Протеомное исследование белков культивируемых мышечных и эпителиальных клеток человека

Макаров, Андрей Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Протеомное исследование белков культивируемых мышечных и эпителиальных клеток человека
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Протеомное исследование белков культивируемых мышечных и эпителиальных клеток человека"

На правах рукописи

00346907Б

МАКАРОВ Андрей Александрович

ПРОТЕОМНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ БЕЛКОВ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ МЫШЕЧНЫХ И ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 4

Москва 2009

003469076

Работа выполнена в лаборатории биомедицинских исследований Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Л.И.Ковалев.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Д.И.Левицкий.

доктор биологических наук, профессор

С.П.Сяткин.

Ведущая организация:

ГУ Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича Российской академии медицинских наук.

Защита состоится « 2 Ь » 2009 года в 14 часов на заседании

диссертационного совета Д 002.247.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан «£.? » аи2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одним из актуальных направлений современной науки является изучение пролиферации и дифференцировки клеток, так как эти процессы определяют ход роста, развития и регенерации различных тканей и органов. Рост, регенерация и гипертрофия скелетной мускулатуры происходят в результате пролиферации и дифференцировки сателлитных клеток [Goldring et al., 2002; Charge, Rudnicki, 2004; Dhawan, Rando, 2005]. Экспериментальное изучение молекулярных механизмов, вовлеченных в протекание указанных биологических процессов, является важной задачей современной биомедицинской науки, так как позволяет выработать новые подходы к диагностике, профилактике и лечению ряда распространенных и социально значимых заболеваний. Завершение в 2001 году проекта «Геном человека» позволило достигнуть качественно нового уровня исследования молекулярных механизмов функционирования клетки за счет сочетания традиционных биохимических методов с рядом подходов, разработанных в рамках геномных и постгеномных дисциплин [Anderson, Anderson, 1998; Арчаков, 2000; Говорун, Арчаков, 2002; Шишкин, 2002; Шишкин и др., 2004]. Так, сочетание традиционных электрофоретических и хроматографических методов фракционирования белков с их идентификацией методами масс-спектрометрии позволяет существенно расширить возможности изучения белкового состава различных биологических объектов [Tomlinson et al., 2001; Koomen et al., 2005; Chen et al., 2006; Doran et al., 2007]. Использование нормальных и опухолевых культивируемых клеток человека в качестве экспериментальной модели для изучения процессов дифференцировки и злокачественного перерождения позволяет приблизиться к пониманию молекулярных механизмов указанных процессов в организме человека, не сталкиваясь с разнообразными трудностями (в том числе и этическими), неизбежно возникающими при постановке соответствующих экспериментов на животных или человеке.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлось изучение протеомными технологиями особенностей белкового состава

миобластов человека, культивируемых в условиях, обеспечивающих пролиферацию и индуцирующих дифференцировку, а также выяснение возможного участия отдельных белков в этих процессах и при опухолевой трансформации на примере злокачественных клеток мышечного и эпителиального происхождения.

В соответствии с целью исследования в работе решались следующие задачи:

1. Провести сравнительный протеомный анализ белков пролиферирующих и дифференцирующихся миобластов человека, направленный на выявление и идентификацию белков, изменяющихся в ходе дифференцировки.

2. Сопоставить результаты протеомного анализа идентифицированных белков миобластов человека с материалами баз данных N0131 и Зулзз-Рго!:.

3. Изучить различия белкового состава пролиферирующих нормальных миобластов человека и некоторых культивируемых опухолевых клеток мышечного и эпителиального происхождения с целью идентификации потенциальных онкомаркеров.

4. Оптимизировать клеточную тест-систему, использующую в качестве тест-объекта культивируемые миобласты человека, для определения эффектов биологически активных соединений, подавляющих пролиферацию клеток.

Научная новизна работы. Получены новые данные об особенностях белкового состава пролиферирующих и дифференцирующихся культивируемых миобластов человека. В культивируемых миобластах человека обнаружено 3 новых белка.

Для 40 аминокислотных конфликтов в 12 белках культивируемых мышечных клеток человека подтверждена достоверность определения одного из вариантов аминокислотной последовательности.

Использование культивируемых опухолевых клеток человека позволило уточнить специфичность некоторых потенциальных онкомаркеров. В частности, показано присутствие белка AGR2, рассматриваемого в качестве перспективного онкомаркера, в культивируемых клетках рака предстательной железы, но не в культивируемых клетках мышечного происхождения.

Оптимизация клеточной тест-системы (в частности, использование бессывороточного контроля) позволила использовать ее для тестирования ростовых факторов, не только стимулирующих, но и подавляющих пролиферацию культивируемых миобластов человека.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Протеомными технологиями изучен белковый состав культивируемых миобластов человека на разных этапах дифференцировки; при этом идентифицировано 42 белковых фракции (в том числе 13 фракций, количество которых меняется в ходе дифференцировки) и три новых белка.

2. Подтверждено существование по одному из вариантов для 40 расчетных «конфликтных» определений в аминокислотных последовательностях 12 идентифицированных белков культивируемых мышечных клеток человека.

3. Проведенный сравнительный протеомный анализ белков нормальных миобластов человека и некоторых опухолевых культивируемых клеток мышечного и эпителиального происхождения позволил выявить ряд белков, потенциально вовлеченных в процессы опухолевой трансформации.

Апробация работы. Материалы данной работы докладывались на международных и российских конференциях, симпозиумах и школах, в том числе на Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре» (2006 г., Санкт-Петербург), Международном симпозиуме «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии» (2007 г., г.Дубна), 2-м съезде Общества клеточной биологии (2007 г., Санкт-Петербург), 6-й Парнасовской

конференции «Molecular Mechanism of Cellular Signaling» (2007 г., Польша, Г.Краков), 32-м Конгрессе Федерации европейских биохимических обществ (2007 г., Австрия, г.Вена), Летней школе «Hottest Topics in Protein Research» (2008 г., Хорватия, г.Сплит), Европейском мышечном конгрессе (2008 г., Великобритания, г.Оксфорд), Европейском симпозиуме по кальций-связывающим белкам (2008 г., Бельгия, гЛевен), Школе молодых ученых «Методы культивирования клеток» (2008 г., Санкт-Петербург), Совещании «Muscle regeneration and Stem Cells: a multiorganismic approach» (2008 г., Польша, г.Неполомице) и др. Работа была отмечена присуждением стипендии им. члена-корреспондента РАН B.JI. Кретовича на 2008 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 научных работ (из них 5 в зарубежной печати), включая 6 статей в профильных рецензируемых российских и международных журналах, 3 статьи в сборниках и 8 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на (¿»¿страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка используемой литературы (loo наименований) и двух приложений. Работа содержит 3 таблиц и 26 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Использовались скелетномышечные миобласты человека (предоставлены к.б.н. Т.Б.Крохиной), фибробласты человека (предоставлены к.б.н. В.С.Ахуновым), клетки рака предстательной железы человека (предоставлены д.б.н. И.Г. Шемякиным), а также культивируемые клетки рабдомиосаркомы человека (приобретены в НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН). Клетки культивировались в среде F-12 (миобласты), DMEM (фибробласты и клетки рабдомиосаркомы) или RPMI-1640 (клетки рака предстательной железы) производства фирмы «ПанЭко». Среды содержали Hepes, пируват натрия, гентамицин и 12,5%

эмбриональной телячьей сыворотки (ПанЭко, Россия). Микрофотографирование клеток проводилось при помощи микроскопа с цифровой фотонасадкой.

Дифференцировку миобластов индуцировали культивированием в дифференцировочной среде, содержащей 2% лошадиной сыворотки со сменой среды каждые 2 суток.

Для тестирования биологических эффектов различных веществ миобласты человека высевались на 96-луночные культуральные планшеты и инкубировались 2 суток в бессывороточной среде. Затем в соответствующие лунки с клетками добавлялись растворы исследуемого препарата в культуральной среде с 3% эмбриональной телячьей сыворотки и инкубировались с ними в течение 3 суток, после чего проводилась фиксация клеток 10% раствором формалина и окраска 0,25% раствором красителя кристаллического фиолетового в 4% этаноле. Планшеты отмывались дистиллированной водой, связанный клетками краситель элюировался 50% этанолом. Поглощение света с длиной волны 595 нм, соответствующее пику поглощения генцианвиолета, измерялось с помощью планшетного спектрофотометра. Препараты рекомбинантных миостатина и механозависимого ростового фактора были предоставлены д.б.н. А.Б.Шевелевым.

Приготовление образцов клеток, предназначенных для последующего электрофореза белков, проводилось следующим образом. Клетки механически снимали с поверхности матрасов, предварительно проинкубировав в среде без сыворотки в течение часа при температуре 4°С (с целью отмыть адсорбированные на поверхности клеток белки сыворотки, входящей в состав культуральной среды). Полученные препараты клеток до проведения протеомного анализа хранили при температуре -70 °С.

Фракционирование белков проводилось методом двумерного электрофореза по О'Фарреллу в модификации Ковалева [Kovalyov et al., 1995]. Образцы, содержащие 5-6 миллионов клеток, гомогенизировали 3-5 мин в 200

мкл 9М раствора мочевины, содержащего 5% меркаптоэтанола, 2% тритона X-100, 2% амфолинов pH 3,5 - 10 (Sigma, США). Гомогенат осветляли центрифугированием, после чего образцы (по 100 мкл экстракта) фракционировали двумерным электрофорезом по О'Фарреллу. Фракционирование в первом направлении представляло собой изоэлектрофокусирование в стеклянных трубках, заполненных 4% полиакриламидным гелем (ПААГ), приготовленном на 9М растворе мочевины, содержащем 2% тритона Х-100 и 2% смеси амфолинов с pH 5-7 и 3,5-10 в соотношении 4:1. Затем колонки ПААГ с разделенными в ходе изоэлектрофокусирования белками использовали в качестве стартовой зоны при фракционировании во втором направлении, которое проводили пластинах ПААГ с линейным градиентом концентрации акриламида 7,5-20% в присутствии 0,1% SDS.

Для визуализации белковых пятен гели окрашивались красителем Кумасси голубым R-250 и азотнокислым серебром. Денситометрию анализируемых фрагментов двумерных электрофореграмм проводили с использованием пакета программ Melanie 3 («GeneBio», Швейцария).

Идентификация белковых фракций методом MALDI-TOF масс-спектрометрии проводилась на базе Центра протеомных исследований при Институте биомедицинской химии им. В.Н.Ореховича РАМН как описано ранее [Говорун и др., 2003]. Представляющие интерес белковые пятна вырезались из гелей и подвергались трипсинолизу. Масс-спектры триптических пептидов получали на масс-спектрометре Ultraflex («Bruker», Германия) с УФ-лазером (336 нм) в режиме положительных ионов в диапазоне масс 500-8000 Да. Для идентификации белков полученные масс-спектры анализировали с помощью программы Mascot (Matrixscience, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Исследование белкового состава культивируемых миобластов человека на разных сроках дифференцировки.

При культивировании в ростовой среде миобласты представляли собой фибробластоподобные одноядерные клетки и активно пролиферировали. Достигшие монослоя клетки инкубировались в среде, индуцировавшей их дифференцировку, проявляющуюся в выходе клеток из клеточного цикла и слиянии части их с образованием многоядерных миотуб (рис. 1).

Рисунок 1. Культивируемые миобласты человека. Окраска - кристаллический фиолетовый. Слева - одноядерные миобласты, справа - миобласты, дифференцирующиеся в многоядерные миотубы.

