Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование калиевых каналов и их роли в кардиомиоцитах, дифференцированных из эмбриональных стволовых клеток мыши

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование калиевых каналов и их роли в кардиомиоцитах, дифференцированных из эмбриональных стволовых клеток мыши"

, Б ой

* Р

' 0 НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім. 0.0. БОГОМОЛЬЦЯ

ГРИЩЕНКО ОЛЕКСІЙ ВАДИМОВИЧ

УДК 611.127:612.179.1, 577.352.5

ДОСЛІДЖЕННЯ КАЛІЄВИХ КАНАЛІВ ТА ЇХ РОЛІ В КАРДІОМІОЦИТАХ, ДИФЕРЕНЦІЙОВАНИХ З ЕМБРІОНАЛЬНИХ СТОВБУРОВИХ КЛІТИН МИШІ

03.00.02 - біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ - 1998 р.

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України

Науковий керівник: Доктор біологічних наук, проф., академік НАНУ

Костюк Платон Григорович

Інститут фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України, директор

Офіційні опоненти:

Доктор біологічних наук, професор кафедри біофізики Національного університету ім. Тараса Шевченка Зима Валерій Леонідович

Кандидат біологічних наук, вчений секретар Міжнародного центру молекулярної фізіології Федулова Світлана Анатоліївна

Провідна установа: Інститут молекулярної біології та генетики, м. Київ

Захист відбудеться “ <2$ ” 199ІЇр. о годині на

засіданні спеціалізованої вченої ради Д-01.13.01 при інституті

ім.О.О.Богомольця НАН України, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці інституту ім.О.О.Богомольця, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

Автореферат розісланий “ ^ 1998 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор біологічних наук

3.0. Сорокіна-Маріна

ВСТУП

Актуальність проблеми

Під час пренатального періоду розвитку хребетних тварин формуються різні органи і починають виявлятися притаманні їм функції. Серце є першим органом ембріону, що досягає функціонального стану. Тому ембріональний розвиток та раннє розвинення електрофізіологічних та пов’язаних з ними функцій привертають до себе значну увагу. Але фізіологічне дослідження функцій серця, в тому числі електричних властивостей, що обумовлюють реполяризацію потенціалів дії в клітинах серця ембріону, обмежувалось складністю застосування стандартних електрофізіологічних методів. Вивченню експресії іонних каналів під час раннього періоду розвитку ембріону ссавців перешкоджає маленький розмір ембріонального серця та відсутність стабільних клітинних ліній для моделювання пренатальних стадій кардіоміогенезу. Нові можливості для вивчення ранніх стадій кардіоміогенезу були нещодавно продемонстровані з використанням кардіоміоцитів, диференційованих in vitro з ембріональних стовбурових клітин миші.

Мета дослідження

Вивчити зв’язані з віком зміни експресії калієвих каналів, що лежать в основі реполяризації потенціалу дії серцевих клітин, та роль струмів через ці канали в стабілізації ритмічної активності ранніх кардіоміоцитів.

Завдання дослідження

1. Визначити типи вихідних калієвих струмів в кардіоміоцитах, диференційованих in vitro з ембріональних стовбурових клітин.

2.3’ясувати залежність експресії калієвих каналів вихідного випрямлення від часу диференціювання кардіоміоцитів in vitro.

3.Визначити роль АТФ-залежних калієвих каналів вихідного випрямлення ранніх кардіоміоцитів в регуляції та стабілізації електричної активності клітин.

4. Вивчити вплив зміни позаклітинної концентрації іонів калію на швидкий

транзієнтний калієвий струм.

Наукова новизна роботи

Показані зміни експресії різних типів калієвих каналів вихідного випрямлення під час раннього кардіоміогенезу міоцитів, диференційованих

з ембріональних стовбурових клітин миші. Показана особливо важлива роль каналів швидкого калієвого (ІІ0) струму у формуванні та підтримці стабільної ритмічної активності кардіоміоцитів на найбільш ранньому строкові диференційовки - від однієї до чотирьох діб після появи спонтанних, ритмічних скорочень клітин.

Виявлено, що на відміну від інших типів калієвих каналів, АТФ-залежні канали експресуються практично в усіх кардіоміоцитах незалежно від строку діференціювання, а густина струмів крізь ці канали практично не змінюється з віком клітин. Показана роль каналів, що активуються АТФ, в змінах електричної активності кардіоміоцитів, що виникають при змінах енергетичного метаболізму клітини.

Визначені механізми впливу позаклітинної концентрації К+ на функціонування калієвих каналів транзієнтного струму, що обумовлені іон-конформаційною взаємодією білка, що формує канал, та іонів, що проходять крізь нього.

