Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности кальциевой сигнализации в пролиферирующих и дифференцирующихся миобластах линии C2C12 мыши

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Особенности кальциевой сигнализации в пролиферирующих и дифференцирующихся миобластах линии C2C12 мыши"

На правах рукописи

КРАСНЫЙ Алексей Михайлович

ОСОБЕННОСТИ КАЛЬЦИЕВОЙ СИГНАЛИЗАЦИИ В ПРОЛИФЕРИРУЮЩИХ И ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩИХСЯ МИОБЛАСТАХ ЛИНИИ С2С12 МЫШИ

03.00.04 - Клеточная биология, гистология, цитология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 О НОЯ 2011

Москва 2011

4859359

Работа выполнена в лаборатории биофизики развития Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Озернкж Николай Дмитриевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Авдонин Павел Владимирович

доктор биологических наук Романов Юрий Аскольдович

Ведущая организация: МГУ имени М.В. Ломоносова, биологический факультет, кафедра клеточной биологии и гистологии

Защита диссертации состоится «30» ноября 2011 г. в 1500 часов на заседании диссертационного совета Д 002.238.01 в Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 26. Сайт: http://idbras.comcor.ru e-mail: idbras@bk.ru.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.

Автореферат разослан » Qlc W^ <А 2011 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук e-mail: ele0806@yandex.ru

Е.Б. Абрамова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Одним из важнейших этапов развития различных тканей и органов является переход клеток от пролиферации к дифференцировке. В этот период начинается экспрессия многих специфических генов и синтез соответствующих белков, определяющих фенотип дифференцирующихся клеток. Существенным компонентом регуляции внутриклеточных процессов служит кальциевая сигнализация. Концентрация Са2+ в цитоплазме регулируется путем высвобождения запасов данных ионов из внутриклеточных депо, однако стадия формирования этого механизма в ходе дифференцировки клеток неизвестна.

Для понимания формирования механизмов кальциевой сигнализации большое значение имеет изучение закономерностей строения и регуляции функционирования специфических ионных каналов,- осуществляющих поступление Са2+ в цитоплазму пролиферирующих и дифференцирующихся клеток (на модели миобластов). Молекулярная структура и экспрессия отдельных субъединиц кальциевых каналов установлена для многих типов клеток (Berridgt, Irvine, 1989; Авдонин, Ткачук, 1994; MacLennan, 2002; Зинченко, Долгачева, 2003; Rockman et а!., 2002; Болдырев и др. 2006), однако для миобластов подобный анализ не проводился. Поэтому для понимания механизмов кальциевой сигнализации в миобластах установление структуры кальциевых каналов, а также регуляции их функционирования, предпринятое в нашей работе, является актуальной проблемой.

Существенную роль в процессах развития и восстановления мышечных тканей играют адренергические рецепторы (Hinkle et al., 2002; Beitzel et al., 2004; Lynch et al., 2007; Pearen et al., 2009; Duranti et al., 2011), однако данные о характере их регулирующего влияния противоречивы. В связи с этим особый интерес представляет сравнительное изучение роли адренергических рецепторов в регулировании концентрации Са2+ в цитоплазме пролиферирующих и дифференцирующихся миобластов.

Цель и задачи работы. Целью работы было изучение механизмов кальциевой сигнализации в миобластах при их переходе от пролиферации к дифференцировке.

В работе были поставлены следующие задачи :

1. Изучить особенности регуляции внутриклеточной кальциевой сигнализации, вызывающей высвобождения ионов Са2+ внутриклеточных депо, в пролиферирующих и в дифференцирующихся (в течение 24 час) миобластах.

2. Выяснить механизмы регуляции кальциевой сигнализации в пролиферирующих миобластах: выявить активатор поступления Са2+ в цитоплазму этих клеток, а также рецепторы, на которые он воздействует; охарактеризовать каналы, через которые Са2+ поступает в цитоплазму клеток, а также исследовать механизм передачи сигнала от рецептора к каналу.

3. Установить особенности внутриклеточной кальциевой сигнализации, связанные с адренергическими рецепторами в пролиферирующих и дифференцирующихся миобластах.

4. Для установления специфичности потенциалзависимых кальциевых каналов в миобластах определить уровень экспрессии генов СаспаЬ, СаспаМ, Саспа1с и Саспа7/ кодирующих синтез каналообразующих субъединиц Са2+-каналов Ь-типа.

Научная новизна и практическая ценность работы

Впервые описаны особенности внутриклеточной кальциевой сигнализации в пролиферирующих и дифференцирующихся миобластах. Показано, что в пролиферирующих миобластах система, регулирующая концентрацию Са2+ в цитоплазме путем высвобождения этих ионов из внутриклеточных депо, практически не функционирует, а ее формирование происходит в течение первых нескольких часов дифференцировки. Установлено, что поступление Са2+ в делящихся миобластах осуществляется через потенциалзависимые Са2+-каналы Ь-типа. Эти каналы играют ключевую роль в регуляции концентрации Са2+ в цитоплазме пролиферирующих миобластов. Механизм регуляции поступления Са2+ включает в себя активацию

Рг-адренергических рецепторов, участие аденилатциклазы и поступление Са2+ через потенциалзависимые Са2+-каналы Ь-типа. Показано, что после перехода клеток в состояние дифференцировки основным механизмом в регуляции концентрации Са2+ в цитоплазме является высвобождение внутриклеточных запасов этих ионов. Впервые описано изменение уровней экспрессии отдельных субъединиц потенциалзависимых Са2+-каналов Ь-типа в миобластах в процессе их дифференцировки. Обнаружена нейрональная форма Са2+-канала Ь-типа Сау1.3 в пролиферирующих миобластах.

Результаты работы могут быть использованы при чтении курсов лекций по клеточной биологии и биологии развития, а также учитываться в биомедицинских исследованиях при решении задач, связанных с патологиями, которые вызваны нарушениями кальциевой сигнализации и клеточной пролиферации.

Личное участие автора. Работа выполнена непосредственно автором. Поставленные задачи были решены с применением современных методов клеточной биологии, физиологии и молекулярной генетики. Выводы сформулированы на основе собственных оригинальных данных.

Апробация диссертации. Результаты исследования были представлены на XV школе "Актуальные проблемы биологии развития" (Звенигород, 2008), конференции молодых ученых ИБР РАН (Москва, 2009, 2010), Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009, 2011), Всероссийском конкурсе научно-исследовательских работ в области биологических наук (Ульяновск, 2011)

Публикации. По материал диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 93 страницах. Работа состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследований, обсуждение, выводы и список литературы; иллюстрирована 18 рисунками и 2 таблицами. Список литературы включает 74 источника, из них 7 отечественных и 67 иностранных.

ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа проводилась на культуре миобластов линии С2С12 мыши, полученной из коллекции клеточных культур Института цитологии РАН (Санкт-Петербург).

