Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование кальциевой сигнализации культивируемых белых адипоцитов. Конвергенция сигнальных путей, сопряженных с IP3- и рианодиновыми рецепторами.

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование кальциевой сигнализации культивируемых белых адипоцитов. Конвергенция сигнальных путей, сопряженных с IP3- и рианодиновыми рецепторами."

005054174

На правах рукописи

Туровский Егор Александрович

ИССЛЕДОВАНИЕ КАЛЬЦИЕВОЙ СИГНАЛИЗАЦИИ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ БЕЛЫХ АДИПОЦИТОВ. КОНВЕРГЕНЦИЯ СИГНАЛЬНЫХ ПУТЕЙ, СОПРЯЖЕННЫХ С1Р3- И РИАНОДИНОВЫМИ РЕЦЕПТОРАМИ

03.01.02-Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- I КОЯ 2012

Пущино-2012

005054174

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биофизики клетки Российской академии наук. Пущинском Государственном естественно-научном институте

Научный руководитель:

кандидат биологических наук

Долгачева Людмила Петровна

Официальные оппоненты:

Новоселов Владимир Иванович - доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики клетки РАН, главный научный сотрудник лаборатории механизмов рецепции

Гончаров Николай Васильевич - доктор биологических наук, НИИ гигиены, профпатологии и экологии человека ФМБА России, ведущий научный сотрудник лаборатории аналитической токсикологии.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук.

Защита диссертации состоится «15» ноября 2012 г. в 15 ч. 30 мин. на заседании Диссертационного совета Д 002.038.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биофизики клетки Российской академии наук по адресу: 142290, г. Пущино, ул. Институтская, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, г. Пущино, ул. Институтская, 3.

Автореферат разослан « Ю » октября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Смолихина Татьяна Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ожирение рассматривается как один из основных факторов высокой смертности населения вследствие развития неалкогольного стеатогепатита, диабета 2-го типа и сердечно-сосудистых заболеваний (Астспикин и Глезер, 2008; Boguszewski et al., 2010). Развитие этих заболеваний при ожирении обусловлено «дислипидэмией» - избытком циркулирующих в крови токсинов -жирных кислот. Гипертрофия и дисфункция белой жировой ткани (WAT) несет в себе большой патогенный потенциал, ввиду ее неспособности эффективно устранять из крови жирные кислоты, а также за счет трансформации эндокринных и иммунных функций жировой ткани (Bays et al., 2008). Известно, что симпатическая нервная система и нейротрансмиттер норадреналин (НА) играют важную роль в процессе липолиза WAT (Tavernier et al., 2005). Модулирующий эффект норадреналина на функции жировой клетки является комплексным и вовлекает не только различные подтипы адренорецепторов, но и различные системы трансдукции сигналов. В ряде работ показано, что липолиз, стимулированный норадреналином, обеспечивается активацией p-адренорецепторов, аденилатциклазы и синтезом сАМР, а также ключевых липаз HSL и ATGL и фосфорилированием перилипина. Ингибирование этого процесса обеспечивается в результате активации а2-адренорецепторов, гетеротримерного белка G,, а.-субъедипицы, ингибирующей аденилатциклазу и синтез сАМР. Важную роль в процессах передачи сигналов от рецептора к мишеням играют и Ру-субъединицы О.-бслков. В последние годы стало известно, что липолиз также может быть стимулирован предсердным натрийуретическим пептидом с последующим накоплением cGMP и активацией протеинкиназы G.

Что касается парасимпатической нервной системы и ее нейротрансмиттера ацетилхолина, то кроме ингибирования процесса липолиза, о его действии на жировые клетки ничего не известно.

Роль Са2+ в регуляции липолиза и липогенеза белой жировой ткани практически не исследована, несмотря на то, что в роли вторичного мессенджера ионы кальция опосредуют действие более 100 нейротрансмиттеров и гормонов и регулирует многочисленные клеточные функции. Считается, что рост Са + должен приводить к ингибированию липолиза протеинкиназой CaMKII и Са2+ -зависимыми фосфодиэстеразами (PDEIII, IV), снижению концентрации сАМР и cGMP и активности протеинкиназ А и G, соответственно.

Цель исследования. Целью данной работы является получение новых знаний о

функционировании системы кальциевой сигнализации белых адипоцитов.

Основные задачи исследования.

1. Исследовать механизмы генерации кальциевых сигналов белыми адипоцитами в культуре в ответ на стимуляцию адренергических и холинергических рецепторов.

2. Изучить механизм действия L-аргинина на кальциевую сигнализацию

культивируемых белых адипоцитов;

3. Выяснить механизм генерации колебаний [Са2+]| при активации мускариновых ацетилхолиновых рецепторов;

4. Изучить механизмы конвергенции сигнальных систем, сопряженных с 1Р3-зависимыми (1Р311) и рианодиновыми (ЯуЯ) рецепторами.

Научная новизна работы. В работе показано, что норадреналин, действуя на а- и р-адренергические рецепторы белых адипоцитов, вызывает 3 типа кальциевых ответов, отличающихся по амплитуде и длительности сигнала. Агонисты агадренорецепторов активируют фосфоинозитвдный путь передачи сигналов, что приводит к генерации кальциевого ответа типа пик-плато. Для а2-адренергических рецепторов, помимо известного пути ингибирования аденилатциклазы, показано функционирование нового пути передачи сигнала за счет Ру-субъединиц ^-белков на рианодиновый рецептор эндоплазматического ретикулума, активация которого вызывает импульсное увеличение Са2+ в цитозоле.

Показан механизм возникновения и поддержания кальциевых колебаний, индуцируемых ацетилхолином, в котором ведущее значение имеет рианодиновый рецептор (ЯуЯ).

Продемонстрирована конвергенция сигнализации для рецепторов, сопряженных с и ЯуЯ, основанная на том, что гормоны, действуя через рецепторы, сопряженные с в-белком, включают общую схему сигнализации с участием Ру-субъединиц для в,, и в, белков, которые активируют одну общую мишень - фосфатидилинозитол 3-киназу (Р13К).

Научно-практнческая ценность. Полученные результаты позволяют расширить понимание механизмов сигнализации белых адипоцитов. Исследованная трансдукция сигналов с М3-холинорецепторов и адренергических рецепторов способствует не только пониманию действия ацетилхолина и норадреналина на клетки белого жира, но и может быть использована как потенциальная фармакологическая цель для понимания механизмов возникновения ожирения и связанных с ним нарушений обмена веществ. В силу универсальности Р13К-РКО-11уП пути передачи сигнала и существования множества заболеваний, связанных с нарушениями этого пути, полученные результаты могут стать основой для нового направления фармакологической коррекции этих заболеваний.

Апробация диссертации. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009, 2011), на конференции «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2008), на школе-конференции для молодых ученых «Методы культивирования клеток» (Санкт-Петербург, 2008), Международной научной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 2012), IV съезде биофизиков России (Нижний Новгород, 2012), а также на Международной конференции молодых ученых «Экспериментальная и теоретическая биофизика '12» (Пущино, 2012).

Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 15 печатных работах, из них 5 статей в реферируемых журналах, 5 статей в сборниках и 5 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на_

страницах с использованием_рисунков,_ таблиц и включает: введение, обзор

литературы, материалы и методы исследования, собственные экспериментальные

данные и их обсуждение, заключение и выводы. Список литературы содержит_

ссылок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ВЫДЕЛЕНИЕ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ПРЕАДИПОЦИТОВ БЕЛОЙ ЖИРОВОЙ ТКАНИ. Все операции по выделению преадипоцитов из белой жировой ткани мышей линии NMRI (возраст 5-6 недель) производились в стерильных условиях на льду. Процедура выделения и культивирования клеток подробно описана в нашей работе (Туровский, 2011). Полученную суспензию преадипоцитов ресуспендировали в культуральной среде, включающей DMEM (Sigma), 10% FBS (Gibco), 4мМ L-Glutamine acid (Sigma), 4нм инсулина (Sigma), 0,004% гентамицина и 0,25мкг/мл аскорбата натрия (Sigma), и наносили на круглые покровные стекла диаметром 25мМ из расчета 30000 клеток на 1 стекло в объеме 100 мкл и помещали в 35мм чашки Петри. Культивировали во влажной атмосфере С02-инкубатора (5% С02 и 95% воздуха). Для ингибирования пролиферации фибробластов использовали ЮнМ цитозин-арабинозида. В экспериментах использовали культуру в возрасте 9 дней (9 DIV). Белые адипоциты в культуре идентифицировали по морфологическим признакам: форма клеток и наличие жировых включений в цитоплазме.

ИЗМЕРЕНИЯ УРОВНЯ ЦИТОЗОЛЬНОГО КАЛЬЦИЯ МЕТОДОМ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ. Эксперименты проводили с помощью флуоресцентной станции на базе инвертированного микроскопа Axiovert 200М, оснащенного монохромной CCD-камерой AxioCam HSM (Carl Zeiss, Германия) и системой высокоскоростной смены возбуждающих светофильтров Ludí МАС5000. В эксперименте получали серии изображений культуры белых адипоцитов с интервалом 3 секунды. При измерении уровня цитозольного кальция и NO использовались объектив Plan Neofluar lOx/0,3 и 20х/0,7. Для регистрации уровня цитозольного кальция использовали зонд Fura-2. Флуоресценцию Fura-2 в двух длинах волн возбуждали с помощью светофильтров BP 340/30 и BP 387/15. Регистрацию проводили в диапазоне 465-555нм. После предварительного вычитания фонового сигнала рассчитывали отношение интенсивности флуоресценции Fura-2 при возбуждении в 340 и 380нм (Fura-2, 340/380).

ИЗМЕРЕНИЕ ПРОДУКЦИИ ОКСИДА АЗОТА (NO). Для регистрации продукции NO клеточную культуру белых адипоцитов нагружали ЮмкМ DAF FM в течение 40мин при 37°С. Затем клетки дважды промывали HBSS и оставляли на Юмин. После этого вновь промывали HBSS и монтировали в специальную

измерительную камеру для инвертированного микроскопа. Среда НВЗБ на всех стадиях загрузки зондом и отмывки, а также при аппликации различных агонистов включала 200мкМ Ь-аргинина для поддержания ЪЮ-синтазы в активном состоянии. Для возбуждения флуоресценции ОАР-БМ применяли светофильтр ВР 475/40. Для регистрации флуоресценции использовали фильтр ВР 530/50.

Изображения клеток регистрировали с интервалом в 20 сек. Полученные серии 8-битных изображений анализировали с помощью программы 1п^е.Г.

СИСТЕМА АППЛИКАЦИИ И ОТМЫВКИ ВЕЩЕСТВ. Для аппликации веществ нами была разработана система смены раствора в экспериментальной ячейке. Эта система позволяет осуществлять перфузию со скоростью 10 мл/мин. Разработанная система позволяет производить добавки известных концентраций агонистов и антагонистов рецепторов, а также растворов других соединений, и осуществлять полную их отмывку.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

УВЕЛИЧЕНИЕ [Са2+], ПОД ДЕЙСТВИЕМ НОРАДРЕНАЛИНА. Аппликации норадреналина (НА) к культивируемым белым адипоцитам (9 Б1У) в диапазоне концентраций от ЗООнМ до ЗОмкМ инициирует Са2+-ответы (рис. 1А), которые можно разделить на три группы: 1) высокоамплитудный ответ типа пик-плато с полумаксимальной длительностью 27±15 секунд; 2) импульсный ответ с полумаксимальной длительностью 10±0,5 секунд; 3) медленный Са2+-ответ с лаг-периодом 3-5 мин. Следует отметить, что каждый из трех типов ответов существенно отличается друг от друга и достоверно воспроизводится.

Известно, что норадреналин действует через различные типы а- и Р-адренорецепторов, сопряженных с различными системами трансдукции сигналов. Для выяснения типа рецепторов, ответственных за формирование каждого из Са2+-сигналов был проведен ингибиторный анализ. Преинкубирование адипоцитов с антагонистом арвдрепорецепторов празозином полностью подавляет Са2+-ответы 1-го типа (пик-плато) (рис. 1В). Антагонист а2-адренорецепторов - раувольфин препятствует появлению импульсных Са2+-сигналов 2-го типа (рис. 1Г), а антагонист р-адренорецепторов — пропранолол, ингибирует медленные ответы 3-го типа (рис. 1Д).

Второй путь доказательства наличия нескольких популяций клеток, отличающихся набором адренорецепторов, основывается на предположении, что каждый из этих рецепторов сопряжен со своей системой передачи сигналов. Известно, что агадренорецепторы сопряжены с фосфоинозитидной системой передачи сигналов и 1Р3-зависимой мобилизацией Са +. Ингибирование ключевых молекул этого пути (фосфолипазы С и 1Р3-рецептора) подавляет ответ 1-го типа (рис. 1Б), и не влияет на генерацию импульсных и медленных сигналов 2-го и 3-го типов.

' 160 ' 260 ' збо ' 460 ' едо " ббо ' 760

400 БОО

Бремя, с

Время, с

Рис. 1. Изменение |Са2+]| в белых адипоцитах под действием норадреналшм. ПнгибнторныП анализ.

(А) — три типа Са2+-ответов белых адипощггов на аппликацию норадреналина; (Б) - добавление 400 пМ ксестоспонгина С - ингибитора 1Рз-рецепторов; (В) добавление ЗмкМ празозина -антагониста а|-адренорецепторов; (Г) - добавление ЗмкМ раувольфина - антагониста аг адренорецепторов; (Д) - добавление 5мкМ пропранолола - антагониста р-адренорецепторов; Антагонисты добавляли за 5 минут до аппликации норадреналина. Эксперименты выполнены на (3-5)-ти клеточных культурах, с 5-ю повторами для каждой культуры.

КАЛЬЦИЕВЫЕ ОТВЕТЫ АДИПОЦИТОВ НА АГОНИСТЫ а,-АДРЕНЕРГИЧЕСКИХ РЕЦЕПТОРОВ. ВКЛАД а1А-АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ. Третий путь доказательства наличия нескольких популяций клеток, отличающихся набором адренорецепторов, состоит в применении агонистов, селективных к отдельным типам адренорецепторов. Селективные активаторы а^адренорецепторов -фенилэфрин, циразолин и А61603 (а1А-адренорецепторы) дозозависимо вызывают кальциевые ответы типа пик-плато (рис. 2А), подобные 1-му типу сигналов при аппликации норадреналина.

