Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование компартментализации в процессе роста многоклеточных систем

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование компартментализации в процессе роста многоклеточных систем"

На правах рукописи

УДК 573.3

од

:~ ноя т

ВАЧАДЗЕ ДАВИД МИХАЙЛОВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ КОМПАРТМЕНТАЛГ В ПРОЦЕССЕ РОСТА МНОГОКЛЕТ СИСТЕМ

ИИ »IX

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико- математических наук

ПУТЦИНО 1995

Работа выполнена в лаборатории биофизики клетки Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Научные руководители: кандидат физико-математических наук,

К.Б.Асланиди

доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН Л.М.Чайлахян

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук,

профессор, член-кореспондент РАН Г.Р.Иваницкий

кандидат биологических наук Ю.А.Лабас

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН

Защита диссертации состоится-/-3 //¿^¿уА-У 1995 года в час, на заседании Диссертационного совета Д200.22.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142292, г.Пущино Московской обл., ИТЭБ РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН

Автореферат разослан 1995 года.

Ученый секретарь Диссертационно^ совета кандидат биологических наук

П.А.Нелипович

и

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Материал диссертации связан с разработкой фундаментальной общебиологической проблемы - исследованием физико-химических закономерностей развития многоклеточных систем. Актуальность исследования локальных межклеточных взаимодействии в процессах компартментализации обусловлена той важной ролью, которую они играют в функционировании многоклеточных систем [СЬаЛакЬуап, 1990]. Очевидно, что в ходе роста многоклеточной системы сила электрических, химических и/или механических взаимодействий между удаленными клетками уменьшается из-за шунтирующего влияния увеличивающегося окружения. При этом локальность указанных взаимодействий (осуществляющихся через проницаемые межклеточные контакты или посредством адгезии) не допускает координации кооперативного поведения клеток в системе, линейные размеры которой превышают максимальный из характерных пространственных масштабов взаимодействий. Координация может быть восстановлена через фрагментацию системы на компактные надклеточные, относительно независимые, компартменты с внутренней координацией клеточных функций посредством локальных межклеточных взаимодействий.

Функциональные компартменты в системах взаимодействующих клеток обнаружены у широкого класса многоклеточных организмов. Известна функциональная специализация морфологически однородных клеток печени, кожи, а так же у мицелиальных грибов и цианобактерий. Размеры функциональных компартментов (как дифференцированных, так и пролиферирующих) у различных организмов практически одинаковы и определяются величиной порядка 1 мм. Можно предположить, что постоянство размеров компартментов взаимодействующих клеток у различных организмов отражает общую физическую природу формирования надклеточной самоорганизации а их величина определяется характерным пространственным масштабом электродиффузионных взаимодействий.

Рост (прирост биомассы) является общей функцией ряда многоклеточных систем и, следовательно, можно ожидать, что возникновение новых компартментов будет модулировать эффективность (удельную скорость) роста клеточной ассоциации. Однако, до настоящего времени вопрос о роли компартментализации в процессах роста многоклеточных систем не рассматривался.

Цель и задачи исследования. Целью работы было определение зависимости скорости роста многоклеточной системы от ее линейных размеров и от кинетики процессов компартментализации.

Цель исследования обусловила постановку ряда задач:

1. Выбор экспериментальных моделей с разными типами клеточной организации, разработка методов и поиск условий регистрации кинетики роста.

2. Разработка компьютерных программ обработки изображения и создания соответствующих цифровых массивов.

3. Подбор адекватных методов обработки цифровых массивов для графического представления динамики отдельных параметров, включая частотный анализ ростовых пульсаций.

4. Исследование кинетики роста выбранных экспериментальных моделей с использованием разработанной методики.

Научная новизна. На основании теоретических оценок и экспериментальных результатов сформулированы представления о роли компартментализации в процессе роста различных многоклеточных систем. В частности, показано, что:

• постоянство размеров компартментов взаимодействующих клеток у различных организмов отражает наличие общих физических механизмов формирования надклеточной самоорганизации, возможно, на основе электродиффузионных взаимодействий.

• удельная скорость роста трихома цианобактерии Anabaena var. уменьшалась при длинах, превосходящих 1 мм. Образование новых компартментов в процессе фрагментации трихома сопровождалось восстановлением удельной скорости роста.

• падение удельной скорости роста мицелиальной гифы N. crassa по мере увеличения длины гифы сменялось ее ростом после образования нового относительно независимого компартмента.