В качестве ростовой среды использовали DMEM (Sigma, США) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (БиоЛот, Россия), 2 мМ L-глютамина (Sigma, США). Антибиотики в среду не добавляли. Процедуру пересева клеток проводили, используя 0.25% трипсин и 0.02% версен в отношении 1 : 3. Кратность рассева составляла 1:3 - 1:6, оптимальная плотность соответствовала 2.0-4.0x104 клеток/см2. Пересев клеток проводили каждые 3-4 суток. В качестве среды дифференцировки использовали DMEM с добавлением 2% эмбриональной лошадиной сыворотки. Культивировали клетки в С02-инкубаторе при 37°С с 5% СОг.

Рис. 1. Миобласты линии С2С12 мыши. Конфокальная микроскопия.

Изменение концентрации Са2+ в цитоплазме оценивали на единичных клетках на конфокальном микроскопе LEICA SP 5; объектив 20х; одновременно можно было оценить 20-40 клеток (рис. 1).

Клетки рассаживали в специальные чашки Петри (SPL, Канада) и добавляли к ним чувствительный к изменению концентрации Са2+ в цитоплазме флуоресцентный краситель FLUO-3/AM фирмы Biotium (Канада). Флуоресцентный анализ и окрашивание проводили в специальных средах, К пролиферирующим миобластам добавляли раствор Хенкса с 5тМ буфера HEPES, pH 7.4 при 37°С. К дифференцирующимся клеткам добавляли физиологический раствор (PSS), содержащий 145 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ СаС12, 1 мМ MgCl2, 10 мМ глюкозу, 5 мМ HEPES, pH 7.4 при 37°С. В этих же средах растворяли краситель. Для лучшего проникновения в клетку FLOU 3/АМ экспериментально был подобран оптимальный режим. На 1 мл среды добавляли б мкг FLOU 3/АМ, 0,8 мкл 5% Pluronic F-127 (Biotium, Канада); окрашивание проводили в течение 20 мин при 37°С; далее миобласты три раза отмывали и выдерживали 1 час при 37°С. В ряде экспериментов использовали также бескальциевую среду (PSS, где Са2+был заменен на 1 мМ ЭГТА).

Для оценки внутриклеточных запасов Са2+ в миобластах в бескальциевую среду добавляли 50 мкМ АТФ (Sigma, США). АТФ, как известно, не только участвует в передаче энергии в клетке, но и способен взаимодействовать с различными пуринорецепторами на поверхности мембраны. Миобласты линии С2С12 обладают метаботропными (P2Y) и ионотропными (Р2Х) пуринорецепторами (Banachewicz et al., 2005). Ионотропные рецепторы являются неселективными и пропускают Са2+ в цитоплазму. Метаботропные рецепторы сопряжены с G белком, который активирует фосфолипазу С, что, в свою очередь, приводит к опустошению ретикулярных запасов.

В конце каждого эксперимента в качестве контроля добавляли 100 мкМ иономицина (Sigma, США), который, являясь ионофором, в данной концентрации приводил к заполнению цитоплазмы этими ионами более

активно, чем их выведение клеточными системами; при этом интенсивность флуоресценции принималась за 1.

Для анализа экспрессии генов, кодирующих субъединицы кальциевых каналов, выделяли тотРНК из пролиферирующих и дифференцирующихся одноядерных миобластов, используя Tri reagent (Sigma). Фракцию мРНК получали из тотРНК с помощью набора Gene-elute-mRNA (Sigma). Синтез кДНК проводили с использованием обратной транскриптазы M-MLV и олиго-д(Т)18 праймеров (Силекс, Россия). ПЦР-анализ экспрессии изучаемых генов проводили на амплификаторе Eppendorf (Германия) по следующей программе: предварительная денатурация - 94°С, 5 мин; отжиг праймеров - 58°С, 45 с; удлинение цепи - 72°С, 45 с; денатурация - 94°С, 45 с, 40 циклов; завершающее удлинение цепи - 72°С, 5 мин. Специфические праймеры были сконструированы при помощи программы Primerselect (таблица).

Таблица.

Структура праймеров, использованных для ПЦР-анапиза экспрессии генов, кодирующих каналообразующие субъединицы потенциалзависимых Са2+ -каналов L-типа.

Геи Структура праймера Размер фрагмента н. п.

RPL19 Пр. 5'-AGGGTACTGCCAATGCTCGGA-3' Обр. 5'-CCTTGGACAGAGTCTTGATGATC-3' 327

Cacnals Пр. 5'-AAGAGGAATGCAGGGGCTACTACT-3' Обр. 5'-ATGAAGAAGGCAATGAGGATGATG-3' 274

Cacnalc Пр. 5'-TCTAAACAGACGGAGGCAGAATG-3' Обр. 5'-CTGGAAGGTGACAATGACGAA-3' 326

Cacnald Пр. 5'-GACCCCATCCGTAGCCACTCAT-3' Обр. 5'-GCCGCAAGACCCTCAAAACC-3' 253

Cacnalf Пр. 5'-TGCACTGATGAGGCCAAACACA-3' Обр. 5'-TGATGATAACAAAGCCCACAAAGA-3' 331

Предварительная нормировка кДНК, полученной из пролиферирующих и дифференцирующихся миобластов, осуществлена по гену рибосомапьного белка RPL 19. Секвенирование ПЦР-продуктов проводили на оборудовании Applied Biosystems (США) в ЗАО "Синтол" (Москва).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 7. Внутриклеточные запасы Са2+ в пролиферирующих миобластах. Запасы Са2+ внутриклеточных депо, как известно, играют основную роль в регуляции концентрации Са2+ в цитоплазме во всех типах клеток млекопитающих кроме эритроцитов. Чтобы оценить эти запасы, в пролиферирующих миобластах было исследовано изменение концентрации Са2+ в цитоплазме при добавлении АТФ в бескальциевой среде с последующим добавлением ионов кальция, Использование бескальциевой среды позволяет исключить вклад ионотропных рецепторов.

На рис. 2 показан типичный ответ одиночной клетки, находящейся в состоянии пролиферации. В цитоплазме миобластов АТФ вызывает небольшое повышение флуоресценции (примерно 5% от максимального значения флуоресценции, полученного в результате добавления иономицина). Всего было оценено 20 клеточных ответов из трех различных экспериментов; среднее значение флуоресценции составило 4.8±0.3% от максимального, т.е близко к фоновым колебаниям концентрации Са2+.

0.50 п

§

х о со о

Ц_

к =г

о.

о >. с

■е-

Рис. 2. Изменение концентрации Са2+ в цитоплазме пролиферирующих миобластов при добавлении АТФ и Са2+в бескальциевой среде. Интенсивность флуоресценции после добавления 100 мкМ иономицина принята за 1.

Таким образом, в пролиферирующих миобластах линии С2С12 мыши система кальциевой сигнализации, регулирующая концентрацию Са2+ в цитоплазме путем опустошения внутриклеточных депо, практически не функционирует. Поскольку при добавлении Са2+ в среду концентрация этих ионов в цитоплазме не меняется, можно сделать вывод, что отсутствует поступление внеклеточного Са2+ в цитоплазму миобластов, вызываемое опустошением внутриклеточных запасов.