На типичных двумерных электрофореграммах белков миобластов человека при окраске азотнокислым серебром регистрировалось более 500 белковых фракций с молекулярной массой 8 - 200 кДа и изоэлектрической точкой 4,5 -11,0 (рис. 2). Сорок две белковые фракции были идентифицированы с использованием методов времяпролетной и, в некоторых случаях, тандемной масс-спектрометрии. Сравнение двумерных электрофореграмм недифференцированных и дифференцирующихся миобластов показало, что представленность ряда белковых фракций зависит от срока инкубации в дифференцировочной среде, при том, что большинство белков сохраняли свое количественное соотношение во всех исследованных образцах. В соответствии со стратегией протеомных исследований [Шишкин и др., 2004] были идентифицированы 29 «постоянных» (количество которых не претерпевало существенных изменений при дифференцировке) белков (табл. 1).

5,0 7.0 9.5 р1

Рисунок 2. Обзорная двумерная электрофореграмма белков пролиферирующих миобластов человека. Цифрами обозначены идентифицированные белковые фракции (номера соответствуют табл. 1 и 2).

Таблица 1. «Постоянные» белки, идентифицированные на двумерных электрофореграммах в недифференцированных и дифференцирующихся миобластах человека.

№ Название белка № в базе данных ЫСВ1 % перекрытия Мол. масса, кДа/р!

экспериментальные расчетные

1 2 3 4 5 6 ■

1 Комплекс тяжелых и легких цепей ферритина* 47125326 182516 40 41 450,0/5,07 26,2/6,04 16,4/5,65

2 а2-коллаген 1 типа 32451581 18 165,0/5,35 129,3/9,08

3 Неизвестный белок 62702215 47 58,0/7,90 58,8/8,88

4 Винкулин, изоформа УСЬ 24657579 18 120,0/5,30 116,7/5,83

5 Белок МШР1 38014595 33 87,0/4,75 73,6/4,91

6 Белок теплового шока, изоформа 5 (70 кДа) 16507237 50 74,0/4,72 72,3/5,07 _

1 2 3 4 5 6

7 Белок теплового шока изоформа 9В (70 кДа) 24234688 31 72,5/5,33 73,6/5,87

8 а-АТФ-синтаза митохондриальная 30583257 55 56,0/6,60 59,7/9,16

. 9 Коллаген-связывающий белок, изоформа 2 1199487 32 45,5/8,35 46,5/8,89

. ю Р-актин 15277503 54 40,0/4,75 40,2/5,55

И Ассоциированный белок 1 рецептора липопротеинов низкой плотности 4505021 33 40,0/8,70 41,4/8,73

12 Продукт гена PIG 14 33090237 37 39,5/ 8,72 46,4/8,75

13 Фосфоглицераткиназа 1 4505763 44 39,0/7,70 44,6/8,30

14 Аннексии А1 54696696 49 35,0/6,62 38,7/6,57

15 Глицеральдегид-З -фосфатдегидрогеназа 31645 70 35,5/8,40 36,0/8,27

16 Р-тропомиозин, изоформа 2 15079982 33 33,0/4,6 33,0/4,63

17 Аннексии 2, изоформа 2 62896643 57 32,7/6,50 38,6/7,57

18 Смесь изоформы 7 а-тропомиозина и фибробластной изоформы у-тропомиозина 63252906 88928 18 25 32,5/4,64 32,8/4,71 32,8/4,72

19 Маинозо-связывающий лектин 2 16878112 21 32,5/6,40 40,2/6,46

20 Порин 31 НМ 238427 60 30,5/6,75 30,6/8,63

21 8-тропомиозин 45501027 28 30,0/4,62 28,5/4,67

■ 22 у-тропомиозин, изоформа 2 24119203 33 29,5/4,70 29,0/4,75

23 Трансгелин 55637017 72 22,0/7,00 22,6/8,87

24 Циклофилин В, цепь А (пептидилпролил изомераза В) 1310882 70 19,5/9,80 19,6/9,18

25 S100A10 49457320 38 11,0/6,82 11,2/6,82

29 ER-60 протеаза (дисульфид изомераза) 1208427 65 57,0/6,12 56,7/5,98

30 Енолаза 1 4503571 68 47,0/6,57 47,2/7,01

31 Виментин 37852 69 56,0/5,30 53,7/5,06

35 Триозофосфатизомераза 1 4507645 31 26,0/6,40 26,7/6,45

* Данные белковые фракции, вероятно, представляют собой устойчивые олигомерные

комплексы, возможно, стабилизирование поперечными ковалентными связями.

Участок полипептидной цепи Мол. масса, Да Аминокислотная последовательность пептида Модификации*

Экспериментальная Расчетная

6 - 13 805.43 804.42 УСУ^ЯСК

28 - 55 3324.60 3323.55 УО^АШОРРтЬМУМУУМРОУОБТНСК М

28 - 55 3340.61 3339.55 У01УАШ0РРГОиЧУМУУМРС>У05ТНСК 2М

67 - 80 1613.86 1612.89 1Л/Ш6ЫР1Т1Р0ЕК

67 - 84 2041.08 2040.10 ОЛЫбМРГПРОЕЯОРБК

85 - 107 2534.18 2533.20 ЖМ/СРАСАЕУУУЕБТСУРТТМЕК М

87 - 107 2277.05 2276.03 \«СОАСАЕУУУЕЗТСУРТТМЕК

87 - 107 2293.05 2292.03 М/СОАСАЕУУУЕБТСУПТМЕК М

108 - 117 909.50 908.48 А6АН1_0ССАК

118 - 139 2369.21 2368.20 ЯУПЗАРЗАРАРМРУМСУЫНЕК

118 - 139 2385.22 2384.20 (гУИЗАРБАРАРМРУМбУШЕК М

118 - 139 2401.21 2400.19 (*УН5АР5АОАРМРУМСУ1ЧНЕК 2М

119 - 139 2213.13 2212.10 УПЗАРБАРАРМРУМСУМНЕК

119 - 139 2229.12 2228.10 УИБАРЗАйАРМРУМСУМНЕК М

119 - 139 2245.11 2244.09 УН5АР5А0АРМРУМ6У1\1НЕК 2М

119 - 145 2949.43 2948.44 УИЗАРБАРАРМРУМСУЫНЕКУОМБи М

119 - 145 2965.43 2964.44 УИБАРБАРАРМРУМбУМНЕКУОИЗ!-« 2М

146 - 162 1861.98 1860.94 И5ЫА5СТТЫа_АР1_АК 2С

163 - 186 2595.34 2594.35 У1НРМРС1УЕС1_МТТУНА1ТАТ(Ж

163 - 186 2611.36 2610.35 У1НРМРС1УЕС1-МТТУНА1ТАТ(5К М

201 - 215 1411.81 1410.78 СА1_ОГдПРА5ТСААК

220 - 227 870.51 869.49 У1РЕ1_РСК

220 - 234 1662.90 1661.88 У1РЕ1_ОСК1.ТСМАРК м

228 - 234 811.41 810.41 иСМАРй м

235 - 248 1544.84 1543.80 УРТАМУБУУРиа* с

235 - 254 2211.10 2210.21 УРТАМУБУУРиПЖЕКРАК с

264 - 271 829.43 828.43 ОАБЕСРЦ<

310 - 323 1763.80 1762.80 1Л5\Л/УР1\|ЕРСУ5т

324 - 335 1330.71 1329.64 УУРСМАНМАБКЕ

324 - 335 1346.66 1345.64 УУР1_МАНМА5КЕ М

324 - 335 1362.68 1361.63 УУ01-МАНМА5КЕ 2М ■

*М - окисление остатка метионина, С - пропионилирование остатка цистеина.

1 МСКУКУСтаС ЕЧЗ£1СНЬУТН ААРИЗОКУР! УАШРРРЮ!» ШНУТУУМРОУР 51 §ТН§КРНСТУ КАЕШКЬУШ СНР1Т1Р0ЕН РРЭКТ^дРА вАЕУУУЕБТО 101 УРТТМЕКАСА НЬОСаАКНУ! ХБАРЭДРАРМ РУЖ?УШЕКУ РЫЗЬКНЭНА 151 БСТТЖХАРЬ АКУИГОКтеО! УЕйЬМТТУНА ХТАТОКТУРО РЭСКШИВСЯ 201 СЛЬОНИРАЭ ТСААКАУОКУ ТРЕЪРСКЬТС МАРИУРТАКУ БУУРЪТСЕЪЕ 251 КРАКУРРТКК УУК0А§ЕСТ1, КС1ЬОУТЕН0 УУЗБРРЫБРТ НБЗТРБАСАС-301 1АШРНРУКЪ ТБИУРМЕРСУ ЗННУУРЬМАН МАЗКЕ

Рисунок 3. Результаты масс-спектрометрической идентификации глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. Сверху - список триптических пептидов, обнаруженных при масс-спектрометрии. Снизу - перекрытие аминокислотной последовательности ГФДГ и обнаруженных пептидов. Последовательности пептидов выделены жирным шрифтом и подчеркнуты.

К ним относились глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа (ГФДГ), винкулин, митохондриальная АТФ-синтетаза, фосфоглицераткиназа, а также ряд изоформ тропомиозинов, аннексинов и белков теплового шока.

Результаты идентификации глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы представлены на рис. 3.

Сравнительный протеомный анализ белков в пролиферирующих и дифференцирующихся миобластах позволил выявить и идентифицировать 11 белков, количество которых значительно уменьшалось в процессе дифференцировки, и 2 белка, отсутствовавших в пролиферирующих, но обнаруженных в дифференцирующихся миобластах. Результаты их идентификации представлены в табл. 2.

Таблица 2. Идентифицированные белки, количество которых изменяется в ходе

дифференцировки миобластов.

№ Наименование белка № в базе % Мол. масса, кДа/р!

(синонимы) данных МСВ1 перекрытия

экспериментальные расчетные

. 26 (З-тропомиозин изоформа 1 42476296 34 32,8/4,66 32,8/4,66

27 Аннексии V (липокортин V) 999937 70 31,0/4,75 35,7/4,98

28 БелоквЮОАН (кальгиззарин) 5032057 44 11,0/6,1 11,7/6,56

32 Неизвестный белок 16552261 27 38,0/4,90 47,5/5,01

33 Кальдесмон 1 33878450 21 37,0/5,25 36,7/5,36

34 Нуклеофосмин 1, изоформа 2 40353736 40 33,5/4,90 29,5/4,47

36 Супероксиддисмутаза 38503339 57 22,0/6,9 22,2/6,86

37 Нейрополипептид ИЗ (фосфатитидил этаноламин связывающий белок) 913159 40 22,0/7,40 21,0/7,43

' 38 Пептидил пролил изомераза А (цикпофилин А) 51895760 35 17,0/6,90 18,0/7,68

39 Кофилин 1, немышечный 15012201 63 16,0/7,80 18,5/8,22

40 Профилин 1 15488591 46 14,5/7,50 15,0/8,44

41 Галектин 1, цепь А 42542977 29 14,0/4,92 14,6/5,34

42 Неизвестный белок 62702215 38 59,0/8,30 58,8/8,88

Особый интерес представила динамика изменений белка БЮОАН и немышечной формы кофилина. Белок ЭЮОАП участвует в проведении тормозящего пролиферацию сигнала от рецептора к трансформирующему фактору роста-бета (ТФРБ) [8ака§исЫ е1 а1., 2004; 8опе§а\уа et а1., 2007]. Вероятно, относительно высокое содержание этого белка во вступающих в дифференцировку клетках может отражать их высокую чувствительность к сигналу от ТФРБ, благодаря чему обеспечивается достаточно быстрый выход миобластов из клеточного цикла, в то время как в неделящихся дифференцированных клетках необходимость в этом белке отсутствует (рис. 4). Уменьшение количества немышечной формы кофилина закономерно отражает начало дифференцировки фибробластоподобных пролиферирующихся миобластов с немышечным типом подвижности в дифференцированные мышечные клетки.