Данные, полученные в результате ингибиторного анализа (рис. 2Б), свидетельствуют в пользу того, что арадренорепторы культивируемых белых адипоцитов инициируют Са2+-ответы по классическому фосфоинозитидному пути.

Известно, что адипоциты WAT разных видов млекопитающих могут экспрессировать различные подтипы cti-адренорецепторов: aiA, diB или аш- Для исследования подтипа dj-адренергических рецепторов, ответственных за генерацию Са2+-сигнала 1-го типа в белых адипоцитах мыши, нами были использованы селективный агонист aiA-подтипа адренорецепторов - А61603 и селективный антагонист - WB4101, который полностью предотвращает появление Са2+- ответов на аппликацию не только А61603, но и фенилэфрина, и циразолина (рис. 2Б). Следовательно, aiA-адренорепторы белых адипоцитов мыши играют ведущую роль в реализации Са2+-ответа по классическому фосфоинозитидному пути.

Рис. 2. Изменение [Са1+]; при активации а1-адреноргическнх рецепторов, участие ключевых молекул.

(А) - типичные Са2+-ответы клеток при аппликации селективных агонистов щ-адренорецепторов: кривая 1 - А61603 (активатор аи-адренорецепторов), кривая 2 - фенилэфрин, кривая 3 -циразолин; (Б) - ингибиторный анализ: действие антагонистов и ингибиторов ключевых молекул фосфоинозитидного сигнального каскада на амплитуду кальциевого ответа (АКО) при аппликации активаторов (ц-адренорецепторов. и73122 - ингибитор фосфолипазы С, фентоламин - антагонист а|,2-адренорецепторов, ксестоспонгин С (ХеС) - ингибитор 1Рз-рецепторов, празозин - антагонист щ-адренорецепторов, ВМУ7378 - антагонист ат-адренорецепторов, WB4101 - антагонист сид-адренорецепторов. В процентах выражена доля клеток, в которых наблюдается подавление амплитуды Са2+-сигналов.

Са2+-ОТВЕТЫ БЕЛЫХ АДИПОЦИТОВ НА АГОНИСТЫ а2-АДРЕНЕРГИЧЕСКИХ РЕЦЕПТОРОВ. ИССЛЕДОВАНИЕ ПУТИ ПЕРЕДАЧИ СИГНАЛОВ. Более тридцати лет назад с помощью радиолигандных методов были идентифицированы а2-адренорецепторы в белой жировой ткани. Позже установлена их способность подавлять процесс липолиза. Для активации а2-адренорецепторов были использованы селективные агонисты - гуанабенц и иК-14,304 в присутствии физиологической концентрации (200мкМ) Ь-аргинина (рис. ЗА). Са2+-ответы имеют вид быстрых одиночных импульсов, которые отличаются от ответов под действием

агонистов ai-адренорецепторов и характеризуются высокой скоростью нарастания амплитуды, что указывает на активацию выброса Са2+ из внутриклеточного депо. Аналогичный Са2+-ответ регистрировали при аппликации норадреналина (2-й тип ответов). Во всех случаях Са2+-сигнал не зависит от присутствия антагонистов cti-адренорецепторов и полностью подавляется антагонистами а2-адренорецепторов -раувольфином и иохимбином. Ингибиторы PLC и IP3R не влияли на генерацию Са2+ -сигнала в адипоцитах. При этом инкубирование клеток с ингибитором рианодинового рецептора рианодином препятствует появлению кальциевых импульсов на аппликацию селективных а2-агонистов. Кроме этого, преинкубирование клеток с коклюшным токсином, который препятствует диссоциации Gpy-субъединиц Gj-белков (Michal et al., 2007), также ингибирует появление импульсных сигналов. В виду того, что мобилизация Са2+ при активации а2-адренорецепторов происходит не за счет 1Р3-рецептора, а рианодинового рецептора, активатором которого (по литературным данным) является циклическая АДФ-рибоза, а рецепторы, связанные с активацией Gq-H Gi-белков за счет Gpr-субъединиц, могут участвовать в активации Akt/PKB (Joshi et al., 2007, McCarthy et al., 2003) мы предположили функционирование сигнального каскада: Akt/PKB—>eNOS—>sGC—>PKG—»CD38—>RyR—»Са2+, приводящего к высвобождению Са2+ через RyR.

Ингибиторный анализ данного сигнального пути показал, что ингибиторы PI3K - LY294002 и вортманнин подавляли появление Са2+-ответов на активацию а2-рецепторов селективными агонистами (рис. ЗБ). Ингибиторы NO-синтазы — L-NAME и 7NI, а также АДФ-рибозилциклазы (CD38) - никотинамид -

Рис. 3. Изменение [Ca2+J; в ответ на гуанабенц и UK-14,304, участие ключевых молекул. (А) - генерация Са2+-импульсов при повторной аппликации селективных агонистов а2-адренорецепторов не подавляется ингибиторами PLC (U73122) и IPjR (ксестоспонгин С, ХеС). (Б) - подавление АКО (в %) на аппликацию 1мкМ гуанабенца в присутствии: U73122 - ингибитор PLC, празозин - антагонист ai -адренорецепторов, ксестоспонгин С (ХеС) - ингибитор IP3R-рецепторов, рианодин (Rya)- ингибитор RyR, NAM - конкурентный ингибитор CD38, Wort и LY 294,002 - ингибиторы РБК.

РЕЦЕПТОР-ОПОСРЕДОВАННОЕ ДЕЙСВИЕ L-АРГИНИНА НА БЕЛЫЕ АДИПОЦИТЫ МЫШИ. В соответствии с литературными данными, L-аргинин оказывает многочисленные эффекты на клетки различных типов. Продемонстрировано положительное воздействие аргинина на метаболизм животных, страдающих диабетом 2 типа (Fu et al., 2005). Кроме того, в экспериментах на кардиомиоцитах было показано, что наличие в средах выделения клеток небольших концентраций L-аргинина (200мкМ) способствует стабилизации получаемых ответов (Са2+-токов L-каналов) при действии норадреналина и ацетилхолина (Dynnik et al., 2005). Было также показано, что L-аргинин при добавлении в среду инкубации, участвует в регуляции L-токов, действуя через а2-адренорецепторы, PI3K, eNOS и PKG (Ненов и др., 2009).

Преинкубирование белых адипоцитов с 200мкМ L-аргинина в течение 10 и более минут с последующей кратковременной (30—40 сек.) аппликацией миллимолярных (1-10мМ) концентраций L-аргинина (рН=7,4), приводит к генерации кальциевого импульса. После отмывки аргинина и паузы, последующая добавка такой же концентрации L-аргинина приводит к повторному появлению кальциевого ответа, амплитуда которого в среднем может совпадать с первой амплитудой. По типу кальциевого ответа и амплитуде, увеличение [Ca2+]j на добавку L-аргинина крайне похоже на активациею а2-адренорецепторов селективными агонистами (рис. 4А - черная кривая). Ингибиторы PLC и IP3R не влияют на кальциевый ответ, вызываемый аппликацией ЮмМ L-аргинина, но, как и в случае с селективными агонистами а2-рецепторов, подавляется селективными антагонистами.

А Б

Рис. 4. Импульсное увеличение [Са2^ в белых адипоцитах мыши.

(А) - увеличение [Са2+]* в белых адипоцитах мыши под действием 1мкМ гуанабенца, ЗмкМ иК-14,304 и ЮмМ Ь-аргинина; (Б) - преинкубирование адипоцитов с ингибитором РКХЗ - КТ5822 (5мкМ) в течение 5 мин. подавляет генерацию импульсных сигналов на добавку ЮмМ Ь-аргинина. Представлены усредненные ответы клеток. В процентах выражена доля клеток, для которых характерен представленный Са2+-сигнал.

Данный кальциевый сигнал на аргинин полностью подавляется ингибиторами сигнального пути: Ак1/РКВ-»еМ08->50С->РК0->СП38-»11у11-»Са2+, что говорит о его действии через а2-адренергические рецепторы на мобилизацию Са2+ через рианодиновые рецепторы ЭПР белых адипоцитов. При этом, в случае инкубирования клеток с ингибитором РКО - КТ5822, происходит подавление импульсных Са2+-сигналов на Ь-аргинин, однако, ответ клеток приобретает вид медленного увеличения [Са21 (рис. 4Б), что может быть обусловлено либо действием Ь-аргинина на аденилатциклазу и увеличение концентрации сАМР {КеШеп, 2001), либо ингибированием АТФазы плазматической мембраны.

РОЛЬ р-АДРЕНЕРГИЧЕСКИХ РЕЦЕПТОРОВ В КАЛЬЦИЕВОЙ СИГНАЛИЗАЦИИ БЕЛЫХ АДИПОЦИТОВ. В культивируемых белых адипоцитах мыши, аппликация агониста р-адренорецепторов - изопротеренола на фоне антагониста ар, а2-адренорецепторов фентоламина приводит к появлению кальциевых ответов, схожих с 3-им типом сигналов при добавлении норадреналина (рис. 5А), к подобным эффектам приводит активация р2-адренорецепторов -добутамином и р3-адренорецепторов - В11Ь37344 и СОР12177. Пропранолол -антагонист Р-адренорецепторов приводит к полному подавлению такого типа Са2+-ответа адипоцитов (рис. 5Б).

А Б

Рис. 5. Увеличение [Са2*]: в дифференцированных белых адипоцитах при активации Р-адренорецепторов н протеинкипазы А.

(А) - активация Р-адренорецепторов селективными агонистами - изопротеренол (Ри.з, кривая 1), ВЯЬ-37344 (Рз, кривая 2), аденилатциклазы (форсколин, кривая 3) и протеинкиназы А (8-Вгото-сАМР, кривая 4) приводит к медленному увеличению [Са2+],;. (Б) - изопротеренол (1мкМ), добавленный на фоне антагониста Р-адренорецепторов - пропранолола (ЗмкМ) и антагониста а-адренорецепторов - фентоламина 5мкМ. Контроль - кривая 1, добавка изопротеренола (1мкМ). добавлен в начале записи. Антагонисты адренорецепторов добавлены к клеткам за 5 минут до начала эксперимента, их концентрацию поддерживали в течение всего эксперимента.

Непосредственная активация аденилатциклазы форсколином или инкубация клеток с проникающим аналогом сАМР (8-Вгото-сАМР) приводит к медленному росту [Са2+]| (рис. 5А кривая 3 и 4 соответственно). Наблюдаемое увеличение [Са2+]1 происходит после 5 минутного лаг-периода в случае форсколина, а в случае 8-Вгото-сАМР - лаг-период составляет более 10 минут, что, по-видимому, связано с необходимостью проникновения соединения через плазматическую мембрану клеток до необходимой концентрации, активирующей РКА. Ингибитор протеинкиназы А (РКА) - Н-89, добавленный в концентрации 200нМ за 5 минут до аппликации агонистов Рз-адренорецепторов, либо форсколина, предотвращает появление кальциевых ответов белых адипоцитов у 76% клеток, у остальных 24% адипоцитов АКО уменьшалась в 3-4 раза по сравнению с контролем.

Таким образом, в адипоцитах белой жировой ткани мыши, норадреналин, способен вызывать 3 типа кальциевых ответов, отличающихся по механизму формирования. Действуя через арадренорецепторы (о^д), сопряженные с Gq белком и фосфоинозитидным сигнальным каскадом, НА приводит к мобилизации кальция через 1Р3-рецептор. Через сь-адренорецепторы норадреналин и Ь-аргинин активируют сигнальный каскад с участием ряда ферментов: Ак1/РКВ—>еЫ08—»бОС—>РКО—>СЭ38—>11у1*.—+Са2+ и интермедиатов (N0, свМР, сАОРЯ). Появление 3-го типа ответов (медленное увеличение [Са2+]() обусловлено действием норадреналина на Р-адренорецепторы и аденилатциклазный сигнальный каскад.

ХОЛИНЕРГИЧЕСКАЯ СИГНАЛИЗАЦИЯ В КУЛЬТИВИРУЕМЫХ БЕЛЫХ АДИПОЦИТАХ МЫШИ. Са2+-СИГНАЛЫ, ГЕНЕРИРУЕМЫЕ БЕЛЫМИ АДИПОЦИТАМИ В ОТВЕТ НА АЦЕТИЛХОЛИН. Помимо симпатической иннервации, белая жировая ткань также регулируется парасимпатической нервной системой и нейротрансмиттером ацетилхолином (АСЬ). Аппликация АСЬ к клеткам белого жира в концентрации от 0,1 до ЮмкМ инициирует колебания цитозольного кальция (рис. 6) в 61-93% клеток. Сразу после аппликации АСЬ, наблюдается быстрый ответ клеток с увеличением [Са2+]* относительно исходного уровня в 2-3 раза. Затем происходят колебания, у которых максимумы и минимумы постепенно опускаются (дрейфуют) до некоторого окончательного положения. При этом амплитуда колебаний обычно растет, частота уменьшается за счет удлинения межспайкового интервала и достигает ~1мин~'. Между спайками [Са2+], достоверно выше начального уровня. В целом, колебания у большинства (67—78%) клеток длятся менее 5 минут. У остальных 22—33% клеток колебания имеют те же характеристики, но могут длиться до 10 минут (рис. 6 серая кривая).

AC h

0,8-

5 ' 160 ' 260 ' ЗОО ' 4ÔO ' 5ÔO '

Время, с

Рис. б. Действие ацетилхолина на культивируемые белые адипоциты мыши.

В процентах выражена доля клеток, для которых характерен данный тип кальциевого ответа. Представлены типичные кальциевые ответы одиночных адипоцитов.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ РЕЦЕПТОРА АЦЕТИЛХОЛИНА, УЧАСТВУЮЩЕГО В ФОРМИРОВАНИИ Са2+-СИГНАЛА. Периодические режимы изменения [Са2+], сохраняются в присутствии антагонистов Мр (телензепин) и М2- (methoctramine) холинорецепторов. Преинкубирование клеточной культуры белых адипоцитов мыши с антагонистом Мз-холинорецепторов (p-Fluorohexahydro-si!a-difenidol hydrochloride) в концентрациях от 1нМ до ЮОнМ всегда приводит к подавлению кальциевых ответов (в том числе периодических режимов) на ацетилхолин у 90% клеток. При этом 10% адипоцитов отвечают на агонист транзитным увеличением цитозольного кальция, который подавляется в присутствии антагониста Мз-холинорецепторов совместно с ингибитором PLC (U73122).

ИССЛЕДОВАНИЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО ПУТИ ПЕРЕДАЧИ СИГНАЛА С Мз-ХОЛИНОРЕЦЕПТОРА АДИПОЦИТОВ. Чтобы исследовать роль входа Са2+ через плазматическую мембрану была использована среда, не содержащая кальция с добавлением 0,5мМ EGTA. Появление нескольких Са2+-спайков в бескальциевой среде говорит о том, что в механизме ACh-индуцируемых колебаний модуляция входящего потока внеклеточного кальция не играет принципиальной роли. В то же время затухание колебаний показывает необходимость входа Са2+ для их поддержания. Ответы [Са2+]; на ACh полностью предотвращаются преинкубацией клеток с 1мкМ тапсигаргина, ингибирующего Са2+-АТФазу эндоплазматического ретикулума.

Механизмы кальциевых колебаний могут быть разделены на два больших класса в зависимости от использования IP3R или RyR для мобилизации Са2+ из внутриклеточных структур (Thomas et al., 1996; Keizer and Levine, 1996). Чтобы различить возможные пути высвобождения Са2+, мы использовали ингибиторы PLC, IP3R и RyR. Инкубация белых адипоцитов с ингибиторами PLC (U73122) и IP3R -

ксестоспонгином С (ХеС) не только не предотвращает колебания, возникающие при последующей добавке ACh, но и никак не влияет на их вид. Более того, эксперимент, представленный на рисунке 7А демонстрирует, что у адипоцитов с незатухающими в течение 10 минут колебаниями, последовательное добавление ксестоспонгина С и затем U73122, не подавляет периодические режимы на аппликацию ACh. Для определения роли RyR в колебаниях, перед стимуляцией ацетилхолином клетки инкубировали с рианодином, который блокирует RyR в состоянии малой проводимости при микромолярной концентрации и в закрытом состоянии при высоких дозах (около ЮОмкМ) (Dupont and Croisier, 2010). В диапазоне ЮОнМ - ЮмкМ рианодин подавляет кальциевые колебания, вызванные 5мкМ ацетилхолина у 100% адипоцитов в поле зрения (рис. 7Б). Таким образом, механизм колебаний, индуцируемых в адипоцитах ацетилхолином, не зависит от PLC и IP3R, а включает высвобождение Са2+ через RyR из тапсигаргин-чувствительного пула.

А Б

Рианодин

Время, с Время, с

Рис. 7. Изменения [Ca2+]i в белых адипоцитах под действием 5 мкМ ацетилхолина.

(А) - совместное действие ингибиторов PLC (U73122, ЗмкМ) и IP3R (ксестоспонгин С, ХеС), 500нМ) на ход кальциевых колебаний; (Б) - аппликация ацетилхолина на фоне ингибитора RyR -рианодина (1мкМ). В процентах выражена доля клеток с характерным типом ответа.

ВКЛАД NO-cGMP СИГНАЛЬНОГО ПУТИ В ПЕРЕДАЧУ СИГНАЛА С М3-ХОЛИНЕРГИЧЕСКИХ РЕЦЕПТОРОВ. Рианодиновый рецептор (RyR) имеет множество регуляторов (Dupont and Croisier, 2010), которые могут опосредовать пути к нему от рецепторов ACh. Для исследования сигнального пути с М3-холинорецептора, направленного на мобилизацию Са2+ рианодиновым рецептором, нами были использованы ингибиторы соответствующих внутриклеточных ферментов. Результаты ингибиторного анализа представлены на рис. 8.

Преинкубирование белых адипоцитов с любым ингибитором NO-cGMP снгналыюго пути препятствует генерации Са2+-колебаний в большинстве клеток. При этом клетки белого жира реагируют на аппликацию ACh кратковременным увеличением [Са2+]|.

А Б

В Г

Рис. 8. Изменения [Ca2+]i в белых адипоцитах под действием ингибиторов NO-cGMP сигнального пути.

(А) - аппликация ACh на фоне ингибитора PI3K.Y - AS605240; (Б) - аппликация ингибитора Akt/PKB (Aktl/2 kinase inhibitor) на фоне колебаний, индуцированных ACh; (В) - предварительное инкубирование клеток с ингибиторома NOS - L-NAME; (Г) - предварительное инкубирование адипоцитов с ингибитором протеинкиназы G - Rp-8-Br-cGMPS препятствует генерации колебаний в 92% адипоцитов. Представлены ответы одиночных клеток.

Исчезновение индуцируемых ACh колебаний после ингибирования N0-синтазы говорит о важной роли данного фермента в генерации периодических режимов в белых адипоцитах. Подтверждением этому является параллельное измерение продукции оксида азота (N0) и кальция во время Са2+-колебаний (рис. 9). Под действием ацетилхолина, удалось установить, что индуцируя колебания цитозольного кальция, ACh вызывает увеличение продукции N0 в 15 раз. Ингибиторы NO-синтазы - 7NI и L-NAME, добавленные на фоне кальциевых колебаний приводят к подавлению продукции N0, при этом происходит уменьшение амплитуды кальциевых колебаний с дальнейшим прекращением.

Видно, что периодические изменения уровня [Са2+} (рис. 9, кривая 3) в адипоцитах сопряжены с периодическими изменениями скорости продукции N0 (рис. 9, кривая 2). Фаза повышения уровня [Са2+]; сопровождается увеличением продукции N0 (рис 9, кривая 1), что, по-видимому, свидетельствует об активации еМОЭ посредством Са2+.

Рис. 9. Параллельное измерение с помощью флуоресцентных зондов Fura-2 и DAF внутриклеточной концентрации ионов кальция [Ca2t]i и оксида азота [NO] в белых адипоцитах мыши при аппликации 5мкМ ацетилхолина.

Уровень [Ca2+]i, выражен в единицах отношения флуоресценции Fura-2 при возбуждении в 340 и 380нм (кривая 3). Продукция NO выражена в относительных значениях флуоресценции DAF-FM во времени (кривая 1), где AF = F - F0 (F - значение флуоресценции DAF-FM в данной точке, a F0 — уровень флуоресценции в начале эксперимента), а также флуоресценция DAF FM (кривая 2), представленная в виде производной. Стрелками показаны моменты аппликации ACh и ингибитора NO-синтазы -7NI. Представлен ответ одиночной клетки.

Циклическая ADP-рибоза (cADPR), которая производится ферментом ADP-рибозилциклазой (CD38) из NAD, является активатором рианодинового рецептора. Преинкубирование белых адипоцитов с конкурентным ингибитором CD38 -никотинамидом, предотвращает появление Са2+-колебаний, а аппликация никотинамида на фоне ацетилхолина, прекращает колебания в течение нескольких секунд. Кроме того, активатор и субстрат для CD38 - pNAD приводит к генерации колебаний, подобных индуцированным ацетилхолином.

Таким образом, при активации М3-холинорецептора происходит генерация устойчивых Са2+ колебаний при активации сигнального каскада, включающего

1,4-

7NI

J/v N0 -1,5

1000 2000 3000

Время, с

активацию: Р13К->Ак1->еМ08->Ы0->с0МР->РК0->С038->11уК->Са2+, за счет (Зу-субъединиц Оч-белков, с которыми сопряжен ацетилхолиновый рецептор.

КОНВЕРГЕНЦИЯ СИГНАЛЬНЫХ ПУТЕЙ, СОПРЯЖЕННЫХ С 1Р3 и РИАНОДИНОВЫМИ РЕЦЕПТОРАМИ В БЕЛЫХ АДИПОЦИТАХ МЫШИ. Ввиду того, что норадреналин, Ь-аргинин и ацетилхолин вызывают различные Са2+-ответы у белых адипоцитов за счет активации различных рецепторов и сигнальных каскадов, а общим для этих агонистов является то, что они действуют через О-белок зависимые рецепторы, которые включают общую систему сигнализации с участием Ру субъединиц й^-белков от а, и Мз-рецепторов, а также Ц-белков (^-рецепторов. Кроме того, эти рецепторы имеют собственные пути сигнализации с участием белков на фосфолипазу С и 1Р3-рецепторы, а со стороны р-адренорецепторов - йз-белков на аденилатциклазу и протеинкиназу А. В таких условиях возможно существование конвергенции сигнализации и наличие различных нелинейных явлений, включая генерацию спайков и периодических процессов. Поэтому представляет интерес исследование взаимодействия адренергической и холинергической сигнальных систем белых адипоцитов.

При концентрации АСЬ 1-10нМ в среде, Са2+ ответы отсутствуют у 100% клеток. Последующая добавка 1мкМ НА приводит к генерации Са2+-колебаний в 4050% клеток (рис. 10Б). Как было показано выше, норадреналин, несмотря на активацию различных подтипов а- и Р-адренорецепторов, не приводит к возникновению периодических колебаний в адипоцитах, что подтверждается нашими экспериментами, в которых на фоне концентраций норадреналина, вызывающих транзитное повышение [Са2+],, аппликация наномолярных доз АСЬ приводит к появлению периодических кальциевых сигналов в адипоцитах мыши (рис. 10В). При более высоких концентрациях АСЬ, вызывающих колебания [Са2+]1, добавка микромолярных доз НА увеличивает частоту колебаний без изменения их амплитуды.

Таким образом, преинкубированием белых адипоцитов мыши с низкими дозами ацетилхолина приводит к преобразованию кальциевого ответа клеток на норадреналин, который из транзитного приобретает вид колебательного. В то же время, аппликация наномолярных концентраций ацетилхолина на фоне норадреналина, аппликация которого уже вызвала транзитное увеличение [Са2+]|, приводит также к генерации кальциевых колебаний. Следовательно, в адипоцитах имеет место потенцирование эффекта АСЬ посредством норадреналина за счет конвергенции сигналов с М3-холинорецепторов и адренергических рецепторов.

Общая схема сигнализации с участием а- и М3-рецепторов, и соответствующих сигнальных путей, а также различных регуляторных связей представлена на рисунке 10А. При достаточно высоких концентрациях АСЬ (5мкМ), действуя через М3-холинорецепторы и активируя Р13Ку с участием Орт белков, запускает периодический процесс. В этом случае НА, действуя через адренорецепторы, способен модулировать частоту колебаний. При слабой передаче сигнала со стороны АСЬ с участием Срт белков, когда АСЬ (ЮнМ) не способен запустить периодические процессы, добавка НА приводит к возникновению

автоколебательного режима за счет первичного 1Р3-зависимого выброса Са2+ активации еЫОЗ, находящейся в петле положительной обратной связи. А

тт. ттшх^ятт

/со.3\1 f r -.l :

/ сАОРЯ ?., J !

/У/ /<кг>

2.0-, 1,81.8 »1.4

§1,2-N ¿1,0-

^ 0,80,6 0,4-:

НА 6цМ

Рис. 10. Конвергенция сигналов с Мз-холинорецепторов и адренергических рецепторов.

(А) - аппликация норадреналина (1мкМ) на фоне ЮнМ ацетилхолина; (Б) - аппликация ЮнМ ацетилхолина на фоне 5мкМ норадреналина; (В) - схема конвергенции сигнальных каскадов, активируемых ар, аг-адренорецепторами и Мз-холинорецепторами.

Обозначения: DAG - диацилглицерол, PIP2 - фосфатидилинозитол бисфосфат, PIP3 -фосфатидилинозитол трисфосфат, РБК - фосфатидилинозитол-3-киназа, PLC - фосфолипаза С, eNOS - эндотелиальная NO-синтетаза, sGC - растворимая гуанилат-циклаза, Akt (РКВ) и PKG -протеинкиназы В и G, CD38 - АДФ-рибозил циклаза, CaMKII - кальций/кальмодулин-зависимая протеинкиназа 2, АМРК - АМФ-активируемая протеинкиназа, CaMKKß - кальций/кальмодулин-зависимая протеинкиназа киназа ß, IP3 - инозитолтрисфосфат, IP3R - рецептор IP3, cADPR -циклическая АДФ-рибоза, RyR - рианодиновый рецептор.

Таким образом, при наличии высокой суммарной концентрации Ору белков, активация РКв выполняет несколько функций: обеспечивает селективное

выключение 1Р311, активацию закачки Са2+ в ретикулум (ЗЕЯСА) и активацию выброса Са2+ из КуЛ-зависимых депо, за счет активации СЭ38 и накопления сАЭР11.

Для исследования возможных вариантов конвергенции сигнальных путей, активируемых различными типами рецепторов, нами использована инкубация клеток с малыми дозами АСЬ с последующей добавкой агонистов к различным рецепторам.

КОНВЕРГЕНЦИЯ СИГНАЛИЗАЦИИ М3-ХОЛИНОРЕЦЕПТОРОВ И а,-АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ. Активация арадренорецептора селективным агонистом -фенилэфрином способна вызвать только кратковременный (транзитный) Са2+-ответ у белых адипоцитов. Однако характер ответов на фенилэфрин радикальным образом изменяется в присутствии малых концентраций АСЬ в среде инкубации клеток. В разных клетках регистрируются динамические режимы двух типов: высокочастотные с высоким уровнем базального [Са2+], (рис. 11А - черная кривая) или низкочастотные, происходящие без повышения базальной концентрации [Са2+]| (рис. 11А - серая кривая), но с большими амплитудами. Подобное изменение кальциевых ответов происходит при активации сн-адренорецепторов циразолином и А61603. Общей характеристикой Са2+-ответов, вызываемых агонистами агадренорецепторов на фоне малой концентрации ацетилхолина является транзитное увеличение [Са2+]; при аппликации агониста, после чего происходят кальциевые колебания, различающиеся частотой и амплитудой у одиночных клеток. В отличие от колебаний, индуцируемых микромолярными дозами ацетилхолина, данные периодические режимы не прекращаются в течение времени регистрации (15 минут) у всех отвечающих клеток.

КОНВЕРГЕНЦИЯ СИГНАЛИЗАЦИИ М3-ХОЛИНОРЕЦЕПТОРОВ И а2-АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ. Селективные агонисты а2-адренорецепторов иК14,304, гуанабенц, а также миллимолярные концентрации Ь-аргинина, приводят в комбинации с низкими дозами АСЬ к генерации кальциевых колебаний (рис. 11Б). Общей чертой таких колебаний является отсутствие базального увеличения [Са2+]; во всех клетках.

Рис. 11. Конвергенция сигнальных путей с Мз-холинергических рецепторов и адренергнческнх рецепторов (аь а:, Рз).

(А) - аппликация 1мкМ фенилэфрина на фоне 2нМ ацетилхолина; (Б) - аппликация ЗмкМ 1Ж-14,304 на фоне 1нМ ацетилхолина; (В) — аппликация Рз-селективного СОР12177 (ЮмкМ) на фоне 1нМ ацетилхолина; (Г) - аппликация 5мкМ активатора адеиилатциклазы - форсколина на фоне 1нМ ацетилхолина. В процентах выражена доля адипоцитов с представленными типами Са2+-сигналов.

