Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование гетерогенности 5'-нетранслируемых областей мРНК рецепторов гормонов роста

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование гетерогенности 5'-нетранслируемых областей мРНК рецепторов гормонов роста"

п О?

Российская академия наук

Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта

На правах рукописи УДК 577.214.62

ПЕХЛЕЦКИЙ Роман Игоревич

ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕТЕРОГЕННОСТИ 5-НЕТРАНСЛИРУЕМЫХ ОБЛАСТЕЙ мРНН РЕЦЕПТОРОВ ГОРМОНОВ РОСТА

03.00.03 — Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1992

Работа выполнена в группе генетической инженерии белковых гормонов Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Российской Академии Наук.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, профессор П. М. Рубцов.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, М. Я. Тимофеева (Институт молекулярной биологии им. В. А, Энгельгардта РАН);

кандидат химических наук, В. В. Носиков (Институт генетики и селекции. промышленных микроорганизмов).

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт физико-химической биологии МГУ.

Защита состоится

» октября 1992 года в часов на заседании специализированного совета Д.002.79.01 при Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Российской АН по адресу: 117984, Москва, ул. Вавилова, дом 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Российской АН.

//

Автореферат разослан « » сентября 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы, гормоны роста (ГР) представляют собой полипептидные гормоны с молекулярной массой 22 кд, состоящие из одной цепи, они синтезируются о передней доле гипофиза н необходимы как для нормального роста и развития организма, так и для регуляции 1 ряда анаболических процессов. Характерными особенностями ГР, в этличие от других гормонов белковой природы, являются выраженная зндоспецифичность и множественность биологических активностей.

Механизм действия ГР на молекулярной уровне остается «достаточно изученный. Известно, что основной тканью-мноеныо . кействня ГР является печень, где гормон запускает синтез гисулиноподобного фактора роста Г (соматомеднна). В клетках печени, i также других тканей обнаружены мембранные рецепторы ГР. Очевидно, (то важным направлением исследований механизмов действия ГР [Вляется детальная характеристика рецепторов и ходнрувдих их- генов, [ервые успехи в этой области были связаны с клонированием кднк «цепторов ГР нэ печени кролика и человека. определение уклеотидных последовательностей клик показало, что рецепторы ГР редставляют собой белки. состоящие из приблизительно боо минокислотных остатков. Они содержат внеклеточный гормон-вяэываюаий участок, короткий трансмембранный домен и нутрнклеточный домен. Позднее, уже в ходе выполнения данной аботы, было сообдено о клонировании фрагментов хромосомного гена ецептора ГР человека н пок:п;шо, что дефекты этого гена приводят к ' дной из фора карликовости, так называемой карликовости Ларона [iron-dwarfism). Ген рецептора ГР картирован в хромосоме 5 еловека и занимает участок размером более 87 тыс.п.п.. Кодирующая Эласть гена состоит из 9 акзоиов. Белковыми продуктами гена аляются мембранная форма рецептор,i и сывороточный белок, зязывпюинй ГР (СБСГР), который" лишен трлисмемСрашюго н |утриклеточиого доменов к образуется в результате альтернативного майсинга пре-нРНК или протеолитнческого расщепления мембранной )рмы рецептора.

К моменту начала нгшен работы имелись также косвенные данные о 13МОКНОЙ сложной организации 5'-концевой области генов рецептороз >. Leung et al. (1987) выявили гетерогенность 3'-нетранслнруемых ¡ластей (5 "-¡(ТО) .клик рецепторов ГР человека и кролика к высказали »едполокение о существовании множественных экзоноо з лИлерноГ: S 'О соответствует!!*' геноз. такое' строение S'-области гена едполагает наличие альтернативных промоторов и позмо*!!ость тонкой

регуляции экспрессии гена как на уровне инициации транскрипции, так и на посттранскрипцнонных уровнях.

Цель и залами исследования. Целью настоящего исследования явилось более подробное изучение особенностей организации 3'-коицевой области генов рецепторов ГР и экспрессии различных фори мРНК, отличающихся 5'-НТО, в печени крысы и человека, а также поиск альтернативных форм мРНК в других тканях человека. В ходе выполнения работы были поставлены и решены следующие задачи: 1. разработка варианта метода опосредованной лигированиеи однонаправленной полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющего избирательно амплифнцировать фрагменты кДНК. соответствующие 5'-НТО специфических мРНК. 2. Избирательная амплификация с помощь» данного метода и клоиированне последовательностей 5'-НТО кДНК рецепторов ГР из печени крысы н человека. 3. Определение куклеотидных последовательностей альтернативных форм мРНК рецепторов ГР. и их сравнительный анализ. 4. Поиск альтернативных 5'-нетранслируеыых последовательностей в мРНК рецепторов ГР различных тканей человека и предварительная оценки их относительного содержания. 5. Предварительная характеристика з'-области хромосомного гена рецептора ГР человека. 6. Клонирование кодирующих участков кднК рецепторов ГР и пролактшш крысы и инсулиноподобного фактора роста I крысы.

Научная новизна и практическая ценность работы. Клонированы 2 нзоформы кднк рецептора ГР из печени крысы и 8 изотри кДНК рецептор;! ГР из печени человека, отличающихся 5'-НТО. Получены предварительные данные о соотношении представленности этих иэоформ в печени, для нескольких вариантов 5'-НТО мРНК рецептора ГР человека получены данные о ткннеспецифнчности их экспрессии, на основе анализа нуклеотилных последовательностей обнаруженных вариантов 5'-НТО рецептора ГР сделано предположение о возможности модуляции экспрессии этого белка на уровне, инициации трансляции. Обосновано представление о сложности транскрипционных единиц генов рецептора соматотропина Клонированы транслируемые области Ш1К рецепторов ГР и пролактина и участок кднк инсулимпподобного фактора роста I (юя ¡), кодирующий зрелый фактор из печени крысы. Разработала и успешно применена модификация метода однонаправленной опосредованной лнгированием ПЦР для обнаружения и изучения вариабельности 5•-коииеоого участка молекул мРНК (клик).

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на X И XI советско-французских симпозиумах -Организация и экспрессия генома эукариот и прокариот-, г. киев, 1990 и Сопсагпеаи, Франция,

1992; на международном симпозиуме "Synthetic Oligonucleotides: Problems and Frontiers of Practical Application", г. Москва, 1991; на Soveit-oernan/Wfest-European Molecular Biology Meeting, Konstanz, 1991; на конференции по геному человека (США-Россия), г. Санкт-Петербург, 1992; на семинаре отдела генетической инженерии ИМБ РАН, ' г. Москва, 1992.

