционных центров // Тезисы докладов XIV Симпозиума "Современная химическая физика" Туапсе, 2002 С 104

25 Borovykhl V, Klemnal В, Proskuryakov 1 I, Gast Р, Hoff A J The carotenoid triplet state m Rb sphaeroides RCs An EPR magnetophotoselection study // EPR m the 21st Century Basics and application to material, life and earth sciences Kawamori A, Yamauchi J, Ohta H, eds. Elsevier Science b v 2002 P 659-668

26 Proskuryakov 11, Klemna I В, Borovykh I V, Gast P, Shkutopatov A Ya Magnetophotoselection studies of the photomduced transient states of photosynthetic reaction centers // Abstracts of International Conference "Primary Processes of Photosynthesis" Pushchmo, 2003 P 37

27 Klemna I В, Borovykhl V, Shkuropatov A Ya, Gast P, Proskuryakov I I Orientation of the Qy optical transition moment of bactenopheophytm m Rhodobacter sphaeroides RCs//Chem Phys 2003 V 254 P 451-458

2%.Klemna IВ, Borovykhl V, GastP, Proskuryakov 11 Effects of

magnetophotoselection m EPR spectra of triplet states of photosynthetic bacterial RCs excited with plane-polarized light // Abstracts of the International Conference "Modern development of magnetic resonance" Kazan, 2004 P 262-263

Подписано в печать 12 09 2007 г Исполнено 12 09 2007 г Печать трафаретная

Заказ № 702 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ш

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Кленина, Ирина Борисовна

Список сокращений и обозначений

Введение

1 Фотосинтез, общее рассмотрение

1.1 Явление фотосинтеза.

1.2 РЦ пурпурных бактерий.

1.2.1 Структура.

1.2.2 Оптические свойства.

1.2.3 Первичные процессы фотосинтеза.

1.3 Первичные фотоиндуцированные парамагнитные состояния.

1.4 Электронная спиновая поляризация.

1.4.1 Спин-коррелированные радикальные пары.

1.4.2 Синглет-триплетная конверсия, S-T0 приближение.

2 Объекты и методы их исследования. Обработка измерений

2.1 Биохимические методики приготовления препаратов.

2.2 Метод электронного парамагнитного резонанса.

2.3 Магнетофотоселекция.

2.4 Техника измерения МФС методом ЭПР высокого временного разрешения (ВР-ЭПР).

2.5 Математическое моделирование спектров ЭПР.

2.5.1 Радикальные пары.

2.5.2 Триплетные состояния.

2.5.3 Конструирование "изотропного" спектра. Учёт эффектов МФС.

3 Спектроскопия ВР-ЭПР первичной радикальной пары бактериального фотосинтеза [Р+Фд ]

3.1 Формирование первичной РП (РП1) в бактериальных РЦ.

3.2 Наблюдение сигнала РП1 в РЦ фотосинтезирующих бактерий

3.3 Спектральное моделирование сигнала ЭПР РП1.

3.4 Наблюдение и свойства сигнала ЭПР РП1 в мутанте

YM210W бактерии Rb. sphaeroides.

3.5 Краткие выводы.

4 Спектроскопия ВР-ЭПР вторичной радикальной пары бактериального фотосинтеза [P+Qa ]

4.1 Наблюдение эффектов МФС сигнала ЭПР [P+Qa ].

4.2 Спектральное моделирование.

4.2.1 Моделирование "изотропного" спектра.

4.2.2 Моделирование спектров РП2 с МФС.

4.3 Краткие выводы.

5 Спектроскопия ВР-ЭПР триплетных состояний бактериального фотосинтеза

5.1 Формирование триплетных состояний в бактериальных РЦ.

5.2 Вектор оптического дипольного момента перехода.

5.3 Возможности ВР-ЭПР спектроскопии при изучении триплетных состояний РЦ.

5.3.1 Определение ориентации Qy первичного донора РЦ пурпурных бактерий.

5.3.2 Определение ориентации D каротиноида сфероидина РЦ фототрофной бактерии Rb. sphaeroides 2.4.1.

5.3.3 Определение ориентации Qy молекулы бактериофеофитина, промежуточного акцептора РЦ.

5.3.4 Пересчёт полученной ориентации Qy первичного донора в молекулярную систему координат.

5.3.5 Пересчёт полученной ориентации D сфероидина в молекулярную систему координат.

5.3.6 Пересчёт полученной ориентации Qy бактериофеофитина в молекулярную систему координат.

5.3.7 Неизотропный характер возбуждения неполяризованным светом.

5.4 Краткие выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование короткоживущих парамагнитных интермедиатов первичной фотохимической реакции в реакционных центрах фототрофных бактерий"

Постановка проблемы, её актуальность

Основным источником энергии для всех живых существ, населяющих нашу планету, служит энергия солнечного света. Фотосинтез - это процесс преобразования солнечной энергии в энергию химических связей. В результате его протекания энергия солнечного света используется для синтеза органических веществ.

