Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование химической передачи в различных синаптических входах мотонейрона лягушки

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование химической передачи в различных синаптических входах мотонейрона лягушки"

о а н 9

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

ИНСТИТУТ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ имени И. М. СЕЧЕНОВА

На правах рукописи

КАЛИНИНА Наталья Ивановна

УДК 612.815: 615.34:595.443

ИССЛЕДОВАНИЕ ХИМИЧЕСКОЙ ПЕРЕДАЧИ В РАЗЛИЧНЫХ СИНАПТИЧЕСКИХ ВХОДАХ МОТОНЕЙРОНА ЛЯГУШКИ

Специальность: 03.00.13 — Физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЛЕНИНГРАД 1991

Работа выполнена в лаборатории эволюции межнейроиного взаимодействия Института эволюционной физиологии и биохимии имени И. М. Сеченова.

Научный руководитель — доктор медицинских наук, профессор Н. П. Веселкин.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Н. Я. Луком-ская; доктор медицинских наук М. О. Самойлов.

Ведущее учреждение: Ленинградский государственный университет.

Защита состоится 1СССЬ?Я 1991 года в час. „а за.

седании Специализированного совета (К 002.89.01) по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова АН СССР (Ленинград, пр. М. Тореза, д. 44).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

Автореферат разослан Ж 1991 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

Л. В. Зуева

Актуальность темы.

¡В1 последние десятилетия в изучении механизмов межнейронного ^взаимодействия достигнуты значительные успехи (Есс1ев, 19861""Шаповалов, Ширяев, 1987; Shapovalov, 1988). Однако многие важные вопросы, касающиеся синаптической передачи в ЦНС позвоночных, остаются невыясненными. Двае на таком классической объекте, как спинальный мотонейрон, до сих пор есть ряд неясных моментов в трактовке ионных механизмов возбуядапцих постсинапти-ческих потенциалов (ВПСП), идентификации возбуждающих передатчиков и модуляторов,1 не говоря уяв о роли отдельных ионных каналов и взаимодействии передатчиков с рецепторами. В частности, на препарате изолированного спинного мозга лягушки показано, что синаптическая передача осуществляется посредством химического и электрического механизмов (Shapovalov et al., 1978). Однако недоставало необходимого звена в доказательстве химической передачи -реверсии ВПСП под влиянием деполяризации. На основании опытов с изменением ионного состава среды было сделано' предположение о тон, что ВПСП генерируется преимущественно .натриевым током, однако из-за методических трудностей не был измерен потенциал реверсии ВПСП, являющийся ванной количественной характеристикой, отражающей ионшй состав генерирующего его тока.

В настоящее врем одним из вероятных возбуждающих медиаторов в ЦНС считается глутаиат (Ratkins, EvanB, 1981s Fagg, Footer, 1983; Fonnum, 1984). Однако строгое доказательство медиатсркоЗ функции глутвматэ получено только для насекомых (Anwyl, 1977; UBhemood, 1977, 1978; Ueherwood et al., 1984; Cull-Candy et al., 1981, 1982, 1987). В ЦНС позвоночных такое доказательство долгое время бь£ло затруднено из-за отсутствия мощных избирательных антагонистов возбуждающих аминокислот. Не была получена и реверсия возбуждающего ответа, вызываемого аппликацией глутамата к мембране ыотонейрона спинного мозга, что являлось пробелом в доказательстве, основанном на критерии идентичности действия (ITerman, 1980).

В последние годы появились многочисленные данные, подтверждающие глутаматергическую природу передачи в головном мозгу млекопитающих, где найдены разные типы глутаматных рецепторов (Watkins, EvanB, 1981; Foster, Fagg, 1984; Monagham et al., 1989; Дамбинова, 1989). Однако для спинного мозга подобного рода данные весьма отрывочны и разноречивы (Evans et al., 1979;

Corradetti et al., 1985; Fletcher et al., 1988).

Важность интегративной функции ыотонейрона не вызывает сомнения, однако механизмы его активации через разные возбуждающие входы почти не изучены. Практически ничего не известно относительно различия или сходства между супраспинальным и сенсоио-торным входами с точки зрения ионного механизма генерации постси-наптических потенциалов и участвующих в синаптической передаче медиаторов.

Учитывая все это, представлялось необходимым исследовать ионный механизм генерации ВПСП и возможную медиаторную функцию глутамата в различных аозбуздащих входах ыотонейрона лягушки. .

Модель для подобного рода исследований - мотонейрон изолированного спинного иозга ллгуики с разными скнаптическими входа-121 - Сила разработано з нашей лаборатории (Ширяев, 1972). Относительно цели данной работы предстояло расширить возможности этой модели, прхшэшш иетод одноэлектродной трансыенбрашюй поляризации с покощью прерывистого поляризующего тока и дискретного измерения урошш избранного потенциала (Ш) в паузах этого тока (НИбоп, Goldner, 1975; Курчавый, Рябов, 1984). Этот иетод позволяет непосредетвешю измерить потенциалы реверсх;и, что до сих пор ни иотонейронах лягуыки сделать не удавалось. . •

В наиих экспериментах фармакологическое исследование было начато с изучения действия недавно открытого вещества - ергиопи-на, ннзкоцолекулярного компонента яда паука , известного как блокатор глутамат-актнвпруеиых каналов у насекомых (Магазаник и др., 1986; Jackeon, Ueherwood, 1988). Аргиогаш и другие известные антагонисты глутамата была использованы для анализа природа химического медиатора и типов рецепторов, опосредующих передачу в исследуемых входах иотонейрона. Такой комплексный подход дает возможность решать вопросы, которые не только имеют теоретическое значение, но и позволяют приблизиться к разработке целенаправленного фармакологического воздействия на определенные механизмы нервной системы, что похет иметь практическое значение в клинической практике.

Цель работы.

. Целью настоящей работы являлось изучение механизма генерации возбуждающих постсинаптических потенциалов в мотонейроне лягушки, исследование предполагаемой медиаторной роли глутамата, а также сравнение разных синаптических возбуждающих входов.

Основные задачи.

1. Исследовать зависимость моносинаптических ВПСП, полученных в мотонейроне при активации разног. возбулдащих входов и ответов, вызываемых никроаппликацией глутаматп к мембране от уровня мембранного потенциала. Проверить, реверскруэт ли эти ответы при деполяризукцеи смешении неубранного потенциала, а такяе пепосредствегао измерить их потенциалы реверетп! в одной п той 71в метке.

2. Для этого освоить применительно к мотонейрону лягунпга методику, позволялдур с помоцъп одного и того пе шшрозлектрода смещать мембранный потенциал путей пропускания прерывистого трансме^бранного тока и измерять непосредствешш уровень мембранного потенциала и физиологический ответ клетки а паузах этого полярязугчего тока.

3. Изучить из иотонейроне ллгуши действие аршопина - нового Избирательного антагониста глутсипта.

' 4. Исследовать постсинаптачзсккз реакции, возникавшие в иотонейроне в ответ на аппликация глутаната и его агонистов, а твкзе влияние на них антагонистов возбуздвзЕзис аминокислот.

5. Исследовать влияние антагонистов возбуяданцях аминокислот па ВПСП, генерируете при актнвзцзи разных синоптических входов.

6. Сопоставить результата исследовакая потенциалов реверетш н исследования оффэктов антагонистов, попутаться регглть вспрос о зкютеской прргроде гладиатора и типах рецепторов, которые опосредуют синаптическую передачу в разных возбуздагецих входах кото-нейрона лягугкн.