День -2. День 0. День +4. День +6.

т \ щ \ ■4 % щт о И ,—4. .. о

Рисунок 4. Фрагменты двумерных электрофореграмм белков пролиферирующих и дифференцирующихся миобластов человека на разных сроках индукции дифференцировки. Стрелкой отмечена белковая фракция, идентифицированная как белок ЭКЮЛИ. Сверху указан срок инкубации клеток в дифференцировочной среде («День -2» - за два дня до начала индукции дифференцировки).

В дифференцирующихся миобластах отмечалось появление изоформы 1 тропомиозина (№26), присутствующей и в зрелой скелетной мышце. Другие тропомиозины, представленные в зрелой мышце (СМ1 - изоформа 3 и СМ2 -изоформа 1 а-тропомиозина) в миобластах идентифицированы не были (рис. 5).

Фибробласты Пролиферирующие миобласты Дифференцирующиеся миобласты (6 день дифференцировки) Зрелая мышечная ткань

■щ,.^" 16 21 еЯНЯШНЯ ^16 21 """ .. .....^ ^ ^22 ^16 «»г- _26 21 22 ч* 26 / \ СМ1 СМ2

Рисунок 5. Фрагменты двумерных электрофореграмм белков фибробластов, пролиферирующих и дифференцирующихся миобластов и зрелой мышечной ткани. Номера идентифицированных белков соответствуют таблицам 1 и 2.

В целом, проведенный протеомный анализ позволил достоверно соотнести 39 из 42 идентифицированных белковых фракций с ранее описанными белками, зарегистрированными в базах данных ЫСВ1 и 8\У155-Рго1.

Идентификация новых белков в культивируемых миобластах человека.

Три из идентифицированных белков миобластов человека не были ранее зарегистрированы, хотя их существование предполагалось, поскольку ранее были обнаружены соответствующие им мРНК. Два из этих белков уменьшались в количестве в ходе дифференцировки миобластов. Один из них (№32 в таблице идентифицированных белков) был идентифицирован как неизвестный белок, сходный по структуре с виментином (§к 16552261). Однако его экспериментальная молекулярная масса оказалась на 9,5 кДа меньше расчетной. Пептиды, полученные при трипсинолизе указанного белка, перекрывают участок от 93 до 403 а.о. (рис. 6), при этом расчетные молекулярная масса и изоэлектрическая точка фрагмента неизвестного белка без первых 92 а.о. оказались близкими к полученным экспериментально (37,4/4.81 и 38,0/4,90 соответственно). Это позволяет предположить, что обнаруженный белок является укороченным вариантом белка 16552261.

Участок полипептидной цепи Мол. масса, Да Аминокислотная последовательность пептида Модификации*

Экспериментальная Расчетная

93 - 99 870.41 869.43 РА^ЮК

102 - 108 906.52 905.46 рьЕодык

109 - 118 1169.75 1168.71 И1_АЕ|_ЕС>|_К

125 - 134 1270.63 1269.55 иЗРЬУЕЕЕМЯ М

176 - 186 1323.69 1322.61 ЕЕАЕМТЮЗРР

203 - 214 1405.78 1404.75 \ZESLQEEIAFLK

203 - 215 1533.91 1532.84 \ZESLQEEIAFLKK

262 - 271 1309.69 1308.60 |\Л_ОЕАЕЕ\Л/УК

325 - 343 2203.08 2201.95 ЕМЕЕМРАУЕАА|\|УСЮТ1СР М

370 - 380 1311.70 1310.65 МА1_Р1Е1АТУЯ М

390 - 403 1570.95 1569.89 151_Р1РМР551_М1_Р.

*М - окисление одного остатка метионина.

1 ИЗТЕЗУБЭЗЗ УЯИМРООРОТ АВКРЭЗЗИЗУ УТТвТИТУЗЬ УАЭЗРОСУУА 51 ТКББАУИЬЬО БЗУОРЗЪАРА ШТЕРКШ^Т ЫЕКУЕЬОЕШ РИРАНУЮКУ 101 КРЬБООЫКТЬ ЬАЕЬЕОЫСОО ОКБРЬОРЬУЕ ЕЕШ1Е1^<2У DQLTNDKARV 151 ЕУЕ1ШЫЪАЕО IMRLREKLQE ЕМЪОКЕЕАЕЫ ТЫЭЗЕИОРУР ЫАЗЬАЯЬРЬЕ 201 НКУЕЗЬОЕЕ! АРЬККЬНЕЕЕ ЮЕЬОАОЮЕ ОНУ<21ВУОУ5 КРРЬТААГЛР 251 УИООУЕЗУАА КНЪЦЕАЕВ'ИУ КЭКРАРЬЗЕА АИИШВАГ^О AKQESTEYRR 3 01 ОУОЙЬТСЕУВ АЬКОТЫЕЗЬЕ КОМРЕМЕЕ№ АУЕААНУбРТ IGRLQDEIQN 3 51 MKEEMARHLR ЕУОБЬЬОТКМ АЬР1Е1АТУК KLLEGEESRI 5ЬР1,Р№381. 401 ЫЪЕСКНРХЗЬ

Рисунок б. Результаты масс-спектрометрической идентификации неизвестного белка с Мм/р1 38,0/4,90. Выявленные пептиды перекрывают фрагмент белка между 93 и 403 а.о.

Другие два белка (№ 3 и 42) были идентифицированы как соответствующие гипотетическому белку gi: 62702215. Молекулярная масса обнаруженных белков соответствовала указанному белковому продукту, однако изоэлектрическая точка отличалась в меньшую сторону.

Пролиферирующие миобласты Дифференцирующиеся миобласты

fiWTWgftff

- тш

.....feS^

Рисунок 7. Динамика неизвестных белков с Мм/р1 58,0/7,90 (обозначен белой стрелкой) и 59,0/8,30 (обозначен черной стрелкой) в ходе миогенной дифференцировки.

Интересно, что белок с большей pi исчезал в ходе дифференцировки, в то время как количество другого белка оставалось постоянным (рис. 7). Таким образом, эти белки, будучи продуктами одного гена, различно представлены в пролиферирующих и дифференцирующихся миобластах, возможно, в силу их разных функциональных особенностей.

Сопоставление данных протеомиого анализа белков культивируемых мышечных клеток человека с информацией о конфликтных определениях аминокислотной последовательности белков, содержащейся в базе данных Swiss-Prot.

В базах данных аминокислотных последовательностей белков встречаются ссылки на имеющиеся аминокислотные конфликты (single amino acid conflicts). Аминокислотные конфликты определяют как альтернативное присутствие одной или другой аминокислоты в определенной позиции аминокислотной последовательности белка. В некоторых случаях наличие аминокислотного конфликта объясняется не описанным ранее полиморфизмом, связанным с одноаминокислотной заменой. Но в подавляющем большинстве случаев конфликтные определения аминокислотных последовательностей возникают при перерасчете данных секвенирования нуклеотидной последовательности соответствующих генов, полученных разными группами авторов. Результаты протеомного анализа позволяют подтверждать отдельные варианты аминокислотных последовательностей, имеющиеся в базах данных.

Таблица 3. Результаты уточнения конфликта аминокислотной последовательности в белке hsp70 (heat shock protein 70).

Белок Значения Аминокислотные последовательности Зарегистрированные

M/z триптических пептидов, соответствующих «аминокислотные

идентифи- найденным значениям M/z (позиции). конфликты».

цирован- Жирным шрифтом выделены Подчеркнуты а.о.,

ных обнаруженные «конфликтные» обнаруженные при

пептидов аминокислотные остатки масс-спектрометрии

HSP70 1964.99 KSQIFSTASDNQPTVTIK (447 - 464) 447 К/N

В данной работе были подтверждены отдельные варианты аминокислотных последовательностей в 40 зафиксированных в базе данных Swiss-Prot конфликтных определениях аминокислотной последовательности 12 идентифицированных белков культивируемых мышечных клеток человека. Полученные данные были суммированы в таблице, фрагмент которой представлен ниже (табл. 3).

Таким образом, использование масс-спектрометрии для идентификации белковых продуктов генной экспрессии позволяет получать информацию, подтверждающую один из вариантов зафиксированных в базах данных конфликтных определений аминокислотной последовательности.

Сравнительный протеомный анализ белков культивируемых миобластов человека и некоторых опухолевых клеток мышечного и эпителиального происхождения.

Рабдомиосаркома - злокачественная опухоль скелетной мышцы. Клетки рабдомиосаркомы могут рассматриваться как озлокачествленные сателлитные клетки скелетной мускулатуры, поскольку в них экспрессируется характерный для последних ген Рах7 [Tiffin et al., 2003]. Рак предстательной железы представляет собой злокачественную опухоль эпителиального происхождения. В качестве модели для исследования молекулярных механизмов этого заболевания используются культивируемые клетки линии LNCaP. Соответственно, изучение белкового состава этих клеток представляется необходимым для дальнейшего определения характеристик этого объекта, в том числе для изучения потенциальных белковых маркеров рака предстательной железы. В целом, была идентифицирована 31 белковая фракция в клетках рабдомиосаркомы и 35 фракций в клетках рака предстательной железы. В их число входили белки NM23B, DJ-1 шаперонин-10, не идентифицированные в нормальных миобластах человека (табл. 4). В настоящее время последние два белка рассматриваются как вовлеченные в развитие опухолевых процессов [Melle et al., 2006; Yuen et al., 2008], а белок

N132313 относится к продуктам гена ЫМЕ, некоторые из которых также вовлечены в указанные процессы [ТэсЫесЫ е! а1., 2008].

Миобласты Клетки рабдомиосаркомы Клетки предстательной железы

у щщ % / щдт

Рисунок 8. Белок ИМ23В и некоторые «постоянные» белки в культивируемых клетках человека. Белая пунктирная стрелка - кофилин, сплошная белая стрелка - циклофиллин, черная стрелка - белок ИМ23В.

Наличие белка НМ23В в злокачественных, но не в нормальных клетках (рис. 8), позволяет рассматривать его как белок, потенциально вовлеченный в процессы опухолевой трансформации.

Таблица 4. Результаты идентификации белков, рассматриваемых в качестве онкомаркеров

№ Наименование белка № в базе данных NCBI % перекрытия Мол. масса, кДаУр!

экспериментальные расчетные

1 кОЮ. 55628194 72 17,0/9,10 20,0/9,03

2 Белок теплового шока 10 кДа 4008131 63 10,0/7,80 10,5/9,44

3 Белок КМ23В 12803317 61 17,5/8,37 17,3/8,52

4 Белок 01-1 50513593 40 22,0/6,30 20,0/6,33

Среди белков, идентифицированных только в клетках рака предстательной железы, оказался белок AGR2, рассматривающийся как потенциальный маркер процессов опухолевой трансформации в предстательной железе [Ковалев и др., 2006; Zhang et al., 2007]. Сравнительный анализ белкового состава нормальных и опухолевых клеток человека и ткани предстательной железы показал, что белок AGR2 присутствует в ткани и культивируемых клетках рака предстательной железы. В нормальных клетках и тканях, а также в злокачественных мышечных клетках белок AGR2 обнаружен не был (Рис.9).