Структура н объем диссертации. диссертация состоит иэ введения, трех глав, выводов н списка литературы, она изложена на 106 страницах, содержит J2 рисунка и библиографический список иэ 77 названий.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Клонирование и анализ 5*-НТО клик рецептора ГР печени человека и крысы, к моменту начала данного исследования в литературе имелось сообщение о гетерогенности 5'-НТО клНК рецепторов ГР человека и кролика. Это указывало на возможность суиестоования нескольких промоторов и 5'-нетранслнруеыих экэонов в гена* рецепторов ГР этих видов. Представляло интерес более подробное исследование природы гетерогенности 5'-НТО кднк рецепторов ГР. В связи с этим мы решили исследовать возможную гетерогенность 5'-НТО кднк рецептора ГР из печени крысы, попытаться клонировать различные варианты 5'-НТО кднк рецептора ГР из печени, «еловека. исследовать тканеспеиифичность экспрессии альтернативных зариянтов мРНК рецептора ГР человека н провести сравнение • 1уклеотидных последовательностей 5'-НТО рецептора ГР различных шдов.

Для обеспечения возможности клоннровання слабопредставленных шрнантов 5'-НТО кднк рецептора ГР мы использовали модификацию [етода однонаправленной опосредованной лидированием ПЦР (00\ ПЦР). :хема этого подхода изображена на рис.!.• После отжига двух 1СП0М0гательных олигонуклеотидов. проводили лпгирование с вухиепочечной кднк-мптрниен. В результате адапторнын лигонуклеотнд прививался к S'-концаи матричной ДНК. После очистки Т невключившихся олигонуклеотидов, взятых в болызом избытке для редотврашения сшивки матричных молекул между собой, проводили ПЦР.

качестве праймеров использовали специфический н адапторный лигонуклеотиды, причеи место отжига для адапторного праймера эявлялось только после завершения первого никла ПНР, в результате |{нтеза комплементарной цепи со специфического праймера .

— .......8'3'—8'

Llgase, Precipitation with Isopropanol

-------,-- • • • • -——-* 3'

..............«"

Annealing with speci-

•4/ lie & adaptor primer»

----------------- 9'

........ B'

3'--—.................5'

vj^ First PCR cycle --------- • • - —-s*

N»w atrand < ... - »

Second denaturation 8 Annealing

_________ • • - --3'

........ »■

»*•-----3- __:

Second PCR cycle s]/ ...... 8p,cl(l0 p,i..r

..........—*- g. •••• Speclflo prlmar .

Nsw ilrandi I complementary region

Third PCR cycle ------ Xdaploi pilmar

Helper primer

Other PCR cycles

P»ic.l. Схема, иллюстрирующая методическим подход, однонаправленной опосредованно;! лнгнрованиен ПЦР.

с - применение»

Hind Ш

5'-AACTAGTACGCAAGCTTCACG-3'

На рис.2 изображены олигонухлеотиды В79 и В90, использовавшиеся в качестве ад ¡штора для ООЛ ПЦР. Олнгонуклеотид В90 пришивался к матричной лнк в процессе лигировання и использовался в качестве адапторшго В79 амплификациошюго прайиера. из

Hinriрисунка видно, что адаптер содержит сайт расщепления З'-TTGATCÄTGCGTTCG AAGTGCCTAG-5' рестриктазы Hind III.

в качестве матрицы для В90 амплификации использовали'

двухцепочечиую клик печени крысы с пришитым алаптерным олиго-иуклеотидом В90. Первичная структура и участки отжига спе-специфичесхих олигонуклеотидов GAIU7 и GA231, комплементарных началу кодирующей области мРНК рецептора ГР, пс лзаны на рис.3. ПЦР проводили в двух независимых экспериментах с использованием пар олигонуклеотидов GA107-B90 и СА211-В90 в качестг". праймеров. На рис.4 (А и В, соответственно) представлены радиоавтограф и фотография результатов илектрпфоретического разделения .продуктов амплификации. Из рисунка видно, что продукта амплификации в обоих случаях представляют собой смесь гетерогенных по длине фрагментов

Рис.J. .Адапторние олигонуклеотн-ды, использованные для однонаправленной опосредованной лигиро-iianiiew ПЦР '

GA107

Start ot translation 3'. TGGGACCGTGACCGTCAGAGG

ATGGATCTTTGGCGGGTGTTCTTAACCCTGGCACTGGCAGTCTCC

•10

• 20

♦30

♦40

GA231

TCGCTGTACAAAGGA-5' 3'- TGTGGTCGATGAGAACCG

AGCGACATGTTTCCTGGAAGTGGGGCTACACCAGCTACTCTTGGC

•60 .70 «80 »SO

♦60

TTTCGA-5' AAAGCTTCCCCGQ-.... ♦100

Рис.3. Первичная структура и расположение на кднк рецептора ГР из крысы специфических олнгонуклеотидов, использованных для эднонаправленнои опосредованной лидированием ПЦР.

лечекн кс

UIK с различимыми на их (}>оне отдельными полосами. Продукты ПЦР слонировалнсь в плазмндные вектора рИС19 и pUCl18 по сайту рестрик-

----- иконной эндонухлеазы Sua J. В

а

Ь-

1 2

результате определения нуклео-гидных последовательностей было обнаружено 2 варианта 5'-НТО кднк нептора ГР печени хрисы. Один из клонов содержал вариант 5'-НТО, обнаруженный ранее еЬ а1. (1989). обозначенный нами как тип I (Т1). 17 клонов содержали вставки разной 1 длины другого варианта 5'-НТО, названного нами типом 2 (Т2).

Нуклеотилные последовательности вариантов Т1 и Т2 представлены на рис.5. Как видно из рисунка, вариант Т2 отличается от варианта'Т!, начиная с положения -12 от инициируюше-го АТС-кодона. Точка с аналогичными координатами соответствует в гене рецептора ГР человека з '-концу ближайшего к кодирующей области интрона. Вариабельные области вариантов Т1 и Т2 Не имеют заметной 1МОЛОГШ С последовательностью интрона гена рецептора ГР человека не содержит потенциальных сигналов 3'-акцепторного сайта лайсянгй, поэтому предположение о том. что один из них является

ВЗ №

Рис,4, Электройоретмческнн ана-ШЗ продуктов однонаправленном

)ПОсредовнннои лнгнропаннем ПИР m матрице КДНК из печени кры-:Ы1 8-е использованием а ка-1еетве праймеров олнгонуклеотн-109 890 Н CA 107 (ХС H ВВ - по-имение красителе» маркеров) и » - олнгонуклеотидов В90 и IA21J (дорожхя I), дорожка 2 -iiui-гидрэлизат плэзмиды рвкз22.