КОНВЕРГЕНЦИЯ СИГНАЛИЗАЦИИ М3-ХОЛИНОРЕЦЕПТОРОВ И Р|,Рз-АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ. Аппликация агонистов р-адренорецепторов (изопротеренол, ССР 12177, добутамин) на фоне низких концентраций АСЬ вызывает появление кальциевых колебаний в культивируемых белых адипоцитах. Колебания, в отличие от активации а-адренорецепторов, сопровождаются ростом базального уровня Са2+ в клетках и наличием лаг-периода (рис. 11В) перед началом колебаний, продолжительность которого различается у отдельных адипоцитов и наблюдается при любой концентрации агониста..

Активация Р-адренорецепторов связана с последующей активацией О, белков и действием сАМР и РКА на различные ферменты и каналы в клетке, включая фосфорилирование и активацию 1РзЯ, 11у11 и Са2+-АТФазы ретикулума (вЕЯСА), что накладывается на регуляцию этих и других клеточных мишеней с участием N0, свМР, сАОРИ. и РКО. Подтверждением этому являются эффекты, вызванные активатором адеиилатциклазы — форсколином. Видно, что форсколин, который приводит к накоплению сАМР и последующей активации РКА, в присутствии малых концентраций ацетилхолина, вызывает генерацию Са2+-колебаний (рис. 11Г),

также сопровождающихся увеличением базального уровня [Са2+], и наличием лаг-периода у большинства адипоцитов.

Это свидетельствует об известной по литературным данным активации Са2+-каналов ретикулума и Са2+-АТФаз с участием РКА.

Таким образом, в белых адипоцитах имеет место конвергенция сигнализации для всех перечисленных агонистов, основанная на том, что данные гормоны, действуя через G белок зависимые рецепторы:

- включают общую систему сигнализации с участием Ру субъединиц (GpY) для Gq, Q и Gs белков, и имеющих одну общую мишень - фосфоинозитидкиназу Р13Ку:

GpY—»Р1РЗКу—>Akt/PKB—>eNOS—»NO—>sGC—»cGMP—»PKG-+CD38—>cADPR—»RyR—>Ca2t

- имеют классические пути сигнализации с участием Gaq белков (PLC, IP3) и Gs белков (сАМР, РКА).

Gaq, GPy PLC -> IP3 -> IP3R Са2+,

Gas —» AC —» сАМР -» РКА (RyR, IP3R)

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Фундаментальные механизмы регуляции сигнальных систем жировых клеток изучены недостаточно. Практически не исследованы и не принимаются во внимание механизмы конвергенции различных сигнальных систем, как на уровне входов — рецепторов для различных гормонов и трансмиттеров, так и на уровне вторичных мессенджеров - сАМР, cGMP, Са2+, NO, IP3, cADP.

В представленном исследовании показано, что белые адипоциты при воздействии естественного гормона — норадреналина, способны генерировать различные кальциевые сигналы. Причиной данного различия кальциевых ответов является не только экспрессия нескольких типов адренергических рецепторов, но и активация разных сигнальных каскадов. Первый тип кальциевых ответов характеризуется быстрым транзитным кальциевым ответом, являющимся результатом активации через ai-адренорецептор фосфоинозитидного сигнального каскада и мобилизацией кальция из ЭПР. Второй тип ответов белых адипоцитов характеризуется быстрым кратковременным одиночным импульсом, по кинетике и механизму формирования отличающемуся от первого типа. В основе этого (впервые показанного для адипоцитов) механизма лежит активация сигнального пути PI3K—►Akt/PKB—»eNOS—>sGC—>PKG—»CD38—»RyR при действии норадреналина на аг-адренорецептор через Gpy-субъединицы G,-белков. Третий тип ответов представляет собой медленное высокоамплитудное увеличение Са2+ в цитозоле, связанное с активацией аденилатциклазного сигнального каскада при действии норадреналина на p-адренорецепторы.

Впервые показано действие ацетилхолина на клетки белой жировой ткани. С помощью ингибиторного анализа продемонстрирована экспрессия функционального М3-холинорецептора, активация которого приводит к возникновению колебаний

[Ca2+]i за счет Gp^-субъединицы Gq-белков, в результате приводящих к мобилизации Са2+ через активацию рианодинового рецептора. В поддержании таких кальциевых колебаний ключевую роль играет NO-синтаза и оксид азота, продукция которого возрастает под действием ацетилхолина, а ингибирование фермента предотвращает генерацию периодических режимов в цитоплазме белых адипоцитов мыши.

В работе продемонстрирована конвергенция сигнализации с рецепторов, запускающих сигнальные каскады, сопряженные с активацией IP3R и RyR за счет сопряжения сигналов G-белок зависимых рецепторов с участием Ру-субъединиц на одну общую мишень - фосфоинозитидкиназу (Р13Ку).

ВЫВОДЫ

1. В клетках белого жира мыши экспрессируются а1А-, а2- и Pi,3-адренергические рецепторы, активация которых норадреналином способна вызывать различные по типу и механизму формирования кальциевые ответы.

2. При действии норадреналина и селективных агонистов на diA-адренорецепторы в белых адипоцитах наблюдается типичное для невозбудимых клеток транзитное увеличение [Ca2+]i за счет активации фосфоинозитидного пути передачи внутриклеточных сигналов.

3. При активации а2-адренорецепторов норадреналином, L-аргинином и селективными агонистами может активироваться сигнальный путь с участием PI3Ky—*Akt—>eNOS ->NO->sGC->cGMP-»PKG-»CD38-*RyR, что приводит к импульсному выбросу ионов кальция из эндоплазматического ретикулума.

4. Ацетилхолин вызывает колебания кальция в адипоцитах, которые обусловлены его взаимодействием с М3-холинорецепторами и селективной активацией RyR по сигнальному каскаду PI3 Ку—► Akt—»eNO S—*NO—>sGC—»cGMP—»PKG—>CD3 8—>RyR.

5. В белых адипоцитах имеет место взаимодействие адренергической и холинергической сигнальных систем, выраженное в конвергенции сигналов от он, а2-адренорецепторов и М3-холинорецепторов на одну общую мишень — PI3K, за счет ее активации Ру-субъединицами соответствующих G-белков.

6. Конвергенция сигналов с М3-холинорецепторов и р-адренергических рецепторов происходит за счет активации РОК с помощью Ру-субъединиц Gs- и Gq-белков, а также за счет активации РКА, которая приводит к фосфорелированию каналов эндоплазматического ретикулума и Са2+-АТФаз плазматической мембраны.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах

Х.Туровский Е.А., Туровская М.В., Бережное A.B., Толмачева A.B., Кашючников Н.П., Долгачева Л.П., Зинченко В.П., Маевский Е.И., Дынник В.В. Конвергенция Са2+-сигнальных путей в адипоцитах. Роль L-аргинина и протеинкиназы G в генерации импульсных и периодических Са2+ сигналов. Биологические мембраны, 2011. Т.28(6): 1-11.

2.Туровский Е.А., Каймачников Н.П., Туровская М.В., Бережное A.B., Дынник В.В., Зинченко В.П. Два механизма кальциевых колебаний в адипоцитах. Биологические мембраны, 2011. Т.28(6):463-72.

3. Туровский Е.А., Конаков М.В., Бережное A.B., Зинченко В.П., Бронников Г.Е., Долгачева Л.П. Изменение Са2+-ответов культивируемых бурых адипоцитов при адренергической активации. Цитология, 2011. Т.53(6): 466-73.

4. Конаков М.В., Долгачева Л.П., Туровский Е.А., Бронников Г.Е. Изменение

концентрации ионов кальция в цитоплазме бурых преадипоцитов при адренергической стимуляции. Биологические мембраны 2010, Т27(1): 77-83. 5Долгачева Л.П., Туровский Е.А., Туровская М.В., Зинченко В.П., Дынник В.В. а-адренергический контроль двух Са2+-сигнальных путей адипоцитов. Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2012 (в печати) Статьи в сборниках

1.Туровский Е.А.. Туровская М.В., Бережное A.B., Толмачева A.B., Ненов М.Н., Долгачева Л.П., Зинченко В.П., Маевский Е.И., Дынник В.В. Регуляция уровня [Ca2+]i в адипоцитах мыши норадреналином, аргинином и ацетилхолином. Конвергенция сигнализации ai, a2 и m3 рецепторов. Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино 2011. (2426 мая) 1, стр. 57-63.

2. Туровский Е.А.. Туровская М.В., Бережное A.B., Долгачева Л.П., Зинченко В.П.,

Маевский Е.И., Дынник В.В. Регуляция уровня Са2+ в адипоцитах ацетилхолином. Роль т3-холинорецепторов и PKG. Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино 2011. (2426 мая) 1, стр. 64-70.

3.Конаков М.В., Туровский Е.А., Туровская М.В., Бережное A.B., Зинченко В.П., Долгачева Л.П. Развитие кальциевого ответа и ретикулума в процессе дифференцировки адипоцитов в культуре. Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино 2011. (24-26 мая) 1, стр. 352-57.

4.Туровский Е.А.. Кашючников Н.П., Туровская М.В., Бережное A.B., Дынник В.В., Зинченко В.П. Два механизма кальциевых колебаний в адипоцитах. Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино 2011. (24-26 мая) 1, стр. 391-96.

5.Конаков М.В., Долгачева Л.П., Туровский Е.А.. Агафонова Т.А., Бронников Г.Е. Сравнение Са2+-ответов преадипоцитов мышей и сусликов (SPERMOPHILIS UNDULATUS) при адренергической стимуляции. Международная

конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино 2009. (2-4 июня) 1, стр. 278-82.

Тезисы докладов

1. Дынник В.В., Туровский Е.А.. Туровская М.В., Толмачева A.B., Долгачева Л.П.,

Зинченко В. П. Активация М3-мускариновых рецепторов вызывает колебания концентрации Са2+ и N0 в адипоцитах, действуя через Са2+—»NO—»cGMP—»cADP-ribose—>Са2+ обратную связь. IV съезд биофизиков России. Нижний Новгород 2012 год.

2.Дынник В.В., Туровский Е.А.. Долгачева Л.П., Зинченко В.П. Ожирение, диабет 2-го типа и дисфункция жировой ткани. Международная научная конференция «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем», Минск 2012. стр. 126.

3.Туровский Е.А., Конаков М.В. Суслики (SPERMOPHILIS UNDULATUS) и мыши скорее всего имеют разные механизмы индукции гиперплазии бурой жировой ткани. Школа-конференция для молодых ученых «Методы культивирования клеток», Санкт-Петербург 2008 год, стр.827.

4.Конаков М.В., Туровский Е.А. Суслики (SPERMOPHILIS UNDULATUS) и мыши имеют разные механизмы индукции гиперплазии бурой жировой ткани. Всероссийская медико-биологическая научная конференция молодых учёных «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (XI Всероссийская конференция «Человек и его здоровье»), Санкт-Петербург 2008 год, стр.162.

5. Туровский Е.А.. Долгачева Л.П., Туровская М.В., Дынник В.В., Зинченко В.П. а-адренергический контроль двух Са2+-сигнальных путей белых адипоцитов. Международная конференция молодых ученых «Экспериментальная и теоретическая биофизика '12», Пущино, 2012 год, стр. 52-53.

Подписано в печать:

05.10.2012

Заказ № 7677 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Туровский, Егор Александрович

ВВЕДЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Гормоны и медиаторы жировой ткани

1.2 Дисрегуляция жировой ткани

1.3 Регуляция липидного обмена в адипоцитах

1.3.1 Метаболический контроль

1.3.2 Ковалентная модификация

1.3.3 Генетический контроль

1.4 Липотоксичность свободных жирных кислот

1.5 Метаболизм адипоцитов белой жировой ткани

1.6 Базальный липолиз, рециркуляция TAG = FFA и футильные циклы

1.7 Адренергические рецепторы

1.7.1 а 1-адренергические рецепторы

1.7.2 аг-адренергические рецепторы

1.7.3 Р-адренергические рецепторы

1.8 Ацетилхолиновые мускариновые рецепторы. Структура и функции

1.9 Синтетазы оксида азота и NO-цГМФ сигнальный путь

1.9.1 Структура и подтипы синтетаз оксида азота

1.9.2 Оксид азота как вторичный мессенджер

1.9.3 Активируемая оксидом азота цитозольная гуналатциклаза и их активированными производными

1.9.4 Протеинкиназа G

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Выделение и культивирование клеток

2.1.1 Выделение и культивирование преадипоцитов белой жировой ткани

2.2 Флуоресцентная микроскопия

2.2.1 Регистрация уровня цитозольного кальция

2.2.2 Измерение продукции оксида азота (N0)

2.3. Система аппликации и отмывки веществ

2.4. Обработка цифровых изображений и графические построения 46 2.5 Использованные реактивы

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

3.1. Увеличение [Ca2+]i под действием норадреналина 48 3.1.1. Кальциевые ответы адипоцитов на агонисты сц-адренергических рецепторов.

Вклад aiA-адренорецепторов

3.1.2. Са -ответы белых адипоцитов на агонисты аг-адренергических рецепторов. Исследование пути передачи сигнала

3.1.3. Рецептор-опосредованное действие Ь-аргинина на белые адипоциты мыши

3.1.4. Роль р-адренергических рецепторов в кальциевой сигнализации белых адипоцитов

3.2. Холинергическая сигнализация в культивируемых белых адипоцитах мыши

3.2.1. Са2+-сигналы, генерируемые белыми адипоцитами в ответ на ацетилхолин

3.2.2. Определение рецептора ацетилхолина, участвующего в формировании Са2+-сигнала

3.2.3. Исследование внутриклеточного пути передачи сигнала с Мз-типа холинорецептора адипоцитов

3.2.3.1. Вклад МО-сОМР сигнального пути в передачу сигнала с Мз-холинергических рецепторов

3.3. Конвергенция сигнальных путей, сопряженных с 1Рз- и ЯуЯ рецепторами в адипоцитах мыши

3.3.1. Конвергенция сигнализации Мз-холинорецепторов и сн-адренорецепторов

3.3.2. Конвергенция сигнализации Мз-холинорецепторов и аг-адренорецепторов

3.3.3. Конвергенция сигнализации Мз-холинорецепторов и РьРз-адренорецепторов

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование кальциевой сигнализации культивируемых белых адипоцитов. Конвергенция сигнальных путей, сопряженных с IP3- и рианодиновыми рецепторами."

