Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Трансплантация миобластов и стромальных клеток костного мозга человека в скелетные мышцы мыши

ВАК РФ 03.00.30, Биология развития, эмбриология

Автореферат диссертации по теме "Трансплантация миобластов и стромальных клеток костного мозга человека в скелетные мышцы мыши"

На правах рукописи

Сабурина Ирина Николаевна

Трансплантация миобластов н стромальных клеток костного мозга человека в скелетные мышцы мыши.

03.00.30 - биология развития, эмбриология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА -2003-

Работа выполнена на Кафедре эмбриологии Биологического факультета МГУ имени МВ.Ломоносова и в ЗАО "РеМеТэкс"

Научные руководители: чл.-корр.РАМН В.С.Репин

к.б.н. МЛ.Семеиова

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

д.м.н. Н.В.Миронов к.б.н. Т.Л.Маршак

Российский тчкударствешшй Медицинский университет им. Н.И.Пирогова

Защита диссертации состоится СЖидбр^ 2003 года

в ¡5- ЬОцдсов на заседании диссертационного Совета Д.501.001.52 в Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан "23>я с^^Т-Уь^Я 2003 года.

Ученый секретарь диссертационного совета к.б.н. Р^-----Е.Н.Калистрагова

2004-4 25069

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Последние исследования на млекопитающих свидетельствуют о том, что самообновление и репарация тканей идет за счет локальных и системных процессов. Генератором локального обновления являются региональные стволовые клетки, а источником системного обновления - стромальные клетки костного мозга (СККМ). В общем виде эта схема поддержания клеточного гомеостаза подтверждена и для тканей человека (ПесЫу К.\У. е1 а1.,2000). Если СККМ постоянно используются организмом для самообновления эндотелия и специализированной паренхимы, то региональные стволовые клетки выступают на первый план в случае интенсивной локальной репарации после травмы, вирусных и прочих местных поражений (Оооёе1 й а1., 1997). В работах последних лет показано, что в ходе процессов репарации регулированная численность СККМ не только направленно поступает в зоны повреждения, но и направленно дифференцируется в региональные соматические клетки без побочных аномалий дифференцировки (Ъа^яе й а1., 2000; $Ъгаиег й а1.,2002). Эта закономерность обновления и репарации соматических клеток с помощью двух источников стволовых клеток сейчас используется в медицине для лечения многих наследственных, аутоиммунных и возрастных дегенеративных заболеваний. Клеточная заместительная терапия мышечной дистрофии Дюшенна начала апробироваться в клинике в начале 90-х годов XX века. Как известно, дистрофин-дефицитные мышечные волокна подвергаются быстрой дегенерации при сокращении. В скрытую фазу заболевания разрушение мышечных волокон компенсируется интенсивной регенерацией. Клиническая манифестация начинается в период роста детей, когда резервы регенерации не в состоянии компенсировать деградацию мышц. В экспериментах на животных и первых испытаниях в клинике было показано, что локальная массивная трансплантация однородных аллогенных миобластов, размноженных ных в

скелетные мышцы, приводит к образованию химерных мышечных волокон, способных синтезировать дистрофии (Law et al.,1997). Однако интенсивная региональная гибель миобластов после внутримышечного введения заставила искать альтернативные источники клеток. Наиболее продвинутыми оказались эксперименты с локальным и системным введением СККМ, но многочисленные работы по оценке эффективности трансплантации миобластов и СККМ в скелетные мышцы трудно интерпретируются, поскольку проводились не в стандартных условиях, с клетками, полученными разными способами, имеющими разный исходный фенотип. В опытах на разных линиях животных, в разную фазу заболевания использовались разные дозы клеток (Ohlendieck et al., 1991; Liu et al., 1998; Duelas et al., 1998; Piccolo et al., 2000; Young et al., 2001). В таких случаях только сравнительный анализ активности миобластов и СККМ в одних экспериментах и на одной выборке животных позволяет выявить разницу в поведении клеток.

Пели и задачи исследований. Целью данного исследования являлось изучение сравнительного поведения и судьбы эмбриональных миобластов и СККМ человека при их трансплантации в нормальные и дистрофин-децицитные скелетные мышцы мыши идентичным методом. В связи с этим были поставлены следующие задачи: провести сравнение способности клеток разного происхождения участвовать в регенерации мышечных волокон; проанализировать пригодность различных популяций культивированных клеток для трансплантаций, их способность дифференцироваться в клетки соответствующего фенотипа; изучить возможности применения данных клеточных популяций при лечении наследственных заболеваний скелетной мускулатуры; разработать модель для проведения предклинической экспресс-оценки состояния этих клеток.

Научная новизна. В данной работе впервые была прослежена судьба пересаженных миобластов и СККМ в течение первых суток после введения. Было показано, что при введении миобластов и СККМ в скелетную мышцу подавляющая часть погибших клеток оставалась в

г ■« } ' * Л *

зоне введения, тогда как живые клетки выявляются исключительно в неповрежденных участках ткани, а миграционный фронт клеток формировался в течение первых 6 часов и зона распространения донорских клеток практически не увеличивалась в более поздние сроки. Если популяции мигрирующих миобластов наблюдались в области эндомизия интактных волокон, то СККМ накапливались преимущественно в эпимизии и перимизии тех же мышц. Данное распределение донорских клеток было подтверждено при анализе положения дистрофин-положительных донорских клеток в мышечной ткани мышей линии С57В1/101-тёх на сроках до 37 дней после трансплантации.

Результаты данного исследования показали, что происходит атипическое, не характерное для нормальных мышц мыши, распределение дистрофина при использовании для трансплантации культуры эмбриональных миобластов и СККМ, полученных из плодов 17-19 недель развития, а наилучшие результаты дала трансплантация культивированных миобластов, полученных из эмбрионов 9-11 недель развития.

Практическая значимость Полученные данные имеют существенное значение для клинической трансплантологии, поскольку доказывают различные способы и пути направленной миграции миобластов и СККМ в скелетной мышце. В работе впервые визуализирован и доказан факт преимущественной гибели пересаженных клеток в зоне введения. Эти данные в дальнейшем могут использоваться для улучшения эффективности трансплантации. Был разработан метод экспресс-оценки поведения трансплантированных клеток в тканях животного, который может быть применен для оценки пригодности разных популяций клеток для репарации поврежденных тканей при проведении предклинических испытаний. Предложенный метод может использоваться для оценки эффективности трансплантации не только в миологии, но и в кардиологии, неврологии, ортопедии.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на научном семинаре кафедры эмбриологии биологического ф-та МГУ им. Ломоносова и представлены на Международном междисциплинарном семинаре «Новые технологии в медицине и экологии, интегративная медицина» (Словакия, 2003г.) и следующих конференциях: "Стволовые клетки и перспективы их использования в здравоохранении" (Москва, 2003); Всероссийская конференция "Гистологическая наука России в начале ХХГ века: итоги, задачи, перспективы" (Москва, 2003); 2-ой московский международный конгресс «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2003).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Объем и структура работы. Материалы диссертации изложены на 141 страницах машинописного текста и сгруппированы в следующие разделы: введение, обзор литературы, описание использованных методов, изложение результатов и выводы. Работа проиллюстрирована 92 микрофотографиями, графиками и рисунками, а также 9 таблицами. Список процитированной литературы содержит 171 источников (из них 32 работы отечественных авторов, в том числе и опубликованных в иностранных журналах, и 145 работ зарубежных авторов).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

В качестве донорского материала использовался фетальный абортивный материал, полученный при искусственном прерывании беременности. Для получения первичной культуры миобластов фрагменты мышечных волокон, выделенных механически из закладки ягодичных мышц эмбрионов, соответствующих двум срокам гестации (7-12 нед. и 18-20 нед.), измельчали и подвергали ферментативной дезагрегации с использованием раствора диспазы, пипетировали до получения одноклеточной суспенции, центрифугировали (10 мин, 1000 об/мин.) и культивировали в ростовой среде ДМЕМ/Р12 (1:1) с

добавлением 2 мМ L-глютамина; 50 мкг/мл гентамицина, ИТС (инсулин, трансферин, селенит, 1:100); EGF (epidermal growth factor, 20 нг/мл), и 20% эмбриональной телячьей сыворотки в плотности не менее ЮОтыс. кл/мл. При образовании миобластами плотного монослоя клетки дезагрегировали 0,05% р-ром трипсина и перепассировали; длительность культивирования составляла 16-35 дней, что соответствовало 4-7 пассажам. Для oí дельных культур длительность культивирования составила более двух месяцев. Для индукции дифференцировки миобластов ростовую среду в культурах заменяли не каждые два дня, а через 5-6 дней. Для трансплантаций использовали клетки четвертого и пятого пассажей с общим сроком культивирования от 15 до 20 дней.