Научная новизна.

Впервые получено такое ванное доказательство химического механизма передачи в разшх возбуздагсцях сшюптичесюи входах •..'отоквйропа лягушки как истинная реверсия возбуждающих постсикап-тнческих потэшхчалов под влиянием трансмеыбраннсй деполяризации. Впервые получена нстинная реверсия постсинаптического ответа, вызываемого иакроаппликацией глутаыата к разным участкам нембранн уотсиейрона. Непосредственно измерены потенциалы ревериш ВПСП и глутонатшх ответов. Потенциалы реверсии ВПСП п глутанатних ответов, измеренные в одной и той ге клетке, близки по величине. Получетдзе значения потенциалов реверсии соответствует представлению о слабоселективкых иенннх каналах н участии в возбуждающей токе ионов натрия и калия. Измеренные во время глутаматного от-

вета изменения проводимости мембраны оказались незначительный!, что свидетельствует против участия ионов хлора в генерации данного ответа. . Установлено, что аргиопин, блокатор глутамат-активируешх каналов у насекомых, у лягушек также является избирательным блокаторои не-НМДА рецепторов, скорее всего квисква-латиых. Показано (электрофизиологически и фармакологически), что супраспинальный (ретикулоспинвльный) и сенсомоторный входа мотонейрона имеют глутаматергическую природу и опосредуются рецепторами не-НМДА типа. В то ке время фармакологически обнаружена гетерогенность этих возбуждающих моносинаптических входов в отношении влияния на них аргиопина. Ретикулоспинальный вход, по-видимому, опосредуется преимущественно квисквалатными рецепторами, сенсоиоторный вход - каинатными.

Научно-практическое значение.

Результаты проведенного исследования имеют значение для общей нейрофизиологии, нейрофармакологии и физиологии нервной клетки.

Полученные факты значительно уточняют и расширяют имеющиеся представления об общих принципах, функциональной организации цежнейронных синоптических связей в центральной нервной системе Позвоночных, в частности, о механизмах генерации. возбуждащих синаптических потенциалов, о природе и действии возбуждащих медиаторов, о типах постсинаптических рецепторов, опосредующих синаптическую передачу. Результаты настоящей работы вносят существенный вклад в решение вопросов, связанных с разработкой целенаправленного фармакологического воздействия на определенные механизмы нервной системы, что имеет большое значение в клинической практике.

0 работе содержатся также сведения, важные для изучения функциональной организации и'эволюции глутаматных рецепторов.

Апробация работы, публикации.

Материалы диссертации были доложены на IX Всесоюзном совещании по аволюционной физиологии (Ленинград, 1986), на смотре-конкурсе работ молодых ученых и специалистов Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова АН СССР (Ленинград, •1986, 1988), на XV. съезде Всесоюзного физиологического общества им. И.П.Павлова (Кишинев, 1987), на Всесоюзном симпозиуме "одиночные ионные каналы в биологических мембранах" (Пущино,- 1989), на XII ежегодном совещании Европейской Ассоциации по Нейронаукаы

(Турин, Италия, 1989). По материалам диссертации опубликовано II работ.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы (I глава), описания методики исследования (II глава), изложения результатов исследования (III, IV главы), их обсуждения (V глава) и выводов. Список литературы включает 208 работ ( 35 отечественных и 173 зарубежных). Диссертация изложена на 147 страницах ыаши-нописного текста, содержит 28 рисунков, 2 таблицы.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на 120 лягушках Rana rldlburtda обоего пола весоы Ю0-200г.

Опыты проводили на препарате изолированного спинного иозгз. После наркотизации эфирои н дорсальной лашшэктоши спинкой иозг вместе с продолговатыи извлекали и помещали в перфузионную камеру объемом 3 ил. Препарат перфузировали нормальным физиологический растворои, содержащий (в иМ/л): líaCl - 98; KCl - 2; трис - I; НаНС03 - 9j MgClg - 0,5; СаС1? - 1,5; глгжсза -5,5. Полное блокирование хиыичэскоЯ псредо-п: а синапсоп достигалось перфузией препарата в бескальциэБса ргсгаорэ следукг,его состава (з и'.'/л): NaCl - 101; KCl - 2; MgClg - 2; ИаНСОд - 10; глжоза - 5,5. Потенцяала деЯстшя (ПД) блогёфозали добавлением в п8рфузируЕСГ*Я раствор тетродотоксгага d концентрации Я::10-'м.

При ::сслодозс1^з чувствительности оеыбранн иотонейрона гс 2Г0ШСТЕН и антагониста:! дикарбопових агзшскислот вещества добавляли з перфуз!фукщ!й раствор в следующих концентрациях (d :?.!/л): глутв:>ат - 5x10-'* - 2x10 ¡ аспартат - 1x10 = квисквалат -

(1-2)хЮ каинат - 1x10 шшуренат -2x10 J¡ 2-амино-5-

-d -7

фосфоновалериановая кислота - 3x10 ; аргиопин - ЗхЮ - 1x10 ;

стрихнин - IxIO-6 - IxIO-5; пикротоксин - IxIO-4.

Все раствори аэрировались в течение опыта карбогенои (98% 02 + 2% СО,) и пыелн рН=7,4-7,6. Температуру раствора поддергивали около 17 С.

Схшантические потенциалы вызывал:! активацией различных входов ыотонейрона. Супраспинальный вход актив1фовали путец стимуляции ретикулярной формации ствола мозга. Биполярный стиму-лируюцкй электрод из гахроыовоЯ проволоки с кехполюснш расстоянием около 100 UKU вводили в дно IV яелудочка.. СенсомоторныЯ вход актив!фовали путем стимуляции девятого или десятого дорсального

корешка. Кроме того, для активации мотонейрона использовали микростимуляцию нисходящих волокон латерального канатика (ЛК) и микростимуляцию. неидентифицированных пресинаптических терминалей (ПТ) на расстоянии до 400 мкм от сомы мотонейрона. Для микрости-иуляции ЛК использовали стеклянный микроэлектрод с диаметрои кончика 5-10 шш, заполненный ЗМ NaCl, который погружали в мозг на уровне У1сегыента на глубину до 500 шш. Электрод устанавливали в разных фокусах, при стимуляции которых в мотонейрона возникал ВПСП. Стимулирующий ток Сил около I мкА, длительность тока около I мс. Для микростимуляции ПТ использовали отдельный подвижный относительно внутриклеточного иикроэлектрод с диаметрои кончика около 5 икм, сопротивлением 5-20 МОм. Микростимуляцию ПТ осуществляли отрицательными импульсами тока силой 400-500 нА, длительностью 0,5-1,0 мс. Из этого же микроэлектрода, заполненного 2-3 М глутшатом натрия (рН=8), ионофоретически апплицировалн глутаиат к разданным точкам соматодендритной мембраны. Ток ионо-фореза составлял 100-200 нА, длительность тока 100-600 мс. Ионо-фореткческий мнкроэлектрод ног устанавливаться на разных расстояниях от сош мотонейрона. Микростимуляция не вызывала выходе глутамата из-за кратковременности стимула, а импульс тока аппликации глутамата был меньше порога, обеспечивающего электрическук ьмкростимуляцию пресинаптических окончаний.

Для внутриклеточного отведения потенциалов использовала стеклянные иикроэлектродц с диаметром кончика около 2 мкм, сопротивлением 5-10 МОм, заполненные ЗМ KCl, а в части опытов ацетйтоь (IM) или цитратом (2М) калия. Внутриклеточные отведения производили от поясничных мотонейронов с потенциалом покоя не менее -5( мВ. Мотонейроны идентифицировали по антидромному ПД, вызываемому стимуляцией вентрального корешка.