Исследования общих принципов структурной организации и механизма первичных реакций фотосинтеза, происходящих в специализированных пигмент-белковых комплексах (реакционных центрах, РЦ) имеют большое значение, т.к. именно в РЦ происходит стыковка физических, биологических, биохимических процессов, которые и создают энергетическую основу жизни на Земле. Эти исследования важны как для понимания самого процесса фотосинтеза, так и для создания высокоэффективных фотопреобразователей, работающих на сходных принципах.

Фотосинтетические РЦ остаются объектом пристального внимания исследователей многих стран, и интенсивно изучаются. Уже известна структурная организация ряда реакционных центров, но уникальные свойства этого объекта (практически равный единице и не зависящий от температуры квантовый выход первичного фотохимического процесса, асимметрия переноса электрона в РЦ и др.) остаются до конца не объяснёнными.

Современный взгляд на механизм первичных стадий фотосинтеза предполагает, что с электронного возбуждения одной из молекул пигментов, входящих в состав РЦ, начинается цепочка реакций переноса электрона между его компонентами. В процессе этого первичного разделения зарядов образуются парамагнитные продукты, такие как свободные радикалы, радикальные пары (РП) и триплетные состояния пигментов. Эффективным методом изучения подобных состояний является электронный парамагнитный резонанс (ЭПР). Этот метод позволяет получать информацию о природе парамагнитных молекул, их магнитных взаимодействиях, динамических свойствах и, в конечном счёте, о механизмах реакций, в которых они принимают участие.

Надо отметить, что спектры, полученные методом стандартного ЭПР, являются стационарными, в то время как большинство парамагнитных состояний в РЦ - короткоживущие. В связи с этим, в качестве методического подхода в диссертационной работе выбран метод электронного парамагнитного резонанса прямого детектирования высокого временного разрешения (ВР-ЭПР). Важным преимуществом данного метода является также то, что он даёт возможность регистрации парамагнитных состояний ещё до протекания их заметной спин-решёточной релаксации или дезактивации.

Из литературы известны многочисленные попытки применения кинетического ЭПР к исследованию фотохимических процессов в РЦ. Между тем, при анализе этих работ обнаруживаются определённые проблемы:

- существенные детали спектральной формы некоторых сигналов ЭПР препаратов РЦ, приготовленных одинаковым образом, измеренные исследователями разных групп, различаются;

- качество моделирования сигналов короткоживущих состояний РЦ (соответствие модельного спектра экспериментальному) зачастую весьма далеко от удовлетворительного, что вызывает сомнения в правильности интерпретации экспериментальных данных;

- сигналы некоторых парамагнитных состояний, (например, первичной радикальной пары, см. ниже), наблюдаемые другими время-разрешёнными методиками, методом ЭПР не наблюдаются вовсе.

Цель и задачи исследований

Целью настоящей работы являлось исследование короткоживущих парамагнитных интермедиатов первичной фотохимической реакции в РЦ фототрофных бактерий методом ВР-ЭПР, что включало:

- поиск сигнала ЭПР первичной радикальной пары (РП1) в реакционных центрах ряда фототрофных бактерий, его анализ с целью выяснения взаимодействий между компонентами РП1;

- исследование спектральных свойств сигнала ЭПР вторичной радикальной пары бактериального фотосинтеза (РП2), анализ зависимости формы сигналов РП2 от условий их регистрации, получение информации о взаимодействиях между компонентами РП2;

- систематическое исследование триплетных состояний бактериальных РЦ и анализ формы полученных спектров;

- разработку программ математического моделирования спектров ЭПР короткоживущих состояний РЦ с целью определения, из экспериментально полученных данных, величин магнитных взаимодействий и ориентации физических (оптических и магнитных) осей парамагнитных молекул.

Научная новизна и практическое значение работы

Впервые зарегистрирован спектр ЭПР первичной радикальной пары фотосинтетического реакционного центра. В результате разработанных программ спектрального моделирования (в среде ТурбоПаскаль 5.0) наиболее прямым образом определён знак обменного взаимодействия (7РФ) между радикалами первичного донора и промежуточного акцептора РЦ для ряда фототрофных бактерий. Определённый в работе отрицательный знак 1РФ согласуется с механизмом последовательного переноса электрона в первичной фотохической реакции бактериального фотосинтеза.

Разработана методика измерения спектров ВР-ЭПР в условиях возникновения магнетофотоселекции (МФС) и разработаны программы математического моделирования полученных спектров:

- вторичной радикальной пары бактериального фотосинтеза, с определением ориентации дипольной оси РП2;

- триплетных состояний бактериальных РЦ, с определением ориентации векторов оптических дипольных моментов перехода, D, ряда пигментов: РЦ-связанного каротиноида сфероидина фототрофной бактерии Rb. sphaeroides 2.4.1., а также первичного донора и промежуточного акцептора РЦ пурпурных бактерий.