Актуальность проблемы. Ожирение рассматривается как один из основных факторов высокой смертности населения вследствие развития неалкогольного стеатогепатита, диабета 2-го типа и сердечно-сосудистых заболеваний (Асташкин и Глезер, 2008; Boguszewski et al., 2010). Развитие этих заболеваний при ожирении обусловлено «дислипидэмией» - избытком циркулирующих в крови токсинов - жирных кислот.

Гипертрофия и дисфункция белой жировой ткани (WAT) несет в себе большой патогенный потенциал, ввиду ее неспособности эффективно устранять из крови жирные кислоты, а также за счет трансформации эндокринных и иммунных функций жировой ткани (Bays et al., 2008).

Известно, что симпатическая нервная система и нейротрансмиттер норадреналин (НА) играют важную роль в процессе липолиза WAT (Tavernier et al., 2005). Модулирующий эффект норадреналина на функции жировой клетки является комплексным и вовлекает не только различные подтипы адренорецепторов, но и различные системы трансдукции сигнала. В ряде работ показано, что липолиз, стимулированный норадреналином, обеспечивается активацией Р-адренорецепторов, аденилатциклазы и синтезом сАМР, а также ключевых липаз HSL и ATGL и фосфорилированием перилипина. Ингибирование этого процесса обеспечивается в результате активации аг-адренорецепторов, гетеротримерного белка Gj, а;-субьединицы, ингибирующей аденилатциклазу и синтез сАМР. Важную роль в процессах передачи сигналов от рецептора к мишеням играют и Ру-субьединицы Gj-белков. В последние годы стало известно, что липолиз также может быть стимулирован предсердным натрийуретическим пептидом с последующим накоплением cGMP и активацией протеинкиназы G (Wong and Fiscus, 2011).

Что касается парасимпатической нервной системы и ее нейротрансмиттера, ацетилхолина, то кроме ингибирования процесса липолиза, о его действии на жировые клетки ничего не известно.

Роль Са в регуляции липолиза и липогенеза белой жировой ткани практически не исследована, несмотря на то, что в роли вторичного мессенджера кальций опосредует действие более 100 нейротрансмиттеров и гормонов и регулирует многочисленные клеточные функции. Считается, что рост

Са должен приводить к ингибированию липолиза протеинкиназой CaMKII и Са

-зависимыми фосфодиэстеразами (PDEIII, IV), снижению концентрации сАМР и свМР и активности протеинкиназ А и О, соответственно.

Цель исследования. Целью данной работы является исследование кальциевой сигнализации белых адипоцитов.

Основные задачи исследования.

1. Исследовать особенности кальциевой сигнализации культивируемых белых адипоцитов на уровне адренергических и холинергических рецепторов, а также на уровне вторичных мессенджеров - цАМФ, свМР, Са2+, N0, 1Рз, сАОРг;

2. Изучить механизм действия Ь-аргинина на кальциевую сигнализацию культивируемых белых адипоцитов;

3. Выяснить механизм генерации и поддержания периодических режимов колебаний уровня цитозольного кальция, индуцируемых активацией мускариновых ацетилхолиновых рецепторов;

4. Изучить механизмы конвергенции сигнальных систем, сопряженных с 1Рз- и рианодиновыми (ЯуЯ) рецепторами.

Научная новизна работы. В настоящей работе показано, что норадреналин, действуя на а- и Р-адренергические рецепторы культивируемых белых адипоцитов, вызывает 3 типа кальциевых ответов, имеющих различные механизмы формирования. Быстрые кальциевые ответы адипоцитов преобладают при адренергической стимуляции и отличаются по амплитуде и длительности сигнала. Воздействие на а 1 -адренорецепторы приводит к активации фосфоинозитидного пути передачи сигналов и как результат, высокоамплитудному увеличению [Са2+]1 типа пик-плато. Активация аг-адренергических рецепторов норадреналином, селективными агонистами и Ь-аргинином, помимо хорошо изученного действия, направленного на ингибирование аденилатциклазы, приводит к кратковременному импульсному увеличению кальция в цитозоле через активацию рианодинового рецептора с помощью Ру-субъединиц 0;-белков. Таким образом, показан новый путь передачи сигналов при активации <Х2-адренорецепторов. Активация Р-адренергических рецепторов приводит к медленному увеличению кальция в цитозоле за счет накопления цАМФ и функционирования аденилатциклазного сигнального каскада.

Показан механизм возникновения и поддержания кальциевых колебаний, индуцируемых ацетилхолином, в котором ведущее значение имеет рианодиновый рецептор (ИуЯ).

Продемонстрирована конвергенция сигнализации для рецепторов, сопряженных с 1Рз- и ЯуЯ, основанная на том, что гормоны, действуя через рецепторы, сопряженные с в-белком, включают общую схему сигнализации с участием ру-субъединиц для Gq, в! и Об белков, которые активируют одну общую мишень - фосфоинозитидкиназу (РБК).

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

WAT - белая жировая ткань Akt/PKB - протеинкиназа В

САМКИ — кальмодулин-зависимая протеин киназа II

DAG - диацилглицерол

1Р3 — инозитол-1,4,5-трифосфат

IP3R —рецептор IP3

PIP2 (Р1Р4,5) - фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат

Р1Рз - фосфатидилинозитол-1,4,5-трифосфат

PLC - фосфолипаза С

RyR - рианодиновый рецептор

Ca2+]¡ - концентрация ионов кальция в цитозоле

FFA - свободные жирные кислоты

НА - норадреналин

ACh - ацетилхолин

РКА - протеинкиназа А

РКС - протеинкиназа С

АКО - амплитуда кальциевого ответа

SERCA - кальциевая АТФаза сарко- и эндоплазматического ретикулума РМСА - кальциевая АТФаза плазматической мембраны

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Туровский, Егор Александрович

выводы

1. В клетках белого жира мыши экспрессируются <Х1а-, а2- и Р^з-адренергические рецепторы, активация которых иорадреналином способна вызывать различные по типу и механизму формирования кальциевые ответы.

2. При действии норадреналина и селективных агонистов на а1А-адренорецепторы в белых адипоцитах наблюдается типичное для невозбудимых клеток транзитное увеличение [Са ]; за счет активации фосфоинозитидного пути передачи внутриклеточных сигналов.

3. При активации а2-адренорецепторов иорадреналином, Ь-аргинином и селективными агонистами может активироваться сигнальный путь с участием Р13Ку —» Ак1/РКВ->-еШ8 N0 -> зОС-» сйМР -> РКО СБ38 -> сАБРЯ ЯуК, что приводит к импульсному выбросу ионов кальция из эндоплазматического ретикулума

4. Ацетилхолин вызывает колебания кальция в адипоцитах, которые обусловлены его взаимодействием с Мз-холинорецепторами и селективной активацией ЯуЯ по цепочке Р13Ку—»Ак1УРКВ -> еЫОЗ -> N0 эОС -> свМР -> РКО -> СБ38-> сАБРЯ -> ЯуЯ. Наличие одной или нескольких петель положительных обратных связей, позволяет системе проявлять различные динамические режимы.

5. В белых адипоцитах имеет место взаимодействие адренергической и холинергической сигнальных систем, выраженное в конвергенции сигналов от аь а2-адренорецепторов и Мз - холинорецепторов рецепторов на одну общую мишень - Р13К, за счет ее активации (Зу-субъединицами соответствующих в-белков.

6. Конвергенция сигналов с Мз-холинорецепторов и р-адренергических рецепторов происходит за счет активации Р13К с помощью ру-субъединиц Об- и Gq-белков, а также за счет активации РКА, которая приводит к фосфорелированию каналов эндоплазматического ретикулума и

Са2+-АТРаз плазматической мембраны.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основу современных представлений о нарушениях, вызываемых избытком свободных жирных кислот при ожирении и диабете 2 типа составляют представления об инсулиновой резистентности клеток жировой ткани и др. органов (печень, мышцы, поджелудочная железа, эндотелий) и о стрессе эндоплазматического ретикулума, при котором имеют место синтез «неправильных» белков с нарушением сворачивания их полипептидных цепей и опустошение ретикулума (Tsiotra and Tsigos, 2006; Nakatani et al., 2005). Однако, таких данных недостаточно для объяснения причин и механизмов избыточного накопления триглицеридов, гипертрофии и гибели клеток жировой ткани, вследствие некроза и активации макрофагов, продуцирующих провоспалительные цитокины.

Фундаментальные механизмы регуляции сигнальных систем жировых клеток изучены недостаточно. Практически не исследованы и не принимаются во внимание механизмы конвергенции различных сигнальных систем, как на уровне входов — рецепторов для различных гормонов и трансмиттеров, так и на уровне вторичных мессенджеров - cAMP, cGMP, Са2+, NO, IP3, cADP.

В представленном исследовании показано, что дифференцированные белые адипоциты при воздействии естественного гормона - норадреналина, способны генерировать различные кальциевые сигналы. Причиной данного различия кальциевых ответов является не только экспрессия нескольких типов адренергических рецепторов, но и активация разных по механизму сигнальных каскадов. Первый тип кальциевых ответов характеризуется быстрым транзитным кальциевым ответом, являющимся результатом активации через сц-адренорецептор фосфоинозитидного сигнального каскада и мобилизацией кальция из ЭПР. Второй тип ответов белых адипоцитов характеризуется быстрым кратковременным одиночным импульсом, по кинетике и механизму формирования отличающемуся от первого типа. В основе этого (впервые показанного для адипоцитов) механизма лежит активация сигнальной цепочки PI3K —» Akt/PKB —► eNOS -» sGC -» PKG —► CD38 —> RyR при действии норадреналина на а2-адренорецептор через Gpy-субъединицы Gi-белков. Быстрая инактивация данного Са2+-сигнала происходит с участием PKG. Третий тип ответов представляет собой медленное высокоамплитудное увеличение Са2+ в цитозоле, связанное с активацией аденилатциклазного сигнального каскада при действии норадреналина на Р-адренорецепторы.

Впервые показано действие ацетилхолина на клетки белой жировой ткани. С помощью ингибиторного анализа продемонстрирована экспрессия функционального М3холинорецептора, активация которого приводит к возникновению колебаний [Са2+];за счет Ору-субъединицы Оч-белков, в результате приводящих к мобилизации Са2+ через активацию рианодинового рецептора. В поддержании таких кальциевых колебаний ключевую роль играет ЫО-синтаза и оксид азота, продукция которого возрастает под действием ацетилхолина, а ингибирование фермента предотвращает генерацию периодических режимов в цитоплазме белых адипоцитов мыши.

В работе продемонстрирована конвергенция сигнализации с рецепторов, запускающих сигнальные каскады сопряженные с активацией 1РзЯ и ЯуЯ. В основе которой лежит сопряжение сигналов в-белок зависимых рецепторов с участием Ру субъединиц на одну общую мишень - фосфоинозитидкиназу Р13Ку.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Туровский, Егор Александрович, Пущино

1. Асташкин Е.И. Глезер М.Г. Ожирение и артериальная гипертония // Проблемы женского здоровья. 2008. -Т.З. -№4. С 5-13.

2. Бережнов А.В. Федотова Е.И., Ненов М.Н., Зинченко В.П., Дынник В.В. Токсические эффекты жирных кислот. Роль фосфолипаз. // Материалы междунар. конф. "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" Пущино. 2009. - С. 15-19.

3. Дынник В.В. Бережнов А.В., Федотова Е.И., Ненов М.Н. Каталитические матрицы фосфоинозитидов. Возможные механизмы регуляции // Материалы междунар. конф. «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» Пущино. 2009. - С. 36-42.

4. Ивашкин В.Т. Маевская М.В. Липотоксичность и метаболические нарушения при ожирении // РЖГГИ. 2010. -№1. С 4-13.

5. Крутетская З.И. Лебедев О.Е., Курилова Л.С. Механизмы внутриклеточной сигнализации // СПб: Изд-во СПбГУ, 2003. С. 208.

6. Клебанова Е.М., Балаболкин М.И. Гормоны жировой ткани и их роль в патогенезе сахарного диабета 2-го типа // Лечащий врач. 2010. №11. — С. 27-33.

7. Сергеев П.В. Шимановский Н.Л., Петров В.И. Рецепторы физиологически активных веществ // Волгоград: Семь вёрст, 1999. С. 640.

8. Турпаев К.Т. Роль окиси азота в передаче сигнала между клетками // Молекулярная биология. 1998. -Т. 32. -№ 4. С. 581-591.

9. Ahren В. Autonomic regulation of islet hormone secretion-implications for health and disease // Diabetologia. 2000. Vol. 43. - P. 393-410.

10. Alderton W.K. Cooper. C.E., Knowles R.G. Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition // J Biochem. 2001. Vol. 357. - P. 593-615.

11. Altaian J.D. Trendelenburg A.U., MacMillan L., Bernstein D., Limbird L., Starke K., Kobilka B.K., Hein L. Abnormal regulation of the sympathetic nervous system in a2A-adrenergic receptor knockout mice // Mol Pharmacol. 1999. Vol. 56. - P. 154-161.

12. Arner E. Westermark P.O., Spalding K.L., Britton T., Ryden M., Frisen J., Bernard S., Arner P. Adipocyte turnover: relevance to human adipose tissue morphology // Diabetes. 2010. Vol. 59. -№ 1. - P. 105-109.

13. Arner P. Human fat cell lipolysis: biochemistry, regulation and clinical role // Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. 2005. Vol. 19. - №4. - P. 471-482.

14. Baggaley E. McLarnon S., Demeter I., Varga G., Bruce J.I. Differential regulation of the apical plasma membrane Ca(2+) -ATPase by protein kinase A in parotid acinar cells // J Biol Chem. 2007. Vol. 282. - № 52. - P. 37678-37693.

15. Balbatun A. Louka F.R., Malinski T. Dynamics of nitric oxide release in the cardiovascular system // Acta Biochimica Polonica. 2003. Vol. 50. - № 1. - Vol. 61-68.

16. Bays H.E. Laferrere B., Dixon J., Aronne L., Gonzalez-Campoy J.M., Apovian C., Wolfe B.M. Adiposopathy and bariatric surgery: is 'sick fat' a surgical disease? // Int J Clin Pract. 2009. Vol. 63. - № 9. p. 1285-1300.

17. Bellamy T.C. Griffiths C., Garthwaite J. Differential sensitivity of guanylyl cyclase and mitochondrial respiration to nitric oxide measured using clamped concentrations // J Biol Chem. 2002. Vol. 277. - P. 31801 -31807.