• удельная скорость роста, по мере увеличения размера колоний культивируемых клеток млекопитающих VERO и SVK необратимо уменьшалась при размерах колонии превосходящих 1 мм.

Впервые показано, что ослабление межклеточных взаимодействий на расстояниях порядка 1 мм коррелирует с фрагментацией трихомов цианобактерий, ветвлением у мицелиальных грибов и развитием процессов контактного торможения деления у культивируемых клеток млекопитающих. Возникновение новых компартментов в процессе роста клеточной системы коррелирует с цикличе-

скими изменениями удельной скорости роста. Падете удельной скорости роста монослойных колоний культивируемых животных клеток было необратимым, возможно вследствие невозможности формирования новых компартментов.

Практическая ценность диссертационной работы обусловлена возможностью применения полученных в ней результатов как в дальнейших теоретических исследованиях локальных межклеточных взаимодействий, так и в биотехнологии. В частности, полученные результаты определяют диапазон оптимальных размеров фрагментов трихомов водорослей, гиф мицелиальных грибов и колоний животных клеток, обуславливающих максимальую скорость прироста биомассы при культивировании в промышленных условиях.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на следующих конференциях:

1. "Консервация генетических ресурсов", г. Пущино, 13-15 апреля 1993г.

2. "Fourth European Congress of Cell Biology", Prague, June 26 - July 1, 1994.

3. 'Workshop on Intercellular Communication", Pushchino, Aug 26 - Sep 1, 1994.

4. "First Workshop on Nonlinear Models of Biomembrane Molecular Structures". Pushchino, October 9-16, 1994.

5. Научная конференция ИТЭБ РАН, 1994г.

6. Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ленинские горы-95" (секция биологии).

7. International Conference "Criteria Of Self-Organization In Physical, Chemical And Biological Systems", Moscow-Souzdal, June 12-18 1995.

8. International Symposium on Differentation and Behavior in Fungal Models, Irapuato,Mexico, September 4-7, 1995.

9. "Second Workshop on Nonlinear Models of Biomembrane Molecular Structures". Pushchino, June 26 - July 1, 1995.

Публикации. По материалам диссертации опубликованно 9 печатных работ в виде статей и тезисов докладов.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора и анализа литературы (I глава), описания объектов и методов (II глава), изложения и обсуждения экспериментальных результатов (III, IV и V главы), заключения, выводов, списка литературы и списка работ, опубликованных по теме диссертации. Работа изложена на . . страницах и содержит_ рисунков.

II.СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение. Здесь обоснована тема диссертации, сформулированы задачи исследования и кратко рассмотрено содержание работы.

Глава 1. Литературный обзор. Важная роль межклеточных взаимодействий, в частности, через проницаемые контакты, продемонстрирована в кооперативном поведении различных многоклеточных систем [Ьоеи'езгет, 1992,Беркинблит и др., 1981,СЬа11акЬуап, 1990]. Выявлено значение этих взаимодействий в реализации основных тканевых процессов: при развитии (в механизмах индукции, дифференцировки и морфогенеза), при интегральном поведении клеточных популяций (в механизмах энергетической и метаболической кооперации), при различных патологиях (в процессах регенерации и новообразований).

В координации и интеграции функциональной активности клеток внутри компартмента или компартментов внутри ткани могут принимать участие различные механизмы (электрические, диффузионные, механические). Взаимная координация клеточной активности внутри компартмента на основе межклеточных взаимодействий может осуществляться как посредством диффузии сигнальных молекул, так и посредством энергетической кооперации посредством ионных потоков через проницаемые контакты [Ро1ароуа, Аз1ашсН, 1995, Асланиди и др., 1988]. Третий вариант, рассматриваемый рядом авторов как определяющий, в частности, в контактном торможении (УавШеу е1 а1, 1969] и морфогенезе [\Volpert, Сшде11, 1969], заключается в механическом напряжении, возникающем в клеточной системе.

Существуют решения уравнения электродиффузии Нернста-Планка для одномерного, двумерного и трехмерного случая как непрерывной так и дискретной среды [Смоляшшов, 1980, Гутман, 1987] и соответствующие экспериментальные подтверждения. Величина пространственной константы эквивалентного электрического кабеля, определяющая расстояние, на котором эффективна энергетическая кооперация посредством ионных потоков через проницаемые контакты, для самых разнообразных организмов и тканей лежит в пределах 0,5-2,0 мм [Беркинблит и др 1980, Асланиди и др 1988].