Найденные векторы были совмещены с известной рентгеноструктурной моделью РЦ, в результате были определены ориентации этих векторов по отношению к молекулярной структуре.

Показан неизотропный характер возбуждения неполяризованным светом и, таким образом, определён источник ошибок в обработке и интерпретации спектральных данных в работах прошлых лет.

Полученные результаты способствуют более глубокому пониманию механизмов переноса энергии и электрона в процессе первичной фотохимической реакции в фотосинтетических РЦ.

Апробация работы

Основные результаты диссертации докладывались на: международной конференции "Биоэнергетика фотосинтеза" (Пущино, 1996), IV International Symposium on Magnetic Field and Spin Effects in Chemistry and Related

Phenomena (Новосибирск, 1996), 5th Joint Colloquium on Photosynthesis in th

Bacteria, Algae, and Higher Plants (Берлин, 1998), XI International Congress on Photosynthesis (Будапешт, 1998), TMR meeting 'Molecular mechanisms of photosynthetic energy conversion' (Ноордвайк, 1999), ICP-XX International Conference on Photochemistry (Москва, 2001), Симпозиум "Современная химическая физика" (Туапсе, 2001 - 2007), XVII Pushchino Readings in Photosynthesis and International Conference "Primary Processes of Photosynthesis in Bacteria and Plant Photosystem И" (Пущино, 2002), VI Voevodsky Conference "Physics and Chemistry of Elementary Chemical Processes" (Новосибирск, 2002), International Conference "Primary Processes of Photosynthesis" (Пущино,

2003), International Conference 'Modern development of magnetic resonance' (Казань, 2004), а также на иных конференциях и семинарах.

Основные результаты работы изложены в 28 публикациях, в том числе в 10 статьях.

Структура и объём работы

Диссертация состоит из введения, 5 глав с изложением литературных данных и собственного экспериментального материала, а также заключения с выводами. Диссертация содержит 105 страниц, 36 рисунков, 6 таблиц. Список литературы включает 166 ссылок на работы отечественных и зарубежных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Кленина, Ирина Борисовна

Заключение

Основные научные результаты работы можно сформулировать следующим образом:

1 Методом ЭПР высокого временного разрешения (ВР-ЭПР) впервые получен спектр первичной радикальной пары в реакционных центрах ряда фототрофных бактерий и проведено его математическое моделирование. Определённый отрицательный знак обменного взаимодействия между первичным донором и промежуточным акцептором электронов РЦ подтверждает реализацию механизма последовательного переноса электрона в процессе первичной фотохимической реакции бактериального фотосинтеза.

2 Разработана методика измерения спектров ВР-ЭПР в условиях возникновения магнетофотоселекции (МФС). Указанная методика позволяет изучать МФС в случае короткоживущих состояний с быстрой спин-решёточной релаксацией, таких как триплетные состояния и радикальные пары. Установлено, что противоречивые данные разных лабораторий о форме спектров ЭПР радикальных пар [P+Qa] бактериальных РЦ вызваны различными условиями МФС, возникающими в этих экспериментах.

3 Впервые экспериментально определены ориентации оптических переходных моментов Qy первичного донора и промежуточного акцептора РЦ фототрофной бактерии Rhodobacter sphaeroides R26, а также ориентация D каротиноида сфероидина, входящего в состав РЦ Rhodobacter sphaeroides 2.4.1., относительно структурных систем координат соответствующих молекул. Эти данные важны для дальнейших исследований механизма переноса энергии и электрона в реакционных центрах фотосинтеза.

4 Впервые удалось определить ориентацию триплетных магнитных осей по отношению к структуре молекулы каротиноида сфероидина, входящего в состав реакционного центра Rhodobacter sphaeroides 2.4.1.

5 Показано, что возбуждение образца в резонаторе спектрометра ЭПР не может рассматриваться как изотропное даже при применении деполяризованного света. Игнорирование этого обстоятельства приводит к ошибкам в расчётах и интерпретации спектров ЭПР магнитно-анизотропных состояний.

Автор выражает глубокую благодарность своим учителям, Арнольду Хоффу и Ивану Игоревичу Проскурякову, за терпеливое обучение, помощь в экспериментальной и теоретической работе, обсуждение результатов и культивирование идей. Я признательна также коллегам, принимавшим участие в данной работе на разных её этапах, а также в её обсуждении, как в России, так и за её пределами: И.В. Боровых, П. Гасту, С.А. Дзюбе, Н.Д. Гудкову, А.Я. Шкуропатову, В.А. Шувалову. Особенно благодарна я также своей семье за понимание и терпение.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Кленина, Ирина Борисовна, Пущино

1. Л., Сагдеее Р. 3., Салихов К М. Магнитные и спиновые эффекты в химических реакциях. Новосибирск: Наука, 1978,296 с.