СККМ получали из бедренных костей плодов человека 17-19 нед. гестации путем промывания полости кости раствором Хэнкса с помощью иглы 16G, насаженной на шприц. Полученную суспенцию центрифугировали (10 мин, 1000 об/мин, 2 раза), полученный клеточный осадок ресуспендировали в ростовой среде следующего состава: ДМЕМ/Р12 (1:1), 2мМ L-глютамина, ИТС (инсулин, трансферин, селенит, 1:100), 50 мкг/мл гентамицина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки и рассевали в плотности не менее 1 млн. клеток / мл. Через 2-3 суток культивирования среду с не прикрепившимися кроветворными клетками костного мозга сливали, добавляли свежую среду, и продолжали культивировать оставшиеся прикрепленными ко дну чашки клетки стромы еще 8-12 сут, меняя среду каждые 3 суток. При достижении плотного монослоя культуру рассеивали в соотношении 1:2. Общая длительность культивирования составляла 18-20 дней. Для трансплантаций использовали первичные культуры СККМ или после первого пассажа.

Перед трансплантацией монослой миобластов и СККМ дезагрегировали, клеточную суспензию отмывали в растворе Хэнкса. Для визуализации клеток после трансплантации их окрашивали ядерным люминесцентным красителем бисбензимидом (Hoechst 33342, Serva) по методике, используемой нами в предыдущих исследованиях

(Александрова, Сабурина и др., 2001). Перед каждой инъекцией клеток животным-реципиентам суспензию тщательно пипетировали.

Для визуализации живых и погибших клеток и анализа их распределения в тканях животного-реципиента мы использовали нижеследующую, разработанную нами методику двойного флуоресцентного окрашивания. Суспензию культивированных эмбриональных миобластов и СККМ человека окрашивали по следующей схемс: 1) для визуализации ядер суспензию клеюк инкубировали в растворе бисбензимида (Hoechst 33342) в PB S в концентрации 0,02 мг/мл с последующей отмывкой в растворе Хенкса; 2) для выявления живых и мертвых клеток использовали LIVE/DEAD киг (Molecular Probes, L-23103) с флуоресценцией в красной части спектра; окрашивание суспензии клеюк проводили в соответствии с протоколами производителя, но перед трансплантаций отмывки реакшва не проводили. LIVE/DEAD кит, не оказывающий питотоксического воздействия, предлагается фирмой Molecular Probes для выявления погибших клеток методами флуоресцентной микроскопии и проточной цитофотометрии. Клетки с поврежденной мембраной светятся в 100 раз ярче ингактных, т.к. краситель проходит через мембраны погибших клеюк и связывается со свободными амииогруппами как на поверхности, так и внугри клеток. Живые клетки окрашиваются слабо, поскольку в них краситель может взаимодействовать со свободными аминогруппами только на клеточной поверхности.

Эксперименты по трансплантации клеток проводили на лабораторных мышах линий ICR (самцы возраста 2-2,5 мес., п=40) и C57BL/10J-mdx (mucular dystrophy X-chromosome linked, самцы возраста 4-6 мес., п=29), выращенных в виварии кафедры эмбриологии МГ У им. М.В .Ломоносова. Мыши C57BL/10J-mdx страдают мышечной дистрофией, гистологически и генетически гомологичной мышечной дистрофии Дюшена/Беккера человека (Bulfield et al., 1984). Мутация mdx носит точечный характер, приводит к преждевременной терминации трансляции гена дистрофина (Sicinski et al., 1989) в

результате чего в мышечных волокнах отсутствует продукт его экспрессии. Эта линия мышей является всемирно признанной моделью для исследования патологического процесса, протекающего при миодистрофиях и широко используется в экспериментах по разработке методов лечения данных заболеваний.

Для экспериментов отбирали самцов в возрасте 10-12 недель. Перед трансплантацией клеток в мышечную ткань мышь наркотизировали внутрибрюшинным введением калипсола (кетамин гидрохлорид 500 мг/10мл в форме солянокислой соли, Гедеон Рихтер АО, Венгрия) в расчете 0,004 мл на 1 грамм массы животного.В поверхностную и среднюю ягодичные мышцы (m. glutaeus superficialis, т. glutaeus medius) с помощью гамильтоновского шприца мышам вводили клеточную суспензию в разведении 500 тыс. клеток в 1 мкл на глубину 2-3 мм по приведенной ниже схеме (таблица 1) или физиологический раствор в том же объеме (контрольная группа).

Через 30 минут, 2, 6 и 18 часов, 15 и 37 суток после проведенной операции мышей умервщляли путем дислокации шейных позвонков, диссектировали ягодичную мышцу, ориентировали ее на алюминиевой подложке для последующей резки поперек мышечных волокон и замораживали в жидком азоте.

Таблица 1: Схема трансплантаций эмбриональных клеток человека в скелетные мышцы мыши

Вид клеток Время Объем Общее кол-во

культивирования раствора клеток

Миобласты, полученные от 20дней, 5 мкл (5 инъекций 2 500 000

эмбрионов 9-ти нед. разви- 4-ый пассаж по 1 мкл)

тия

Миобласты, полученные от 20 дней, 5 мкл (5 инъекций 2 500 000

плодов 19-ти нед. развития 3-ий пассаж по 1 мкл)

СККМ, полученные от 19 дней, 5 мкл (5 инъекций 2 500 000

плодов 19-ти нед. развития 1-ый пассаж по 1 мкл)

Исследуемые кусочки мышц извлекали из жидкого азота и приготовляли серийные криостатные срезы толщиной 10 - 15 мкм,

высушивали их при комнатной температуре и просматривали под люминесцентным микроскопом (Axiovert 25, K.Zeiss) По люминесцентному свечению клеток, окрашенных бисбензимидом, отбирали срезы с трансплантированными клетками.

Для визуализации специфического мышечного белка десмина в миобластах, последние инкубировали с мышиными моноклональными антителами к десмину человека ("Biotrend"), а затем с антимьппиными иммуноглобулинами кролика, конъюгированными с FITC ("Abeam") в течение 2 часов при 37°С. Дистрофии выявляли, инкубация криостатные срезы мышц с моноклональными антителами мыши к дистрофину человека (Abeam) в течение 2 часов при 37°С и с антимышиными иммуноглобулинами козы, конъюгированными с фикоэритрином (Abeam).

Для изучения миграционной способности трансплантированных клеток серийные срезы просматривали под люминесцентным микроскопом, отбирали те, на которых видна была зона прокола (идентифицировалось по массе LIVE/DEAD кит положительных клеток) и фотографировали цифровой камерой. На фотографиях измеряли треки (пути) бисбензимид-положительных клеток, как наименьшее расстояние, отделяющее данную клетку от края зоны прокола. Статистическую обработку результатов проводили при помощи компьютерной программы Stadia 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Получение эмбриональных клеточных культур. В работе использовались фетальные ткани от 13-ти эмбрионов 7-12 недель развития (миобласты) и 5-ти плодов 18-20 недель развития (миобласты и СККМ). Выделенные миобласты вели на непокрытых пластиковых чашках Петри (d=90MM) в среде DMEM/F12 с добавлением 20% сыворотки. Более 80% миобластов, полученных из 7-12 нед. эмбрионов, после рассева прикреплялись ко дну культуральной чашки в течение 1-3 часов, в то время как миобласты, полученные из 18-20 нед. плодов,

прикреплялись в течение 24-35 часов. Длительность культивирования миобластов, полученных от 7-12 недельных эмбрионов, составляла не менее 30 дней. При этом, достигая высокой плотности, клетки не сливались, оставаясь одноядерными и сохраняли свой миогенный фенотип (Рис. 1А). Для оценки чистоты и однородности культур использовали тест на десмин, коллаген I и коллаген III типа ( определялась примесь фибробластов). Миобласты на 4-5 пассажах сохраняли до 95% десмин+ клеток, не содержали коллаген 1+ и коллаген III+ клеток и при индуцированной дифференцировке формировали симпласты и миотубы (Рис. 1В).

А Б В

Рис.1. Культуры эмбриональных миобластов (фазово-контрастная микроскопия):

А - миобласты от 9-ти нед эмбрионов человека, 14 день культивирования; Б - миобласты от 19-ти. нед плодов человека, 2 день культивирования; В - индуцированная дифференцировка миобластов, 26 день культивирования; образование симпластов и миотубов. (Измерительный отрезок - 100, 40 и 60 мкм для А, Б и С соответственно)

При тех же самых условиях культивирования в культурах миобластов, полученных от плодов более поздних сроков, слияние отдельных клеток можно было увидеть уже на 2-3 день культивирования, клетки выстраивались в один ряд, образуя

протяженные цепочки (Рис. 1 Б). Миобласты, полученные от плодов 1820-ти нед. развития, сохраняли незрелый фенотип в течение 16-20 дней (3-4 пассажа).

При культивировании миобластов различалось время, необходимое для образования полного монослоя. Для миобластов, полученных от 7-12 нед. эмбрионов достатчно было 3-4 сут., а для миобластов, полученных от 18-20-ти нед. плодов требовалось не менее 5-6 сут. О пролиферативной активности клеточных культур миобластов судили по индексу пролиферации (отношение количества выросших за 4 дня клеток к числу посеянных) (рис. 2)

индекс пролиферации

номер гтсслжя

Рис.2: Индекс пролиферативной активности культур миобластов, полученных от 7-12 нед. (1) и 18-20 нед.(2) эмбрионов.

