Исследование функциональной роли специфических и неспецифических взаимодействий РНК-полимеразы Escherichia coli с ДНК на разных стадиях транскрипции

Пупов, Данил Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование функциональной роли специфических и неспецифических взаимодействий РНК-полимеразы Escherichia coli с ДНК на разных стадиях транскрипции
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование функциональной роли специфических и неспецифических взаимодействий РНК-полимеразы Escherichia coli с ДНК на разных стадиях транскрипции"

На правах рукописи

ИИЧ01 / ¿А

ПУПОВ ДАНИЛ ВЛАДИМИРОВИЧ

Исследование функциональной роли специфических и неспецифических взаимодействий РНК-иолимеразы Escherichia coli с ДНК на разных стадиях транскрипции

Специальность 03.01.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- s ДЕК ?П10

Москва-2010

004616234

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов Учреждения Российской академии наук Института молекулярной генетики РАН (Москва) и на Кафедре молекулярной биологии Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова.

Научные руководители:

Академик РАН, доктор биологических наук, профессор Гвоздев Владимир Алексеевич

Доктор биологических наук Кульбачинский Андрей Владимирович

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Патрушев Лев Иванович

Доктор химических наук Туницкая Вера Леонидовна

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт белка РАН

Защита состоится "2М декабря 2010 года в I1 часов на заседании диссертационного совета Д.500.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119992 Россия, Москва, Воробьевы горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского, ауд. 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова

Автореферат разослан «_» ноября 2010"

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

ДНК-зависимая РНК-полимераза (РНКП) - главный фермент, осуществляющий процесс транскрипции генетического материала в клетках всех живых организмов. Процесс транскрипции включает три основные стадии: инициацию, элонгацию и терминацию, которые сопровождаются сложными структурными перестройками транскрипционного комплекса и изменениями контактов РНКП с ДНК-матрицей. РНКП является эволюционно консервативным ферментом, структура которого сходна у всех изученных прокариот и эукариот. Однако, кор-фермент РНКП не способен самостоятельно узнавать последовательность промотора - для этого необходимо наличие а-субъединицы, которая диссоциирует из комплекса с ферментом после его перехода к элонгации. В последние годы понимание тонких молекулярных механизмов функционирования РНКП стало возможным благодаря успехам в расшифровке пространственной структуры РНКП термофильных бактерий Thermus aquaticus и Thermus thermophilus и РНКП II Saccharomyces cerevisiae, а также частичных структур элонгационных комплексов этих РНКП. Имеющиеся на сегодняшний день данные позволяют утверждать, что молекулярные механизмы разных стадий синтеза РНК РНК-полимеразой очень похожи у бактерий и у эукариот. Благодаря более простому строению, бактериальная РНКП может служить удобной моделью для изучения фундаментальных механизмов транскрипции и ее регуляции.

Каталитически активный кор-фермент бактериальной РНКП представляет собой комплекс из пяти субъединиц (a2ßß'w); две наиболее крупные субъединицы - ß и ß', -образуют активный центр, расположенный в глубине главного канала РНКП, и принимают участие в формировании основных контактов РНКП с ДНК и РНК, которые в процессе транскрипции располагаются внутри главного канала. Инициация транскрипции осуществляется холоферментом РНКП, который содержит дополнительную с-субъединицу, необходимую для узнавания промоторов и плавления ДНК вокруг стартовой точки транскрипции; большинство промоторов узнается при участии так называемой главной а-субъединицы. В ходе инициации РНКП может синтезировать короткие абортивные РНК-продукты, оставаясь при этом прочно связанной с промотором. Переход к синтезу полноразмерных РНК сопровождается диссоциацией а-субъединицы из транскрипицонного комплекса. Элонгационный комплекс РНКП характеризуется очень высокой стабильностью, что является необходимым условием для обеспечения процессивности работы фермента, позволяя РНКП оставаться связанной с ДНК и РНК в течение всего процесса элонгации. Таким образом, эффективный и точный синтез РНК обеспечивается сложными динамическими взаимодействиями РНКП с нуклеиновыми кислотами.

Анализ пространственной структуры РНКП позволил предположить, какие домены фермента ответственны за узнавание промоторов, плавление ДНК, уход РНКП с промотора и стабилизацию промоторных и элонгационных комплексов. В то же время, функции большинства из этих районов РНКП в процессе транскрипции и ее регуляции детально не изучены. Сделанные на основе структурного анализа предположения о роли различных доменов РНКП во взаимодействиях с ДНК требуют экспериментальной проверки. Структура РНКП Escherichia coli, которая лучше всего изучена биохимическими и генетическими методами, остается неизвестной. Кроме того, неизвестна пространственная структура промоторных комплексов бактериальной РНКП. В связи в этим, в настоящее время назрела необходимость поиска новых подходов к изучению механизмов взаимодействий РНКП с ДНК на разных стадиях

транскрипции. Одним из таких подходов может являться анализ ДНК-аптамеров, специфически узнаваемых РНКП, который может быть использован для изучения механизмов РНКП-ДНК взаимодействий на разных стадиях транскрипции, в том числе, специфических взаимодействий с промоторами.

Сравнение пространственных структур РНКП в различных состояниях выявило несколько подвижных доменов в (5- и Р'-субъединицах (в частности, домен Р'-с1атр, «зажим»), которые способны занимать различное положение на разных стадиях транскрипции и участвовать в контактах с ДНК. Было предположено, что Р'-с1атр играет основную роль в стабилизации транскрипционных комплексов, за счет «закрывания» переднего дуплекса ДНК и ДНК-РНК-гибрида внутри главного канала РНКП. Домен Р'-с1атр соединяется с основным телом РНКП через несколько подвижных «шарниров» (так называемые Бш^сЬ-районы), наиболее консервативным из которых является район P'-switch2 (Я\А/2), который напрямую контактирует с матричной цепью ДНК в районе активного центра фермента. В холоферменте РНКП район SW2 взаимодействует с районом 3.2 о-субъединицы, который, в свою очередь, участвует в связывании инициаторных нуклеотидов и в уходе РНКП с промотора в процессе инициации. Это позволяет предполагать, что может также играть роль в инициации транскрипции. Рядом с районом Б\У2 находится участок связывания важнейшего ингибитора бактериальной РНКП - антибиотика рифампицина, однако, возможное участие района в подавлении активности РНКП рифампицином

остается неизвестным. Таким образом, детальное исследование функциональной роли района должно дать важную информацию о механизмах инициации и элонгации транскрипции РНКП.

В ходе элонгации транскрипции РНКП может совершать временные остановки (паузы), которые могут быть вызваны наличием в ДНК особых регуляторных сигналов. Транскрипционные паузы имеют важное значение для регуляции работы оперонов прокариот, а также многих генов эукариот. В настоящее время предложено несколько различных моделей образования таких пауз, но молекулярные механизмы узнавания сигналов пауз РНКП во многом остаются неисследованными. Предположительно, узнавание некоторых типов сигналов может происходить в результате контактов нематричной цепи ДНК с РНКП. Точное положение нематричной цепи ДНК в транскрипционных комплексах неизвестно, но моделирование показывает, что в области активного центра она должна контактировать с районом р-йэгк-1оор2 (РЬ2) р-субъединицы РНКП. Таким образом, исследование функциональной роли района ¥Ь2 на разных стадиях транскрипции, в том числе, при взаимодействии с промоторами и при узнавании сигналов пауз, позволит более детально понять некоторые принципы регуляции транкрипции и вклад в них специфических взаимодействий РНКП с нематричной цепью ДНК.

Важно подчеркнуть, что понимание детальных механизмов транскрипции и ее регуляции представляет не только фундаментальный интерес, но и имеет важнейшее практическое значение. РНКП является одной из привлекательных мишеней для создания новых антибиотиков, которые могут применятся для терапии широкого спектра инфекционных заболеваний человека и животных. Детальное изучение функциональной роли районов РНКП, взаимодействующих с ДНК, и механизмов работы известных ингибиторов РНКП необходимо для разработки новых методов подавления активности РНКП и получения новых антибиотиков.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы являлось исследование функциональной роли специфических и неспецифических взаимодействий бактериальной РНКП Escherichia coli с ДНК на разных стадиях транскрипции: при узнавании и плавлении промоторов, инициации и элонгации синтеза РНК. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи.

1. Охарактеризовать одноцепочечные ДНК-аптамеры, специфически взаимодействующие с холоферментом РНКП Е. coli. Получить искусственные промоторы на основе аптамеров и определить, какие элементы последовательности ДНК являются необходимыми для инициации транскрипции.

2. Изучить функциональную роль участков РНКП ß'-switch2 и ß-fork-loop2, взаимодействующих с матричной и нематричной цепями ДНК в районе активного центра фермента, на разных стадиях транскрипции: в образовании промоторных комплексов, связывании инициаторных нуклеотидов, уходе РНКП с промотора, элонгации синтеза РНК и узнавании регуляторных сигналов на стадии элонгации.

Научная новизна и практическая значимость работы

В работе впервые охарактеризованы ДНК-аптамеры, специфически взаимодействующие с холоферментом бактериальной РНКП. На основе аптамеров получены искусственные однонитевые транскрипционные матрицы; идентифицированы элементы в последовательности аптамеров, которые являются необходимыми для инициации транскрипции. Получены новые данные о функциональной роли контактов района ß'-switch2 РНКП с матричной цепью ДНК в области активного центра на разных стадиях транскрипции. Впервые показано, что мутации в районе ß'-switch2 РНКП приводят к серьезным нарушениям в инициации транскрипции, в том числе, к ухудшению связывания инициаторных нуклеотидов, снижению стабильности промоторных комплексов, нарушениям в плавлении ДНК в ходе инициации и к снижению эффективности ухода РНКП с промотора. Кроме того, установлено, что район ß'-switch2 играет важную роль в стабилизации транскрипционных комплексов. Показано, что антибиотик рифампицин и мутации в районе ß'-switch2 оказывают сходное влияние на связывание инициаторных нуклеотидов в активном центре РНКП, что указывает на возможную роль района ß'-switch2 в подавлении транскрипции рифампицином. Впервые изучены эффекты мутаций в районе ß-fork-loop2 РНКП, предположительно контактирующем с нематричной цепью ДНК в области активного центра РНКП, на разных стадиях транскрипции. Установлено, что мутации в районе ß-fork-loop2 влияют на стабильность промоторных коплексов и уход РНКП с промотора. Впервые показано, что возникновение транскрипционных пауз может быть связано с образованием специфических контактов района ß-fork-loop2 РНКП с нематричной цепью ДНК.

Полученные в работе данные существенно расширяют имеющиеся представления о структуре и функциональной роли контактов РНКП с ДНК на разных стадиях транскрипции. Результаты работы могут быть использованы для создания модельных систем для структурных исследований транскрипционных комплексов и разработки новых ингибиторов бактериальной РНКП.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на следующих семинарах, конференциях и симпозиумах: VII Международной конференции по биоинформатике «Структура и регуляция генома» (Новосибирск, Россия, 2010), 14 Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Пущино, Россия, 2010), Французско-Российском научном семинаре «Транскрипция - от основных механизмов к созданию лекарств» (Монпелье, Франция, 2009), 2-ом Международном форуме по нанотехнологиям (Москва, 2009), 1-м Международном форуме по нанотехнологиям (Москва, 2008), XX Международном генетическом конгрессе (Берлин, Германия, 2008), IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, 2008).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них 2 — статьи в рецензируемых научных изданиях, 6 - материалы международных и всероссийских конференций и симпозиумов.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и

списка цитируемой литературы. Работа изложена на_ страницах машинописного

текста и содержит_рисунков и _таблиц.