18. Berridge M.J. Lipp P., Bootman M.D. The versatility and universality of calcium signaling // Nat Rev Mol Cell Biol. 2000. -Vol. 1. № 1. - P. 11 -21.

19. Berridge M.J. Capacitative calcium entry // Biochem J. 1995. Vol. 312. - № 1. - P. 111.

20. Berridge M.J. Inositol trisphosphate and calcium signaling // Nature. 1993. Vol. 361. — P.315-325.

21. Bode-Boger S.M. Scalera F., Ignarro L.J. The L-arginine paradox: Importance of the L-arginine/asymmetrical dimethylarginine ratio// Pharmacol Ther. 2007. Vol. 114. - № 3.-P. 295-306.

22. Boguszewski C.L. Paz-Filho G., Velloso L.A. Neuroendocrine body weight regulation: integration between fat tissue, gastrointestinal tract, and the brain // Endokrynol Pol. 2010. Vol. 61.-№ 2.-P. 194-206.

23. Boschmann M. Krupp G., Friedrich C.L., Klaus S., Jordan J. In Vivo response to alphal-adrenoreceptor stimulation in human white adipose tissue // Obesity Research. 2002. -Vol. 10,- №6.-P. 555-558.

24. Bowers R.R. Festuccia W.T., Song C.K., Shi H., Migliorini R.H., Bartness T.J. Sympathetic innervation of white adipose tissue and its regulation of fat cell number // Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2004. Vol. 286. - № 6. - P. 1167-1175.

25. Brede M. Nagy G., Philipp M., Sorensen J.B., Lohse M.J., Hein L. Differential control of adrenal and sympathetic catecholamine release by <X2-adrenoceptor subtypes // Mol Endocrinol. 2003.-Vol. 17.-P. 1640-1646.

26. Brenman J.E. Chao D.S., Gee S.H. Interaction of nitric oxide synthase with the postsynaptic density protein PSD-95 and alphal-syntrophin mediated by PDZ domains // Cell. 1996. Vol. 84. - № 5. - P. 757-767.

27. Bronnikov G.E. Aboulaich N., Vener A.V., Stralfors P. Acute effects of insulin on the activity of mitochondrial GPAT1 in primary adipocytes // Biochem Biophys Res Commun. 2008. Vol. 367. -№ 1. - P. 201-207.

28. Buechler W.A. Nakane M., Murad F. Expression of soluble guanylate cyclase activity requires both enzyme subunits // Biochem Biophys Res Commun. 1991. Vol. 174. - № l.-P. 351-357.

29. Burch R.M. Luini A., Axelrod J. Phospholipase A2 and phospholipase C are activated by distinct GTP-binding proteins in response to ai-adrenergic stimulation in FRTL-5 thyroid cells // Proc Natl Acad Sci. 1986. Vol. 83. - P. 7201-05.

30. Cancela J.M. Van Coppenolle F., Galione A. Transformation of local Ca spikes to global Ca2+transients: the combinatorial roles of multiple Ca2+ releasing messengers // J EMBO. 2002.-Vol. 21. P. 909-919.

31. Carling D. Sanders M.J., Woods A. The regulation of AMP-activated protein kinase by upstream kinases // Int J Obes. 2008. Vol. 32. - № 4. - P. 55-59.

32. Chakrabarti S.K. Cole B.K., Wen Y„ Keller S.R., Nadler J.L. 12/15-lipoxygenase products induce inflammation and impair insulin signaling in 3T3-L1 adipocytes // Obesity. 2009. Vol. 17. - № 9. - P. 1657-1663.

33. Chakraborti S. Das S., Kar P., Ghosh B., Samanta K., Kolley S., Ghosh S., Roy S., Chakraborti T. Calcium signaling phenomena in heart diseases: a perspective // Mol Cell Biochem. 2007. Vol. 298. -№ 1-2. - P. 1-40.

34. Clementi E. Role of nitric oxide and its intracellular signalling pathways in the control of Ca2+ homeostasis // Biochem Pharmacol. 1998. Vol. 55. - P. 713-718.

35. Convents A. De Backer J.P., André C., Vauquelin G. Desensitization of alpha 2-adrenergic receptors in NG 108 15 cells by (-)-adrenaline and phorbol 12-myristate 13-acetate // J Biochem. 1989. Vol. 262. - № 1. - P. 245-251.

36. Coppack S.W. Jensen M.D., Miles J.M. In vivo regulation of lipolysis in humans // J Lipid Res. 1994.-Vol. 35.-№2.-P. 177-193.

37. Corbin J.D. Doskeland S.O. Studies of two different intrachain cGMP-binding sites of cGMP-dependent protein kinase // J Biol Chem. 1983. Vol. 258. - P. 11391-11397.

38. Cornwell T.L. Soff G.A., Traynor A.E., Lincoln T.M. Regulation of the expression of cyclic GMP-dependent protein kinase by cell density in vascular smooth muscle cells // J Vase Res. 1994.-Vol. 31.-P. 330-337.

39. Daval M. Foufelle F., Ferré P. Functions of AMP-activated protein kinase in adipose tissue // J Physiol. 2006. Vol. 574. - № 1. - P. 55-62.

40. DeFronzo R.A. Insulin resistance, lipotoxicity, type 2 diabetes and atherosclerosis: the missing links // Diabetologia. 2010. Vol. 53. - № 7. - P. 1270-1287.

41. Dimmeler S. Fleming I., Fisslthaler B., Hermann C., Busse R., Zeiher A.M. Activation of nitric oxide synthase in endothelial cells by Akt-dependent phosphorylation // Nature. 1999. Vol. 399. -№ 6736. - P. 601-605.

42. DiSalvo J. Fell C. Stimulation of renal vascular "alpha-receptors" with isoproterenol // Proc Soc Exp Biol Med. 1970. Vol. 133. - № 4. - P. 1435-1438.

43. Dupont G. Croisier H. Spatiotemporal organization of Ca2+ dynamics: a modeling-based approach // HFSP J. 2010. Vol. 4. - № 2. - P. 43-51.

44. Dumonteil E. Barre H., Meissner G. Effects of palmitoyl carnitine and related metabolites on the avian Ca(2+)-ATPase and Ca2+ release channel // J Physiol. 1994. -Vol. 479.-№1.-P. 29-39.

45. Dynnik V.V. Grushin K.S., Korystova A.F., Nenov M.N., Murashov A.N., Kokoz Y.M. Stabilizing role of arginine and NO in the regulation of voltage-sensitive L-type Ca2+ current in cardiocytes // Dokl Biochem Biophys. 2005. Vol. 404. - P. 353-356.

46. Elizalde M. Ryden M., Van Harmelen V., Eneroth P., Gyllenhammar H., Holm C., Ramel S., Olund A., Andersson K. Expression of nitric oxide synthases in subcutaneous adipose tissue of nonobese and obese humans // J Lipid Res. 2000. Vol. 41. - P. 12441251.

47. Endo M. Calcium-induced calcium release in skeletal muscle // Physiol Rev. 2009. Vol. 89. -№4. -P. 1153-76.

48. Ethier M.F. Madison J.M. LY294002, but not wortmannin, increases intracellular calcium and inhibits calcium transients in bovine and human airway smooth muscle cells // Cell Calcium. 2002. Vol. 32. - № 1. - P. 31 -38.

49. Fain J.N. Garcia-Shinz J.A. Adrenergic regulation of adipocyte metabolism // J Lipid Res. 1983. Vol. 24. - P. 945-966.

50. Feng J. Tamaskovic R., Yang Z., Brazil D.P., Merlo A., Hess D., Hemmings B.A. Stabilization of Mdm2 via decreased ubiquitination is mediated by protein kinase B/Akt-dependent phosphorylation // J Biol Chem. 2004. Vol. 279. - № 34. - P. 35510-35517.

51. Fields T.A. Casey P. Signalling functions and biochemical properties of pertussis toxin-resistant G-proteins // J Biochem. 1997. Vol. 321. - P. 561-571.

52. Foster D.C. Wedel B.J., Robinson S.W., Garbers D.L. Mechanisms of regulation and functions of guanylyl cyclases // Rev Physiol Biochem Pharmacol. 1999. Vol. 135. - P. 1-39.

53. Fliers E. Kreier F., Voshol P.J., Havekes L.M., Sauerwein H.P., Kalsbeek A., Buijs R.M., Romijn J.A. White adipose tissue: getting nervous // J Neuroendocrinol. 2003. Vol. 15. -P. 1005-1010.

54. Francis S.H. Poteet-Smith C., Busch J.L., Richie-Jannetta R., Corbin, J.D. Mechanisms of autoinhibition in cyclic nucleotide-dependent protein kinases // Front Biosci. 2002. -Vol. 7.-P. 580-592.

55. Francis S.H. Corbin, J.D. Cyclic nucleotide-dependent protein kinases: intracellular receptors for cAMP and cGMP action // Crit Rev Clin Lab Sci. 1999. Vol. 36. - P. 275328.

56. Friebe A. Koesling D. Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase // Circ Res. 2003. Vol. 93. - № 2. - P. 96-105.

57. Friebe A. Wedel B, Foerster J, Harteneck C, Malkewitz J, Schultz G, Koesling D. Function of conserved cysteine residues on soluble guanylyl cyclase // Biochemistry. 1997. Vol. 36. - P. 1194-1198.

58. Fritz N. Mironneau J., Macrez N., Morel J.L. Acetylcholine-induced Ca2+ oscillations are modulated by a Ca regulation of InsP3R2 in rat portal vein myocytes // Pflugers Arch. 2008. Vol. 456. - № 2. - P. 277-283.

59. Fu W. Haynes T.E., Kohli R., Hu J., Shi W., Spencer T.E., Carroll R.J., Meininger C.J., Wu G. Dietary L-Arginine supplementation reduces fat mass in zucker diabetic fatty rats // J Nutr. 2005. Vol. 135. - P. 714-721.

60. Fujii T. Mori Y., Tominaga T., Hayasaka I., Kawashima K. Maintenance of constant blood acetylcholine content before and after feeding in young chimpanzees // Neurosci Lett. 1997.-Vol. 227.-№ 1.-P. 21-24.

61. Fulceri R. Giunti R., Knudsen J., Leuzzi R., Kardon T., Benedetti A. Rapamycin inhibits activation of ryanodine receptors from skeletal muscle by the fatty acyl CoA-acyl CoA binding protein complex // Biochem J. 1997. Vol. 325. - № 2. - P. 423-428.

62. Fulton D. Gratton J.P. Sessa W.C. Post-translational control of endothelial nitric oxide synthase: why isn't calcium/calmodulin enough // J Pharmacol Exp Ther. 2001. — Vol. 299.-P. 818-824.

63. Fulton D. Gratton J.P., McCabe T.J., Fontana J., Fujio Y., Walsh K., Franke T.F., Papapetropoulos A., Sessa W.C. Regulation of endothelium-derived nitric oxide production by the protein kinase Akt // Nature. 1999. Vol. 399. - P. 597-601.

64. Furchgott R.F. Zawadzki J.V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine // Nature. 1980. Vol. 288. - P. 373-376.

65. Galione A. Cyclic ADP-ribose, the ADP-ribosyl cyclase pathway and calcium signaling //Mol Cell Endocrinol. 1994.-Vol. 98.-№2.-P. 125-131.

66. Gallo M.P. Ghigo D., Bosia A., Alloatti G., Costamagna C., Penna C., Levi R.C. Modulation of guinea-pig cardiac L-type calcium current by nitric oxide synthase inhibitors//J Physiology. 1998. -Vol. 506. № 3.-P. 639-651.

67. Garcia-Villafranca J. Guillen A., Castro J. Involvement of nitric oxide/cyclic GMP signaling pathway in the regulation of fatty acid metabolism in rat hepatocytes // Biochem Pharmacol. 2003. Vol. 65. -№ 5. - P. 807-812.

68. Garcia-Sainz J.A. Characterization of the alphai-adrenoceptor of rat white fat cells // Eur J Pharmacol. 1983.-Vol. 87.-P. 159-161.

69. Garthwaite J. Charles S.L., Chess-Williams R. Endothelium-derived relaxing factor release on activation of NMD A receptors suggests role as intercellular messenger in the brain//Nature. 1988,-Vol. 336.-№6197.-P. 385-388.

70. Gautam D. Gavrilova O., Jeon J., Pack S., Jou W., Cui Y., Li J.H., Wess J. Beneficial metabolic effects of M3 muscarinic acetylcholine receptor deficiency // Cell Metab. 2006. Vol. 4. - № 5. - P. 363-75.

71. Gerzer R. Böhme E., Hofmann F., Schultz G. Soluble guanylate cyclase purified from bovine lung contains heme and copper // FEBS Lett. 1981. Vol. 132. - P. 71-74.

72. Girardier L. Schneider-Picard G. Alpha- and beta-adrenergic mediation of membrane potential changes and metabolism in rat brown adipose tissue // J Physiol Lond. 1983. -Vol. 335.-P. 629-641.

73. Gregor M.G. Hotamisligil G.S. Adipocyte stress: The endoplasmic reticulum and metabolic disease // J Lipid Res. 2007. Vol. 48. - № 9. - P. 1905-1914.

74. Guan H.P. Li Y., Jensen M.V., Newgard C.B., Steppan C.M., Lazar M.A. A futile metabolic cycle activated in adipocytes by antidiabetic agents // Nat Med. 2002. Vol. 8. -№ 10.-P. 1122-1128.

75. Hajer G.R. van Haefiten T.W., Visseren F.L. Adipose tissue dysfunction in obesity, diabetes, and vascular diseases // Eur Heart J. 2008. Vol. 29. - № 24. - P. 2959-2971.

76. Hayashi Y. Nishio M„ Naito Y., Yokokura H., Nimura Y., Hidaka H.,Watanabe Y. Regulation of neuronal nitric-oxide synthase by calmodulin kinases // J Biol Chem. 1999. Vol. 274. - P. 20597-20602.

77. Hayashi H. Miyata H. Fluorescence imaging of intracellular Ca // J Pharmacol Toxicol Meth. 1994. Vol. 31.-№1.-P. 1-10.

78. Hein L. Altman J.D., Kobilka B.K. Two functionally distinct alpha2-adrenergic receptors regulate sympathetic neurotransmission // Nature. 1999. Vol. 402. - P. 181-184.