2. Внутриклеточные запасы Са2+ в дифференцирующихся миобластах. Было оценено поступление Са2+ из внутриклеточных депо в цитоплазму дифференцирующихся миобластов. Добавление АТФ к клеткам, помещенным в бескальциевую среду, вызвало значительную флуоресценцию красителя Fluo-3 в цитоплазме. При этом в части клеток наблюдался одиночный ответ. На рис. 3 приведен типичный ответ клеток на данное воздействие. Значение флуоресценции составляет 85% от максимального, вызванного добавлением иономицина. Следует отметить, что ответ на внесение АТФ проявлялся с некоторой задержкой во времени. Всего было оценено 17 клеточных ответов из трех различных экспериментов; среднее значение флуоресценции составило 84.8±5.2% от максимального.

В части клеток после добавления АТФ наблюдались кальциевые волны, состоящие из двух или более выбросов Са2+ (рис. 4). Значения максимальной флуоресценции при выбросе Са2+ были ниже, чем при одиночных ответах и наблюдался значительных разброс данных (значение максимального ответа составило 78%, минимальное - 31% от максимальной флуоресценции). При этом происходило, по-видимому, неполное опустошение ретикулума. В дальнейших наших исследованиях использовались данные о флуоресценции клеток с одиночным кальциевым ответом.

Вызываемый добавлением Са2+ вход этих ионов через каналы, регулируемые опустошением эндоплазматического ретикулума (SOC - store operate channel), составил примерно 14% от максимального значения флуоресценции.

0,9-

-,-,-,-1-|—

0 300 600

время, с

Рис. 3. Изменение концентрации Са2+ в цитоплазме дифференцирующихся миобластов при добавлении АТФ и Са2+в бескальциевой среде. Интенсивность флуоресценции после добавления 100 мкМ иономицина принята за 1.

0,0-1-,-,-,-,-г-

0 300 600

время, с

Рис. 4. Изменения концентрации Са2+ в цитоплазме дифференцирующихся миобластов при добавлении АТФ и Са2+ в бескапьциевой среде. Интенсивность флуоресценции после добавления 100 мкМ иономицина принята за 1.

3. Механизмы активации поступления Са2+ в цитоплазму пролиферирующих миобластов. Для выяснения особенностей кальциевой сигнализации в делящихся миобластах необходимо было установить механизм активации входа этих ионов в клетку. Мы предположили, что поступление Са2, в миобластах регулируется адренергическими рецепторами. Чтобы проверить это предположение, к клеткам, нагруженным кальциевым флуоресцентным красителем, был добавлен адреналин, что вызывало поступление Са2+ в цитоплазму клеток (рис. 5). В данном эксперименте флуоресценция составила 92% от максимальной. Повторное добавление адреналина через 2 мин не оказывало влияние на поступление Са2+. В качестве контроля был добавлен ионофор иономицин, который вызывал накопление Са2+ в цитоплазме миобластов. На основании полученных результатов, можно заключить, что в данном случае поступление Са2+ в пролиферирующих миобластах регулируется адренергическими рецепторами.

адреналин 5 мкМ

I

иономицин 100 мкМ|

адреналин 5 мкМ

0,0-

50 100 150

время, с

200 250

Рис. 5. Активация адреналином поступления Са2+ в цитоплазму пролиферирующих миобластов. Интенсивность флуоресценции после добавления 100 мкМ иономицина принята за 1.

Следует отметить, что участие адренергических рецепторов в регуляции концентрации Са2+ в цитоплазме миобластов обнаружено впервые. Ранее было известно, что адренергические рецепторы участвуют в гликогенолизе, а также в регуляции сокращения скелетных мышц.

Далее, предстояло выяснить тип адренергических рецепторов, участвующих в регуляции поступления Са2+ в цитоплазму пролиферирующих миобластов. В начале было показано, что норадреналин - активатор аг, а2- и Р1 -адренергических рецепторов не вызывает поступления Са2+ в цитоплазму этих клеток. Однако, при замене адреналина на фенотерол (специфический активатор (32 -адренорецепторов) было обнаружено, что он вызывает вход Са2+ в цитоплазму пролиферирующих миобластов (рис. 6).

Рис. 6. Повышение концентрации Са2+, вызванное фенотеролом, в пролиферирующих миобластах, нагруженных флуоресцентным красителем Р1ио-3. а) клетки в состоянии покоя, б) клетки после добавления фенотерола.

Представленные данные свидетельствует о том, что в поступлении Са2н в цитоплазму этих клеток участвуют р2-адренергические рецепторы, тогда как а.)-, а2- и ^-адренорецепторы в данном процессе не принимают участия. Следует отметить, что раннее обращали внимание на особую роль (32-адренергических рецепторов в пролиферирующих миобластах: их активатор рактопамин усиливал пролиферацию клеток, не оказывая влияния на миотубы. (БЬарреП е1 а!., 2000).

4. Выявление каналов, проводящих Са2+ в цитоплазму клетку. Для выяснения особенностей кальциевой сигнализации в делящихся миобластах необходимо было установить тип каналов, проводящих Са2+. Один из подходов для решения этой задачи состоит в использовании специфических ингибиторов. Чтобы определить тип каналов, проводящих ионы Са2+, в наших экспериментах применялся верапамил - специфический ингибитор потенциалзавасимых кальциевых каналов L-типа. Было обнаружено, что добавление верапамила приводит к полному ингибированию поступления Са2+, активируемого адреналином. Следует отметить, что существует точка зрения, согласно которой Са2+-каналы L-типа присутствуют только в многоядерных миотубах (Zheng et al., 2002; Bidaud et al., 2006). Однако полученные нами результаты ингибиторного анализа свидетельствуют о том, что Са2+-каналы в делящихся миобластах относятся к потенциалзависимым каналам L-типа.

5. Передача сигнала от адренергических рецепторов к потенциалзависимым Са2^-каналам L-muna. Предполагалось, что активация потенциалзавасимых Са2+ каналов L-типа в миобластах происходит по цАМФ-зависимому пути. Для проверки этого предположения был использован форсколин - специфический активатор аденилатциклазы (Seamon, Daly, 1981).

Как видно из рис. 7, форсколин активирует поступление Са2+ в цитоплазму миобластов, что подтверждает предположение об активации входа этих ионов в клетку аденилатциклазой. Следующее добавление адреналина не вызывает поступление Са2+ в цитоплазму делящихся миобластов, как это было показано выше (рис. 5). Также этот вход полностью блокируется верапамилом. Из этих данных следует, что аденилатциклаза в пролиферирующих миобластах регулирует поступление Са2+, вызванное р2-адренергическими рецепторами.

иономицин100мкМ 1,0- форсколин 10 мкМ ^-.—

о

и.

адреналин 50 мкМ

| 0,4-

среда

X <1!

а о

д!

-50 0 50 100 150 200 250 300 350 400

время, с

Рис. 7. Поступление Са2+ в цитоплазму делящихся миобластов, вызванное активацией аденилатциклазы форсколином. Интенсивность флуоресценции после добавления 100 мкМ иономицина принята за 1.