2. Вертц Дж., Болтон Дж. Теория и практические приложения метода ЭПР, Москва: Мир, 1975, 548 с.

3. Клейтон Р. Фотосинтез. Физические механизмы и химические модели. Москва: Мир, 1984. 350 с.

4. Кленина И. Б., Боровых И. В., Гаст П., Хофф А. Я., Проскуряков И. И. // Докл. РАН. 2000. Т. 370. С. 546-550

5. Кленина И. Б., Проскуряков И. И., Шкуропатов А. Я., Хофф А. Я., Шувалов В. А. //Докл. РАН. 1996. Т. 347. С. 259-263

6. ЛенинджерА. Основы биохимии. Москва: Мир, 1985. 1056 с.

7. Лихтенштейн Г. К, Котельников А. П., Куликов А. В. // Докл. АН СССР. 1981. Т. 257. С. 733-736

8. Мак-Глинн С., Адзуми Т., Киносита М. Молекулярная спектроскопия триплетного состояния. Москва: Мир, 1972. 448 с.

9. Проскуряков И. К, Шкуропатов А.Я., Сарвазян Н.А., Шувалов В.А. // Докл. АН СССР. 1991. Т. 320. С. 1006-1008

10. Шувалов В. А. Первичное преобразование световой энергии при фотосинтезе. Москва: Наука, 1990. 208 с.

11. AasaR., VanngardT. //J. Magn. Res. 1975. V. 19. P. 308-315

12. Akiyama K., Tero-Kubota S., Ikoma Т., Ikegami Y. // J. Am. Chem. Soc. 1994. V. 116. P. 5324-5327

13. Allen J.P., Feher G„ Yeates Т.О., Komiya H., Rees B.C. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. P. 6162-6166

14. Angerhofer A. // Chlorophylls / Ed Scheer H. Boca Raton, FL: CRC Press, 1991.945 p.

15. Angerhofer A., Bornhauser F., Gall A., Cogdell R. // Chem. Phys. 1995. V. 194. P. 259-261

16. Bauman D., WrobelD. //Biophys. Chem. 1980. V. 12. P. 83-91

17. Baxter R. H. G., Seagle B.-L., Ponomarenko N., Norris J. R. // Acta Crystallogr. Sect. D. 2005. V. 61. P. 605-612

18. Baxter R. #., Ponomarenko N„ Stajer V., Pahl R., Moffat K, Norris J. R. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. P. 5982-5987

19. Bittl R., Fuchsle G., van der Est A., Lubitz W., Stehlik D. // Research in photosynthesis, vol.1 / Ed Murata N. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ., 1992. P. 461-464

20. Bixon M., Jortner J., Michel-Beyerle M.E. II Biochim. Biophys. Acta. 1991. V. 1056. P. 301-315

21. Bixon M, Jortner J., Michel-Beyerle M.E. II Chem. Phys. 1995. V. 197. P. 389-404

22. Bixon M., Jortner J., Michel-Beyerle M.E. IIZ. Phys. Chem. 1993. V. 180. P. 193-208

23. Bixon M., Jortner J., Plato M., Michel-Beyerle M.E. II The Photosynthetic Bacterial Reaction Centers. Structure and Dynamics. / Eds. J. Breton, A. Vermeglio. N. Y.: Plenum Press, 1988,443 p.

24. Blankenship R.E. //Photosynth. Res. 1992. V. 33. P. 91-111

25. Blankenship R.E., Madigan M.T., Bauer C.E. // Anoxygenic Photosynthetic Bacteria. Advances in Photosynthesis, vol. 2 Dordrecht: Kluwer Acad. Publ., 1995. 1368 p.

26. Borovykh I. V., Klenina I. В., Proskuryakov 1.1., Gast P., Hoff A. J. //J. Phys. Chem. 2002. V. 106. P. 4305-4312

27. Borovykh I. V., Klenina I. В., Proskuryakov 1.1., Gast P., Hoff A. J. //EPR in the 21st Century: Basics and Application to Material, Life and Earth Sciences / Eds. A. Kawamori, J. Yamauchi, H. Ohta. Amsterdam: Elsevier, 2002. P. 659-668

28. Borovykh I. V., Proskuryakov 1.1., Klenina I. В., Gast P., Hoff A. J. //J. Phys. Chem. 2000. V. 104. P. 4222-4228

29. Bosch M. К., Gast P., Franken E. M., Zwanenburg G., Hore P. J., Hoff A. J. II Biochim. Biophys. Acta. 1996. V. 1276. P. 106-116

30. Bosch M. K., Proskuryakov 1I, Gast P., Hoff A. J. //J. Phys. Chem. 1996. V. 100. P. 2384-2390

31. Bosch M. K., Proskuryakov 1.I., Gast P., Hoff A.J. //J. Phys. Chem. 1995. V. 105. P. 15310-15316

32. Boucher F., van der Rest M., Gingras G. //Biochim. Biophys. Acta. 1977. V. 461. P. 339-357

33. Boxer S. G., Roelofs M. G. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. V. 76. P. 5636-5640

34. Breton J., Bylina E.J., Youvan C.Y. //Biochemistry. 1989. V. 28 P. 6423-6430

35. Breton J., Vermeglio A. // The Photosynthetic Bacterial Reaction Center: Structure and Dynamics. New York: Plenum Press, 1988

