Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование генетического разнообразия эпидемиологически значимых видов описторхид

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Исследование генетического разнообразия эпидемиологически значимых видов описторхид"

г

004601643

На правах рукописи

Шеховцов Сергей Викторович

Исследование генетического разнообразия эпидемиологически значимых видов описторхид

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 9 ДПР 2010

Новосибирск 2010

004601643

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте цитологии и генетики СО РАН в лаборатории функциональной генетики, г. Новосибирск

Научный руководитель: доктор биологических наук

В.А. Мордвинов Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

О.В. Морозова

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск

кандидат биологических наук О.Э. Костерин

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Институт систематики и экологии животных Сибирского отделения Российской академии наук, г. Новосибирск

Защита диссертации состоится " ftClM, 2010 г. на утреннем заседании диссертационого совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 10; факс 7(383) 333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН

Автореферат разослан 2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, , \ ^

доктор биологических наук Л^^ Т.М. Хлебодарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Семейство Opisthorchiidae (кл. Trematoda, тип Platyhelminthes) включает в себя паразитов почти всех классов позвоночных, главным образом млекопитающих и птиц. Тремя представителями этого семейства - Opistorchis felinens, Clonorchis sinensis и O. viverrini - заражены около 30 млн человек в мире (King, Scholtz, 2001) и примерно 300 млн человек находится в группе риска. Кроме того, в некоторых случаях человека могут поражать ряд других видов описторхид. Pseudamphistomum truncatum считается настолько же патогенным для человека, как и О. felineus (Ромашов с соавт., 2005). Есть сообщения, что Metorchis bilis и М. xanthosomus также могут быть опасны для человека (Сидоров, 1983).

Несмотря на практическую важность, генетическая изменчивость как представителей сем. Opisthorchiidae, так и кл. Trematoda в целом остается слабо изученной. Главной причиной этого является относительно небольшое (в сравнении, например, с позвоночными и членистоногими) количество признаков для традиционного морфологического анализа; кроме того, многие из этих признаков, например, размер и форма тела, зависят в большей степени от вида организма-хозяина и интенсивности инвазии, чем от генетических факторов.

В последние годы широкое паспространение получили различные методы изучения генетического разнообразия последовательностей ДНК. Эти методы зачастую могут выявлять значительно больший природный полиморфизм, чем традиционные методы, основанные на анализе морфологических признаков. Другим плюсом является возможность работать с музейными образцами, небольшими фрагментами тканей (вплоть до отдельных клеток) и различными стадиями жизненного цикла. В последнем случае появляется возможность определять вид паразита на стадии, на которой идентификация с помощью морфометрии невозможна.

Для успешного изучения генетического разнообразия описторхид при помощи молекулярных методов прежде всего необходимы исследования изменчивости отдельных последовательностей и выбор наиболее быстро эволюционирущих из них. В связи с этим первоочередной задачей становится определение первичных последовательностей митохондриальных геномов как одних из наиболее быстро эволюционирующих последовательностей ДНК животных (Brown et al., 1987).

Цель и задачи исследований

Основной целью данного исследования было определение меж- и внутривидовой изменчивости ядерной и митохондриальной ДНК О. felineus и близкородственных видов - С. sinensis, О. viverrini, М. bilis и М. xanthosomus.

В работе были поставлены и решены следующие задачи:

1. Определение нуклеотидных последовательностей митохондриальных геномов О. felineus, С. sinensis и О. viverrini и их анализ.

2. Исследование филогенетических взаимоотношений между О. felineus, С. sinensis, О. viverrini, М. bilis, М. xanthosomus и P. truncation при помощи митохондриальных и ядерных маркеров.

3. Исследование внутривидовой структуры О. felineus на территории России при помощи митохондриальных маркеров.

Научная новизна

Разработаны новые ядерные (9й интрон гена парамиозина и гистон HI) и митохондриальные (сохЗ и atp6) маркеры описторхид. Усовершенствованы системы использования ранее использовавшихся маркеров coxl и ITS2. По данным маркерам получены нуклеотидные последовательности образцов О. felineus, С. sinensis, О. viverrini, М. bilis, М. xanthosomus и P. truncatum и реконструированы филогенетические отношения между этими видами. Впервые проведена реконструкция полных нуклеотидных последовательностей митохондриальных геномов О. felineus и С. sinensis и частичной последовательности митохондриального генома О. viverrini. Проведено масштабное исследование генетической изменчивости О. felineus на молекулярном уровне.

Практическая значимость работы

Полученные нуклеотидные последовательности митохондриальных геномов и ядерных маркеров найдут применение в эпидемиологических исследований в качестве маркеров видов и популяций, а также в медицинских диагностических наборов на основе ДНК.

Положения, выносимые на защиту

1. Реконструированные митохондриальные геномы О. felineus, С. sinensis и О. viverrini обладают рядом особенностей, отличающих их от известных митохондриальных геномов трематод. В частности, обнаружены альтернативные структуры для TPHK-Ser(AGN) и отсутствие DHU-петли у тРНК-Cys этих видов; впервые для трематод обнаружено перекрывание стоп-кодона с последующим геном тРНК. В контрольных районах митохондриальных геномов О. felineus и С. sinensis отсутствуют тандемные повторы и шпильки; кроме того, не выявлено сходства нуклеотидных последовательностей некодирующих регионов этих видов между собой.

2. Схемы филогенетических отношений между исследованными видами описторхид, построенные на основе ядерных и митохондриальных маркеров, различаются.

3. Отсутствуют достоверные различия между популяциями О. /еНпеш на территории России по митохондриальным последовательностям. На основании этих данных выдвинута гипотеза о происхождении популяций О. /е1теш на территории России от одной небольшой популяции вследствие ее экспансии во время микулинского межледниковья.

Апробация работы

Основные положения диссертации были представлены на: IV Съезде Паразитологического общества РАН (Санкт-Петербург, 2008), на рабочем совещании по программе "Геномика, протеомика, биоинформатика" в рамках проекта "Секвенирование генома возбудителя описторхоза /еНпеш" (Новосибирск, 2008), на VI Международной конференции по биоинформатике регуляции и структуры генома (Новосибирск, 2008), на отчетной сессии Института Цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск, 2009), на IV Международной конференции молодых учёных "Биология: от молекулы до биосферы" (Харьков, 2009), на Всероссийской конференции молодых ученых "Эволюционная и популяционная экология" (Екатеринбург, 2005) и на XX Международном генетическом конгрессе (Берлин, 2008). Вклад автора

Основные результаты работы получены автором самостоятельно. Публикации

По материалам диссертации опубликовано 10 работ. Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, содержащего 154 источника (в том числе на иностранном языке 135). Работа изложена на 131 странице машинописного текста, иллюстрирована 8 таблицами и 15 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве исходного биологического материала использовались образцы описторхид на стадии мариты либо метацеркарии. Метацеркарии выделяли из второго промежуточного хозяина либо компрессионным методом, либо путем переваривания мышц рыбы в искусственном желудочном соке. Мариты выделяли из печени естественно или искусственно зараженного хозяина (кошек и золотистых хомячков).

ДНК из образцов описторхид выделяли или фенольным методом, или перевариванием протеиназой К, или гуанидинизотиоцианатным методом. Электрофорез проводили в 0.5-2% агарозных гелях.

Анализ и редактирование хроматограмм проводился программами Chromas v.2.0 и FinchTV v.1.4.0. Для поиска гомологичных последовательностей использовались прогрмаммы серии BLAST, представленные на сервере www.ncbi.nlm.nih.gov/blast. Множественное выравниване последовательностей производилось при помощи программы ClustalW (Larkin et al., 2007). Также использовались программы Genomatix, Virtual Ribosome (Wernersson, 2006), Tandem Repeats Finder (Benson, 1999), MEME и MAST (Bailey, Gribskov, 1998), Primer3, Oligo v.3.3, программы серии VectorNTI Suite 7. Поиск тРНК производился программой tRNA-Scan. Филогенетический анализ проводился программами PAUP v.4bl0 и MEGA v.4.0. Для выбора наилучшей модели нуклеотидных замен использовалась программа ModelTest (Posada, Crandall, 2000).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Секвенирование митохондриальных геномов О. felineus. С. sinensis и О. viverrini

Для получения последовательностей митохондриальных геномов используется несколько подходов. Прямой подход - выделение мтДНК -проводится путем мягкого разрушения клеточных стенок с последующим разделением ядер и митохондрий. Он, однако, пригоден лишь при наличии большого количества исходного живого материала, что делает его непригодным для организмов малых размеров, которых нельзя набрать в большом количестве. В таких случаях предпочтительны методы, основанные на ПЦР, что требует предварительного знания хотя бы части последовательностей мтДНК организма,

В связи с очень малым весом единичных марит, в качестве исходного биологического материала для получения митохондриальных геномов О. felineus и С. sinensis были использованы пулированые мариты. Для получения тотальной ДНК О. felineus были взяты кошки, пойманной в селе Усть-Тула Болотнинского района Новосибирской области. Для получения тотальной ДНК С. sinensis были взяты мариты, полученные в результате заражения сирийского хомячка метацеркариями из Приморского края. Для получения тотальной ДНК О. viverrini была взята марита из провинции Хон Хаен (Таиланд), предоставленная проф. Р. Sithithaworn. Для всех образцов было проведено морфологическое определение.

На момент начала исследования были известны: последовательность гена nd2, частичная последовательность гена ndl и кластера из трех тРНК, находящиеся между ними, для С. sinensis и частичные последовательности

генов ndl и nd3 и находящихся между ними четырех тРНК - для О. viverrini.

Сначала были получены короткие фрагменты генов cob, nd5 и nd4 при использовании универсальных праймеров, подобранных путем поиска консервативных сайтов в геномах Fasciops hepático, Paragonimus westermani и Schistosoma mansoni программой MEME. Затем аналогичным способом были получены последовательности, фланкирующие эти фрагменты. Таким образом, были получены перекрывающиеся ампликоны, вместе составляющие последовательность полного митохондриального генома. За исключением фрагментов генов 16S рРНК, nd5 и некодирующего региона, которые были клонированы, все остальные последовательности получены путем прямого секвенирования ампликонов. Для заклонированных фрагментов было просеквенировано не менее трех клонов каждой последовательности для того, чтобы исключить возможность мутаций, внесенных Taq-полимеразой.