.-190 .-180 .-170 .-160 .-150

T1 CGGA OAGACCACAA ОАТАСЛООАТ ТЛТТААТТТА TGGGGATTTT

T2 GGCGGTCTAGGGAG CGGCGGCACT GGCAGAAGCO GCTGTTACAO CGGCGGTCGC

.-140 .-130 .-120 .-110 .-100

T1 TTCGAGATTT АТАГАСССАА GCAACAACTC CTAOATGCTA CAGACCAAGA T2 GGCOACCGCT GTTGCTGAGC CCCGCCAGCC GCGACGACCC CGGGCTGGGG

.-90 .-80 .-70 .-60 .-SO

T1 CACCAAGAAA TAACCACGAA ATTCTACTTT CAACCCTACC TTCTCTACCA T2 CCACGCGGCC TGAGGCCTCG GCTCCAGCAG CCCCCAAGCG GACGCGAACC

.-40 .-30 .-20 .-10 .+1

T1 GATTTTAACT AAACAAGATC TTCTTGCAA „_^.„„„„_ T2 COCGCTCTGT CTCCCA/GGC OAAGCTCCGA PqTCTCAGOT ATGGATl^IXt

Рис.5. Нуклеотидная последовательность двух вариантов 5"-НТО КА.НК рецептора гр из печени крысы (в случае варианта Т1 показана полная нуклеотнлная последовательность, опубликованная Mathews et al. (1989), клонированная нами последовательность подчеркнута).

несплансированной или частично сплайсированной формой и РНК, представляется маловероятным. Скорее варианты Т1 и Т2 это продукты дифференциального сплайсинга двух первичных транскриптов, инициируемых с альтернативных промоторов.

Среди клонированных продуктов ПЦР на один клон, содержащий вставку варианта TI, приходится 17 клонов со вставками варианта Т2. Если допустить, что эффективность всех манипуляций, связанных с клонированием, примерно одинакова для двух типов мРНК, то соотношение клонов отражает представленность двух типов 5'-НТО в популяции мРНК рецептора ГР в печени крысы.

Суммируя результаты данной части работы, можно заключить, что использование метода оол ПНР позволило нам клонировать 2 типа 5 НТО кЛНК рецептора ГР из печени крысы. Точка дивергенции нуклеотндных последовательностей двух типов 5'-НТО соответствует положению -12 относительно инициирующего ATG-кодона, совпадая таким образом с границей интрона 5'-НТО гена рецептора ГР человека.

Приблизительно 50% полученных в предыдущей части работы клонов, содержал» вставки, являющиеся продуктами специфической амплификации. Целью следующего этапа работы была амплификация, клонирование и анализ нуклеотндных последовательностей 5'-НТО кдНК рецептора ГР печени" человека. Для дальнейшего повышения специфичности и эффективности избирательной амплификации последовательностей был использован модифицированный ¿чухступенчатый вариант метода. Схема, иллюстрирующая примененный подход приведена на рис.6. В качестве матрицы использовали двухцепочечную клик, синтезированную с применением рассеянной гексануклеотидной затравки на матрице полИ<,А)-РНК .из печенн человека. Поишвку адаптооного олигонуклеотиди В90 проводили как

di cDNA

1 UoBtlon wlth olloonucleotlde adaptor«

A ¥

г гы «ир о( рси

3. 8«cond tfefi o( РСП

это описано ранее. Полученную смесь фрагментов кднк с пришитыми к 5'-концам адапторными олигонуклеотидами В90 использовали в качестве матрицы для первой ступени ПЦР. На этой стадии праймерами служили: праймер I, комплементарный участку +47 - +70 от инициирующего кодона мРНК рецептора ГР человека (см. рис.7) и адаптор-ный олнгонуклеотид В90, выполняющий роль неспецнфичного ■ праймера. После 25 циклов амплификации проводили фракционирование продуктов ПЦР с помощью электрофореза в ПААГ, удаляя одновременно неиспользованные олигонуклеотиды и короткие продукты амплификации. ДНК, выде-ьенную из геля, подвергали второй ступени ПЦР с' предварительно )осфорилированным с помошью полннуклеотид кнназы фага Т4 :пецифическим праймерои и, комплементарным мРНК рецептора ГР юловека в участке +23 - +46 (рис.7) по отношении к инициирующему :одону. В качестве второго праймера на этой стадии как и в случае ¡ервой ступени ПЦР. использовали адапториыи олнгонуклеотид В90. осле 25 циклов ПЦР синтезированные продукты отделяли от лигонуклеотидов с помощью злектрофореза в ПААГ, элюнровали из геля обрабатывали фрагментом Кленов;» днк полнмераэы I.

Рис.б. Стратегия избирательной амплификации с помощью однонап-

Еавлеиной опосредованной лигиро-анием ПЦР со сиеной специфического олигонуклеотнда 5'-НТО кдНК рецептора ГР из печени человека.

iii

.-10 . + 1 .+10 .+20 .+30 . + 40

з • -тлсстлслслссх;тсолсслсаас-5 '

5' -СТССГАСЛСаТЛТСОЛТСТСГСССЛССТССГС'п'сассптссслсгсаслсслтслл-

3 '-лстсоалссхзтоассютсстлотг-5 '■ .+50 ,+гн) .+70 ii

-стоатсстгптстсоластоаос-з • 3' -састлсслааа аслсгттслстсс-5' I

Рис.7. Нуклеотндная последовательность первого кодирующего зк-эона кднк рецептора ГР человека; первичная структура и :ние специй:......-...... ....................

е специфических, олигонуклеотидов. анных для ПЦР (олнгонуклеотилы I и II) и отбор. ------'тов (оли—............. г

расположение

ванных для .'! . ........................... .

рованных продуктов (олнгонуклеотид III

сполЬзо-а клони-

далее проводили растепление рестриктазой HindiII, сайт /знавания которой был введен в адапторный олнгонуклеотид (см. рнс.2). Полученные фрагменты клонировали в векторе puciis по сайтам Hindi II и Smal, что в отличие от клонирования продуктов амплификации клик рецептора ГР из печени крысы детерминировало ориентацию вставхи 5'-концом антикодирующей' цепи к месту отжига универсального праймера п позволило в дальнейшем проводить реакции грекннга и/или секвенирования с обратного праймера с целью идентификации типа лидера непосредственно от точки дивергенции без предварительного рестрикшюпного анализа на ориентацию вставки. Клоны, содержащие амплнфниированные фрагменты кднк рецептора ГР, отбирали методом гибридизации колоний с олигонуклеотидом III, соответствующий последовательности первых 24 нуклеотидов транслируемой области iPHK рецептора ГР (рис.7). для дальнейшего анализа было взято 1 УК отобранных таким способом клонов,