36. BudilD. E., ThurnauerM. C. //Biochim. Biophys. Acta. 1991. V. 1057. P. 141

37. ChadwickB. W., FrankH. A. //Biochim. Biophys. Acta. 1986. V. 851. P. 257262

38. Chang J.C. //J. Chem. Phys. 1977. V. 67. P. 3901-3909

39. Chauvet J.-P., Bazin M., Santus R. //Photochem. Photobiol. 1985. V. 41. P. 83-89

40. Chirino, A. J., Lous, E. J., Huber, M., Allen, J. P., Schenck, С. C., Paddock, M. L., Feher, G., Rees, D. C. //Biochemistry. 1994. V. 33. P. 4584-4593

41. Closs G. L„ Forbes M. D. E., Norris J. R. //J. Phys. Chem. 1987.V. 91. P. 3592-3599

42. Cogdell R. J., Durrant I., Valentine J., Lindsay, J. G., Schmidt K. // Biochim. Biophys. Acta. 1983. V. 722. P. 427-431

43. Cogdell R. J., FrankH. A. // Biochim. Biophys. Acta. 1987. V. 895. P. 63-79

44. Cogdell R. J., Monger T. G., Parson W. W. //Biochim. Biophys. Acta. 1975. V. 408. P.189-199

45. De Winter A., Boxer S. G. //J. Phys. Chem. 1999. V. 103. P. 8786-8789

46. Deisenhofer J., Epp 0., Miki K., HuberR., MichelH. //J. Mol. Biol. 1984. V. 180. P. 385-398

47. Deisenhofer J., Epp O., Sinning I., Michel H. //J. Mol. Biol. 1995. V. 246. P. 429-457

48. Den Blanken H. J., HoffA. J. //Biochim. Biophys. Acta. 1982. V. 681 P. 365369

49. Diner B.A., Babcock G.T. II Oxygenic Photosynthesis: The Light Reactions. Advances in Photosynthesis, vol. 4 / Eds D.R. Ort, C.F. Yocum. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ., 1996. P. 213-247

50. Dressier K., UmlaufE., Schmidt S., Hamm P., Zinth W., Buchanan S., Michel H. //Chem. Phys. Lett. 1991. V. 183. P. 270-276

51. El-SayedM. A., SiegelS. //J. Chem. Phys. 1966. V. 44. P. 1416-1423

52. Ermler U., Fritzsch G., Buchanan S.K., Michel H. // Structure. 1994. V. 2. P. 925-936

53. Feher G. //Photosynth. Res. 1998. V. 55. P. 3-40

54. Feher G., Hoff A. J., Isaacson R. A., Ackerson L. С. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1975. V. 244. P. 239-259

55. Feher G., Okamura M. Y. //The Photosynthetic Bacteria / Eds. R. K. Clayton, W. R. Sistrom. New York: Plenum Press, 1978. Chapter 19

56. Fragata M., Norden В., Kurucsev T. //Photochem. Photobiol. 1988. V. 47. P. 133-138

57. Frank H. A. // The Photosynthetic Reaction Center, vol. 2 / Eds. J Deisenhofer, J. R. Norris. New York: Academic Press, 1993. P. 221-231

58. Frank H. A., Bautista J. A., Josue J., Pendon Z, Hiller R. G., Sharpies F. P., Gosztola D., Wasielewski M. R. //J. Phys. Chem. B. 2000. V. 104. P. 45694577

59. Frank H. A., Bolt J. D., de Costa S. M. В., Sauer K. // J. Am. Chem. Soc. 1980. V. 102. P. 4893-4898

60. Frank H. A., Friesner R., Nairn J. A., Dismukes G. C., Sauer K. // Biochim. Biophys. Acta. 1979. V. 547. P. 484-501

61. FrankH. A., MachnickiJ., Felber M. //Photochem. Photobiol. 1982. V. 35. P. 713-718

62. Frank H. A., Machnicki J., Friesner R. //Photochem. Photobiol. 1983. V. 38. P. 451-455

63. Frank H. A., Violette C. A. //Biochim. Biophys. Acta. 1989. V. 967. P. 222232

64. Franken E.M., Shkuropatov A.Ya., Francke C., Neerken S., Gast P., Shuvalov V.A., HoffA.J., Aartsma T.J. //Biochim. Biophys. Acta. 1997. V. 1321. P. 1-9