Библиография включает_названия.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Исследование одноцепочечных ДНК-аптамеров к холоферменту РНКП и получение промоторов на их основе

Изучение механизмов узнавания промоторов холоферментом бактериальной РНКП позволило выявить несколько основных консервативных элементов промоторов, узнаваемых при участии главной а-субъединицы (рис. 1 А) (Gross et al., 1998; Haugen et al., 2008):

1) -10 элемент (консенсусная последовательность TATAAT), в узнавании которого участвуют консервативные районы 2.3 и 2.4 а-субъединицы, -располагается на расстоянии примерно 5-7 п.н. от старта транскрипции;

2) -35 элемент (TTGACA), узнаваемый районом 4.2 а-субъединицы, -располагается на расстоянии 16-18 п.н. от -10 элемента;

3) TG-элемент, узнаваемый районом 2.5 а-субъединицы, - располагается на расстоянии 1 п.н. от -10 элемента.

Пространственная структура промоторных комплексов РНКП и детали специфических взаимодействий РНКП с промоторными элементами остаются неизвестны, в частности, из-за больших размеров и сложного многостадийного механизма образования промоторного комплекса. Это делает актуальным поиск новых модельных систем для изучения механизма инициации транскрипции.

Первая часть данной работы была посвящена характеристике новых олигонуклеотидных лигандов к холоферменту бактериальной РНКП - однонитевых ДНК-аптамеров. Аптамеры - это олигонуклеотидные последовательности, специфически взаимодействующие с белком-мишенью, которые получают при помощи отбора in vitro из комбинаторных библиотек последовательностей. Аптамеры к ДНК-связывающим белкам, к которым относится РНКП, обычно взаимодействуют с природными сайтами связывания нуклеиновых кислот, что позволяет использовать аптамеры для анализа специфичности ДНК-белковых взаимодействий и для исследования структуры районов белковой молекулы, участвующих в связывании нуклеиновых кислот. Кроме того, так как комплексы аптамеров с белками-мишенями очень стабильны и специфичны, они могут использоваться для кристаллизации с последующим анализом трехмерной структуры. Таким образом, анализ аптамеров к холоферменту РНКП должен дать важную информацию о механизмах узнавания промоторных последовательностей, а также может являться основой для рационального дизайна новых ингибиторов РНКП.

1.1. Анализ первичной и вторичной структуры аптамеров, полученных при отборе к холоферменту РНКП Е. coli

Ранее в Лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов (ЛМГМ) ИМГ РАН был проведен отбор аптамеров к холоферменту РНКП Е. coli и Т. thermophilus, содержащим в своем составе главную а-субъединицу (er70 и сЛ соответственно). Для получения аптамеров, специфически связывающихся с холоферментом РНКП, был использован метод SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment - систематическая эволюция лигандов с экспоненциальным обогащением), суть которого заключается в проведении in vitro многократных раундов отбора олигонуклеотидов, взаимодействующих с белком-

TTGACA 16-18 нт

TATAAT 5-7 нт +1

Номера клонов

Рисунок 1. Последовательности аптамеров, полученных при отборе к холоферменту РНКП Е. coli. (А) Схема расположения консенсусных элементов в бактериальных промоторах. (Б) Выравнивание последовательностей аптамеров. Сверху показаны границы центрального случайного района в составе использованной при отборе библиотеки олигонуклеотидов и районов с фиксированной последовательностью (показаны зеленым цветом). Красным цветом показана последовательность в центральном районе, соответствующая -10 и TG элементам бактериальных промоторов.

мишенью, и амплификации связавшихся последовательностей. Использованная при отборе библиотека содержала центральный случайный район длиной 32 нт и концевые районы с фиксированными последовательностями (длиной 23 и 20 нт), которые были необходимы для ее амплификации. Исследуемые нами аптамеры были получены после проведения 12 циклов такого отбора с последующим клонированием отобранных последовательностей.

Первой задачей нашей работы было охарактеризовать первичную и вторичную структуры полученных аптамеров к холоферменту бактериальной РНКП, в том числе, выделить наиболее консервативные структурные элементы, которые могут быть важны для их связывания с РНКП. Последовательности аптамеров к холоферменту РНКП Е. coli приведены на рис. 1Б. Проведенный анализ выявил, что все они содержат участок, похожий на -10 промоторный элемент (консенсусная последовательность ТАт/сАл/сТ), а также динуклеотидный мотив TG, расположенный с 5'-конца от -10 элемента и похожий на TG-элемент промоторов. Аптамеры к холоферменту Т. thermophilus имеют похожую структуру. Важно отметить, что -10 элемент является наиболее консервативным элементом бактериальных промоторов и присутствует во всех промоторах, которые узнаются при участии главной с-субъединицы. Наличие -10 и TG элементов промоторов в составе всех отобранных аптамеров свидетельствует о том, что эти элементы являются наиболее оптимальными последовательностями ДНК, узнаваемыми холоферментом бактериальной РНКП, а районы 2.4 и 2.5 ст-субъединицы РНКП, которые принимают участие в их узнавании, - наиболее аффинными к нуклеиновым кислотам эпитопами холофермента РНКП. Тот факт, что аптамеры, полученные при отборе к холоферментам РНКП Е. coli и Т. thermophilus, содержат данные промоторные элементы, позволяет предположить, что аптамеры могут взаимодействовать с РНКП подобно участку ДНК, содержащему промотор.

Предсказание предполагаемой вторичной структуры полученных аптамеров к холоферменту проводили с использованием программы RNAdraw (Mazura Multimedia). Было выявлено, что все полученные последовательности могут образо-

fcggaggacagaaccggtctcc ¡caggatggtagaacgggatcc wjacatgaggcccggcactcc ■■fctaggaccgggaatci

"С'ГТТТС

^TATGATCTTACATAATMl латсатсттасатаатля

\tcacaccctcacattgfi xctaccagcccacattg

;atgcctcacacattgca 3tcctcacaccttagacg "gaccacccctccattga

¡.taatattcgtcttctal

Левый праймер j

Случайный регион

Правый праймер

Рисунок 2. Предполагаемая вторичная структура аптамеров, полученных путем уменьшения исходных аптамеров, отобраных к холоферменту РНКП Е. coli. Предполагаемая вторичная

структура аптамеров полученна в программе RNAdraw (Mazura Multimedia), красным и синими цветами обозначены

поледовательность -10 и TG элементов промотора,

соответственно. Приведены

значения констант диссоциации соответствующих комплексов аптамеров с РНКП.

вывать структуры типа ДНК-шпилек, содержащих двунитевой стебель и участок с одноцепочечной петлей (рис. 2). Важно отметить, что -10 элемент промотора всегда входит в состав одноцепочечной петли на конце шпилечной структуры, a TG-элемент находится в основании двухцепочечного стебля. Наличие такой структуры в составе всех аптамеров позволяет заключить, что для их узнавания холоферментом РНКП важна не только последовательность ДНК, но и особая вторичная структура аптамера в виде шпильки. Расположение промоторных элементов в структуре аптамеров очень сходно с их расположением в открытом промоторном комплексе бактериальной РНКП, в котором цепи ДНК расплавлены вокруг стартовой точки транскрипции. Это может свидетельствовать о высоком сродстве холофермента РНКП именно к подобной структуре промотора.

Для дальнейшего анализа было выбрано несколько аптамеров: hEcap5, hEcapö, hEcapl2'. На основе предсказаний вторичной структуры мы получили более короткие варианты аптамеров, в которых были удалены участки фиксированных районов библиотеки, не участвующие в формировании вторичной структуры. Для анализа эффективности связывания аптамеров были измерены константы диссоциации (Кл) их комплексов с холоферментом РНКП. Было показано, что все исследованые алтамеры являются высокоаффинными лигандами, которые связываются с холоферментом РНКП с Kä в пределах от 1 до 10 нМ. Некоторые из аптамеров оказались строго специфичны только к той РНКП, к которой проводился их отбор (ЬЕсар5/36. ЬТар12/39), а другие могут хорошо связываться с обоими РНКП (например, hEcap6/43) (рис. 2).

Для проверки роли промоторных элементов в связывании с РНКП были исследованы мутантные варианты аптамера hEcap5, в котором эти элементы были заменены на другие последовательности. Было обнаружено, что замены как -10, так и TG-элементов значительно снижают аффинность аптамеров к холоферменту РНКП (Ki > 100 нМ). Таким образом, холофермент РНКП специфически узнает промоторные элементы в составе аптамеров.

! Название аптамеров в данной работе образуется путем сокращения. hEcap5 - holoenzyme Е. coli aplamer clone 5 - аптамер к холоферменту РНКП Е. coli, клон №5; hTapl2 - holoenzyme Thermus sp. aptamer clone 12 - аптамер к холоферменту РНКП Т. thermophilics и Т. aquaticus, клон №12.

UpA+UTP

hEcap6/5i 1 ot - -TG

hEcap6/5i £ о тЧ -TG

да»;;.

-am

Рисунок 3. Транскрипция на аптамерных матрицах, содержащих различные наборы промоторных элементов. (А)

Аптамер ЬЕарб/51. Красная стрелка показывает положение точки старта транскрипции, также обозначены нуклеотиды матричной цепи в -1 и +1 положениях относительно старта транскрипции. Синей чертой отмечено место вставки в аптамерную матрицу дополнительной петли из 8 нт, (Б) Холофермент РНКП инкубировали с соответствующим фрагментом ДНК в транскрипционном буфере, в качестве субстратов использовали смесь всех четырех рибонуклеотидов (с добавлением меченого аР32-гиТР) и затравку 11рА, соответствующую -1 и +1 положениям (В) Транскрипцию проводили в присутствии гиТР и затравки 1ГрА. Реакцию проводили при 37°С в течение 10 минут. Показаны образующиеся продукты длиной 3 нуклеотида (ирАрЦ).

UpApU-

НшННННШ

1.2. Исследование транскрипционной активности РНКП Е. coli на аптамерных матрицах

Ранее было показано, что РНКП может инициировать транскрипцию на одноцепочечных ДНК разной структуры, но большинство исследованных матриц имело достаточно случайное происхождение (денатурированная ДНК, статистические со-полимеры нуклеотидов, синтетические олигонуклеотиды). В отличие от этого, использование аптамеров дает возможность получить одноцепочечные ДНК-матрицы, которые узнавались бы РНКП с высокой специфичностью и обеспечивали бы эффективную инициацию транскрипции.