Микроэлектроды через • неполяризующиеся хлор-серебрянны« электроды включались в мостовые схемы. Усиление сигналов производилось ыикрозлектродными усилителями постоянного тока с входяы» сопротивлением I ГОм. Мембранный потенциал клеток контролировал по цифровым вольтметрам. Использовали фоторегистрацию с экран; осциллографа (ЭМОФ) и запись на ленту самописца (КСП-4). Статистическую обработку данных производили по общепринятой методике (Урбах, 1964).

Для смещения мембранного потенциала от уровня потенциал! покоя применяли методику прерывистого приложения трансмембранногс

поляризущего тока и дискретного измерения потенциала монбршш в паузах мелду толчками тока с помощью одного и того яе микроэлектрода (ИНвоп, Со1с1пег, 1975). В этой методике используется схема, с помощью которой смещение мембранного потенциала достигается путем заряда мембранной емкости короткими толчками поляризующего тока, а измерение биологического потенциала и смещенного уровня производится дискретно в паузах между толчками, так что п номент измерения ток через микроэлектрод и соответствующее паразитное напряжение на нем отсутствуют (прерываются) и не мешают измерению потенциала на мембране. Этим данная схема выгодно отличается От мостовой схемы. В данной работе использовалась модифицированная система, аналогичная описанной ранее (Курчавий, Рябов, 1934). Частота прерывания составляла 1-2 кГЦ, длительность толчка тока равнялась паузе. В части опчтов для смещения мембранного потенциала использовался постоянный ток.

СРАВНЕНИЕ ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ВОЗБУЖДАЮЩИХ ПОСТСИНАПТИЧЕСКИХ ПОТЕНЦИАЛОВ И ОТВЕТОВ НА МИКРОАППЛИКАЦИЮ ГЛУТАМАТА В МОТОНЕЙРОНАХ ЛЯГУШКИ

Свойства ВПСН. Влияние на ;ых 'трансмембранной поляризации.

Потенциал реверсии.

Исследовали ответы, вызываемые в мотонейроне активацией различных синоптических входов: ответы на роздраиение ретикулярной формации ствола мозга (ГФ ВПСП), ответы на раздражение дорсального корешка (Д1С ВПСП) и ответа, вызываете электрической микростимуляцией латеральных канатиков (ЛК ВПСП). Моносинаптичес-кне ВПСП имели простую форму: быстрое нарастание (2-5 не) и более медленный, близкий к экспоненциальному спад (10-20 мс). Для получения ответов, приближенных к г"еиентаршм, применяли стимулы минимальной силы, при которых наблюдался устойчивый ответ. Критерием моносинаптического характера ответа служила величина латентного периода: 2,5-3,5 мс для РФ ВПСП, не более 3,1 мс для химического компонента ДГС ВПСП, 1,0-3,5 мс для ЛК ВПСП (Ширяев, 1972; Б)1ароуа1оу ег а1., 1978).

Деполяризующее смещение мембранного потенциала трансмембранным прерывистым или постоянном током о течение нескольких секунд приводило к уменьшению амплитуды моносинаптического ВПСП (иногда до нуля), но не к реверсии ответа. Непосредственное измерение МП помогло рыяснить , что реперсия не развивается по той причине,

что уровень МП смещается недостаточно в связи с уменьшением сопротивления мембраны под вликниец деполяризации (задерганное выпрямление ). .

Далее иы обнарукили такое явление: при увеличении длительности деполяризующего тока силой 40-60 нА до 1-2 ш сопротивление мембраны постепенно вырастало, и уровень 1Ш при той пе токе соответственно смещался, достигая положительных значений порадев +50 иВ к более. В таких условиях по мере смещения f,'JI в сторону положительных значения саплитуда ВПСП уменьшалась, затеи ответ реверсировал (менял полярность ), i. с^оиштуда реварсировашюго ответа росла. В более поздних опытах задерганное выпрямление стали устранять с помощьа инъекции ь клетку попов цезия из внутриклеточного олектрода. Цэзкй вызывал рост вводного сопротивления naflpoHQ, т.к. блокировал потенциалзависшаш калиевые канала иеыб-рани, ответственной за генерации потенциала действия.

Из 43 исследованных РО) ВПСП реверсия Сила получена для 33, па 13 Д1С ВПСП - для 0, из 14 ЛК ЕПСП - для всех 1-1, Была получена реверсия одного унитарного ЕПСП.. глззаниого прящц внутрааксо-налыпле раздракениец одного ¡¡исходящего волокна. П ü случаях ДК ВПСП Ht¡ реверсировали, п 4 случаях па наблюдалось отчетливой peuapcmi PS ВПСП, хотя в тех 5.е клетках отрепалась реверсия. ЯК ППСП. Возсошо, аш S случаев соответствует наиболее отдаленно!; локализации пходоз, когда сшщиш КП и coro входа значительно лсльбдьио (Calvin, 1S5Si Enguere, Uaruhall, 19Y9).

Ващгчяиг/ потенциала рзвероки ВПСП определяли как точку пересечения графика зависимости аииитуди ВПСП (ордккатв) от уровня неубранного потенциала с' осы; абсцисс. Зпичешш потенциалов реверсии ноиомшаптпческкх ДЕС ЕПСП к Pi.' ЕПСП лазали и диапазоне 0 - -10 ив; В 4 клетках били определены поушщкали реверсии ддл 14 Jilt ВПСП. В одноц ц той ve аотонейропа косно било получить насколько Ж ВПСП с разкыки латентными периодами, амплитудой, длительностью фронта к различными потенциалами реверсии. Эти JHC ВПСП назывались спасуляцией разных фокусов, активируемых по пера продвикения стниулирущего иикроэлектрода. Потенциал реверсии для Ж ВПСП варьировал от +5 до -25 мВ. В единственном случае удовлетворительной регистрации унитарного ВПСП, вызванного прямым внутриклеточным раздражением нисходящего аксона, потенциал реверсии был равен -10 мВ. • ■

ВПСП с длинными латентными периодами (3,5 - 7,0 мс), отне-

сегаше к полисинаптическим, имели значительно более отрицательные значения потенциалов реверсии (-10 - -35 мВ). При этом длинно-латентные ответы в отличие от коротколг тентшх реверсировали сразу после приложения небольшого поляризующего тока (10-20 пА). Ценность приведенных данных заключается в том, что уровни МП и потенциалов реверсии, благодаря использованной методике, измеряли непосредственно, не прибегая к экстраполяции, которую вынуждены были использовать в предыдущих исследованиях (5Ъароуа1оу et а1.,1978).

Свойства ответов на аппликацию глутамата.

В следующей серии экспериментов были изучены свойства ответов на иикровппликацшо глутамата (ГЛУ-отЕетов) из ионофорети-ческого микроэлектрода, который подводился к различным точкаы соиатодендритной поверхности мотонейрона на разных расстояниях от сошл. Как правило, ГЛУ-ответ начинал появляться при расстояниях около 300 ыкн. С дальнейшим продвижением электрода он мог исчезать и вновь появляться. Перемещая вверх-вниз форетический микроэлектрод, ыожно было найти "горячие" точки, в которых амплитуда ГЛУ-ответа была максимальной. Однако- выявить какую-либо корреляцию не жду расстоянием до сомы и амплитудой ГЛУ-ответа в пределах +300 мкм нам не удалось. Возмошю, на величину амплитуды влияют тагам толщина и ветвление дендритов и/или количество и тип рецепторов на данном участке мембраны.