Теоретичне та практичне значення роботи

Описані явища можуть мати безпосереднє відношення до процесу стабілізації скорочувальної активності міокардіальних клітин в процесі пренатального розвитку та до пізнання процесів, що лежать в основі онтогенетичного ставлення іонних каналів мембран кардіоміоцитів, що має як теоретичне, так і практичне значення для розробки нових видів лікарських препаратів.

Особистий внесок

Всі експерименти, приведені в цій роботі, були виконані автором особисто. В розробці концепцій роботи також приймали активну участь інші співавтори публікацій.

Апробація роботи

Основні положення роботи доповідались і обговорювались на наукових семінарах Інституту фізіолога ім. О.О.Богомольця НАН України (1995), Інституту нейрофізіології університету м. Кельн (Німеччина, 1996), на першому семінарі Німецько-Української дослідницької групи (Київ, 1996), на щорічному з’їзді фізіологів Німеччини (1997). За матеріалами дисертації опубліковано 3 статті у міжнародних наукових журналах.

Обсяг та структура дисертації

Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису методів дослідження, результатів дослідження, висновків та списку літератури з 141 найменувань. Робота викладена на 104 сторінках, ілюстрована 20 малюнками.

МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ

Об’єкт дослідженім. Більшість експериментів було проведено на кардіоміоцитах, диференційованих в умовах культури з ембріональних стовбурових клітин миші. Для цього краплини суспензії стовбурових клітин лінії D3 (400 клітин у 20 мкл розчину) культивувалися дві доби на кришечках чашок Петрі. За цей час формувалися сферичні, так звані ембріональні тільця. Наступні 5 діб вони переносилися у великі чашки Петрі і культивувалися у суспензії. Потім семиденні ембріональні тільця розподілялися у 24-лункові плати - одне тільце на лунку. Наступного дня можна було бачити кластери кардіоміоцитів, що спонтанно скорочувалися. За допомогою ферментативної обробки ми отримували поодинокі кардіоміоцити, що спонтанно та ритмічно скорочувалися. На 2-4 добу після появи перших клітин, що скорочувались, ми отримували міоцити “раннього” строку диференціювання, а на 9-11 добу - клітини “пізнього” строку диференціювання.

Клітини лінії GH3 культивувались в моношарі в середовищі RPMI 1640 з додаванням 10 % бичої сироватки в атмосфері, що містила 5% С02 при 37° С.

Реєстрація та обробка результатів. Трансмембранні струми вимірювались у режимі фіксації мембранного потенціалу - методика patch-clamp в конфігурації “ціла клітина” (Hamil et al. 1981) та модифікованій конфігурації - “whole-cell perforated patch” із використанням антибіотика амфотеріцину Б (Rae et al., 1991). Скляні мікропіпетки вироблялись із легкоплавких капілярів діаметром 1,8 мм. Для виділення калієвих струмів використовувався безнатрієвий розчин, який містив ( у мМ): КС1 5, MgCl2

1, СаС12 1.8, Choline-Chloride 140, HEPES 10, CdCl2 0.1, pH 7.45 (КОН); внутрішній розчин мав такий склад ( у мМ): КС1 - 150, EGTA 10, СаС12 1, MgCl2 1, HEPES 10, pH 7.4 (КОН); у випадку перфорованого варіанту

patch-clamp використовувався трохи інший розчин, а саме (у мМ): КС1 55, MgCl2 7, HEPES 10, K2S04 70, pH 7.45.

Реєстрація струмів проводилась при використанні аналогового підсилювача Axopatch 200 А. Усі отримані дані записувались на комп’ютер та оброблялись за допомогою спеціальних програм. Обчислювання параметрів струмів проводилось програмами Datasel та ISO 2, а наступна математична обробка даних та побудува малюнків - Sigma Plot.

Реєстрація струмів на кардіоміоцитах проводилась при температурі 32°С, на клітинах лінії GH3 - при кімнатній температурі. Струм витоку компенсувався аналогово та з використанням процедури Р/4 та контролювався впродовж всього експерименту. Амплітуда струму одержувалась як різниця між піковим значенням струму та нульовою лінією. Отримані результати представлені у одиницях ± с.с.п. (середня статистична помилка).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Для вивчення змін експресії К+ каналів під час диференціювання та їх ролі в кардіоміоцитах ми використовували дві групи клітин - ранні клітини (7+2 - 7+4 діб спеціального протоколу культивування) та пізні кардіоміоцити (7+9 - 7+14 діб культивування).

Розділення калієвого струму на компоненти

Використовуючи 4-амінопірідін ми виділяли три різні компоненти калієвого струму , що мали різну кінетику та різну чутливість до 4-АП. К+ струм викликався деполяризацією від -40 мВ до +80 мВ від підтримуваного потенціалу -80 мВ. Всі компоненти мали швидку активацію, але різну кінетику інактивації. Швидка компонента струму (It0 ) була чутлива до зовнішнього прикладання 4-АП (Кд= 1.7 мМ), компонента з повільною інактивацією (Isiow) була надчутливою до 4-АП (Кд= 29 мкМ) та компонента, що неінакгавується (І^), була нечутлива до 4-АП (Рис.1).