С этой точки зрения особенный интерес представляют аптамеры, образующие достаточно длинную шпильку с внутренним одноцепочечным участком (например, аптамер hEcap6/43, см. рис. 2). Можно предположить, что такие аптамеры могут связываться рядом с активным центром РНКП и служить матрицами для транскрипции, так как они имеют область ДНК, которая соответствует точке старта транскрипции в двунитевых промоторах. Для анализа транскрипционной активности РНКП на аптамерных матрицах мы получили вариант аптамера hEcap6/43 - аптамер hEcap6/51, содержащий вставку длиной 8 нт в центральной петле (рис. ЗА). Увеличение длины петли было произведено для того, чтобы РНКП,

связанная с аптамером, имела возможность начать синтез РНК без разрыва контактов с промоторными элементами в составе аптамера.

Было обнаружено, что при добавлении нуклеотидов комплекс РНКП Е. coli с hEcap6/51 обладает транскрипционной активностью, при этом синтезируется большое количество абортивных РНК-продуктов длиной до 10-11 нт (рис. ЗБ). Синтез более длинных РНК, вероятно, оказывается затруднен из-за прочных контактов РНКП с промоторными элементами. С использованием различных комбинаций инициаторных нуклеотидов и динуклеотидных затравок было установлено, что первым нуклеотидом, который включается в состав молекулы РНК при инициации на hEcap6/51 является АТР, а вторым - UTP. Это означает, что точка инициации, с которой начинается синтез РНК в hEcap6/51, отстоит на такое же расстояние от -10 элемента, как и в двунитевых промоторах, узнаваемых РНКП Е. coli.

Нашей следующей задачей было исследовать, каким образом наличие промоторных элементов в составе аптамерных матриц влияет на инициацию и дальнейший синтез РНК. Для этого на основе hEcap6/51 были получены две матрицы: «hEcap6/51-10», у которой -10 элемент был заменен на последовательность ТСАССА, и «hEcap6/51-TG», у которой TG-элемент был заменен на последовательность АС (без нарушения вторичной структуры). Данные матрицы инкубировали с холоферментом РНКП Е. coli, после чего к ним добавляли субстраты: смесь всех четырех rNTP и затравки UpA (рис. ЗБ), либо смесь UTP и затравки (рис. ЗВ). На матрице hEcap6/51 при добавлении затравки UpA и UTP происходит образование тринуклеотида UpApU, а при добавлении всех четырех нуклеотидов — более длинных продуктов. При удалении -10 элемента матрица становится транскрипционно неактивной - синтез тринуклеотида и более длинных РНК на ней не наблюдается. В случае матрицы, лишенной TG-элемента, РНКП сохраняет способность к синтезу тринуклеотида UpApU с использованием затравки, но синтеза более длинных РНК-продуктов в этом случае не происходит. Таким образом, узнавание аптамерных матриц высокоспецифично и зависит от наличия в их составе промоторных элементов: замена TG элемента нарушает, а замена -10 элемента полностью подавляет инициацию транскрипции на данных матрицах.

В целом, по данной части работы можно сделать следующее заключение:

1) В ходе работы впервые охарактеризованы однонитевые алтамеры, которые связываются с РНКП Е. coli и Т. themophilus с высокой аффинностью, сравнимой с аффинностью РНКП к природным промоторам. Аптамеры содержат в своем составе TG и -10-элементы бактериального промотора, которые необходимы для связывания с РНКП. Структура аптамеров соответствует структуре расплавленного участка двунитевых промоторов, образующейся в ходе инициации транскрипции.

2) На основе аптамеров получены транскрипционные матрицы, на которых РНКП Е. coli способна осуществлять специфическую инициацию транскрипции. Аптамеры могут служить основой для создания новых типов однонитевых промоторов для специфической инициации транскрипции различными РНКП и использоваться в структурных исследованиях механизмов инициации транскрипции.

2. Анализ функциональной роли района switch2 ß'-субъединицы РНКП на разных стадиях транскрипции

Наша дальнейшая работа была посвящена изучению функциональной роли контактов РНКП с матрицей ДНК в области активного центра на разных стадиях транскрипции. Взаимодействия в этом участке должны быть особенно важны для транскрипционной активности РНКП: предположительно, они могут играть роль в расплетании переднего дуплекса ДНК и в позиционировании матричной цепи ДНК в активном центре фермента, а также в стабилизации транскрипционных комплексов. РНКП-ДНК контакты в области активного центра, вероятно, носят в основном сиквенс-неспецифический характер; в то же время, нельзя полностью исключить возможность специфических взаимодействий РНКП с ДНК в области активного центра на определенных участках матрицы. В данной работе мы исследовали функции районов ß'-SW2 и ß-FL2 РНКП, которые контактируют с матричной и нематричной цепями ДНК в области активного центра (от -2 до +2 нуклеотидов), соответственно. В этой главе изложены результаты исследования мутаций в районе SW2 РНКП Е. coli; результаты исследований, посвященных району FL2, приведены в главе 3.

Согласно данным рентгеноструктурного анализа, район ß'-SW2 (аминокислотные остатки ß' 327-352 в РНКП Е. coli) соединяет домен clamp с основной частью РНКП, а также напрямую контактирует с матричной цепью ДНК в области активного центра (рис. 4). Кроме того, в холоферменте РНКП район SW2 взаимодействует с районом 3.2 ст-субъединицы, который вовлечен в процессы инициации синтеза РНК и ухода РНКП с промотора. Недавно было показано, что группа антибиотиков, таких как миксопиронин, связывается с районом SW2 и фиксирует его в неактивной конформации, что препятствует плавлению ДНК в области точки старта транскрипции. Эти данные позволяют предположить, что район SW2 может координировать связывание ДНК и конформационные перестройки домена clamp, а также участвовать в процессе инициации транскрипции. Однако, детально функциональная роль района SW2 на разных стадиях транскрипции изучена не была.

Для изучения функций района SW2 на разных стадиях транскрипции мы исследовали РНКП Е. coli с заменами остатка аргинина в положении 339 в этом районе; этот остаток абсолютно консервативен в РНКП всех исследованных бактерий, архей и эукариот и взаимодействует с фосфатными остатками матричной нити ДНК вблизи активного центра РНКП. Мы исследовали РНКП с заменами R339 на аланин (незаряженная аминокислота с небольшим по размеру радикалом), лизин (положительно заряженная аминокислота) и глутаминовую кислоту (отрицательно заряженная аминокислота).

2.1. Общая транскрипционная активность РНКП Е. coli с заменами остатка R339

Транскрипционную активность РНКП Е. coli с заменами R339A, R339E и R339K исследовали в тесте по транскрипции in vitro с использованием промотора Т7А1 в присутствии четырех rNTP. В данном эксперименте измеряли количество полноразмерной РНК длиной 53 нт., которая синтезировалась в результате последовательного прохождения РНКП нескольких стадий транскрипции, включая узнавание промотора, инициацию синтеза РНК, уход с промотора и элонгацию

Рисунок 4. Структура контактов РНКП с нуклеиновыми кислотами в элонгационном комплексе. (А) Структура элонгационного комплекса РНКП Т. thermophilus. Субъединицы РНКП отмечены различными цветами: а - светло голубым, ß - светло зеленым, ß' - светло красным, a to -светло серым. ДНК и РНК показаны в виде шаро-стержневой модели; район ß'-SW2 показан синим; район ß-FL2 показан зеленым. Два основных элемента активного центра РНКП - ВН (bridge helix, мостовая спираль или F-спираль) и TL (trigger loop, переключающая петля или G-петля), -показаны фиолетовьм и светло-зеленым, соответственно. Направление движения домена clamp («зажим») при изменении конформации показано двусторонней стрелкой. Красной сферой показан ион Mg2+ в активном центре фермента. (Б) Структура активного центра РНКП в элонгационном комплексе. Район ß'-SW2 показан синим, консервативные положительно заряженные аминокислотные остатки района SW2 показаны голубым (R339 - темно голубым). Серым цветом показан участок clamp-домена, в который входят следующие элементы; clamphead (головка зажима), ß' coiled-coil 1, lid (крышка) и rudder (шип).

транскрипци (рис. 5.) Было обнаружено, что РНКП дикого типа и РНКП с заменой R339K синтезируют сравнимые количества полноразмерной РНК (дор. 1 и 4), а РНКП с заменами R339A и R339E обладают значительно меньшей активностью (дор. 2 и 3). Однако, при добавлении к смеси субстратов динуклеотидной затравки СрА, которая соответствует -1 и +1 положениям промотора, происходит значительная стимуляция синтеза полноразмерной РНК РНКП с заменами R339A и R339E (дор. 5-8). Необходимость наличия динуклеотидной затравки для эффективной инициации и синтеза полноразмерной РНК в случае мутантных РНКП указывает на то, что замены остатка R339 в районе SW2 РНКП Е. coli на остатки аланина или аспарагиновой кислоты могут влиять на инициацию транскрипции, затрагивая, в частности, процессы образования промоторного комплекса и синтез первой фосфодиэфирной связи.

2.2. Влияние замен остатка R339 в РНКП Е. coli на связывание инициаторных субстратов

Для того, чтобы установить, как влияют замены остатка R339 на образование первой фосфодиэфирной связи в процессе инициации, мы измерили значения кажущихся констант Михаэлиса (Км) для инициаторных нуклеотидов для мутантных РНКП. Измерение значений Км проводили в реакции синтеза РНКП динуклеотидных продуктов на промоторе Т7А1; в ходе реакции инициаторные нуклеотиды АТР и UTP, соответствующие +1 и +2 положениям матрицы, объединялись с образованием динуклеотида pppApU. Как оказалось, замены аминокислотного остатка R339 РНКП незначительно изменяют значения Км для

Рисунок S. Исследование транскрипционной активности РНКП Е. coli с заменами остатка R339 на промоторе Т7А1.

Транскрипцию проводили в отсутствие (дор. 1-4) или в присутствии (дор. 5-8) динуклеотидной затравки СрА (концентрация 100 мкМ). Положение полноразмерной РНК длиной 53 нт обозначено стрелкой. Снизу рисунка приведены величины активности мутантных РНКП с заменами аминокислотного остатка R339 относительно РНКП дикого типа

5'-инициаторного нуклеотида АТР, приводя к их увеличению всего в 1,5-4 раза в случае различных РНКП (табл. 1). Однако более выраженный эффект замены остатка R339 оказывают на значения Км для З'-инициаторного нуклеотида UTP, приводя к увеличению Км в 3, 6 и 13 раз для РНКП R339K, R339A и R339E, соответственно. Важно отметить, что сила эффекта, который оказывает замена аминокислотного остатка R3 39 в РНКП, зависит от природы замены.

Затем мы измерили значения кажущихся Км для инициаторных субстратов при синтезе тринуклеотидных продуктов, когда в реакции используются динуклеотидная затравка СрА и мононуклеотид UTP (СрА + UTP —> CpApU). Значения Км для З'-инициаторного нуклеотида, измеренные в такой реакции, в случае всех трех мутантных РНКП не превышали значения Км для РНКП дикого типа (табл. 1). Таким образом, наблюдаемые у РНКП с заменами R339 дефекты в образовании первой фосфодиэфирной связи могут быть объяснены тем, что у этих РНКП нарушается связывание З'-инициаторного нуклеотида в активном центре. Данный эффект может объясняться изменением положения и/или конформации матричной цепи ДНК в +1 положении активного центра РНКП, что будет приводить к нарушению связывания субстратов. Следует отметить, что ранее в нашей лаборатории было показано, что делеция аминокислот 513-519 в районе 3.2 а-субъединицы РНКП Е. coli, который котнактирует с районом SW2, приводит к сходным (но более сильным) дефектам в образовании первой фосфодиэфирной связи. Это позволяет предполагать, что оба района скоординированно участвуют в связывании инициаторных нуклеотидов.