Ткань ГПЖ Ткань РПЖ Культивируемые клетки РПЖ

* % 4—- 1 -Ж КЙ№ 1 - - Н ■1

Клетки рабдомиосаркомы Миобласты Фибробласты

_ /с ■ у.й тя Ч ."./'у

Рисунок 9. Сравнительный анализ присутствия белка АОЯ2 в нормальных и опухолевых клетках человека и ткани предстательной железы. ГПЖ - гиперплазия предстательной железы, РПЖ - рак предстательной железы. Белая стрелка указывает на циклофиллин, присутствовавший во всех представленных клетках и тканях. Черная стрелка указывает на белок А0112.

Наличие этого белка в культивируемых клетках рака предстательной железы позволяет рассматривать их как потенциальную экспериментальную модель для изучения опухолевой трансформации на доклинической фазе испытаний, в то время как клетки рабдомиосаркомы могут выступать в качестве контроля (как клетки, являющиеся злокачественными, но не содержащими указанный белок).

Оптимизация клеточной тест-системы для определения биологического эффекта ростовых факторов, способных подавлять пролиферацию миобластов человека.

Разработка технологий получения биологически активных субстанций рекомбинантных белковых факторов роста требует наличия соответствующих методов определения физиологической активности получаемых препаратов.

Влияние препарата механозависимого А ростового фактора на миобласты человека

В 160%

плотнс О О

55 юо% I

0 80% 1 60%

о 40%

8 20% X

о ....... 0 0.1 0.25 0.5 1 2,5 5

Концентрация, мкг/мл

Влияние препаратов миостатина на Б миобласты человека

1 3 5 10 20 Концентрация, мкг/мл

БСК

Рисунок 10. Выявление биологической активности различных фракций, получаемых при выделении и очистке рекомбинантных факторов роста. Тест-объект - культивируемые миобласты человека. Окраска кристаллическим фиолетовым. А - график, характеризующий влияние физиологически активного препарата механозависимого ростового фактора на культивируемые миобласты человека. Б - графики, характеризующие физиологический (сплошная линия, подавление пролиферации в концентрации 3-10 мкг/мл без цитотоксического эффекта) и цитотоксический (пунктирная линия, эффект в концентрациях от 1 мкг/мл). В - микрофотографии миобластов человека в контроле, содержащем сыворотку (1), в бессывороточном контроле (3), а также под действием различных препаратов миостатина (2, 4). Окраска кристаллическим фиолетовым. Отсутствие клеток в одном из образцов, подвергнутом воздействию миостатина (4), объясняется цитотоксическим действием указанного препарата.

Ранее разработанная с этой целью клеточная тест-система способна определять рост-стимулирующий и цитотоксический эффекты исследуемых препаратов, но не степень подавления пролиферации [Черников и др., 2001]. В связи с этим она нуждалась в определенных модификациях, позволяющих использовать ее для определения подавляющего пролиферацию эффекта исследуемых субстанций. Для этого было предложено использование бессывороточного контроля, то есть образцов клеток, инкубируемых в бессывороточной среде. Клетки в культуре растут под действием ростовых факторов, содержащихся в добавляемой к культуральной среде сыворотке. В отсутствие последней клетки практически не делятся, что позволяет

рассматривать бессывороточный контроль как пример полного подавления пролиферации клеток.

Тестирование ряда препаратов миостатина и механозависимого фактора роста показало, что часть препаратов обладает свойственным им биологическим эффектом, в то время как другие препараты не обладают эффектом или вызывают гибель клеток (рис. 10).

Биологически активный препарат миостатина способен практически полностью подавить пролиферацию миобластов, индуцируемую эмбриональной телячьей сывороткой, не оказывая при этом цитотоксического эффекта. Часть препаратов механозависимого фактора роста стимулировала рост миобластов, другие же препараты не оказывали влияния на пролиферацию миобластов.

ВЫВОДЫ.

1. С помощью протеомного анализа белков в пролиферирующих и дифференцирующихся миобластах человека:

а) идентифицировано 42 белковых фракции, в том числе актин, кальций- и актин-связывающие белки (кофилин, кальдесмон, трансгелин, тропомиозины, ЭЮОАЮ, Б100Л11), белки теплового шока и другие.

б) выявлено и идентифицировано 11 белковых фракций, количество которых значительно уменьшалось при дифференцировке; уменьшение количества немышечной формы кофилина и белка БЮОАП предлагается рассматривать как ранние признаки, отражающие дифференцировку одноядерных пролиферирующих миобластов с немышечным типом подвижности в многоядерные миотубы.

в) в дифференцирующихся миобластах обнаружено увеличение 2 белковых фракций; появление изоформы 1 р-тропомиозина, типичной для зрелых мышечных клеток, можно рассматривать как один из ранних признаков дифференцировки миобластов.

2. В культивируемых миобластах человека обнаружено 3 новых белка (Мм/р1 38,0/4,90; 59,0/8,30; 58,0/7,90), сходных с гипотетическими белками -потенциальными продуктами трансляции транскриптов, зарегистрированных в базе данных NCBI.

3. По итогам сопоставления результатов протеомного анализа с информацией баз данных NCBI и Swiss-Prot подтверждено существование по одному из вариантов для 40 расчетных «конфликтных» определений в аминокислотных последовательностях 12 идентифицированных белков культивируемых мышечных клеток человека.

5. Клеточная тест-система, использующая в качестве тест-объекта культивируемые миобласты человека, оптимизирована для определения активности рекомбинантных ростовых факторов и других биологически активных веществ, подавляющих пролиферацию клеток.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ. Статьи в рецензируемых журналах

1. Шишкин С.С., Крохина Т.Б., Ахунов B.C., Макаров A.A.. Попов В.О. Влияние миостатина и некоторых других ростовых факторов на культивируемые клетки человека. Прикладная биохимия и микробиология, 2004, т.40, №6, с.630-633.

2. Еремина Л.С., Ковалев Л.И., Шишкин С.С., Торопыгин И.Ю., Буракова М.В., Ковалева М.А., Макаров A.A.. Дзеранов Н.К., Казаченко A.B., Тотров К.И., Кононков И.В., Лоран О.Б. Биохимический полиморфизм трансгелинов

в предстательной железе человека при гиперплазии и раке. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. №3,2007, с.49-52.

3. Еремина JI.C., Ковалев Л.И., Ковалева М.А., Макаров A.A.. Шишкин С.С., Буракова М.И., Чернов H.H., Торопыгин И.Ю., Кононков И.В. Сравнительное изучение белка AGR2 в некоторых культивируемых клетках и образцах тканей простаты. Вестник РУДН. Серия «Медицина». 2007, №6. С.271-276.

4. Kuznetsova TV, Schulga АА, Wulfson AN, Keruchenko JS, Ermolyuk YS, Keruchenko ID, Tikhonov RV, Lisitskaya KV, Makarov AA. Chobotova K, Khomenkov VG, Khotchenkov VP, Popov VO, Kirpichnikov MP, Shevelev AB. Producing human mechano growth factor (MGF) in Escherichia coli. Protein Expression and Purification, 2008 Vol. 58. №1, p. 70-77.

5. Ковалева M.A., Ковалев Л.И., Еремина JI.C., Макаров A.A.. Буракова M.B., Торопыгин И.Ю., Серебрякова М.В., Шишкин С.С., Арчаков А.И. Определение «аминокислотных конфликтов» и аминокислотных замен в первичных структурах 41 белка человека протеомными технологиями. Биомедицинская химия. Т.54, №4,2008. С. 420-434.

6. Макаров A.A., Ковалев Л.И., Ковалева М.А., Торопыгин И.Ю., Шишкин С.С. Изучение изменений белкового профиля в дифференцирующихся миобластах человека. Онтогенез. 2009, Т.40, №2, С.112-119.

Статьи в сборниках

7. Ковалев Л.И., Ковалева М.А., Макаров A.A.. Шишкин С.С., Тихонова О.В., Мошковский С.А., Серебрякова М.В. Протеомные технологии в исследованиях проблемы гипертрофии мышечных клеток (возможности тестирования молекулярных эффектов при использовании медико-биологических технологий повышения работоспособности). Сб. статей «Медико-биологические технологии повышения работоспособности в условиях напряженных физических нагрузок». Москва, 2004, с.160-168.

8. Шишкин С.С., Крохина Т.Б., Ахунов B.C., Макаров A.A. Определение с помощью клеточной биотест-системы функциональной активности некоторых ростовых факторов, влияющих на состояние опорно-двигательного аппарата. Сб. статей «Медико-биологические технологии повышения работоспособности в условиях напряженных физических нагрузок». Москва, 2004, с. 169-177.

9. Шишкин С.С., Макаров A.A., Ахунов B.C., Ковалев Л.И., Ковалева М.А., Князев А.И., Воронина A.C., Лисицкая К.В., Еремина Л.С. Создание и использование лабораторного регламента для определения биологической активности рекомбинантных ростовых факторов и некоторых других биологически активных веществ. Сб. статей «Медико-биологические технологии повышения работоспособности в условиях напряженных физических нагрузок». Вып. 2. Москва, 2006, с.8-22.

Тезисы докладов

Ю.Макаров A.A.. Ковалев Л.И., Лисицкая К.В., Еремина Л.С., Торопыгин И.Ю., Шишкин С.С. Исследование изменений белкового профиля культивируемых скелетно-мышечных миобластов человека в ходе миогенной дифференцировки. Тезисы докладов Всероссийского симпозиума «Биология клетки в культуре». Цитология, 2006, т.48, №9, с.778.

П.Макаров A.A.. Ковалев Л.И., Ковалева М.А., Лисицкая К.В., Еремина Л.С., Торопыгин И.Ю., Шишкин С.С. Изучение изменений белковых продуктов генной экспрессии в культивируемых миобластах человека при миогенной дифференцировке. Аннотации докладов 3-го Международного симпозиума «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии». Дубна, 2006, с.45.

12.Makarov A., Kovalyov L., Lisitskaya К., Toropygin I., Shishkin S. Effect of mechano growth factor on protein profile of cultured human myoblasts. Abstracts of the 6th Pamas Conference «Molecular Mechanism of cellular signalling». Acta Biochimica Polonica, vol.54, suppl.2,2007, p.22.

13.Makarov A.. Kovalyov L., Lisitskaya K., Shishkin S. Dynamics of S100A11 protein in human myoblasts after stimulation of differentiation. Abstracts of the 32th FEBS Congress "Molecular Machines". FEBS Journal, vol.274, suppl.l,

2007, p. 139.

14.Макаров А.А., Ковалев Л.И., Торопыгин И.Ю., Шишкин C.C. Возможное физиологическое объяснение изменения количества белка S100A11 в дифференцирующихся миобластах человека. Тезисы докладов 2-го Съезда общества клеточной биологии. Цитология, 2007, т.49, №9, с.773.

15.Makarov АА. Kovalyov LI, Kovalyova MA, Toropygin IYu, Shishkin SS. S100A11 protein in normal and malignant skeletal muscle cells. Materials of 37th European Muscle Conference, Oxford, 2008, p.121.