Розподіл та зміна густини різних компонент К+ струму

Слід відмітити, що внесок різних компонент до калієвого струму був різний у різних клітин і залежав від часу диференціювання кардіоміоцитів. Були виявлені дві популяції клітин, що відрізнялися різними пропорціями експресії різних типів К+ каналів. В 75% кардіоміоцитів ранньої стадії диференціювання (п=72) були виявлені тільки дві компоненти калієвого

струму вихідного випрямлення: компонента із швидкою інактивацією (ІІ0 ) та компонента, що неінактивувалась (І5и5). В решті 25% клітин спостерігалась і третя компонента з повільною інактивацією (І5]0,л,). В кардіоміоцитах пізньої стадії диференціювання цей розподіл був трохи інший: 69% та 31% відповідно. В другій популяції клітин ми спостерігали наявність всіх трьох компонент катієвого струму (Рис.2).

З

• 54

л

п

о_

І. 5 <

п

л

1 2 З

Рис.1 Розділення К+ струму па компоненти за Рис.2 Зміни розподілу густини компонент К+ допомогою 4-АП, Ік, викликані ступінчатою струму з віком кардіоміоцитів. 1 -

деполярізацією мембрани від 0 мВ до 80 мВ компонента І(0, 2 - І5Ц5, 3 - Калієвий

з кроком 20 мВ від підтримуваного струм викликався деполяризацією мембрани

потенціалу -80 мВ: 1 - в контролі; 2 і 3 - від -80 мВ до 40 мВ; п - число клітин.

після приюіаданкя 0.3 мМ та 10 мМ 4-АП,

відповідно; І№ та І5іот отримані

вирахуванням із записів струмів (3 з 2 та 2 з

1, відповідно).

Роль ртих компонент К+ струму в стабілізації електричної активності

Ми перевірили дію 4-АП на частоту генерації та форму потенціалів дії кардіоміоцитів, що спонтанно скорочувалися. В пізніх клітинах прикладання 4-АП в позаклітинний розчин не змінювало частоту генерації потенціалів дії, або ці зміни були незначними (1.1+0.03, п=9). В той же час електрична активність кардіоміоцитів в ранній стадії диференціювання була чутлива до прикладання 4-АП. Так, наприклад, прикладання 10 мМ 4-АП приводило до збільшення частоти генерації потенціалів дії приблизно вдвічі (1.83±0.088, п=5) і цей ефект був зворотнім. Додавання 10 мМ 4-АП в позаклітинний розчин не впливало на пізні клітини, але приводило до

збільшення тривалості (виміряного на рівні нульового потенціалу) потенціалів дії раніх клітин (11+0.8 %, п=5).

В клітинах, що мали досить велику І5[оч, компоненту, прикладання 100 мкМ 4-АП не призводило до зміни частоти генерації потенціалів дії. Ми зробили висновок, що ця компонента не відіграє великої ролі в стабілізації електричної активності кардіоміоцитів.

Додавання в позаклітинний розчин невеликої концентрації Ва2+ (від 50 до 100 мкМ), як класичного блокатору каналів ІК1, теж не впливало на частоту генерації потенціалів дії клітин. То ж ми дійшли висновку, що найбільш важливою компонентою калієвого струму, що відповідає за стабілізацію електричної активності, в кардіоміоцитах ранньої стадії диференціювання є компонента ІІ0. В пізніх клітинах велику роль в підтриманні частоти генерації потенціалів дії починає відігравати нечутлива до 4-АП І5и5 компонента калієвого струму. Стала часу виходу з інактивації Тю дорівнює 2.4 сек. Базуючись на кінетичних та фармакологічних властивостях цієї компоненти калієвого струму, ми дійшли висновку, що кодуючим геном каналів І,0 є Куі.4.

АТФ-залежні калієві канали

Певну роль в генерації збудження та стабілізації електричної активності клітин міокарду відіграють і інші калієві канали, наприклад канали Іи, Ідей та ік,аТФ- В протилежність каналам Ік1 та ІАсь, ми не спостерігали великої різниці в густині струмів ікагф між ранніми та пізніми кардіоміоцитами.