Во всех случаях глутамат вызывал только деполяризацию мембраны. Амплитуда ответа зависела от силы и длительности тока фореза и варьировала от 0,5 до 20 мВ. Время нарастания составляло 0,3 - 1,р с, а длительность всего ответа - 1,0 - 4,0 с. Во многих случаях ГЛУ-отзеты сопровождались усилением активности спонтанных миниатюрных потенциалов.

Для исключения нэпряыого- действия глутамата (например, деполяризации глутаматом пресинаптических элементов) сравнивали ГЛУ-ответы, полученные в нормальном и бескальциевом (содеряащем 2 Ш Мп2+) растворах, т.е. в условиях полного, но обратимого блока химической передачи. В таких условиях ГЛУ-ответы сохранялись без изменений, что свидетельствует о прямом действии глутамата на мембрану постсинэптического нейрона.

Было обнаружено, что ГЛУ-ответ изменяется при смещении МП аналогично ВПСП и, так же как ВПСП, реверсирует при деполяризации. Истинная реверсия ГЛУ-ответа наблюдалась во всех 26 исследо-

ванных мотонейронах в нормальной растворе и в условиях блока химической передачи. Наличие реверсии свидетельствовало о том, что глутамат воздействовал на рецепторы постсинаптическгй. мембраны, и ГЛУ-ответы, как и ВПСП, являлись следствием изменения ионной проводимости этой мембраны. Обычно амплитуды ГЛУ-ответов, как и амплитуды ВПСП, уменьшались по мере увеличения трансмембранного деполяризующего тока, проходили через нуль при токах 20-30 нА (в среднем 25,7 ± 1,5 нА, п=13) и изменяли полярность с возрастанием тока до 30-50 нА при уровне МП около нуля. При величинах МП около +20 мВ ГЛУ-ответ становился почти зеркальным отображением исход-ног<?. Потенциал реверсии определялся, так же как и для ВПСП.Среднее значение потенциала, реверсии для ГЛУ-ответа, вычисленное по 13 наиболее устойчивым клеткам, составляло -16,9 ± 1,7 ыВ (п=13). Такая величина, вероятно, отражает участие как ионов натрия, так и ионов калия в генерации ГЛУ-ответа. Разброс значений потенциалов реверсии ГЛУ-ответа (от О до -20 мВ) может быть связан с различием в электротонических расстояниях, а также может отражать неодинаковое соотношение натриевой и калиевой проводимостей в различных клетках.

Изменение проводимости мембраны во время ГЛУ-ответа измеряли о. помощью короткого толчка поляризующего тока. Увеличение входной проводимости было незначительным, оно не превышало 10%, что также говорит в пользу преобладания натриевой проводимости и против хлорной проводимости, которая должна была бы вызывать гораздо большие изменения входной проводимости.

Сравнение в одной и той же клетке потенциалов реверсии

ГЛУ-ответов и ВПСП.

В, 13 случаях ДК ВПСП, РФ ВПСП, а также ВПСП, вызываемые микростимуляцией пресинаптических терминалей (ПТ ВПСП), и ГЛУ-ответ были зарегистрированы в одной и той же клетке. Это исключало неопределенности, связанные с измерениями в разных клетках, и поэтому было особенно важно. В этих случаях с большей уверенностью можно было использовать критерий идентичности действия (Werman, 1980) для оценки глутамата как предатчика в исследуемых входах.

• Глутаматшй и синаптические ответы (ДК, РФ и ПТ ВПСП) изменялись по мере смещения МП сходным образом. Реверсия развивалась

примерно при одинаковом деполяризующем токе, ГЛУ-ответ и все ВПСП реверсировали при уровнях МП, близких к нулю. Средние значения потенциалов реверсии для ГЛУ-ответа, ДК ВПСП, РФ ВПСП и ПТ ВПСП составляли, соответственно: -16,9 ± 1,7 мВ (п=13), -9,8 ± 1,8 мВ (п=6), -6,8 ± 1,7 мВ (п=13), -16,1 ± 1,4 мВ (п=13), Полное совпадение потенциалов реверсии глутнматного и синаптическия ответов наблюдалось в нескольких клетках. Ближе других к ГЛУ-ответу был ПТ ВПСП. В среднем отклонения не превышали для ТГГ ВПСП - 2 мВ, для РФ ВПСП - 10 мВ, для ДК ВПСП - 7 мВ. Такие отклонения можно объяснить тем, что микростимуляция пресинаптических терминалей И микроаппликация глутамата производились в одной и той де точке (см. МЕТОДИКУ), тогда как входы ДК и РФ могли быть отдалены от кончика форетического микроэлектрода. Линейная суммация ГЛУ-ответа и РФ ВПСП, которая наблюдалась в большей части случаев, свидетельствует в пользу того,что эти ответы генерировались в разных точках мембраны.

■ Результаты сравнения ГЛУ-ответов и моносинаптических ВПСП говорили в пользу сходства ионных механизмов их генерации. Это является необходимым, но не достаточным условием для доказательства глутвматергической природы передачи в исследованных синапсах. Дальнейшее исследование этого вопроса проводилось с использованием фармакологического подхода.

ИССЛЕДОВАНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МЕМБРАНЫ МОТОНЕЙРОНА К ДЕЙСТВИЮ АГ0НИСТ0В И АНТАГОНИСТОВ возбуждающих АМИНОКИСЛОТ Фармакологический подход состоял в том, что в одной и той яе клетке сопоставлялось действие антагонистов возбуядащих аминокислот на ответы, вызванные агонистами и на синаптические ответы, вызванные активацией разных входов (РФ, ДК, ПТ ВПСП). Для этого получали ответ мотонейрона на кратковременное добавление в нормальный пер1)узируки1{ий раствор агонистов и ВПСП из разных синаптических входов, затем исследовали эти ответы на фоне антагониста, добавляемого в перфузирующий раствор в течение 30-40 мин. Наш были исследованы следующие антагонисты глутамата: аргиопин, низкомолекулярный яд паука Arglope lobata, известный как блокатор глутамат-активируемых каналов у насекомых; 2-амино-5-фосфоновалериановая кислота (APV), хорошо изученный мощный конкурентный блокатор глутаматннх рецепторов НМДА типа; кинуре-нат, неспецифический антагонист глутэматных рецепторов.и 6-цивно-7-китроквинооалин-2,3-даон (CTJQX) - ног-ый малоисследованный

специфический антагонист глутаматных рецепторов не-НВДА типа (СНОХ в малых концентрациях блокирует квисквалатные рецепторы, в больших - каинатные). Таким ке способом мы изучили свойства аргиопина, как избирательного блока гора, применительно к иотоней-ронам спинного мозга лягушки и тем продолжили исследование этого нейротоксина, начатое Антоновым и соаьт. (Ап1;опоу е! а1., 1987).