Если индекс пролиферативной активности для миобластов 7-12 нед. сохранялся высоким в течение 5 пассажей, то для миобластов 18-20 нед.индекс пролиферативной активности имел тенденцию к снижению к 5 пассажу.

В отличие от миобластов, для СККМ прикреплялись ко дну культуральных чашек только через 3 дня. Прикрепленная популяция состояла из двух морфологически различимых типов фибробластоподобных клеток: больших распластанных и мелких игольчатых или веретеновидных (Рис. ЗА). Плотный монослой из

СККМ образовывался лишь к 10 дню культивирования. Гетерогенность СККМ сохранялась при дальнейшем культивировании и отчетливо выявлялась при трипсинизации (Рис. 36)

А Б

Рис. 3: Культуры эмбриональных СККМ (фазово-контрастная микроскопия): А СККМ от 19-ти нед. плодов человека, 4-ый день культивирования; Б - СККМ после трипсинизации, 14 день культивирования; гетерогенность клеточной культуры. (Измерительный отрезок - 80мкм (А) и 40 мкм (Б)

Трансплантация эмбриональных миобластов и СККМ мышам линии С57В1/10.)-тс1х. При трансплантации эмбриональных миобластов и СККМ, мышей С57В1/101-тёх разделили на 3 экспериментальные группы: первой (п=8) инъецировали миобласты, полученные от эмбрионов 9-ти нед. развития, второй (п=8) - миобласты, полученные от плодов 19-ти нед. развития, а третьей (п=8) - СККМ, также полученные от плодов 19 нед. развития. Животным контрольной группы (п=5) параллельно вводили по 5 мкл физиологического раствора. Результаты этих экспериментов представлены на Рис.4-6. Мышечные волокна, положительно окрашенные на дистрофии, были обнаружены у всех мышей, которым инъецировали эмбриональные клетки. Однако выявлялись существенные различия в локализации дистрофина в мышечной ткани в разных экспериментальных группах.

В группе животных, которым инъецировали культивированные миобласты, полученные от эмбрионов ранних сроков развития (9 нед.), присутствие большого количества дистрофин-положительных волокон

выявлялось в области повреждения. Как правило, дистрофии располагался в кортикальной области мышечных волокон. Он вьивлялся на препаратах сплошной светящейся линией по периметру срезанных поперек мышечных волокон (Рис. 4А).

Рис. 4. Поперечные гистологические срезы ягодичной мышцы мыши, обработанные I антителами мыши к дистрофину человека и II антителами козы, конъюгированными с фикоэритрином.

A, Б - распределение дистрофина через 37 дней после транплантации

миобластов от 9-ти нед. эмбрионов человека; дистрофии присутствует во всех мышечных волокнах, находящихся непосредственно около области инъекции и занимает в них периферическое положение в кортикальной области волокна, характерное для нормальных мышечных волокон;

B. Г - распределение дистрофина через 37 дней после транплантации

миобластов от 19-ти нед. плодов человека: атипичное распределение дистрофина выражено в диффузном свечении цитоплазмы дистрофин-положительных волокон.

(А, В - люминесцентная, Б,Г - фазово-контрастная микроскопия)

Рис. 5. Распределение дистрофина в мышечных волокнах через 37 дней после трансплантации миобластов от 19-ти. нед плодов человека (обработка антителами к дистрофину); стрелками показаны мелкие дистрофин-положительные клетки, прилегающие к регенерировавшим мышечным волокнам.

(А, Б - люминесцентная, В - фазово-контрастная микрофотография участка, представленного на фотографии Б)

Такое распределение дистрофина соответствовало его локализации у мышей нормального фенотипа. На всех препаратах интенсивность свечения фикоэритрина ослабевала по мере удаления от места введения эмбриональных клеток. На периферии дистрофин-положительной области в большинстве мышечных волокон наблюдалась лишь частичная флуоресценция в кортикальной области. Уровень и морфологический характер гетерогенности клеток совпадал с результатами, описанными в других работах (Colter et al., 2001; Poulson et al., 2002; Hung et al., 2002)

Второй группе животных инъецировали миобласты, полученные от плодов 19-ти нед. развития. У всех животных этой группы так же обнаружены зоны дистрофин-положительных мышечных волокон, располагающихся в области прокола. Периферическое свечение фикоэритрина соответствовало распределению дистрофина в, мышечных волокнах с нормальным фенотипом. Однако, во внутренней зоне дистрофин-положительной области, прилегающей непосредственно к месту прокола, были обнаружены группы волокон с

атипичным расположением дистрофина. Кроме более яркого свечения по периферии наблюдалось выраженное диффузное свечение всего мышечного волокна (Рис. 4В; Рис 5Б). На периферии дистрофин-положительной области, также как и у животных первой группы обнаруживались волокна с частичным, очаговым свечением кортикальной области (Рис. 5А, Б).

Животным третьей группы инъецировали СККМ, полученные от плодов 19-ти недель развития. У всех животных этой группы вокруг места введения клеток в мышечной ткани наблюдались дистрофин-положительные области с нетипичным распределением флуоресцентной метки. Дистрофии в основном располагался вдоль крупных соединительнотканных оболочек мышц (по эпимизию и в основном по перимизию) (Рис. 6А, В, Д), причем свечение фикоэритрина распределялось не равномерно вдоль соединительнотканной оболочки, а в виде дискретных, ярких очагов. Кроме такого нетипичного распределения дистрофина, редко встречались мышечные волокна с нормальным его распределением по кортикальному слою.

Но во всех трех экспериментальных группах при введении различных клеточных культур дистрофии положительные области, соответствующие зоне расположения транспортированных клеток занимали локальные ограниченные области в мышечной ткани и располагались вокруг зон введения эмбриональных клеток.

Исследование распространения эмбриональных миобластов и СККМ в мышечной ткани в первые сутки после трансплантации.

Для анализа процесса формирования зоны распространения трансплантированных клеток в первые часы после пересадки была разработана методика двойного флюоресцентного мечения клеток перед инъекцией, о которой говорилось в разделе материалов и методов. После стандартного окрашивания бисбензимидом клетки ресуспензировали в растворе, содержащим некрокит и затем суспензию меченных клеток инъецировали в ягодичную мышцу мышей ICR по

Рис 6. Поперечные гистологические срезы ягодичной мышцы мыши через 37 дней после транплантации эмбриональных СККМ человека (обработка антителами к дистрофину); показано расположение дистрофин-положительных клеток преимущественно в области перимизия и эпимизия: А, Б - центральная область распределения дистрофина; В, Г - краевая область распределения дистрофина; Д, Е - единично встречающиеся мышечные волокна с нормальным распределением дистрофина (показано стрелкой). (А, В, Д - люминесцентные микрофотографии и Б, Г, Е - фазово-контрастные микрофотографии соответственно).

методике, описанной выше. В этой серии экспериментов были исследованы криостатные срезы мышцы следующих групп животных с введением СККМ (0,5; 2; 6 и 18 часов после трансплантации, п=5 в трансплантации п=5 в каждой группе)

Рис. 7. Гистологические срезы мышечной ткани, окрашенный для выявления живых и погибших трансплантированных клеток (миобласты, 0,5 часа после инъекции)

А - фазово-контрастная микрофотография; Б - распределение клеток, окрашенных бисбензимидом в мышечной ткани вокруг зоны прокола; В - скопление погибших клеток в зоне прокола.

(длина измерительного отрезка - 200 мкм)

Через 0,5 часа после инъекции вокруг прокола формировалась зона распространения трансплантированных клеток. При этом погибшие клетки (имеющие ядра, окрашенные бисбензимидом и цитоплазму, окрашенную китом LIVE/DEAD) располагались в виде скопления непосредственно в зоне прокола, а живые клетки, демонстрирующие только свечение бисбензимида, находились в толще мышечной ткани вокруг зоны прокола, в неповрежденных мышечных волокнах (Рис. 7). Та же картина распределения живых и погибших клеток была обнаружена через 2, 6 и 18 часов после инъекции. Результаты данного исследования показывают, что в первые часы после инъекции клеток происходит миграция трансплантированных клеток, а

А

Б

В

не инфузия всей массы клеток в результате избыточного давления при инъекции, так как в этом случае наблюдалось бы равномерное распределение на срезах живых и погибших клеток. Очевидно, все погибшие клетки остаются в зоне прокола в виде агрегатов, а жизнеспособные клетки мигрируют вглубь мышечной ткани.