В деяких поодиноких кардіоміоцитах ми спостерігали виникнення переривання генерації потенціалів дії. Така електрична активність характеризувалася періодами (22.6 сек) генерації потенціалів дії, між якими спостерігалися періоди відсутності електричної активності (21.1 сек). Під час періоду генерації ПД розвивалась постійна гіперполяризація мембрани, поширення розвитку ПД та спад частоти потенціалів дії. В періоди відсутності ПД виникала постійна деполяризація і після досягнення критичного рівня спонтанні ПД виникали знову (Рис.З). Розвинення гіперполяризації мембрани кардіоміоцитів під час активного періоду припускає участь в цьому процесі калієвих струмів. Додавання в камеру тапсігаргіну (блокатору саркоплазматичної Са2+-АТФаз), що приводило до

підвищення рівня вільного кальцію б клітині, не змінювало характер генерації ПД (Рис 3). До того ж в експериментах з фіксацією потенціалу ми ніколи не бачили Са2+-активовані калієві струми. Отже, участь Ік,са о виникненні пачкового тину електричної активності викликає сумніви.

Рас.З Вшшв ТС па пачковий тип електричної активності кардіомітштів.

Знизу, додавання в розчин тапсігаргіну (блокатору саркоплазматичної Са2+-АТФаз) не змінює характер генерації потенціалів дії.

Вгорі, частота генерації потенціалів дії в Гц, момент прикладання ТО вказаний стрілкою.

Рие.4 Залежність кіііетичігах параметрів І(0 від рівноважного калієвого потенціалу.

Ліворуч, залежність сталої часу активації ї10 від рівноважного К+ потенціалу,

праворуч - параметру стаціонарної

активації І,0. Приведено по 3 криві,

отриманні для різних концентрацій

позаклітинного калію - 10, 20 та 30 мМ. По осі абсцис калієвий рівноважний

потенціал (У'Ук).

Така пачкова активність рідко зустрічалася на ізольованих

кардіоміоцитах, то ж природу та механізми виникнення такого типу електричної активності ми вивчали використовуючи метод для тривалої реєстрації - позаклітинне відведення потенціалів від областей

ембріонального тільця, що скорочувались. Таку типову пачкова активність можна було викликати видаленням основних “енергетичних” компонентів культурального розчину, або додаванням в розчин компонентів, які

підвищують частоту генерації потенціалів дії, таких, як Вау К 8644 (агоніста Ь-типу Са2+ каналів). Прикладання блокатору ікдтф глібенкламіду (1 мкм) приводило до повного пригнічення пачкової активності. Ми дійшли висновку, що ік.атф і є гіперполяризуючим струмом, що обумовлює виникнення пачкового типу електричної активності кардіоміоцитів.

Вплив позаклітинної концентрації К+ на швидкий калієвий струм Практично всі кардіоміоцити мали струм. Але вивченню цієї компоненти струму на міокардіальних клітинах перешкоджає наявність великої кількості типів струмів в клітинах та практичної неможливості виділення Ісо компоненти в чистому виді. Тому для подальшого вивчення властивостей І4о, ми використовували клітини лінії ОН з, які експресують аналог кардіального Ісо - ІА, транзієнтний калієвий струм (Ку1.4).

К+ струм, що швидко інактивується, викликався деполяризацією до -40 мВ і вище від підтримумого потенціалу -80 мВ. Реєстрація проводилась при тестуючих потенціалах від 0 мВ до +80 мВ з кроком 20 мВ. По отриманим реєстраціям струмів були розраховані сталі часу активації 1^ (тп) та значення параметру стаціонарної активації (їй) для різних концентрацій К+ в позаклітинному розчині. Згідно класичної моделі Ходжкіна-Хакслі тп та Поо є функціями мембранного потенціалу і не залежать від іонних

Рис.5 Коиформаційішй потенціал іопного каналу з двома мінімумами.

Конформаційний потенціал визначає кінетику функціонування іонного каналу: ймовірність реалізації стану, час життя та частота переходів між станами визначаються значенням потенціалу в точках екстремумів - Щхі), и(х2) та ІДх3).

концентрацій. Але ми спостерігали зсув залежності тп від значення мембранного потенціалу водночас із зміною потенціалу реверсії струму. Цей зсув мав немонотонний характер. При збільшенні позаклітинної [К+] від 10 до 20 мМ залежність зсувалась в напрямку більш низьких потенціалів, але

Рис.б Залежності швидкостей переходів а та В від позаклітинної концентрації іонів калію.

Залежності а та В від зовнішньої концентрації К+ надані для трьох тестуючих потенціалів: 0, 20 та 40 мВ (вказані на графіках).

для концентрацій завбільшки 20 мМ ця залежність зсувалась в напрямку більш високих потенціалів. Подібний ефект ми спостерігали і для залежностей тп від мембранного потенціалу ер (Рис.4). Залежність іа та ги від позаклітинної [К+] мали екстремуми при [К+]30В близько 20 мМ (Рис.4).