Полученные перекрывающиеся последовательности были собраны в программе Vector-NTT. Каждая просеквенированная последовательность исследовалась программами серии BLAST на предмет присутствия схожих последовательностей в нуклеотидных и белковых базах данных. Затем при помощи программы Virtual Ribosome производился поиск рамок считывания. Вторичные структуры части тРНК были найдены программой tRNAScan-SE (Lowe, Eddy, 1997); вторичные структуры остальных тРНК были найдены вручную, используя сравнения последовательностей тРНК описторхид между собой и с тРНК других трематод.

Полные митохондриальные геномы О. felineus и С. sinensis имели длину 14277 п.н. и 13875 п.н., соответственно. Таким образом, они являются наиболее короткими из просеквениро ванных на данный момент геномов трематод. Частичная последовательность митохондриального генома О. viverrini имела длину 12735 п.н. Как и у всех изученных митохондриальных геномов плоских червей, все гены описторхид транскрибировались только с одной кодирующей цепи (Le et al., 2002). В последовательностях геномов О. felineus, С. sinensis и О. viverrini были обнаружены 12 белок-кодирующих генов, 2 гена рРНК и 22 гена тРНК. Порядок расположения генов совпадает с таковым у F. hepático (Рисунок 1). Как и у F. hepatica (Le et al., 2000), гены nd4L и nd4 перекрывались по разным рамкам считывания на 40 п.н. у всех трех видов.

Как и митохондриальные геномы других видов трематод, за исключением Р. westermani, митохондриальные геномы описторхид АТ-богаты. Но в случае трематод стоит скорее говорить об обогащении кодирующей цепи тимином и гуанином. У всех трех видов наблюдалось обогащение тимином и недостаток аденина и, в особенности, цитозина: при -42% Т в кодирующей цепи наблюдалось всего 12% С. Эта же особенность отмечается и у других митохондриальных геномов трематод,

за исключением P. westermani (Le et al., 2004).

Различные компоненты митохондриального генома заметно различаются по нуклеотидному составу. Наиболее обеднены цитозиномтретьи позиции кодонов - около 7%. В то же время в генах тРНК тимина заметно меньше, чем в среднем по геному - 35% против 45%. Заметно отличаются по нуклеотидному составу как от средних показателей, так и между собой некодирующие регионы О. felineus и С. sinensis.

Рис. 1. Схема строения митохондриальных геномов описторхид.

Особенности нуклеотидного состава влияют и на использование ! кодонов и аминокислот. Так, самыми часто встречающимися кодонами в митохондриальных геномах описторхид являются ТТТ, GTT и TTG. ТТТ составляет почти 10% всех кодонов, в то время как все кодоны, содержащие только А и С, составляют около 2%. Аминокислоты, в первых и вторых позициях которых присутствуют Т или G (Cys, Phe, Gly, Leu, Val и Trp), составляют почти 50% от всех аминокислот, а аминокислоты, в первых и вторых позициях которых присутствуют А или С (His, Lys, Asn, Pro, Gin и Thr ) - только около 10%.

В качестве старт-кодонов в митохондриальных геномах описторхид используются ATG и GTG, необычных старт-кодонов (например, GTT, который был найден у цестоды Hymenolepis diminuta (Le et al., 2002)), обнаружено не было. При установлении рамки считывания выбирался старт-кодон, при котором длина некодирующей последовательности между исследуемым геном и предшествующим ему минимальна. Иногда

tRNA-Glu tRNA-Gly

tRNA-Ser(AGN)

tRNA-Lys

присутствовало несколько альтернативных старт-кодонов на небольшом расстоянии друг от друга.

Стоп-кодонами являлись TAG и ТАА, что также типично для трематод. У гена ndl О. viverrini стоп-кодон TAG перекрывался с последующим геном тРНК-Asn на 1 пн; таким образом, нельзя исключить возможность, что этот кодон на самом деле является укороченным и достраивается до стоп-кодона ТАА путем полиаденилирования транскрипта (Ojala et al., 1981).

В митохондриальных геномах О. felineus и С. sinensis было обнаружено по 22 гена тРНК. В частичной последовательности митохондриального генома О. viverrini было обнаружено 20 генов тРНК. Структура тРНК описторхид сходна с таковой у прочих многоклеточных животных. Длина тРНК составляет от 59 до 72 нуклеотидов, у большинства - 63-67 нуклеотидов. У тРНК-Cys всех трех видов отсутствует DHU-петля. Известно, что DHU-петля у тРНК-Cys присутствует у F. hepático и P. westermani, в то время как для различных видов шистосом характерно как ее наличие, так и отсутствие (Littlewood et al., 2006).

Как и у большинства многоклеточных животных, у всех трех видов описторхид DHU-петля TPHK-Ser(AGN) отсутствует. У многих многоклеточных животных, и у всех трематод, чей геном известен, отсутствует и DHU-петля TPHK-Ser(UCN). В случае наших видов, у О. felineus и С. sinensis возможны две альтернативные структуры тРНК-Ser(UCN), без DHU-петли и с ней; в последнем случае наблюдается перекрытие 3 пн с предыдущим геном TPHK-Leu(CUN) (Рисунок 2). В

Рис. 2. Альтернативные структуры TPHK-Ser(UCN) O.felineus, С. sinensis и О. viverrini.

случае TPHK-Ser(UCN) О. viverrini возможны две структуры, обе из которых способны к формированию DHU-петли.

Некодирующие регионы О. felineus и С. sinensis разделены на 2 части неравной длины геном тРНК-Gly (Рисунок 3). Некодирующий регион между генами тРНК-Gly и сохЗ имеют длину 78 и 67 п.н. у О. felineus и С. sinensis, соответственно, и не содержат каких-либо структурных особенностей. Участки между генами тРНК-Gln и тРНК-Gly значительно длиннее - 561 и 153 п.н., соответственно. В этом длинном некодирующем регионе у О. felineus было обнаружено 30 повторов ТА-микросателлита и длинная открытая рамка считывания длиной 402 п.н., в то время как у С. sinensis никаких особенностей данный район не содержал.

Рис. 3. Схема строения некодирующих регионов О. felineus и С. sinensis. LNR -длинный некодирующий

регион, SNR - короткий некодирующий регион.

У млекопитающих некодирующий регион содержит ориждин репликации, промотор полицистрона митохондриальных генов, консервативные CSB- и TAS-элементы, а также участки, спообные к формированию тРНК-подобных структур (Shadel, Clayton, 1997). У всех изученных до сих пор цестод эти участки содержат участки, способные к формированию шпилек, а у трематод - длинные тандемные повторы (Le et al., 2002). Предположительно, эти структуры необходимы репликации или транскрипции мтДНК. У О. felineus и С. sinensis, однако, не было обнаружено ни длинных тандемных повторов, ни участков, способных формировать шпильки. Не было обнаружено и каких-либо консервативных участков, присутствующих у обоих видов.

Из этого можно сделать вывод, что ни тандемные повторы, ни шпильки, ни консервативные мотивы не являются необходимыми для функционирования контрольного региона описторхид. Следует, однако, подчеркнуть, что даже у млекопитающих его функционирование изучено слабо, так что окончательных выводов без поддержки экспериментальных данных сделать пока нельзя.

Интересно, что открытая рамка считывания в некодирующем регионе обнаруживается также у F. hepatica и у моногенеи Microcotyle sebastis (Park et al., 2007). Однако, последовательности некодирующего

О. felineus

ndS

Открытая рамка счнты&ания tRNA-Glu / tRNA-Öy

ГА-мнкросаталпит

LNR

561 bp

.ft n SNR

COXJ

4

C. sinensis

tRNA-Gly nd5 tRNA-GIU \ сохЗ

II LNR Д SNR/

региона О. /еНпет не имеют сходства ни с этими рамками, ни с какими-либо другими последовательностями в базах данных. Это оставляет открытым вопрос о ее функциональности.

| Фитогеография О. ЬеИпеия

Для изучения внутривидовой изменчивости О. /еНпеия были использованы образцы из 13 географических точек (Рисунок 4, Таблица 1).

Для исследования внутривидовой изменчивости О. /еНпет нами были подобраны праймеры для последовательности, включающей в себя 3' , конец гена сохЗ (561 пн), частичную последовательность (26 пн) гена тРНК-Ив и участок длиной 54 п.н., находящийся между ними; этот маркер в дальнейшем будем для краткости называть просто сохЗ. Для исследования был выбран именно данная последовательность, так как она наряду с последовательностью гена сохЗ, более изменчивого, чем традиционно используемый для описторхид сох 1, включает в себя и самый длинный (после ЬЫ11 и 5КИ) некодирующий спейсер. Ожидалось, что этот участок будет более изменчив, чем кодирующая последовательность, что и подтвердилось впоследствии: в данном спейсере были выявлены мутации в 18,5% нуклеотидов по сравнению с 8,7% для последовательности гена сохЗ.

I Рисунок 4. Точки сбора образцов О. /еИпеш. Серым цветом показан ареал О. | /еИпеш.

В результате были получены 135 последовательностей сохЗ из 13 популяций (Таблица 1). Всего в этой выборке последовательностей был обнаружен 55 гаплотипов. Из 64 вариабельных сайтов 49 приходились на кодирующую последовательность гена сохЗ, 5 - на тРИК-Шв и 10 - на

Рисунок 5. Сеть гаплотипов О. /еИпеш. Цифры означают количество образцов, имеющих данный гаплотип; пустой кружок означает, что данный гаплотип представлен одним образцом. Точками обозначены отсутствующие образцы.

Таблица 1. Характеристика исследованных популяций О. /еИпеш. Номера популяции соответствуют точкам, указанным на карте. Главный гаплотип -количество образцов в данной популяции, имеющих главный гаплотип; СО ± ББ - галотипическое разнообразие и его стандартное отклонение; л ± 81) -нуклеотидное разнообразие и его стандартное отклонение.

Номер Популяция Образцов Гаплотипов Главной ОИ ± 80 к ± 80

гаплотип

1 Новосибирск 17 9 7 0.846 ±0.089 0.003 ± 0.002

2 Томск 14 8 7 0.769 ±0.120 0.002 ±0.001

3 Куйбышев 11 5 7 0.618 ±0.164 0.001 ±0.001

4 Черлак 1 1 1

5 Тобольск 19 15 4 0.965 ± 0.036 0.004 ± 0.003

Ханты-

6 Мансийск 9 5 4 0.833 ±0.127 0.001 ±0.001

7 Сургут 8 7 2 0.964 ± 0.077 0.003 ± 0.002

8 Шеркалы 6 4 3 0.800 ±0.172 0.002 ±0.001

9 Мехонское 8 5 3 0.893 ±0.111 0.003 ± 0.002

10 Сакмара 1 1 0

11 Илек 14 7 6 0.835 ±0.101 0.002 ± 0.002

12 Сыртинское 11 6 5 0.818 ± 0.119 0.003 ± 0.002

13 Воронеж 16 6 10 0.625 ±0.139 0.001 ±0.001

Вся выборка 135 55 59 0.811 ±0.037 0.002 ± 0.002

из 50 были представлены всего одним образцом, 7 гаплотипов - двумя, два - тремя и два - шестью образцами.

межгенный промежуток. 34 из 49 вариабельных сайтов, приходящихся на ген сохЗ, приводят к синонимичным заменам; чаще всего встречаются транзиции СоТ, приходящиеся на третью позицию кодона.

Большинство минорных гаплотипов отличались от главного одной-двумя заменами. Исключения составляют гаплотипы spSUC)r03-04 (Сыртинское), oft)pNk05-24 (Новосибирск), spToTu03-02 и spToTu03-06 (Тобольск), образующие группу и заметно (5-6 замен) отличающиеся от главного гаплотипа.

Величины нуклеотидной и гаплотипической изменчивости для каждой популяции и для выборки в целом представлены в Таблице 1. Для выборки в целом нуклеотидная изменчивость мала, в то время как гаплотипическая изменчивость имеет достаточно высокие значения. По Avise (2000), это может свидетельствовать о быстрой экспансии популяции, имевшей изначально малый эффективный размер; т.е. время экспансии было достаточным для появления новых гаплотипов, но мало для накопления значительного количества замен.

Попарные значения коэффициэнта генетической дифференциации Fst для всех изученных популяций представлены в Таблице 2. Видно, что они для большинства популяций близки к нулю и лишь в двух случаях, кроме двух, р-value значений FST не является значимым. Точный тест дифференциации популяций (Exact test of population differentiation) не выявил достоверной дифференциации ни для одной пары популяций.

Дисперсионный анализ (AMOVA) показал, что 99% всех различий приходятся на разнообразие внутри популяций и лишь 1% - на различия

Таблица 2. Попарные значения коэффициэнтов Fst Для изученных популяций О. felineus. * - значение является достоверным с вероятностью 0,95.

| Новосибирск Куйбышев Томск Тобольск Ханты-Мансийск Мехонское Сургут Шеркалы

Новосибирск -

Куйбышев 0 -

Томск 0 0 -

Тобольск 0.01 0.07* 0.03 -

Ханты-

Мансийск 0 0 0 0 -

Мехонское 0 0.02 0 0 0 - -

Сургут 0 0.07 0.02 0 0 0 -

Шеркалы 0 0 0 0 0 0 0 -

Сыртинское 0 0 0 0.01 0 0 0 0

Илек 0 0 0 0.01 0 0 0 0

Воронеж 0.01 0 0 0.08* 0 0.02 0.08 0

Я) §

о

а s

н

и

между популяциями. Это свидетельствует о том, что, по-видимому, даже на такой значительной территории популяции О. felineus почти не отличаются друг от друга генетически.

С целью проверки гипотезы о прохождении популяцией О. felineus недавнего бутылочного горлышка был проведен тест распределения попарных замен (mismatch distribution). Распределение попарных различий было унимодальным, наблюдаемое распределение отличалось от ожидаемого лишь незначительно; p-value как индекса шероховатости (raggedness index), так и суммы квадратных отклонений были незначительными ( < 0,05). Это подтверждает гипотезу о недавней популяционной экспансии О. felineus.

Параметр х, оценивающий время начала экспансии, для всей нашей выборки составил 1,38 (1,09 - 1,67 при 5% отклонении). Как известно, т = 2ut, где и - скорость мутации, a t - время дивергенции в поколениях. К сожалению, на данный момент мы не можем достаточно точно оценить ни скорость мутации мтДНК О. felineus. ни среднюю продолжительность его поколения. Если же мы примем наиболее распространенную оценку для coxl позвоночных (2% замен/млн лет, т.е. 6,41*10-6 замен/сайт/год (Brown et al., 1987)) и примем время поколения равному 1 году, то получим оценку в 108 ООО (85 ООО - 130 ООО) лет. Эти цифры хорошо согласуются с приведенными для ряда других видов, обитающих на той же территории: 125 ООО (85 ООО - 151 ООО) лет для лесного лемминга Myopus schisticolor (Fedorov et al., 2008) и 106 000 (38 000 - 138 000) лет для красного лесного муравья Formica lugubris (Goropashnaya et al., 2004). Если считать верной оценку времени начала демографической экспансии для О. felineus и ряда упомянутых выше видов, то можно утверждать, что эти виды прошли бутылочное горлышко, скорее всего, во время московского оледенения, с последующей экспансией во время микулинского межледниковья - около 125 000 лет назад.

Филогения видов сем. Opisthorchiidae

Для исследования филогенетических отношений между видами сем. Opisthorchiidae мы использовали несколько различающихся по происхождению и скорости эволюции последовательностей. Внутренний транскрибируемый спейсер рибосомального кластера (ITS2) - наиболее часто .используемый для исследования филогенетических отношений трематод ядерный маркер. Так как степень его изменчивости не всегда достаточна для надежного исследования филогенетических отношений, мы разработали более изменчивые ядерные маркеры - Pm-int9, включающий в себя девятый интрон гена парамиозина с фланкирующими экзонными последовательностям, и HI - частичная последовательность гена гистона HI, содержащая экзонные и интронные последовательности, а также 3'-UTR. Кроме того, мы использовали частичную последовательность

митоховдриального гена сох-7, которая также была использована в ряде работ по видам сем. Opisthorchiiae (Pauly et al., 2003; Pick, 2005).

Филогенетический анализ был проведен при помощи методов МБ (минимальной эволюции), NJ (метод ближайших соседей), MP (максимальной парсимонии) и ML (максимального правдоподобия) при помощи программ PAUP v.4bl0 (Swofford, 2003) и MEGA v.4.0 (Tamura et al., 2007). Мы проводили укоренения деревьев при помощи последовательностей различных видов из близкородственных семейств и выявили сильное влияние внешней группы на получающееся дерево, что является следствием насыщения заменами. Вследствие этого мы использовали в филогенетическом анализе либо неукорененные деревья, либо деревья, укорененные на среднюю точку. Для выбора наилучшей модели нуклеотидных замен использовалась программа ModelTest (Posada, Crandall, 2000).

Взаимоотношения родов Opistorchis и Clonorchis

О. felineus, О. viverrini и С. sinensis - весьма близкие друг к другу виды. Относительно филогенетических взаимоотношений этих видов существует две точки зрения. Согласно первой, О. felineus и О. viverrini ближе друг к другу, чем к С. sinensis. Эта точка зрения основана на строении марит: У О. felineus и О. viverrini яичники цельнокрайние или неглубоко лопастные, не заходят за кишечные стволы, в то время как у С. sinensis яичники древовидно разветвленные, заходящие за кишечные стволы.

Согласно другой точке зрения, О. viverrini и С. sinensis ближе друг к другу, чем к О. felineus. В пользу этой точки зрения говорят следующие аргументы:

а) Экскреторные формулы (количество протонефридиев) на стадиях метацеркарии и церкарии у С. sinensis и О. viverrini формула имеет вид 2[(3+3)+(3+3+3)]=30, в то время как у О. felineus она имеет вид 2[(5+5)+(5+5+5)]=50 для церкарии и 2[(6+6)+(6+6+6)]=60 для метацеркарии (Посохов, 2004).

б) Число желез проникновения у церкарий также различно: 20 у О. felineus и 14 у О. viverrini и С. sinensis.

Рядом авторов был проведен филогенетический анализ при помощи молекулярных методов. По данным Kang et al. (2008) основанным на последовательностях ITS1, О. felineus оказался ближе к О. viverrini, а по данным Saijuntha et al. (2008), строивших свой анадиз на последовательностях митохондриального гена nd¡ - ближе к С. sinensis. Мы провели более глубокий анализ с использованием дополнительных локусов (Pm-int9 и HI) и пришли к выводу, что С. sinensis и О. viverrini объединяются в одну ветвь с довольно высокой бутстрепной поддержкой

1 o(j i OvKKTaQ2 21

O. viverrini

S2

• ОХКТаОЗ 21 CsMUPkOI 21

C. sinensis

■— OfNeNkO? 31

íof

O. felineus

Ш 01NeNk02 21

MbNeNkOI 26 M. bU'lS

Рисунок 6. Филогенетическое дерево, построенное по конкатенированным последовательностям ITS2+Pm-int9+Hl методом ME. Цифры означают бугстрепную поддержку соответствующей ветви.

(Рисунок 6). Это говорит в пользу мнения о синонимичности родов Clonorchis и Opisthorchis.

В деревьях, построенных по частичной последовательности митохондриального гена сох], надежно выделялись только ветви, включающие в себя представителей одного вида или группы образцов; связей более высокого уровня выявлено не было. Неожиданным оказалось то, что О. viverrini отличался от О. felineus и С. sinensis сильнее, чем меторхины. Так как эта карина отличалась от ожидаемой, было проведено секвенирование нескольких других митохондриальных локусов (16S+cob+nd4+nd2) общей длиной 1943 пн. На этом наборе данных была выявлена та же закономерность. Такое расхождение генетических расстояний между митохондриальными геномами с взаимоотношениями между данными видами описторхид, полученным по морфологическим признакам и ядерным последовательностям позволяет нам утверждать, что митохондриальные последовательности не отражают филогенетических отношений представителей сем. Opisthorchiidae и не должны быть использован в качестве филогенетического маркера в данном семействе. Этот феномен является результатом особенности эволюции мтДНК в пределах данного семейства, что может быть результатом ускоренной эволюции мтДНК О. viverrini или интрогрессией мтДНК вследствие межвидовой гибридизации.

Взаимоотношения между видами рода Metorchis

Из 14 видов рода Metorchis наиболее часто встречаются и лучше всего изучены М. bilis и М. xanthosomus (Скрябин, Петров, 1950). Мариты этих видов плохо отличимы друг от друга морфологически (Ромашов с соавт., 2003). Так, в работе Pick (2005), посвященной изучению генетического разнообразия М. bilis, среди последовательностей coxl М. bilis была обнаружена одна последовательность М. xanthosomus. Нашей задачей было исследовать образцы представителей рода Metorchis из Новосибирской и Челябинской областей.

MbNeNkOI 23 -MbNeNkOI 23 Ё. MbNeNkOI 22 100 MspMCCh10 22

Metorchis sp.

, MbNeNkOI 25 791 MbNeNkOI 27 -MspVkNo02 21

39

Mbil Pick Mbil FJ423739

M. b ilis

99

Mbil Pauly

MbNeNkOI 24

M6DPCIAENS1B

M. xanthosomus

MbNeNkOI 26 Mxan FJ423740

spOpNkOI 01

Рисунок 7. Филогенетическое дерево, построенное по конкатенированным последовательностям coxl методом ME. Цифры означают бутстрепную поддержку соответствующей ветви.

Среди исследованных образцов были обнаружены на основании высокой степени сходства их последовательностей coxl с последовательностями coxl образцов соответствующих видов из Германии представители видов М. bilis и М. xanthosomus. Но кроме того, последовательности coxl части образцов выделялись на филогенетических деревьях в отдельную ветвь. Можно утверждать, что, судя по генетическим расстояниям между последовательностями сох1, эти образцы могут быть отнесены к другому виду. Таким образом, мы можем утверждать, что нами обнаружен криптический вид рода Metorchis, почти неотличимый от М. bilis и М. xanthosomus.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в ходе работы была проведена реконструкция полных последовательностей митохондриальных геномов О. felineus и С. sinensis и частичной последовательности митохондриального генома

0.viverrini, в которых были идентифицированы все характерные для митохондриальных геномов трематод гены (12 белок-кодирующих генов, 2 гена рРНК и 22 гена тРНК). Было проведено генотипирование собранной коллекции образцов разных видов описторхид по нескольким ядерным и митохондриальным маркерам, что позволило сделать заключения о филогенетических отношениях видов сем. Opisthorchiidae, а также о происхождении популяций О. felineus на территории России.

ВЫВОДЫ

1. Митохондриальные геномы О. felineus, С. sinensis и О. viverrini имеют стандартный для трематод набор генов и порядок их следования,

совпадающий с таковым у F. hepático. Обнаружены альтернативные структуры для TPHK-Ser(AGN) О. felineus, С. sinensis и О. viverrini. Выявлено отсутствие DHU-петли у тРНК-Cys О. felineus, С. sinensis и О. viverrini. Впервые для трематод обнаружено перекрывание стоп-кодона с последующим геном тРНК.

2. В контрольных районах митохондриальных геномов О. felineus и С. sinensis отсутствуют тандемные повторы и шпильки; кроме того, не выявлено сходства нуклеотидных последовательностей некодирукицих регионов этих видов между собой. Это позволяет заключить, что ни консервативные мотивы, ни тандемные повторы, ни особенности вторичной структуры не являются необходимыми для функционирования контрольного региона описторхид.

3. Данные филогенетического анализа подтверждают предположения о синонимичности родов Clonorchis и Opisthorchis.

4. Показано, что схема филогенетических отношений О. viverrini с другими описторхидами, полученная по митохондриальным маркерам, не совпадает с таковой по ядерным маркерам и по морфологическим признакам. Это, предположительно, является следствием ускоренной эволюции мтДНК у данного вида или интрогрессии митохондриального генома от другого вида.

5. При помощи филогенетического анализа наряду с представителями видов М. bilis и М. xanthosomus обнаружен еще один криптический вид рода Metorchis.

6. Анализ изменчивости митохондриальной последовательности, включающей в себя частичную последовательность гена сохЗ, межгенного спейсера и гена tPHK-Hís, у 135 образцов из 13 популяций О. felineus из трех речных систем (Дон, Урал и Обь-Иртышская система) показал отсутствие достоверных различий между этими популяциями. Данные позволяют выдвинуть гипотезу о происхождении популяций О. felineus на территории России от одной небольшой популяции вследствие ее экспансии во время микулинского межпедниковья.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Shekhovtsov S.V., Katokhin A.V., Kolchanov N.A., Mordvinov V.A. The complete mitochondrial genomes of the liver flukes Opisthorchis felineus and Clonorchis sinensis (Trematoda) II Parasitology International. 2010. V. 59. P. 100-103.

2. Shekhovtsov S.V., Katokhin A.V., Romanov K.V., Besprozvannykh V.V, Fedorov K.P. , Yurlova N.I., Serbina E.A., Sithithawom P., Kolchanov N.A., Mordvinov V.A. A novel nuclear marker, Pm-int9, for phylogenetic studies of Opisthorchis felineus, Opisthorchis viverrini, and Clonorchis sinensis (Opisthorchiidae, Trematoda) // Parasitology Research. 2009. V. 106 P. 293297.

3. Катохин А.В., Шеховцов С.В., Konkow S., Юрлова Н.И., Сербина

E.А., Водяницкая С.Н., Федоров К.П., Локтев В.Б., Муратов И.В., Ohyama

F., Махнева Т.В., Пельтек С.Е., Мордвинов В.А. Оценка генетических отличий Opistorchis felineus от Opistorchis viverrini и Clonorchis sinensis no ITS2- и СО 1-последовательностям // Доклады Академии Наук. 2008. Т. 421. №4. С. 549-552.

4. Мордвинов В.А., Марданов А.В., Равин Н.В., Шеховцов С.В., Демаков С.А., Катохин А.В., Колчанов Н.А., Скрябин К.Г. Определение полной нуклеотидной последовательности митохондриального генома возбудителя описторхоза, Opistorchis felineus II Живые системы. № 1. С. 95-100.

5. Патент на изобретение № 2332456. Мордвинов В.А., Катохин А.В., Шеховцов С.В., Пельтек С.Е. Фрагмент FR316 митохондриального гена ndl, предназначенный для выявления возбудителей описторхоза. Приоритет изобретения 05 декабря 2006 г.

6. Шеховцов С.В., Катохин А.В., Конков С., Юрлова Н.И., Сербина Е.А., Водяницкая С.Н., Федоров К.П., Беспрозванных В.В., Охияма Ф., Сититаворн П., Локтев В.Б., Мордвинов В.А. Исследование генетического разнообразия описторхид - О. felineus, О. viverrini, С. sinensis и М. bilis И «Паразитология в XXI веке - проблемы, методы, решения». Том 3. (под ред. К.В.Галактионова и А.А.Добровольского). Санкт-Петербург: «Лема». 2008. С.223-226.

7. Katokhin A., Shekhovtsov S., Konkow S., Yurlova N., Serbina E., Vodianitskaia S., Fedorov K., Besprozvannykh V., Ohyama F., Peltek S., Mordvinov V. Analysis of Opistorchis felineus and Clonorchis sinensis (Trematoda, Digenea, Opisthorchiidae) ITS2 and COl Sequences Variations // XX International Congress of Genetics. Berlin. 2008. p 235.

8. Shekhovtsov S.V., Katokhin A.V., Konkow S., Yurlova N.I., Serbina E.A., Vodianitskaia S.N., Fedorov K.P., Besprozvannykh V.V., Ohyama F., Sithithaworn P., Loktev V.B., Mordvinov V.A. Comparative phylogenetic analysis of opisthorchiid species based on nuclear and mitochondrial sequences // Proceedings Of The Sixth International Conference On Bioinformatics Of Genome Regulation And Structure. 2008. p. 735.

9. Катохин A.B., Шеховцов C.B., Романов K.B., Брусенцов И.И., Юрлова Н.И., Мордвинов В.А. Молекулярно-генетическая филогения видов семейства Opisthorchiidae // Материалы III межрегиональной научной конференции паразитологов Сибири и Дальнего Востока, посвященной 80-летию профессора Константина Петровича Федорова 1520 сентября 2009 г. Новосибирск. 2009. С. 121-123.

10. Шеховцов С.В. Изменчивость митохондриального генома у кошачьей двуустки на территории России // Maxepiam IV М1ждународгел конференицп молодих науковщв «Бюлогия: вщ молекули до бюсфери». Харив. 2009 г. С. 153-154.

Подписано к печати 22.03.2010

Формат бумаги 60 х 90 1/16. Печ. 1. Уч. изд. 0,7

Тираж 110 экз. Заказ 23.

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 10

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шеховцов, Сергей Викторович

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Общая характеристика семейства Opisthorchiidae.

1.2 Биологическая характеристика исследуемых видов.

1.2.1 Развитие в первом промежуточном хозяине.

1.2.2 Развитие во втором промежуточном хозяине.

1.2.3 Развитие в окончательном хозяине.

1.3 Географическое распространение.

1.3.1 Ареал O.felineus.

1.3.2 Ареал С. sinensis.

1.3.3 Ареал О. viverrini.,.,.

1.3.4 Ареалы М. bilis, М. xanthosomus и P. truncatum.

1.4 Морфологическое строение и систематическое положение изучаемых видов.

1.5 Систематическое положение исследуемых видов.

1.5.1 п\сем Opisthorchiinae.

1.5.2 п\сем Metorchiinae.

1.6 Характеристика молекулярных маркеров.

1.7 Характеристика митохондриальных геномов плоских червей.

1.8 Молекулярно-филогенетические исследования описторхид.

1.9 Работы по изучению внутривидовой изменчивости описторхид.

1.10 Филогенетические методы анализа последовательностей.

1.10.1 Методы, основанные на вычислении филогенетических дистанций.

1.10.2 Метод максимальной парсимонии.

1.10.3 Метод максимального правдоподобия.

10.11 Филогеография трематод.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Выделение биологического материала.

2.1.1 Компрессионный метод выделения метацеркарий.

2.1.2 Выделение метацеркарий путем переваривания мышц рыбы в искусственном желудочном соке.

2.1.4 Выделение марит из печени искусственно зараженного хозяина.

2.2 Выделение нуклеиновых кислот.

2.2.1 Выделение ДНК из марит и метацеркарий фенольным методом.

2.2.2 Выделение ДНК из марит и метацеркарий перевариванием протеиназой К.

2.2.3 Выделение ДНК из марит и метацеркарий при помощи гуанидинизотиоцианата.

2.2.4 Выделение плазмидной ДНК.

2.3 Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозных гелях.

2.4 Трансформация плазмидной ДНК в клетки E.coli.

2.5 Подготовка компетентных клеток Е. coli для электропорации.

2.6 Элюция ДНК из агарозного геля.

2.7 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и олигонуклеотиды.

2.8 Компьютерный анализ последовательностей ДНК.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1 Митохондриальные геномы О. felineus, С. sinensis и О. viverrini.

3.2 Филогеография О, felineus.,.

3.3 Филогения видов сем. Opisthorchiidae.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1 Митохондриальные геномы.

4.2 Филогеография O.felineus.

4.3 Филогения видов сем. Opisthorchiidae.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование генетического разнообразия эпидемиологически значимых видов описторхид"

Семейство Opisthorchiidae (кл. Trematoda, тип Platyhelminthes) включает в себя паразитов почти всех классов позвоночных, главным образом млекопитающих и птиц. Тремя представителями этого семейства -Opistorchis felineus, Clonorchis sinensis и О. viverrini — заражены около 30 млн человек в мире (King, Scholtz, 2001) и примерно 300 млн человек находится в группе риска. О. felineus является важным паразитом человека на территории России и республик бывшего СССР - Украины, Белоруссии, Казахстана и стран Прибалтики (Беэр, 2005). С. sinensis поражает людей в Китае, Корее, Японии, Лаосе, Вьетнаме и на Дальнем Востоке России (Посохов, 2004; Lun et al, 2005). О. viverrini распространен в Таиланде, Лаосе, Вьетнаме и Камбодже.

В то время как важность трех вышеупомянутых видов не вызывает сомнения, существуют данные, что в некоторых случаях человека могут поражать ряд других видов описторхид. Pseudamphistomum truncatum считается настолько же патогенным для человека, как и О. felineus (Ромашов с соавт., 2005; Скрябин, Петров, 1950). Есть сообщения, что Metorchis bilis и М. xanthosomus также могут быть опасны для человека (Сидоров, 1983). Это дает некоторым'' авторам основания полагать, что в некоторых географических районах заболеваемость может вызываться сразу несколькими видами опистохид (Ромашов с соавт., 2005), причем особенности симптоматики и лечения смешанных заболеваний пока не известны. •

Как сем. Opisthorchiidae, так и кл. Trematoda в целом с молекулярной точки зрения изучены слабо. Различные представители кл. Trematoda значительно отличаются друг от друга по жизненному циклу, в котором различные стадии трематод могут иметь от одного до четырех хозяев, обычно двух или трех. Стадий размножения тоже несколько: на стадии мариты происходит половое размножение, а подробности размножения спороцисты и редии в деталях неизвестны; по наиболее распространенному мнению оно представляет собой бесполое клональное размножение (Гинецинская, 1968).

Больше всего молекулярных исследований проведено на кровяных двуустках, которые значительно отличаются от прочих трематод, в особенности наличием полового диморфизма (все прочие трематоды гермафродитны). Следующими по количеству работ идут фасциолиды {Fasciola hepatica, Fasciola gigantica и Fasciolopsis buski) и Paragonimus westermani. У первых отсутствует стадия метацеркарии; церкария превращается в адолескарий, который напрямую попадает в окончательного хозяина. У P. westermani вторые промежуточные хозяева - ракообразные, которые отличаются от рыб - вторых промежуточных хозяев описторхид -по тем расстояниям, на которые они способны мигрировать, а, следовательно, эпидемиологически P. westermani и описторхиды могут значительно отличаться.

Описторхиды отличаются от фасциолид и парагонимид не только наличием в жизненном цикле второго промежуточного хозяина, но и иным соотношением плодовитости на бесполой и половой стадиях, что оказывает влияние и на популяционные характеристики. Таким образом, возможно, что для каждой изучаемой группы трематод следует подбирать подходящие именно этой группе генетические маркеры.

До сих пор работы на описторхидах по прямому исследованию изменчивости ДНК не предоставили большого количества информации, главным образом, из-за недостаточной вариабельности используемых маркеров. В этой связи перед исследователями в первую очередь стоит задача подбора маркеров с оптимальной вариабельностью, что является непростой задачей для малоизученных на молекулярном уровне организмов со сложным биологическим циклом.

Наибольшее число исследований меж- и внутривидового разнообразия трематод проводится при использовании последовательностей рибосомального кластера и некоторых митохондриальных генов (coxl, ndl). В то время как единообразие используемых разными авторами маркеров удобно при сравнении результатов разных авторов, у такого подхода есть и недостатки. Эти последовательности могут оказаться недостаточно вариабельными для решения некоторых задач. Кроме того, в ряде случаев использование только одного маркера может привести к неверным выводам (Zhang, Hewitt, 2003). Некоторые авторы рекомендуют использовать маркеры из различных геномов (ядерные и митохондриальные), мультигенный анализ и анализ разных по своей функциональности последовательностей (белок-кодирующие последовательности, интроны, межгенные промежутки).

Одной из главных мишеней для решения филогенетических и филогеографических вопросов у животных является митохондриальный геном. Он содержит набор генов, среди которых белок-кодирующие последовательности, рибосомальные и транспортные РНК, а также некодирующие районы. Это дает возможность для выбора маркеров с разной скоростью эволюции; кроме того, используются и такие структурные признаки, как последовательность и ориентация генов, особенности вторичной структуры функциональных РНК.'

Нашей целью было исследовать меж- и внутривидовое разнообразие описторхид по последовательностям различного происхождения: внутренним транскрибируемым спейсерам рибосомального кластера, экзонным и интронным участкам ■ ядерных4 генов, митохондриальным последовательностям.

Одной из задач, которую предстоит решить молекулярными методами - это ревизия систематики семейства. В настоящее время она основывается на морфологии взрослой стадии; главные проблемы ее - это неопределенность относительного веса признаков. при оценке взаимоотношений видов, большая зависимость морфологии паразита от средовых факторов (вида окончательного хозяина и интенсивности инвазии) и наличие переходных форм у многих признаков (Скрябин, Петров, 1950). Альтернативный подход основывается на морфологии церкарий, которые считаются некоторыми исследователями рекапитуляцией предковых форм (King, S.choltz, 2001); результаты его часто конфликтуют с традиционной систематикой.

Важной задачей является также исследование параметров внутривидовой изменчивости описторхид. Препятствием, тормозящим развитие этих исследований, является недостаток таких работ в целом по классу. Если в случае позвоночных или членистоногих исследователь может сравнить свои данные с данными других авторов по близкородственному виду, то в случае трематод - в лучшем случае с представителем другого семейства или отряда. Работы по изучению внутривидовой изменчивости необходимы для понимания закономерностей эволюции беспозвоночных в целом. Кроме того, эти результаты могут быть важны для понимания эпидемиологии описторхидозов.

Цель и задачи исследования

Основной целью данного исследования было определение меж- и внутривидовой изменчивости ядерной и митохондриальной ДНК О. felineus и близкородственных видов - С. sinensis, О. viverrini, М. bilis и М. xanthosomus.

В работе были поставлены и решены следующие задачи:

1. Определение нуклеотидных последовательностей митохондриальных геномов О. felineus, С. sinensis и О. viverrini и их анализ.

2. Исследование филогенетических взаимоотношений между О. felineus, С. sinensis, О. viverrini, М. bilis, М. xanthosomus и P. triincatum при помощи митохондриальных и ядерных маркеров.

3. Исследование внутривидовой структуры О. felineus на территории России при помощи митохондриальных маркеров.

Научная новизна

Разработаны новые ядерные (9й интрон гена парамиозина и гистон HI) и митохондриальные (сохЗ и atp6) маркеры описторхид. Усовершенствованы системы использования ранее использовавшихся маркеров coxl и ITS2. По данным маркерам получены нуклеотидные последовательности образцов О. felineus, С. sinensis, О. viverrini, М. bilis, М. xanthosomus и P. truncatum и реконструированы филогенетические отношения между этими видами. Впервые проведена реконструкция полных нуклеотидных последовательностей митохондриальных геномов О. felineus и С. sinensis и частичной последовательности митохондриального генома О. viverrini. Проведено масштабное исследование генетической изменчивости О. felineus на молекулярном уровне.

Практическая значимость работы

Полученные нуклеотидные последовательности митохондриальных геномов и ядерных маркеров найдут применение в эпидемиологических исследований в качестве маркеров видов и популяций, а также в медицинских диагностических наборов на основе ДНК.

Благодарности

Автор выражает глубокую благодарность д.б.н. В.А. Мордвинову и академику РАН Н.А. Колчанову за чуткое и внимательное руководство работой. Особые слова благодарности автор выражает к.б.н. А.В. Катохину, S. Konkow и К.П. Романову за неоценимую помощь в выполнении экспериментальных исследований, а также всему коллективу лаборатории функциональной геномики ИЦиГ СО РАН за помощь и советы по выполнению работы. Автор крайне признателен д.б.н. Н.И. Юрловой, к.б.н. Е.А. Сербиной, к.б.н. С.Н. Водяницкой, д.б.н. К.П. Федорову, д.б.н. В.В. Беспрозванных, д.б.н. F. Ohyama, д.б.н. P. Sithithaworn, д.б.н. Б.В. и В.А. Ромашовым, д.б.н. В.Б. Локтеву и д.б.н. О.А. Морозовой за предоставленные образцы описторхид. Автор выражает глубокую благодарность д.б.н. Л.И. Гундериной и д.б.н. Ю.Г. Матушкину за любезно предоставленную возможность воспользоваться их лабораторным оборудованием, а также всех сотрудников Межинститутского Центра Секвенирования СО РАН за проведение капиллярного электрофореза реакции секвенирования и анализ полученных результатов. Автор выражает искреннюю признательность Е.А. Иванкиной, д.б.н. С.А. Демакову, к.б.н. Т.Д. Колесниковой, к.б.н. Н.В. Володько, к.б.н. П.Н. Меныыанову и к.б.н. Ю.Ю. Илинскому за неоценимую помощь и советы по выполнению работы. Отдельно хотелось бы поблагодарить к.б.н. О.Э. Костерина, к.б.н. А.Г. Блинова и к.б.н. Н.С. Юдина за ценные замечания, высказанные при чтении рукописи данной работы.

Публикации

1. Shekhovtsov S.V., Katokhin A.V., Kolchanov N.A., Mordvinov V.A. The complete mitochondrial genomes of the liver flukes Opistorchis felineus and Clonorchis sinensis (Trematoda) // Parasitology International. 2010. V. 59. P. 100103.

2. Shekhovtsov S.V., Katokhin A.V., Romanov K.V., Besprozvannykh V.V, Fedorov K.P. , Yurlova N.I., Serbina E.A., Sithithaworn P., Kolchanov N.A., Mordvinov V.A. A novel nuclear marker, Pm-int9, for phylogenetic studies of Opisthorchis felineus, Opisthorchis viverrini, and Clonorchis sinensis (Opisthorchiidae, Trematoda) // Parasitology Research. 2009. V. 106 P. 293-297.

3. Катохин A.B., Шеховцов C.B., Konkow S., Юрлова Н.И., Сербина E.A., Водяницкая C.H., Федоров К.П., Локтев В.Б., Муратов И.В., Ohyama F., Махнева Т.В., Пельтек С.Е., Мордвинов В.А. Оценка генетических отличий

Opistorchis felineus от Opisthorchis viverrini и Clonorchis sinensis no ITS2- и CO 1-последовательностям // Доклады Академии Наук. 2008. Т. 421. № 4. С. 549-552.

4. Мордвинов В.А., Марданов А.В., Равин Н.В., Шеховцов С.В., емаков С.А., Катохин А.В., Колчанов Н.А., Скрябин К.Г. Определение полной нуклеотидной последовательности митохондриального генома возбудителя описторхоза, Opisthorchis felineus // Живые системы. № 1. С. 95100.

5. Патент на изобретение № 2332456. Мордвинов В.А., Катохин А.В., Шеховцов С.В., Пельтек С.Е. Фрагмент FR316 митохондриального гена ndl, предназначенный для выявления возбудителей описторхоза. Приоритет изобретения 05 декабря 2006 г.

6. Шеховцов С.В., Катохин А.В., Конков С., Юрлова Н.И., Сербина Е.А., Водяницкая С.Н., Федоров К.П., Беспрозванных В.В., Охияма Ф., Сититаворн П., Локтев В.Б., Мордвинов В.А. Исследование генетического разнообразия описторхид - О. felineus, О. viverrini, С. sinensis и М. bilis // «Паразитология в XXI веке - проблемы, методы, решения». Том 3. (под ред. К.В.Галактионова и А.А.Добровольского). Санкт-Петербург: «Лема». 2008. С.223-226.

7. Katokhin A., Shekhovtsov S., Konkow S., Yurlova N., Serbina E., Vodianitskaia S., Fedorov K., Besprozvannykh V., Ohyama F., Peltek S., Mordvinov V. Analysis of Opisthorchis felineus and Clonorchis sinensis (Trematoda, Digenea, Opisthorchiidae) ITS2 and COl Sequences Variations // XX International Congress of Genetics. Berlin. 2008. p 235.

8. Shekhovtsov S.V., Katokhin A.V., Konkow S., Yurlova N.I., Serbina E.A,, Vodianitskaia S.N., Fedorov K.P., Besprozvannykh V.V., Ohyama F., Sithithaworn P., Loktev V.B., Mordvinov V.A. Comparative phylogenetic analysis of opisthorchiid species based on nuclear and mitochondrial sequences // Proceedings Of The Sixth International Conference On Bioinformatics Of Genome Regulation And Structure. 2008. p. 735.

9. Катохин А.В., Шеховцов С.В., Романов К.В., Брусенцов И.И., Юрлова Н.И., Мордвинов В.А. Молекулярно-генетическая филогения видов семейства Opisthorchiidae // Материалы III межрегиональной научной конференции паразитологов Сибири и Дальнего Востока, посвященной 80-летию профессора Константина Петровича Федорова 15-20 сентября 2009 г. Новосибирск. ООО Компания "Талер-Пресс" 2009. С. 121-123.

10. Шеховцов С.В. Изменчивость митохондриального генома у кошачьей двуустки на территории России // Матер1али IV М1ждународши конференицп молодих науковщв «Бюлогия: вщ молекули до бюсфери». Харюв. 2009 г. С. 153-154.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Шеховцов, Сергей Викторович

выводы

1. Митохондриальные геномы О. felineus, С. sinensis и О. viverrini имеют стандартный для трематод набор генов и порядок их следования, совпадающий с таковым у F. hepatica. Обнаружены альтернативные структуры для TPHK-Ser(AGN) О. felineus, С. sinensis и О. viverrini. Выявлено отсутствие DHU-петли у тРНК-Cys О. felineus, С. sinensis и О. viverrini. Впервые для трематод обнаружено перекрывание стоп-кодона с последующим геном тРНК.

2. Обнаружено отсутствие в контрольных районах митохондриальных геномов О. felineus и С. sinensis тандемных повторов и шпильек; кроме того, не выявлено сходства нуклеотидных последовательностей некодирующих регионов этих видов между собой. Это позволяет заключить, что ни консервативные мотивы, ни тандемные повторы, ни особенности вторичной структуры не являются необходимыми для функционирования контрольного региона описторхид.

3. Данные филогенетического анализа подтверждают предположения о синонимичности родов Clonorchis и Opisthorchis.

4. Показано, что схема филогенетических отношений О. viverrini с другими описторхидами, полученная по митохондриальным маркерам, не совпадает с таковой по ядерным маркерам и по морфологическим признакам. Это, предположительно, является следствием ускоренной эволюции мтДНК у данного вида или интрогрессии митохондриального генома от другого вида.

5. При помощи филогенетического анализа наряду с представителями видов М. bilis и М. xanthosomus обнаружен еще один криптический вид рода Metorchis.

6. Анализ изменчивости митохондриальной последовательности, включающей в себя частичную последовательность гена сохЗ, межгенного спейсера и гена TPHK-His, у 123 образцов из 13 популяций О. felineus из трех речных систем (Дон, Урал и Обь-Иртышская система) показал отсутствие достоверных различий между этими популяциями. Данные позволяют выдвинуть гипотезу о происхождении популяций О. felineus на территории России от одной небольшой популяции вследствие ее экспансии во время микулинского межледниковья.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шеховцов, Сергей Викторович, Новосибирск

1. Бэер С.А. Биология возбудителя описторхоза // Москва: Товарищество научных издательств КМК. 2005.336 с.

2. Виноградов Л.И. Циркуляция возбудителя описторхоза (Opisthorchis felineus) в условиях Семипалатинской области // Автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук 1970, Алма-Ата.

3. Динамика ландшафтных компонентов и внутренних морских бассейнов северной Евразии за последние 130000 лет. Атлас-монография. Под ред. А.А. Величко. Москва: ГЕОС. 2002. 296 стр.

4. Кануникова Е.А., Соловых Т.Н. Типизация очагов описторхоза в Оренбуржье // Мед. Паразитология 2007 №3 11-14.

5. Малков С.Н. Описторхоз в бассейнах Вятки и верховья Камы // Ветеринария 1991, Т 4. С. 39-41. .

6. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярной клонирование// Москва: Мир. 1984.

7. Размашкин Д.А. Видовая принадлежность метацеркарий рода Metorchis (Trematoda, Opisthorchiidae) из, рыб. Западной Сибири // Паразитология 1978 Т 12.68-78.

8. Ромашов Б.В. Природно-очаговые гельминтозы в Центральном Черноземье (Воронежская область) // «Паразитология в XXI веке -проблемы, методы, решения». Том 3. (под ред. К.В.Галактионова и А.А.Добровольского). Санкт-Петербург: «Лема». 2008. С. 96-100.

9. Посохов П.С. Клонорхоз в Приамурье // Хабаровск: Издательство Дальневосточного государственного медицинского университета. 2004. 187с. ' . •••

10. Сергиев В.П. Регистрируемая и истинная распространенность паразитарных болезней // Мед. Паразитология 1991 Т 2. 3-5.

11. Сидоров Е.Г. Природная очаговость описторхоза // Алма-Ата: Наука.1983,240с. / , ;,,:,.

12. Скрябин К.И., Петров A.M. Трематоды животных и человека // Т.4 Москва: Наука. 1950.

13. Филимонова JI.B. Таксономический обзор двух подсемейств {Opisthorchiinae Looss, 1899 и Plotnikoviinae Skrjabin,1945) семейства Opisthorchiidae (Looss, 1899) фауны России // в: "Актуальные проблемы паразитологии". Москва: Наука. 2000.

14. Хедрик Ф. Генетика популяций // Москва: Техносфера. 2003. 592 с.

15. Adlard, R. D., Barker, S. C., Blair, D., and Cribb, Т. H. Comparison of the second internal transcribed spacer (ribosomal DNA) form populations and species of Fasciolidae (Digenea) // International Journal for Parasitology. 1993 V.23 P. 423-425.

16. Agatsuma, Т., Arakawa, Y., Iwagami, M., Honzako, Y., Cahayaningsih, U., Kang, S-Y., and Hong, S-J. Molecular evidence of natural hybridization between Fasciola hepatica and F. gigantica II Parasitology International. 2000 V. 49 P. 231-238.

17. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., and Lipman, D. J. Basic local alignment search tool // Journal of Molecular Biology. 1990 V.215 P. 403410.

18. Ando, K., Sithithaworn, P., Nuchjungreed, C., Tesana, S., Srisawangwong,

19. Т., Limviroj, W., and Chinzei, Y. Nucleotide sequence of mitochondrial COI andt 'ribosomal ITSII of Opisthorchis viverrini in Northeast Thailand. // The Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health. 2001 V.32 P. 17-22.

20. Avise, J. C. Phylogeography: The History and Formation of Species. Harvard University Press. 2000.

21. Bailey, T. L. and Gribskov, Й. Combining evidence using p-values: application to sequence homology searches // Bioinformatics. 1998 V. 14 P. 48-55.

22. Beheregaray, L. B. Twenty years of phylogeography: the state of the field and the challenges for the:Southern Hemisphere,// Molecular Ecology. 2008 V.17 P. 3754-3774.

23. Behura, S. K. Molecular marker systems in insects: current trends and future avenues//Molecular Ecology. 2006 V. 15 P. 2087-3113.

24. Benson, G. Tandem repeats finder: a program to analyze DNA sequences // Nucleic Acids Research. 1999 V.27 P. 573-580.

25. Bessho, Y., Ohama, Т., and Osawa, S. Planarian Mitochondria II. The Unique Genetic Code as Deduced from Cytochrome с Oxidase Subunit I Gene Sequences // Journal of Molecular Evolution. .1992 V.34 P. 331-335.

26. Boore, J. L. Animal mitochondrial genomes // Nucleic Acids Research. 1999 V.27 P. 1767-1780.35.: Boore, J. L., Macey, J. R., and Medina, M. Sequencing and Comparing Whole Mitochondrial Genomes of Animals. // Methods in Enzymology 2005. P. 311-348.

27. Braun, M. DieTierischen Parasiten Des Menschen. Leipzig. 1925.

28. Brinkman, F. S. L., Leipe, D. D. Phylogenetic Analysis // Baxevanis, A. D., Ouellette, B. F. F. Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins. 2001. P. 323-358.