65. Frick J., von Schutz J. U., Wolf H. C., Kothe G. //Mol. Ciyst. Liq. Cryst. 1990. V. 183,269-273

66. Fuchsle G., Bittl R., van der Est A., Lubitz W., StehlikD. //Biochim. Biophys. Acta. 1993. V. 1142. P. 23-35

67. Garab G. // Biophysical Techniques in Photosynthesis / Eds. J. Amesz, A. J. Hoff. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ., 1996. P. 11-40

68. Gast P., Norris J. R. //FEBS Lett. 1984. V. 177. P. 277-280

69. Gast P., Wasielewski M. R., Schiffer M., Norris J. R. //Nature. 1983. V. 305. P. 451-452

70. Hoff A. J. // Advanced EPR: Applications in Biology and Biochemistry / Ed HoffA.J. Amsterdam: Elsevier, 1989. P. 633-684

71. Hoff A. J. // Photosynthesis. New Comprehensive Biochemistry, V. 15 / Ed Amesz J. Amsterdam: Elsevier, 1987, P. 97-123

72. Hoff A. J. //Quart. Rev. Biophys. 1984. V. 17. P. 153-282

73. Hoff A. J., Proskuryakov 1.1. II Chem. Phys. Lett. 1985. V. 115. P. 303-310

74. HoffA.J. //Quart. Rev. Biophys. 1981. V. 14. №. 4. P. 599-665

75. HoffA.J., DeisenhoferJ. //Phys. Rep. 1997. V. 287. 247 p.

76. HoffAJ., Gast P., RomijnJ.C. // FEBS Lett. 1977. V. 73. P. 185-190

77. Hore P. J. // Advanced EPR: Applications in Biology and Biochemistry / Ed HoffAJ. Amsterdam: Elsevier, 1989. P. 405-440

78. Hore P. J., Hunter D. A., McKie C. D., Hoff A. J. // Chem. Phys. Lett. 1987. V. 137. P. 495-500

79. Ноге P. J., Hunter D. A., Van Wijk F. G. H., Schaafsma T. J., Hoff A. J. // Biochim. Biophys. Acta. 1988. V. 936. P. 249-258

80. Hore P.J., Riley D.J., Semlyen J.J., Zwanenburg G., Hoff A.J. // Biochim. Biophys. Acta. 1993. V. 1141. P. 221-230

81. Hunter D. A., Hoff A. J., Hore P. J. II Chem. Phys. Lett. 1987. V. 134. P. 6-11

82. Jordan P., Fromme P., Witt H. Т., Klukas 0., Saenger W., Krauss N. //Nature. 2001. V. 411. P. 909-917

83. Kamiya N., Shen J.-R. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 98-103

84. Kandrashkin Yu. E., Salikhov К. M., Stehlik D. //Appl. Magn. Reson. 1997. V. 12. P. 141-166

85. Kaufmann K. J., Dutton P. L., Netzel T. L., Leigh J. S., Rentzepis P. M. // Science. 1975. V. 188. P. 1301-1304

86. Ke B. //Photosynthesis: Photobiochemistry and Photobiophysics. Advances in Photosynthesis, vol. 10 / Ed Govindjee. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ., 2001. 792 p.

87. Kirmaier C., Holten D. //Photosynth. Res. 1987. V. 13. №3. P. 225-260

88. Kirmaier C., Holten D., ParsonW. W. //FEBS Lett. 1985. v. 185. P. 76-82

89. KleinfeldD., Okamura M. Y., Feher G. //Biochemistry. 1984. V. 24 P. 57805786

90. Klenina I. В., Borovykh I. V., Shkuropatov A. Ya., Gast P., Proskuryakov 1.1. //Chem. Phys. 2003. V. 254. P. 451-458

91. Klette R., Torring J. Т., Plato M., Mobius K., Bonigk В., Lubitz W. II J. Phys. Chem. 1993. V. 97. P. 2015-2020

92. Klukas O., Schubert W. D., Jordan P., Krauss N., Fromme P., Witt H. Т., Saenger W. //J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 7351-7360

93. Kohler В. E. // Carotenoids, Vol. IB: Spectroscopy / Eds G. Britton, S. Liaaen-Jensen, H. Pfander. Basel: Birkhauser Verlag, 1995. P. 3-7

94. Komiya H, Yeates Т. O., Rees D. C., Allen P., Feher G. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 9012-9016

95. Kottis P., Lefebvre R. //J. Chem. Phys. 1964. V. 41. P. 3660-3661

96. Koyama Y., Kito M., Takii Т., Saiki К., Tsukida К., Yamashita J. // Biochim. Biophys. Acta. 1982. V. 680. P. 109-112

97. KukiA., Boxer S.G. //Biochemistry. 1983. V. 22. P. 2923-2933

98. Lancaster C. R. D., Ermler U., Michel H. // Anoxygenic Photosynthetic Bacteria. Advances in Photosynthesis, N. 2 I Eds. R.E. Blankenship, M.T. Madigan, C.E. Bauer. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ., 1995, Chapter 23