б.Оценка поступления Са2+ в цитоплазму дифференцирующихся миобластов при активации адренергических рецепторов адреналином. При

активации адренергической системы в дифференцирующихся миобластах добавлением адреналина величина флуоресценции составила 68% от максимального значения флуоресценции, вызванного добавлением 100 мкМ иономицина (рис. 8). Всего было оценено 12 клеточных ответов из двух различных экспериментов, среднее значение флуоресценции составило 65±4.4% от максимального. Это существенно ниже, чем в пролиферирующих миобластах. Далее, в этом эксперименте после добавления бескальциевой среды и АТФ флуоресценция составила 94% от максимальной величины.

г а

о >>

4

1,0-

0,5-

0,0-

АТФ 50 мкМ

адреналин 5 мкМ

рвБ/б Са

200

время, с

400

Рис. 8. Активация адреналином входа Са в цитоплазму дифференцирующихся миобластов. Интенсивность флуоресценции после добавления 100 мкМ иономицина принята за 1.

Таким образом, в процессе дифференцировки роль адренергических рецепторов в регулировании концентрации Са2+ в миобластах существенно снижается. При этом значительное повышение флуоресценции после добавления АТФ демонстрирует, что механизм, регулирующий опустошение запасов Са2+ из внутриклеточных депо, полностью сформирован.

7. Экспрессия генов капалообразующих субъединиц потенциалзависимых Са2*-каналов Ь-типа в пролиферирующих и дифференцирующихся миобластах. Как отмечалось выше (раздел 4), при помощи ингибиторного анализа было установлено, что пролиферирующие миобласты обладают потенциалзависимыми Са2+ -каналами Ь-типа. Поступление Са2+ через данные каналы регулируется адреналином. Для понимания механизмов транспорта Са2+ в миобластах существенным представляется исследование экспрессии генов потенциалзависимых Са2+-каналов Ь-типа, поскольку ингибиторный анализ, использованный для их выявления, не позволяет судить о виде Са2+-канала Ь-типа. Кроме того, данные,

свидетельствующие о наличии потенциалзависимых Са2+-каналов L-типа в одноядерных миобластах, не согласуются с существующей точкой зрения, согласно которой Са2+-канапы L-типа присутствуют только в многоядерных миотубах (Zheng et al., 2002; Bidaud et al., 2006).

Для анализа потенциалзависимых Са2+-каналов L-типа была исследована экспрессия генов, которые кодируют синтез каналообразующих субъединиц всех известных Са2+-каналов L-типа в мышиных миобластах линии С2С12 на стадиях пролиферации и начала дифференцировки. При помощи ПЦР-анализа определен уровень экспрессии генов Cacnals, Cacnalc, Cacnald, Cacnalf, которые кодируют субъединицы: ajS, а,С, a,D ajF, соответственно. Обнаружено, что экспрессия гена Cacnals, который кодирует синтез специфической для скелетных мышц каналообразующей субъединицы, в пролиферирующих миобластах находится на низком уровне, тогда как в дифференцирующихся миобластах она многократно увеличивается (рис. 9).

Стадия развития культуры Ген Пролиферация Дифференциров-ка 24 часа Размер ПЦР-фрагмента н. п.

Cacnals 274

Cacnald 253

RPL19 327

Рис. 9. ПЦР-анализ уровня экспрессии генов, кодирующих субъединицы Са2^ канала L-типа, в пролиферирующих и дифференцирующихся миобластах. ЛРЬ19 -рибосомальный белок, по которому нормированы кДНК.

В миобластах впервые была обнаружена экспрессия гена СаспаЫ, кодирующего синтез субъединицы щБ. В делящихся миобластах уровень экспрессии этого гена значительно выше, чем в дифференцирующихся клетках (рис. 9). Экспрессия генов Саспа1с и Саспа//в миобластах не выявлена.

Таким образом, в одноядерных миобластах линии С2С12 впервые обнаружены два вида потенциалзависимых Са2+-каналов L-типа: Cavl.l и Cavl.3, синтез которых меняется в пролиферирующих и дифференцирующихся миобластах (рис. 9). Было показано, что экспрессия гена Cacnals, кодирующего синтез специфической для скелетных мышц субъединицы aiS (канал Cavl.l), активируется только в дифференцирующихся одноядерных миобластах. Вместе с тем, транскрипция известных изоформ этого гена ранее была обнаружена только в многоядерных миобластах (Zheng et а!., 2002; Bidaud et al., 2006). Это позволяет предположить, что нами обнаружена новая, экспрессирующаяся на более ранних этапах изоформа мРНК Cacnals.

В пролиферирующих миобластах обнаружен высокий уровень экспрессии гена Cacnald, кодирующего синтез субъединицы aiD (канал Cavl.3). Это дает основание предполагать, что в пролиферирующих миобластах регуляция внутриклеточной концентрации Са2+ осуществляется через каналы Cavl.3. Уменьшение уровня экспрессии гена Cacnald в дифференцирующихся миобластах свидетельствует о снижении роли каналов Cavl.3 в кальциевой сигнализации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Установлено, что формирование внутриклеточной системы кальциевой сигнализации, регулирующей опустошение запасов кальциевых депо, происходит на начальных этапах дифференцировки миобластов. В пролиферирующих миобластах мыши данная система кальциевой сигнализации практически не функционирует.

Показано также, что поступление Са2+ в цитоплазму пролиферирующих миобластов осуществляется через кальциевые каналы L-типа, которые играют ключевую роль в регуляции концентрации Са2+. Механизм регуляции поступления Са2+ включает в себя активацию р2-адренергических рецепторов и участие аденилатциклазы. После перехода миобластов к дифференцировке основным механизмом повышения концентрации Са2+ в цитоплазме становится высвобождение ретикулярных запасов этих ионов.

В одноядерных миобластах впервые обнаружены два вида потенциалзависимых Са2+-каналов L-типа: Cavl.l и Cavl.3. Было показано, что экспрессия гена Cacnals, кодирующего синтез специфической для скелетных мышц субъединицы ciiS (канал Cavl.l), активируется только в дифференцирующихся одноядерных миобластах. Вместе с тем, транскрипция известных изоформ этого гена ранее была обнаружена только в многоядерных миобластах (Zheng et al., 2002; Bidaud et al., 2006). Это позволяет предположить, что нами найдена новая, экспрессирующаяся на более ранних этапах дифференцировки изоформа мРНК гена Cacnals.

В пролиферирующих миобластах обнаружен высокий уровень экспрессии гена Cacnald, кодирующего синтез субъединицы otiD (канал Cavl.3). Это дает основание предполагать, что в пролиферирующих миобластах регуляция внутриклеточной концентрации Са2+ происходит через каналы Cavl.3. Уменьшение уровня экспрессии гена Cacnald в дифференцирующихся миобластах свидетельствует о снижении роли каналов Cavl.3 в кальциевой сигнализации.

Таким образом, нами обнаружены существенные различия в механизмах внутриклеточной сигнализации в пролиферирующих и дифференцирующихся миобластах. В перспективе, это может служить основой для разработки новых подходов к селективному воздействию на клетки, находящиеся на разных стадиях развития, с целью регуляции пролиферации и перехода клеток к дифференцировке.