Секвенирование части случайно выбранных клонов показало, что все они содержат последовательности, соответствующие 5'-иетранслнруеиым участкам мрик рецептора ГР. дальнейший анализ клонов включал: 1) гибридизацию с олиго! ,клеотидами и/или соответствующими МП-пробами, специфичными для отдельных вариантов 5'-нетранслируемой области; 2) идентификацию и секвенирование самых длинных вставок каждого из вариантов; 3) отнесение новых хлонов, содержащих короткие вставки к тому или иному варианту по результатам А-, Т-, или С-трекнига. В результате оказалось, что 183 из 198 проанализированных клонов (более 92%) содержали фрагменты 8 различных вариантов 5'-нетранслируемой области кднк рецептора ГР. Столь высокий выход специфических продуктов амплификации бил получен, благодаря трем стадиям селекции (две ступени ПНР и отбор по результатам гибридизации со специфическим зондом). Определение нуклеотидиых последовательностей вставок, показало, что- все клонированные фрагменты содержат на одном конце последовательность, соответствующую фрагменту адагпорного олигонуклеотида В90 (от 3'-конца до Hindi И-са'та включительно). На другом конце вставки всех клонов имели общую последовательность, которая, как и ожидалось, начиналась с положения +46 по отношению к инициирующему кодону иРНК рецептора ГР (место отжига 5'-конца праймера II). общая последовательность продолжалась до положения -12. Начиная с остатка -13. наблюдалась гетерогенность последовательностей. На pHC.8t-показан 5'-конец нуклеитилнон последовательности общей для всех клопов и начало 8 обнаруженных .вариантных лидерных последователь-

s

v1tctgccggactattg v2 aggcgaagctcggag\ v3gtgctgaaattacag\\

v4atggtggaagataagvv10 Start

v5tttttgt<^ttgca^|tcctacagg1hs

V6GTAGTTTCCAGA3GGG« V7ATGTACTGGGCAAAs/ V8 ACGTATGAGCCTGGG (ytocag/g

ág/э

Рис.». расположение точки дивергенции вариантов кднк рецептора ГР человека vi-ve. Нике приведена каноническая последовательность Э -сайта сплайсинга (незаполненные буква). а под ней нуклеотядная последовательность экзон-зкзоннага стыка.

костей (VI-V8). В хромосомном гене рецептора ГР человека первый экзон кодируюаей области начинается в положении -11 по отноаекн» к

Габлкца I. Распределение различных вариантов 5'-НТО КЛНК рецептора ГР среди клонированных продуктов вмплификдции.

. Вариант 5 -НТО «ДНЕ рецептора ГР ю печек* человека Максимальная длина клонированной 5'-НТО Количество обигрухеинше клонов данного варианта % от общего проанализированное клонов

w 329 86 47.00

п иг О ' 26.80

V3 Щ > .20 10.90

¥« 153 17 9.30

« 416 7 3.80

те 161 2 1.10

V7 119 1 0.55

та 1 0.55

гарту трансляция, таким образом точка дивергенции иуклеотидкых халдователькостей вариантов VI-V8 лежит'рядом с левой границей

первого кодирующего экзона. Как видно из рисунка в положении -13 -12 варианты V2-V5, V7 содержат АО, варианты V6 и V8 - GG, вариант vi - TG. Варианты vj н V 5 ииеют в данной облает последовательность, хорошо укладывающуюся в консенсус З'-сайт сплайсинга. Т.о. варианты v з и V5, по-видимому, соответствуй: несплайсированным или частично спланированным формам ИРНК.

Представляет интерес вопрос об относительном содержат различных форм мРНК в популяции мРНК рецептора ГР в печек человека. Как следует из данных таблицы 1, варианты 5' нетранслируемон последовательности КДНК рецептора ГР с разнс частотой встречались в библиотеке клонированных продуктов ПЦР.

-329 lagatatglgtgtgtgtgcatgagagagagagattgagaatgactgatttgggagg VJ -273 gattttgtgaaggtttalatatcaaagcagaaagaccaaEaatttagagattaata VI -217 catgccaagtggtaaccaagaaaCllctgtgggatcccacctccaacccctccctç VI -161 tctgtcagattttaaccaaatcagtgtgatgtgatctgcttgcatatatgagtgaa Vl -105 agaaaaaggaaatttaaaaagttcttgatataaagcctggaggaaacaatacgaaa VI -49 atccagcctctaUtcagcaatatctgccggactattggtcctacaggtATO VI

-14 2 tggcggcggcggctgclgctgagcccgggcggcggcggggaccccgggctggggcc V2 -86 acgcgggcggaccgggcaccattggccccagcgcagacggaacccgcgctctctga V2 -30 tcagaggcgaagctcggaggUxJ ca^ptATO V2

-151 gcctgtctglttgtgccgccai>gagacctlggadggg;:cagaga;>agagctggggt V3 -95 tttgccalgttBcccaggctgatctccaac'icclgggatcaagcagtctgcccacc V3 -39 tf ggcclcccaaagtgctgaaatt:icai>gtçetj>rag£tAiIG - V3

->5î ggggaatgaglagcaaagatggiil taagtgagaagngtataggaggcagcagggcc V4 -97 agaggLgtgaatagcccagaaccUctgagaagaUcctltgtggacggaagaaag V4 -41 gggaggUtgtggaaatggtggaagataaggtcctaeaggtATG V4

-416 tagttcctgtcagctaaggcccalgctttctgatactgctgataaggttttctatt V5 -360 lecagat caaattaaagcmiacct tact ggccctgt tac tgaagctgtgcai'gggg У S -304 gtcgtLlgcLgtgagglglttctatggclttgagccagggtatgaacatctctagt V5 —248 gtlcatgttattlcclgagactagcacLcacgggaagtagaatttattacaacctB V5 -192 ctgtItgagltcaLgaagagtaggacaatalgagaclctggggcagtgaaagactt VJ .-136 accaggaLIccttctggaactgacLcgtcagctcat tcalgtcttacccagtcttt V5 -80 aaacagtatttcatgataatggtctgcLlUaattgctgggctttaccttaccctt V5

-24 tttgtgaLtgcagriççlasagiUJVffi . , .. V5

-161 ggcccggaaccacaaggtcagcatcalcagatgggggcgBalaccggggaagatcg V6 -105 aaga¡'aa¡;cctgtgctctcagt.gcacaggttggcaaaggclccgactgccaggact V6 -49 ccatggKKKtRRaaKccc:Kcaat.ctaKttccaga(,'p|ígt!l:cctacaggtATC V6

-119 cctctlxtcagctgatttggctgcctccattgtaalaggcctcalgagactccagc V7 -63 ctaggrctggccttcagttcaRcagcagagcccagagatgtactgggcaaaggice V7 -7 tacagg.tATS L V7

4» caaigalaLta|iciatRacancacKtatcHKccti;cgptcciacaggtATO vs

Рис.9. Нуклеотидная последовательность восьми вариантов 5'-НТО рецептора ГР из "печени человека - V1-V8. ИшиГинруыций АТО-код коооражЬн заглавными буксами, обаая для Ъсех . вариант последовательноегь подчеркнута. . . * _

Если допустить, что эффективность синтеза кднк на матрица* азных вариантов мРНК, скорость деградации мРНК в процессе ыделения, эффективность пришивки адапторного олигоиуклеотида в роцессе лигирования, амплификации полученных кднк в ходе ГШР и лонирования продуктов ГШР для разных вариантов примерно одинаковы, 1

0 соотношение клонов в таблице 11 отражает соотношение различных ори мРНК рецептора ГР. отличающихся структурой 5'-нетранслируемой Власти, в исходной популяции полн(А)-РНК. Если эти допущения ерны, то соотношение разных форм иРИК в печени человека выглядит ледуюаим образом - VI:V2:VJ:V4: V5:V6:V7:V8 » 85:50:20:17:7:2: 1:1.