Опис роботи іоипого каналу з урахуванням іон-конформаційної взаємодії

Модель Ходжкіна-Хакслі припускає, що різноманітні воротні механізми відповідають за відкривання-закривання каналу та визначають кінетику іонних каналів. Ворота можуть знаходитися в двох позиціях: відкритій та закритій (Рис. 5). Але вони можуть знаходитися в будь якому стані, відповідно до певного значення узагальненої конформаційної змінної х. Ця змінна може описувати ефективний діаметр каналу, положення зарядженої групи каналу, якого-небудь кутового або молекулярного розміру та інше. Кожен стан характеризується енергією, що є функцією х -конформаційного потенціалу (и(х)). Його мінімуми визначають стійкі стани: Хі відповідає відкритому стану, Хз - закритому стану, а хг відповідає позиції потенційного максимуму, що визначає енергію, яка необхідна для переходу із одного мінімуму в інший. Ефективний потенціал и(х) повністю визначає кінетику переходів і має термо-активовану природу. Швидкості переходів а та р визначаються такими рівняннями:

а~ехр[ (и(х3)-и(х2))/кТ], й~ехр[ (и(Х!)-и(х2))/кТ] (1)

де к - константа Больцмана, Т - абсолютна температура.

Для опису іон-конформаційної взаємодії (ІКВ) та її впливу на функціонування іонного каналу розіб’ємо и(х) на дві складові: и(х)=Н(х)+У(х), де Н(х) - значення енергії воротної ірупи каналу в разі відсутності іона в каналі. Вона залежить від мембранного потенціалу, але не від концентрації іонів. У(х) - це енергія ІКВ, що включає заселеність каналу іонами N і залежить як від мембранного потенціалу, так і від позаклітинної концентрації іонів. Потенціал каналу поблизу відчиненого (хі) та зачиненого (хз) станів ми можемо задати у вигляді парабол:

Н(х)=аіХ2+ВіХ+кТсіср, хгД; < х < Хі+Ді (2)

де і=1 або 3, ф - мембранний потенціал, а;, Ь] та с; - це фіксовані структурні параметри каналу, Д; - позитивна величина, що визначає відхилення від мінімуму х;, коли вірне наближення (2).

Використовуючи взаємозалежність т„, ги, а та й (тп=1/а+й, іг,-а/а+ії), ми обчислили залежність а та В від [К+]30В (Рис.6). Залежність а від [К+] має більш виразний характер, ніж для (3, що означає, що різниця и(х])-и(х2) є постійною, а значення и(хз)-и(хг) залежить від [К+]зов. Відкритий стан (хі) практично нечутливий до позаклітинної [К+]. В той же час екстремуми залежностей а від [К+]зов не зсувалися для різних значень мембранного потенціалу.

Таким чином, мембранний потенціал не виливав на ІКВ. Це може значити, що ефекти, що спостерігаються, визначаються залежністю заселення каналу в місці, близькому до зовнішнього розчину. Завдяки більш швидкому обміну із зовнішнім розчином, заселеність в місці зв’язування визначається в основному позаклітинною концентрацією іонів калію, а не потенціалом та/або внутрішньою їх концентрацією.

Отже, беручи до уваги, що [К+]зов практично не змінює швидкість переходу р, знехтуємо У(х) при розгляді відкритого стану (хі). Для простоти будемо розглядати положення х2 та значення и(х2) фіксованим (и(х2)=соп8І), тобто тільки потенціал, що визначає зачинений стан (хз), чутливий до змін [К+]зов, що обумовлюється належністю функції У(х) в ІКВ. Можемо знову спростити, вважаючи, що іон-конформаційна сила є постійною, тобто дУ(х)^х=т)К, де N - це заселеність, що є головним фізичним параметром, що визначає ІКВ, а ті - це сила, що діє, коли іон постійно знаходиться каналі (N=1). ІКВ пропорційна числу іонів, що приймають участь у взаємодії, тобто N. Інтегруючи по х, отримуємо потенціал У(х):

У(х)= г|Мх + тії'!, х3 - Д3 < х < Х3+А3

(3)

де постійна інтегрування пропорційна N. В цьому випадку як іон-конформаційна сила, так і енергія дорівнюється нулю, коли місце зв’язування вільне (N=0). Таким чином, конформаційний потенціал и(х) можливо описати у відчиненому стані: '

и(х)=а!х2 + Ьіх + кТсіф, X] - Ді < х < Хі+Аі ■ (4а)

та в зачиненому стані:

и(х)=а3х2 + (Ьз + т]]Ч)х + кТс3ф + ті>Т, х3 - Л3 < х < х3+А3 (46)

За умов, що визначають положення мінімумів Х| та хз сШ(х)/сіх=0 видно, що зачинений стан визначається як х3= -(Ьз+гіК)/2а3 та, підставляючи цей вираз в рівняння (46), отримуємо значення конформаційного потенціалу Щх) в цій точці:

и(х3) = кТ[ -к(К - N0)2 + сзФ] + и3° (5а)

де константи к, N0 та и3° визначаються попередніми параметрами а3, Ьз, ц та п, які залежать від потенціалу; N0 визначає положення екстремуму и(хз) та, отже, екстремуму константи швидкості. Таким чином, ця формула припускає, що максимум функції а([К+]нар) не залежить від мембранного потенціалу, що і спостерігається в експерименті.