99. Lersch W., Michel-Beyerle M.E. // Advanced EPR: Applications in Biology and Biochemistry / Ed Hoff A.J. Amsterdam: Elsevier, 1989. P. 685-706

100. Lhoste J.-M., HaugA., Ptak, M. //J. Chem. Phys. 1966. V. 44. P. 654-657

101. Lutz M., Agalidis I., Hervo G., Cogdell R. J. //Biochim. Biophys. Acta. 1978. V. 503. P. 287-290

102. Lutz M., Chinski L., Turpin P. Y. // Photochem. Photobiol. 1982. V. 36. P. 503-507

103. Martin J.-L., Breton J., Hoff A. J., Migus A., Antonetti A. //Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83. P. 957-961

104. McElroy J. D., Feher G., MauzerallD. C. //Biochim. Biophys. Acta. 1972. V. 267. P. 363-374

105. McGann W. J., Frank H. A. // Biochim. Biophys. Acta. 1985. V. 807. P. 101-109

106. McLauchlan K. A. // Advanced EPR: Applications in Biology and Biochemistry / Ed Hoff A ,J. Amsterdam: Elsevier, 1989. P. 345-369

107. Meyer M. Ph.D. Thesis. Ludwig-Maximilians-Universitat Munchen, Germany, 1997

108. Michl, J.; Thulstrup, E. W. Spectroscopy with Polarized Light, New York: VCH Publishers, 1986

109. Monger T. G., Cogdell R. J., Parson W. W. //Biochim. Biophys. Acta. 1976. V. 449. P. 136-153

110. Morris A. L., Snyder S. W., Zhang Y. N., Tang J., Thurnauer M. C., Dutton P. L., Robertson D. E., Gunner M. R. //J. Phys. Chem., 1995, V. 99. P. 38543866

111. Norris J. R., Budil D. E., Gast P., Chang C.-H., El-Kabbani O., Schiffer M. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 4335-4339

112. Norris J. R., Lin C. P., Budil D. E. //J. Chem. Soc. Faraday Trans. 1. 1987. V. 83. P. 13-27

113. Norris J. R., Morris A. L., Thurnauer M. C., Tang J. //J. Chem. Phys. 1990. V. 92. P. 4239-4249

114. Norris J. R., Scheer H, Katz J. J. //Ann. N. Y. Acad. Sci. 1975. V. 244. P. 260-280

115. Norris J.R., Bowman M.K., Budil D.E., Tang J., Wraight C.A., Closs G.L. II Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1982. V. 79. № 18. P. 5532-5536

116. Nuijs A. M., van Grondelle R., Joppe H. L. P., van Bochove A.C., Duysens L. N. M. //Biochim. Biophys. Acta. 1985. V. 810. P. 94-105

117. Okamura M. Y., Isaacson R. A., Feher G. //Biochim. Biophys. Acta. 1979. V. 546. P. 394-417

118. Okamura M. Y., Isaacson R. A., Feher G. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1975. V. 72. P. 3491-3497

119. Parson W. W., CogdellR. J. //Biochim. Biophys. Acta. 1975. V. 416. P. 105149

120. Parson W.W., WarshelA. //J. Am. Chem. Soc. 1987. V. 109. P. 6152-6155

121. Petke J.D., Maggiora G.M., Shipman L.L., Christoffersen R.E. //Photochem. Photobiol. 1979. V. 30. P. 203-207

122. Prince R. C., Tiede P. M., Thornber J. P., Dutton P. L. //Biochim. Biophys. Acta. 1977. V. 462. P. 467-490

123. Prisner T. F., van der Est A., Bittl R., Lubitz W., Stehlik D., Mobius K. // Chem. Phys. 1995. V. 194. P. 361-370

124. Proskuryakov I. I., Klenina I. В., Borovykh I. V., Gast P., Hoff A.J. // Chem. Phys. Lett. 1999. V. 299. P. 566-570

125. Proskuryakov 1.1., Klenina I. В., Ноге P. J., Bosch M. K, Gast P., Hoff A. J. // Chem. Phys. Lett. 1996. V. 257. P. 333-339

126. Proskuryakov I. I., Klenina I. В., Shkuropatov A. Ya., Shkuropatova V. A., Shuvalov V. A. // Biochim. Biophys. Acta. 1993. V. 1142. P. 207-210

127. Rademaker H., Hoff A. J., van Grondelle R., Duysens L. N. M. // Biochim. Biophys. Acta. 1980. V. 592. P. 240-257

128. Reed D.W., Clayton R.K. //Biochem. Biophys. Res. Comm. 1968. V. 30. P. 471-475

129. Regev A., Michaeli S., Levanon H, Cyr M., Sessler J. L. // J. Phys. Chem. 1991. V. 95. P. 9121-9129

130. Rhee K., Morris E. P., Barber J., Kuhlbrandt W. //Nature. 1998. V. 396. P. 283-286

131. Robert B. //Biochim. Biophys. Acta. 1990. V. 1017. P. 99-102

132. Robert В., Szponarski W., Lutz M. //Time-Resolved Vibrational Spectroscopy / Eds. A. Laubereau, M. Stockburger. Berlin: Springer, 1985. P. 220-224