.-320 .-310 .-300 .-290 .-280 .-270 ГАОАТАТОТСТОТОТОТССАТОЛОЛОЛСЛОАОЛТТОЛСAATCACTGATTTCGCAOGGATT hV 1

.—260 .-250 .-240 .-230 .-220 .-210

rTGTOAAGGTTTATATATCAAAOCAGAAAOACCAAGAATTTAOAGATTAATACATGCCAA hVl

.-200 .-190 .-180 .-170 .-160

jTGGTAACCAAGAAAC-TTCTGTGGGATCCCACCTCCAACCCCTCCCTCTCTGTCAGATT hVl

0 aaaccttcaccat-attcctcctccaacccckcactgtrrgccaactc bov

c¿ttcaccÁt-attcctcxtccaaccccacacagtttgc¿aaatc ov

.-ISO .-14» .-130 .-izo .-110 .-100

ТТАОТАТААТОТТАТСТООГГОСАТАТЛТаОСГ-ААОТСААААОААААТТО rab

rTAACCAAATCAGTCTGATGTOATtrrcCTTCCATATÁTa^GTGAA^ hVl

П'ААССАААТГАССАТАОТССООТСГОСГПХГАТАСЛТОАСТОААТОААТААСОААОТТТ 1K)V

r^AACCAAATTAGCATAGTGCOTTCTGCTTCCATtiCATGACTGAATGAATAAGGAAA'rTT OV

.-90 .-80 .-70 . -60 .-50 .-40

1 АОАОПТСГГОЛТАСА A AGCCTCÛ AGGGAGCTACAOGrrCA A A A ATCCA ACTTCTATA T га Ь

VAAAAGTTCnTGATATAAAGCCTCCAOGAAAC-A-A——ТАСОААААТССАСССТСТГЛТТТ hVl kOAC-GTCCTTGCCATAAAGCCTGGAGGAA-CCA----TACGAAAATCCAGCCrCTGTTT bov UAC-OTCCTTGCCATAAAOCCTGCAGGAAACCA----TACGAAAATCCAGCCTCTGTTT ov

.-30 .-20 .-10 .+1

AGGAACATCTGCTGGACTATTGGTCCTACACGTATC rab

AGCAATATCTGCCXJGACTATTGGTCCTACACGTATG hVl

AGGAGTGTCTGCTGGACTCTTGGTCCTACAGGTATG bov

AGGArrOTCTGCCGGACTATTGGTCCTACAGGTATG . OV

1С.10. Выравнивание 5'-нетранслнруеиых нуклеотилных последовательностей клик рецептора ГР: варианта VI человека - 11У1, кролика - гаЬ.. быки - Ьоу и овцы - оу, нумерация дана по последовательности кднк человека.

Помше нуклеотидные последовательности самых длинных вставок, относящихся к различным вариантам, представлены на рис.9. Сравнение длин вставок в разных клонах, относящихся к вариантам VI-У4, Показало, что значительная доля клонов содержит вставки, равные яли близкие по длине к максимальным величинам, приведенным в таблице I. Известно,' что 5'-некодирующне последовательности мРНК позвоночиы как правило имеет длину от 20 до юо нуклеотидов. В случае вариантов мРНК рецептора ГР из печени человека \2-V4 эта длина составляет не менее 140 - 150 нуклеотидов, а для вариантов VI н У5 - более 300 и более 400 нуклеотидов соответственно.

Мы провели сравнение иуклеотидных последовательностей обнаруженных нами вариантов с опубликованными последовательностями 5'-нетранслируемых участков кднк рецептора ГР различных видов. Оказалось. что вариант VI высокогомологичен опубликованным нуклеотндным последовательностям 5'-нетранслируеиых участков КДНК рецептора ГР кролика, быка и овцы. Выравнивание этих последовательностей приведено на рис.10. Уровень гомологии между последовательностью VI и кднк рецептора ГР кролика составляет 76,1* (102 совпадающих остатка из 134), а между VI и кдНК рецептора ГР быка (овиы) - 75,7% (143 совпадающих остатка из 189).

Клонированный нами варнант У2 совпадает с единственной ранее опубликованной последовательность» 5•-нетранслируемого участка КАНК рецептора ГР из печени человека, но длиннее еч на 99 п.и. Кроме того, зтот варнант высокогомологичен (более 77% гомологии) одной из клонированных ранее форм 5'- нетранслируемои области КДНК СБСГР крысы (ВР2) и выявленной нами кднк рецептора ГР из печени крысы типа и (гТ2).

Меньшая степень гомологии обнаружена при сравнении варианта V? с 5•-нетранслируемои областью первого варианта хднк СБСГР крысы, клик рецептора ГР крысы типа 1 и единственной известной последовательность» кднк рецептор-' ГР мыши. Уровень гомологии в этом слу^е составляет около 50*. Сходство иуклеотидных последовательностей ..остаточио выс ко в участке, непосредственно прилегающем к точке дивергенции ■ (7«» гомологии, 13 совпадающих нуклеотидов из 17) а затем оно снижается.

Для остальных пяти вариантов 5'-нетранслируемых •последовательностей кднк рецептора ГР человека, клонированных нами (уз, у4, у5, \(> н ук), аналогов среди опубликованных О последовательностей кднк рецепторов ГР не обнаружено. Нуклеотидная последовательность.варианта У5 оказалась идентичной опубликованной

последовательности масти нитрона гена рецептора ГР человека, предиествуюиего первому каднрупщему окзону, но длиннее ее приблизительно на 370 п.н. таким образом вариант V5 представляет собой, по-видимому, несплансировпниуп или частично сплайсированную форму мРНК рецептора ГР (неисключена н возможность загрязнения препарата, клнк, использованного для амплификации, хромосомной ДНК).

Интересной особенностью предполагаемых 5"-нетранслнруемых последовательностей клик рецептора ГР из печен« человека является

Таблица II. Вышележащие лто-кодопы в различных вариантах кднк рецептора ГР из печени человека.

Вариант Положение ОРС Длина I

кАЖ рецеп- по отношение ОРС Контекст I

тора ГР Номер * первому (амино- нухлеогидной 1

из печени ОРС нуклеотмду кислот - последователь- 1

человека основного них ос- ноети [

ATG-кодона татков)

ORF 1 -324 - -309 5 ТлСЛТАШ

ORF г -308 - -393 5 TGTGCMSA

V 1 ORF 3 -138 - -264 8 TGAGA&ISA

ORF 4 -216 - -135 27 длтледце

0RF 5 -114 - -75 13 СШ1Ы£С

v г — ... — ...