При трансплантации эмбриональных миобластов и СККМ уже через 2 часа наблюдались существенные различия в распределении разных популяций клеток в мышечной ткани. Эмбриональные миобласты распространялись в мышечной ткани равномерно вокруг зоны прокола, причем большее количество бисбензимид-положительных клеток наблюдалось ближе к месту введения. При введении СККМ меченые клетки наблюдались на более дальних расстояниях от зоны прокола, чем миобласты, при этом бисбензимид положительные клетки располагаются в виде цепочек вдоль соединительно-тканной оболочки мышцы (в основном в перимизии). Статистическую обработку результатов измерений, включающую в себя анализ типа распределения, проводили при помощи программы Stadia 6.0. Так как при анализе значений выборок было выяснено, что во всех случаях распределение отличалось от нормального, для проведения сравнений использованы не выборочные средние, а медианы выборок; анализ проводили при помощи непараметрических критериев сдвига (критерии Вилкоксона и Ван дер Вердена). Гистограммы распределений, представленные на Рис. 8, дают возможность предположить, что как при трансплантации миобластов, так и при трансплантации СККМ методом локального введения, в суспензии присутствовали клетки с разной способностью к миграции вглубь мышечной ткани реципиента. Большая часть миобластов мигрировала на расстояние до2000 мкм. При трансплантации СККМ наблюдались 2 клеточные субпопуляци мигрирующих клеток. Первая - клетки с невысокой способностью к миграции, которые располагались на расстоянии до 1000-1500 мкм от зоны введения и вторая популяция -активно мигрирующие клетки, которые наблюдались на расстоянии 1500-4000 мкм. Наличие достоверных различий при сравнении выборок,

соответствующих 0,5, 2 и 6 часам после трансплантации клеток свидетельствует об увеличении зоны распространения трансплантированных клеток (как миобластов, так и СККМ) в этот период времени.

Шве

0 1 2 3 4 *ЕЗ 0 1 2 3 4 *ЕЗ

1 в

1_

|||

III. 1 1

I М1П ■

11

0 1 2 3 4 *ЕЗ 0 1 2 3 4 "ЕЗ

Рис. 8: Гистограммы распределения расстояний, отделяющих трансплантированные клетки от инъекционного трека: миобласты через 6 (А) и 18 часов (В) и СККМ через 6 (Б) и 18 часов (Г) часов после инъекции.

(по оси абсцисс отложено расстояние в микрометрах, по оси ординат - количество клеток)

Однако, при сравнении медиан выборок, соответствующих 6 и 18 часам достоверных различий не было выявлено как для миобластов, так и для СККМ. Эти результаты свидетельствуют о том, что при локальной инъекции эмбриональных клеток в мышечную ткань, зона распространения этих клеток формируется в первые 6 часов и в последствии практически не увеличивается. Эти данные совпадают с нашими результатами, полученными при анализе распределения

дистрофин-положительных клеток в мышечной ткани мыши после трансплантации эмбриональных миобластов и СККМ На более поздних сроках (более месяца) после трансплантации донорские клетки также располагаются в виде ограниченных локальных областей вокруг зон введения. В наших предыдущих работах было показано, что прогениторные клетки других типов тоже обладают достаточно ограниченной способностью к миграции вглубь тканей животного реципиента. Нейральные прогениторные клетки при трансплантации в мозг крыс мигрировали на расстояние от 200-300 мкм до 1500-2000мкм от места инъекции (Александрова и др., 2001). По-видимому, расстояния в несколько миллиметров является предельным значением при миграции трансплантированных прогениторных клеток в ткани реципиента.

выводы

1. Налажен метод стандартного получения однородной культуры эмбриональных миобластов человека (ЭМЧ) из фетальной ткани 7-12 нед и 18-20 нед развития. Миобласты на 4-5 пассаже сохраняли до 95% десмин-положительных клеток, не содержали коллаген I-положительных и коллаген Ш-положительных клеток. До 90% миобластов формировали миотубы in vitro.

2. Показано, что трансплантации ЭМЧ 7-12 нед развития в скелетную мышцу mdx мышей вели к стабильному периферическому встраиванию дистрофин-положительных клеток в кортикальный зоне поврежденных/регенерирующих мышечных волокон mcbc мышей. Трансплантация ЭМЧ 19 нед. развития приводила к достоверному увеличению химерных мышечных волокон с интенсивным диффузным свечение всего мышечного волокна. Причины этих различий не установлены.

3. Аналогичная трансплантация СККМ в скелетную мышцу mdx мышей вела к накоплению пересаженных дистрофин-положительных клеток в перимизии/эпимизии.

4. Для изучения судьбы пересаженных ЭМЧ и СККМ разработан метод количественной оценки распределения живых/погибших клеток в первые сутки после введения.

5. Этим методом установлено, что при введении ЭМЧ и СККМ в скелетную мышцу преобладающая часть погибших клеток оставалась в зоне введения, тогда как живые клетки выявлялись исключительно в неповрежденной ткани. Миграционный фронт клеток формировался в течение первых 6 часов и практически не изменялся в более поздние сроки.

6. Этим же методом выявлены 2 субпопуляции СККМ с разной способностью к миграции в мышечной ткани.

7. Показано, что популяция мигрирующих миобластов наблюдалась в области эндомизия интактных волокон, а СККМ накапливались преимущественно в эпимизии и перимизии тех же мышц.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. М.А. Александрова, И.Н. Сабурина, Л.И. Корочкин, А.В. Ревищин, В.С. Репин, А.А. Ржанинова, Г.Т. Сухих. Поведение и дифференцировка нейрональных стволовых клеток in vivo.// Известия АН. Серия биологическая. 2001,6,656-665.

2. М.А. Александрова, Р.А.Полтавцева, М.В. Марей, А.В. Ревищин, И.Н. Сабурина, И.В. Дубровина, Л.И. Корочкин, Г.Т. Сухих. Трансплантация культивированных нейральных прогениторных клеток человека в мозг крыс: миграция и дифференцировка. //Бюлл. эксперим. биологии и медицины. 2001,132,10,455-458.

3. М.А. Александрова, И.Н. Сабурина, Р.А.Полтавцева, М.В. Марей, И.В. Дубровина, А.В. Ревищин, Л.И. Корочкин, Г.Т. Сухих. Миграция и развитие нейральных стволовых клеток человека при трансплантации в мозг крыс. //Цитология, 2001,43,9,838.

5. М.А. Alexandrova, I.N. Saburina, R.A. Poltavtseva, A.V. Revistchin, L.I. Korochkin, G.T. Sukhikh. Behavior of human neural progenitor cells transplanted to rat brain. //Development Brain Research, 2001, V.132№l-2, P3-1.

6. Сабурина И.Н., Ржанинова A.A., Семенова М.Л., Голиченков В.А., Репин В.С. Трансплантация культивированных миобластов в скелетные мышцы мыши./ Международный междисциплинарный семинар "Новые технологии в медицине и экологии, интегративная медицина" Татры, Словакия, 2003, С.107-111.

7. Сабурина И.Н., Семенова М.Л., Томм Н.А., Ржанинова А.А., Голиченков В.А., Репин В.С. Трансплантация эмбриональных миобластов и стромальных клеток костного мозга человека в скелетную мышцу мышей линии C57BL/10J-mdx. //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2003. в печати.

'P- it 249

РНБ Русский фонд

2004-4 25069

Отпечатано в копицентре «Учебная полиграфия» Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www.stprint.ru e-mail: zakaz@stprint.ru тел 939-3338 Заказ № 375, тираж 50 экз. Подписано в печать 23.09.2003 г.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сабурина, Ирина Николаевна

1.ВВЕДЕНИЕ

2.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 .Применение новых клеточных технологий

2.1.1. История вопроса

2.1.2. Используемые модели Использование унипотентных стволовых клеток Использование полипотентных стволовых клеток Использование тотипотентных эмбриональных стволовых клеток

2.2.Трансплантация миобластов

2.2.1. Происхождение и дифференцировка поперечно-полосатой мышечной ткани в эмбриональный период

2.2.2. Регенерация поперечно-полосатой мышечной ткани

2.2.3. Миодистрофия человека: разрабатываемые методы лечения Трансплантация миобластов в мышечную ткань

Трансплантация миобластов в сердечную мышцу

2.3.Трансплантация стромальных клеток костного мозга

2.3.1. Потенции к дифференцировке стромальных клеток костного мозга при культивировании in vitro

2.3.2. Потенции к дифференцировке стромальных клеток костного мозга в экспериментах in vivo

2.3.3. Пр еделы пластичности

2.3.4. Предклинические и клинические испытания СККМ 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Получение эмбриональных клеточных культур

3.1.1. Выделение миобластов

3.1.2. Культивирование эмбриональных миобластов

3.1.3. Выделение стромальных клеток костного мозга

3.1.4. Культивирование стромальных клеток костного мозга

3.2. Подготовка клеточных культур к трансплантации

3.3. Трансплантация эмбриональных клеток человека в скелетные мышцы мыши

3.4. Приготовление гистологических препаратов

3.5. Иммуноцитохимический анализ

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

4.1 Выделение и культивирование эмбриональных прогениторных клеток

4.2. Трансплантация эмбриональных миобластов и СККМ мышам линии C57Bl/10J-mdx

4.3. Исследование распространения эмбриональных миобластов и СККМ в мышечной ткани в первые сутки после трансплантации