В той же час енергія и(х) в положенні хі може бути записана у вигляді:

ІІ(Хі) = кТс^ф + и”, и” = +Ь1х1 (56)

Підставляючи вирази (5) в рівняння (1) і вводячи нові параметри, знайдемо константи швидкості:

а=а0ехр[-к(М-К0)2 +с3ф], р=р0єхр[с1ф]

(6)

де ао та р0 - нові параметри моделі, які включають початкові енергії Uj°. Зауважимо, що всі параметри моделі в рівнянні (6) є взаємно незалежними і можливо апроксимувати а та р незалежно.

Таким чином, конформаційний потенціал, що визначає кінетику каналу по рівнянню (1), залежить від квадрату заселеності N. Ця залежність визначає нелінійності, наведені на рисунках 3 і 5. Очевидно, що зростання концентрації викликає зростання заселеності N, поки не буде досягнуте насичення, що обумовлене обмеженим розміром місця зв’язування в каналі, так що N не може перевищити граничну величину.

ОБГОВОРЕННЯ

В кардіоміоцитах, диференційованих in vitro з ембріональних стовбурових клітин, основним реполяризуючим струмом був К+ струм, що швидко активується. Ми виділили три різних компоненти струму, внесок яких в сумарний струм залежав від віку клітин. Ці компоненти відрізнялися як по кінетиці, так і по чутливості до позаклітинного прикладання амінопірідінів. Швидкий калієвий струм (It0) був присутній практично у всіх протестованих кардіоміоцитах, але його електрофізіологічна роль (сумарний заряд, що переносився за час тестуючого зміщення потенціалу) була більш виразна в клітинах ранньої стадії диференціювання. Густина цієї компоненти струму лише незначно зростала в пізніх кардіоміоцитах. В той же час густина компоненти, що неінактивується, була не так суттєва, як густина І(0 компоненти. В пізніх клітинах густина Isus збільшувалася більш ніж в два рази. Беручи до уваги практичну відсутність інактивації цього струму, його електрофізіологічна роль значно зростала в кардіоміоцитах пізньої стадії диференціювання. Ми дійшли висновку, що в ранніх кардіоміоцитах І£о-подібна компонента струму є основною в контролі електричної активності клітин, а в пізніх кардіоміцитах сильно підвищується роль 4-АП нечутливої компоненти струму (Isus). В частині клітин, що були протестовані (близько 30%), була присутня ще й гіперчутлива компонента струму з повільною інактивацією. На нашу думку, цей струм не має суттєвого значення в стабілізації частоти генерації ПД, але важливий для регулювання сили та тривалості скорочення клітин міокарду.

В процесі робота з кардіоміоцктами, диференційованими in vitro, ми іноді спостерігали пачковий тип електричної активності клітин. Позаклітинні реєстрації від ділянок, що скорочувались, вказували на АТФ-чутливі К+ канали, як на канали, що визначали цей тип електричної активності клітин. Додавання в позаклітинний розчин блокатору ік,атф глібенкламіду перетворювало пачкову активність в звичайні регулярні ритмічні скорочення. Пачкова активність легко викликалась зменшенням вмісту метаболічних компонентів в культуральному середовищі, що вказує на зв’язок між метаболічним станом ембріонального тільця та мембранною збудливістю кардіоміоцитів. Різниця в енергетичному балансі та його підтриманні може пояснити спонтанну електричну активність ембріональних тілець в культуральному середовищі та тілець, що були деякий час в позаклітинному розчині.

Коливальні зміни, але не пачкова поведінка мембранної збудливості вже були раніше показані у вентрикулярних кардіоміоцитах (O’Rourke, et al., 1994). Циклічні зміни активності АДФ та НАДН змінювали мембранну збудливість шляхом дії на канали 1к,лтф- Також відомо, що активність каналів ік,атф сильно залежить від концентрації АДФ- Місце зв’язування АДФ розташоване на рецепторі SUR, і зв’язування АДФ заважає блоку АТФ, який може виникати безпосередньо на каналі KIR 6.2. Це припускає, що процеси, які потребують присутності АТФ, в кардіоміоцитах в основному підтримуються АТФ, отриманим в ході гліколізу. Пряме чи непряме включення мітохондріальних коливань не може бути повністю виключено для нашої системи, але воно малоймовірно, так як пачки виникали спонтанно та могли бути викликані в присутності позаклітинного глютамату та пірувату - речовин, які можуть використовуватись мітохоцдріями в окислювальному метаболізмі.