Идея о самоорганизующихся химических градиентах, задающих позиционную информацию в морфогенетическом поле, введена в круг ключевых идей теории морфогенеза Тьюрингом [Turing, 1952]. Найдены аналитические решения уравнения диффузии для бесконечной цепочки клеток, связанных проницаемыми контактами [Brink and Ramanan, 1985], конечной цепочки и монослоя при разных начальных условиях [Ramanan and Brink, 1990]. Соответствующие выражения содержат члены, имеющие смысл утечки через плазматическую мембрану и (или) скорости разложения вещества в клетках -донорах. Однако, определить характеристические масштабы диффузионных взаимодействий трудно в связи с многообразием свойств потенциальных морфогенов и экспериментальной недоступностью многих параметров.

Сопровождающие морфологическую поляризацию клеток контактная поляризация и упругие напряжения (локальные и дистантные моды межклеточной связи) [Конев, 1977, Белинцев, Белоусов и др 1985] показаны в эксперименте. Верхний предел действия факторов, ответственных за контактаое торможение культивируемых клеток млекопитающих [Vasiliev et al, 1969] или разметку мор-фогенетического поля для разных зачатков и различных организмов [Wolpert, 1969, 1971] находится в том же размерном диапазоне. Вместе с тем, для цианобактерий и мицелиальных грибов, обладающих жесткой клеточной стенкой, механические напряжения не могут передаваться на плазматическую мембрану.

Можно предположить, что постоянство размеров компарт-ментов взаимодействующих клеток у самых различных организмов отражает наличие общих физических механизмов формирования надклеточной самоорганизации. Возможно, что именно характерный пространственный масштаб электродиффузионных взаимодействий определяет размеры компартмента взаимодействующих клеток.

Анализ роста многоклеточных систем с позиции формирования надклеточной организации до настоящего времени не проводился.

Глава 2. Объекты и методы.

Объекты. Для выявления общих закономерностей роста многоклеточных систем необходимо было отобрать объекты, разли-

чающиеся по максимально возможному количеству признаков. В работе использовалась культура трихомов синезеленных водорослей Anabaena variabilis (АТСС 29413 ), два штамма мицелиальных грибов Neurospora crassa (R-2 и WC-1), а также две линии клеток млекопитающих: Vero (клетки почки африканской зеленой мартышки) и SVK14 (трансформированные вирусом SV40 человеческие эпидер-мальные кератиноциты).

Anabaena variabilis - прокариот, Neurospora crassa - многоядерный мицелиальный гриб, клетки млекопитающих - эукариоты. В отличии от клеток млекопитающих и мицелиальных грибов, циано-бактерии - автотрофы. Градиенты электрохимических потенциалов на плазматических мембранах грибов и цианобактерий поддерживаются специфическими протонными насосами, а в клетках млекопитающих - Ыа-К,АТРазой. Клетки цианобактерий [Cosgrove, 1987] и грибов [Jackson,Heath, 1993], в отличии от клеток млекопитающих, окружены жесткой клеточной стенкой, распираемой тургорным давлением. Размеры клеток цианобактерий составляли 6-8 мкм, животных клеток - 15-25 мкм, грибов - 20x100 мкм.

Для двух объектов - синезеленых водорослей и мицелиальных гиф - операционным определением компартмента в нашей работе является визуально наблюдаемые фрагменты трихома и ветки гифы, а компартментализации - фрагментация трихома и процесс ветвления гифы. Таким образом определенные компартменты тождественны электро-диффузионным компартментам этих объектов.

Трихомы синезеленых водорослей могут быть описаны простейшей моделью одномерного электрического кабеля [Беркинблит и др., 1981,Chailakhyan et al, 1982]. Гифы мицелиальных грибов также состоят из клеток, связанных проницаемыми контактами. Однако, в отличие от трихомов, гифы ветвятся, образуя более сложные кабельные структуры [Potapova et al, 1988]. Культивируемые колонии клеток млекопитающих представляют собой плоский монослой, обладающий электрической связью между клетками в середине "островка", т.е. двумерную электрически проводящую среду [Беркинблит и др., 1981]. Известно, что связь краевых клеток, участвующих в процессах движения и размножения, с центральными клетками и друг с другом ослаблена, а пролиферирующие краевые клетки гиперполяризованы относительно центральных [Потапова

1976]. Известно, что у клеток млекопитающих, культивируемых в виде отдельных колоний или "островков", и мицелиальных грибов увеличение биомассы происходит за счет деления и роста краевых клеток. У исследуемых нами водорослей в митотическом цикле участвуют все клетки.