79. Heck D.A. Bylund D.B. Differential down-regulation of alpha-2 adrenergic receptor subtypes // Life Sci. 1998. Vol. 62. -№ 17-18. - P. 1467-1472.

80. Hermann D. Schlereth T., Vogt T., Birklein F. Clonidine induces nitric oxide- and prostaglandin-mediated vasodilation in healthy human skin // J Appl Physiol. 2005. -Vol. 99.-P. 2266-2270.

81. Hobbs A.J. Soluble guanylate cyclase: the forgotten sibling // Trends Pharmacol Sci. 1997.-Vol. 18.-№ 12.-P. 484-491.

82. Hofmann F. The Biology of Cyclic GMP-dependent Protein Kinases // JBC. 2005. Vol. 280.-№ l.-P. 1-4.

83. Hoffmann C. Leitz M.R., Oberdorf-Maass S., Lohse M.J., Klotz K.N.K. Comparative pharmacology at human p-adrenergic receptor subtypes // Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2004. Vol. 369. - № 2. - P. 151-159.

84. Hofmann F. Gensheimer H.P., Gobel C. cGMP-dependent protein kinase. Autophosphorylation changes the characteristics of binding site 1 // Eur J Biochem. 1985. -Vol. 147.-P. 361-365.

85. Holm C. Molecular mechanisms regulating hormone-sensitive lipase and lipolysis // Biochem Soc Trans. 2003. Vol. 31. -№ 6. - P. 1120-1124.

86. Ignarro L.J. Haem-dependent activation of guanylate cyclase and cyclic GMP formation by endogenous nitric oxide: a unique transduction mechanism for transcellular signaling // Pharmacol Toxicol. 1990. Vol. 67. - P. 1-7.

87. Ignarro L.J. Buga G.M., Wood K.S., Byrns R.E., Chaudhuri G. Endothelium-derived relaxing factor produced and released from artery and vein is nitric oxide // Proc Natl Acad Sci USA. 1987. Vol. 84. - P. 9265-9269.

88. Imai Y. Jiang B., Pappano A.J. Mechanism for muscarinic inhibition of I(Ca(L)) is determined by the path for elevating cyclic AMP in cardiac myocytes // Cardiovasc Res. 2001.- Vol. 51. № 2. -P. 331-343.

89. Janovska A. Hatzinikolas G., Staikopoulos V., Mclnerney J., Mano M., Wittert G.A. AMPK and ACC phosphorylation: effect of leptin, muscle fibre type and obesity // Mol Cell Endocrinol. 2008. Vol. 284. -№ 1-2. -P. 1-10.

90. Jilka R.L. O'Brien C.A., Ali A.A., Roberson P.K., Weinstein R.S., Manolagas S.C. Intermittent PTH stimulates periosteal bone formation by actions on post-mitotic preosteoblasts // Bone. 2009. Vol. 44. - № 2. - P. 275-286.

91. Jobgen W. Fu W., Gao H., Li P., Meininger C.J., Smith S. B., Spencer T.E., Wu G. High fat feeding and dietary L-arginine supplementation differentially regulate gene expression in rat white adipose tissue // Amino Acids. 2009. Vol. 37. - P. 187-198.

92. Jobgen W.S. Fried S.K., Fu W.J., Meininger C.J., Wu G. Regulatory role for the arginine-nitric oxide pathway in metabolism of energy substrates // J Nutr Biochem. 2006. Vol. 17. - № 9. - P. 571-588.

93. Joshi M.S. Ferguson T.B. Jr., Johnson F.K., Johnson R.A., Parthasarathy S., Lancaster J.R. Jr. Receptor-mediated activation of nitric oxide synthesis by arginine in endothelial cells // PN AS. 2007. Vol. 104. - № 24. - P. 9982-9987.

94. Kahn B.B. Alquier T., Carling D., Hardie D.G. AMP-activated protein kinase: ancient energy gauge provides clues to modern understanding of metabolism // Cell Metab. 2005. -Vol. l.-№ l.-P. 15-25.

95. Karastergiou K. Mohamed-Ali V. The autocrine and paracrine roles of adipokines // Mol Cell Endocrinol. 2010. Vol. 318. -№ 1-2. - P. 69-78.

96. Kawashima K. Oohata H., Fujimoto K., Suzuki T. Extraneuronal localization of acetylcholine and its release upon nicotinic stimulation in rabbits // Neurosci Lett. 1989. -Vol. 104. -№3. -P. 336-339.

97. Keizer J. Levine L. Ryanodine receptor adaptation and Ca2+(-)induced Ca2+ release-dependent Ca2+ oscillations // Biophys J. 1996. Vol. 71. -№ 6. - P. 3477-3487.

98. Keizer J. Li Y.X., Stojilkovic S., Rinzel J. InsP3-induced Ca2+ excitability of the endoplasmic reticulum // Mol BiolCell. 1995. Vol. 6. - № 8. - P. 945-951.

99. Keim M. Feelisch M., Spahr R., Piper H.M., Noack E., Schräder J. Quantitative and kinetic characterization of nitric oxide and EDRF released from cultured endothelial cells // Biochem Biophys Res Commun. 1988. Vol. 154. -№ 1. - P. 236-244.

100. Kersten S. Mechanisms of nutritional and hormonal regulation of lipogenesis // EMBO Rep. 2001. Vol. 2. - № 4. - P. 282-286.

101. Keuper M. Blüher M., Schön M.R., Möller P., Dzyakanchuk A., Amrein K., Debatin K.M., Wabitsch M., Fischer-Posovszky P. An inflammatory micro-environment promotes human adipocyte apoptosis // Mol Cell Endocrinol. 2011. Vol. 339. - № 1-2. -P. 105-113.

102. Kimura H. Mittal C.K., Murad F. Appearance of magnesium guanylate cyclase activity in rat liver with sodium azide activation // J Biol Chem. 1976. Vol. 251. - № 24. - P. 7769-7773.

103. Knowles R.G. Nitric oxide biochemistry // Biochem Soc T. 1997. Vol. 25. - P. 895901.

104. Koesling D. Studying the structure and regulation of soluble guanylyl cyclase // Methods. 1999.-Vol. 19.-№4.-P. 485-493.

105. Koesling D. Friebe A. Soluble guanylyl cyclase: structure and regulation. Rev Physiol Biochem Pharmacol. 1999. Vol. 135. - P. 41-65.

106. Kulaksiz H. Schlenker T., Rost D., Stiehl A., Volkmann M., Lehnert T., Cetin Y., Stremmel W. Guanylin regulates chloride secretion in the human gallbladder via the bile fluid // Gastroenterology. 2004. Vol. 126. - P. 732-740.

107. Kulaksiz H. Rehberg E., Stremmel W., Cetin Y. Guanylin and functional couplingproteins in the human salivary glands and gland tumors: expression, cellular ocalization, and target membrane domains // Am J Pathol. 2002. Vol. 161. - P.655-664.

108. Kuschel M. Zhou Y.Y., Cheng H., Zhang S.J., Chen Y., Lakatta E.G., Xiao R.P. Gj protein-mediated functional compartmentalization of cardiac ßr-adrenergic signaling // J Biol Chem. 1999. Vol. 274. - P. 22048-22052.

109. MacMillan L.B. Hein L., Smith M.S., Piascik M.T., Limbird L.E. Central hypotensive effects of the <X2A-adrenergic receptor subtype // Science. 1996. Vol. 273. - P. 801-803.

110. Makaritsis K.P. Handy D.E., Johns C., Kobilka B., Gavras I., Gavras H. Role of the a2B-adrenergic receptor in the development of saltinduced hypertension // Hypertension. 1999.-Vol. 33.-P. 14-17.

111. Marietta M. Nitric oxide synthase: aspects concerning structure and catalysis // Cell. 1994. Vol. 78. -№ 6. - P. 927-930.

112. McCarthy T.V. Datar S., Mackrill J.J. Activation of ryanodine receptor/Ca2+ release channels downregulates CD38 in the Namalwa B lymphoma // FEBS Lett. 2003. Vol. 554.-№ 1-2.-P. 133-137.

113. McLaughlin T. Deng A., Yee G., Lamendola C., Reaven G., Tsao P.S., Cushman S.W., Sherman A. Inflammation in subcutaneous adipose tissue: relationship to adipose cell size // Diabetologia. 2010. Vol. 53. -№ 2. - P. 369-377.

114. Meier U. Gressner A.M. Endocrine regulation of energy metabolism: review of pathobiochemical and clinical chemical aspects of leptin, ghrelin, adiponectin, and resistin // Clin Chem. 2004. Vol. 50. - № 9. - P. 1511 -25.

115. Michal P. El-Fakahany E., Dolezal V. Muscarinic M2 receptors directly activate Gq/n and Gs G-proteins // JPET. 2007. Vol. 320. - P. 607-614.

116. Mohell N. Connolly E., Nedergaard J. Distinction between mechanisms underlying alphai- and beta-adrenergic respiratory stimulation in brown fat cells // Am J Physiol. 1987.-Vol. 253.-P. 301-308.

117. Munday M.R. Regulation of mammalian acetyl-CoA carboxylase // Biochem Soc Trans. 2002.-Vol. 30.-№6.-P. 1059-1064.

118. Nagano T. Yoshimura T. Bioimaging of nitric oxide // Chem Rev. 2002. Vol. 102. - P. 1235-1270.

119. Nakane M. Murad F. Cloning of guanylyl cyclase isoforms // Adv Pharmacol. 1994. -Vol. 26.-P. 7-18.

120. Nanberg E. Putney J.J. Alpha-adrenergic activationof brown adipocytes leads to an increased formation of inositol phosphates // FEBS Lett. 1986. Vol. 195. - P. 319-322.

121. Nanberg E. Nedergaard J., Cannon B. Alpha-adrenergic effects on 86Rb+(K+) potentials and fluxes in brown fat cells // Biochim Biophys Acta. 1984. Vol. 804. - P. 291-300.

122. Nathan C. Xie Q. Nitric oxide synthases: roles, tolls, and controls // Cell. 1994. Vol. 78. -№ 6.-P. 915-918.

123. Niijima A. Neural mechanisms in the control of blood glucose concentration // J Nutr. 1989.-Vol. 119.-P. 833-840.

124. Nikolic D.M. Li Y., Liu S., Wang S. Overexpression of constitutively active PKG-I protects female, but not male mice from diet-induced obesity // Obesity. 2011. Vol. 19. - № 4. - P. 784-791.

125. Parkinson S.J. Jovanovic A., Jovanovic S., Wagner F., Terzic A., Waldman S.A. Regulation of nitric oxide-responsive recombinant soluble guanylyl cyclase by calcium // Biochemistry. 1999. Vol. 38. -№ 20. - P. 6441-6448.

126. Pfeifer A. Aszodi A., Seidler U., Ruth P., Hofmann F., Fassler R. Intestinal secretory defects and dwarfism in mice lacking cGMP-dependent protein kinase II // Science. 1996. Vol. 274. - P. 2082-2086.

127. Plato C.F. Garvin J.L. a2-adrenergic-mediated tubular NO production inhibits thick ascending limb chloride absorption // Am J Physiol Renal Physiol. 2001. Vol. 281. - P. 679-686.

128. Potter L.R. Abbey-Hosch S., Dickey D.M. Natriuretic peptides, their receptors, and cyclic guanosine monophosphate-dependent signaling functions // Endocr Rev. 2006. -Vol. 27. -№ l.-P. 47-72.

129. Porter A.C. Svensson S.P., Stamer W.D., Bahl J.J., Richman J.G., Regan J.W. Alpha-2 adrenergic receptors stimulate actin organization in developing fetal rat cardiac myocytes // Life Sci. 2003. Vol. 72. - P. 1455-1466.

130. Poulain-Godefroy O. Lecoeur C., Pattou F., Friihbeck G., Froguel P. Inflammation is associated with a decrease of lipogenic factors in omental fat in women // Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2008. Vol. 295. - № 1. - P. 1-7.

131. Prakash Y.S. Kannan M.S., Walseth T.F., Sieck G.C. Role of cyclic ADP-ribose in the regulation of Ca2+., in porcine tracheal smooth muscle // Am J Physiol. 1998. Vol. 274. - № 6. - P. 1653-1660.

132. Prentki M. Madiraju S.R. Glycerolipid metabolism and signaling in health and diseas // Endocr Rev. 2008. Vol. 29. - № 6. - P. 647-676.

133. Quitterer U. Lohse M.J. Crosstalk between Gai- and Gaq-coupled receptors is mediated by Gpy exchange // Proc Natl Acad Sci. 1999. Vol. 96. - P. 10626-10631.

134. Raasmaja A. Alphal- and beta-adrenergic receptors in brown adipose tissue and the adrenergic regulation of thyroxine 5'-deiodinase // Acta Physiol Scand. 1990. Vol. 139. -№590.-P. 1-64.

135. Raasmaja A. Larsen P.R. Alphai- and beta-adrenergic agents cause synergistic stimulation of the iodothyronine deiodinase in rat brown adipocytes // Endocrinology. 1989. Vol. 125. - P. 2502-2509.

136. Razzini G. Brancaccio A., Lemmon M.A., Guarnieri S., Falasca M. The role of the pleckstrin homology domain in membrane targeting and activation of phospholipase C beta // J Biol Chem. 2000. Vol. 275. -№ 20. - P. 14873-14881.

137. Rondinone C.M. Adipocyte-derived hormones, cytokines, and mediators // Endocrine. 2006. Vol. 29. — № 1. — P. 81-90.

138. Ruth P. Pfeifer A., Kamm S., Klatt P., Dostmann W. R„ Hofmann F. Identification of the amino acid sequences responsible for high affinity activation of cGMP kinase I alpha // J Biol Chem. 1997.-Vol. 272.-P. 10522-10528.

139. Rybalkin S.D. Yan C, Bornfeldt K.E., Beavo J.A. Cyclic GMP phosphodiesterases and regulation of smooth muscle function // Circ Res. 2003. Vol. 93. - № 4. - P. 280-291.

140. Lahi S. Fain I.N. ai-Adrenergic receptor-mediated activation of phospholipase D in rat cerebral cortex // J Biol Chem. 1992. Vol. 267. - P. 3679-85.

141. Large V. Peroni O., Letexier D., Ray H., Beylot M. Metabolism of lipids in human white adipocyte // Diabetes Metab. 2004. Vol. 30. - № 4. - P. 294-309.

142. Lawrence J.C.J. Larner J. Effects of insulin, methoxamine and calcium on glycogen synthase in rat adipocytes//J Mol Pharmacol. 1978.-Vol. 14.-P. 1079-1091.