Ми зробили спробу розкрити фізико-хімічні механізми функціонування найбільш суттєвого типу іонних калієвих каналів - каналів Ito струму. Емпірична теорія кінетики іонних струмів Ходжкіна-Хакслі заснована на кінетичних рівняннях, що зв’язують струм крізь мембрану з електричним потенціалом. Ця модель надає задовільний математичний опис поведінки мембран, що збуджуються, та надає наочне уявлення про функціонування іонного каналу. Але ця теорія не змогла дати коректну

макроскопічну інтерпретацію воротних процесів. Крім того, ця модель не описує концентраційних залежностей параметрів іонних струмів. Наприклад, спостерігалась нелінійність вольт-амперної характеристики поодинокого каналу м’язів людини (Fahlke & Ruppersberg, 1998). Було показано, що натрієвий струм при потенціалі +130 мВ є нелінійною функцією зовнішньої концентрації іонів натрію, хоча електрохімічний градієнт повинен чинити протилежний ефект. Було показано, що структура потенціального профілю каналу змінюється в залежності від концентрації іонів, що проходять крізь канал (Eisenman & Dani, 1986). Зсув залежностей кінетичних характеристик та струмів від потенціалу в сторону потенціалу реверсії відображають вплив іонних концентрацій на кінетику каналу (Hille, 1992; White et al., 1993). Ці факти, як і багато інших, вказують, що концентрація іонів може контролювати функціонування каналу. Використання трохи іншого підходу до опису ІКВ (Kharkyanen et al., 1994; Weinreb & Kharkyanen, 1995) дозволяє вирішити ці проблеми: зсув п*,(ф) при змінах іонних концентрацій, зникнення зачиненого стану при нульовому струмі, природу конформаційних станів каналу та інші. Такий підхід дозволяє описати і наші експерименти. Ми бачимо, що немонотонні залежності швидкостей переходів між станами від позаклітинної концентрації калію зв’язані з деформацією ефективного конформаційного потенціалу U(x). Таким чином, наші результати підтверджують точку зору, що іон-коформаційна взаємодія може значно впливати на функціонування каналу.

ВИСНОВКИ

1. Досліджено калієвий струм, що виходить в кардіоміоцитах, диференційованих з ембріональних стовбурових клітин, який можливо розділити на три різні компоненти по кінетиці активації та інактивації та використовуючи їх різну чутливість до амінопірідінів.

2. Прослідковано зміни густини трьох компонент калієвого струму, що виходить, а саме: It0 - швидкого транзієнтного, Isiow, що повільно інактивується та lsus, що неінактивиється, від віку кардіоміоцитів в процесі раннього кардіоміогенезу.

3. На ранніх періодах диференціювання особливо важну роль відіграє компонент калієвого струму, що швидко інактивується - It0 струм, який не

тільки приймає участь в формуванні потенціалу дії кардіоміоцитів, а і відіграє важливу роль н стабілізації електричної активності клітини.

4. АТФ-залежні калієві канали відіграють важливу роль на всіх

періодах раннього кардіоміогенезу і є такими, що обумовлюють виникнення пачкового типу електричної активності кардіоміоцитів.

5. Аналіз кінетичних характеристик швидкого калієвого струму

показав, що зміна позаклітинної концентрації іонів калію веде до їх зміни, які певно обумовленні належністю іон-конформаційної взаємодії іонів із структурою каналу.

Роботи, опубліковані за матеріалами дисертації

1. Грищенко А.В., Березетская Н.М., Ваинреб Г.Е., Кононенко Н.И.,

Седова М.В. Влияние внеклеточной концентрации ионов калия на

функционирование потенциал зависимых калиевых каналов клеток GH3 // Нейрофизиология.-1995.- Т.27.- N2.- С.85-89.

2. O.V.Grishchenko, V.N.Kharkyanen, N.I.Kononenko and G.E.Weinreb. Ion Regulation of the Kinetics of Potential-Dependent Potassium Channel // Journal of Biological Physics.- 1997.- V.23.- P.195-208.

3. Грищенко A.B. Изменения экспрессии ионных каналов в кардиомиоцитах млекопитающих во время раннего эмбриогенеза // Нейрофизиология.-1998.-Т.ЗО. N3.-C.232-237.

Тези доповідей:

1. First meeting of the Gcrman-Ukrainian Research Group, Київ, 1996. Gryshchenko O.V., Outward rectifier K+ channels in cardiomyocytes: Control by development and long-term application of blockers.

2. Deutsche Physiologische Gesellschaft, 76th Annual Meeting, Rostock, Germany, 1997. Gryshchenko O.V., Fleischmann B.K., Hescheler J. Outward rectifier K+ currents in early- and late stage cardiomyocytes derived from embryonic stem cells.

3. Deutsche Physiologische Gesellschaft, 76th Annual Meeting, Rostock, Germany, 1997. Igelmund P., Fischer I.R., Soest J., Gryshchenko O.V.,

Fleischmann В.K., Hescheler J. Nimodepine induces arrhythmia in cardiomyocyte clusters in three-dimensional cell culture.