29. Brown, W. M., George, M., and Wilson, A. C. Rapid evolution of animal mitochondrial DNA // Proceedings of the National Academic Society. 1979 V.76 P. 1967-1979. ■

30. Brunhoff, C., Galbreath, К. E., Fedorov, V. В., Cook, J. A., and Jaarola, M. Holarctic phylogeography of the* root vole (Microtus oeconomus): implications for late Quaternary biogeography of high latitudes // Molecular Ecology. 2003 V.12 P. 957-968.

31. Chenuil, A. Choosing the right molecular genetic markers for studying biodiversity: from molecular evolution to practical aspects // Genetica. 2006 V.127 P. 101-120.

32. Cho, P. Y., Lee, M. J., Kim, Т. I., Kang, S., and Hong, S. Expressed sequence tag analysis of adult Clonorchis sinensis, the Chinese liver fluke // Parasitology Research. 2006 V.99 P. 602-608.

33. Cho, P. Y., Kim, Т. I., Whang, S. M., and Hong, S. Gene expression profile of Clonorchis sinensis metacercariae // Parasitology Research. 2007 V.

34. Cho, S-H., Lee, K-Y., Lee, B-C., Cho, P. Y., Cheun, H-I., Hong, S-T., Sohn, W-M., and Kim, T-S. Prevalence of Clonorchiasis in Southern Endemic Areas of Korea in 2006 // Korean Journal of Parasitology. 2008 V.46 P. 133-137.

35. Choi, В. I., Han, J. K., Hong, S. Т., and Lee, К. H. Clonorchiasis and Cholangiocarcinoma: Etiologic Relationship and Imaging Diagnosis // Clinical Microbiology Reviews. 2004 V.l7 P. 540-552.

36. Coleman, A. W. Pan-eukaryote ITS2 homologies revealed by RNA secondary structure // Nucleic Acids Research. 2007 V.35 P. 3322-3329.

37. Curtis, J., Fraga, L. A., De Souza, C. P., Correa-Oliveira, R., and Minchella, D. J. Widespread heteroplasmy in schistosomes makes an mtVNTR marker "nearsighted" // Journal of Heredity. 2001 V.92 P. 248-253.

38. Davidova, M., Ondrackova, M., Jurajda, P., and Gelnar, M. Parasite assemblages of European bitterling (Rhodeus amarus), composition and effects of habitat type and host body size // Parasitology Research. 2007 V.102 P. 10011011.

39. Denver, D. R., Morris, K., Lynch, M., Vassilieva, L. L., and Thomas, W. K. High direct estimate of the mutation rate in the mitochondrial genome of Caenorhabditis elegans I I Science. 2000 V.289 P. 2342-2344.

40. Despres, L., Imbert-Establet, D., Combes, C., Bonhomme, F., and Monnerot, M. Isolation and polymorphism in mitochondrial DNA from Schistosoma mansoni //Molecular and Biochemical Parasitology. 1991 V.47 P. 139-142.

41. Ellegren, H. Microsatellites: simple sequences with complex evolution I I Nature Reviews Genetics. 2004 V.5 P. 435-445.

42. Erhardt, A., Germer, W. D., and Hoerning, B. Die Opisthorchiasis, hervorgerufen durch den Katzenleberegel Opisthorchis felineus (Riv.). Jena , Veb Gustav Fischer Verlag. 1962.

43. Fedorov, V. В., Goropashnaya, A. V., Jaarola, M., and Cook, J. A. Phylogeography of lemmings (Lemmus): no evidence for postglacial colonization of Arctic from the Beringian refugium // Molecular Ecology. 2003 Y.12 P. 725731.

44. Fedorov, V. В., Goropashnaya, A. V., Boeskorov, G. G., and Cook, J. A. Comparative phylogeography and demographic history of the wood lemming

45. Myopus schisticolor): implications for late Quaternary history of the taiga species in Eurasia I I Molecular Ecology. 2008 V.17 P. 598-610.

46. Goropashnaya, A. V., Fedorov, V. В., Seifert, В., and Pamilo, P. Limited phylogeographical structure across Eurasia in two red wood ant species Formicapratensis and F. lugubris (Hymenoptera, Formicidae) // Molecular Ecology. 2004 V.13P. 1849-1858.

47. Gyllensten, U., Wharton, D., Josefsson, A., and Wilson, A. C. Paternal inheritance of mitochondrial DNA in mice //Nature. 1991 V.352 P. 255-257.

48. Haynes, S., Jaarola, M., and Searle, J. B. Phylogeography of the common vole (Microtus arvalis) with particular emphasis on the colonization of the Orkney archipelago I I Molecular Ecology. 2003 V.12 P. 951-956.

49. Iwagami, M., Ho, L. Y., Su, K., Lai, P. F., Fukushima, M., Nakano, M., Blair, D., Kawashima, K., and Agatsuma, T. Molecular phylogeographic studies on Paragonimus westermani in Asia // Journal of Helminthology. 2000 V.74 P. 315322.

50. Iwagami, M., Rajapakse, R. P. V. J., Paranagama, W., and Agatsuma, T. Identities of two Paragonimus species from Sri Lanka inferred from molecular sequences // Journal of Helminthology. 2003 V.77 P. 239-245.

51. Iwagami, M., Rajapakse, R. P. V. J., Paranagama, W., Okada, T., Kano, S., and Agatsuma, T. Ancient divergence of Paragonimus westermani in Sri Lanka // Parasitology Research. 2007 V.102 P. 845-852.

52. Jannotti-Passos, L. K., Souza, C. P., Parra, J. C., and Simpson, A. J. G. Biparental Mitochondrial Dna Inheritance In The Parasitic Trematode Schistosoma Mansoni II Journal of Parasitology. 2001 V.87 P. 79-82.

53. Jeon, H.-K., Kim, K.-H., and Eom, K. S. Complete sequence of the mitochondrial genome of Taenia saginata: Comparison with T. solium and T. asiatica II Parasitology International. 2007 V.56 P. 243-246.

54. Johnston, D. A., Blaxter, M. L., Degrave, W. M., Foster, J., Ivens, A. C., and Melville, S. E. Genomics and the biology of parasites // BioEssays. 1999 V.21 P. 131-147.

55. Kaewkes, S. Taxonomy and biology of liver flukes // Acta Tropica. 2003 V.83 P. 177-186.

56. Kaewpitoon, N., Kaeqpitoon, S. J., and Pengsaa, P. Opisthorchiasis in Thailand: Review and current status // World Journal of Gastroenterology. 2008 V.14P. 2297-2302.

57. King, S. and Scholz, T. Trematodes of the family Opisthorchiidae: a minireview // The Korean Journal of Parasitology. 2001 V.39 P. 209-221.

58. Kondo, R., Satta, Y., Matsuura, E. Т., Ishiwa, H., Takahata, N., and Chigusa, S. I. Incomplete maternal transmission of mitochondrial DNA in Drosophila// Genetics. 1990 V.126 P. 657-663.

59. Kotlan, A. Helminthologie. Budapest. 1960.

60. Krone, O., Sternberg, Т., Kenntner, N., Tataruch, F., Koivusaari, J., and Nuuja, I. Mortality factors, helminth burden, and contaminant residues in whitetailed sea eagles (Haliaeetus albicilla) from Finland // Ambio. 2006 V.35 P. 98104.

61. Kvist, L., Martens, J., Ahola, A., and Orell, M. Phylogeography of a Palaearctic sedentary passerine, the willow tit (Parus montanus) II Journal of Evolutionary Biology. 2001 V.14 P. 930-941.

62. Kvist, L., Martens, J., Nazarenko, A. A., and Orell, M. Paternal leakage of mitochondrial DNA in the great tit (Parus major) // Molecular Biology and Evolution. 2003 V.20 P. 243-247.

63. Kvist, L., Martens, J., Higuchi, H., Nazarenko, A. A., Valchuk, O. P., and Orell, M. Evolution and genetic structure of the great tit (Parus major ) complex // Proceedings of the Royal Society of London B. 2003 V.270 P. 1447 -1454.

64. Ladoukakis, E. D. and Zouros, E. Direct evidence for homologous recombination in Mussel (Mytilus galloprovincialis) mitochondrial DNA // Molecular Biology and Evolution. 2001 V.18 P. 1168-1175.

65. Laha, Т., Pinlaor, P., Mulvenna, J., Sripa, В., Sripa, M., Smout, M. J., Gasser, R. В., Brindley, P. J., and Loukas, A. Gene discovery for the carcinogenic human liver fluke, Opisthorchis viverrini II BMC Genomics. 2007 V.8 P.

66. Le, Т. H., Blair, D., and McManus, D. P. Mitochondrial DNA sequences of human schistosomes: the current status // International Journal for Parasitology. 2000 V.30 P. 283-290.

67. Le, Т. H., Blair, D., and McManus, D. P. Complete DNA sequence and gene organization of the mitochondrial genome of the liver fluke, Fasciola hepatica L. (Platyhelminthes; Trematoda)//Parasitology. 2001 V.123 P. 609-621.

68. Le, Т. H., Blair, D., and McManus, D. P. A leucine zipper protein of mitochondrial origin // Biochimica et Biophysica Acta. 2001 V.1546 P. 435-443.

69. Le, Т. H., Blair, D., and McManus, D. P. Mitochondrial genomes of parasitic flatworms // Trends in Parasitology. 2002 V.18 P. 206-213.

70. Le, Т. H., McManus, D. P., and Blair, D. Codon usage and bias in mitochondrial genomes of parasitic platyhelminthes // Korean Journal of Parasitology. 2004 V.42 P. 159-167.

71. Lee, S-U. and Huh, S. Variation of nuclear and mitochondrial DNAs in Korean and Chinese isolates of Clonorchis sinensis I I Korean Journal of Parasitology. 2004 V.42 P. 145-148.

72. Lee, S-U., Chun, H-C., and Huh, S. Molecular phylogeny of parasitic Platyhelminthes based on sequences of partial 28 S rDNA D1 and mitochondrial cytochrome с oxidase subunit I // Korean Journal of Parasitology. 2007 V.45 P. 181-189.

73. Li, Y,-C., Korol, А. В., Fahima, Т., Beiles, A., and Nevo, E. Microsatellites: genomic distribution, putative functions and mutational mechanisms: a review // Molecular Ecology. 2002 V.ll P. 2453-2465.

74. Lis, J. T. and Schleif, R. Size fractionation of double-stranded DNA by precipitation with polyethylene glycol // Nucleic Acids Research. 1975 V.2 P. 383389.