Кратковременное (20-40 с) добавление в перфузирующий раствор глутамата (ГЛУ), аспартата (АСП) и синтетических агонистов, квисквалата (КВ) и каината(КА), вызывало четкую деполяризацию во всех 32 исследованных мотонейронах. По эффективности действия на мембрану иотонейрона использовашше агонисты поено располошггь следующим образом: КВ>КА>ГЛУ>АСП, поэтому для получения ответов одного порядка по амплитуде ' использовались различные рабочие концентрации агонистов (см. Методику). Даке при одной и той не концентрации агониста амплитуда ответа варьировала в разных клетках от 5 до 20 мВ для ГЛУ, от 2 до 10 иВ для АСП, от 10 до 20 мВ для КВ и от 5 до 25 пВ для КА. Временное течение ответов на аппликации агонистов характеризовалось следующими параметрами, соответственно,, для ГЛУ-, ДСП-, КВ- н КА-ответов: время нарастания 0,3 - 1,0 млн, 0,2 - 1,0 шга, 0,2 - 0,5 шн, 0,2 - 0,5 мин, длительность всего ответа- 2,0 - 4,0 мин, 0,5 - 2,0 иин, 2,0 -4,0 мин, 2,0 -4,0 мин. Стабильность ответов проверялась путем повторного вызова ответа через 2-3 ыин после окончания предыдущего. После 2-,3-кратного повторения аппликации десенситизации не наблюдалось.

Кинуренат в концентрации 2x10 М закономерно угнетал ответы на аппликацию ГЛУ, КВ, КА, соответственно, до 62,3 ± 13,8%, п=4; 23,0 +• 3,0%, п=2; 15%, п=1 от исходного значения.

Аргиопин в кош(ентрации 10 М в четырех случаях из шести уменьшал ГЛУ-ответ до 45-805Г (в среднем до 50,8 ± 12,7%, п=4), КВ-ответ (в трех случаях из шести) до 28-64% (в среднем до 51,3 ± 10,2%, п=3). В шести случаях из семи аргиопин не уменьшал КА-ответ. Аргиопин такие не оказывал заметного влияния на АСП-от-вет. Напротив, АРУ почти полностью блокировала ДСП-ответ (п=3) и уменьшала ГЛУ-ответ (известно, что глутамат активирует как НМДА, ,так и не-НМДА рецепторы). Эффект аргиопина был слабо обратимым. Для восстановления ответа после воздействия аргиопинои требовалось, как правило, несколько часов, тогда как действие АРУ и кинурената прекращалось через 20-30 мин.

-13В части опытов действие аргиопина на ответы, вызываемые аминокислотами, изучалось в условиях блокирования потенциалов действия с помощью тетродотоксина (с целью исключить непрямое действие аргиопина). В этих условиях аргиогаш уменьшал ГЛУ- и КВ-ответы аналогичным образом.

Эти результаты показали, что аргиопин в ЦНС лягушки, так ш как и у насекомых, является избирательным блокатором глутаматных рецепторов не-НМДА типа (преимущественно квисквалатных).

В 43 случаях было исследовано действие антагонистов на ВПСП, Еызваемыа активацией ретикуломотонейропного и дорсальноко-реикового сииаптическнх входов мотонейрона.

Кинуренат (2x10 ) эффективно угнетал раншше и поздние компоненты как РО ВПСП, так и ДК ВПСП. Через 10-20 мин действия кинуреиата амплитуда РФ ВПСП снижалась на 26-70% (в средней на 48,7 ± 5,3%,п=9). Наблюдаемый характер угнетения да ВПСП отличался от такового для РФ ВПСП. Блок РФ ВПСП развивался более градуально, чем ДК ВПСП. Последний во многих случаях блокировался до нуля ( при данной силе стимуляции) уке через 8-10 шш действия кинураната. В части клеток сохранялся какой-то особо устойчивый компонент, имеющий простую форму, близкую к экспоненциальной н латентность приблизительно на 1нс больше, чем у самого раннего компонента. На исключено, что это тормозный компонент, поскольку .он угнетался в ряде случаев стрихнином (специфическим блокатором глициновых рецепторов) и пикротоксином (блокатором ГЛЖ-рецепторов). Кинуренат отмывался быстро , ответы полностью восстанавливались через 30 мин. СНОХ (10 |1М) также угнетал ранние и поздние компоненты ВПСП обоих входов. Эти результаты хорошо согласуются с предположением о глутаматергической природе синап-тической передачи в обоих исследованных входах.

В первые 10-15 мин после начала перфузии раствором, содержащим аргиопин (ЗхЮ-7 - ЗхЮ-6 М) в большинстве случаев отчетливо наблюдалось увеличение амплитуды всех ВПСП (иногда до 1002 от исходного значения). Однако далее обнаруживалось принципиальное различие во влиянии аргиопина на ДК ВПСП и РФ ВПСП. Аргиопин в низких концентрациях (ЗхЮ-7 М) угнетал моносинаптический РФ ВПСП. Амплитуда ответа через 40 мин действия блокатора снижалась до 30-50%, составляя в среднем 4б;8 + 4,7%, п=13 от исходного Уровня. Однако в той же клетке амплитуда моносинаптического ДК ВПСП никогда не уменьшалась. Подобное различие менду моносинапти-

- -14-

ческиыи ДК ВПСП и РФ ВПСП сохранялось и при увеличении концентрации аргиопина в 3 И 10 раз: амплитуда ДК ВПСП не уменьшалась, а амплитуда РФ ВПСП падала почти до нуля. Амплитуда РФ ВПСП снижалась почти до нуля и при низкой концентрации аргиопина в случае увеличения времени его экспозиции до 60 мин. Блокирующий эффект аргиопина на моносинаптический РФ ВПСП был очевиден в 13 экспериментах из 18. В 5 случаях моносинаптический РФ ВПСП, подобно раннему компоненту ДК ВПСП, оставался устойчивым к блокирующему действию аргиопина даже после 40 мин обработки блокатором в концентрации ЗхЮ-6 М.

Эффект аргиопина был неоднозначным и в тех 7 опытах, в которых, помимо РФ и ДК ВПСП, исследовано влияние аргиопина на ответы, вызванные микростимуляцией пресинаптических терминалей. В четырех из них аргиопин угнетал ПТ ВПСт1: через 35-40 мин амплитуда ответа составляла 25-40£ от исходной (в среднем 26,2 ± 5,1%, п=4), в трех опытах ПТ ВПСП не уменьшались даже после более длительного действия блокатора. Возможно, такой результат был ' связан с тем, что стимулируемые терминали в одних случаях принадлежали ретикулоспинальньш волокнам, в других - дорсальнокорешко-выы.

В ряде клеток было исследовано также действие аргиопина на полисинаптические компоненты РФ ВПСП и ДК ВПСП. Полисинаптические компоненты ВПСП существенно снижались по амплитуде после 40-45 мин перфузии аргиопином. Как правило, через. 60-70 мин действия блокатора ответ практически не «одержал поздних компонентов.

Чтобы исключить влияние тормозных процессов в части экспериментов перед или после воздействия аргиопином в перфузирующий раствор добавлялись стрихнин и пикротоксин. Продолжительная перфузия препарата тормозными блокаторами вызывала судорожный эффект: регулярно, примерно I раз в минуту", повторяющиеся деполя-ризационные волны длительностью около 10 сек, амплитудой 15-20 мВ в течение 1,0 - 1,5 часов. После предварительной обработки кон-вульсантами действие аргиопина на все ВПСП осталось прежним, с той лишь разницей, что. не наблюдалось увеличение амлитуды в первые 10-15 мин действия аргиопина. Это может указывать на то, что аргиопин действует и на тормозные процессы. Возможно, что потекциируодее действие аргиопина связано с тем, что он блокирует глутаматные рецепторы некоторых интернейронов, входящих в тормозной путь и тем самым угнетает торможение (показано наличие преси-

наптического торможения в мотонейронах лягушки (Тамарова и др., 1981).