4. Deutsche Physiologische Gesellschaft, 76th Annual Meeting, Rostock, Germany, 1997. Gryshchenko O.V., Fischer I.R., Soest J., Viatchenko-Karpinski

S., Igelmund P., Fleischmann B.K., Hescheler J. Bursting behavior induced by ATP-sensitive K+ channels in embryonal stem cell derived cardiomyocytes.

5. Conference on Physics of Biological Systems, Київ, 1998. Gryshchenko O.V., Weinreb G.E. Nonlinear effects of ion-conformational interaction in potassium channels of biomembranes.

АНОТАЦІЇ:

Грищенко О.В. Дослідження калієвих каналів та їх ролі в кардіоміоцитах, диференційованих з ембріональних стовбурових клітин миші. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічній наук за спеціальністю 03.00.02-біофізшса. - Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України, Київ, 1998.

За допомогою методу фіксації потенціалу було досліджено калієвий струм мембрани поодиноких кардіоміоцитів, диференційованих in vitro з ембріональних стовбурових клітин миші лінії D3. Показані зміни експресії калієвих каналів клітин під час раннього кардіоміогенезу. Показана особливо важлива роль каналів транзієнтного струму (It0) в формуванні та підтримці стабільної електричної активності кардіоміоцитів на ранньому строку диференціювання - від двох до чотирьох діб після появи спонтанних ритмічних скорочень. Встановлено, що на відміну від інших типів калієвих каналів, АТФ-залежні канали експресуються практично у всіх кардіоміоцитах незалежно від строку диференціювання і густина ік,атф практично не змінюється з віком клітин. Показана роль АТФ-залежних каналів в змінах електричної активності кардіоміоцитів, що виникають при змінах енергетичного метаболізму клітини. Визначені механізми впливу позаклітинної концентрації К+ на функціонування калієвих каналів швидкого транзієнтного струму, що обумовлені іон-конформаційною взаємодією білку, що формує канал, та іонів, що протікають крізь нього. Ключові слова: кардіоміоцити, К+ канали, АТФ-залежні канали, іон-конформаційна взаємодія.

Грищенко AB. Исследование калиевых каналов и их роли в кардиомоцитах, дифференцированию: нз ембриональних стволових клеток миши. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02-биофизика. - Институт физиологии им. А.А.Богомольца НАН Украины, Киев, 1998.

С помощью метода фиксации потенциала был исследовался калиевый ток мембран одиночных кардиомиоцитов, дифференцированных in vitro из эмбриональных стволовых клеток мыши линии D3. Показаны изменения экспрессии калиевых каналов клеток во время раннего кардиомиогенеза.

Показана особо важная роль каналов быстрого транзиентного тока (It0) в формировании и поддержке стабильной электрической активности кардиомиоцитов раннего срока дифференцирования - от двух до четырех дней после появления спонтанных ритмических сокращений. Установленно, что в отличии от других типов калиевых каналов, АТФ-зависимые каналы экспрессируются практически во всех кардиомиоцитах независимо от срока дифференцирования и плотность 1к,атф практически не изменяется с возрастом клеток. Показана роль АТФ-чувстаительных каналов в изменениях, возникающих при изменениях энергетического метаболизма клетки. Определены механизмы влияния внеклеточной концентрации К+ на функционирование калиевых каналов быстрого транзиентного тока, обусловленные ион-конформационным взаимодействием каналообразуещего белка и проникающими ионми. Ключевые слова: кардиомиоциты, К+ каналы, АТФ-зависимые канали, ион-конформационное взаимодействие.

Gryshchenko O.V. Исследование калиевых каналов и их роли в кардиомоцитах, дифференцированиях из ембриокалышх стволових клеток миши. - Рукопись.

Thesis for a candidate’s degree by speciality 03.00.02 - biophysics.- Bogomoletz Institute of Physiology of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 1998.

Path-clamp technique has been used to investigate potassium currents in the membranes of single cardiomyocytes differentiated in vitro from embrionic stem cells (D3 line). Changes in the expression of potassium channels in early cardiomyogenesis have been shown. A significant role of the channels of rapid transient current (It0) has been proved in forming and maintaining the stable electric activity of early cardiomyocytes - from two to four days after the spntaneous contractions begin. It has been found that unlike other types of potassium channels, ATP-dependent channels are expressed practically in all cardiomyocytes irrespective of the differentiation time, and that the density of Ik,atp practically does not change at different stages. The role of ATP-sensitive channels in variations that occur with the change of energy metabolism of a cell has been shown. The mechanisms of the influence of outside K+ concentration on

the functioning of potassium channels of the rapid transient current caused by ion-conformational interaction of channel-forming protein with passing ions have been determined.

Key words: cardiomyocytcs, K+ channels, ATP-sensitive channels, ion-conformational interaction.