Методы. Для получения изображения применялась видеокамера SONY XC7I1P типа CCD RGB, устанавливаемая на инвертированном микроскопе или на бинокуляре МБС-2. Изображение от камеры регистрировалось на видеомагнитофоне PANASONIC VTR AG-6200-EG системы VHS (для культуры животных клеток - 1 кадр через 12 часов). Одновременно непосредственная визуа.шзация эксперимента проводилась с помощью цветного видеомонитора

PANASONIC BT-M1420PY, служившего также и коммутатором видеосигнала. При работе с грибными гифами или циано-бактериями видеосигнал подавался непосредственно на плату оцифровки изображения DATA TRANSLATION Frame Grabber DT2853 в автоматическом режиме.

Параметры оцифрованного изображения. Оцифрованное изображение представляет собой кортинку размером 512x512 пикселей 256 градаций серого (байт на пиксель). Она записана в файл формата row data с заголовком 512 байт. Таким образом, общий объём файла составляет 262656 байт.

Рис.1. Блок-схема пакета программ анализа изображения.

Настройка яркости и Контрастированная яркость пикселя вычисля-256

контрастирование, лась по формуле: / = Round

('о - Ann)'

где /о - исходная яр-

кость, /max и /min соответственно максимальное и минимальное значения яркости, Round - операция округления до целого. Данная процедура часто называется экуализацией палитры (palette equalization).Иногда было достаточно просто подстроить яркость. При этом к значению яркости каждого пикселя просто прибавляется некоторое число. Наилучшие результаты можно получисть, объединив эти два метода

Скелет. В этом режиме снимается информация о длине и ориентации объекта. Это является аналогом проволочной модели. "Мышка" устанавливается на начало объекта, и далее отмечаются точки, последовательно соединяющиеся в ломаную. Во втором окне отслеживается точность расстановки точек. Необходимо во-первых, точно совмещать точки с началом и концом объекта, а во-вторых, следить за центровкой получающейся ломаной - она должна проходить по центру объекта.

Контур. В этом режиме снимается информация о форме объекта. После обведения скелета, тем же образом - расставляя точки ломаной - обводится контур объекта. Для выполнения этой операции необходимо высокое качество и резкость изображения. Последний отрезок, замыкающий ломаную в многоугольник, проводатся автоматически нажатием на правую кнопку "мышки".

Скелет-обратный ход. (Склт-ОХ) Этот режим использует следующее обстоятельство: растущая гифа не меняет своего местоположения. После обведения последнего кадра получается траектория роста гифы. Двигаясь в обратном (по времени и по траектории) направлении фиксируется положение растущего кончика в данный момент времени на уже готовой траектории. Таким образом упрощается процесс обводки.

Оценка погрешности обводки. Пусть е - требуемая относительная погрешность в долях единицы. Тогда минимальный реги-

N к

стрируемый прирост длины (на уровне ошибки) ai. = l2 - = —!——

£

где в числителе - абсолютное значение ошибки (произведение ошибки в пикселях Npix на коэффициент увеличения к оптической части системы регистрации). Будем считать, что за промежуток времени экспозиции трихом растет с постоянной удельной скорость V. Тогда ¿2 =1Л- ехр(/ • v). Отсюда получаем выражение для экспозиции:

V

e ■ Li

- + 1

Таким образом

можно подбирать такие параметры эксперимента, как коэффициент увеличения, время экспозиции в зависимости от удельной скорости, длины и требуемой точности. Ясно, что таким образом полученная точность - максимально достижимая, учитывающая только неопределенность границы трихома, при условии абсолютно точно воспроизводимой на разных кадрах формы.

Рис.2. Оконтуренные изображения исследуемых объектов ( вверху - лидирующая гифа штамма R-2, ниже - отдельные трихомы цианобактерии Anabaena variabilis, внизу - клон культивируемых клеток SVK14), полученные на экране монитора. Приросты, соответствующие разным временам, окрашены на экране монитора различными цветами, а на рисунке различными оттенками серого. В левом нижнем углу каждого изображения представлен масштаб.