выводы

1. В пролиферирующих миобластах линии С2С12 мыши система кальциевой сигнализации, регулирующая концентрацию Са2+ в цитоплазме путем опустошения внутриклеточных депо этих ионов, практически не функционирует. Регулируемые АТФ запасы Са2+ в этих клетках незначительны.

2. В пролиферирующих миобластах поступление Са2+ в цитоплазму регулируется адреналином через р2-адренергические рецепторы и происходит через потенциалзависимые кальциевые каналы Ь-типа Сау1.3.

3. Передача сигнала внутриклеточной кальциевой сигнализации от Рг-адренергических рецепторов к кальциевым каналам Ь-типа происходит по цАМФ-зависимому пути.

4. Формирование системы кальциевой сигнализации, регулирующей концентрацию Са2+ в цитоплазме путем опустошения запасов внутриклеточных депо, происходит на начальных этапах дифференцировки миобластов.

5. В дифференцирующихся миобластах поступление Са2+ при активации адренергической системы существенно ниже по сравнению с пролиферирующими клетками.

6. В процессе дифференцировки миобластов значительно возрастает уровень экспрессии гена СаспаЬ, который кодирует синтез специфической субъединицы сцБ кальциевых каналов Ь-типа Сау1.1, тогда как уровень экспрессии каналообразующей субъединицы СаспаМ, кодирующей синтез субъединицы с^Б кальциевых каналов Сау1.3, заметно снижается.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Красный А. М., Озернюк Н. Д. Различия в Са2+-сигнализации в пролиферирующих и дифференцирующихся миобластах мыши // Биофизика.

2010. Т. 4. С. 640-644.

2. Красный А. М., Сефиханов Т. Г., Озернюк Н. Д. Регуляция входа Са2+ в пролиферирующих и дифференцирующихся миобластах мыши с участием Са2+-каналов Ь-типа // Биофизика. 2011. Т. 1. С. 74-78.

3. Красный А. М., Озернюк Н. Д. Экспрессия генов, кодирующих субъединицы потенциалзависимых Са2+-каналов Ь-типа в пролиферирующих и дифференцирующихся миобластах линии С2С12 мыши // Известия РАН. Серия биол. 2011. Т. 3 .С. 1-5.

4. Красный А. М., Озернюк Н. Д. Сравнение механизмов Са2+-сигнализации в делящихся и дифференцирующихся миобластах мыши // Сборник статей. Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». 2009. Т. 1. С. 283-287.

5. Красный А. М., Озернюк Н. Д. Механиз регулции внутриклеточной Са2+-сигнализации в пролиферирующих миобластах // Сборник статей. Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация».

2011. Т. 1. С. 357-361.

6. Красный А. М. Озернюк Н. Д. Экспрессия генов потенциалзависимых Са2+ -каналов Ь-типа в пролиферирующих и дифференцирующихся миобластах С2С12 мыши // Сборник статей. Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». 2011. Т. 1. С. 361-364.

Заказ № 103-р Подписано в печать 25.10.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л.1

\ ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30

10^7/ www.cfr.ru; e-mail:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Красный, Алексей Михайлович

Введение.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Кальциевая сигнализация.

1.1.1. Поступление Са в цитоплазму клеток при стимуляции клеточных рецепторов.

1.1.2. Са - транспортирующие системы.

1.1.3. Мобилизация Са из внутриклеточных структур.

1.1.3.1. Инозитолтрифосфатный рецептор (1РзК).

1.1.3.2. Рианодиновый рецептор (КуР.).

1.1.4. Са2+-каналы плазматической мембраны.

941.1.4.1. Потенциал-управляемые Са -каналы.

1.1.4.2. Рецептор-управляемые Са -каналы плазматической мембраны.

1.1.4.3. Истинные рецептор-управляемые каналы.

941.1.4.4. Са -каналы, активируемые вторичными посредниками.

94- 94

1.1.4.5. Са -каналы, регулируемые высвобождением Са из внутриклеточные депо.

1.2. Формирование мембранного потенциала.

1.3. Кальциевая сигнализация в миобластах.

1.4. Кальциевая сигнализация и некоторые патологические состояния мышечной системы: миодистрофия Дюшенна-Беккера.

1.5. Адренергические рецепторы.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Объект исследования.

2.2. Культивирование клеток.

942.3. Оценка внутриклеточных запасов Са

2.4. Флуоресцентные исследования Са

2.5. Реактивы и концентрации, используемые при флуоресцентных исследованиях Са

942.6. Оценка концентрации Са в митохондриях.

2.7. Выделение тотальной РНК.

2.8. Определение концентрации тотРНК в пробе.

2.9. Выделение мРНК.

2.10. Синтез кДНК.

2.11. Конструирование праймеров.

2.12. Нормировка к ДНК библиотек.

2.13. ПЦР-анализ.

2.14. Выделение ДНК из агарозного геля.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Ретикулярные запасы Са в пролиферирующих миобластах.

3.2. Ретикулярные запасы Са дифференцирующихся миобластов.

3.3. Сравнение кинетики удаления Са2+ из цитоплазмы пролиферирующих и дифференцирующихся миобластов.

3.4. Роль митохондрий в регуляции концентрации Са в цитоплазме пролиферирующих миобластов.

3.5. Анализ механизмов кальциевой сигнализации в пролиферирующих миобластах.

3.5.1. Механизмы активации входа

Са в клетку.

3.5.2. Выявление каналов, проводящих в цитоплазму делящихся миобластов.

3.5.3. Выявление типа адренергических рецепторов, вызывающих поступление Са в цитоплазму миобластов.

3.5.4. Передача сигнала от адренергических рецепторов к потенциалзависимым кальциевым каналам Ь-типа.

3.6. Оценка поступления Са в цитоплазму дифференцирующихся миобластов при активации адренергических рецепторов адреналином.

3.7. Влияние деполяризации на поступление Са в цитоплазму пролиферирующих миобластов.

3.8. Экспрессия генов, кодирующих субъединицы потенциалзависимых кальциевых каналов Ь-типа в пролиферирующих и дифференцирующихся миобластах.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1. Роль опустошения ретикулярных запасов Са во внутриклеточной кальциевой сигнализации в пролиферирующих миобластах.

4.2. Роль адреналина во внутриклеточной кальциевой сигнализации в пролиферирующих миобластах.

4.3. Механизм внутриклеточной кальциевой сигнализации в пролиферирующих миобластах.

4.4. Роль и свойства кальциевого потенциалзависимого канала Ь-типа в пролиферирующих миобластах.

4.5. Особенности кальциевой сигнализации через 24 часа после начала дифференцировки миобластов.

4.6. «Кальциевые волны» в дифференцирующихся миобластах.

4.7. Возможная роль митохондрий в регуляции концентрации Са2+ в цитоплазме миобластов.

4.8. Обсуждение механизмов кальциевой сигнализации в миобластах, выявленных в данной работе.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности кальциевой сигнализации в пролиферирующих и дифференцирующихся миобластах линии C2C12 мыши"

Одним из важнейших этапов развития различных тканей и органов является переход клеток от пролиферации к дифференцировке. В этот период начинается экспрессия многих специфических генов и синтез соответствующих белков, определяющих фенотип дифференцирующихся клеток. Существенным компонентом регуляции внутриклеточных процессов служит кальциевая сигнализация, задачей которой является активация Са -зависимых белков в результате кратковременного повышения концентрации ионов Са в цитоплазме. Действие этих ионов может быть опосредовано специальными Са2+-связывающими белками, такими, как кальмодулин; кроме того кальцийзависимые ферменты могут иметь собственные сайты связывания Са2+.

Повышение концентрации ионов Са2+ в цитоплазме может происходить в результате открывания кальциевых каналов плазматической мембраны или внутриклеточных кальциевых депо. Открывание каналов может быть вызвано деполяризацией мембран или действием сигнальных веществ, нейромедиаторов (АТФ, глутамат), вторичных мессенджеров (1Р3, цАМФ).

Известно, что запасы внутриклеточных депо играют основную роль в регуляции концентрации Са2+ в цитоплазме различных типов клеток животных, однако стадия формирования механизмов высвобождения внутриклеточных запасов Са в процессе клеточной дифференцировки неизвестна.

Для понимания кальциевой сигнализации важное значение имеет изучение особенностей строения, а также регуляции функционирования специфических ионных каналов, осуществляющих поступление

Са2+ в цитоплазму. Молекулярная структура и экспрессия отдельных субъединиц кальциевых каналов, а также механизмы их регуляции установлены для многих типов клеток (Berridgt, Irvine, 1989; Авдонин, Ткачук, 1994; 6

МасЬеппап, 2002; Зинченко, Долгачева, 2003; 11осктап е1 а1., 2002; Болдырев и др., 2006), однако для миобластов подобный анализ не проводился. Таким образом, актуальной проблемой является исследование механизмов внутриклеточной кальциевой сигнализации в миобластах на стадии пролиферации и во время дифференцировки.

Фундаментальное значение этой работы состоит в обнаружении новых сигнальных путей на стадии пролиферации миобластов и описании их изменений в процессе дифференцировки.

Результаты работы могут быть использованы при чтении курсов лекций по клеточной биологии и биологии развития, а также учитываться в биомедицинских исследованиях при решении задач, связанных с патологиями, которые вызваны нарушениями механизмов кальциевой сигнализации и клеточной пролиферации.

Цели и задачи исследования

Целью работы было изучение механизмов кальциевой сигнализации, как в пролиферирующих, так и в дифференцирующихся миобластах. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить особенности регуляции кальциевой сигнализации, вызывающей высвобождение ионов Са2+ внутриклеточных депо, в пролиферирующих и в дифференцирующихся миобластах.

2. Выяснить механизмы регуляции кальциевой сигнализации в пролиферирующих миобластах: выявить активатор поступления Са в цитоплазму этих клеток, а также рецепторы, на которые он воздействует; охарактеризовать каналы, через которые Са2+ поступает в цитоплазму клеток, а также исследовать механизм передачи сигнала от рецептора к каналу.

3. Установить особенности внутриклеточной кальциевой сигнализации, связанные с адренергическими рецепторами в пролиферирующих и дифференцирующихся миобластах.

4. Для установления специфичности потенциалзависимых кальциевых каналов в миобластах определить уровень экспрессии генов СаспаЬ, СаспаМ, Саспа1с и Саспа1/, кодирующих синтез каналообразующих субъединиц Са -каналов Ь-типа.

Научная новизна и теоретическая значимость работы

Впервые описаны особенности внутриклеточной кальциевой сигнализации в пролиферирующих и дифференцирующихся миобластах. Показано, что в пролиферирующих миобластах система, регулирующая концентрацию

Са2+ в цитоплазме путем высвобождения этих ионов из внутриклеточных депо, практически не функционирует, а ее формирование происходит в течение первых нескольких часов дифференцировки. Установлено, что поступление Са в цитоплазму пролиферирующих миобластов осуществляется через потенциалзависимые Са -каналы Ь-типа. Эти каналы играют ключевую роль в регуляции концентрации Са2+ в цитоплазме пролиферирующих миобластов. Механизм регуляции поступления Са включает в себя активацию [32-адренергических рецепторов, участие аденилатциклазы и вход Са2+ через потенциалзависимые Са -каналы Ь-типа. Показано, что после перехода клеток в состояние дифференцировки основным механизмом в регуляции концентрации Са в цитоплазме является высвобождение внутриклеточных запасов этих ионов. Впервые описано изменение уровней экспрессии отдельных субъединиц потенциалзависимых

Са2+

-каналов Ь-типа в миобластах в процессе их

2+ дифференцировки. Обнаружена нейрональная форма Са -канала Ь-типа Сау1.3 в пролиферирующих миобластах.

Результаты работы могут быть использованы при чтении курсов лекций по клеточной биологии и биологии развития, а также учитываться в биомедицинских исследованиях при решении задач, связанных с патологиями, которые вызваны нарушениями кальциевой сигнализации и клеточной пролиферации.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Красный, Алексей Михайлович

Выводы

1. В пролиферирующих миобластах линии С2С12 мыши система кальциевой сигнализации, регулирующая концентрацию Са2+ в цитоплазме путем опустошения внутриклеточных депо этих ионов, практически не функционирует. Регулируемые АТФ запасы Са2+ в этих клетках незначительны.

2. В пролиферирующих миобластах поступление Са в цитоплазму регулируется адреналином через р2"аДренергические рецепторы и происходит через потенциалзависимые кальциевые каналы Ь-типа Сау1.3.

3. Передача сигнала внутриклеточной кальциевой сигнализации происходит по цАМФ-зависимому пути.

4. Формирование системы кальциевой сигнализации, регулирующей концентрацию Са2+ в цитоплазме путем опустошения запасов внутриклеточных депо, происходит на начальных этапах дифференцировки миобластов (в течение 8-10 час после переноса клеток в среду дифференцировки).

5. В дифференцирующихся миобластах поступление Са2+ при активации адренергической системы существенно ниже по сравнению с пролиферирующими клетками.

6. В процессе дифференцировки миобластов значительно возрастает уровень экспрессии гена СаспаЬ, который кодирует синтез специфической субъединицы с^Б, тогда как уровень экспрессии каналообразующей субъединицы СаспаЫ, кодирующей синтез субъединицы о^О, заметно снижается.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Красный, Алексей Михайлович, Москва

1. Авдонин П.В., Ткачук В.А. Рецепторы и внутриклеточный кальций. М., Наука. 1994. 288 с.

2. Авдонин П.В., Суханова И.Ф., Сурков К.В., Ruegg U.T. Экспрессия и функциональная роль белка Orai-1 в скелетных миобластах и миотубулах//Биол. мембраны. 2008. Т. 25. С. 472-479.

3. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., и др. Молекулярная биология клетки, 2 изд. М. Мир. 1994. 346 с.

4. Болдырев А. А., Кяйвяряйнен Е. К, Илюш В. А. Биомембранология. Петрозаводск. КарНЦ РАН. 2006. 225с.

5. Зинченко В. П., Долгачева Л.П. Внутриклеточная сигнализация. Пущино Эл. изд. Аналитическая микроскопия. 2003. 84с.

6. Крутецкая 3. К, Лебедев О. Е., Курилова Л. С. Механизмы внутриклеточной сигнализации: Монография. СПб. Изд-во С. Петерб. Ун-та. 2003. 208с.

7. Arnaudeau S., Holzer N., Konig S., Bader C. R., Bernheim L. Calcium sources used by post-natal human myoblasts during initial differentiation // J. Cell. Physiol. 2006. V. 208. P. 435-445.

8. AhlquistR. P., A study of the adrenotropic receptors 11 Am J Physiol 1948. V. 153. P. 586-600.

9. Alderton J. M., Steinhardt R. A. How calcium influx through calcium leak channels is responsible for the elevated levels of calcium-dependent proteolysis in dystrophic myotubes // Trends Cardiovasc Med. 2000.T. 10. № 6. C. 268-72.

10. Brennesvik E. 0., Ktori C., Ruzzin J., Jebens E., Shepherd P.R., Jensen J. Adrenaline potentiates insulin-stimulated PKB activation via cAMP and Epac: implications for cross talk between insulin and adrenaline // Cell Signal. 2005. V.17. P.1551-1559.

11. Beitzel F., Gregorevic P., RyallJ., Plant D. R., Sillence M. N., Lynch G. S. (32-Adrenoceptor agonist fenoterol enhances functional repair of regenerating rat skeletal muscle after injury // J Appl Physiol. 2004. V. 96: P. 1385-1392.

12. Berridge M. J., Irvine R. F. Inositol phosphates and cell signalling // Nature. 1989. V. 341. P. 197-205.

13. Berridge M. J. Inositol trisphosphate and calcium signaling. Nature. 1993. V. 361. P. 315-325.

14. Bootman M. D., Berridge M. J., Lipp P. Cooking with calcium: the recipes for composing global signals from elementary events. Cell. 1997. V. 91. P. 367373.

15. Baylor S. M., Hollingworth S. Measurement and interpretation of cytoplasmic Ca signals from calcium-indicator dyes // News Physiol. Sci. 2000. V. 15: P. 19-26.

16. Bezprozvanny I., Ehrlich B. E. Inositol (l,4,5)-trisphosphate (lnsP3)-gated

17. Ca channels from cerebellum: conduction properties for divalent cations and regulation by intraluminal calcium.//J. Gen. Physiol. 1994.V.104. P. 521-568.

18. Cornell R., MacLennan D. H., Independent synthesis of phospholipid and the intrinsic proteins of the sarcoplasmic reticulum // J Biol Chem. 1985. V. 260. № 2. P. 1290-1295.9+

19. Chen Z, Li Z, Peng G., et al. Extracellular ATP-induced nuclear Ca transient is mediated by inositol 1,4,5-trisphosphate receptors in mouse pancreatic beta-cells // Biochem Biophys Res Commun. 2009. V. 382. P. 381384.

20. Duranti G., La Rosa P., Dimauro I. et al. Effects of Salmeterol on Skeletal Muscle Cells: Metabolic and Pro-Apoptotic Features // Med Sci Sports Exerc. 2011. V. 4.

21. DeLisle S., Marksberry E. W., Bonnett C. et al. Adenophostin A can stimulate94. • 94

22. Ca influx without depleting the inositol 1.4,5-trisphosphate-sensitive Ca stores in the Xenopus oocyte //J. Biol Chem. 1997. V. 272. P. 9956-9961.

23. Darbellay B., Arnaudeau S., Konig S. et al. STIM1- and Orail-dependent store-operated calcium entry regulates human myoblast differentiation // J Biol Chem. 2009. V. 284. P. 5370-5380.

24. Feske S., Gwack Y., Prakriya M. et al. A mutation in Orail causes immune deficiency by abrogating CRAC channel function // Nature. 2006. V. 441. P. 179-185.

25. Galvan D. L., Borrego-Diaz E., Perez P. et al Subunit oligomerization, and topology of the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor// J. Biol. Chem. 1999. V. 274.29483-29492.

26. Grynkiewicz G., Poenie M., Tsien R. A new generation of Cal" indicators with greatly improved fluorescence properties // J. Biol. Chem. 1985. V. 260. p. 3440-3450.

27. Gukovskaya A. S., Zinchenko V.P. Mechanisms of receptor mediated generation of ionic signals in rat thymocytes and Ehrlich ascites tumour cells f/Phys. Chem. Biol. 1990. V. 10. P. 1—98.

28. Hinkle R., Hodge K., Cody D. et al. Skeletal muscle hypertrophy and anti-atrophy effects of clenbuterol are mediated by the p2-adrenergic receptor. // Muscle Nerve. 2002. V. 25. P. 729-734.

29. Konig, S., Beguet, A., Bader, C. R., andBernheim, L. The calcineurin pathway links hyperpolarization (Kir2.1)-induced Ca2+ signals to human myoblast differentiation and fusion // Development 2006. V. 133. P. 3107-3114.

30. Kao J. Practical aspects of measuring Ca ., with fluorescent indicators // Methods in cell biology. 1994.V. 40. P. 155-181.

31. Liu J.H., Konig S., Michel M. et al. Acceleration of human myoblast fusion by depolarization: graded Ca2+ signals involved // Development. 2003. V. 130. P. 3437-3446.

32. Lynch G. S., SchertzerJ. D., Ryall J. G. Therapeutic approaches for muscle wasting disorders // Pharmacol Ther. 2007. P. 113. V. 461-487.

33. Liou J., Kim M. L,, Heo W. D., et al, STIM is a Ca sensor essential for Ca -store-depletion-triggered Ca2+ influx// CurrBiol. 2005. V. 15. P. 1235-1241.

34. Lee S. J., Lee Y. H., Kim Y. S. et al Transcriptional regulation of phospholipase C-gamma 1 gene during muscle differentiation // Biochem Biophys Res Commun. 1995. V. 206. P. 194-200.

35. MacLennon D. H., Rice W. J., Green N. M. The mechanism of Ca transportiby sarco(endo) plasmic reticulum Ca -ATPases // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 28815-28818.

36. MacLennon D. H. Ca2+ signalling and muscle disease // Eur J Biochem. 2000. V. 267. P. 5291-5297.

37. Marshall I., Taylor C. W. Regulation of inositol 1,4,5-trisphosphate receptors //J. Exp. Biol. 1993. V. 184. P. 161-182.

38. MendellJ., Campbell K, Rodino-Klapac L. et al. Dystrophin immunity in Duchenne's muscular dystrophy// N Engl J Med. 2010. V.363. P.1429-1437.

39. Mignery G. A., SudhofT. C. The ligand binding site and transduction mechanism in the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor // EMBO J. 1990. V. 9. P. 3893-3898.

40. Marks A. R. Intracellular calcium-release channels: regulators of cell life and death // Amer. J. Physiol. 1997. V. 272. P. 597- 605.