5. ОБСУЖДЕНИЕ

6. ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Трансплантация миобластов и стромальных клеток костного мозга человека в скелетные мышцы мыши"

Последние исследования на млекопитающих свидетельствуют о том, что самообновление и репарация тканей идет за счет локальных и системных процессов. Генератором локального обновления являются региональные стволовые клетки, а источником системного обновления стромальные клетки костного мозга (СККМ). В общем виде эта схема поддержания клеточного гомеостаза подтверждена и для тканей человека

Liechty et al., 2000). Если СККМ постоянно используются организмом для самообновления эндотелия и специализированной паренхимы, то региональные стволовые клетки выступают на первый план в случае интенсивной локальной репарации после травмы, вирусных и прочих местных поражений (Репин, 1998; Шевченко, 1999; Bianco et al., 2001;

Korbling et al., 2003). В работах последних лет показано, что в ходе процессов репарации регулированная численность СККМ не только направленно поступает в зоны повреждения, но и направленно дифференцируется в региональные соматические клетки без побочных аномалий дифференцировки (Lagasse et al., 2000; Goodell et al., 2001;

Strauer et al., 2002). Эта закономерность обновления и репарации соматических клеток с помощью двух источников стволовых клеток сейчас используется в медицине для лечения многих наследственных, 4 аутоиммунных и возрастных дегенеративных заболеваний. Наиболее часто используется пересадка гематопоэтических клеток для лечения лейкопролиферативных заболеваний, анемий, метаболических заболеваний кроветвореной системы и гемофилий. Трансплантацию гепатоцитов обычно применяют при недостаточности функции печени. Часто для восстановления функции собственной печеночной ткани используют "искусственную печень" - колонки с гепатоцитами. Клетки островков Лангерганса применяют для лечения тяжелых форм инсулин-дефицитного сахарного диабета. При некоторых формах стерильности пересаживают клетки яичника. Нейрональные стволовые клетки используют в терапии ряда заболеваний головного мозга, спинного мозга и периферической нервной ткани, при таких нозологиях, как болезнь Паркинсона, детский церебральный паралич, ишемические повреждения мозга (Gage et al., 2000) Пересадки миобластов используют для лечения миодистрофий. Клеточная заместительная терапия мышечной дистрофии Дюшенна начала апробироваться в клинике в начале 90-х годов XX века. Как известно, дистрофин-дефицитные мышечные волокна подвергаются быстрой дегенерации при сокращении. В скрытую фазу заболевания разрушение мышечных волокон компенсируется интенсивной регенерацией. Клиническая манифестация начинается в период роста детей, когда резервы регенерации не в состоянии компенсировать деградацию мышц. В экспериментах на животных и первых испытаниях в клинике было показано, что локальная массивная трансплантация однородных аллогенных миобластов, размноженных в культуре и инъецированных в скелетные мышцы, приводит к образованию химерных мышечных волокон, способных синтезировать дистрофии (Law et al.,1997). Стабильную химеризацию реципиентных мышц объясняют несколькими причинами. Во-первых, аллогенные миобласты имеют высокую скорость миграции и фузогенную активность. Во-вторых, выращенные в культуре эмбриональные миобласты практически лишены антигенов гистосовместимости. В третьих, химерные мышечные волокна экспрессируют антигены гистосовместимости превалирующей ткани реципиента. Однако интенсивная региональная гибель миобластов после внутримышечного введения заставила искать альтернативные источники клеток. Наиболее продвинутыми оказались эксперименты с локальным и системным введением СККМ. Пластичность, интенсивная миграционная и фузогенная активность позволяла достичь результата при их системном введении. С другой стороны, высокая гетерогенность, множественность локальной дифференцировки в миобласты, ангиобласты и другие производные мезодермы и мезенхимы in vivo затрудняет оценку эффективности таких вмешательств. Многочисленные работы по оценке эффективности трансплантации миобластов и СККМ в скелетные мышцы трудно интерпретируются, поскольку проводились с клетками, полученными разными способами, имеющими разный исходный фенотип, на разных линиях животных, с разными дозами клеток (Ohlendieck et al., 1991; Fan et al., 1996; Piccolo et al., 2000; Young et al., 2001; Heslop et al

2001). В таких случаях только сравнительный анализ активности миобластов и СККМ в одних экспериментах и на одной выборке животных позволяет выявить разницу в поведении клеток.

Целью данного исследования являлось: изучение сравнительного поведения и судьбы эмбриональных миобластов и СККМ человека при их трансплантации в нормальные и дистрофин-децицитные скелетные мышцы мыши идентичным методом; провести сравнение способности клеток разного происхождения участвовать в регенерации мышечных волокон; проанализировать пригодность различных клеточных популяций при лечении наследственных заболеваний скелетной мускулатуры, а так же разработать модель для проведения предклинической экспресс-оценки состояния этих клеток.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биология развития, эмбриология", Сабурина, Ирина Николаевна

6. выводы

1. Налажен метод стандартного получения однородной культуры эмбриональных миобластов человека (ЭМЧ) из фетальной ткани 7-12 нед и 18-20 нед развития. Миобласты на 4-5 пассаже сохраняли до 95% десмин-положительных клеток, не содержали коллаген I-положительных и коллаген Ill-положительных клеток. До 90% миобластов формировали миотубы in vitro.

2. Показано, что трансплантации ЭМЧ 9 нед развития в скелетную мышцу mdx мышей через 21-37 дней после введения вели к стабильному периферическому встраиванию дистрофин-положительных клеток в кортикальный зоне поврежденных/регенерирующих мышечных волокон mdx мышей. Трансплантация ЭМЧ 19 нед. развития приводила к достоверному увеличению химерных мышечных волокон с интенсивным диффузным свечение всего мышечного волокна. Причины этих различий не установлены.

3. Аналогичная трансплантация СККМ в скелетную мышцу mdx мышей вела к накоплению пересаженных дистрофин-положительных клеток в перимизии/эпимизии.

4. Для изучения судьбы пересаженных ЭМЧ и СККМ разработан метод количественной оценки распределения живых/погибших клеток в первые сутки после введения.

5. Этим методом установлено, что при введении ЭМЧ и СККМ в скелетную мышцу преобладающая часть погибших клеток оставалась в зоне введения, тогда как живые клетки выявлялись исключительно в неповрежденной ткани. Миграционный фронт клеток формировался в течение первых 6 часов (миобласты мигрировали на расстояние до 2000 мкм, СККМ - до 4000 мкм) и практически не изменялся в более поздние сроки.

6. Этим же методом выявлены 2 субпопуляции СККМ с разной способностью к миграции в мышечной ткани.

7. Показано, что популяция мигрирующих миобластов наблюдалась в области эндомизия интактных волокон, а СККМ накапливались преимущественно в эпимизии и перимизии тех же мышц.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сабурина, Ирина Николаевна, Москва

1. Александрова М.А., Ревищин А.В., Полтавцева Р.А., Черкасова Л.В., Клещинов В.Н., Корочкин Л.И., Сухих Г.Т. Трансплантация стволовых/прогениторых клеток мозга человека в мозг взрослых крыс. // Онтогенез. 2002. Т.34. С.167-173.

2. Александрова М.А., Сабурина И.Н., Корочкин Л.И., Полтавцева Р.А., Ревищин А.В., Репин B.C., Ржанинова А.А., Сухих Г.Т. Поведение и дифференцировка нейрональных стволовых клеток in vivo.// Известия АН: серия биологическая. 2001. № 6. С.656-665.

3. Володина А.В., Поздняков О.М. Особенности посттравматической дифференцировки клеток-сателлитов в скелетной мышце // Бюл. эксперимент биологии и медицины. 1988; т 105. №6 с.755-757.

4. Габбасов З.А., Соболева Э.Л. Стромальные стволовые клетки взрослого организма резерв восстановительной хирургии. // Клиническая геронтология. 2003. Т.5. С.20-24.

5. Данилов Р.К., Очерки гистологии мышечной ткани./ Уфа, 1994 49С.

6. Клишов А.А., Данилов Р.К. Миосаттелиты // Арх. Анатомии, гистологии и эмбриолгии. 1981. Т.80. №1. С.95-107.

7. Мануйлова Е.С., Гордеева О.Ф., Гривенников И.А., Озернюк Н.Д. Эмбриональные стволовые клетки: спонтанная и направленная дифференцировка. // Известия АН: серия биологическая. 2001. № 6. С.704-710.

8. Озернюк Н.Д. Регуляция миогенеза // Изв. АН. Сер. Биол. 1998. №3. С.330-343.

9. Полежаев Л.В. Состояние проблемы регенерации мышцы сердца. // Успехи современной биологии. 1995. №115. С.198-212.

10. Полежаев Л.В. Факторы регенерации нерегенерирующих органов и тканей. // Вестник РАН. 2000. №70. С.597-603.