V 3 ORF 1 -« - +гз 37 ттессыет

tf 4 ORF 1 -И8 - +48 65 GGGGMIGA

0RF 2 -26 - +23 16 TGGAAÜXSG

ORF 1 -394 - -274 40 GGCCCfilSC

0RF г -310 - -274 12 TGTGCAI5G

ORF 3 -281 - -233 16 TTTCTMSG

V 5 0RF 4 -263 - -233 10- AGGGTjffiA

0RF 5 -244 - -211 12 TG11CA1ST

0RF б -180 - -152 6 AGTTCM5A

0RF 7 -153 - -65 32 ACAAT¿I5A

саг а -93 - -50 16 CATTCMflT

V б ORF 1 -131 - +23 51 ATCAGjJKG

oRf г -47 - +23 23 ACTCCMfiG

V 7 ORF 1 -76 - +48 42 gcctcatca

ORF г -25 - +23 16 CAGAGálSA

V 8 ORF 1 -45 - +48 31 ...CAñlfiA '

наличие во всех из'них, кроме варианта V2, выиележашнх АТО-кодонов, Э что нетипично для большинства mFHK, за исключением мРНХ Протоонкогенов. Результаты проведенного анализа вьдоележашх ATO во всех хлотшованных нами вариантах клик рецептора ГР из печени

человека суммированы в таблице II. Как видно из таблицы II, наиболее богаты вышележащими ATG-кодонами варианты VI и VJ. в отношении варианта V5, содержащего 8 коротких открытых рамок считывания (ОРС), прерывающихся до ATG-кодона основной рамки считывания. это неудивительно, так как V5 содержит последовательность интрона. Вариант vi, содержащий 5 коротких ОРС в 5'-нетранслируемой области, скорее всего соответствует зрелой мРНК, наиболее богато представленной в печени человека, овцы н быка, в вариантах V3 и V8 выявлено по одному, а в сариантах V4, V6 и V8 по два вышележащих АТС. Соответствующие этим АТС ОРС в отличие от всех пяти ОРС варианта VI не прерываются перед началом основной ОРС рецептора гр, а частично перекрываются с ней (на 7 или 16 аминокислотных остатков), из таблицы II видно, что вышележащие ATO, обнаруженные во всех вариантах КДНК рецептора ГР из печени человека находятся в неблагоприятном контексте. Также как и в случае вышележащих ATG других Гейов, ни одна из последовательностей, приведенных а таблице П не укладывается в консенсус ccpuccatcg, выведенный Kozak (1987) для сильных сайтов инициации трансляции мРНК позвоночных. Вариант V2, не имеющий вышележащих atg; имеет gc-состав превышающий 76%. Эти особенности 5•-нетранслируемых участках вариантов кднк рецептора ГР допускают возможность регуляции экспрессии рецептора ГР не только на уровне транскрипции и процессинга РНК, но и на уровне инициации трансляции.

В связи с возможностью тонкой регуляции экспрессии рецептора ГР человека, представлялось интересным показать ее позарнантную тканеспецнфнчность. С атон цель« ш проводили амплификацию с помощью ПНР с использованием двух вариантоспеиифичных олигонуклеотидов. В каждой серии экспериментов проводили тестирование двухцепочечной кднк из 7 различных тканей человека на присутствие последовательностей одного из вариантов. Один нз олигонуклеотидов перед использованием в ПЦР метился с помощью 3-Р. После определенного количества циклов из каждой соответствующей определенной ткани пробирки отбиралась часть реакционной смеси, затем ПНР продолжали до следующей стадии отбора. На рис.11 изображена радиоавтограмма продуктов такого анализа для варианта vi. видно, что продукт амплификации ожидаемой длины практически отсутствует в случае кдНК, полученной из мозга. Аналогичные .чкепермченты с вариантами ¡< vj также свидетельствуют в пользу ткансспецифнчногти уровня экспрессии соответсвуюиих изоформ мРНК.

для получения предварительных данных о строении 5'-области

Lívtr Olig. OlPancraaaPtacantalhymua Qram Spltan Italia

Рис.11. Электрофоретическни анализ продуктов ПЦР с использованием в качестве праййеров общего для всех вариантов олигопуклеотида III в паре со специфичным к последовательности варианта VI олигонуклеотн-дом. Продукты амплификации на матрице кднк из каждой ткани занимают по-4 дорожки. Количество циклов ПUP идентично для соотвествующих дорожек каждой из тканей и возрастает по каждой ткани с увеличением номера дорожки.

хромосомного гена рецептора ГР. человека нами был проведен анализ по Саузерну геномной ДНК. После переноса и фиксации фрагментов ДНК, мембрану использовали для гибридизации и, последующих регибридизаций с варнантоспецифичными зондами.

На рис.12 изображены радиоавтографы фильтра.после гибридизации _ , i с зондами, специфичными к вариантам: vi (рис.i2А) и V2 (рис.12В). в

случае У2-зонда, несмотря на очень жесткие условия отмывки фильтра

после гибридизации, так и не удалось добиться, достаточной

специфичности (рис.12В), что неудивительно, .учитывая что 5'-НТО

этого варианта сильно обогашена GC-парами (более 77%),

На основе полученных результатов можно сделать следующие выводы:

I. Ген рецептора ГР человека, по-видимому, представлен единственной копией, на гаплоидный геном. По крайней мере нет фактов, указывающих." на _ суяес-вование дополнительных копий этого гена, наличие двух полос в л рожке с Ваши!-переваром (см. рнс.12А) объясняется присутствием в следователыюсти варианта V2 сайта для

этой рестриктаэы {положение -186 - -181; си. рис.»). При более длительной экспозиции в случае всех переваров выявлялись дополнительные полосы, совпадающие с УЗ-специфичными (данные не показаны). Это объясняется тем, что вариант уз содержит 3'-конец последнего некодмрушаего интроиа, а в состав зондов входит участок кдНК. соответствующий началу первого кодирующего окзона.

2. 5•-нетранслируемые последовательности вариантов VI н VI, по-видимому, кодируются последовательностями ДНК, непрерываемыми нитронами, эти вариантоспецифичные экзоны и первый кодируший экзон разделены в геномной последопательностн достаточно протяженными интроиамп. т.к. ни одни рестркктный фрагмент не содержит последовательность более чем одного варианта кдНК рецептора ГР человека.

3. лмплнфикаиня м кмшнраиаимс кодирую««* участков клНК рецепторов ГР м пролакт»«» м >*нсу\мнопол<»(шоп> фактора роста I крысы. Наряду с клонированием « исследование« 5•-нетранелнруеиих

последовательностей рецептора ГР из печен» к человека, мы

поставили перед со&ой задачу получения кодарувшЛ области КДНК

рецептора ГР крысы для дальнейшего использования в работах, направленных на синтез полноризмерного рецептора и различных его фрагментов с использованием методов генетической инженерии.