16.Makarov AA. Kovalyov LI, Kovalyova MA, Toropygin IYu, Shishkin SS. Study of SI00 proteins in human normal and malignant cells and tissues. Materials of 10th European Symposium on Calcium-binding Proteins in Normal and Transformed Cells, 2008, C-31.

П.Макаров А.А.. Ковалев Л.И., Ковалева М.А., Торопыгин И.Ю., Шишкин С.С. Изучение белка S100A11 и немышечной формы кофилина в культивируемых мышечных клетках и зрелой скелетной мышце человека. Тезисы докладов Школы молодых ученых «Методы культивирования клеток», Цитология,

2008, т.50, №9, с.814-815.

Заказ № 146/04/09 Подписано в печать 24.04.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5

/КГ^ 000 "ЦИФР0ВИЧ0К" тел- (495) 797-75-76; (495) 649-83-30 JJ www.cfr.ru; e-mail:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Макаров, Андрей Александрович

Список сокращений

Введение

ГЛАВА 1. Современные подходы к изучению белков в скелетномышечных миобластах, а также в некоторых других нормальных и злокачественных клетках человека (обзор литературы).

1.1. Общая характеристика сателлитных клеток скелетной мускулатуры.

1.2. Ростовые факторы и их роль в регуляции роста сателлитных 17 клеток.

1.3. Исследование мышечных белков с помощью постгепомных 21 технологий.

1.4. Использование постгеномных технологий для исследования 36 белкового состава предстательной железы.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Реактивы и биологические материалы.

2.2. Методы культивирования клеток человека.

2.3. Определение влияния исследуемых препаратов на 40 пролиферацию культивируемых клеток.

2.4. Электрофоретическое разделение белков.

2.5. Детекция белков на гелевых пластинах с 45 использованием кумасси голубого R-250 и азотнокислого серебра.

2.6. Фотодокументирование изображений и архивирование гелей. 46 2.7 Масс-спектрометрическая идентификация белков. 46 2.8. Методы статистической обработки результатов.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. 48 3.1. Исследование белкового состава культивируемых миобластов человека на разных сроках дифференцировки.

3.2. Идентификация новых белков в культивируемых миобластах 57 человека.

3.3. Сопоставление данных протеомного анализа белков 58 культивируемых мышечных клеток человека с информацией о конфликтных определениях аминокислотной последовательности белков, содержащейся в базе данных Swiss-Prot.

3.4. Сравнительный протеомный анализ белков культивируемых ^ миобластов человека и некоторых опухолевых клеток мышечного и эпителиального происхождения.

3.5. Оптимизация клеточной тест-системы, использующей в качестве 74 тест-объекта культивируемые миобласты человека.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Протеомное исследование белков культивируемых мышечных и эпителиальных клеток человека"

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлось изучение протеомными технологиями особенностей белкового состава миобластов человека, культивируемых в условиях, обеспечивающих пролиферацию и индуцирующих дифференцировку, а также выяснение возможного участия отдельных белков в этих процессах и при опухолевой трансформации на примере злокачественных клеток мышечного и эпителиального происхождения.

В соответствии с целью исследования в работе решались следующие задачи:

2. Сопоставить результаты протеомного анализа идентифицированных белков миобластов человека с материалами баз данных NCBI и Swiss-Prot.

Научно-практическая значимость. Работа имеет фундаментальный характер и направлена на изучение особенностей белкового состава культивируемых клеток человека и механизмов их дифференцировки. Использование культивируемых опухолевых клеток человека позволило уточнить специфичность некоторых потенциальных онкомаркеров. В частности, показано присутствие белка AGR2, рассматриваемого в качестве перспективного онкомаркера, в культивируемых клетках рака предстательной железы, но не в культивируемых клетках мышечного происхождения.

4. Оптимизирована клеточная тест-система, что позволило использовать ее для тестирования как стимулирующих, так и подавляющих пролиферацию рекомбинантных белковых факторов роста. Апробация работы. Материалы данной работы докладывались на международных и российских конференциях, симпозиумах и школах, в том числе на Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре» (2006 г., Санкт-Петербург), Международном симпозиуме «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии» (2007 г., г.Дубна), 2-м съезде Общества клеточной биологии (2007 г., Санкт-Петербург), 6-й Парнасовской конференции «Molecular Mechanism of Cellular Signaling» (2007 г., Польша, г.Краков), 32-м Конгрессе Федерации европейских биохимических обществ (2007 г., Австрия, г.Вена), Летней школе «Hottest Topics in Protein Research» (2008 г., Хорватия, г.Сплит), Европейском мышечном конгрессе (2008 г., Великобритания, г.Оксфорд), Европейском симпозиуме по калыдий-связывающим белкам (2008 г., Бельгия, г.Левен), Школе молодых ученых «Методы культивирования клеток» (2008 г., Санкт-Петербург), Совещании «Muscle regeneration and Stem Cells: a multiorganismic approach» (2008 г., Польша, г.Неполомице) и др. Работа была отмечена присуждением стипендии им. члена-корреспондента РАН В.Л. Кретовича на 2008 г.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Макаров, Андрей Александрович

выводы.

1. С помощью протеомного анализа белков в пролиферирующих и дифференцирующихся миобластах человека: а) идентифицировано 42 белковых фракции, в том числе актин, кальций- и актин-связывающие белки (кофилин, кальдесмон, трансгелии, тропомиозины, S100A10, S100A11), белки теплового шока и другие. б) выявлено и идентифицировано 11 белковых фракций, количество которых значительно уменьшалось при дифференцировке; уменьшение количества немышечной формы кофилина и белка S100A11 предлагается рассматривать как ранние признаки, отражающие дифференцировку одноядерных пролиферирующих миобластов с немышечным типом подвижности в многоядерные миотубы. в) в дифференцирующихся миобластах обнаружено увеличение 2 белковых фракций; появление изоформы 1 p-тропомиозина, типичной для зрелых мышечных клеток, можно рассматривать как один из ранних признаков дифференцировки миобластов.

4. Сравнительное изучение белкового состава нормальных и опухолевых культивируемых клеток мышечного и эпителиального происхождения позволило идентифицировать в клетках рабдомиосаркомы и рака предстательной железы 3 белка (NM23B, DJ-1 и шаперонин-10), рассматриваемых в качестве потенциальных онкомаркеров; белок AGR2, рассматриваемый как потенциальный маркер рака предстательной железы, был обнаружен только в клетках рака предстательной железы. 5. Клеточная тест-система, использующая в качестве тест-объекта культивируемые миобласты человека, оптимизирована для определения активности рекомбинантных ростовых факторов и других биологически активных веществ, подавляющих пролиферацию клеток.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Выражаю свою искреннюю благодарность д.б.н. Л.И.Ковалеву за чуткое и доброжелательное научное руководство, проф. С.С.Шишкину за терпение и неоценимую помощь в работе, к.б.н. М.А.Ковалевой за помощь в работе с компьютерными изображениями, к.м.н. Л.С. Ереминой и асп. К.В.Лисицкой за помощь в постановке экспериментов, а также другим сотрудникам лаборатории биомедицинских исследований за всестороннюю поддержку. Благодарю к.б.н. Т.В.Крохину, к.б.н. В.С.Ахунова и д.б.н. Шемякина за предоставленные образцы культивируемых клеток человека, д.б.н. А.Б.Шевелева за предоставленные препараты рекомбинантных миостатина и механо-зависимого ростового фактора, к.б.н. И.В.Кравченко за организационную помощь.

Я искренне признателен всем сотрудникам Института биохимии им.А.Н.Баха РАН за доброту и моральную поддержку.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Завершение в 2001 году Международного проекта «Геном человека» ознаменовало собой начало так называемой постгеномной эры в биологии. В результате этого возник целый ряд подходов к изучению биологических объектов, основанный на использовании современных постгеномных технологий. Особый интерес при этом представляет изучение генной экспрессии на белковом уровне, осуществляемое при помощи протеомных технологий. Культивируемые клетки являются распространенной моделью для экспериментального изучения многих биологических процессов. Одним из существенных преимуществ использования культивируемых клеток в биомедицинских исследованиях является возможность изучать молекулярные процессы в клетках человека, не сталкиваясь с различными трудностями (как техническими, так и этическими), неизбежно возникающими при постановке экспериментов на животных и человеке.

Данная работа была выполнена с использованием в качестве экспериментальной модели неиммортализованных культивируемых миобластов человека, клеток рабдомиосаркомы (злокачественной опухоли скелетной мышцы) человека и клеток рака предстательной железы человека. В ряде случаев имело место сопоставление белкового состава культивируемых клеток и образцов ткани человека.

Миобласты, вступая в дифференцировку, претерпевают ряд изменений -выходят из клеточного цикла, превращаются в миоциты и начинают сливаться с образованием многоядерных миотуб. Соответственно этому происходит изменение генной экспрессии, что закономерно проявляется в изменении белкового состава. Используя протеомные технологии, удалось выявить 13 белковых фракции, претерпевавших выраженные количественные изменения в ходе дифференцировки, и идентифицировать их. К ним относились белок S100A11, немышечная форма кофилина, ряд изоформ тропомиозинов и другие белки. Помимо этого, было идентифицировано 29 белков, не претерпевающих значительных количественных изменений.

Кроме того, было обнаружено 3 новых белка, не описанных ранее в базах данных NCBI и Swiss-Prot. Информация, полученная при масс-спектрометрической идентификации, позволила подтвердить по одному из вариантов для 12 конфликтных определений аминокислотной последовательности 40 белков, зарегистрированных в базе данных Swiss-Prot.

Сравнительный протеомный анализ белков нормальных миобластов и некоторых опухолевых культивируемых клеток мышечного и эпителиального происхождения позволил установить, что белок AGR2, рассматриваемый как потенциальный маркер рака предстательной железы, присутствует как в ткани, так и в культивируемых клетках рака предстательной железы, но отсутствует в мышечных клетках (как нормальных, так и опухолевых). Белки NM23B, DJ-1 и шаперонин-10, рассматриваемые как потенциальные участники процессов опухолевой трансформации и онкомаркеры, были идентифицированны в клетках рабдомиосаркомы и рака предстательной железы, но не в нормальных миобластах.

Оптимизация клеточной тест-системы, использующей в качестве тест-объекта культивируемые миобласты человека, позволила использовать ее для определения как стимулирующих, так и подавляющих пролиферацию кульвируемых миобластов человека рекомбинантных ростовых факторов -миостатина и механозависимого ростового фактора. С использованием указанной тест-системы была проведена проверка эффектов различных препаратов миостатина и механозависимого ростового фактора. Тестирование позволило различать физиологически активные и неактивные препараты и разумно подходить к усовершенствованию технологии их получения.

Таким образом, сочетание использования культивируемых клеток человека, выступающих в качестве моделей ряда нормальных (пролиферация, дифференцировка) и патологических (опухолевый рост) процессов, и протеомных технологий позволило выявить ряд существенных фактов, представляющих как чисто научный, так и практический интерес.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Макаров, Андрей Александрович, Москва

1. Арчаков А.И. (2000) Что после геномики? Протеомика. Вопр. мед. химии, 46, 335-343.

2. Баев А.А. (1990) Программа «Геном человека»: ее возникновение, содержание и развитие. Итоги науки и техники. Сер. Геном человека, 1,4-33.

3. Гланц С. (1999) Медико-биологическая статистика. М., Практика, 459 с.