11. Потапов И.В., Крашенинников М.Е., Онищенко Н.А. Клеточная кардиомиопластика.// Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2001. Т.2. С.46-53.

12. Репин B.C. Трансплантация клеток: новые реальности в медицине. // Бюл. эксперимент биологии и медицины. 1998. №126 (приложение 1). С.14-28.

13. Репин В., Сухих Т.Г. Медицинская клеточная биология. М., Изд-во БЭБиМ, 1998, 200 С.

14. Румянцев П.П. Кардиомиоциты в процессах репродукции, дифференцировки и регенерации. Л., Наука, 1982,288 С.

15. Терехов С.М., Крохина Т.Б., Шишкин С.С., Крахмалева И.Н., Захаров С.Ф., Ершова Е.С. Культивируемые миобласты человека как стволовые клетки мышечной ткани в медико-биологических исследованиях. // Известия АН: серия биологическая. 2001. №6. С.745-752.

16. Шевченко Ю.Л. Экспериментальное обоснование возможности имплантации эмбриональных кардиомиоцитов в комплексной терапии миокардиальной слабости. // Физиология человека 1999. Т.25 №4. С.109-117.

17. Шубникова Е.А., Юрина Н.А., Гусев Н.Б., Балезина О.П., Большакова Г.Б. Мышечные ткани // Москва, Медицина 2001. С.234.

18. Щегельская Е.А., Микульский Ю.Е., Ревищин А.В., Омельченко Е.А., Кулынин В.Е., Грищенко В.И., Корочкин Л.И. Плюрипотентость клеток стромы костного мозга и перспективы их использования в клеточной терапии. // Онтогенез. 2003. Т.34. №3. С.228-235.

19. Anderson J.E. A role for nitric oxide in muscle repair: oxide-mediated activation of muscle satellite cells // Mol. Biol. Cell. 2000. V.ll. P. 1859-1874

20. Ashton BA, Allen TD, Howlett CR, Eaglesom CC, Hattori A, Owen MFormation of bone and cartilage by marrow stromal cells in diffusion chambers in vivo. // Clin Orthop. 1980. V. 151. P.294-307.

21. Bagutti C., Wobus A.M., Fassler R., Watt F.M. Differentiation of embryonal stem cells into keratinocytes: comparison of wild-type and beta 1 integrin-deficient cells. //Dev Biol. 1996. V.179.P.184-96.

22. Beauchamp J.R., Morgan J.E., Pagel C.N, Partridge T.A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. // J Cell Biol. 1999. V.144. P.l 113-22.

23. Bennett J.H., Joyner C.J., Triffitt J.T., Owen M.E. Adipocytic cells cultured from marrow have osteogenic potential. // J Cell Sci. 1991. V.99. P. 131-139.

24. Beresford J.N., Bennett J.H., Devlin C., Leboy P.S., Owen M.E,. Evidence for an inverse r elationship b etween t he d ifferentiation о f adipocytic and о steogenic с ells in r at marrow stromal cell cultures. // J Cell Sci. 1992. V.102. P.341-351.

25. Berry L., Grant M.E., McClure J., Rooney P. Bone-marrow-derived chondrogenesis in vitro. // J Cell Sci. 1992. V.101. P.333-342.

26. Blaveri K., Heslop L., Yu D.S., Rosenblatt J.D., Gross J.G., Partridge T.A., Morgan J.E. // Patterns of repair of dystrophic mouse muscle: studies on isolated fibers. // Dev Dyn 1999.V. 216(3). P.244-256.

27. Bianco P., Costantini M., Dearden L.C., Bonucci E. Alkaline phosphatase positive precursors of adipocytes in the human bone marrow. // Br J Haematol. 1988. V.68. P.401-403.

28. Bianco P, Robey PG. Stem cells in tissue engineering.// Nature. 2001. V.414. P.118-121.

29. Bianco P, Riminucci M., Gronthos S., Robey P.G. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential application. // Stem Cells. 2001. V.19. №3. P.180-192.

30. Brazelton Т., Rossi F.M., Keshet G.I., Blau H.M. From marrow to brain: expression of neuronal phenotypes in adult mice. // Science 2000. V.290. P. 1775-9.

31. Bruder S.P., Caplan A.I. Discrete stages within the osteogenic lineage are revealed by alterations in the cell surface architecture of embryonic bone cells. // Connect Tissue Res. 1989. V.20. P.73-79.

32. Bulfield G, Siller WG, Wight PA, Moore KJ. X chromosome-linked muscular dystrophy (mdx) in the mouse.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984 V.81. P. 1189-1192.

33. Cantini M., Massimino M.L., Bruson A., Catani C., Dalla Libera L.,Carraro U.Macrophages regulate proliferation and differentiation of satellite cells.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994.V202, P.1688-1696.

34. Cantini M., Carraro U. Macrophage-released factor stimulates selectively myogenic cells in primary muscle culture. // J. Neuropathol. Exp. Neuro. 1995. V.54. P.121-128.

35. Chen J., Sanberg P.R., Li Y., Wang L., Lu M., Willing A.E., Sanchez-Ramos J., Chopp M. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats. // Stroke 2001. V.32. P.2682-8.

36. Chiu R.C., Zibaitis A., Kao R.L. Cellular cardiomyoplasty: myocardial regeneration with satellite cell implantation.//Ann Thorac Surg. 1995. V.60. P. 12-18.

37. Colter D.C., Class R., DiGiromalo C.M., Prockop D.J. Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of plastic-adherent cells from human bone marrow. // Proc Natl Acad Sci. USA. 2000. V.97 P.3213-3218.

38. Compagnoli C., Roberts I.A., Kumar S., Bennett P.R., Bellantuono I., Fisk N.M. Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal blood, liver, and bone marrow.//Blood. 2001. V.98. P.2396-2402.

39. Davis H.L., Michel M.L., Whalen R.G. Use of plasmid DNA for direct gene transfer and immunization. // Ann N.Y. Acad. Sci. 1995. V.772. P.21-29.

40. Deng W., Obrocka M., Fisher I., Prockop D.J. In vitro differentiation of human marrow stromal cell into early progenitors of neural cells by conditions that increase intracellular cyclic AMP // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. V.282. №1. P.148-152.

41. Dennis J.E, Charbord P. Origin and differentiation of human and murine stroma. //Stem Cells. 2002. V.20. P.205-214.

42. Dennis J.E., Carbillet J.P., Caplan A.I., Charbord P. The STRO-1+ marrow cell population is multipotential. // Cells Tissues Organs. 2002. V.170. P.73-82.

43. Dietrich S. Regulation of hypoaxial muscle development. // Cell Tiss. Res. 1999. V.296. P. 175-82.

44. Ducy P., Zhang R., Geoffroy V., Ridall A.L., Karsenty G. Osf2/Cbfal: a transcriptional activator of osteoblast differentiation. // Cell 1997. V.89. P.747-754.

45. Evans M.J., Kaufman M.H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. //Nature. 1981.V.292. P. 154-156.

46. Fan Y, Maley M., Beilharz M., Grounds M. Rapid death of injected myoblasts in myoblast transfer therapy. //Muscle Nerve. 1996. V.19. P.853-60.

47. Friedenstein A.J., Chailakhjan R.K., Lalykina K.S. The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells. // Cell Tissue Kinet. 1970. V.3. P.393-403.

48. Friedenstein AJ, Latzinik NW, Grosheva AG Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges. // Exp Hematol. 1982.V.10. P.217-227.

49. Friedenstein A.J., Shapiro-Piatetzky I.I., Petrakova K.V. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells. // J Embryol Exp Morphol. 1966. V.16. P.381-390.

50. Gage F.H. Mammalian neural stem cells. // Science. 2000. V.287. P.1433-1438.

51. Goodell M.A., Jackson K.A., Majka S.M., Mi Т., Wang H., Pocius J., Hartley C.J., Majesky M.W., Entman M.L., Michael L.H., Hirschi K.K. Stem cell plasticity in muscle and bone marrow. // Ann N Y Acad. Sci. 2001. V.938. P.208-218.

52. Gronthos S, Graves SE, Ohta S, Simmons PJ. The STRO-1+ fraction of adult human bone marrow contains the osteogenic precursors. // Blood 1994;84:4164-4173.

53. Gronthos S., Simmons P.J. The growth factor requirements of STRO-1-positive human bone marrow stromal precursors under serum-deprived conditions in vitro. // Blood1995. V.85. V.929- 940.

54. Guan K., Rohwedel J., Wobus A.M. Embryonic stem cell differentiation models: cardiogenesis, myogenesis, neurogenesis, epithelial and vascular smooth muscle cell differentiation in vitro. // Cytotechnology. 1999. V.30. P.211-226.

55. Guo Y., Lubbert M., Engelhardt M. CD34-hematopoietic stem cells: current concepts and controversies. //Stem Cells. 2003. V.21. P. 15-20.