Первичная математическая обработка и визуализация (ПМО). Этот этап завершает графическую обработку данных. Он включает:

• программную визуализацию покадрового роста на основе полученных данных о траектории;

• перевод данных в новый формат, таким образом исключая ненужную для последующей обработки информацию.

Математическая обработка и визуализация. В зависимости от задачи использовалось 2-х, 3-х точечное дифференцирование (2-ТД, 3-ТД). В тех случаях, когда не выполнялось условие для дифференцирования At 0 при недостаточной степени дискретизации, для получения значения удельной скорости прироста V использовалась

формула V ■ At = In

U

(Эксп).

/

Частотный анализ. Для получения частотных характеристик (ЧА) ростовых пульсаций использовались формулы: корреля-

ционная

1 "

Т о

автокорреляционная

= — £ (XjXj+j)&i функхщи, а так же их нормированные аналоги

Т 7=о

Ку

и г[х = Щ-, где Xj и Yj- абсолютные скорости роста

разных ветвей в момент времени дt-j. Т - время регистрации.

Визуализация проводилась с помощью пакета SIGMA PLOT for Windows 1.02 (Jandel Scientific Inc.).

о о

EL

О О

О.

§

О ОС <4 X л

5 5

0.08

0.06

Глава 3. Исследование кинетики роста синезеленных водорослей Anabaena variabilis. Исследован 71 трихом (по 3 измерения). Размеры трихомов в наших условиях были ограничены длиной 1,0 - 1,5 мм. Достигнув длины 0,8 - 1,3 мм, трихом обычно делился на две, реже на три части.

Рис.3. Зависимость

удельной скорости прироста длины трихомов цианобактерий Anabaena variabilis (АТСС 29413) (соответственно, биомассы) от их длины. По вертикали - удельная скорость прироста длины трихомов в час, по горизонтали - длина трихома в мм. Усредненные данные (29 трихомов по 3 измерения) аппроксимированны полиномом третьего порядка, длина трихома, мм Как следует из резуль-

татов анализа, представленых на рис.3, удельная скорость роста по мере увеличения длины фрагмента трихома уменьшалась. Удельная скорость роста коротких трихомов, образовавшихся после фрагментации, превосходила соответствующий показатель, характерный для длинного трихома до деления. Таким образом, суммарный прирост трихома после его фрагментации возрастал.

0.04 - J-

0.02

0.00

Примененный подход позволил выявить диапазон линейных размеров трихомов (0,2 - 1,0 мм), который обеспечивает максимальный рост биомассы. Эти размеры, по нашему мнению, определяют длину цепочки электрически связанных клеток, внутри которой энергетические и информационные взаимодействия обеспечивают оптимальную функциональную специализацию отдельных клеток.

Таким образом, удельная скорость роста трихома по мере увеличения его длины уменьшалась, а после образования новых независимых компартментов - увеличивалась.

Глава 4. Исследование кинетики роста мицелиальпых грибов Меигозрога сгояжо. Исследование более 50 фрагментов регенерирующих и лидирующих гиф (число измерений каждой от 7 до более 100). Регенерирующие верхушки гиф Меиговрога сгавБа являются удобной моделью для исследования развития многоклеточных систем, в частности, позволяя определять удельную скорость роста, что невозможно осуществить на интактной гифе, обладающей значительными линейными размерами.

Скорость роста как интактной гифы, так и изолированных фрагментов обычно флуктуировала. Вычислите автокорреляционной функции позволяет выделить ряд гармоник, соответствующих, по нашему мнению, периоду ростовых пульсаций (рис.4). Период ростовых пульсаций у разных верхушек имел, обычно, один (20 или 10 секунд) либо два максимума.

Изолированные верхушечные фрагменты, длиной более 0,50,6 мм, как правило, продолжали расти (рис.5), так что скорость верхушечного роста составляла обычно через 30 - 40 мин после операции 8-15 мкм/мин., в то время, как до операции у кончика лидирующей гифы она достигала 40 - 50 Рис.4. Автокорреляционные функции скорости роста двух (сплошная линия и пунктир) различных верхушек гифы 11-2.

О 10 20 30

время, сек

мкм/мин.. Вторая точка роста возникала при достижении опериро-ьанным участком длины 0,6 - 1,0 мм (рис.5). В некоторых случаях возникали две новые точки роста, однако, одна из них через несколько минут прекращала рост. По мере увеличения длины регенерирующего верхушечного фрагмента удельная скорость роста уменьшалась. Появление новой точки роста приводило к восстановлению удельной скорости роста, подобно тому, как это наблюдалось при фрагментации трихомов цианобактерий.