4. Говорун В.М., Арчаков А.И. (2002) Протеомные технологии в современной биомедицинской науке. Биохимия, 61, 1341 — 1359.

5. Громов П.С., Целис Х.Э. (2000) От геномики к протеомике. Молекулярная биология, 34, 597—611.

6. Ивахно С., Корнелюк А. (2006) Количественная протеомика и ее применение в системной биологии. Биохимия, 71, 1312-1327.

7. Ковалев Л.И., Шишкин С.С., Хасигов П.З., Дзеранов Н.К., Казаченко А.В., Ковалева М.А., Торопыгин И.Ю., Еремина Л.С., Грачев С.В. (2006) Новые подходы к молекулярной диагностике рака простаты. Урология, 5, 16-19.

8. Ковалев Л.И., Шишкин С.С., Иволгина Г.Л., Громов П.С., Шандала A.M. (1986)Выявление межлинейного полиморфизма белков сердечной мышцы мышей методом двумерного электрофореза. Биохимия, 51, 896908.

9. Кушлииский Н.Е., Соловьев В.Ю., Трапезникова М.Ф. (2002) Рак предстательной железы. М., Издательство РАМН, 432 с.

10. Остерман Л.О. (1983) Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. М., Наука, 304 с.

11. Примроуз С., Тваймен Р. (2008) Геномика. Роль в медицине. М., Из-во «БИНОМ. Лаборатория знаний», 277 с.

12. Пуляева Е.В., Ковалев Л.И., Цветкова М.Н., Шишкин С.С., Болдырев Н.И. (1990) Двумерная карта белков левого желудочка сердца человека. Биохимия, 55, 489-498.

13. Ригетти П. (1986) Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение. М., Мир, 398 с.

14. Шишкин С.С. (1985) Молекулярно-анатомическое направление в биохимической генетике. Вестник АМН СССР, 1, 78-84.

15. Шишкин С.С. (2002) От структурной геномики к функциональной: теоретические и прикладные аспекты. Вест. РАМН, 4, 11-16.

16. Шишкин С.С. (2004) Миостатин и некоторые другие биохимические факторы, регулирующие рост мышечных тканей у человека и ряда высших позвоночных. Успехи биол. химии, 44, 209-262.

17. Шишкин С.С., Егоров Ц.А., Ковалев Л.И., Лаптев А.В., Цветкова М.Н., Пуляева Е.В., Барбашов С.Ф. Идентификация альфа-тропомиозина сердечной мышцы человека двумерным электрофорезом и секвенированием. (1991) Биохимия, 56, 136-140.

18. Шишкин С.С., Калинин В.Н. (1992) Медицинские аспекты биохимической и молекулярной генетики. М., Из-во ВИНИТИ, 216 с.

19. Шишкин С.С., Ковалев Л.И., Громов П.С. (2000) Функциональная геномика человека и протеомика, как раздел функциональной геномики. // В кн.: "Многоликость современной генетики человека" под ред. С.С.Шишкина. Москва-Уфа, "Гилем", 17-50.

20. Шишкин С.С., Ковалев Л.И., Ковалева М.А. (2004) Протеомные исследования мышечных белков человека и некоторых других позвоночных. Биохимия, 69, 1574- 1591.

21. Шубникова Е.А., Юрина Н.А., Гусев Н.Б., Балезина О.П., Большакова Г.Б. (2001) Мышечные ткани. Москва, «Медицина», 235 с.

22. Adams GR. (2006) Satellite cell proliferation and skeletal muscle hypertrophy. Appl Physiol Nutr Metab, 31, 782-790.

23. Alaiya A, Roblick U, Egevad L, Carlsson A, Franzen B, Volz D, Huwendiek S, binder S, Auer G. (2000) Polypeptide expression in prostate hyperplasia and prostate adenocarcinoma. Anal Cell Pathol., 21, 1-9.

24. Allen RE, Sheehan SM, Taylor RG, Kendall TL, Rice GM. (1995) Hepatocyte growth factor activates quiescent skeletal muscle satellite cells in vitro. J Cell Physiol, 165, 307-312.

25. Anderson JE. (2000) A role for nitric oxide in muscle repair: nitric oxide-mediated activation of muscle satellite cells. Mol Biol Cell, 11, 1859-1874.

26. Anderson NG, Anderson NL. (1982) The human protein index. Clin.Chem., 28, 739-748.

27. Anderson NG, Matheson A, Anderson NL. (2001) Back to the future: the human protein index (HPI) and the agenda for post-proteomic biology. Proteomics, 1, 3-12.

28. Anderson NL, Anderson NG. (1991) A two-dimensional gel database of human plasma proteins. Electrophoresis, 12, 883-906.

29. Anderson NL, Anderson NG. (1998) Proteome and proteomics: new technologies, new concepts, and new words. Electrophoresis, 19, 18531861.

30. Asakura A, Rudnicki MA. (2002) Cellular and molecular mechanisms regulating skeletal muscle development. In: Mouse Development. Orlando, FL: Academic, p. 253-278.

31. Baker CS, Corbett JM, May AJ, Yacoub MH, and Dunn MJ. (1992) Electrophoresis, 13, 723-726.

32. Balcerzak D, Poussard S, Brustis JJ, Elamrani N, Soriano M, Cottin P, Ducastaing A. (1995) An antisense oligodeoxyribonucleotide to m-calpain mRNA inhibits myoblast fusion. J Cell Sci, 108, 2077-2082.

33. Barton ER, Morris L, Musaro A, Rosenthal N, Sweeney HL. (2002) Muscle-specific expression of insulin-like growth factor I counters muscle decline in mdx mice. J Cell Biol, 157, 137-148.

34. Bischoff R. (1986) Proliferation of muscle satellite cells on intact myofibers in culture. Dev Biol, 115, 129-139.

35. Bischoff R. (1997) Chemotaxis of skeletal muscle satellite cells. Dev Dyn, 208, 505-515.

36. Blau HM, Pavlath GK, Hardeman EC, Chiu CP, Silberstein L, Webster SG, Miller SC, Webster C. (1985) Plasticity of the differentiated state. Science, 230, 758-766.

37. Blum H, Beir H, Cross HG. (1987) Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis, 8, 126129.

38. Campion DR, Richardson RL, Reagan JO, Kraeling RR. (1981) Changes in the satellite cell population during postnatal growth of pig skeletal muscle. J AnimSci, 52, 1014-1018.

39. Celis J, Honore B, Bauw G, Vandekerckhove J. (1990) Comprehensive computerized 2D gel protein databases offer a global approach to the study of the mammalian cell. BioEssays, 12, 93-98.

40. Celis JE, Leffers H, Rasmussen HH, Madsen P, Honore B, Gesser B, Dejgaard K, Olsen E, Ratz GP, Lauridsen JB, Bassen B, Andersen AN,

41. Celis JE, Bravo R. (1984) Two-Dimensional Gel Electrophoresis of Proteins: Methods and Applications, N.Y., Academic Press.

42. Charge SB, Rudnicki MA. (2004) Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev, 84, 209-238.

43. Charlton CA, Mohler WA, Radice GL, Hynes RO, Blau HM. (1997) Fusion competence of myoblasts rendered genetically null for N-cadherin in culture. J Cell Biol, 138, 331-336.

44. Chen EI, Hewel J, Felding-Habermann B, Yates JR 3rd. (2006) Large scale protein profiling by combination of protein fractionation andmultidimensional protein identification technology (MudPIT). Mol Cell Proteolytics, 5, 53-56.

45. Chi N, Epstein JA. (2002) Getting your Pax straight: Pax proteins in development and disease. Trends Genet, 18, 41-47.

46. Chung LW, Kao C, Sikes RA, Zhau HE. (1997) Human prostate cancer progression models and therapeutic intervention. Hinyokika Kiyo, 43, 815820.

47. Comings D. (1982) Two-dimensional gel electrophoresis of human brain proteins. Clin. Chem., 28, 782-789.

48. Cornelison DD, Filla MS, Stanley HM, Rapraeger AC, Olwin BB. (2001) Syndecan-3 and syndecan-4 specifically mark skeletal muscle satellite cells and are implicated in satellite cell maintenance and muscle regeneration. Dev Biol, 239, 79-94.

49. Cossu G, Cicinelli P, Fieri C, Coletta M, Molinaro M. (1985) Emergence of TPA-resistant "satellite" cells during muscle histogenesis of human limb. Exp Cell Res, 160, 403-411.

50. Cottin P, Brustis JJ, Poussard S, Elamrani N, Broncard S, Ducastaing A. (1994) Ca2+-dependent proteinases (calpains) and muscle cell differentiation. Biochim Biophys Acta, 1223, 170-178.

51. Craven RA, Totty N, Harnden P, Selby PJ, Banks RE. (2002) Laser capture microdissection and two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis: evaluation of tissue preparation and sample limitations. Am. J. Pathol., 160, 815-822.

52. Dedieu S, Dourdin N, Dargelos E, Poussard S, Veschambre P, Cottin P, Brustis J J. (2002) Calpain and myogenesis: development of a convenient cell culture model. Biol Cell, 94, 65-76.

53. Dhawan J, Rando ТА. (2005) Stem cells in postnatal myogenesis: molecular mechanisms of satellite cell quiescence, activation and replenishment. Trends Cell Biol., 15, 666-673.

54. Doran P, Donoghue P, O'Connell K, Gannon J, Ohlendieck K. (2007) Proteomic profiling of pathological and aged skeletal muscle fibres by peptide mass fingerprinting. IntJMol Med, 19, 547-564.

55. Dvorzhinski D, Thalasila A, Thomas PE, Nelson D, Li H, White E, Dipaola RS. (2004) A novel proteomic coculture model of prostate cancer cell growth. Proteomics, 4, 3268-3275.

56. Emmert-Buck MR, Bonner RF, Smith PD, Chuaqui RF Zhuang Z, Goldstain SR, Weiss RA, and Liotta LA. (1996) Laser capture microdissection. Science, 274, 998-1001.

57. Fairbanks G, Steck TL, Wallach DFH. (1971) Electroforetic analysis of the major peptides of the erytrocyte membrane. Biochemistry, 10, 2607-2617.

58. Fawcett JS, Vicchio D, Chrambach A. (1988) The adsorbtion of large proteins in electro focusing on immobilized pH gradients: II. Dependence of the oligomeric state of Immobiline. Electrophoresis, 9, 469-474.

59. Fields S, Kohara Y, Lockhart DJ. (1999) Functional genomics. Proc Natl AcadSci USA, 96, 8825-8826.

60. Fritzsche FR, Dahl E, Dankof A, Burkhardt M, Pahl S, Petersen I, Dietel M, Kristiansen G. (2007) Expression of AGR2 in non small cell lung cancer. Histol Histopathol, 22, 703-708.

61. Fritzsche FR, Dahl E, Pahl S, Burkhardt M, Luo J, Mayordomo E, Gansukh T, Dankof A, Knuechel R, Denkert C, Winzer KJ, Dietel M, Kristiansen G.2006) Prognostic relevance of AGR2 expression in breast cancer. Clin Cancer Res, 12, 1728-1734.

62. Gal-Levi R, Leshem Y, Aoki S, Nakamura T, Halevy O. (1998) Hepatocyte growth factor plays a dual role in regulating skeletal muscle satellite cell proliferation and differentiation. Biochim Biophys Acta, 1402, 39-51.

63. Gamble HJ, Fenton J, Allsopp G. (1978) Electron microscope observations on human fetal striated muscle. JAnat, 126, 567-589.