56. Gussoni E., Soneoka Y., Strickland C.D., Buzney E.A., Khan M.K., Flint A.F., Kunkel L .M., Mulligan R.C. Dystrophin expression in the mdx mouse restored by stem cell transplantation. //Nature 1999. V.401. P.390-4.

57. Haynesworth S.E., Baber M.A., Caplan A.I. Cell surface antigens on human marrow-derived mesenchymal cells are detected by monoclonal antibodies. // Bone 1992. V.13.P.69-80.

58. Herbertson A., Aubin J.E. Cell sorting enriches osteogenic populations in rat bone marrow stromal cell cultures. // Bone 1997. V.21. V.491-500.

59. Heslop L., Beauchamp J.R., Tajbakhsh S., Buckingham M.E., Partridge T.A., Zammit P.S. Transplanted primary neonatal myoblasts can give rise to functional satellite cells as identified using the Myf5nlacZl+ mouse. // Gene Ther 2001. V.8(10). P.778-783.

60. Huard J. , AcsadiG., Massic ВКarpati G. Gene trasfer to sceletal muscles by isogenic myoblasts. // Hum. Gene Tber. 1994b. V.5. P.949-958.

61. Hung S.C., Cheng H., Pan C.Y., Tsai M.J., Kao L.S., Ma H.L. In vitro differentiation of size-sieved stem cells into electrically active neural cells. // Stem Cells. 2002. V.20. P.522-529.

62. Johnstone В., Hering T.M., Caplan A.I., Goldberg V.M., YooJ.U. In vitro chondrogenesis of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells. // Exp Cell Res. 1998. V.238. P.265-272.

63. Joyner C.J., Bennett A., Triffitt J.T. Identification and enrichment of human osteoprogenitor cells by using differentiation stage-specific monoclonal antibodies. // Bone 1997. V.21. P.1-6.

64. Koh G.Y., Klug M.G., Soonpaa M.H., Field L.J. Differentiation and long-term survival of C2C12 myoblast grafts in heart. IIJ Clin Invest. 1993. V.92. №3. P.l548-1554.

65. Korbling M., EstrovZ., Champlin R. Adult stem cells and tissue repair. // Bone Marrow Transplant. 2003. Suppl. 1. P.S23-24.

66. Korbling M., Estov Z Adult stem cells for tissue repair a new therapeutic concept? //N Engl J Med. 2003. V.349. P.:570-582.

67. Krause D.S., T heise N.D., С ollector M .1., Henegariu О., H wang SG ardner R., Neutzel S., Sharkis S.J. Multi-organ, multi-lineage engraftment by a single bone marrow-derived stem cell. // Cell 2001. V.105. P.369-77.

68. Krebsbach P.H., Kuznetsov S.A., Bianco P., Robey P.G. Bone marrow stromal cells: characterization and clinical application. //Biol. Med. 1999. V.10. №2. P. 165-181.

69. Kuznetsov S.A., Friedenstein A.J., Robey P.G. Factors required for bone marrow stromal fibroblast colony formation in vitro. // Br J Haematol. 1997. V.97. P.561-570.

70. Kuznetsov S.A., Krebsbach P.H., Satomura K., Kerr J., Riminucci M., Benayahu

71. D., Robey P.G. Single-colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts form bone after transplantation in vivo. // J Bone Miner Res. 1997. V.12. P.1335-1347. Lagasse

72. E., Connors H., Al-Dhalimy M., Reitsma M., Dohse M., Osborne L., Wang X., Finegold

73. M., Weissman I.L., Grompe M. Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo. //Nat Med. 2000. V.6. P.1229-34.

74. Lagasse E., Connors H., Al-Dhalimy M., Reitsma M., Dohse M., Osborne L., Wang X., Finegold M., Weissman I.L., Grompe M. Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo. // Nat Med. 2000. V.6. P.1229-34.

75. Law P., Goodwin Т., Fang Q., Deering M., Duggirala V., Larkin C., Florendo J.A., Quinley Т., Cornett J., Shirzad A., Yoo Т., Holcomb R. Whole body myoblast transfer. // Transplantation Proceedings. 1994. V.26. №6. P.3381-3383.

76. Linge C., Green M.R., Brooks R.F. A method for removal fibroblasts from human tissue culture systems // Exp. Cell Res. 1989. V.185 P.519-528

77. Li R.K., Mickle D.A.G., Weisel R.D. et al. In vivo survival and function of transplanted rat cardiomyocytes. // Circ. Res. 1996. V.78. №2. 283-288.

78. Lu D., Wang L., Chen J. Intraarterial administration of marrow stromal cell in a rat model of traumatic brain injury // Neurotrauma. 2000. V.18. №8. P.813-819.

79. Lucas P. А., С ulcutt A .F., S outherland S .S. A p opulation о f с ells r esident w ithin embryonic and newborn rat skeletal muscle is capable to differentiate into multipke mesodermal phenotypes. // Wound Rep. Regen. 1995. V.3. P.457-468.

80. Lucas P.A., Warejcka D.J., Zhang L.M. Effect of rat mesenchymal stem cells on the development of abdominal adhesions after surgery. // J.Rurg.Res. 1996. V.62. P.229-232.

81. Machmood A., Lu D., Wang L., Chop M. Treatment of traumatic brain injury in female rats with intravenous administration of bone marrow stromal cells. // Neurosurgery. 2001. V.49. №5. P. 1196-1203.

82. Makino S., Fukuda K., Miyoshi S. Cardiomyocytes can be generatated from marrow stromal cells in vitro. // J. Clin Invest. 1999. V103. №5. P.697-705.

83. Masuya M, Drake С J, Fleming PA, Reilly CM, Zeng H, Hill WD, Martin-Studdard A, Hess DC, Ogawa M. Hematopoietic origin of glomerular mesangial cells. // Blood 2003. V.101. P.2215-2218.

84. McKay R. Stem cells-hype and hope. // Nature. 2000. V.406. P.361-364.

85. McLennan I.S., Koishi K., Cellular localisation of transforming growth factor-beta 2 and -beta 3 (TGF-beta2, TGF-beta3) in damaged and regenerating skeletal muscles. // Dev Dyn. 1997. V. 208. P. 278-89.

86. Mezey E, Chandross KJ, Harta G, Maki RA, McKercher SR. Turning blood into brain: cells bearing neuronal antigens generated in vivo from bone marrow. // Science 2000. 290. P.1779-1782.

87. Mezey E, Key S, Vogelsang G, Szalayova I, Lange GD, Crain B. Transplanted bone marrow generates new neurons in human brains. // Proc Natl Acad Sci USA. 2003. V.100. P. 1364-1369.

88. Morgan J.E. Phosphorylase kinase activities in damaged mouse skeletal muscles. // J Neurol Sci. 1988. V.86. P.149-58.

89. Morgan J.E. Myogenicity in vitro and in vivo mouse muscle cells separated on discontinuous Percll gradients//J. Neurol. Sci. 1988 V.85. P. 197-207.

90. Morgan J.E., Partridge T.A. Cell transplantation and gene therapy in muscular dystrophy. // Bioessays. 1992. V.14. P.641-5.

91. Nichols J., Zevnik В., Anastassiadis K., Niwa H., Klewe-Nebenius D., Chambers I., Scholer H., Smith A. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4. // Cell. 1998. V.95. P.379-391.

92. Ohlendieck K., Campbell K.P. Dystrophin-associated proteins are greatly reduced in skeletal muscle from mdx mice. // J Cell Biol. 1991. V.l 15. P. 1685-94.

93. Ohlendieck K., Ervasti J.M., Matsumura K., Kahl S.D., Leveille C.J., Campbell K.P. Dystrophin-related protein is localized to neuromuscular junctions of adult skeletal muscle. //Neuron. 1991. V.7. P.499-508.

94. Orlic D., Kajstura J., Chimenti S., Jakoniuk I., Anderson S.M., Li В., Pickel J., McKay R., Nadal-Ginard В., Bodine D.M., Leri A., Anversa P. Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium. // Nature 2001. V.410. P.701-5.

95. Otani A., Kinder K., Ewalt K., Otero F.J., Schimmel P., Friedlander M. Bone marrowderived stem cells target retinal astrocytes and can promote or inhibit retinal angiogenesis. //Nat Med. 2002. V.8. P.1004-1010.

96. OwenM. Marrow stromal stem cells. //J Cell Sci. 1988. V.10. Suppl.63-76.

97. Owen M., Friedenstein A.J. Stromal stem cells: marrow-derived osteogenic precursors. // Ciba Found Symp. 1988. V.136. P.42-60.

98. Pate D.W., Southerland S.S., Grande D.A. et al. Isolation and differentiation of mesenchymal stem cells from rabbit muscle. // Surg. Forum. 1993. XLIV. P.587-589.

99. Pate E, White H, Cooke R. Determination of the myosin step size from mechanical and kinetic data. // Proc Natl Acad Sci USA. 1993. V.90. P.2451-2455.