Угнетение аргиопином РФ ВПСП дополнительно подтвердило глутаматергическую природу нисходящего входа. В то ее время выраженная чувствительность нисходящего входа к аргиопину и резистентность к нему сенсомоторного входа свидетельствовали о том, что эти два входа в чем-то гетерогенны.

Предположив, что гетерогенность входов связана с различием в типе глутаматных рецепторов, опосредующих эти два возбуждающих моносинаптических' входа, мы попытались уточнить тип рецепторов. С этой целью было испытано действие АРУ и СЩХ на синаптическиа ответы. АРУ даже в высокой концентрации (ЗхЮ~4.М) не оказывала заметного влияния ни на ионосинаптический РФ ВПСП, ни на моноси-наптический ДК ВПСП, однако угнетала поздние (полисинаптические) компоненты ВПСП обоих входов. В тех же клетках АРУ существенно подавляла ответы, вызванные кратковременным добавлением в перфу-зирующий раствор аспартата. Последнее служило контролем блокирования НМДА рецепторов мотонейрона. СЫОХ в концентрации 1-3 рЛ действовал подобно кинуренату, т.е. подавлял ранние и .поздние компоненты ответов, регистрируемых в вентральном корешке .при раздражении дорсального корешка (ДК-ВК) и медиальной ретикулярной формации (РФ-ВК),а также ДК и РФ ВПСП. Причем более эффективно и раньше по времени С№ЗХ утнетал моносинаптический супраспинальный вход по сравнению с дорсальнокорешковын, в чем выявилось его сходство с аргиопином. Амплитуда мокосинаптического РФ ВПСП снижалась через 20-30 мин до 71,5 ± 5,2%, п=4; 38,3 ± 2,6Х,п=4; 20,5 ± 4,1*, п=4 от исходного значения при конценрациях СЫОХ 1,3,10 рМ, соответственно. Поздние компоненты ДК и РФ ВПСП подавлялись примерно в одинаковой степени. Но в отличие от аргиопина СЫ0Х утнетал Также и ранний (резистентный к аргиопину) компонент •ДК ВПСП. При малой концентрации блокатора это угнетение было выражено слабо: амплитуда ДК ВПСП уменьшалась в среднем до 92,3 ± 5,835, п=4; 79,8 + 6,2%, п=4 (концентрации СШХ I и З^Л, соответственно), но при большей концентрации (10 цМ ) СИОХ уже через 10 мин вызыьал резкое падение амплитуды ДК ВПСП: ответ почти полностью блокировался.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные результаты позволили дополнить имеющиеся представления о химическом механизме передачи в исследованных синап-

сах. Соотношвние химического и электрического компонентов ВПСП можно определить путем блокирования химической передачи при удалении ионов кальция из перфузирующего раствора и добавлении ионов марганца (Katz, Miledi, 1970; Bennett,- 1972; Shapovalov et al., 1978). Однако при таком способе нельзя исключить возможность подавления импульсной активности в пресинаптических терминалях. Неоспоримым доказательством химического механизма передачи в синапсах является закономерное изменение амплитуды ВПСП и демонстрация реверсии ВПСП при смещении мембранного потенциала (Edwarde et al., 1976; Brown, Jonston, 1983). После первых работ Экклсв и сотр.- (СоошЪв et al., 1955), продемонстрировавших истинную реверсию 1а ВПСП в мотонейронах кошки, ее удалось воспроизвести лишь через 20 с лишним лет из-за экспериментальных трудностей (Engberg, Marshall, 1979; Platman et al., ,1982). В мотонейроне лягушки путем замены в перфузирущем растворе кальция на марганец было показано, что афферентные и нисходящие ВПСП опосредуются либо чисто химическими, либо смешанными (совмещающими электрический и химический способы передачи) синапсами, причем число химических синапсов для нисходящего входа значительно преобладает (Shapovalov et al., 1978, Бабалян, 1984). ■ Вместе с тем реверсию получить не удавалось. Почти все исследованные.в нашей работе ВПСП реверсировали, что подтверждает их химическую природу. Отсутствие реверсии в единичных случаях можно объяснить наиболее отдаленной локализацией входов.

В настоящей работе свойства синаптических ответов одной и той яе клетки на раздражение разных возбуждающих входов сопоставляли со свойствами ответа на микроаппликацто глутамата. Было показано, что глутаматный и моносинаптический ответы изменяются по мере' смещения мембранного потенциала сходным образом, и их потенциалы реверсии близки по значению. Важно, что использованная нами методика позволила определить потенциал реверсии непосредственно, не прибегая к экстраполяции (Shapovalov et al., 1978).

Известно, что' Натриевый и калиевый равновесные потенциалы, вычисленные по уравнению Нернста, составляют в мотонейроне лягушки +29,4 и -88,1 мВ, соответственно (Bührle, Sonnhof, 1983). Полученные нами величины потенциалов реверсии говорят об участии в генерации ВПСП и ГЛУ-ответа натриевого и калиевого токов, что-

соответствует представлению о слабоселективных ноншх каналах. Зная цеыбранный потенциал покоя и потенциалы реверсии для ВПСП и ГЛУ-ответа, iai вычислили отношение проницаеиостей для натрия и калия (Рдоц/Рц) в покое и в иоыенг реверсии (т.е. в момент генерации теоретически максимального ВПСП), используя уравнение Гольд-'.¡ана-Ходккина-Катца (Goldman, 1943; Hodgkin,Kats, 1949): RT 1K)0 + (P,ia/PK) tNal0

E = — In- , где

F IK)1 f (P.Ja/PK) [Ha]^

П - универсальная газовая постоянная;

T - абсолютная температура;

V - число ©арадея;

П110, tKlji Ilia!j - концентрации калия и

натрия снаруги н внутри клетки, соответственно;

?!{а,Рк - проницаемости натрия и калия;

Е - иеибрашкй потенциал.

Отношение Pjra/iV составило 0,074 при средне» потенциале покоя -58,4 иВ (п=13). При потенциала реверсии оно увеличилось до 0,93 (для РЗ ВПСП), О,GS (для ДК ВПСП), 0,65 (для ПТ ВПСП), 0,6 (для ГЛУ-ответа). Танки образом, результаты настоящей работа согласуется с представленной о юи, что ВПСП генерируется за счет увеличения преимущественно ньтризпого входодего тока. Такое прэдполс-^нке било сделано на основании -oiiütob с изменение!: ионного состава внеклеточной среду (Sliapovalov et al., 1978). Пгкепешш входной проводииости по время ГЛУ-ответа, изиерсишв в настоящей работе, на прешизлн 10". Изменения входной проводк-* нести, связанные с генерацией ВПСП, то^е кеэначктелып; (S;'iiih et al., 1967i Sliapovalov, Kurchavyi, 1574). Полученные значительнее изменения соотношения натриевой и калиевой проницаеностей погут объясняться увеличением натриевой проводимости при уненьпетш калиевой' (Shapovalov et al., 1978). Незначительные изменении входной проводимости во время генерации ГЛУ-ответа и ВПСП (при значительной изменении P;ia/P{;) могут такяе объясняться дендритной локализацией ГЛУ-рецепторов. Измеренные значения потенциалов реверсии не исключают возможности участия в генерации ВПСП ионов Са^+. Однако полученные нами данные о тон, что ионосикаптическке ВПСП опосредуются глутаиатныш рецепторами не-НМДА типа, нсклвча-ют такую возможность, т.к. нр-НМДА каналы в отличие от НМДА каналов проницаемы для натрия и калия, но слабо проницаемы для

кальция (HacDermott, Dale, 19Э7; Asher, Nowak, 1987).