2.3. Влияние замен остатка R339 в РНКП Е. coli на стабильность промоторных комплексов

Как было показано, многие мутации в домене clamp, а также некоторые изученные ранее мутации в районе SW2 могут приводить к нарушениям стабильности открытого промоторного комплекса РНКП (Rutherford et al., 2009; Belogurov et al., 2009). Для того, чтобы исследовать, каким образом замены остатка R339 в районе SW2 могут влиять на стабильность промоторного комплекса, мы провели измерения стабильности комплексов РНКП с промотором XPR в присутствии гепарина, который является конкурентным ингибитором связывания РНКП с ДНК (рис.6). Измерения показали, что промоторные комплексы РНКП Е. coli характеризуются очень высокой стабильностью, что соответствует литературным данным (время полужизни комплексов составляет более 120 минут). В то же время, комплексы, сформированные мутантными РНКП, оказываются

ß'339 R Е А К R Е А К

СрА - +

РНК-»-

• ■ ■

активность 1 0,04 0,2 1,1 1 0,4 0,6 1,1

3 4

5 6 7 8

Таблица 1. Значения кажущихся для инициаторных субстратов для РНКП дикого типа и РНКП с заменой 11339Е. Полужирным шрифтом показаны соотношения Км для мутантной РНКП и РНКП дикого типа.

РНКП Реакция

ATP+UTP CpA+UTP

Км АТР, мкМ Км UTP, мкМ Км СрА, мкМ Км UTP, мкМ

WT 190 ±4 9,2 ± 0,5 90 ±24,8 4,8 ± 1,1

R339E 410 ±10 2,2 120 ±20 13,2 175 ±45 1,9 2,2 ±0,5 0,4

нестабильными и имеют маленькое время полужизни: 4,2 ± 1,1 минуты, 0,7 ± 0,2 минуты и 0,5 ± 0,1 минуты в случае РНКП с заменами R339K, R339A и R339E, соответственно. Можно заключить, что замена положительно заряженного остатка R339 приводит к сильному нарушению стабильности промоторного комплекса. Данный эффект можно объянить тем, что, по-видимому, в случае замены данного остатка происходит изменение положения домена clamp относительно тела РНКП, либо увеличение его конформационной подвижности.

2.4. Влияние замен остатка R339 в районе SW2 на плавление ДНК при образовании открытого промоторного комплекса

Как было показано ранее, антибиотик миксопиронин, взаимодействующий с районом SW2, способен стабилизировать РНКП на стадии промежуточного промоторного комплекса, в котором плавление ДНК не достигает стартовой точки транскрипции. Это эффект имитирует деления аминокислотных остатков ß'338-341 в РНКП Е. coli, которая блокирует перестройки района SW2 (Belogurov et al., 2009). Так как остаток R339 располагается в данном районе РНКП, его контакты с ДНК могут быть важны для распространения области расплавленной ДНК в направлении точки начала синтеза РНК.

Для исследования того, как замены остатка R339 влияют на плавление дуплекса ДНК при образовании промоторного комплекса мутантными РНКП, мы использовали метод перманганатного (КМ1Ю4) футпринтинга на промоторе Т7А1.

РНКП WT R339A R339E R339K

время

ApUpG ► 1

^1/2 >120 мин 0,7 мин 0,5 мин 4,2 мин

Рисунок 6. Исследование стабильности промоторных комплексов РНКП с заменами аминокислотного остатка И339. Транскрипцию проводили на промоторе Комплексы РНКП с промоторным фрагментом ДНК инкубировали в присутствии гепарина, через различные промежутки времени (от 30 секунд до 120 минут) из смеси отбирали аликвоты и добавляли к ним инициаторные субстраты - динуклеотидную затравку Ари и ОТР. Реакцию останавливали через 3 минуты. Полученные для различных РНКП значения времен полужизни промоторных комплексов (^д) приведены внизу рисунка.

Рисунок 7. Влияние замен аминокислотного остатка R339 в районе SW2 на процесс плавления ДНК при образовании открытого промоторного комплекса. Приведены результаты футпринтинга пермангана-том калия нематричной цепи ДНК в комплексах РНКП с Т7А1-промотором. Расщепление ДНК происходит по остаткам тимина в одноцепочечных участках, образующихся в результате плавления промотора.

R - РНКП дикого типа, А, Е и К - РНКП с заменами R339A, R339E, и R339K, соответственно. М -маркер длин фрагментов, полученный при расщеплении ДНК по остаткам аденина и гуанина. Последовательность промотора Т7А1 в районе стартовой точки транскрипции приведена справа, -10 элемент обозначен рамкой; стрелками указаны полосы на электрофореграмме, соответствующие остаткам тимина, по которым происходит расщепление.

Перманганат преимущественно реагирует с остатками тимина в однонитевых участках ДНК, что позволяет затем провести расщепление ДНК в модифицированных участках и установить размеры расплавленной области ДНК при образовании промоторного комплекса. Результаты исследования влияния замен остатка R339 в РНКП на процесс плавления промотора приведены на рис. 7. В случае комплекса холофермента РНКП Е. coli дикого типа с промотором Т7А1 при проведении футпринтинга образуется набор полос, соответствующих расщеплению по тиминовым остаткам в положениях -11, -8, -7 и +2 нематричной цепи ДНК, что свидетельствует об образовании открытого промоторного комплекса, в котором расплавленная область дуплекса ДНК включает в себя точку начала транскрипции. В отличие от этого, РНКП с заменами остатка R339 осуществляют плавление дуплекса ДНК в области -10 элемента промотора, но не способны плавить промотор в точке начала транскрипции (полоса, соответствующая продукту расщепления по тимину в +2 положении промотора Т7А1, имеет гораздо меньшую интенсивность или совсем отсутствует).

Таким образом, замена аминокислотного остатка R339 в РНКП Е. coli приводит к. нарушению плавления ДНК в стартовой точке транскрипции при образовании промоторного комплекса.

2.5. Влияние замен остатка R339 в районе SW2 на работу РНКП на стадии элонгации транскрипции

Проведенные исследования влияния замен остатка R339 в районе SW2 на процесс инициации транскрипции позволили предположить, что эти замены также могут влиять и на процесс элонгации, за счет изменений в контактах РНКП с матрицей ДНК. Измерения скорости элонгации у РНКП с заменами R339 показали, что данные РНКП обладают несколько сниженными скоростями синтеза РНК по сравнению с ферментом дикого типа (данные не приведены). Данное снижение скорости наиболее заметно проявляется в случае РНКП с заменой R339E (уменьшение скорости примерно в 1,5 раз). Полученные результаты можно объяснить тем, что замены остатка R339 нарушают структуру элонгационного комплекса и контакты РНКП с матрицей ДНК. В связи с этим, нашей следующей задачей было исследовать, каким образом замена аминокислотного остатка R339 в РНКП будет влиять на стабильность элонгационного комплекса.

РНКП м - R А Е К

■ щж

1 55 <

I ттФ

R339A

26 нт^

R339E О 1 3 10 20 40 (

R339K О 1 3 10 20 40 <

и®в

Рисунок 8. Влияние замен аминокислотного остатка R339 в районе SW2 РНКП на стабильность элонгационных комплексов. Элонгационные комплексы, остановленные в +26 положении матрицы, получали путем добавления к промоторному РНКП ограниченного набора субстратов и сорбировали на Ni-NT А-агарозу. К пробам добавляли раствор NaCl до концентрации 1 М, отбирали аликвоты через различные промежутки времени и отмывали диссоциировавшую из комплексов РНК. Количество РНК, оставшейся в составе элонгационных комплексов, анализировали с помощью электрофореза в ПААГ.

Известно, что элонгационные комплексы РНКП являются очень стабильными (время полужизни составляет несколько часов). Для проверки влияния замен остатка R339 на стабильность элонгационных комплексов РНКП Е. coli мы получили комплексы, остановленные в 26 положении матрицы, содержащей APr-промотор, инкубировали их в условиях высокой ионной силы (в присутствии 1 М NaCl) и измеряли количество радиоактивно-меченой РНК, оставшейся в составе комплексов (рис. 8). Было обнаружено, что комплекс РНКП дикого типа остается стабильным в условиях эксперимента более часа. В то же время, комплексы, образованные мутантными РНКП, гораздо менее стабильны, причем скорость их диссоциации, как и в случае промоторных комплексов (см. выше), зависит от природы аминокислотной замены. Таким образом, можно сделать вывод, что замены остатка R339 в районе SW2 приводят к дестабилизации элонгационных комплексов, вероятно, за счет нарушения контактов между РНКП и ДНК.

2.6. Влияние замен остатка R339 в районе SW2 на эффективность действия на РНКП антибиотика рифампицина

Антибиотик рифампицин является наиболее эффективным ингибитором бактериальной РНКП и используется в медицине для лечения целого ряда инфекционных заболеваний, включая туберкулез. Рифампицин блокирует инициацию синтеза РНК и уход РНК-полимеразы с промотора. Белковый карман, участвующий в связывании рифампицина, находится поблизости от района SW2 и района 3.2 а-субъединицы. Предполагается, что рифампицин может стерически блокировать удлинение РНК в ходе инициации, а также аллостерически влиять на структуру активного центра РНК-полимеразы и нарушать связывание нуклеотидов (Artsimovitch et al„ 2004).

Для проверки возможного аллостерического воздействия рифампицина на связывание инициаторных субстратов и синтез первой связи РНК в ходе инициации мы измерили кажущиеся Км для инициаторных нуклеотидов в присутствии антибиотика. Было показано, что рифампицин значительно повышает значения Км для инициаторных субстратов (в отсутствие рифампицина Км для 5-нуклеотида АТР составляет 190 мкМ, для З'-нуклеотида UTP - 9,2 мкМ; в присутствии рифампицина Км АТР = 850 мкМ, Км UTP = 170 мкМ). Так как рифампицин напрямую не контактирует с инициаторными нуклеотидами (Artsimovitch et al., 2004), этот эффект должен иметь аллостерическую природу.

Влияние антибиотика на связывание нуклеотидов похоже на эффекты, которые оказывают замены остатка R339 в районе SW2 (см. выше) и мутации в районе 3.2 ст-субъединицы (Kulbachinskiy, Mustaev, 2006). Мы предположили, что эти районы РНКП могут принимать участие в аллостерическом пути блокирования работы фермента при связывании рифампицина. Для проверки этого предположения мы исследовали влияние рифампицина на Км инициаторных нуклеотидов для РНКП с заменами остатка R339 в районе SW2 и с делецией остатков 513-519 в районе 3.2 а-субъединицы в реакции динуклеотидного синтеза (ATP + UTP —► pppApU) на Т7А1-промоторе. Было показано, что при добавлении рифампицина к РНКП дикого типа происходит повышение в 19 раз значения кажущейся Км для З'-инициаторного субстрата. Замена R339E в районе SW2 и делеция в районе 3.2 а также приводят к увеличению значений Км для З'-инициаторного нуклеотида в 13 и 54 раза, соответственно. В присутствии рифампицина увеличение Км в случае данных РНКП составляет 42 и 90 раз, соответственно, относительно РНКП дикого типа в отсутствие антибиотика. Таким образом, можно заключить, что при добавлении рифампицина к РНКП, имеющим мутации в районах SW2 и 3.2 о, практически не наблюдается аддитивного эффекта в увеличении значений Км для инициаторных субстратов. Это может свидетельствовать о том, что данные районы РНКП могут участвовать в ингибировании рифампицином активности РНКП транскрипции по аллостерическому механизму. Для проверки этого предположения требуется проведение дополнительных экспериментов.

В целом, полученные во второй части работы результаты показывают, что район SW2 РНКП играет ключевую роль в процессах инициации и элонгации транскрипции, в том числе, в связывании промотора, образовании открытого промоторного комплекса, инициации синтеза РНК, ухода РНКП с промотора, и удлинении растущей цепи РЖ. Изменение конформации района SW2 с участием различных факторов может являться одним из эффективных механизмов регуляции активности РНКП на разных стадиях транскрипции. Антибиотик рифампицин способен аллостерически нарушать связывание нуклеотидов в активном центре РНКП, причем в передаче аллостерических изменений может быть задействован район SW2. Таким образом, этот район является перспективной мишенью для получения новых ингибиторов РНКП и антибиотиков.

3. Анализ функциональной роли района fork-loop2 р-субъединицы РНКП на разных стадиях транскрипции

Заключительная часть нашей работы была посвящена анализу возможных функций района fork-loop2 (FL2) р-субъединицы РНКП во взаимодействиях с ДНК на стадиях инициации и элонгации транскрипции. Как уже отмечалось выше, в последние годы были расшифрованы частичные структуры элонгационных комплексов бактериальной и эукариотической РНКП. Однако, одним из существенных «белых пятен» является отсутствие в этих структурах данных о положении нематричной цепи ДНК в расплетенном участке. Вместе с тем, контакты РНКП с нематричной цепью ДНК, прежде всего, в области активного центра, могут играть важную роль в стабилизации транскрипционных комплексов, а также в узнавании регуляторных сигналов на стадии элонгации, в частности, сигналов транскрипционных пауз. Для понимания роли контактов РНКП с нематричной ДНК в транскрипции необходимо идентифицировать основные районы РНКП,

вн

Е546 D446 R451

TL'

/ матричная нематричная R339 цепь ДНК цепь ДНК

Т539

Рисунок 9. Структура района (5-fork-loop2.

Показан район активного центра РНКП в структуре элонгационного комплекса РНКП Т. thermophilic, вид со стороны района FL2. Синтезируемая РНК, а также матричная и нематричная цепи ДНК показаны желтым, оранжевым и темно-бордовым цветами, соответственно. Аминокислотные остатки Е546, D446, R451 и Т539 в районе FL2, которые могут контактировать с нематричной цепью ДНК, обозначены зеленым цветом. Каталитический ион магния в активном центре показан сферой красного цвета. Районы ВН, TL, SW2 и rudder показаны фиолетовым, светло-зеленым, синим и красным цветами, соответственно.

которые могли бы принимать участие в такого рода взаимодействиях.

Район FL2 располагается недалеко от активного центра в передней части главного канала РНКП, напротив района SW2, образованного ß'-субъединицей и контактирующего с матричной цепью ДНК (см. рис. 9). Анализ расположения обоих цепей в составе ДНК-дуплекса спереди от активного центра в элонгационном комплексе (рис. 9) показывает, что в расплавленном участке в области активного центра нематричная цепь ДНК должна проходить в непосредственной близости от района FL2. Это позволяет предполагать, что район FL2 участвует в функционально-важных взаимодействиях с нематричной цепью ДНК. Для изучения функций района FL2 в транскрипции в нашей работе были получены мутантные варианты РНКП Е. coli, которые содержат замены одного из четырех аминокислотных остатков: R451, D446. Е546 или Т539, - на аланин; эти остатки образуют заряженный карман в районе FL2 непосредственно на пути нематричной цепи ДНК (рис. 9). Мы исследовали, каким образом полученные замены в районе FL2 влияют на работу РНКП на разных стадиях транскрипции, а также на узнавание ферментом сигналов транскрипционных пауз.

3.1. Влияние аминокислотных замен в районе FL2 на стабильность промоторного комплекса РНКП Е. coli

Контакты РНКП с нематричной цепью ДНК должны быть важны для образования стабильного открытого промоторного комплекса в процессе инициации транскрипции, в котором матричная цепь пространственно отделена от нематричной и находится в активном центре РНКП. Для проверки возможной роли района FL2 в стабилизации промоторных комплексов, мы измерили стабильность комплексов РНКП Е. coli дикого типа и РНКП с заменами аминокислотных остатков в районе FL2 на промоторе Т7А1 в присутствии гепарина. Измерение стабильности промоторных комплексов проводили аналогично тому, как описано в разделе 2.3. В условиях данного опыта время полужизни промоторных комплексов РНКП Е. coli дикого типа составляет примерно 30 минут. Промоторные комплексы РНКП с заменой Е546А обладают сравнимой стабильностью (время полужизни около 40 минут). Замены D446A и T539G приводят к незначительному снижению

времени полужизни промоторных комплексов (до 20 минут). Наиболее сильный эффект оказывает замена R451E, в случае которой время полужизни промоторных комплекса составляет около 1 минуты. Таким образом, замены аминокислотных остатков района FL2 по разному влияют на стабильность промоторных комплексов РНКП, причем остаток R451 играет важную роль в стабилизации промоторных комплексов.

3.2. Влияние замен в районе FL2 РНКП Е. coli на узнавание регуляторных сигналов /us-пауз на стадии элонгации транскрипции

В ходе элонгации транскрипции РНКП может совершать временные остановки -транскрипционные паузы, появление которых регулируется наличием особых последовательностей в структуре ДНК. Одной из главных проблем при этом является вопрос о механизмах распознавания соответствующих регуляторных сигналов РНКП. В расшифрованных структурах элонгационного комплекса отсутствуют специфические контакты РНКП с азотистыми основаниями в дуплексе ДНК спереди по ходу транскрипции и в РНК-ДНК гибриде в области активного центра и, следовательно, регуляторные сигналы не могут распознаваться РНКП в составе этих участков ДНК и РНК. Таким образом, основную роль в узнавании регуляторных сигналов, вероятно, могут играть взаимодействия РНКП с 5'-концом РНК и с нематричной цепью ДНК в расплавленном участке (стоит отметить, что расположение именно этих участков в элонгационном комплексе остается неизвестным).

В качестве основной модельной системы для изучения механизма образования транскрипционных пауз в нашей работе была использована последовательность his-паузы (his?), которая входит в состав регуляторного участка гистидинового оперона прокариот. Как было показано ранее, при прохождении РНКП через сигнал данной паузы происходит образование РНК-шпильки, которая, видимо, специфически узнается РНКП и является основным элементом, необходимым для приостановки синтеза РНК (рис. 10). Однако, имелись данные, показывающие, что нуклеотидные замены в области З'-концевого участка сигнала паузы также оказывают влияние на продолжительность паузы (Laudiek et. al., 1993). Так как в этом участке З'-конец РНК находится в дуплексе с матричной цепью ДНК и не может напрямую узнаваться РНКП, мы предположили, что в данном случае в специфическое взаимодействие может быть вовлечена нематричая цепь ДНК и, возможно, район FL2 РНКП.

Для проверки этих предположений мы исследовали, каким образом замены аминокислотных остатков в районе FL2 влияют на узнавание сигнала his-паузы РНКП Е. coli в процессе элонгации. Для этого были получены транскрипционные матрицы, содержащие >.PR промотор и различные варианты сигнала his-паузы и измерена продолжительность паузы для различных РНКП (см. рис. 10). При проведении эксперимента сначала получали элонгационные комплексы, остановленные в 26 положении матрицы (путем добавления к промоторным комплексам ограниченного набора нуклеотидов), а затем к таким комплексам добавляли полный набор субстратов. Через определенные промежутки времени из реакционной смеси отбирали аликвоты и следили за изменением количества РНК-продукта, соответствующего состоянию паузы. Результаты измерения времени продолжительности паузы приведены в таблице на рис. 10Б.

т т т

♦1 1-26 +136

РНКП HisPWT HisP C-2T HisP С-2С HisP G-3A HisP с-зс

WT 40±4 20±1 31±1 15+1 38±2

Е546А 20+1 10±2 14±1 5±1 20±1

D446A 21±1 10±1 18±1 15±1 29±2

Рисунок 10. Влияние замен в районе FL2 РНКП Е. coli на узнавание регуляторных сигналов Аи-пауз на стадии элонгации транскрипции. (А) Схема транскрипционной матрицы, использованной в эксперименте. Матрица содержит XPR-промотор, за которым следует участок длиной 26 нт, не содержащий остатков цитозина, что позволяет получать элонгационный комплекс, остановленный в 26 положении при проведении транскрипции в присутствии только трех нуклеотидов: ATP, GTP и UTP. Показаны последовательности, кодирующие РНК-шпильку и З'-концевой участок сигнала his-паузы (отмечены остатки, соответствующие -3, -5 и -7 положениям относительно места паузы). (Б) Времена полужизни, измеренные для элонгационных комплексов в состоянии паузы (tm) для РНКП дикого типа (WT) и РНКП с заменами в районе FL2 на транскрипционных матрицах, содержащих различные варианты сигнала his-паузы.

Было показано, что в условиях данного эксперимента время полужизни транскрипционной паузы, образованной РНКП Е. coli дикого типа (ti/2 - время, за которое половина всех элонгационных коплексов покидает последовательность паузы) составляет около 40 с. Нуклеотидные замены в положениях -2 и -3 относительно места остановки РНКП при узнавании hisP уменьшают эффективность образования транскрипционной паузы, причем эффект зависит от природы замены: например, замена С-2А ведет к более сильному нарушению образования паузы (t./2 - 14 е.), чем замена C-2G (tl;2 - 31 е.). Полученные данные подтверждают, что 3'-концевая часть сигнала hisР, следующая за шпилькой, играет важную роль в узнавании сигнала паузы РНКП.

В случае РНКП с заменами Е546А и D446A оказалось, что при узнавании сигнала hisР дикого типа эти замены снижают время полужизни паузы примерно в 2 раза, до 20 с (рис. 10Б). Эта закономерность сохраняется и в случае сигналов пауз с заменами С-2Т и C-2G, при этом происходит суммирование эффекта мутаций в РНКП с эффектом от внесения замен в саму последовательность сигнала паузы. Так, в случае замены С-2Т для РНКП дикого типа t\n = 20 е., а для РНКП с заменами Е546А и D446A t1/2 = 10 с. Однако, в случае замены G-3A в последовательности hisP, время полужизни паузы у РНКП с заменой Е546А снижается в 3 раза относительно РНКП дикого типа, а у РНКП с заменой D446A данный параметр остается неизменным. Таким образом, в случае РНКП с заменой D446A не происходит суммирования эффекта от аминокислотной замены с эффектом от нарушения последовательности сигнала hisP. Этот результат позволяет предположить, что аминокислотный остаток D446 в районе FL2 может участвовать

в специфическом узнавании нуклеотида в -3 положении последовательности hisV. Таким образом, в данном эксперименте получено подтверждение нашего предположения о том, что заряженный аминокислотный карман района FL2 РНКП Е. coli способен контактировать с нематричной цепью ДНК.

В целом, полученные в третьей части работы данные позволяют предположить, что район FL2 ß-субъединицы РНКП Е. coli принимает участие во взаимодействиях фермента с нематричной цепью ДНК в области активного центра РНКП на разных стадиях транскрипции. Данные взаимодействия могут быть важны для поддержания стабильности транскрипционного комплекса, а также для узнавания РНКП сигналов транскрипционных пауз. Вместе с тем, следует подчеркнуть, что имеющиеся данные пока не позволяют однозначно утверждать, что район FL2 напрямую контактирует с промоторной ДНК. Дальнейшие исследования роли района FL2 в специфических и неспецифических взаимодействиях РНКП с ДНК требуют более полного анализа пространственных структур промоторного и элонгационного комплексов.

выводы

1. Холофермент РНКП Е. coli специфически узнает одноцелочечные ДНК-аптамеры, которые содержат в своем составе -10 и TG-элементы промотора и по своей вторичной структуре аналогичны расплавленному участку ДНК в составе открытого промоторного комплекса.

2. На основе аптамеров получены искусственные одноцепочечные промоторы нового типа. Для инициации транскрипции на аптамерных промоторах необходимо наличие в их составе -10 и TG элементов.

3. Контакты района switch2 ß'-субъединицы с матричной цепью ДНК в области активного центра РНКП Е. coli играют роль в плавлении промотора в точке старта транскрипции, в стабилизации промоторного и элонгационного комплексов и в уходе РНКП с промотора.

4. Контакты района switch2 с ДНК стимулируют связывание инициаторных нуклеотидов в активном центре РНКП Е. coli. Район 3.2 а-субъединицы, взаимодействующий с switch2, может играть аналогичную роль в связывании нуклеотидов в процессе инициации.

5. Антибиотик рифампицин значительно ухудшает связывание субстратов в процессе инициации транскрипции. Мутации в районе switch2 ß'-субъединицы и районе 3.2 а-субъединицы влияют на эффективность действия антибиотика.

6. Район fork-loop2 ß-субъединицы, контактирующий с нематричной цепью ДНК в области активного центра РНКП, участвует в стабилизации промоторного комплекса и узнавании регуляторных сигналов пауз в процессе элонгации транскрипции.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

Статьи:

1. Pupov Р., Miropolskaya N., Sevostyanova A., Bass I., Artsimovitch I., Kulbachinskiy A. Multiple roles of the RNA polymerase P' SW2 region in transcription initiation, promoter escape, and RNA elongation.// Nucleic Acids Research. 2010. 38. p. 5784-5796.

2. Пупов Д.В.. Кульбачинский A.B. Структурная динамика активного центра многосубъединичных РНК-полимераз в процессе синтеза и редактирования РНК.// Молекулярная биология. 2010. т. 44. с. 573-590.

Материалы всероссийских и международных конференций:

1. Kulbachinskiy A., Pupov Р., Miropolskaya N., Esyunina D. Molecular mechanisms underlying fidelity of RNA synthesis by bacterial RNA polymerase.// The 7th International Conference on Bioinformatics of Genom Regulation and Structure. June 20-27, 2010, Novosibirsk, Russia, p. 153.

2. Пупов Д.В.. Кульбачинский A.B. Механизмы подавления активности бактериальной РНК-полимеразы антибиотиком рифампицином и аптамерами.// 14 Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино, 2010 г., 20-23 апреля. Том 2, с. 174

3. Пупов Д.В., Миропольская Н.А., Кульбачинский А.В. Роль района switch-2 во взаимодействиях РНК-полимеразы с ДНК на разных стадиях транскрипции.// 2-й Международный форум по нанотехнологиям. 6-8 октября 2009 г., Москва, Россия, с. 490-491.

4. Пупов Д.В.. Есюнина Д.М., Кульбачинский А.В. Создание однонитевых транскрипционных матриц для РНК-полимеразы с использованием метода SELEX.// 1-й Международный форум по нанотехнологиям. 3-5 декабря 2008 г., Москва, Россия, с. 504-505.

5. Kulbachinskiy A., Punov P., Barinova N. Analysis of promoter recognition by bacterial RNA polymerase using model DNA substrates.// XX International Congress of Genetics. «Genetics - understanding living systems». July 12-17, 2008, Berlin, Germany, p.292

6. Кульбачинский A.B., Пупов Д.В.. Баринова H.A. Исследование структуры РНК-полимеразы и механизмов узнавания промоторов при помощи аптамеров.// IV Съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, 2008 г., 11-15 мая. с. 66.

Подписано в печать 18.11.2010 г. Печать трафаретная Усл.п.л. - 1,5 Заказ № 3972 Тираж: 90 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36

(499) 788-78-56 vvww.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пупов, Данил Владимирович

Список используемых сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы.

Цели и задачи исследования.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Часть 1. Структура и функции бактериальной РНКП. Взаимодействия РНКП с ДНК и РНК на разных стадиях транскрипции.

1.1. Введение

1.2. Структура бактериальной РНКП.

1.2.1. Структура кор-фермента РНКП.

1.2.2. Структура холофермента РНКП.

1.2.3. Структура а-субъединицы.

1.3. Структурные модели транскрипционных комплексов.

1.3.1. Структурная модель промоторного комплекса.

1.3.2. Структурная модель элонгационного комплекса.

1.4. Механизмы работы активного центра РНКП.

1.4.1. Реакции, катализируемые РНКП.

1.4.2. Механизм синтеза РНК.

1.4.3. Механизм транслокации РНКП.

Часть 2. Взаимодействия РНКП с некодирующими нуклеиновыми кислотами.

1.5. Неканонические транскрипционные матрицы.

1.5.1. Система синтеза затравки для отстающей цепи при репликации плазмид по типу катящегося кольца.

1.5.2. Система синтеза затравки при репликации нитевидных фагов.

1.5.3. Репликация вироидов: РНКП может использовать РНК в качестве матрицы для транскрипции.

1.5.4. Регуляция транскрипции у прокариот с помощью 6S РНК.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование функциональной роли специфических и неспецифических взаимодействий РНК-полимеразы Escherichia coli с ДНК на разных стадиях транскрипции"

Актуальность проблемы

ДНК-зависимая РНК-полимераза (РНКП) - главный фермент, осуществляющий процесс транскрипции генетического материала в клетках всех живых организмов. Процесс транскрипции включает три основные стадии: инициацию, элонгацию и терминацию, которые сопровождаются сложными структурными перестройками транскрипционного комплекса и изменениями контактов РНКП с ДНК-матрицей. РНКП является эволюционно консервативным ферментом, структура которого сходна у всех изученых прокариот и эукариот. В последние годы понимание тонких молекулярных механизмов функционирования РНКП стало возможным благодаря успехам в расшифровке пространственной структуры РНКП термофильных бактерий (Thermus aquaticus и Thermus thermophilus) и РНКП II Saccharomyces cerevisiae, а также частичных структур элонгационных комплексов этих РНКП (Cramer et al., 2001а; Gnatt et al., 2001; Vassylyev et al., 2002a; Vassylyev et al, 2007a; Vassylyev et al., 2007d; Zhang et al., 1999a). Имеющиеся на сегодняшний день данные позволяют утверждать, что молекулярные механизмы разных стадий синтеза РНК очень похожи у бактерий и у эукариот. Благодаря более простому строению, бактериальная РНКП может служить удобной моделью для изучения фундаментальных механизмов транскрипции и ее регуляции.

Каталитически активный кор-фермент бактериальной РНКП представляет собой комплекс из пяти субъединиц (а2[3[3'ю); две наиболее крупные субъединицы - Р и Р', -образуют активный центр, расположенный в глубине главного канала РНКП, и принимают участие в формировании основных контактов РНКП- с ДНК и РНК, которые в процессе транскрипции располагаются внутри главного канала. Инициация транскрипции осуществляется холоферментом РНКП, который содержит дополнительную ст-субъединицу, необходимую для узнавания промоторов и плавления ДНК вокруг стартовой точки транскрипции. В ходе инициации РНКП может синтезировать короткие абортивные РНК-продукты, оставаясь при этом прочно связанной с промотором. Переход к синтезу полноразмерных РНК сопровождается диссоциацией с-субъединицы из транскрипционного комплекса. Элонгационный комплекс РНКП характеризуется очень высокой стабильностью, что является необходимым условием для обеспечения процессивности работы фермента, позволяя РНКП оставаться связанной с ДНК и РНК в течение всего процесса элонгации. Таким образом, эффективный и точный синтез РНК бактериальной РНКП определяется сложными и динамическими взаимодействиями фермента с нуклеиновыми кислотами.

Анализ пространственной структуры РНКП позволил предположить, какие домены фермента ответственны за узнавание промоторов, плавление ДНК, уход РНКП с промотора и стабилизацию промоторных и элонгационных комплексов (Cramer et al., 2001а; Gnatt et al., 2001; Vassylyev et al., 2002a; Vassylyev et al., 2007a; Vassylyev et al., 2007d; Zhang et al., 1999a). В то же время, функции большинства из этих районов РНКП в процессе транскрипции и ее регуляции детально не изучены. Сделанные на основе структурного анализа предположения о функциях различных доменов РНКП во взаимодействиях с ДНК требуют экспериментальной проверки. Структура РНКП Escherichia coli, которая лучше всего изучена биохимическими и генетическими методами, остается неизвестной. Кроме того, неизвестна пространственная структура промоторных комплексов бактериальной РНКП. В связи в этим, в настоящее время остро стоит вопрос о необходимости поиска новых подходов к изучению механизмов взаимодействий РНКП с ДНК на разных стадиях транскрипции. Одним из таких подходов может являться анализ ДНК-аптамеров, специфически узнаваемых РНКП, который может бьтть использован для изучения механизмов РНКП-ДНК взаимодействий на разных стадиях транскрипции, в том числе, специфических взаимодействий с промоторами.

Сравнение пространственных структур РНКП в различных состояниях выявило несколько подвижных доменов в р- и Р'-субъединицах (в частности, домен P'-clamp, «зажим»), которые способны занимать различное положение на разных стадиях транскрипции и участвовать в контактах с ДНК. Было предположено, что P'-clamp играет основную роль в стабилизации транскрипционных комплексов, за счет «закрывания» переднего дуплекса ДНК и ДНК-РНК-гибрида внутри главного канала РНКП (Gnatt et al., 2001; Vassylyev et al., 2002a; Vassylyev et al., 2007a; Zhang et al., 1999a). Домен p'-clamp соединяется с основным телом РНКП через несколько подвижных «шарниров» (так называемые switch-районы), наиболее консервативным из которых является район P'-switch2 (SW2), который напрямую контактирует с матричной цепью ДНК в районе активного центра фермента (Brueckner and Cramer, 2008а; Gnatt et al., 2001; Kettenberger et al., 2004b; Vassylyev et al., 2007a; Vassylyev et al., 2007d; Wang et al., 2006b). Кроме того, в холоферменте РНКП район SW2 взаимодействует с районом 3.2 а-субъединицы, который, как было показано ранее, участвует в связывании инициаторных нуклеотидов и уходе РНКП с промотора в процессе инициации (Kulbachinskiy and Mustaev, 2006; Murakami et al., 2002c; Nickels et al., 2005). Это позволяет предполагать, что SW2 также может играть роль в инициации транскрипции. Кроме того, рядом с районом SW2 находится участок связывания важнейшего ингибитора работы бактериальной РНКП — антибиотика рифампицина (Artsimovitch et al., 2005; Campbell et al., 2001), однако, возможное участие района SW2 в подавлении активности РНКП рифампицином остается неизвестным.

Таким образом, детальное исследование функциональной роли района SW2 должно дать важную информацию о механизмах инициации и элонгации транскрипции РНКП.

В ходе элонгации транскрипции РНКП может совершать временные остановки -транскрипционные паузы, — которые могут быть вызвана наличием в последовательности ДНК особых регуляторных сигналов. Транскрипционные паузы имеют важное значение для регуляции работы оперонов прокариот, а также многих генов эукариот (Nechaev and Adelman, 2008). В настоящее время существует несколько различных моделей механизмов образования таких пауз, однако механизм узнавания сигналов пауз РНКП во многом остается неисследованным. По-видимому должны существовать районы РНКП, способные специфически взаимодействовать с сигналами таких пауз и приводящие к ряду структурных перестроек в активном центре РНКП при остановке элонгации (Artsimovitch and Landick, 1998; Chan et al., 1997). Предполагается, что узнавание некоторых типов сигналов пауз может происходить в результате контактов нематричной цепи ДНК с РНКП. Однако, современные структурные модели элонгационного комплекса не позволяют точно предсказать положение нематричной цепи ДНК. Моделирование показывает (Vassylyev et al., 2007а), что важную роль в контактах с нематричной цепью ДНК в расплавленном участке и в узнавании сигналов пауз может играть район p-fork-loop2 (FL2) (З-субъединицы РНКП. Исследование функциональной роли района FL2 на разных стадиях транскрипции, в том числе, в процессах узнавания сигналов пауз, позволит более детально понять некоторые принципы регуляции транкрипции и вклад в них специфических взаимодействий РНКП с ДНК в ходе элонгации.

Важно подчеркнуть, что понимание детальных механизмов транскрипции и ее регуляции представляет не только фундаментальный интерес, но и имеет важнейшее практическое значение. Многие опаснейшие заболевания человека и домашних животных связаны с возбудителями бактериальной природы, поэтому создание новых антибиотиков является одной из важнейших задач. Исследование механизмов транскрипции, детальное изучение функциональной роли районов РНКП, взаимодействующих с ДНК, и механизмов работы известных антибиотиков необходимо для разработки новых методов подавления активности РНКП, получения новых ингибиторов фермента и антибиотиков, которые могут применятся для терапии широкого спектра инфекционных заболеваний.

Цели и задачи исследования

1. Охарактеризовать одноцепочечные ДНК-аптамеры, специфически взаимодействующие с холоферментом РНКП Е. coli. Получить искусственные промоторы на основе алтамеров и определить, какие элементы последовательности ДНК являются необходимыми для инициации транскрипции.

2. Изучить функциональную роль участков РНКП switch2 Р' и fork-loop2 р, взаимодействующих с матричной и нематричной цепями ДНК в области активного центра фермента, на разных стадиях транскрипции: в образовании промоторных комплексов, связывании инициаторных нуклеотидов, уходе РНКП с промотора, элонгации синтеза РНК и узнавании регуляторных сигналов на стадии элонгации.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Пупов, Данил Владимирович

4. ВЫВОДЫ

1. Холоферменх РНКП Е. coli специфически узнает одноцепочечные ДНК-аптамеры, которые содержат в своем составе -10 и TG-элементы промотора и по своей вторичной структуре аналогичны расплавленному участку ДНК в составе открытого промоторного комплекса.

4. Контакты района switch2 с ДНК стимулируют связывание инициаторных нуклеотидов в активном центре РНКП Е. coli. Район 3.2 осубъединицы, взаимодействующий с switch2, может играть аналогичную роль в связывании нуклеотидов в процессе инициации.

5. Антибиотик рифампицин значительно ухудшает связывание субстратов в процессе инициации транскрипции. Мутации в районе switch2 ß'-субъединицы и районе 3.2 ст-субъединицы влияют на эффективность действия антибиотика.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Pupov Р., Miropolskaya N., Sevostyanova A., Bass I., Artsimovitch I., Kulbachinskiy

A. 2010. Multiple roles of the RNA polymerase 'P SW2 region in transcription initiation, promoter escape, and RNA elongation. Nucleic Acids Research. 38 (17): 5784-5796

2. Пупов Д.В., Кульбачинский A.B. 2010. Структурная динамика активного центра многосубъединичных РНК-полимераз в процессе синтеза и редактирования РНК. Молекулярная биология, т. 44: 573-590

Материалы всероссийских и международных конференций:

1. Kulbachinskiy A., Pupov Р., Miropolskaya N., Esyunina P. Molecular mechanisms underlying fidelity of RNA synthesis by bacterial RNA polymerase. The 7th International Conference on Bioinformatics of Genom Regulation and Structure. June 20-27, 2010, Novosibirsk, Russia.

2- Пупов Д.В., Кульбачинский A.B. Механизмы подавления активности бактериальной РНК-полимеразы антибиотиком рифампицином и аптамерами. 14 Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология — наука XXI века». Пущино, 2010 г., 20-23 апреля. Том 2, с. 174

3. Пупов Д.В., Миропольская Н.А., Кульбачинский А.В. Роль района switch-2 во взаимодействиях РНК-полимеразы с ДНК на разных стадиях транскрипции. 2-й Международный форум по нанотехнологиям. 6-8 октября 2009 г., Москва, Россия, с. 490-491.

4. Пупов Д.В., Есюнина Д.М., Кульбачинский А.В. Создание однонитевых транскрипционных матриц для РНК-полимеразы с использованием метода SELEX.

I-й Международный форум по нанотехнологиям. 3-5 декабря 2008 г., Москва, Россия, с. 504-505.

5. Kulbachinskiy A., Pupov P., Barinova N. Analysis of promoter recognition by bacterial RNA polymerase using model DNA substrates. XX International Congress of Genetics. «Genetics - understanding living systems». July 12-17,2008, Berlin, Germany, p.292

6. Кульбачинский A.B., Пупов Д.В., Баринова H.A. Исследование структуры РНК-полимеразы и механизмов узнавания промоторов при помощи аптамеров. IV Съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, 2008 г.,

II-15 мая. с. 66.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор искренне благодарит A.B. Кульбачинского и В.А. Гвоздева за организацию данной работы, руководство, ценные советы и критические замечания в процессе ее выполнения, И.А. Басс за огромную помощь в проведении экспериментов. Автор благодарит H.A. Миропольскую, М.А. Петрову и Д.М. Есюнину за советы по оформлению диссертации и редактирование текста. Автор очень признателен И. Арцимович и А. Севостъяновой за предоставление плазмид и препаратов белков. Автор особенно благодарен Ж. М. Горленко, Г.Л. Коган, С.З. Миндлин, Т.С. Логутенковой и всем сотрудникам ЛМГМ и ОМГЖ ИМГ РАН за постоянное внимание, доброе отношение и огромную моральную подержку в процессе выполнения этой работы. Кроме того, автор благодарен преподавателям Кафедры молекулярной биологии Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова за полученные знания и навыки экспериментальной работы.

3.4. Заключение

В данной работе мы исследовали функциональную роль специфических и неспецифических взаимодействий РНКП Е. coli с различными участками ДНК-матрицы на разных стадиях транскрипции. Первая часть данной работы была посвящена анализу структуры и функциональных характеристик оцДНК-аптамеров, специфически узнаваемых холоферментов РНКП Е. coli, и созданию однонитевых матриц на их основе Вторая и третья части работы были посвящены исследованию функции районов ß'-switch2 (SW2) и ß-fork-1оор2 (FL2) РНКП, которые способны контактировать с матричной и нематричной цепями ДНК в области активного центра РНКП, соответственно. Таким образом, в нашей работе получены важные данные как о механизмах узнавания промоторных элементов в ДНК и о механизмах узнавания однонитевых транскрипционных матриц РНКП, так и о функциях нескольких районов фермента, которые вовлечены в образование специфических и неспецифических взаимодействий с ДНК и играют важную роль на разных стадиях транскрипции.

В ходе работы впервые охарактеризованы однонитевые аптамеры, которые связываются с РНКП Е. coli и Т. thermophilus с высокой аффинностью, сравнимой с аффинностью РНКП к природным промоторам. Аптамеры содержат в своем составе TG и -10-элементы бактериального промотора, которые необходимы для связывания с РНКП. Структура аптамеров соответствует структуре расплавленного участка двунитевых промоторов, образующейся в ходе инициации транскрипции. На основе аптамеров получены транскрипционные матрицы, на которых РНКП Е. coli способна осуществлять специфическую инициацию транскрипции. Аптамеры могут служить основой для создания новых типов однонитевых промоторов для специфической инициации транскрипции различными РНКП и использоваться в структурных исследованиях механизмов инициации транскрипции. Полученные данные проясняют некоторые детали механизмов РНКП-ДНК взаимодействий на разных стадиях транскрипции, в том числе, специфических взаимодействий с промоторами.

Полученные во второй части работы результаты показывают, что район SW2 РНКП играет ключевую роль в процессах инициации и элонгации транскрипции, в том числе, в связывании промотора, образовании открытого промоторного комплекса, инициации синтеза РНК, уходе РНКП с промотора и удлинении растущей цепи РНК. Изменение конформации района SW2 с участием различных факторов может являться одним из эффективных механизмов регуляции активности РНКП на разных стадиях транскрипции. Антибиотик рифампицин способен аллостерически нарушать связывание нуклеотидов в активном центре

РНКП, причем в передаче аллостерических изменений может быть задействован район SW2. Таким образом, этот район является перспективной мишенью для получения новых ингибиторов РНКП и антибиотиков.

Полученные в третьей части работы данные позволяют предположить, что район FL2 ß-субъединицы РНКП Е. coli принимает участие во взаимодействиях фермента с нематричной цепью ДНК в области активного центра РНКП на разных стадиях транскрипции. Данные взаимодействия могут быть важны для поддержания стабильности транскрипционного комплекса, а также для узнавания РНКП сигналов транскрипционных пауз. Вместе с тем, следует подчеркнуть, что имеющиеся данные пока не позволяют однозначно утверждать, что район FL2 напрямую контактирует с нематричной ДНК. Дальнейшие исследования роли района FL2 в специфических и неспецифических взаимодействиях РНКП с ДНК требуют более полного анализа пространственных структур промоторного и элонгационного комплексов.