64. Giometti CS, Williams K, Tollaksen SL. (1997) A two-dimensional electrophoresis database of human breast epithelial cell proteins. Electrophoresis, 18, 573-81.

65. Golaz O. Plasma and red blood cell protein map: Update 1993. (1993) Electrophoresis, 14, 1223-1231.

66. Goldring K, Partridge T, Watt D. (2002) Muscle stem cells. J Pathol, 197, 457-67.

67. Gorg A, Postel W, Gunther S. (1988) The current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis, 9, 531-546.

68. Goulding MD, Chalepakis G, Deutsch U, Erselius JR, Gruss P. (1991) Pax-3, a novel murine DNA binding protein expressed during early neurogenesis. EMBOJ, 10, 1135-1147.

69. Hartley RS, Bandman E, Yablonka-Reuveni Z. (1992) Skeletal muscle satellite cells appear during late chicken embryogenesis. Dev Biol, 153, 206216.

70. Hasegawa N, Mizutani K, Suzuki T, Deguchi T, Nozawa Y. (2006) A comparative study of protein profiling by proteomic analysis in camptothecin-resistant PC3 and camptothecin-sensitive LNCaP human prostate cancer cells. Urol Int, 77, 347-354.

71. Hasty P, Bradley A, Morris JH, Edmondson DG, Venuti JM, Olson EN, Klein WH. (1993) Muscle deficiency and neonatal death in mice with a targeted mutation in the myogenin gene. Nature, 364, 501-506.

72. Hawke TJ, Garry DJ. (2001) Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology. JAppl Physiol, 91, 534-551.

73. Hollnagel A, Grund C, Franke WW, Arnold HH. (2002) The cell adhesion molecule M-cadherin is not essential for muscle development and regeneration. Mol Cell Biol, 22, 4760-4770.

74. Hubank M, Schatz DG. (1994) Identifying differences in mRNA expression by representational difference analysis of cDNA. Nucleic Acids Res, 22, 5640-5648.

75. Irintchev A, Zeschnigk M, Starzinski-Powitz A, Wernig A. (1994) Expression pattern of M-cadherin in normal, denervated, and regenerating mouse muscles. DevDyn, 199, 326—337.

76. Israeli D, Benchaouir R, Ziaei S, Rameau P, Gruszczynski C, Peltekian E, Danos O, Garcia L. (2004) FGF6 mediated expansion of a resident subset of cells with SP phenotype in the C2C12 myogenic line. J Cell Physiol, 201, 409^119.

77. Jackowski G, Liew CC. (1980) Fluorescamine staining of nongistone chromatine proteins as revealed by two-dimensional polyacrylamid gel electrophoresis. Anal. Biochim., 102, 321-325.

78. Jacquemin V, Furling D, Bigot A, Butler-Browne GS, Mouly V. (2004) IGF-1 induces human myotube hypertrophy by increasing cell recruitment. Exp Cell Res, 299, 148-158.

79. Jostes B, Walther C, Gruss P. (1990) The murine paired box gene, Pax7, is expressed specifically during the development of the nervous and muscular system. Mech Dev, 33, 27-37.

80. Joulia D, Bernardi H, Garandel V, Rabenoelina F, Vernus B, Cabello G. (2003) Mechanisms involved in the inhibition of myoblast proliferation and differentiation by myostatin. Exp Cell Res, 286, 263-275.

81. Kablar B, Asakura A, Krastel K, Ying C, May LL, Goldhamer DJ, and Rudnicki MA. (1998) MyoD and Myf-5 define the specification of musculature of distinct embryonic origin. Biochem Cell Biol, 76, 1079— 1091.

82. Kahn EB, Simpson SB Jr. (1974) Satellite cells in mature, uninjured skeletal muscle of the lizard tail. Dev Biol, 37, 219-223.

83. Kaufmann U, Martin B, Link D, Witt K, Zeitler R, Reinhard S, and Starzinski-Powitz A. (1999) M-cadherin and its sisters in development of striated muscle. Cell Tissue Res, 296, 191-198.

84. Kislinger T, Gramolini AO, Pan Y, Rahman K, MacLennan DH, Emili A. (2005) Proteome dynamics during C2C12 myoblast differentiation. //Mol Cell Proteomics, 4, 887-901.

85. Klerk H, Jespers A. (1990) GELANAL, a personal computer-program to compare protein pat-terns on two-dimensional polyacrylamide gels. Electrophoresis, 11, 420-424.

86. Klose J. (1975) Protein mapping by combined isoelectric focusing and electrophoresis of mouse tissue. A novel approach to testing for induced point mutations in mammals. Hum. Genet., 26, 231-243.

87. Klose J. (1989) Systematic analysis of the total proteins of a mammalian organism: principles, problems and implications for sequencing the human genomo,. Electrophoresis, 10, 140-152.

88. Koomen JM, Shih LN, Coombes KR, Li D, Xiao LC, Fidler IJ, Abbruzzese JL, Kobayashi R. (2005) Plasma protein profiling for diagnosis of pancreatic cancer reveals the presence of host response proteins. Clin Cancer Res, 11, 1110-1118.

89. Kovalyov LI, Shishkin SS, Efimochkin AS, Kovalyova MA, Ershova ES, Egorov ТА, Musalyamov AK. (1995) The major protein expression profile and two-dimensional protein database of human heart. Electrophoresis, 16, 1160-1169.

90. Kurek JB, Bower J J, Romanella M, Roentgen F, Murphy M, Austin L. (1997) The role of leukemia inhibitory factor in skeletal muscle regeneration. Muscle Nerve, 20, 815—822.

91. Kwak KB, Chung SS, Kim OM, Kang MS, Ha DB, Chung CH. (1993) Increase in the level of m-calpain correlates with the elevated cleavage of filamin during myogenic differentiation of embryonic muscle cells. Biochim Biophys Acta, 1175, 243-249.

92. Laemmli UK. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680-685.

93. Lefaucheur J, Sebille A. (1995) Muscle regeneration following injury can be modified in vivo by immune neutralization of basic fibroblast growth factor, transforming growth factor beta 1 or insulinlike growth factor I. J Neuroimmunol, 57, 85-91.

94. Lemkin PF, Lester EP. (1989) Database and search techniques for two-dimensional gel protein data: a comparison of paradigms for exploratory data analysis and prospects for biological modeling. Electrophoresis, 10, 122-140.

95. Liu Z, Bengtsson S, Krogh M, Marquez M, Nilsson S, James P, Aliaya A, Holmberg AR. (2007) Somatostatin effects on the proteome of the LNCaP cell-line. Int J Oncol, 30, 1173-1179.

96. Lopez MF. (1999) Nonequilibrium pH gel electrophoresis (NEPHGE).-Methods Mol Biol, 112,129-131.

97. Mansouri A, Goudreau G, Gruss P. (1999) Pax genes and their role in organogenesis. Cancer Res, 59, 1707s—1710s.

98. Mansouri A, Stoykova A, Torres M, Gruss P. (1996) Dysgenesis of cephalic neural crest derivatives in Pax7-/- mutant mice. Development, 122, 831—838.

99. Maroto M, Reshef R, Munsterberg AE, Koester S, Goulding M, Lassar AB. (1997) Ectopic Pax-3 activates MyoD and Myf-5 expression in embryonic mesoderm and neural tissue. Cell, 89, 139-148.

100. Martin DB, Gifford DR, Wright ME, Keller A, „Yi E, Goodlett DR, Aebersold R, Nelson PS. (2004) Quantitative proteomic analysis of proteins released by neoplastic prostate epithelium. Cancer Res, 64, 347-355.

101. Martin JF, Li L, Olson EN. (1992) Repression of myogenin function by TGF-bl is targeted at the basic helix-loop-helix motif and is independent of E2A products. J Biol Chem, 267, 10956-10960.

102. Mauro A. (1961) Satellite cells of skeletal muscle fibres. J Biophys Biochem Cytol, 9, 493^195.

103. McCroskery S, Thomas M, Maxwell L, Sharma M, Kambadur R. (2003) Myostatin negatively regulates satellite cell activation and self-renewal. J Cell Biol, 162, 1135-1147.

104. McPherron AC, Lawler AM, Lee SJ. (1997) Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-beta superfamily member. Nature, 387, 83-90.

105. Meehan KL, Holland JW, Dawkins HJ. (2002) Proteomic analysis of normal and malignant prostate tissue to identify novel proteins lost in cancer. Prostate, 50, 54-63.

106. Meehan KL, Sadar MD. (2004) Quantitative profiling of LNCaP prostate cancer cells using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry. Proteomics, 4, 1116-1134.

107. Melle C, Bogumil R, Ernst G, Schimmel B, Bleul A, von Eggeling F. (2006) Detection and identification of heat shock protein 10 as a biomarker in colorectal cancer by protein profiling. Proteomics, 6, 2600-2608.

108. Merril C, Harrington MG. (1984) Two-dimensional electrophoresis and ultrasensitive silver staining of cerebrospinal fluid proteins in neurological disease. Clin. Chem., 30, 1933-1937.

109. Miller JB, Schaefer L, Dominov JA. (1999) Seeking muscle stem cells. Curr Top Dev Biol, 43,191-219.

110. Miller KJ, Thaloor D, Matteson S, Pavlath GK. (2000) Hepatocyte growth factor affects satellite cell activation and differentiation in regenerating skeletal muscle. Am J Physiol Cell Physiol, 278, 174-181.

111. Monteoliva L, Albar JP. (2004) Differential proteomics: an overview of gel and non-gel based approaches. Briefings in functional genomics and proteomics, 3, 220—239.

112. Moore R Walsh FS. (1993) The cell adhesion molecule M-cadherin is specifically expressed in developing and regenerating, but not denervated skeletal muscle. Development, 117, 1409-1420.

113. Musaro A, McCullagh KJ, Naya FJ, Olson EN, Rosenthal N. (1999) IGF-1 induces skeletal myocyte hypertrophy through calcineurin in association with GATA-2 and NF-ATc 1. Nature, 400,581-5.

114. Nabeshima Y, Hanaoka K, Hayasaka M, Esumi E, Li S, Nonaka I. (1993) Myogenin gene disruption results in perinatal lethality because of severe muscle defect. Nature, 364, 532-535.

115. Nakamura T, Nishizawa T, Hagiya M, Seki T, Shimonishi M, Sugimura A, Tashiro K, Shimizu S. (1989) Molecular cloning and expression of human hepatocyte growth factor. Nature, 342, 440-443.

116. Nakamura T, Teramoto H, Ichihara A. (1986) Purification and characterization of a growth factor from rat platelets for mature parenchymal hepatocytes in primary cultures. Proc Natl Acad Sci USA, 83, 6489-6493.

117. Nam HW, Simpson R, Kim YS. (2005) N-terminal isotope tagging with propionic anhydride: proteomic analysis of myogenic differentiation of C2C12 cells. J Chromatogr В Analyt Technol Biomed Life Sci, 826, 91-107.

118. Nelson DL, Cox MM. (2004) Lehninger Principles of Biochemistry. 4th Edition. W.H.Freeman and Co.

119. O'Farrell PH, Goodman HM, O'Farrell PZ. (1977) Hight resolution two-dimensional electrophoresis of basic as well as acidic proteins. Cell, 12, 1133-1142.