41. Missiaen L, De SmedtH., Droogmans G. and Casteels R. Ca2+ release induced by inositol-l,4,5-trisphosphate is a steady-state phenomenon controlled by luminal Ca2+ in permeabilized cells //Nature. 1992. V. 3570. P. 599-602.

42. Missiaen .L, Taylor C. W, Berridge M. J. Spontaneous calcium release from inositol trisphosphate-sensitive calcium stores ///Nature. 1991. V. 352. P. 241-244

43. Mercer J. C., Dehaven W. I., Smyth J. Large store-operated calcium selective currents due to co-expression of Orail or 0rai2 with the intracellular calcium sensor, Stiml // J Biol Chem 2006. V.281. P. 24979-24990.

44. Martonosi A., Roufa D., Ha D. B.,and Boland R. The biosynthesis of sarcoplasmic reticulum // Fed Proc. 1980. V.39. P. 2415-21.

45. Naro F., De Arcangelis V., Coletti D. Increase in cytosolic Ca induced by elevation of extracellular Ca2+ in skeletal myogenic cells // J Physiol Cell Physiol. 2003. V. 284. P. 969 976.

46. Nilius B., Owsianik G., Voets T. and Peters J. A. Transient receptor potential cation channels in disease // Physiol Rev. 2007. V. 87. P. 165-217.

47. Navarro J. Dihydropyridine methyl-3H.PN 200-110 binding and myogenesis in intact muscle cells in vitro // J. Neurochem. 1986. V. 46.P.1166-1179

48. Opas M., Dziak E., Fliegel L. and Michalak M. Calcium regulation of skeletal myogenesis. II. Extracellular and cell surface effects // Cell Calcium. 1994. V. 15. P. 132-42.

49. Oestr-eich E. A., Malik S., Goonasekera S. A. Epac and phospholipase Cepsilon regulate Ca2+ release in the heart by activation of protein kinase Cepsilon and calcium-calmodulin kinase II // J Biol Chem. 2009. V. 284. P. 1514-1522.

50. Peinelt C., VigM., Koomoa D. L. et al. Amplification of CRAC current by STIM1 and CRACM1 (Orail) //Nat Cell Biol. 2006. V.8. P. 771-773.

51. Pinset C., Whalen R. G. Manipulation of medium conditions and differentiation in the rat myogenic cell line L6. Dev. Biol. 1984. V. 102. P. 269-277.

52. Powell J. A., Molgo J., Adams D. S., et al. IP3 receptors and associated Ca signals localize to satellite cells and to components of the neuromuscular junction in skeletal muscle // J Neurosci. 2003. V. 23. P. 8185-8192.

53. Pearen M. A., Ryall J. G., Lynch G. S. et al. Expression profiling of skeletal muscle following acute and chronic beta2-adrenergic stimulation: implications for hypertrophy, metabolism and circadian rhythm. // BMC Genomics. 2009. V.10. P. 448.

54. Rockman H. A., Koch W. J., Lefkowitz R. J. Seven-transmembrane-spanning receptors and heart function //Nature. 2002. V. 415. P. 206-212.

55. Roos J, DiGregorio P. J., Yeromin A. V. STIM1 an essential and conserved component of store-operated Ca2+ channel function // J Cell Biol. 2005.V.169. p. 435-445.

56. Sham J. S., Jones L. R., Morad M. Phospholamban mediates the P-adrenergic-enhanced Ca uptake in mammalian ventricular myocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol 261: 1344-1349,1991.

57. Supattapone S., WorleyP. F., BarabanJ. M, Snyder S. H. Solubilization, purification and characterization of an inositol trisphosphate receptor// J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 1530-1534.

58. SoboloffJ., Spassova M. A., TangX. Orail and STIM reconstitute store-operated calcium channel function // J Biol Chem 2006. V. 281. P. 2066120665.

59. SchmidA., RenaudJ. F., Fosset M., MeataJ. P. an, Lazdunski M. The nitrendipine-sensitive Ca2+ channel in chick muscle cells and its appearance during myogenesis in vitro and in vivo // J Biol Chem. 1984. V. 259. P. 11366-11372.

60. Stokes L., Gordon J., Grafton G. Non-voltage-gated L-type Ca2+ channels in human T cells: pharmacology and molecular characterization of the major alpha pore-forming and auxiliary beta-subunits // J. Biol. Chem. 2004.V. 279. P. 19566-19573.

61. Shin D.H., Lee K.S., Lee E. et al. Pax-7 immunoreactivity in the post-natal chicken central nervous system // Anat Histol Embryol. 2003. V. 32. P. 378383.

62. Suh P. G., Park J. I., ManzoliL., et al. Multiple roles of phosphoinositide-specific phospholipase C isozymes // BMB Rep. 2008. V. 41. P. 415-434.

63. Tsien R. Y., Pozzan T., Rink T. J. Measuring and manipulating cytosolic Ca with trapped indicators // Trends Biochem. Sci. 1984. V. 9. P. 263-266.

64. Takahashi A., Camacho P., LechleiterJ. D., et al. Measurement of intracellular calcium. Physiol. Rev. 1999. V.79. V.1089-1125.

65. Takeshima H., Nishimura S., Matsumoto T. Primary structure and expression from complementary DNA of skeletal muscle ryanodine receptor // Nature. 1989. V. 339. P. 439-445.

66. Varadi G., OrlowskiJ., Schwartz A. Developmental regulation of expression of the alpha 1 and alpha 2 subunits mRNAs of the voltage-dependent calcium channel in a differentiating myogenic cell line // FEBS Lett 1989. V. 250. P. 515-518.

67. VigM, Peinelt C, Beck A, et al. CRACM1 is a plasma membrane protein essential for store-operated Ca2+ entry // Science. 2006.V. 312. P1220-1223.

68. Worley P.F., Zeng W., Huang G. N., et al. TRPC channels as STIM1-regulated store-operated channels // Cell Calcium. 2007. V. 42. P. 205-211.

69. Xiao R. P., Avdonin P, Zhou Y. Y. et. al. Coupling of p2-adrenoceptor to Gi proteins and its physiological relevance in murine cardiac myocytes // Circ Res. 1999. V. 84. C. 43-52.

70. Xiao R. P., Cheng H., Zhou Y. Y. et al. Recent advances in cardiac 02-adrenergic signal transduction. Circ Res 85: 1092-1100, 1999.

71. Xiao R. P., Hohl C., Altschuld R. et al (32-Adrenergic receptor-stimulated increase in cAMP in rat heart cells is not coupled to changes in Ca dynamics, contractility, or phospholamban phosphorylation. J Biol Chem 269: 19151-19156, 1994.

72. XiaS. L., WangL., CashM. N. etal. Extracellular ATP-induced calcium signaling in mIMCD-3 cells requires both P2X and P2Y purinoceptors //Am J Physiol Renal Physiol. 2004.V. 287. P. 204-214.

73. Zhang S. L., YerominA. V., Zhang X. H. etal. Genome-wide RNAi screen of Ca2+ influx identifies genes that regulate Ca2+ release-activated Ca2+ channel activity // PNAS 2006. V. 103. C. 9357-9362.