для решения этой задачи мы использовали подход, основанный на предварительной амплификации нужного фрагмента кдНК с помощью ПЦР. Аналогичный прием был использован для получения кодирующей области кдНК рецептора пролактмна - белка по своей структуре и функциям родственного рецептору ГР н писулнноподобного фактора роста I, который синтезируется в ответ на действие ГР и является посредником некоторых функций ГР.

1

27 491 23 130

4 361

На рис.и изображен результат бл»т-г1<.бр'.Ш1заи\1С1Шого анализа продуктов амплнфпкашш кодирующей области кДПК рецептора ГР из печени крысы. В качестве зонда использовался меченный олнгонуклеотид, комплементарный внутреннему по отношении к ам-плнфикационным праймерам участку ХАНК рецептора ГР. Как видно из рис.15 результат гибридизации подтверждает вывод о том, что единственная визуально наблюдаемая при окраске.бромистым этилием полоса соответствует ожидаемому продукту амплификации кодирующего участка КДНК рецептора ГР из печени крысы.

фрагменты ДНК, соответствующие ожидаемому продукту по размеру (1917 пар нухлеотидов), клонировали. шесть иэ полученных клонов использовали для определения первичной стуктуры вставки методом Сэнгера с применением универсального праймера. секвенирование показало, что все вставки находятся в одной ориентации, а именно - з'-частью кодирующей области КЛНК к последовательности вектора, комплементарной универсальному пранмеру.

Вставки из двух клонов исследовали более подробно (плазииды рОИШ и ран|?2б). Рестрнкштиная карта вставки в плазмиде р0НЯ26 для рестриктаз Н1Пс1Ш, ВншШ , Крп1, Вц1П и Ысо! точно

2 322 2 027

Рис,13. Блот-гибридизационннй анализ продуктов ПЦР, проведенной для амплификации кодирующей области кднк рецептора f'P из печени 'крысы. В дорожку 1 наносили Hindi П-переваЬ ДНК фага лямбда.

соответствовала картам клонированных ранее кднк рецептора гр крысы. Вставка в плазмиде pGHR24 не содержала сайта рестриктазы крпГ в участке, кодирующем цитоплаэматнческий домен рецептора. Для определения полных нуклеотндных последовательностей вставок из плазмид pGHR24 и pGHR26 были получены плазмиды, содержание субфрагменты кднк, а также сконструированы производные плазмид.с делениями участков, кодирующих N- и С-концевую области рецептора ГР, различной протяженности. В установленной нуклеотидной последовательности вставки из плазмиды pGHR26 длиной 1917 п.н. обнаружены 3 точечные замены (А на G в положении 616, G на А в положении 1113 к С на Т в положении 1194) по сравнению с первичной структурой кднк рецептора ГР крысы, опубликованной ранее: Замены в положениях U13 и 1194 приходятся на третье положение кодонов и являются 'иолчатшн'. Замена в положении 61 б приводит к замене Thr (кодон A CG) на Ala (кодон CCG) в положении 206 полнпептндной tu-rni рецептора ГР (табл.111), в. нуклеотидной последовательности вставки из плазмиды pGHR24 имеются 2 замены,- Т на С в положении 887 и G на А 12 22. Обе замены нуклеотидов приводят к замене аминокислот - Met на Thr в 296 и Cly на Ser в 4»s положении полипептидной цепи.

Таблица III. отличия последовательностей транслируемых областей различных вариантов КДНК рецептора ГР из печени крысы.

Номер нуклеогида Номер кодона Вариант кДНК

Опубликован. ранее pGHR24 pGHR26

616 206 ACG (Thr) ACG (Thr) £CG (Ala)

887 296 ATG (Met) ACG (Ihr) ATG (Met)

1113 371 CAG (Gin) CAG (Gin) CAS (Gin)

1194 39S ЛСС (Thr) ACC (Thr) ACI (Thr)

пгг <03 GGT (Glу) m (Ssr) GGT (Gly)

Выявленные нами замены аминокислот являются нейтральными и расположены вне пределов наиболее консервативных участков полнпептндной цепи, которые. как предполагают, важны для функционирования рецептора. Более то.го, несовпадение замен нуклеотидов в плазмндах pGHR24 и pGHR26 позволяет реконструировать нз них 'ген', кодирующий функционально активный рецептор. Нельзя исключить, что замены нуклеотидов а клонированных нами продуктах амплификации клнк рецептора ГР являются следствием неправильного включения нуклеотидов в холе ПЦР. Их частота (приблизительно 1

замена на 750 пар нуклеотидов) не превышает средних значений для ПЦР, проводимой в стандартных условиях, однако необходимо отметить, что Leung и соавторы (1987), изучая первичною структуру клонированных традиционными методам» участков кМ!К рецептора ГР из печени человека и кролика, также обнаружили несколько различий типа иуклеотидных замен, среди которых обнаружено две изменяющих смысл колона (одна d кодирующей области КДНК рецептора ГР человека и одна - кролйка).

Целью следующего этапа работы являлась амплификация и клонирование кодирующего участка КЛНК рецептора пролактина из печени крысы, этот белок имеет высокую степень гомологии с рецептором ГР в области внеклеточного гормонсвязивающего и трансмембранного доменов. Гены, кодирующие последовательности этих двух рецепторов, по-виднмоиу, эволюционировали от общего гена-предшественника . Рецептор пролактнна проявляет довольно высокую афинность связывания ГР.

1 2 3 4 5 6 7

Рис.14. Электрофореграмма продуктов ОТ ПЦР на матрице суммарной РНК из печени крысы с использованием праймеров, специфичных к последовательности кодируюшен области рецептора пролактина из печени крысы.

для амплификации фрагмента кдНК, влючающего полнораэмерную транслируемую область, использовали опосредованную обратной транскрипцией пцр (ОТ ПЦР). На рис.14 изображена фотография 0,8% агарозного геля после электрофоретического разделения продуктов ПЦР. 8 дорожки 1 ц 7 наносили маркеры длины - Hindni-перевар ДНК фага лямбда и Hinfl-nepeeap плаэмиды pBR322 соответстоенно, в дорохки 2-6 - продукты амплификации. Причем а одном случае (дорожки 2-4) смесь для реакции обратной транскрипции содержала по 40 пмолей обоих праймеров и 2, 1. <i,> мкг суммарной РНК, тогда как а другом (дорожки 5 и б) - в ревер! .,энум смесь добавляли no 1 мкг суммарной РНК и по 1 пмолю компле ¡янтарного 3'-концу антикоднруюшей цепи

npaíiMcpu, emu no JO nun л с Л пипмирик ашшних npafmpaa добавляли в реакционную сиссь непосредственно перед 1ШР.