143. Lee H.C. Modulator and messenger functions of cyclic ADP-ribose in calcium signaling // Recent Prog Horm Res. 1996. Vol. 51. - P. 355-388.

144. Levine S.N. Steiner A.L., Earp H.S., Meissner G. Particulate guanylate cyclase of skeletal muscle: effects of Ca2+ and other divalent cations on enzyme activity // Biochim Biophys Acta. 1979. Vol. 566. -№ 1. - P. 171-182.

145. Li H.X. Xiao L., Wang C., Gao J.L., Zhai .YG. Epigenetic regulation of adipocyte differentiation and adipogenesis // J Zhejiang Univ Sci. 2010. — Vol. 11. — № 10. P. 784-791.

146. Li L. Wu L., Wang C., Liu L., Zhao Y. Adiponectin modulates carnitine palmitoyltransferase-1 through ampk signaling cascade in rat cardiomyocytes // Regul Pept. 2007. Vol. 139. -№ 1-3. - P. 72-79.

147. Li H. Meininger C.J., Hawker J.R. Regulatory role of arginase I and II in nitric oxide, polyamine, and proline synthesis in endothelial cells // Am J Physiol Endocrinol Metab. 2001.-Vol. 280.-P. 75-82.

148. Lian Z. Gao J., Qu K., Li J., Hao L., Wu S., Zhu H., Li Y. A novel AMPK activator, WS070117, improves lipid metabolism discords in hamsters and HepG2 cells // Lipids Health Dis. 2011. Vol. 10. - № 1. - P. 67.

149. Link R.E. Desai K., Hein L., Stevens M.E., Chruscinski A., Bernstein D., Barsh G.S., Kobilka B.K. Cardiovascular regulation in mice lacking a2-adrenergic receptor subtypes b and c // Science. 1996. Vol. 273. - P. 803-805.

150. Litosch I. G-protein J3y subunits antagonize protein kinase C-dependent phosphorylation and inhibition of phospholipase C-/71 // Biochem J. 1997. Vol. 326. - № 3. - P. 701707.

151. Lohse M.J. Bltiml K., Danner S., Krasel C. Regulators of G-protein-mediated signaling // Biochem Soc Trans. 1996. Vol. 24. - № 4. - P. 975-80.

152. Lohse M.J. Molecular mechanisms of membrane receptor desensitization // Biochim Biophys Acta. 1993.-Vol. 1179,-№2.-P. 171-88.

153. Lohse M.J. Benovic J.L., Codina J., Caron M.G., Lefkowitz R.J. Beta-arrestin: a protein that regulates beta-adrenergic receptor function // Science. 1990. Vol. 248. - № 4962. — P. 1547-1550.

154. Luiten P.G. Ter Horst G.J., Koopmans S.J., Rietberg M., Steffens A.B. Preganglionic innervation of the pancreas islet cells in the rat // J Auton Nerv Syst. 1984. Vol. 10. - P. 27-42.

155. Lundberg J.O. Weitzberg E., Lunberg J.M., Alving K. Intragastric nitric oxide production in humans: measurements in expelled air // Gut. 1994. Vol. 35. - P. 1543-1546.

156. Sagrada A, Fargeas M.J., Bueno L. Involvement of alpha-1 and alpha-2 adrenoceptors in the postlaparotomy intestinal motor disturbances in the rat // Gut. 1987. — Vol. 28. № 8. -P. 955-959.

157. Schimmel R.J. Dzierzanovski D., Elliot M. E., Honeyman T.W. Stimulation of phosphoinositide metabolism in hamster brown adipocytes exposed to alphal-adrenergic agents and its inhibition by phorbolesters // J Biochem. 1986. Vol. 236. - P. 757-764.

158. Schroder K. Wandzioch K., Helmcke I., Brandes R.P. Nox4 acts as a switch between differentiation and proliferation in preadipocytes // Arterioscler Thromb Vase Biol. 2009.- Vol. 29. № 2. - P. 239-245.

159. Schulz S. Yuen P.S., Garbers D.L. The expanding family of guanylyl cyclases // Trends Pharmacol Sci. 1991.-Vol. 12.-№3.-P. 116-120.

160. Schmidt H.H. Lohmann S.M., Walter U. The nitric oxide and cGMP signal transduction system: regulation and mechanism of action // Biochim Biophys Acta. 1993. Vol. 1178. -№ 2. — P. 153-175.

161. Schuster S. Marhl M., Hofer T. Modelling of simple and complex calcium oscillations. From single-cell responses to intercellular signaling // Eur J Biochem. 2002. Vol. 269.- № 5. P. 1333-1355.

162. Sethi J.K. Empson R.M., Galione A. Nicotinamide inhibits cyclic ADP-ribose-mediated calcium signalling in sea urchin eggs // Biochem J. 1996. Vol. 319. - № 2. - P. 613617.

163. Seydoux J. Muzzin P., Moinat M., Pralong W., Girardier L., Giacobin J. Adrenoceptor heterogeneity in human white adipocytes differentiated in culture as assessed by cytosolic free calcium measurements // Cell Signal. 1996. Vol. 8. - № 2. - P. 117-122.

164. Skeberdis V.A. Structure and function of |33-adrenergic receptors // Medicina. 2004. -Vol. 40.- №5. -P. 407-413.

165. Skulachev V.N. Uncoupling: new approaches to an old problem of bioenergetics // Biochim Biophys Acta. 1998. Vol. 1363. - № 2. - P. 100-124.

166. Stephens M. Rees D., Ludgate M. Muscarinic acetylcholine receptors and adipogenesis // Endocrine Abstracts. 2009.-Vol. 19.-P. 129.

167. Sternfeld L. Krause E., Guse A.H., Schulz I. Hormonal control of ADP-ribosyl cyclase activity in pancreatic acinar cells from rats // J Biol Chem. 2003. Vol. 278. - № 36. - P. 33629-33636.

168. Stone J.R. Marietta M.A. Soluble guanylate cyclase from bovine lung: activation with nitric oxide and carbon monoxide and spectral characterization of the ferrous and ferric states // Biochemistry. 1994. Vol. 33. - № 18. - P. 5636-5640.

169. Strissel K.J. Stancheva Z., Miyoshi H., Perfield J.W., DeFuria J., Jick Z., Greenberg A.S., Obin M.S. Adipocyte death, adipose tissue remodeling, and obesity complications // Diabetes. 2007. Vol. 56. -№ 12. - P. 2910-2918.

170. Stryjecki C. Mutch D.M. Fatty acid-gene interactions, adipokines and obesity // Eur J Clin Nutr. 2011. Vol. 65. -№ 3. - P. 285-297.

171. Summers S.A. Ceramides in insulin resistance and lipotoxicity // Prog Lipid Res. 2006. -Vol. 45. -№ 1. P. 42-72.

172. Takagava Y. Berger M.E., Tuck M.L., Golub M.S. Impaired endothelial alpha-2 adrenergic receptor-mediated vascular relaxation in the fructose-fed rat // Hypertens Res. 2002.-Vol. 25.-P. 197-202.

173. Tanimura A. Nezu A., Tojyo Y., Matsumoto Y. Isoproterenol potentiates alpha-adrenergic and muscarinic receptor-mediated Ca response in rat parotid cells // Am J Physiol. 1999.-Vol. 276.-№ 6-1.-P. 1282-1287.

174. Tappia P.S. Phospholipid-mediated signaling systems as novel targets for treatment of heart disease // Can J Physiol Pharmacol. 2007. Vol. 85. - №1. - P. 25-41.

175. Thatcher J.D. The Inositol trisphosphate (IP3) signal transduction pathway // Science signaling. 2010. Vol. 3. - P. 119.

176. Thomas A.P. Bird G.S., Hajnoczky G., Robb-Gaspers L.D., Putney J.W. Spatial and temporal aspects of cellular calcium signaling // FASEB J. 1996. Vol. 10. - № 15. - P. 1505-1517.

177. Thonberg H. Zhang S.J., Tvrdik P., Jacobsson A., Nedergaard J. Norepinephrine utilizes alpha 1- and beta-adrenoreceptors synergistically to maximally induce c-fos expression in brown adipocytes // J Biol Chem. 1994. Vol. 269. - № 33. - P. 179-186.

178. Torres-Márquez M.E. Romero-Avila M.T., González-Espinosa C., García-Sáinz J.A. Characterization of rat white fat cell alpha le-adrenoceptors // Mol Pharmacol. 1992. — Vol. 42. —№ 3. P. 403-6.

179. Tsiotra P.C. Tsigos C. Stress, the endoplasmic reticulum, and insulin resistance // Ann NY Acad Sci. 2006. Vol. 1083. - P. 63-76.

180. Tsuchida K. Watajima H. Cyclic AMP-mediated increase in L-type calcium current (ICa,L) by nitroglycerin in guinea-pig ventricular myocytes // Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 2002. Vol. 48. -№ 2. - P. 179-185.

181. Wahler G.M. Dollinger S.J. Nitric oxide donor SIN-1 inhibits mammalian cardiac calcium current through cGMP-dependent protein kinase // Am J Physiol. 1995. Vol. 268.-P. 45-54.

182. Waldman S.A. Murad F. Cyclic GMP synthesis and function // Pharmacol Rev. 1987. -Vol. 39. -№3. P. 163-196.

183. Wang Y. Goligorsky M.S., Lin M. A novel, testis-specific mRNA transcript encoding an NH2-terminal truncated nitric-oxide synthase // J Biol Chem. 1997. Vol. 272. - № 17. -P. 11392-113401.« < JU 11 I . it i

184. Watt M.J. Holmes A.G., Pinnamaneni S.K., Garnham A.P., Steinberg G.R., Kemp B.E., Febbraio M.A. Regulation of HSL serine phosphorylation in skeletal muscle and adipose tissue // Am J Physiol Endocrinol Metab. 2006. Vol. 290. - № 3. - P. 500-508.

185. Wendel A.A. Lewin T.M., Coleman R.A. Glycerol-3-phosphate acyltransferases: rate limiting enzymes of triacylglycerol biosynthesis // Biochim Biophys Acta. 2009. Vol. 1791.-№ 6.-P. 501-506.

186. Weller R. Pattullo S., Smith L., Golden M., Ormerod A., Bendjamin N. Nitric oxide is generated on the skin surface by reduction of sweat nitrate // J Invest Dermatol. 1996. -Vol. 107.-P. 327-331.

187. Whitaker M. Calcium at fertilization and in early development // Physiol Rev. 2006. -Vol. 86. -№ l.-P. 25-88.

188. White T.A. Kannan M.S., Walseth T.F. Intracellular calcium signaling through the cADPR pathway is agonist specific in porcine airway smooth muscle // FASEB. 2003. -Vol. 17.-№3.-P. 482-484.

189. Wilcke M. Nedergaard J. Alphal- and beta-adrenergic regulation of intracellular Ca2+-levels in brown adipocytes // Biochem Biophys Res Commun. 1989. Vol. 163. - P. 292-300.

190. Woodman O.L. Vatner S.F. Coronary vasoconstriction mediated by alphal- and alpha2-adrenoceptors in conscious dogs // J Physiol. 2010. Vol. 588. - P. 4007-4016.

191. Wolf G. The mechanism and regulation of fat mobilization from adipose tissue: desnutrin, a newly discovered lipolytic enzyme // Nutr Rev. 2005. Vol. 63. — № 5. - P. 166-170.

192. Yang K.J. Noh J.R., Kim Y.H., Gang G.T., Hwang J.H., Yang S.J., Yeom Y.I., Lee C.H. Differential modulatory effects of rosiglitazone and pioglitazone on white adipose tissue in db/db mice // Life Sci. 2010. Vol. 87. -№ 13-14. - P. 405-410.

193. Yang T. Chang C.K., Tsao C.K., Ya-Mei Hsu Y.M., Hsu C.T., Cheng J.T. Activation of muscarinic M3 receptor may decrease glucose uptake and lipolysis in adipose tissue of rats // Neurosci Lett. 2009. Vol. 451. - № 1. - P. 57-59.

194. Yin W. Mu J., Birnbaum M.J. Role of AMP-activated protein kinase in cyclic AMP-dependent lipolysis In 3T3-L1 adipocytes // J Biol Chem. 2003. Vol. 278. - № 44. - P. 43074-43080.

195. Zammit V.A. Arduini A. The AMPK-malonyl-CoA-CPTl axis in the control of hypothalamic neuronal function // Cell Metab. 2008. Vol. 8. - №3. - P. 175.

196. Zhang C. Hein T.W., Wang W., Chang C.-I., Kuo L. Constitutive expression of arginase in microvascular endothelial cells counteracts nitric oxide-mediated vasodilatory function // J FASEB. 2001.-Vol. 15.-P. 1264-1276.

197. Zweier J.L. Wang P., Samouilov A., Kuppusamy P. Enzyme-independent formation of nitric oxide in biological tissues // Nature Medicine. 1995. Vol. 1. - P. 804-809.

198. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ1. Статьи в журналах

199. Туровский Е.А., Каймачников Н.П., Туровская М.В., Бережное A.B., Дынник В.В., Зинченко В.П. Два механизма кальциевых колебаний в адипоцитах. Биологические мембраны, 2011. Т.28(6):463-72.

200. Туровский Е.А., Конаков М.В., Бережное A.B., Зинченко В.П., Бронников Г.Е., Долгачева Л.П. Изменение Са2+-ответов культивируемых бурых адипоцитов при адренергической активации. Цитология, 2011. Т.53(6): 466-73.

201. Конаков М.В., Долгачева Л.П., Туровский Е.А., Бронников Г.Е. Изменение концентрации ионов кальция в цитоплазме бурых преадипоцитов при адренергической стимуляции. Биологические мембраны 2010, Т27(1): 77-83.

202. Долгачева Л.П., Туровский Е.А., Туровская М.В., Зинченко В.П., Дынник В.В. а-адренергический контроль двух Са2+-сигнальных путей адипоцитов. Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2012 (в печати)1. Статьи в сборниках

203. Туровский Е.А. Каймачников Н.П., Туровская М.В., Бережное A.B., Дынник В.В., Зинченко В.П. Два механизма кальциевых колебаний в адипоцитах. Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино 2011. (24-26 мая) 1, стр. 391-96.

204. Туровский Е.А. Конакое М.В. Суслики (SPERMOPHILIS UNDULATUS) и мыши скорее всего имеют разные механизмы индукции гиперплазии бурой жировой ткани. Школа-конференция для молодых ученых «Методы культивирования клеток», Санкт-Петербург 2008 год, стр.827.