120. O'Farrell PH. (1975) Hight resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem., 250, 4007-4021.

121. Ordahl CP, Williams BA, Denetclaw W. (2000) Determination and morphogenesis in myogenic progenitor cells: an experimental embryological approach. Curr Op Dev Biol, 48, 319-367.

122. Parekh DJ, Ankerst DP, Troyer D, Srivastava S, Thompson IM. (2007) Biomarkers for prostate cancer detection. J. Urol, 178, 2252-2259.

123. Patterson SD, Aebersold R. (1995) Mass spectrometric approaches for the identification of gel-separated proteins. Electrophoresis, 16, 1791-1814.

124. Popiela H. (1976) Muscle satellite cells in urodele amphibians: faciliatated identification of satellite cells using ruthenium red staining. J Exp Zool, 198, 57-64.

125. Potter DJ. (1990) A review of the CLIP system for the quantitative analysis of two-dimensional electrophoresis gels. Electrophoresis, 11, 415-419.

126. Ramachandran V, Arumugam T, Wang H, Logsdon CD. (2008) Anterior gradient 2 is expressed and secreted during the development of pancreatic cancer and promotes cancer cell survival. Cancer Res, 68, 7811-7818.

127. Rios R, Carneiro I, Arce VM, Devesa J. (2002) Myostatin is an inhibitor of myogenic differentiation. Am J Physiol Cell Physiol, 282, 993-999.

128. Rowland JG, Robson JL, Simon WJ, Leung HY, Slabas AR. (2007) Evaluation of an in vitro model of androgen ablation and identification of the androgen responsive proteome in LNCaP cells. Proteomics, 7, 47-63.

129. Sakaguchi M, Miyazaki M, Sonegawa H, Kashiwagi M, Ohba M, Kuroki T, Namba M, Huh NH. (2004) PKCalpha mediates TGFbeta-induced growth inhibition of human keratinocytes via phosphorylation of S100C/A11. J Cell Biol, 164, 979-984.

130. Sardana G, Jung K, Stephan C, Diamandis EP. (2008) Proteomic analysis of conditioned media from the PC3, LNCaP, and 22Rvl prostate cancer celllines: discovery and validation of candidate prostate cancer biomarkers. J ProteomeRes, 7, 3329-3338.

131. Scheele GA. (1975) Two-dimensional gel analysis of soluble proteins. Characterization of guinea pig exorcine pancreatic proteins. J Biol Chem, 250, 5375-5385.

132. Schultz E. (1996) Satellite cell proliferative compartments in growing skeletal muscles. Dev Biol, 175, 84-94.

133. Seale P, Sabourin LA, Girgis-Gabardo A, Mansouri A, Grass P, Rudnicki MA. (2000) Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell, 102, 777-786.

134. Semsarian C, Wu MJ, Ju YK, Marciniec T, Yeoh T, Allen DG, Harvey RP, Graham RM. (1999) Skeletal muscle hypertrophy is mediated by a Ca2+-dependent calcineurin signalling pathway. Nature, 400, 576-81.

135. Sheehan SM, Tatsumi R, Temm-Grove CJ, Allen RE. (2000) HGF is an autocrine growth factor for skeletal muscle satellite cells in vitro. Muscle Nerve, 23, 239-245.

136. Shinin V, Gayraud-Morel B, Gomes D, Tajbakhsh S. (2006) Asymmetric division and cosegregation of template DNA strands in adult muscle satellite cells. Nat Cell Biol, 8, 677-687.

137. Skvortsova I, Skvortsov S, Stasyk T, Raju U, Popper В A, Schiestl B, von Guggenberg E, Neher A, Bonn GK, Huber LA, Lukas P. (2008) Intracellular signaling pathways regulating radioresistance of human prostate carcinoma cells. Proteomics, 8, 4521-4533.

138. Smythe GM, Davies MJ, Paulin D, Grounds MD. (2001) Absence of desmin slightly prolongs myoblast proliferation and delays fusion in vivo in regenerating grafts of skeletal muscle. Cell Tissue Res, 304, 287-294.

139. Sonegawa H, Nukui T, Li DW, Takaishi M, Sakaguchi M, Huh NH. (2007) Involvement of deterioration in S100C/A11-mediated pathway in resistance of human squamous cancer cell lines to TGFbeta-induced growth suppression. J Mol Med, 85, 753-762.

140. Stamey ТА, Caldwell M, McNeal JE, Nolley R, Hemenez M, Downs J. (2004) The prostate specific antigen era in the United States is over for prostate cancer: what happened in the last 20 years? J. Urol, 172, 12971301.

141. Sun W, Ye Z, Mi Z, Shi T, Han C, Guo S. (2008) A comparative study on proteomics between LNCap and DU145 cells by quantitative detection and SELDI analysis. JHuazhong Univ Sci Technolog MedSci, 28, 174-178.

142. Suzuki J, Yamazaki Y, Li G, Kaziro Y, Koide H. (2000) Involvement of Ras and Ral in chemotactic migration of skeletal myoblasts. Mol Cell Biol, 20, 4658^4665.

143. Suzuki S, Yamanouchi K, Soeta C, Katakai Y, Harada R, Naito K, Tojo H. (2002) Skeletal muscle injury induces hepatocyte growth factor expression in spleen. Biochem Biophys Res Commun, 292, 709—714.

144. Tajbakhsh S, Rocancourt D, Cossu G, Buckingham M. (1997) Redefining the genetic hierarchies controlling skeletal myogenesis: Pax-3 and Myf-5 act upstream of MyoD. Cell, 89, 127-138.

145. Tatsumi R, Anderson JE, Nevoret CJ, Halevy O, Allen RE. (1998) HGF/SF is present in normal adult skeletal muscle and is capable of activating satellite cells. Dev Biol, 194, 114-128.

146. Tatsumi R, Hattori A, Ikeuchi Y, Anderson JE, Allen RE. (2002) Release of hepatocyte growth factor from mechanically stretched skeletal muscle satellite cells and role ofpH and nitric oxide. Mol Biol Cell, 13, 2909-2918.

147. Temm-Grove CJ, Wert D, Thompson VF, Allen RE, Goll DE. (1999) Microinjection of calpastatin inhibits fusion in myoblasts. Exp Cell Res, 247, 293-303.

148. Thomas M, Langley B, Berry C, Sharma M, Kirk S, Bass J, Kambadur R. (2000) Myostatin, a negative regulator of muscle growth, functions by inhibiting myoblast proliferation. J Biol Chem, 275, 40235-40243.

149. Thompson IM, Ankerst DP. (2007) Prostate-specific antigen in the early detection of prostate cancer. CMAJ, 176, 1853-1858.

150. Tiffin N, Williams RD, Shipley J, Pritchard-Jones K. (2003) PAX7 expression in embryonal rhabdomyosarcoma suggests an origin in muscle satellite cells. Br J Cancer, 89, 327-332.

151. Tomlinson IM, Holt LJ. Protein profiling comes of age. Genome Biol, 2, REVIEWS1004.1-1004.3.

152. Tschiedel S, Gentilini C, Lange T, Wolfel C, Wolfel T, Lennerz V, Stevanovic S, Rammensee HG, Huber C, Cross M, Niederwieser D. (2008) Identification of NM23-H2 as a tumour-associated antigen in chronic myeloid leukaemia. Leukemia, 22, 1542-1550.

153. Unlu M, Morgan ME, Minden JS. (1997) Difference gel electrophoresis: a single gel method for detecting changes in protein extracts. Electrophoresis, 18, 2071-2077.

154. Wagner ICR, Liu X, Chang X, Allen RE. (2005) Muscle regeneration in the prolonged absence of myostatin. Proc Natl Acad Sci USA, 102, 2519—2524.

155. Wagner KR, MePherron AC, Winik N, Lee SJ. (2002) Loss of myostatin attenuates severity of muscular dystrophy in mdx mice. Ann Neurol, 52, 832-836.

156. Wallace A, Saluz H. (1994) Detection of subpicogram quantities of protein in polyacrylamide gels. / In: Cell biology (Ed. J.Celis), N.Y., Acad.Press, 3, 288-298.

157. Wallenius V, Wallenius K, Ahren B, Rudling M, Carlsten H, Dickson SL, Ohlsson C, Jansson JO. (2002) Interleukin-6-deficient mice develop mature-onset obesity. Nat Med, 8, 75-79.

158. Wang Z, Hao Y, Lowe AW. (2008) The adenocarcinoma-associated antigen, AGR2, promotes tumor growth, cell migration, and cellular transformation. Cancer Res, 68, 492-497.

159. Wasinger VC, Cordwell. SJ, Cerpa-Poljak A, Yan JX, Gooley AA, Wilkins MR, Duncan MW, Hams R, Williams KL, Humphery-Smith I. (1995) Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium. Electrophoresis, 16, 1090-1094.

160. Weintraub H, Tapscott SJ, Davis RL, Thayer MJ, Adam MA, Lassar AB, Miller AD. (1989) Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD. Proc Natl AcadSci USA, 86, 5434-5438.

161. Wilkins MR, Williams KL, Appel RD, Hochstrasser DF. (1997) Proteomic research: new frontiers in functional genomics (principle and practice). Berlin, Springer Verlag 1997, 464 p.

162. Wulfkuhle JD, Liotta LA, Petricoin EF. (2003) Proteomic applications for the early detection of cancer. Nat Rev Cancer, 3, 267-275.

163. Yaffe D, Saxel O. (1977) Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature, 270, 725-727.

164. Yan JX, Harry RA, Wait R, Welson SY, Emery PW, Preedy VR, Dunn MJ. (2001) Separation and identification of rat skeletal muscle proteins usingtwo-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. Proteomics, 1, 424-434.

165. Yang SY, Goldspink G. (2002) Different roles of the IGF-I Ec peptide (MGF) and mature IGF-I in myoblast proliferation and differentiation. FEBS Lett, 522, 156-160.

166. Yuen HF, Chan YP, Law S, Srivastava G, El-Tanani M, Мак TW, Chan KW. (2008) DJ-1 could predict worse prognosis in esophageal squamous cell carcinoma. Cancer EpidemiolBiomarkers Prev, 17, 3593-3602.

167. Zakharov S, Kwok S, Sokoloff H, Chang H, Radko S, Chrambach A. (1998) The band areas of proteins determined by fluorescent scanning in the commercial automated gel electrophoresis apparatus. Electrophoresis, 19, 1625-1630.

168. Zammit PS, Partridge ТА, Yablonka-Reuveni Z. (2006) The skeletal muscle satellite cell: the stem cell that came in from the cold. J Histochem Cytochem, 54, 1177-1191.

169. Zeschnigk M, Kozian D, Kuch C, Schmoll M, Starzinski-Powitz A. (1995)41.volvement of M-cadherin in terminal differentiation of skeletal muscle cells.JCellSci, 108, 2973-2981.

170. Zhang Y, Forootan SS, Liu D, Barraclough R, Foster CS, Rudland PS, Ke Y. (2007) Increased expression of anterior gradient-2 is significantly associated with poor survival of prostate cancer patients. Prostate Cancer Prostatic Dis, 10, 293-300.

171. Zweitzig DR, Smirnov DA, Connelly MC, Terstappen LW, O'FIara SM, Moran E. (2007) Physiological stress induces the metastasis marker AGR2 in breast cancer cells. Mol Cell Biochem, 306, 255-260.

Информация о работе

Макаров, Андрей Александрович
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.04

Диссертация

Протеомное исследование белков культивируемых мышечных и эпителиальных клеток человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы