Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гормональная регуляция экспрессии гена рецептора гормона роста крысы

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Гормональная регуляция экспрессии гена рецептора гормона роста крысы"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта

Р Г 8 ОД На правах рукописи

2 2 СЕН 1938

Бабасян Сусанна Ашотовна

ГОРМОНАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА РЕЦЕПТОРА ГОРМОНА РОСТА КРЫСЫ

03.00.03 —Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва—1998

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта Российской академии наук.

Научные руководители: Д.б.н., проф. П.М. Рубцов Д.б.н. А.Н. Смирнов

Официальные оппоненты: Д.б.н., проф. В.В. Носиков К.б.н. Н.С. Куприянова

Ведущая организация: Центр "Вионженерия" РАН

Защита состоится: X_1998 г., в У^~часов

На заседании диссертационного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 117984 Москва, ул. Вавилова, д.32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН.

Автореферат разослан ¿Л 1998г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, Кандидат химических наук

А.М.Крицын

Общая характеристика работы

Актуальность работы. Гормон роста является одноцепочечным полипептидным гормоном с молекулярной массой 22кДа и секретируется передней долей гипофиза. ГР действует на метаболизм белков, углеводов и жиров, стимулирует рост и дифференциацию клеток.

Возможными посредниками осуществления биологической активности ГР являются инсулиноподобные факторы роста, вырабатываемые клетками печени в ответ на действие ГР.

Показано и прямое действие ГР на клетки, опосредованное специфическими мембранными белками, обладающими высоким. сродством к ГР. В 1987г Leung и соавторы клонировали кДНК рецептора ГР (РГР) из печени кролика и определили нуклеотиднуто последовательность. Оказалось, что этот белок содержит 638, аминокислот, включая сигнальную последовательность. Зрелый рецептор состоит из внеклеточного гормоносвязывающего, трансмембранного и внутриклеточного участков. В 1989г Godowski и соавторы картировали ген РГР человека и показали, что он представлен единственной копией в геноме и занимает участок размером более 87 т. п. н. Кодирующая часть гена состоит из 9 экзонов. Белковыми продуктами гена являются полноразмерный мембранный рецептор и растворимый белок, содержащий только внеклеточную часть рецептора. Последний обнаруживается в сыворотке и цитозольных фракциях клеток. Основным источником секреции сывороточного белка, связывающего ГР (ВСГР) является печень, в которой этот белок образуется у одних видов путем протеолиза мембранного рецептора, у других - в результате трансляции альтернативно сплайсированной мРНК.

У грызунов ВСГР содержит уникальную гидрофильную С-концевую последовательность, кодируемую отдельным экзоном и транслируется с альтернативно сцлайсированной мРНК РГР.

Рентгеноструктурный анализ комплекса ВСГР с ГР дает основание полагать, что при связывании ГР с рецептором образуется комплекс, состоящий из одной молекулы гормона и двух молекул рецептора. Показано, что часть этого комплекса интернализируется и подвергается деградации, или частичному протеолизу и, либо высвобождается во внеклеточную среду в виде ВСГР, либо переносится в ядро. Образование комплекса ГР с рецептором приводит к активации внутриклеточных тирозинкиназ семейства JAK киназ, протеинкиназы С, протеинкиназ, активируемых митогенами (МАР-киназ), которые участвуют в передаче сигнала ГР. Таким образом, действие ГР на клетки в первую очередь определяется наличием рецепторов на их поверхности и изучение факторов, регулирующих экспрессию РГР представляет особый интерес.

Экспрессия гена РГР в печени является дифференцированным по половому признаку процессом. Известно, что содержание РГР в печени самок выше, чем у самцов (Baxter R. С., Zaltsman Z., 1984). Кроме того, характер экспрессии гена РГР у крысы находится под контролем гипофизарных гормонов, в первую очередь самого ГР. Известной особенностью структуры мРНК РГР у крысы к началу нашей работы

являлась гетерогенность 5'-нетранслируемой области (5'-НТО), что указывало на наличие нескольких промоторов и 5'-нетранслируемых экзонов гена и предполагало возможность регуляции его экспрессии на уровне транскрипции и трансляции.

Цель и задачи исследования. Целью работы было изучение экспрессии альтернативных вариантов мРНК РГР/ВСГР крысы, отличающихся структурой 5'-НТО. Предполагалось выяснить возможную тканеспецифичность их экспрессии, ее зависимость от возраста, пола и физиологического состояния животных. В связи с половой дифференциацией экспрессии гена РГР в печени ставилась также задача сравнить уровень разных форм мРНК в печени самцов и самок крысы, изучить влияние гормонального статуса на содержание разных изоформ мРНК, используя модели гонадэктомированных и гипофизэктомированных животных.

б ходе работы были поставлены и решены следующие задачи:

1) получение плазмид, содержащих промотор РНК полимеразы фага Т7 и фрагменты 5-НТО мРНК РГР для получения антисмысловых РНК-зондов и смысловых РНК для использования их в качестве внутреннего стандарта;

2) отработка метода защиты гибридов РНК-РНК от действия РНКазы для выявления альтернативных форм 5'-НТО мРНК РГР, в том числе количественного варианта метода;

3) сравнительный анализ альтернативных форм мРНК, содержащих разные 5'-НТО, в различных тканях самцов и самок крысы;

4) сравнительный анализ экспрессии альтернативных форм мРНК в печени крысы в зависимости от пола и возраста;

5) сравнительный анализ экспрессии альтернативных форм мРНК в печени гонадэктомированных крыс, гонадэктомированных крыс, обработанных половыми стероидными гормонами, и гипофизэктомированных крыс;

6) изучение влияния трансплантации донорных гипофизов в почечную капсулу самцов крысы на экспрессию гена РГР в печени;

7) выявление изменений уровня альтернативных форм мРНК, кодирующих собственно мембранный рецептор (РГР) и белок, связывающий гормон роста (БСГР) в печени самок крысы на разных стадиях беременности и лактации.

Научная новизна к практическая ценность работы. Впервые детально изучена экспрессия альтернативных форм мРНК РГР крысы, отличающихся структурой 5'-нетранслируемых областей. Впервые показано, что одна из этих форм - мРНК типа I специфична для печени, причем характер её экспрессии носит ярко выраженную зависимость от возраста и пола. В печени самцов её уровень незначителен, в печени половозрелых самок она легко выявляется разными методами (ЫогШегп-гибридизация, ?ащита гибридов РНК-РНК от действия РНКаз), причем её содержание значительно увеличивается при беременности. Полученные результаты позволили объяснить существовавшее в литературе противоречие между практически одинаковым уровнем мРНК РГР в печени самок и самцов и существенными различиями в содержании РГР (гормон-связывающих сайтов) на поверхности гепатоцитов самок и самцов.

Получено дополнительное подтверждение существования альтернативных промоторов гена РГР крысы и предложена гипотеза, согласно которой более высокое содержание РГР в печени самок, а также дальнейшее повышение содержания РГР и особенно БСГР у беременных самок связано с существованием особой формы мРНК, отличающейся структурой 5-нетранслируемой области и предположительно имеющей более высокую трансляционную активность.

Изучено влияние половых стероидных гормонов и гормона роста на характер экспрессии альтернативных форм мРНК РГР в печени крысы. Впервые показано, что трансплантация донорных гипофизов в почечную капсулу самцов крысы, которая выводит гипофиз из-под контроля гипоталамических факторов и вызывает изменения паттерна секреции ГР - снижение амплитуда пиков секреции и повышение базального уровня ГР, индуцирует экспрессию в печени самцов мРНК РГР с 5'-нетранслируемой последовательности типа I. Этот факт указывает на участие ГР в регуляции активности альтернативного, специфичного для печени самок промотора гена РГР крысы и открывает перспективы выяснения механизмов этой регуляции. Выяснение механизмов полоспецифической регуляции экспрессии гена РГР и участия в ней ГР имеет важное практическое значение в связи с важной ролью ГР в половой дифференцировке функций печени.

Особую практическую значимость такие исследования имеют в связи с разной половой предрасположенностью к развитию ряда широко распространенных заболеваний, связанных с биохимическими изменениями функций печени (атеросклероз, желчнокаменная болезнь и

др.).

Апробация диссертации. Материалы диссертации ' были представлены на XI Российско-французском симпозиуме "Организация и экспрессия генома эукариот и прокариот*, Конкарно, Франция, 1992.; конференции, посвященной 80-летию академика АМН Н.А.Юдаева, Москва, 1993 год; III Европейском эндокринологическом конгрессе, Амстердам, Нидерланды, 1994.; Международном симпозиуме "Молекулярная биология на рубеже XXI века", Москва-Углич, 1994.-, 10-м Международном эндокринологическом конгрессе, Сан-Франциско, США, 1996.; 2-м съезде Биохимического общества РАН, Москва, 1997 г.5-й конференции "Геном человека -96", Черноголовка, 1996.год; Конкурсе научных работ Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН, 1994.; семинарах лаборатории эндокринологии биологического факультета МГУ и лаборатории гормонов и рецепторов Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН.

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в б печатных работах.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Она изложена на 87 страницах и содержит 18 рисунков.

Основное содержание работы.

1. Клонирование фрагментов 5'-НТО кДНК РГР крысы под контроль промотора РНК полимеразы фага Т7 и получение радиоактивных зондов.

К началу нашей работы были клонированы и секвенированы два варианта 5-НТО РГР крысы. Один из них (вариант II) был впервые описан в работе Mathews и соавторов (1989), которые клонировали полноразмерную кДНК мембранной формы РГР. Baumbach и соавторы (1989), наряду с вариантом II, выявили альтернативную 5'-НТО в составе кДНК кодирующей БСГР. Позднее Пехлецким в нашей лаборатории с помощью опосредованной лигированием однонаправленной ПЦР (вариант 5-RACE) были амплифицированы и клонированы оба типа 5'-НТО (Пехлецкий и другие, 1991). Исходным материалом для амплификации в этой работе служила РНК из печени самца крысы. Анализ клонотеки продуктов ПЦР показал, что на один клон, содержащий 5-НТО типа I, приходится 17 клонов с 5'-НТО типа II, что могло указывать на различный уровень экспрессии мРНК РГР/БСГР с разными 5-НТО. На рис. 1 представлены эти последовательности (Пехлецкий и др., 1991). Как видно из рис. 1, последовательности 5'-НТО различаются, начиная с положения -12 относительно иницирующего кодона и представляют собой альтернативные 5'-нетранслируемые экзоны гена РГР крысы, соединенные в этом положении с первым кодирующим экзоном.

190 -180 -170 -160 -160

GAATTCCGGA GAGACCACAA GATAGAGGAT TATTAATTTA TGGGGATTTT TG GCGGTCTAGG GAGCGGCGGC ACTGGCAGAA GCGGCTGTTA CAGCGGCGGT

-140 -130 -120 -110 -100

TTGGAGATTT ATATACCCAA GCAACAACTC CTAGATGCTA CAGACCAAGA GGCGGCGACG GCTGTTGCTG AGCCCCGGCA GCCGCGAGGA CCCCGGGCTG

-90 -80 -70 -60-60

CACCAAGAAA TAACCACGAA ATTCTACTTT CAACCCTAGC ТТСТСТАССА GGCCACGCGG CTGAGGCCTC GGCTCCAGCA GCCCCCAAGC GNGACGAACC

-40 -30 -20 -10 .1 GATTTTAACT AAACAAGATC TTCTTGCAA д GGTCTCAGGT ATGGATCTTT CGCGCTCTGT CTCCCAAGGC GAAGCTCCG

»11 -21 ->31 »41 »51

(II) GGCGGGTGTT CTTAACCCTG GCACTGGCAG CTCCAGCGA CATGTTTCCT

»61 »71 »81 »S1

(II) GGAAGTGGGG CTACACCAGC TACTCTTGGC AAAGCT

Рис. 1. Нуклеотидные последовательности двух вариантов 5'-НТО кДНК РГР крысы (Пехлецкий и др., 1991).

В качестве основного метода исследования экспрессии мРНК РГР крысы мы выбрали метод РНКазного картирования, который достаточно чувствителен и может быть использован для количественного анализа РНК.

Для того, чтобы получить зонды, специфичные к нуклеотидным последовательностям двух типов 5-НТО РГР крысы, мы переклонировали фрагменты 5'-НТО типа I и II из плазмид pUC118 и pUC19, соответственно, в плазмиду pGEMl, содержащую промоторы РНК полимераз фагов Т7 и SP6. Полученные рекомбинаятные плазмиды расщепляли рестриктазой Hind III, сайт которой фланкирует вставку с 5'-конца, и линейные матрицы использовали для синтеза РНК-зондов в системе in vitro транскрипции в присутствии [а-32Р] rUTP и РНК полимеразы фага Т7. Схемы матриц для транскрипции in vitro показаны на рис. 2, где приведены также размеры получаемых антисмысловых РНК-зондов и их фрагментов, защищаемых мРНК РГР с различными типами 5'-НТО от расщепления РНКазами.

Т7

В

Т7

16г

-98

-12

Р

+96

=f

-192

-12

+60

Probe (238) Probe (303)

■4-» 4-

I (194) II (252)

II (108)

I (72)

Рис. 2. Схематическое изображение матриц для транскрипции in vitro, синтезируемых антисмысловых РНК (probe) типа I (А) и II (В) и фрагментов, защищаемых мРНК типа I и типа II от расщепления РНКазой. В скобках указаны размеры фрагментов РНК в нуклеотидах.

После проведения транскрипции in vitro высокомеченые РНК-зонды выделяли из 5% ПААГ, смешивали с аликвотами суммарной РНК из разных тканей и гибридизовали в течение ночи при 45°С в смеси, содержащей 80% формамида. После расщепления РНК смесью РНКаз А и Т1 продукты анализировали в 5% денатурирующем ПААГ с последующей радноавтографией. Так как РНК-зонды содержат участок первого кодирующего экзона, общий для двух типов мРНК, на радиоавтографах должны быть видны две основные полосы: одна из них соответствует фрагменту зонда, защищаемому от расщепления РНКазами мРНК данного типа, а другая, более короткая полоса - участку зонда, защищаемого природной мРНК альтернативного типа.

2 Экспрессия двух типов мРНК в разных тканях самцов и самок крысы.

Используя метод защиты от РНКазы, мы сравнили уровень мРНК РГР с 5-НТО типа I и II в разных тканях взрослых самцов и самок крысы. мРНК типа И выявлялась почти во всех исследованных тканях. В частности, у самцов транркрипты с 5'-НТО типа II обнаруживаются в печени почках, мышцах, сердце, легких. Очень низкий их уровень выявлен в головном мозге и семенниках. На рис. 3 представлен радиоавтограф, демонстрирующий результаты одного из таких опытов.

А В

Р С 1 2 3 4 5 6 М 1 2 3 4 5 6 С Р

Рис. 3. Результаты эксперимента по защите от действия РНКазы антисмысловых РНК-зондов типа I (В) и II (А) препаратами РНК из различных тканей самца крысы. Р -необработанный РНКазой зонд; С - обработанный РНКазой зонд; М - маркеры длины; РНК из легких (1), сердца (2), головного мозга (3), мышц (4), почек (5) и печени (б), соответственно. Цифрами справа и слева указаны размеры РНК-зонда и защищенного фрагмента зонда.

У самок мРНК с 5-НТО типа II присутствует в печени, почках, жировой ткани, матке, надпочечниках, яичниках, слюнных железах.

У самцов содержание мРНК РГР с 5'-НТО типа II так же, как и суммарной мРНК РГР (Mathews et. al, 1989) наиболее высоко в печени, у самок высоким уровень этой формы мРНК характерен также для жировой ткани. Сравнение интенсивности полос, соответствующих защищенным фрагментам РНК-зонда типа II препаратами РНК позволило оценить относительное содержание мРНК с 5-НТО II типа в разных тканях. Эти данные представлены на рис. 4.

Самки

143,0%

100,0%

79,0%

46,6%

54,0%

30,8%

17,6%

3 4 10 11 12

100,0%

Самцы

79,8%

59,7%

47 4% 49,8%

47,4 Л 42,1%

25,3%

14,8% 17.2% 14,2%

1 2 3 4 5 6 7

9 10

Рис. 4. Относительное содержание мРНК РГР с 5'-НТО типа II в разных тканях самок и самцов крысы: печень (1), жировая ткань (2), почки (3), надпочечники (4), мышцы (5), сердце (6), мозг (7), легкие (8), предстательная железа (9), слюнная железа (10), матка (11), яичники (12). За 100% принято содержание таких мРНК в печени.

Экспрессия мРНК РГР с 5'-НТО типа I была обнаружена сначала только в печени самок (рис. 5). В других исследованных тканях как самок, так и самцов её выявить не удалось.

А В

РСМ1234 С Р М 1 2 3 4

303252-

72-

-238 -194

-108

Рис. 5. Результаты эксперимента по защите от действия РНКаз антисмысловых РНК-зондов типа I (А) и II (В) препаратами РНК из печени самцов (1), интактных самок (2) и беременных самок (3). Р -необработанный РНКазой зонд, С - обработанный РНКазой зонд, М -маркеры длины. Цифрами справа и слева указаны размеры РНК-зонда и защищенных фрагментов зонда.

Таким образом, результаты этой части работы показали, что экспрессия мРНК РГР с 5-НТО типа II носит практически повсеместный характер, тогда как варианты мРНК РГР с 5'-НТО типа I специфичны для печени самок. В связи с этим мы провели более подробное исследование экспрессии этой формы мРНК в печени крысы.

3 Зависящая от пола экспрессия мРНК РГР типа I в печени крысы.

Как отмечалось в предыдущей главе, мРНК с 5-НТО типа I была выявлена только в печени самок (рис. 5). Однако более длительная экспозиция гелей позволила обнаружить слабый сигнал в препаратах РНК из печени самцов (рис. 6).

Сравнение интенсивности полос на радиоавтографе показало, что уровень мРНК с 5'-НТО типа II при этом у самок и самцов примерно одинаков. При беременности содержание мРНК типа II лишь слегка увеличивается, а типа I значительно возрастает (рис. б).

i 2 Э 4 S 6t tt G P

Î94-

108-

Рис. б. Результаты эксперимента по защите от действия РНКаз РНК-зонда типа I препаратами РНК из различных тканей самца крысы (обозначения, как на рис. 3).

16г

i

17

В

г Ч

Т7

Probe (238)

Probe (303)

II (108)

I (72)

I (194)

С (228)

С RNA (239)

II (252)

С (275)

С RNA (286)

T7

T7

27 г-

-98

27 I

-12

+96

-192

Î

-12

+60

Рис. 7. Схематическое изображение матриц для транскрипции in vitro, синтезируемых антисмысловых РНК-зондов (probe) и контрольных РНК (cRNA) типа 1(A) и Н(В) и фрагментов, защищаемых мРНК типа 1(1), типа 11(11) и контрольной РНК (С) от расщепления

РНКазами. В скобках указаны размеры фрагментов РНК в нуклеотидах.

Для более точной оценки уровней двух типов мРНК РГР в печени самцов, самок и беременных самок мы применили количественный вариант метода защиты от РНКаз. В качестве внутренних стандартов были использованы синтезированные in vitro смысловые РНК, соответствующие 5'-НТО мРНК РГР типа I или И, названные нами контрольными РНК. Контрольные РНК содержат наряду с участками, соответствующими природным РНК РГР, еще и участки, транскрибируемые с последовательностей вектора, фланкирующих вставки, поэтому фрагменты зондов, защищаемые от расщепления РНКазами контрольными и природными РНК, несколько различаются по длине, что позволяет разделить их с помощью электрофореза. На рис. 7 схематически представлена структура контрольных РНК -типа I и И, фрагментов РНК-зондов, защищаемых рт расщепления РНКазами контрольной и природной РНК.

Известное количество-контрольных РНК (0.1, 0.5, 1.0. 5.0 и 10.0 пкг) типа I или II-смешивали с аликвотами РНК из печени и гибридизовали с соответствующим меченым [a-33P]UTP РНК-зондом при 45°С в 80% формамиде. Затем смесь обрабатывали РНКазами А и Т1 и продукты расщепления анализировали в 5 % денатурирующем ПААГ. Плотность полос на радиоавтографах (рис. 9), соответствующих контрольным и природным мРНК, измеряли, используя Computing Densitometer (Molecular Dynamics). Полученные данные нормализовали в соответствии с количеством остатков уридина в защищенных фрагментах РНК. Исходя из цифр, полученных для контрольных РНК, рассчитывали уровень двух типов РНК РГР в печени самок, самцов и беременных самок.

ABC

РНК из печени, мкг кокгрольная РНК, пкг

-238 Р -228 С

-1941

-108 II

20 20 20 10 10 10 10 10 5 5 5 5 5 PI М 0.1 0.5 1.0 0.1 0.5 1.0 5.0 10 0.1 0.5 1.0 5.0 10

ABC

10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 РНК из печени, MKT pu ц 0.51.a 5.a w ол ол o¿. 1Л s.aio ол t.a 5.a ta коигролыия-рнк, пкг

-303 P

-275 С -252 ti

-721

Рис. 8. Количественный анализ мРНК РГР с 5'-НТО типа I и II в печени самцов (А), самок (В) и беременных (С) самок. PI, PII - РНК-зонды, не обработанные РНКазой, M - маркеры длины, С, I и II -фрагменты РНК-зонда, защищенные от действия РНКаз контрольной (С) и природными мРНК типа I (I) и II (II). Цифры справа указывают размер фрагментов РНК в нуклеотидах.

Из проведенных расчетов следует, что содержание мРНК РГР типа I составляет в печени самца, самки и беременной самки менее 0.1, около 1.0, и 8.0, а мРНК типа II - примерно 6.5, 5.5 и 7.0 аттомолей на 1 мкг суммарной РНК, соответственно. Суммарное количество двух вариантов мРНК РГР в печени самца и нормальной самки по нашим данным примерно одинаково - 6.5 аттомолей/мкг РНК. Эти значения близки к приведенным в работе Mathews и соавторов (Mathews et. al, 1989) данным о содержании суммарной мРНК РГР в печени самки, самца и беременной самки, основанным на результатах гибридизации с зондом, специфичным к кодирующей области мРНК РГР. Полученные нами данные о значительно более высоком содержании мРНК типа I в печени самок по сравнению с печенью самцов на фоне примерно одинакового содержания суммарной мРНК РГР позволяет объяснить существовавшее в литературе противоречие. Было известно, что уровень РГР и БСГР в печени самцов ниже по сравнению с самками (Herrington et al., 1976; Maes et al., 1983; Sadeghi et al., 1990). В то же время результаты ряда работ показали, что содержание мРНК РГР в печени самок.лишь немного выше (Baufflbaeh-etal.,

1989; Mathews et al., 1989; Tiong and Herrington, 1991; Carmignac et al., 1993) или такое же (Carlsson et al., 1990), как в печени самцов. Можно предположить, что специфичные для печени самки варианты мРНК с 5'-НТО типа I обладают более высокой трансляционной активностью, чем мРНК с 5-НТО типа II. Для последней характерно высокое содержание G и С (75%) и, как показали более поздние исследования, наличие очень консервативной короткой рамки считывания, расположенной tj полностью сплайсированной мРНК перед стартовым кодоном основной рамки считывания твгРНК РТР. Такие особенности структуры 5'-НТО типа II не исключают, что она может быть трансляционно малоактивной, таким образом увеличение содержания РГР у самок связано не столько с увеличением содержания мРНК этого белка в целом, сколько с увеличением относительной доли трансляционно более активной формы мРНК.

¿Возрастные изменения уровня мРНК РГР.

Учитывая половые различия в экспрессии мРНК типа I в печени крысы, можно было предположить влияние на неё половых стероидных гормонов. В ,связи с этим представляло интерес выяснить, изменяется ли экспрессия мРНК типа I в ходе полового созревания животных.

Для этого оценили уровень мРНК РГР двух типов в печени крыс в зависимости от возраста. У 12-дневных крыс обоих полов мы не обнаружили транскриптов типа I, тогда как тяРНК типа II экспрессировалась у этих особей на уровне взрослых животных (рис. 9).

238 Р-1941-

108II-

Рис. 9. Анализ мРНК РГР в печени 12-дневных крыс методом защиты от действия РНКаз с использованием РНК-зонда, специфичного для 5-НТО типа I. Р - РНК-зонд, не обработанный РНКазами; РНК из печени взрослой самки (1), 12-дневных самок (27), взрослого самца (8) и 12-дневных самцов (9-14). Слева указаны длины РНК-зонда (Р) и его фрагментов, защищенных мРНК типа I и II, в нуклеотидах.

мРНК типа I начинает экспрессироваться в печени самок и самцов только в процессе полового созревания (в нашем эксперименте у 45-дневных крыс), как это видно на рис. 10.

Р 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Р

238194-

108-

Рис. 10. Анализ мРНК в печени крыс разного возраста методом защиты от действия РНКаз. с использованием. РНК-зонда, специфичного для 5-НТО типа I. Р - РНК-зонд, не обработанный РНКазами; РНК.из печени половозрелой самки (1), 12-дневной самки (2), 45-дневных самок (3-10), половозрелого самца (11), 12-дневного самца (12), 45-дневных самцов (13-18).

Таким образом, мы обнаружили, что мРНК. РГР с 5'-НТО типа II экспрессируется конститутивно, а экспрессия мРНК РГР с 5'-НТО типа I специфична для печени и зависит от возраста и пола животного.

5.Действие половых гормонов на экспрессию мРНК РГР типа I

Для изучения возможной роли половых гормонов в рефляции экспресс™ мРНК типа I, мы проверили как влияют кастрация и последующее введение женского полового гормона эстрадиола на уровень экспрессии этой формы мРНК в печени самцов. Как видно из рис. 11, содержание мРНК типа I увеличивается после кастрации по сравнению с контрольными самцами, но не достигает уровня, наблюдаемого в печени интактных самок. Последующее введение эстрадиола практически не отражается на содержании мРНК типа I в печени кастрированных самцов.

0

Р С 1 2 1 ♦ 5- ^ 7 Я Ш И 12 13

238 Р-

1941-

10811-

Рис.11. Действие кастрации и последующей обработки эеградиолом на содержание мРНК РГР с 514ГК>тшюгЬ Р - РНК-зевд, не обработанный РНКазами; РНК из печени кастрированных самцов (8-11), кастрированных самцов, обработанных эеградиолом (1-7^ и интакгаых самцов (12, 13). Слева указаны размеры РНК-зоцца (Р^ и его фрагментов, защищенных от расщепления РНКазами мРНК типа I и П.

В печени овариэктомированных самок мы не обнаружили подавления экспрессии мРНК РГР типа I (рис. 12), однако введение им тестостерона приводило к полному подавлению экспрессии мРНК РГР типа I,- тогда как экспрессия мРНК типа И оставалась- на уровне контрольного животного (рис. 12). Действие тестостерона: было-обратимым: через 14 дней после окончания инъекций, экспрессия-мРШСташа I восстановилась, хоуя и не достигла ^сходного уровня, наблюдаемого в печени интактных самок

12 3 4- * * 7 8 9 10

238 Р

1941-

108 II-

Рис. 12. Действие овариэкгомии и последующего введения тестостерона на уровень мРНК РГР е 5'-НТОтипа I. Оварюкгамировашкле

самки (1-3), овариэктомированные самки, обработанные тестостероном (45), то же через 2 недели после завершения инъекций тестостерона (6-10).

6. Регуляция экспрессии мРНК РГР гипофизом.

Проведенное нами изучение влияния половых стероидных гормонов на экспрессию мРНК РГР с 5'-НТО типа I, показало, что, манипулируя концентрациями этих гормонов можно менять уровень экспрессии мРНК РГР типа I. Из литературы известно, что ГР является одним из ключевых факторов, определяющих половой диморфизм функций печени (Розен и др., 1991). Разное действие ГР на функции печени у самок и самцов определяется характером секреции ГР гипофизом и флуктуации его концентрации в крови. Для самок характерны частые низкоамплитудные пики концентрации и более высокий базальный уровень ГР, для самцов -редкие высокоамплитудные пики концентрации и низкий межпиковый уровень гормона.

Гипофизэктомия животных приводит к резкому снижению содержания РГР в печени, но незначительно влияет на уровень суммарной мРНК РГР. Как показали наши опыты, удаление гипофиза у самок полностью подавляет экспрессию мРНК типа I. мРНК типа И экспрессируется при этом на уровне контрольного животного (рис. 13).

238 Р-

1941-

1в8В-

Рис. 13. Влияние гипофизэктомии на экспрессию мРНК РГР/БСГР типа I в разных тканях самок крыс. Методом защиты от действия РНКаз анализировали по 20 мкг суммарной РНК из разных тканей контрольных и шпофиззктомированных животных. РНК из тканей контрольных самок: печень 1-2; почки 7; жировая ткань 12; матка 15. РНК из тканей гипофизэктомированных самок: печень 3-6; почки 8-11; жировая ткань 13-14; матка 16; надпочечники 17; С -РНК-зонд, обработанный РНКазами, Р - РНК-зонд типа I.

Из литературшлх данных известно, что однократное введение ГР гипофизэктомированным животным приводит к снижению количества РГР, а непрерывное введение ГР стимулирует синтез РГР/БСГР и

123456789 1011 1213 14151617С Р

соответствующих мРНК, причем на уровне белка эта стимуляция проявляется значительно сильнее, чем на уровне РНК.

'В связи с этим, мы проанализировали экспрессию мРНК типа I в печени самцов, у которых в крови постоянно поддерживался высокий уровень ГР. Таких животных получали следующим образом: в почечную капсулу самцов подсадили два свежевыделенных гипофиза. Донорские гипофизы, находясь вне контроля гипоталамуса секретируют ГР на высоком базальном уровне. Через 14 дней после операции в печени этих самцов экспрессия мРНК РГР типа I значительно увеличилась (рис. 14).

238 Р-

1941-

10811-

Рис. 14. Влияние высокого уровня ГР в крови на экспрессию мРНК РГР/БСГР типа I в печени самцов, крыс. По 20 мкг суммарной РНК из печени контрольных самцов (1-4), самцов с трансплантированными гипофизами (5-11), С - РНК-зонд, обработанный РНКазами, Р - РНК-зонд типа I. Слева указаны размеры фрагментов РНК в нуклеотидах.

Дробнор введение самцам или гипофизэктомированным самкам ГР человека или пролактина овцы не приводило к появлению в печени мРНК РГР типа I (данныеTie показаны).

Увеличение содержания транскриптов с 5'-НТО типа I при беременности также может быть связано с повышенным уровнем ГР в крови беременных самок. При беременности резко увеличивается количество рСГР в сыворотке и соответствующей мРНК в печени. Корреляция с накоплением 5'-НТО типа I в печени указывает на возможность неравномерного распределения этой 5-НТО между мРНК РГР и мРНК БСГР, то есть между длинными и короткими транскриптами гена РГР.

Таким образом, экспрессия мРНК РГР/БСГР типа I стимулируется типом секреции ГР, характерным для самок. Высоким базальным уровнем ГР в крови определяется также полозависимая экспрессия ряда генов в печени самок крыс, в том числе рецептора пролактина (Robertson et al., 1990), аполипопротеина Е (Oscarsson et al., 1991), гена CYP2C12 и^ семейства цитохромов Р450 (Legraverend et al., 1992).

1 2 3 4 5 6 7 8 * 10 11 С Р

При беременности у млекопитающих повышается уровень ГР в крови (Cramer et al., 1992; Kelly et al., 1976). У беременных самок мышей и крыс обнаруживается повышенное содержание РГР в печени и БСГР п сыворотке (Smith et at., 1988; Kelly et al., 1974) а также соответствующих мРНК в печени, причем эти изменения более значительны для БСГР (Tiong et al., 199l;r Cramer et al., 1992). Удаление гипофиза беременных самок приводило к снижению уровня РГР и БСГР, а непрерывное введение ГР способствовало поддержанию уровней этих белков, характерных для беременных самок (Sanchez-Jimenez et al., 1990).

Как бщло описано выше, тт печени беременных самок крыс увеличивается содержание транскриптов с 5'-НТО типа I что,, вероятно, также может быть связано с повышенным уровнем ГР в крови. Корреляция увеличения количества БСГР в сыворотке и соответствующей мРНК в печени при беременности с накоплением 5-НТО типа I втгечениуказьгоает на возможность неравномерного распределения этой S^HTO между мРНК РГР и мРНК БСГР, то есть между длинными и короткими транскриптами гена РГР.

7. Выявление альтернативных транскриптов тиРНК РГР в печени крыс на разных стадиях беременности и лактации.

Для того, чтобы выяснить связана ли 5'-НТО типа I преимущественно с коротким транскриптом, мы использовали Northern - гибридизацию. По 15 мкг суммарной РНК из печени самца, самки и беременной самки анализировали в 1% денатурирующем агарозном геле и гибридизовали с антисмыслов;им РНК - зондом, комплементарным фрагменту 5'-НТО мРНК типа I. Количество транскриптов, длиной 4.2 т.н. и 1.8 т.н., соответствующих мРНК РГР и мРНК БСГР, соответственно, увеличивается при беременности,, однако накопление коротких транскриптов более значительно, (рис. 15).

1 2 3

4.2kb-

1.8kb-

Рис. 15. Экспрессия мРНК РГР и мРНК БСГР типа I в печени самцов, самок и беременных самок. Методом Northern гибридизации анализировалось по 15 мкг суммарной РНК из печени самцов - 1, самок - 2 и беременных самок - 3.

4

С помощью метода Northern - гибридизации, мы исследовали также изменение количества коротких и полноразмерных форм мРНК РГР типа I

i8

в печени самок на разных сроках беременности и лактации. Как видно из рис. 16, количество короткого транскрипта увеличивается к поздним срокам беременности и снижается в печени лакггирующей самки.

4ikb

12kb

Рис. 16. Экспрессия мРНК РГР и мРНК БСГР типа I в печени беременных и лактирующих самок крыс. Суммарная РНК из печени нормальной самки (1), беременных самок на б-й (2;3) 12-й (4;5), 19-й (б;7), 21-й (8;9) день беременности и из печени лактирующих самок на 5-й (10; 11), 10-й (12;13), 15-й (14;15), 20-й (16;17) день лактации.

Northern-гибридизация этого геля с зондом типа II показала, что при беременности количество мРНК РГР и БСГР с 5'-НТО типа II увеличивается незначительно и резко уменьшается в печени лактирующей самки. В организме интенсивно кормящей матери устанавливается отрицательный энергетический баланс (Вашпап et aL, 1980), как у животных, получающих недостаточное питание, что приводит к уменьшению общего количества РГР/БСГР (Straus et al., 1990)

Одновременно и независимо от нашей работы, в двух зарубежных лабораториях были получены сходные результаты о тканеспецифичносги и зависимой от-пола экспрессшг мРНК РГР типа I (Baumbach and Bingham, 1995; Gabrielsson et al., 1995). В целом наши данные хорошо согласуются с результатами, опубликованными в этих работах. Есть также некоторые расхождения, причины которых мы. попытаемся объяснить. Baumbach и Bingham (1995) обнаружили повышение уровня экспрессии 5-НТО типа I у кастрированных самцов до уровня овариэктомированной самки. Однако, в одной из групп кастрированных самцов, которым,.операцию проводили немного позже по сравнению с остальными группами, авторы не обнаружили столь явного увеличения экспрессии, что совпадает с нашими результатами.

Возмолщо, эффект зависит от возраста кастрируемого самца и от промежутка времени от операции до момента анализа РНК. У Gabrielsson и соавторов (1995) введение тестостерона овариэкггомйрованным самкам не приводило к дальнейшему снижению уровня мРНК РГР типа I, что не совпадает с нашими данными. Возможно, эта разница связана с различным способом введения тестостерона: медленно растворяющиеся таблетки, имплантированные под кожу, в отличие от регулярных инъекций в нашем эксперименте. По нашим данным действие тестостерона временное и, после выведения гормона из кровообращения, уровень экспрессии мРНК типа I восстанавливается; поэтому большое значение

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

3*^455-.

щШ1 Ш 4м т %«•

Результаты наших экспериментов, так же, как и вышеупомянутых работ не исключают возможности прямого действия половых гормонов на экспрессию мРНК РГР, однако указывают на то, что главным регулятором экспрессии является ГР, а половые гормоны могут действовать опосредовано, путем изменения параметров секреции ГР.

Известно, что кастрирование приводит к повышению базального уровня ГР, а овариэктомия снижает базальный уровень ГР и немного увеличивает амплитуду пиков. Эти изменения являются промежуточными между мужским и женским типами секреции ГР, следовательно, гонадоэктомия должна приводить к такому уровню экспрессии мРНК РГР типа I, который является промежуточным между интактпыми самками и самцами. Введение половых гормонов гонадоэктомированным животным должно еще больше приблизить уровень экспрессии мРНК РГР к уровню интактного животного. В наших экспериментах в основном прослеживалась эта тенденция. Однако, цри введении эстрадиола кастрированным самцам, мы не обнаружили явного повышения уровня мРНК РГР типа I. Видимо, большое значение имеют доза и продолжительность обработки эстрадиолом; у Gabrielsson и соавторов (Gabrielsson et al., 1995) показано, что индукция мРНК РГР типа I становится значительной только через 96 часов после обработки эстрадиолом (25 мкг/день).

В нашем эксперименте тестостерон подавляет экспрессию мРНК РГР в печени, скорее всего путем снижения базального уровня ГР в крови. В пользу этого предположения говорят полученные Cabrielsson и соавторами данные о том, что введение тестостерона на фоне непрерывной подачи ГР с помощью мини насоса не действует на уровень экспрессии мРНК РГР типа I.

Экспрессия гена РГР находится под контролем гормональных, возрастных и тканеспецифичных факторов. Гетерогенность 5'-НТО мРНК РГР предполагает наличие множественных 5'-нетранслируемых экзонов гена РГР и исследование промоторных областей этих экзонов позволило бы прояснить вопросы, связанные с регуляцией экспрессии гена РГР на уровне транскрипции.

В последние годы клонированы промоторные области, ответственные за экспрессию специфичных для печени вариантов мРНК РГР овцы, крысы и мыши (O'Mahoney et.al.,1994; Baumbach and Bingham, 1995; Menon et.al., 1995). Специфичный для печени промотор гена РГР овцы - промотор Р1 -охарактеризован наиболее детально. Он содержит TATA - и ССААТ - боксы в положениях -31 и -88 по отношению к точке старта транскрипции. Для проявления полной промоторной активности в опытах по временной экспрессии репортерного гена люциферазы достаточно фрагмента промотора размером 473 п.н. Наиболее важным регуляторным элементом является участок -180 + -133, содержащий сайты связывания глюко-кортикоидного рецептора и белков семейства С/ЕВР (O'Mahoney et al., 1994). В участке -70 выявлен также элемент GGAAGAGAGAGA. Подобный элемент участвует в стимуляции экспрессии гена инсулина под действием гормона роста (Billestrup et al., 1992).