75. Littlewood, D. T. J., Rohde, K., and Clough, K. A. The interrelationships of all major groups of Platyhelminthes: phylogenetic evidence from morphology and molecules // Biological Journal of the Linnean Society. 1999 V.66 P. 75-114.

76. Lowe, Т. M. and Eddy, S. R. tRNAscan-SE: a program for improved detection of transfer RNA genes in genomic sequence // Nucleic Acids Research. 1997 V.25 P. 955-964.

77. Lun, Z., Gasser, R. В., Lai, D., Li, A., Zhu, X., Yu, X., and Fang, Y. Clonorchiasis: a key foodborne zoonosis in China // Lancet Infectious Diseases. 2005 V.5 P. 31-41.

78. Lee, S-U. and Huh, S. Variation of nuclear and mitochondrial DNAs in Korean and Chinese isolates of Clonorchis sinensis II The Korean Journal of Parasitology. 2004 V.42 P. 145-148.

79. McManus, D. P., Le, Т. H., and Blair, D. Genomics of parasitic flatworms // International Journal for Parasitology. 2004 V.34 P. 153-158.

80. Morgan, J. A. T, Dejong, R. J., Adeoye, G. O., Ansa, E. D. O., Barbosa, C. S., Bremond, P., Cesari, I. M., Charbonell, N., Correa, L. G., Coulibaly, G.,

81. Mueller, В., Schmidt, J., and Mehlhorn, H. Sensitive and species-specific detection of Clonorchis sinensis by PCR in infected snails and fishes // Parasitology Research. 2006.

82. Nakao, M., Abmed, D., Yamasaki, H., and Ito, A. Mitochondrial genomes of the human broad tapeworms Diphyllobothrium latum and Diphyllobothrium nihonkaiense (Cesfoda: Diphyllobothriidae) // Parasitology Research. 2006 V.

83. Oliveira, P., Pires, M. A., Rodrigues, P., Ginja, M., Pires, M. J., Pires, I., Cardoso, L., Antunes, L., and Rodrigues, M. Opisthorchis felineus in cat: case report // Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. 2005 V.57 P. 556-558.

84. Oshida, Т., Abramov, A., Yanagawa, H., and Masuda, R. Phylogeography of the Russian flying squirrel (.Pteromys volans): implication of refugia theory in arboreal small mammal of Eurasia // Molecular Ecology. 2005 V.14 P. 1191-1196.

85. Park, G-M. Genetic comparison of liver flukes, Clonorchis sinensis and Opisthorchis viverrini, based on rDNA and mtDNA gene sequences // Parasitology Research. 2006 V.100 P. 351-357.

86. Pavlova, A., Zink, R. M., Drovetski, S., and Rohwer, S. Pleistocene evolution of closely related sand martins Riparia riparia and R. diluta II Molecular Phylogenetics and Evolution. 2008 V.48 P. 61-73.

87. Репа, H. В., De Souza, C. P., Simpson, A. J., and Pena, S. D. Intracellular promiscuity in Schistosoma mansoni nuclear transcribed DNA sequences are part of a mitochondrial minisatellite region I I Proceedings of the National Academic

88. Society. 1995 V.92 P. 915-919.iii

89. Perez, Т., Albornoz, J., and Dominguez, A. An evaluation of RAPD fragment reproducibility and nature // Molecular Ecology. 1998 V.7 P. 1347-1357.

90. Pick, D. Untersuchungen zur Praevalenz und Phylogenie des Leberegels Metorchis sp. in piscivoren Voegeln. Universitaet Rostock. 2005.

91. Posada, D. and Crandall, K. A. MODELTEST: testing the model of DNA substitution//Bioinformatics. 1998 V.14P. 817-818.

92. Robin, E. D. and Wong, R. Mitochondrial DNA Molecules and Virtual Number of Mitochondria per Cell in Mammalian Cells // Journal of Cellular Physiology. 1998 V.136 P. 507-513.

93. Rozas, J., Sanchez-DelBarrio, J. C., Messeguer, X., and Rozas, R. DnaSP, DNA polymorphism analyses by the coalescent and other methods // Bioinformatics. 2003 V. 19 P. 2496-2497.

94. Rozen, S. and Skaletsky, H. J. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers // Krawetz, S. and Misener, S. Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Totowa, NJ, Humana Press. 2000. P. 365-386.

95. Rychlik, W. and Rhoads, R. E. A computer program for choosing optimal oligonucleotides for filter hybridization, sequencing and in vitro amplification of DNA //Nucleic Acids Research. 1989 V.17 P. 8543-8551.

96. Saeed, I., Maddox-Hyttel, C., Monrad, J., and Kapel, С. M. O. Helminths of red foxes (Vulpes vulpes) in Denmark I I Veterinary Parasitology. 2006 V.139 P. 168-179.

97. Schwartz, M and Vissing, J. Parental inheritance of mitochondrial DNA // The New England Journal of Medicine. 2000 V.347 P. 576-580.

98. Selig, C., Wolf, M., Muller, Т., Dandekar, Т., and Schultz, J. The ITS2 Database II: homology modelling structure for molecular systematics // Nucleic Acids Research. 2008 V.36 P. D337-D380.

99. Semyenova, S. K., Morozova, E. V., Chrisanfova, G. G., Gorokhov, V. V., Arkhipov, I. A., Moskvin, A. S., Movsessyan, S. O., and Ryskov, A. P. Genetic differentiation in eastern european and western asian populations of the liver fluke,

100. Fasciola hepatica, as revealed by mitochondrial nadl and coxl genes // Journal of Parasitology. 2006 V.92 P. 525-530.

101. Shimalov, V. V. and Shimalov, V. T. Helminth fauna of the wolf (Canis lupus Linnaeus, 1758) in Belorussian Polesie // Parasitology Research. 2000 V.86 P. 163-164.

102. Shimalov, V. V. and Shimalov, V. T. Helminth fauna of the American mink (Mustela vison Schreber, 1777) in Belorussian Polesie // Parasitology Research. 2001 V.87P. 886-887.

103. Shimalov, V. V. and Shimalov, V. T. Helminth fauna of the red fox (Vulpes vulpes Linnaeus, 1758) in southern Belarus // Parasitology Research. 2003 V.89 P. 77-78.

104. Shrivastava, J., Qian, B. Z., McVean, G., and Webster, J. P. An insight into the genetic variation of Schistosoma japonicum in mainland China using DNA microsatellite markers // Molecular Ecology. 2005 V.14 P. 839-849.

105. Shustov, A. V., Kotelkin, А. Т., Sorokin, A. V., Ternovoi, V. A., and Loktev, V. B. The Opisthorchis felineus paramyosin: cDNA sequence and characterization of its recombinant fragment // Parasitology Research. 2002 V.88 P. 724-730.

106. Sripa, В., Kaewkes, S., Sithithaworn, P., Mairiang, E., Laha, Т., Smout, M., Pairojkul, C., Bhudhisawasdi, V., Tesana, S., Bethony, J. M., Loukas, A., and Brindley, P. J. Liver Fluke Induces Cholangiocarcinoma // PLoS Medicine. 2007 V.4P. 1148-1155.

107. Stothard, P. The Sequence Manipulation Suite: JavaScript programs for analyzing and formatting protein and DNA sequences // Biotechniques. 2000 V.28 P. 1102-1104.

108. Swofford, D. L. PAUP*. Phylogenetic Analysis Using Parsimony (* and Other Methods). Sinauer Associates, Sunderland MA. 2002.

109. Tamura, K., Dudley, J., Nei, M., and Kumar, S. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0 // Molecular Biology and Evolution. 2007 V.24 P. 1596-1599.

110. Tatusova, T. A. and Madden, T. L. Blast 2 sequences a new tool for comparing protein and nucleotide sequences // FEMS Microbiology Letters. 1999 V.174P. 247-250.

111. Telford, M. J., Herniou, E. A., Russel, R. В., and Littlewood, D. T. J. Changes in mitochondrial genetic codes as phylogenetic characters: Two examples from the flatworms // Proceedings of the National Academic Society. 2000 V.97 P. 11359-11364.

112. Thaenkham, U., Visetsuk, K., Dung, D. Т., and Waikagul, J. Discrimination of Opisthorchis viverrini from Haplorchis taichui using COI sequence marker // Acta Tropica. 2007 V.103 P. 26-32.

113. Thompson, J. D., Higgins, D. G., and Gibson, T. J. ClustalW: Improving the sensitivity of penalties and weight matrix choice // Nucleic Acids Research. 2004 V.22 P. 4673-4680.

114. Thyagarajan, В., Padua, R. A., and Campbell, C. Mammalian mitochondria possess homologous DNA recombination activity // Journal of Biological Chemistry. 1996 V.271 P. 27536-27543.

115. Tsaousis, A. D, Martin, D. P., Ladoukakis, E. D., Posada, D., and Zouros, E. Widespread recombination in published animal mtDNA sequences // Molecular Biology and Evolution. 2005 V.22 P. 925 -933.

116. Upatham, E. S. and Viyanant, V. Opisthorchis viverrini and opisthorchiasis: a historical review and future perspective I I Acta Tropica. 2003 V.88 P. 171-176.

117. Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans, M., van de Lee, Т., Homes, M., Frijters, A., Pot, J., Peleman, J., Kuiper, M., and Zabeau, M. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting // Nucleic Acids Research. 1995 V.23 P. 44074414.

118. Wernersson, R. Virtual Ribosome a comprehensive DNA translation tool with support for integration of sequence feature annotation // Nucleic Acids Research. 2006 V.34 P. W385-W388.

119. Wiley, E. O. Phylogenetics: the theory and practice of phylogenetic systematics. 1981.

120. Zane, L., Bargeloni, L., and Patarnello, T. Strategies for microsatellite isolation: a review // Molecular Ecology. 2002 V.l 1 P. 1-16.

121. Zhang, D.-X. and Hewitt, G. M. Nuclear DNA analyses in genetic studies of populations: practice, problems and prospects // Molecular Ecology. 2003 V.12 P. 563-584.

122. Zink, R. M., Rohwer, S., Drovetski, S., Blackwell-Rago, R. C., and Farrell, S. L. Holarctic phylogeography and species limits of three-toed woodpeckers // Condor. 2002 V.104 P. 167-170.

123. Zink, R. M., Drovetski, S., and Rohwer, S. Phylogeographic patterns in the great spotted woodpecker Dendrocopos major across Eurasia // Journal of Avian Biology. 2002 V.33 P. 175-178.