Аналогичное уменьшение скорости роста лидирующей гифы перед очередным ветвлением и последующее восстановление скорости до прежнего уровня регистрировалось и на интактной гифе.

При характеристике роста мицелиальных грибов обычно используется понятие единицы гифального роста [Типа ег а1, 1994], равной отношению суммарной длины всех ветвей гифы к общему числу верхушек.

0.28

у (О

о а

0.26 -

л 0.24 -

0.22 -

1.5 2.0

длина, мм

Рис.5. Зависимость удельной скорости прироста длины регенерирующей гифы 11-2 (соответственно, биомассы) от ее длины. По вертикали -относительная скорсть прироста всех верхушек в час, по горизонтали - общая длина регенерирующей гифы в мм. Треугольниками отмечены ветвления.

В наших исследованиях, результаты которых представленны на рис.6., отношение общей длины регенерирующей гифы как к общему числу кончиков, так и к числу растущих, у обеих исследованных линий увеличивалось со временем. Следует отметить, что на стадии вегетативного роста у интактной лидирующей гифы 11-2 отношение числа растущих кончиков к общей длине составляло 0,28 - 0,32 мм., а у \УС-1 - 0,35 - 0,40 мкм. Эти различия коррелируют с электрофизиологическими измерениями, выявившими наличие сла-

бой электрической связи между отдельными клетками линии \VC-l по сравнению с диким штаммом 11-2 [Ро1ароуа й а1, 1987].

Таким образом, уменьшение удельной скорости роста, по мере увеличения длины гифы, сменялось ее увеличением после обра-зовашшпового относительно независимого компартмента. Кроме того, полученные результаты позволяют заключить, что размеры компартмента у гиф мицелиальных грибов значительно меняются в процессе жизненного цикла, что должно, на наш взгляд, коррелировать с изменениями электрических свойств плазматических или контактных мембран, определяющих величину кабельной постоянной.

Рис.6. Зависимость размера единицы гифального роста (модуля) от общей длины регенерирующей гифы. По вертикали - отношение общей длины регенерирующей гифы к числу растущих кончиков (кривые 1,3) и к общему числу кончиков ( кривые 2,4). Размер модуля увеличивался для клона R-2 (зависимости 1,2) быстрее, чем для клона WC-1 (зависимости 3,4). Экспериментальные точки (29 обмеренных регенерирующих гиф) аппроксимированы полиномом первого порядка.

Глава 5. Исследование кинетики роста культивируемых клеток млекопитающих. Исследовалоь по 8 клонов обоих линий клеток (121 измерение). По мере развития колонии происходило уменьшение относительной скорости роста площади и, соответственно, биомассы.

Эти результаты, представленью на рис.7, могут интерпретироваться как развитие процессов контактного торможения в центре колонии. В наших экспериментах относительная скорость роста обоих линий клеток уменьшалась при достижении колонией размеров порядка 1 мм, однако, для клеток SVK эти данные статистически недостоверны.

Таким образом, удельная скорость роста, по мере увеличения размера колонии уменьшалась. Развитие процессов контактного торможения в центре колонии, по мере увеличения расстояния между ее краями, определяет, по-видимому, специфику формирования ткани сложного организма в монослойной культуре [Ьоешейет, 1992]. Возможно, что в интактном организме аналогичные процессы ответственны за контроль роста и компартментализацию тканей и органов.

0.04

0.6 R*, mm

Рис.7.Зависимости удельной скорости прироста площади клона от его эквивалентного радиуса для культивируемых клеток линий VERO (слева) и SVK14 (справа). По вертикали - относительная скорость прироста площади в час, по горизонтали - эквивалентный радиус R* в мм. Данные усреднены по 121 измерению.

Заключение. Эксперименты, проведенные на развивающихся многоклеточных системах, существенно отличающихся в эволюционном плане, свидетельствуют, что процессы надклеточной ком-партментализации модулируют рост самых различных клеточных ассоциаций. Формирование компартмента, на наш взгляд, определяется динамическим равновесием между процессами функциональной специализации и межклеточными взаимодействиями, координирующими кооперативное поведение системы как целого. Увеличение количества клеток в системе создает условия для возможной более узкой функциональной специализации отдельных клеток, увеличивающую эффективность всей системы. С другой стороны, увеличение расстояния между крайними клетками, возникающее в процессе роста, неизбежно приводит к ухудшению координации поведения отдельных клеток.