как шин!) на рисунки, пыплнфитшя прошла до стадии видимой в данных условиях полоса только при использовании иеОолызого количества необходимого для работы обратной транскриптазы праймера (дорожки 5 и ft). На основании этих дпнных можно сделать вывод, что ревертазную реакцию для ОТ пир лучше проводить в присутствии небольшого количества необходимого для работы обратной транскриптазы олнгонуклеотила, а праймеры для ПЧР добавлять в смесь непосредственно перед амплификацией.

днк окстрагнровали из участков легкоплавкой агарозы, содержащих продукты ожидаемой длины (<Ш пары нуклёотндов), денатурировали, обрабатыполн полинуклеотидкнназон фага T4, фрагментом Клеиова ДНК полнмеразы 1 E.coli и клонировали в плазмилнын вектор риспн по сайту рестрнктазы SraaI. соответствие клонированного фрагмента • желаемому продукту амплификации подтверждали с помощь» определения нуклеотндной последовательности флпнкнруюинх участков пстнпкн методом сонгера.

Одним из наиболее хорошо изученных эффектов соматотропина является стимуляция экспрессии инсулиноподобного фактора роста I, известного также как соматомеднн С, в печени. Зрелый фактор представляет собой пептид, состоящий из 70-тн аминокислотных остатков и запускающий в свою очередь целый каскад биохимических реакций, связанных с пролиферацией и дифференциацией клеток. Имеются также данные о том, го этот полипептид играет важную роль в регуляции репродуктивной системы млекопитающих.

.С целью получения в перспективе штамма-продуцента и дальнейшего использования IGF I для изучения соматотропин-рецепторного взаимодействия нами была произведена амплификация участка клик 1CF I, кодирующего аминокислотную последовательность зрелого полипептида, с помощью ОТ ПЦР. В качестве матрицы, как и в случае амплификации коднруюаей области рецептора пролаклактина, служил;) суммарная РНК из печени крысы.

На рис.15 изображен результат злектрофоретичегкого разделения продуктов ПНР. Как видно из рисунка, а дорожках 2 (ОТ HUP) и i (Параллельно поставленная ПИР с использованием двухцепочечной к ДНК нэ печени крысы в качестве матрицы к тех же самых олигоиуклеотндов в качестве праймеров) имеются полосы приблизительно равной интенсивности, длина которых соответствует длине ожидаемого продукта - ИЗ пар нукхеотнлов.

•<• м

•»/•it u

• II Ч

«о» V»

4

gfi i«li

V ...

•У l»in

© W

рис 15. Электрофореграмуа продуктов ПЦР на матрице суммарной РНК (ОТ ПЦР - дорожка 2) н двухкепочечной клик (дорожка 5) из печенн крысы с использованием праимероо. комплементарных' концам участка, кодирующего зрелый фактор, клик 1СГ I крысы, дорожка 1 - pBR?22-Hinfi гидролпэат, дЛрохкн 4 - рВ1Ш2-л1и1 гндролнэят.

Участки легкоплавкой агарозы. содержащие продукты ожидаемой длины, вырезали из геля: дик экстрагировали, обрабатывали н клонировали как это опнснно в предыдущем разделе. Нуклеотидную последовательность клонированного участка амплифицированной последовательности кднк IGF I определяли методом Сзнгера.

Т. о. нами получении клоны, содержащие кодирующие области рецепторов пролактина и ГР и учнеток IGF 1, кодирующий зрелый фактор, печенн крысы, которые можно использовать для получения штаммов-продуцентов соответствующих белков.

ВЦ ВОДЫ

1. Разработана и успешно применена модификация метода однонаправленной опосредованной Актированием полимеразной цепной реакции.

2. Обнаружено 2 варианта 5*-НТО мРНК рецептора ГР из печени крысы. Определена их первичная структура и проведен сравнительный анализ.

3. обнаружено 8 вариантов 5'-НТО мРНК рецептора ГР человека. Определена их первичная структура и проведен сравнительный анализ. для нуклеотндных последовательностей 5'-КТО трех вариантов найдена гомология с лилерными областями рецепторов ГР других видов млекопитающих (бык, овца, кролик, крыса, мышь). Последовательность варианта идентична последовательности 3'-конца соотвествуюшего нитрона хромосомного гена рецептора ГР человека. Нуклеотилные- последовательности 5'-НТО обнаруженных вариантов кднк РГР человека и крысы обладают рядом особенностей (наличие вышележащих АТС-кодонов, повышенный СС-состав, превышающая 100 нуклеотидов длина лндерной области), допускающих модуляцию экспрессии рецептора ГР на уровне инициации трансляции.

4. Проведена предварительная оценка относительного содержания различных изоформ мРНК рецепторов ГР, отличающихся 5'-НТО, в печени человека и крысы. Обнаружена тканеспецифичность экспрессии некоторых изоформ иРНК рецептора ГР человека.

5. Проведена предварительная характеристика 5'-области хромосомного гена рецептора ГР человека. Ген представлен единственной копией на гаплоидный геном. В 5•-области гена имеются множественные зкзоны, разделенные протяженными нитронами.

6. Клонированы транслируемые участки кднк рецепторов ГР и пролактнна к инсулиноподобного фактора роста I из печени крысы.

Список pafioT, опубликованных по материалам диссертации:

1. Пехлеикий Р.И., Чернов Б.К.,'Ру(шов П.М. "Амплификация с помощью

однонаправленной полимераэной цепной реакции, клонирование и определение первичной структуры 5'-нетранслируемых участков клнк,•кодирующей соматогенный рецептор гормона роста из печени крысы' - Молекулярная биология, 1991, т.25. с.1418-1423.

2. Pekhletsky, • R.1., Chernov, В.К., and Rubtsov, p.m. "The application of the method of ligation-media ted, single-sided polymerase chain reaction for the analysis of heterogeneity of 5'-untranslated regions of specific mRNA" - Materials of international Symposium "Synthetic oligonucleotides: problems and frontiers of practical application", Moscow, 1991, p.164.

3. . Pekhletsky, R.I.. Chernov, B,K., and Rubtsov, P.M. "The

application of the method оГ Iigntion-mediated, single-sided polymerase chain reaction for the analysis of heterogeneity of 5'-untranslated regions of specific mRNA" - Nucleic Acids Res. Synp. Series. 1991, N0.24, p.276

4. Pekhletsky, r.I., Chernov, b.k. , and Rubtsov, p.m. "Variants of

5'-untranslated sequence of human growth hormone receptor mRNA' - Mol. Cell Endocrinol., 1992, in press. 3, Pekhletsky, R.I., Chernov, U.K., and Rubtsov, P.M. "5'-untranslated regions of rat growth hormone receptor cDNA" -EMBL Database Accession number X60198, 1991. 6. Pekhletsky, R.l. and Rubtsov, р.м "Alternative 5'-untranslated regions of human growth hormone receptor cDNA" - embl Database Accession numbers 211ЯЩ, ZII802, Z1I84S-ZI1853, 1992.