133. Rockley M.G., Windsor M.W., Cogdell A.J., Parson W.W. //Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1975. V. 72. P. 2251-2255

134. Salikhov К. M., Molin Y. N., Sagdeev R. Z., Buchachenko A. L. Spin Polarization and Magnetic Effects in Radical Reactions. Amsterdam: Elsevier, 1984

135. Scheer H, Meyer M., Katheder I. // The Photosynthetic Bacterial Reaction Center II. Structure, Spectroscopy and Dynamics / Eds. J. Breton, A. Vermeglio. New York: Plenum Press, 1992. P. 49-57

136. Schellenberg P., Louwe R. J. W., Shochat S., Gast P., Aartsma T. J. //J. Phys. Chem. 1997. V. 101. P. 6786-6790

137. Schenck С. C., Blankenship R. E., Parson W. W. //Biochim. Biophys. Acta. 1982. V. 680. P. 44-59

138. Schenck С. С., Mathis P., Lutz M. //Photochem. Photobiol. 1984. V. 39. P. 407-417

139. Shochat S., Arlt Т., Francke C., Gast P., van Noort P. I., Otte S. С. M., Schelvis J. P. M., Schmidt S., Vijgenboom E., Vrieze J., Zinth W., Hoff A. J. // Photosynth. Res. 1994. V. 40. P. 55-66

140. Shuvalov V.A., Klevanik A.V., Sharkov A.V., Matveeiz Ju.A., KryukovP.G. // FEBS Lett. 1978. v. 91. P. 135-139

141. Siefermann-Harms D. //Biochim. Biophys. Acta. 1985. V. 811. P. 325-355

142. Snyder S. W., Thurnauer M. C. //The Photosynthetic Reaction Center, vol. 2 / Eds. J Deisenhofer, J. R. Norris. San Diego: Academic Press, 1993. P. 285330

143. StowellM.H.B., McPhillips T.M., Rees D.C., Soltis S.M., AbreschE., Feher G. //Science. 1997. V. 276. P. 812-816

144. The Photochemistry of Carotenoids. Advances in Photosynthesis, Vol. 8 / Eds. H. A. Frank, A. J. G. Young, Britton, R. J. Cogdell. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ. 1999.420 р.

145. Thurnauer M. C., Katz J. J., Norris J. R. //Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1975. V. 72. P. 3270-3274

146. Thurnauer M. C., Norris J. R. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1976. V. 73. P. 501-506

147. Thurnauer M. C., Norris J. R. //Chem. Phys. Lett. 1977. V. 47. P. 100-105

148. Tiede, D. M., Dutton P. L. //Biochim. Biophys. Acta. 1981. V. 637. P. 278282

149. Till U., Klenina I. В., Proskuryakov I. I, Hoff A. J., Hore P. J. // J. Phys. Chem. 1997. V. 101. P. 10939-10948

150. Vasilev S., Orth P., Zouni A., Owens T. G., Bruce D. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. P. 8602-8607

151. Volk M., Ogrodnik A., Michel-Beyerle M. // Anoxygenic Photosynthetic Bacteria. Advances in Photosynthesis, N. 2 I Eds. R.E. Blankenship, M.T. Madigan, C.E. Bauer. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ., 1995, P. 595-626

152. Vos M.H., Breton J., Martin J.-L. //J. Phys. Chem. 1997. V. 101. P. 98209832

153. VriezeJ., Hoff A. J. //Biochim. Biophys. Acta. 1996. V. 1276. P. 210-220

154. Weiss C. //J. Mol. Spectrosc. 1972. V. 44. P. 37-80

155. WittH.T. //Photosynth. Res. 1991. V. 29. P. 55-77

156. Wraight C. A., Leigh J. S., Dutton P. L., Clayton R. H. //Biochim. Biophys. Acta. 1974. V. 333. P. 401-408

157. YamauchiS., HirotaN. //J. Chem. Phys. 1987. V. 86. P. 5963-5970

158. Yeates Т.О., Komiya H., Chirino A., Rees D.C., Allen J.P., Feher G. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 7993-7997

159. Zech S. G., BittlR., Gardiner A., Lubitz W. //Appl. Magn. Res. 1997. V. 13. P. 517-529

160. Zechmeister L. // Cis-Trans Isomeric Carotenoids, Vitamins A and Arylpolyenes. New York: Academic Press, 1962

161. Zouni A., Witt H.-T., Kern J., Fromme P., Krauss N., Saenger W., Orth P. // Nature. 2001. V. 409. P. 739-743

162. Zwanenburg G., Hore P.J. //Chem. Phys. Lett. 1993. V. 203. P. 65-74