Таким образом, факт реверсии, близость потенциалов реверсии глутаыатного и возбуядащих синаптических ответов, сходные изые-нешт проводимости говорят в пользу предположения о сходстве механизмов их генерации, что в свою очередь является одним из доводов в пользу глутаматергической природы синаптических ответов. Ценность этих данных в том, что близость свойств глутаыатного и синаптических ответов показана в одной и той не клетке.

В недавних работах других исследователей были твкке получены близкие значения потенциалов реверсии для ВПСП и ГЛУ-ответов на клетках срезов гиппокампа крысы (Hablitz, Langmoen, 1982) и морской свинки (Crunelli et al., 1984), клетках Пуркинье срезов ыозяечка (Hacket et al., 1979; Kiraura ot al., 1985), клетках культуры ткани спинного мозга мыши '(MacDonald et al., 1983; NelBon et al., 1986). Эти данные в сочетании с данными фармакологических экспериментов позволили авторам Сделать заключение о глутаматергической передаче.

Дальнейшее приближение к доказательству глутаматергической передачи в исследуемых синапсах потребовало фармакологического подхода. Однако последний долгое время был затруднен из-за отсутствия мощных и селективных антагонистов возбуядащих аминокислот. Использовались только неспецифические антагонисты широкого спектра действия и известный селективный антагонист НМДА рецепторов -2-амино-5-фосфоновалериановая кислота (APV). По этой причине электрофизиологические исследования в основном были сконцентрированы вокруг НМДА рецепторов, опосредующих медленные синаптические процессы.

Недавно из яда паука Arglope lobata был выделен низкомолекулярный компонент - аргиопин (Гришин и др. 1986). Было показано, что аргиопин является мощным избирательным блокатором глутамат-активируемых каналов у насекомых (Магазаник и др., 1986; Jackcon, UBherwood, 1988).

В настоящей работе аргиопин был исследован применительно к ыотонейрону позвоночных. Было установлено, что он угнетает в низких концентрациях глутаматный и квисквалатный ответы, не влияя на каинатный и аспартатный. APV, наоборот, подавляла аспартатный ответ, не влияя на квисквалатный и коияатный. Следовательно, в иотонейронах лягушки аргиопин такие является избирательным блокатором глутамптшх рецепторов не-НМДА типа и скорее всего кшскяч-

"латных, поскольку угнетение ответов на приложение квисквалата было наиболее сильно выражено.

Предположение о действ™ аргиопина на рецепторы не-НМДА типа в мотонейронах лягушки было выдвинуто ранее (Antonov et al.f 1987) на основании анализа кривых доза-ответ для глутаиата и аспартата. Большая эффективность аргиопина по отношению к глута-ыатным рецепторам жизотных, находящихся на разных уровнях эволюционного развития (членистоногих и позвоночных) дает основание предполагать принципиальную общность и устойчивость строешш глутаматного рецептора.

Предположение о глутаматергической прхфоде синаптической передачи в исследованных нами возбуждающих входах (супраспиналь-иом и сенсомоторном), которое первоначально было сделано на основании сходства свойств глутаматного ответа и БПСП, подтвердилось тем фактом, что и РФ ВПСП, и ДК ВПСП эффективно подавлялись кинуренатом - известным неспецифическим антагонистом глутамата, а та ice о CNQX (6-циано-7-1штроквиноксалин-2,3- дионом), новым селективным антагонистом квисквалата и каината. Тот факт,, что аргиопин эффективно подавлял РФ ВПСП, такие убедительно говорит в пользу предположения о глутаматергической передаче в синапсах этого входа.

Данные по уточнению типов глутаматных рецепторов пока скудны и противоречивы. Для супраспннального входа они отсутствуют. Для сенсомоторного входа ряд авторов (Evane et al., 1979; Davles et al., 1981; Fletcher et al., 1988) показали, что не-НМДА рецепторы опосредуют ранние компоненты ДК-ВК ответов в спинном мозге лягушки, а полисинаптическое возбуждение опосредуется НМДА рецепторами. Однако другая группй исследователей (Corradetti et al., 1985) приводит данные, свидетельствующие об участии НМДА рецепторов в моносинаптической передаче с первичных афферентов на мотонейроны у лягушки. В наших опытах факты нечувствительности обоих моноси-наптических входов к APV, но чувствительности супраспинального входа к аргиопину и CNQX (1-3 |jlM), а сенсомоторного входа - к CNQX (10 |.tM) говорят о том, что эти входы опосредуются глутамат-1шми рецепторами не-НМДА типа.

Несмотря на то, что, по-видимому, оба моносинаптических входа используют глутаматные рецепторы не-НМДА типа, избирательность аргиопина позволила выявить существенные различия между сенсомоторным и супраспинальшм входами, проявившиеся в том, что в одном и том. же мотоиейроие РФ ВПСП угнетались, а ДК ВПСП были

резистентны к блокирущему действию аргиопина. Это потребовало уточнения типа не-НМДА рецепторов.

На основании того, что аргиопин наиболее аффективно блокировал квисквалатные ответы, нами сделано предположение, что ретику-лоиотонейрональный моносинаптический вход опосредуется преимущественно квисквалатными рецепторами. Резистентный к действия аргиопина ранний компонент дорсальнокорешкового ВПСП эффективно угнетался CKQX в концентрации 10 цМ, но слабо - CNQX в концентрации 1-3 цМ. На этой основании можно предположить, что сенсомотор-ный вход опосредуется каинатными рецепторами. Данное предположение не исключает однако какой-то другой особенности аргиопин-ре-зистентных сенсоыоторных синапсов, связанной с анатомией (например, с отдаленной дендритной локализацией), когда возбуждающий потенциал формируется на основе нелинейных свойств дендритов (Гутман, 1934). Гетерогенность данных входов соответствует анатомическому различию пресинаптических нейронов, которые образуют соответствующие синапсы на мотонейроне: это ыультиполярные клетки ретикулярной формации продолговатого мозга и биполярные клетки дорсальнокорешкового ганглия. Гетерогенность синапсов подтверждается Taicue тем фактом, что часть ПТ ВПСП бала чувствительна к ергиопину, а часть - резистентна. ПТ ВПСП, вне всякого сомнения, были моносшшптичесюши, причем при столь локальной симуляции активируется, по-видимому, небольшое число синапсов, соответствующих либо супраспннвлыюму, либо сенсомоторному входам. Следует подчеркнуть, что приведенная. классификация (квисквалатные, каинатные рецепторы) отчасти условна. В настоящее время не найден лиганд, строго селективно связывающийся только с одним из типов глутаматных рецепторов, поэто^-у мояно говорить лишь о преимущественном связывании (Johnston, 1983; Foster, Fagg, 1984; Eccles, 1986). Например, недавно появились данные о том, что квисквалат ыоает активировать и каинатные рецепторы (Monagham et al., 1989). По-видимому, в природе имеет место какой-то более сложный принцип функционирования глутаматных рецепторов. Случаи "аномального" влияния антагонистов на синвптические входы и ответы, вызванные аппликацией агонистов, подтверздаит.это предположение.