Локальная временная и пространственная специализация внутри компартмента взаимодействующих клеток свойственна са-

мым различным многоклеточным системам. Это - пролиферирующие на краю и покоящиеся клетки в центральной части монослоя [Vasiliev et al, 1969], это - различающиеся по активности транспортных процессов растущие верхушечные клетки и клетки, расположенные в дистальной части гифы [Trinci et al, 1994,Jackson,Heath, 1993], это - клетки трихома, существенно различающиеся по количеству и составу фотосинтетических пигментов [Aslanidi,Shalapyonok, 1991].В первом приближении размеры ком-партментов взаимодействующих клеток у различных организмов и различных тканей определяются величиной порядка 1мм. В то же время, наши эксперименты выявили изменения размеров компарт-ментов в процессе жизненного цикла, в частности, у грибов. В ходе роста многоклеточной системы эффективность взаимодействий между периферическими клетками уменьшается. Когда геометрические размеры растущей системы превысят максимальный из характерных пространственных масштабов взаимодействий, координация кооперативного поведешш клеток нарушается, что коррелирует с уменьшением удельной скорости роста, регистрируемой в эксперименте. Координация может быть восстановлена через фрагментацию системы на компактные надклеточные, относительно независимые, компартиенты с внутренней координацией клеточных функций.

III. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Разработаны условия культивирования и методы регистрации роста модельных многоклеточных систем, включающие методы анализа изображения, обработки цифровых массивов и графического представления кинетики отдельных параметров.

2. Показано, что характерные пространственные масштабы элек-тродиффузионых взаимодействий (порядка 1мм) коррелируют с размерами функционального компартмента у различных многоклеточных систем.

3. Показано, что кинетика роста многоклеточных систем, образующих новые, относительно независимые, компартменты взаимодействующих клеток (цианобактерии, мицелиальные грибы), имеет колебательный характер: удельная скорость роста минимальна перед возникновением нового компартмента, а после его возникновения возрастает.

4. Показано, что падение удельной скорости роста монослойных колоний культивируемых животных клеток было необратимым, вероятно вследствие невозможности формирования новых компарт-ментов.

IV. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Aslanidi К.В., Yachadze D.M., Model of ion-osmotic homeostasis for a single cell under cold ionic stress conditions, Cell Biology International, vol.18, number 5, 1994, p.572, IV th European Cell Biology Congress, Th-137.

2. Асланиди К.Б., Вачадзе Д.М., Моделирование холодового ионного стресса, Биофизика живой клетки N6, 1994, стр.142-145.

3. Асланиди К.Б., Вачадзе Д.М., Чайлахян JI.M., Модель ионно-осмотического гомеостаза клетки при охлаждении, ДАН РАН, 1994, т.338, N2, с. 251-254.

4. Aslanidi К.В., Vachadze D.M., Unitary theory of chemiosmotic coupling for multicellular systems, Workshop on Intercellular Communication, Pushchino, 1994, p.22.

5. Aslanidi K.B., Selezneva 1.1., Shalapionok A.A., Tsyganov M.A., Vachadze D.M., Zamyatnin A.A.jr., A tissue's module organization, Workshop on Intercellular Communication, Pushchino, 1994, p.21.

6. Асланиди К.Б., Вачадзе Д.М., Замятнин А.А.мл., Пожарская Т.Р., Рочев Ю.А., Селезнева И.И., Цыганов М.А., Чайлахян Л.М., Морфометрический анализ динамики роста клеточных ассоциатов, ДАН, 1995, 341, N2, с. 277-280.

7. Aslanidi К., Vachadze D., "The energetic base of compaptmentation", International Conference "Criteria of Self-Organization in Physical, Chemical and Biological Systems", Moscow-Souzdal, 1995, p. 112

8. Aslanidi K., Boitzova L., Potapova Т., Vachadze D., "Grouth unit organization", International Conference "Criteria of Self-Organization in Physical, Chemical and Biological Systems", Moscow-Souzdal, 1995, p.lll

9. Aslanidi K., Vachadze D. "Compartmentation determines dynamics of multicellular system's growth". In: Bioferroelectricity and related phenomena. Proc. of Pushchino workshops on nonlinear models of the membranes. Ed. V.S.Bystrov, Pushchino Research Center, 1995 , p. 36-44.