100. Pagano S.F., Impagnatiello F., Girelli M., .Isolation and characterization of neural stem cells from the adult human olfactory bulb.//. Stem Cells. 200. V.l8. №4. P.295-300.

101. Partridge T, Lu QL, Morris G,Hoffman E. //Is myoblast transplantation effective? //Nat Med. 1998. V.4. P.1208-1209.

102. Petersen B.E., Bowen W.C., Patrene K.D. Bone marrow as a potential source of hepatic oval cells. // Science. 1999. V.284. №5417. P.l 168-1170.

103. Piccolo F., Moore S.A., Ford G.C., Campbell K.P. Intracellular accumulation a nd r educed s arcolemmal e xpression о f d ysferlin i n 1 imb—girdle m uscular dystrophies. // Ann Neurol. 2000. V.48 P.902-912.

104. Pin C.L., Hrychyn A.W., Rogers K.A. Embryonic and fetal rat myoblasts form different muscle fiber types in an ectopic in vivo environment. // Dev Dynam. 2002. V.224. P.253-66.

105. Poulsom R., Alison M.R., Forbes S.J., Wright N.A. Adult stem cell plasticity. // J Pathol. 2002. V.197. №4. P.441-456.

106. Pownall M.E., Gustafsson M.K., Emerson C.P. Myogenic regulatori factors and the specification of muscle progenitors in vertebrate embryos. // Cell Dev. Biol. 2002. V.18. P.748-783.

107. Prockop D.J., Azizi S.A., Phinney D.G. Potential use of marrow stromal cell as terapeutic vectors for diseases of the central nervous system. // Prog. Brain Research. 2000. V.128. P.293-297.

108. Rando T.A., Blau H.M. Primary mouse myoblast purification, characterization and transplantation for cell-mediated gene-therapy // J. Cell. Biol. 1994. V.125. P.1275-1287.

109. Rando T.A., Pavlath G.K., Blau H.M. The fate of myoblasts following transplantation into mature muscle. // Exp. Cell Res. 1995. V.220. P.383-389.

110. Rauch C., Brunet A.C., Deleule J., Farge E. C2C12 myoblast/osteoblast transdifferentiation steps enhanced by epigenetic inhibition of BMP2 endocytosis. // Am J Physiol Cell Physiol. 2002. V.283. P.C235-C243.

111. Reinecke H, MacDonald G.H., Hauschka S.D., Murry C.E. Electromechanical с oupling between skeletal and cardiac muscle: implication for infarct repair. // J Cell Biol. 2000. V.149. P.731-740.

112. Resnick J.L., Bixler L.S., Cheng L., Donovan P.J. Long-term proliferation of mouse primordial germ cells in culture. // Nature. 1992. V.359. P.550-551.

113. Riminucci M., Bradbeer J.N., Corsi A., Gentili C., Descalzi F., Cancedda R., Bianco P. V is-a-vis с ells and the priming of bone formation. // J В one Miner Res. 1998. V.13. P.1852-1861.

114. Rinsch C., Peduto G., Schneider B.L., Aebischer P. Inducing acceptance to encapculated xenogenic myoblasts. // Transplantation. 2001. V.71. P.345-351.

115. Rohwedel J., Guan K., Wobus A.M. Induction of cellular differentiation by retinoic acid in vitro. // Cells Tissues Organs. 1999. V.165. P.190-202.

116. Robert E., Schwartz R.E., Reyes M. Multipotent adult progenitor cells from bone marrow differentiate into functional hepatocyte-like cells // J. Clin. Invest. 2002. V.109. №10. P.1291-1302.

117. Satomura K., Krebsbach P., Bianco P., Gehron R. P. Osteogenic imprinting upstream of marrow stromal cell differentiation. // J Cell Biochem 2000. V.78. P.391-403.

118. Scholer H.R., Dressier G.R., Balling R., Rohdewohld H., Gruss P. Oct-4: a germline-specific transcription factor mapping to the mouse t-complex. // EMBO J. 1990. V.9.P.2185-95.

119. Scott J.E. Oxygen and the connective tissues. // Trends Biochem Sci. 1992. V.17. P.340-343.

120. Sicinski P., Geng Y., Ryder-Cook A.S., Barnard E.A., Darlison M.G., Barnard P.J. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. // Science. 1989. V.244. P.1578-80.

121. Simmons P.J., Torok-Storb B. Identification of stromal cell precursors in human bone marrow by a novel monoclonalantibody, STRO-1. // Blood 1991. V.78. P.55-62.

122. Skuk D., Roy В., Goulet M., Tremblay J.P. Successful myoblast transplantation in primates depends on appropriate cell delivery and induction of regeneration in the host muscle. // Exp Neurol. 1999. V.155. P.22-30.

123. Smythe G.M., Fan Y., Grounds M. Enchanced migration and fusion of donor myoblasts in distrophic and normal host muscle. // Muscle Nerve. 2000. V.23. P.560-574.

124. Stamm С., Westphal В., Kleine H.D., Petzsch MKittner СKlinge H., Schumichen C., Nienaber C.A., Freund M., SteinhofF G. Autologous bone-marrow stem-cell transplantation for myocardial regeneration. // Lancet 2003. V.361. P.45-6.

125. Strauer B.E., Brehm M., Zeus Т., Kostering M., Hernandez A., Sorg R.V., Kogler G., Wemet P. Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans. // Circulation 2002. V.106. P.1913-1918.

126. Svendsen C.N., Caldwell M.A., Ostenfeld T. Human neural stem cells: isolation, expansion and transplantation. // Brain Pathol. 1999. V.9. №3. P.499-513.

127. Svendsen C.N. Stem cells: hype or hope? // Drug Discov Today. 2002. V.7. P.455-456.

128. Takahashi Т., Kalka C., Masuda H., Chen D., Silver M., Kearney M., Magner M., Isner J.M., Asahara T Ischemia- and cytokine-induced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization. // Nat Med. 1999. V.5. P.434-8.

129. Takeshita S., Isshiki Т., Sato T. Increased expression of direct gene transfer into skeletal muscles observed after acute ischemic injury in rats. // Lab Invest. 1996. V.74. P.1061-1065.

130. Taylor D.A., Hruban R., Rodriguez E.R., Goldschmidt-Clermont P.J. Cardiac chimerism as a mechanism for self-repair: does it happen and if so to what degree? // Circulation. 2002. V.106. P.2-4.

131. Till J.E., McCulloch E.A. A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mous bone marrow cells. // Rad. Res. 1961. V.14. P.213-222.

132. Toma J.G., Akhavan M., Fernandes K.J., Barnabe-Heider F., Sadikot A., Kaplan D.R., Miller F.D. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. // Nat Cell Biol. 2001. V.9. P.778-784.

133. Tosh D., Slack J.M. How cells change their phenotype. // Nat Rev Mol Cell Biol. 2002. V.3. P. 187-94

134. Tse H-F., Kwong Y-L., Chan J.K.F., Lo G., Ho C-L., Lau C.P. Angiogenesis in ischaemic myocardium by intramyocardial autologous bone marrow mononuclear cell implantation. // Lancet 2003. V.361. P.47-9.

135. Ueki Т., Kaneda Y., Tsutsui H., Nakanishi K., Sawa Y., Morishita R., Matsumoto K., Nakamura Т., Takahashi H., Okamoto E., Fujimoto J. Hepatocyte growth factor gene therapy of liver cirrhosis in rats. // Nat Med. 1999. V.5. V.226-30.

136. Vacanti M.P., Roy A., Cortiella J., Bonassar L., Vacanti C.A. Identification and initial characterization of spore-like cells in adult mammals. // J Cell Biochem. 2001. V.80. P.455-60.

137. Verfaillie C.M. Adult stem cells: assessing the pluripotency. // Trends in Cell Biol. 2002. V.12. P 502-508.

138. Weimann J.M., Charlton G.A., Brazelton T.R., Hackman R.C., Blau H. Contribution of transplanted bone marrow cells to Purkinje neurons in human adult brains. // Proc Natl Acad Sci USA. 2003. V.100. P.2088-93.

139. Weiss L. Haemopoiesis in mammalian bone marrow. // Ciba Found Symp. 1981. V.84. P.5-21.

140. White J.D., Bower J. J., Kurek J.B., Austin L. Leukemia inhibitory factor enhances regeneration in skeletal muscles after myoblast transplantation. // Muscle Nerve. 2001. V.24. P.695-697.

141. Yao S.-N., Kurachi K. Implanted myoblasts not only fuse with myofibers but also survive as muscle precursor cells. // J. Cell Biol. 1993. V.105. P. 975-963.

142. Yoo K.J., Li R.K., Weisel R.D., et al. Aytologous smooth muscle cell transplantation i mproved h eart function i n d ilated с ardiomyopathy. / / A nn T horac S urg.2000. V.70. P.859-865.

143. Zuk P.A., Zhu M., Mizuno H., Huang J., Futrell J.W., Katz A.J., Benhaim P., Lorenz H.P., Hedrick M.H. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. // Tissue Eng. 2001. V.7. P.211-228.