Антагонисты (APV, кинуренат, аргиопин, CMQX) прикладывались в ванну и оказывали действие на все звенья полисинаптической цепи, поэтому, говоря об их угнетающем действии на поздние компо-

ненты ДК БПСЛ и РФ ВПСП, надо иметь в виду, что мишенью этого действия могут Оцть как синапсы мотонейрона, так и синапсы промежуточных нейронов. Эванс и др. (Еувпэ а1., 1979; Сау1еа а1., 1981) полагали, что полисинаптическое возбуждение в сенсомо-торном синапсе лягушки опосредуется ЭДДА рецепторами. Наши данные позволяют расширить вто представление: в различных звеньях рети-куломотонейрональных и дорсальнокорешковых полисинаптических связей, по-видимому, участвуют глутаматные рецепторы всех типов.

ВЫВОДЫ,

1. На препарате изолированного мозга лягушки, используя методики внутриклеточного отведения потенциалов и трансмембранной поляризации, а также фармакологический подход, включавший применение агонистов и антагонистов возбуждающих аминокислот и микроаппликацию глутамата к индивидуальным нейронам, проведено исследование предполагаемой глутаматергической передачи в разных синаптических входах мотонейрона (ретикулоспинальноц и дорсально-корешковом).

2. Получено важное подтверждение химической, передачи в исследованных синапсах - реверсия ыоносинаптических ретикулоиото-нейрональных и дорсальнокорешковых ВПСП при смещении мембранного потенциала в область положительных значений.

3. За генерацию ВПСП обоих исследованных входов ответственны, вероятно, слабоселективные ионные каналы, проницаемые для натрия и калия, поскольку измеренные непосредственно значения потенциалов реверсии моносинаптическйх ВПСП, вызываемых активацией супраспинального и сенсомоторного входов, составляют 0.—10 мВ.

4. Оба входа по всей вероятности являются глутаматергически-ми. Это подтверждается тем, что, во-первых, ответ на аппликацию глутамата по своим свойствам близок к ВПСП, вызываемым активацией исследованных синаптических входов. И тот, и другие изменяются при смещении мембранного потенциала сходным образом и реверсируют при уровнях мембранного потенциала, близких к нулю, что позволяет предположить сходный ионный механизм генерации этих ответов. Во-вторых, кинуренат, антагонист действия глутамата, подавляет как моносинаптические ретикуломотонейрональные, так и моносинап-тические доревльнокорешковые. ВПСП. Угнетение ВПСП кинуренатоы и б-циано-7-нитроквиноксалин-2,3-дионом . (СЫОХ) и невлияние Й-амино-Б-фосфоновалериановой кислоты (АРУ) свидетельствует в

пользу использования глутаматных'рецепторов не-НМДА типа в обоих входах.

5. Аргиопин, низкомолекулярный компонент яда паука, в ЦНС лягушки, так ке как и у насекомых, является .избирательным блока-тором глутаматных рецепторов не-НМДА типа (возмопно, квисквалат-ного типа), поскольку ответы, вызываемые в ыотонейроне аппликацией глутемата и квисквалата, но не каината и аспаргата угнетались в результате добавления в перфузирующий раствор аргиопина в низких концентрациях.

6. Хотя оба исследованных синаптических входа являются глутаыатергичэскиш, они, по-видимому, гетерогенны с точки зрения типов опосредующих их рецепторов. Резистентность коротколатент-ного дорсальнокорешкового ВПСП к блокирующему действию аргиопина и малой концентрации CHQX, но угнетение его большыи концентрациями CNQX, а такке эффективное угнетение коротколатеитного ретику-лонотонейроналыюго ВПСП аргиопином и CNQX, коррел!фувдее в какой-то степени со способностью аргиопина блокировать квясква-латный ответ и не влиять на каинаткыЯ ответ, говорит в пользу предположения о той, что супраспинальный вход опосредуется преимущественно квисквалатным ткпоы рецепторов, а сенсоиоторныЯ' вход - каинатныи типом.

7. Поскольку полисинаптичоские реакции обоих входов эффективно подавлялись всеми антагонисташ глутамато (кинуренатом, аргиопином, CNQX и APV) моано предполагать, ч.то в различшх звеньях дорсальнокорашковых и .ретикуломотонейроналышх полиси-наптических связей, по-вид&юиу, участвуют глутамаиыв рецепторы всех типов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Калинина Н.И., Курчавый Г.Г. Потенциал равновесия моносинаптических ВПСП в мотонейроне лягушки. Вопросы эволюционной физиологии.Тез. докл. IX Всесоюзного совещания по эволюционной физиологии. Наука, Л.О., 1986, с.112.

2. Калинина H.H., Курчавый Г.Г., Рябов Б.Т. Потенциал равновесия моносинаптических ВПСП в котонейронзх лягушки. Нейрофизиология, 1986, т. 18, Уе4, С.534-542.

• 3. Чмыхова Н.М., Бабалян А.Л., Калинина Н.И., Курчавый Г.Г., Рябоь Б.Т. О структуре и ионном механизме надсегментарного входы поясничных ыотоиейронов лягушки. Тез. докл. XV съезда Всесоюзного

физиологического общества, Кишинев, 1987,т.2,с.221-222.

4. КалининаИ., Курчавый Г.Г. Свойства ответа цотонейронов лягушки на аппликацию глутаиата. Нейрофизиология, 1988, т.20, Г-6, с.776-785.

5. Веселкин Н.П., Магазаник Л.Г., Калинина II.И., Курчавый Г.Г., Антонов С.М., Шупляков О.В. О химической природе синаптических входов мотонэйрона лягушки. Тез. докл. Всесоюзного симпозиума "Регуляция сенсоиоторных функций". Винница, 1989, с.34.

6. Калинина H.H., Курчавый Г.Г., Шупляков О.В., Веселкин II.П., Антонов С.М., Магазаник Л.Г. Гетерогенность возбуядвкщих синаптических входов в апикальных мотонейронах лягушки. Е.эволюц. биох. н физиол., 1989, т.25, Г5, с.755-761.

7. Магазаник Л.Г., Антонов С.!/!., Веселкин Н.П., Калинина Н.И., Курчавый Г.Г., Шупляков О.В. Блокаторы глутенатных каналов ¡сак инструменты исследования синаптической организации нервной систем. Тез. докл. Всесоюзного сишозиуна "Одиночные ионные каналы в биологических мембранах", Пущино, 1989, с.60.

8. Antonov S.V., Kallnina ПЛ., Kurchavyi G.G., Hagazanlk L.G., Shupliakov O.V., Vesselkin H.P. Identification of tpo typeß

■ oi' excitatory monosynaptic inpiits in irog spinal rcotoneuroneB. Heuroßclence lottere, 1990, 7.109, p;82-8T.

9. Антонов С.Ы., Магазаник Л.Г., Калинина H.H., КурчаЕиЯ . Г.Г., Веселкин II.П. Идентификация рецепторов глутаиата в.возбуждающих синаптических входах в иотонейронах лягушш. Тез. докл. Всесоюзного симпозиума "Ионные каналы в биологических пецбранах", Кара-даг, M., 1990, с.4.

10. Antonov S.U., tîagazanik L.G., Kalinina 11.I., Kurchavyi G.G., Veeselkin 1I.P, Glutamate receptors in excitatory synaptic inputs to frog spinal motoneurones. Abstracto oi the international symposium "Excitatory amino' acids 1990", Padova, Italy, Ileurochemistry international, v.16, Supplement 1, 1990, p.74 (148).

11. Антонов С.M., Магазаник Л.Г., Калинина Н.И., Курчавый Г.Г., Веселкин Н.П. Исследование рецепторов глутаиата возбуждающих синаптических входов мотонейронов лягушки. Тез. докл.Всесоюзной конференции "Физиология и биохимия ыедиаторных процессов", M., 1990, с.18.