В клонированной 5'-фланкирующей области гена РГР крысы размером 608 п.н. (Baumbach and Bingham, 1995) не выявлено каких-либо элементов, которые могли бы рассматриваться как кандидаты на роль регуляториых сигналов, контролирующих специфичную для печени самок экспрессию гена РГР. Для выявления таких сигналов вероятно необходимо

исследование более протяженной 5'- фланкирующей области гена. На это указывают результаты исследования 5'- фланкирующей области гена РГР мыши (Мепоп с1 а1., 1995). С помощью делеционного анализа и изучения связывания ядерных белков на расстоянии 3.4 т.п.н. перед точкой старта транскрипции выявлен регуляторный элемент размером 30 п.н. Этот элемент не имеет гомологии с известными сайтами связывания факторов транскрипции. Сравнение активности этого элемента в фетальных и взрослых гепатоцитах мыши позволило предположить его участие в активации экспрессии гена РГР в печени в ходе развития (Мепоп е1:. А1., 1995).

Имеющиеся в литературе данные об организации регуляторных областей генов РГР являются таким образом неполными и отрывочными. Для окончательного выяснения механизмов регуляции экспрессии генов РГР и роли самого гормона роста в этом процессе требуются дополнительные исследования.

Выводы.

1. Разработан количественный метод определения содержания двух изоформ мРНК РГР крысы, отличающихся структурой 5'-нетранслируемой области, основанный на защите гибридов РНК-РНК от действия РНКазы в присутствии внутреннего стандарта.

2. Установлено, что мРНК РГР крысы с 5'-нетранслируемой последовательностью типа I экспрессируется только в печени взрослых крыс, причем уровень этой формы мРНК в печени самцов очень мал, в печени самок он значительно выше и еще больше возрастает при беременности. Экспрессия мРНК типа II, выявлена во многих тканях, как самцов, так и самок крысы.

3. Удаление яичников приводит к незначительному снижению уровня специфичной для печени самок мРНК типа I. Обработка гонадэктомированных самок тестостероном полностью подавляет экспрессию мРНК типа I, а прекращение введения тестостерона восстанавливает её синтез. Удаление семенников практически не изменяет характер экспрессии гена РГР в печени самцов крысы. Последующая обработка кастрированных самцов эстрадиолом слегка повышает уровень мРНК РГР типа I

4. Гипофизэктомия сопровождается полным исчезновением мРНК РГР типа I в печени самок, приводя к характерному для печени самцов паттерну экспрессии гена РГР. Дробное введение ГР или пролактина гипофизэктомированным самкам не восстанавливает экспрессию мРНК типа I. Трансплантация донорских гипофизов в почечную капсулу самцов крысы оказывает сильное феминизирующее действие на экспрессию гена РГР. В печени таких животных выявляется высокий уровень мРНК типа I, характерный для интактных самок крысы. Полученные результаты указывают, что экспрессия мРНК РГР с 5'-нетранслируемой областью типа I регулируется характером секреции ГР гипофизом.

5. При беременности в печени самок крысы происходит накопление изоформ мРНК с 5'-нетранслируемой последовательностью типа I, достигающее максимума на поздних стадиях беременности. В большей степени этот эффект выражен для изоформ мРНК, кодирующей короткий транскрипт БСГР. У лактирующих самок содержание мРНК типа I снижается до контрольного уровня.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Рубцов П.М.,. Бабасян С.А., Свердлова П.С. Половой диморфизм экспрессии альтернативных вариантов мРНК рецептора гормона роста в печени крысы. Молекулярная биология т.27, 5, стр.1157-1164 (1993).

2. Рубцов П.М., Бабасян С.А., Зайцев A.C., Лонина Д.А., Пехлецкий P.H., Свердлова П.С. Организация и экспрессия генов рецепторов гормонов семейства соматотропина/пролактина. Тезисы конференции, посвященной 80 - летию акад. АМН Н.А.Юдаева, Москва, 1993, стр., 21-22.

3. Rubtsov P.M., Babasian S.A., Sverdlova P.S., Smirnov A.N., Smirnova O.V. Two alternative 5'-untranslated sequences of the rat growth hormone receptor mRNA have tissue- and sex- specific differences in expression. Eur. J. Endocrinol., v. 130, suppl. 2, p. 253 (1994).

4. Rubtsov P.M., Babasian S.A., Sverdlova P.S., Astapova I.I., Petraschuk O.M., Shchelkanova T.A., Smirnova O.V., Smirnov A.N.. Pituitari controls sexdifferential expression of growth hormone receptor gene in rat liver. Abst. Of 10th International Congress of Endocrinology, vol. II, San Francisco, 1996, p. 806.

5. Бабасян C.A., Астапова И.И., Свердлова П.С., Щелкунова T.A., Петращук О.М., Смирнова О.В., Смирнов А.Н., Рубцов П.М. Тканевые, возрастные и половые изменения характера экспрессии гена рецептора гормона роста крысы и регуляторная роль гормона роста. Тезисы 2-го съезда Биохимического общества РАН, Москва, 1997, ч.1, стр.254-255.

6. Бабасян С.А., Астапова И.И., Свердлова П.С., Петращук О.М., Щелкунова Т.А., Смирнова О.В., Смирнов А.Н., Рубцов П.М. Индукция синтеза специфичных для самок вариантов мРНК рецептора гормона роста в печени самцов крысы. Молекулярная биология, т. 32, 5, стр. (1998).