В целом, полученные в работе данные существенно расширяют имеющиеся представления о структуре и функциональной роли контактов РНКП с ДНК на разных стадиях транскрипции. Дальнейшие исследования функциональной роли взаимодействий РНКП с ДНК должны быть направлены с одной стороны на установление более детальной картины молекулярных событий, происходящих на разных стадиях транскрипции, с другой стороны на изучение различных механизмов регуляции синтеза РНК. Наиболее важными из задач, которые предстоит решить в дальнейших исследованиях, являются следующие.

1. Получение новых типов промоторов на основе охарактеризованных нами аптамеров для детальных структурных исследований промоторных комплексов и контактов нуклеиновых кислот с ферментом.

2. Исследование функциональной роли взаимодействий районов switch2 и fork-loop2 РНКП с ДНК в регуляции работы фермента при связывании различных транскрипционных факторов на стадиях элонгации и терминации транскрипции, а так же в механизмах образования специфических транскрипционных пауз.

3. Поиск новых ингибиторов РНКП, связывающихся в исследованных нами районах фермента, действие которых может быть основано на подавлении разных стадий транскрипции.

Можно надеяться, что прогресс в структурных исследованиях РНКП, сопряженный с биохимическим и генетическим анализом транскрипции, будет способствовать быстрому и эффективному решению поставленных задач в самое ближайшее время. Проведение этих исследований не только поможет более глубже понять один из наиболее фундаментальных генетических процессов, но будет иметь и важнейшее практическое значение, в том числе, для создания искусственных тонко-регулируемых систем генной экспрессии, получения новых лекарств и антибиотиков.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пупов, Данил Владимирович, Москва

1. Artsimovitch, I. and Landick, R., 1998. Interaction of a nascent RNA structure with RNA polymerase is required for hairpin-dependent transcriptional pausing but not for transcript release. Genes Dev, 12(19): 3110-22.

2. Artsimovitch, I. and Landick, R., 2000. Pausing by bacterial RNA polymerase is mediated by mechanistically distinct classes of signals. Proc Natl Acad Sei USA, 97(13): 7090-5.

3. Artsimovitch, I. and Landick, R, 2002. The transcriptional regulator RfaH stimulates RNA chain synthesis after recruitment to elongation complexes by the exposed nontemplate DNA strand. Cell, 109: 193-203.

4. Artsimovitch, I. et al., 2004. Structural basis for transcription regulation by alarmone ppGpp. Cell, 117(3): 299-310.

5. Artsimovitch, I. et al., 2005. Allosteric modulation of the RNA polymerase catalytic reaction is an essential component of transcription control by rifamycins. Cell, 122(3): 351-63.

6. Bailey, M.J., Hughes, C. and Koronakis, V., 1997. RfaH and the ops element, components of a novel system controlling bacterial transcription elongation. Mol Microbiol, 26(5): 845-51.

7. Bar-Nahum, G. et al., 2005. A ratchet mechanism of transcription elongation and its control. Cell, 120(2): 183-193.

8. Bar-Nahum, G. and Nudler, E., 2001. Isolation and characterization of sigma(70)-retaining transcription elongation complexes from Escherichia coli. Cell, 106(4): 443-51.

9. Barinova, N., Kuznedelov, K., Severinov, K. and Kulbachinskiy, A., 2008. Structural modules of RNA polymerase required for transcription from promoters containing downstream basal promoter element GGGA. J Biol Chem, 283(33): 22482-9.

10. Barne, K.A., Bown, J. A., Busby, S J. and Minchin, S.D., 1997. Region 2.5 of the Escherichia coli RNA polymerase sigma70 subunit is responsible for the recognition of the 'extended-10' motif at promoters. EMBO J., 16(13): 4034-4040.

11. Barrick, J.E., Sudarsan, N., Weinberg, Z., Ruzzo, W.L. and Breaker, R.R., 2005. 6S RNA is a widespread regulator of eubacterial RNA polymerase that resembles an open promoter. RNA, 11(5): 774-84.

12. Bartlett, M.S., Gaal, T., Ross, W. and Gourse, R.L., 1998. RNA polymerase mutants that destabilize RNA polymerase-promoter complexes alter NTP-sensing by rrn PI promoters. J Mol Biol, 279(2): 331-45.

13. Batada, N.N., Westover, K.D., Bushneil, D.A., Levitt, M. and Kornberg, R.D., 2004. Diffusion of nucleoside triphosphates and role of the entry site to the RNA polymerase II active center. Proc Natl Acad Sei USA, 101(50): 17361-4.

14. Belogurov, G.A. et al., 2008. Transcription inactivation through local refolding of the RNA polymerase structure. Nature, 457(7227): 332-335.

15. Belogurov, G.A. et al., 2009. Transcription inactivation through local refolding of the RNA polymerase structure. Nature, 457(7227): 332-5.

16. Birch, P. and Khan, S.A., 1992. Replication of single-stranded plasmid pT181 DNA in vitro. Proc Natl Acad Sei USA, 89(1): 290-4.

17. Boe, L., Gros, M.F., te Riele, H., Ehrlich, S.D. and Gruss, A., 1989. Replication origins of single-stranded-DNA plasmidpUBl 10. J Bacteriol, 171(6): 3366-72.

18. Brodolin, K., Zenkin, N., Mustaev, A., Mamaeva, D. and Heumann, H., 2004. The sigma 70 subunit of RNA polymerase induces lacUV5 promoter-proximal pausing of transcription. Nat Struct Mol Biol, 11(6): 551-7.

19. Bron, S., Bosma, P., van Belkum, M. and Luxen, E., 1987. Stability function in the Bacillus subtilis plasmid pTA 1060. Plasmid, 18(1): 8-15.

20. Brueckner, F. and Cramer, P., 2008. Structural basis of transcription inhibition by alpha-amanitin and implications for RNA polymerase II translocation. Nat. Struct. Mol. Biol., 15(8): 811-818.

21. Brueckner, F., Ortiz, J. and Cramer, P., 2009. A movie of the RNA polymerase nucleotide addition cycle. Curr Opin Struct Biol, 19(3): 294-9.

22. Buc, H. and McClure, W.R., 1985. Kinetics of open complex formation between Escherichia coli RNA polymerase and the lac UV5 promoter. Evidence for a sequential mechanism involving three steps. Biochemistry, 24(11): 2712-2723.

23. Burton, Z.F. et al., 2005. NTP-driven translocation and regulation of downstream template opening by multi-subunit RNA polymerases. Biochem Cell Biol, 83(4): 486-96.

24. Bushnell, D.A., Cramer, P. and Kornberg, R.D., 2002. Structural basis of transcription: alpha-amanitin-RNA polymerase II cocrystal at 2.8 A resolution. Proc Natl Acad Sci USA, 99(3): 1218-22.

25. Bussiere, F., Lehoux, J., Thompson, D.A., Skrzeczkowski, L.J. and Perreault, J., 1999. Subcellular localization and rolling circle replication of peach latent mosaic viroid: hallmarks of group A viroids. J Virol, 73(8): 6353-60.

26. Callaci, S., Heyduk, E. and Heyduk, T., 1998. Conformational changes of Escherichia coli RNA polymerase sigma70 factor induced by binding to the core enzyme. J. Biol. Chem., 273(49): 32995-3001.

27. Callaci, S., Heyduk, E. and Heyduk, T., 1999. Core RNA polymerase from E. coli induces a major change in the domain arrangement of the sigma 70 subunit. Mol. Cell, 3(2): 229-38.

28. Campbell, E.A. et al., 2001. Structural mechanism for rifampicin inhibition of bacterial rna polymerase. Cell, 104(6): 901-912.

29. Campbell, E.A. et al., 2002. Structure of the bacterial RNA polymerase promoter specificity sigma subunit. Mol Cell, 9(3): 527-39.

30. Campbell, E.A. et al., 2005. Structural, functional, and genetic analysis of sorangicin inhibition of bacterial RNA polymerase. Embo J, 24(4): 674-82.

31. Carey, J., Cameron, V., de Haseth, P.L. and Uhlenbeck, O.C., 1983. Sequence-specific interaction of R17 coat protein with its ribonucleic acid binding site. Biochemistry, 22(11): 2601-2610.

32. Chamberlin, M.J., 1976. In: R. Losick and M.J. Chamberlin (Editors), RNA polymerase. Cold Srping Harbor Lab., Cold Srping Harbor, NY, pp. 159-191.

33. Chan, C.L. and Landick, R., 1993. Dissection of the his leader pause site by base substitution reveals a multipartite signal that includes a pause RNA hairpin. J Mol Biol, 233(1): 25-42.

34. Chan, C.L., Wang, D. and Landick, R., 1997. Multiple interactions stabilize a single paused transcription intermediate in which hairpin to 3' end spacing distinguishes pause and termination pathways. J Mol Biol, 268(1): 54-68.

35. Cramer, P., 2002. Multisubunit RNA polymerases. Curr Opin Struct Biol, 12(1): 89-97.

36. Cramer, P., Bushnell, D.A. and Kornberg, R.D., 2001. Structural basis of transcription: RNA polymerase II at 2.8 angstrom resolution. Science, 292(5523): 1863-1876.

37. Dang, C. and Jayasena, S.D., 1996. Oligonucleotide inhibitors of Taq DNA polymerase facilitate detection of low copy number targets by PCR. J. Mol. Biol., 264(2): 268-278.

38. Dempsey, L.A., Zhao, A.C. and Khan, S.A., 1995. Localization of the start sites of laggingstrand replication of rolling-circle plasmids from gram-positive bacteria. Mol Microbiol, 15(4): 679-87.

39. Dombroski, A.J., Walter, W.A. and Gross, C.A., 1993. Amino-terminal amino acids modulate sigma-factor DNA-binding activity. Genes Dev, 7(12A): 2446-55.

40. Donahue, J.P. and Turnbough, C.L., Jr., 1990. Characterization of transcriptional initiation from promoters PI and P2 of the pyrBI operon of Escherichia coli K12. J Biol Chem, 265(31): 19091-9.

41. Eaton, B.E., Gold, L. and Zichi, D.A., 1995. Let's get specific: the relationship between specificity and affinity. Chem. Biol., 2(10): 633-638.

42. Ebright, R.H., 2000. RNA polymerase: structural similarities between bacterial RNA polymerase and eukaryotic RNA polymerase II. J Mol Biol, 304(5): 687-98.

43. Ederth, J., Artsimovitch, I., Isaksson, L.A. and Landick, R., 2002. The downstream DNA jaw of bacterial RNA polymerase facilitates both transcriptional initiation and pausing. J Biol Chem, 277(40): 37456-63.

44. Epshtein, V. et al., 2002. Swing-gate model of nucleotide entry into the RNA polymerase active center. Mol. Cell, 10(3): 623-634.

45. Feklistov, A. et al., 2006. A basal promoter element recognized by free RNA polymerase sigma subunit determines promoter recognition by RNA polymerase holoenzyme. Mol Cell, 23(1): 97-107.

46. Figueroa-Bossi, N., Guerin, M., Rahmouni, R., Leng, M. and Bossi, L., 1998. The supercoiling sensitivity of a bacterial tRNA promoter parallels its responsiveness to stringent control. EMBO J., 17(8): 2359-2367.

47. Flores, R, Daros, J.A. and Hernandez, C., 2000. Avsunviroidae family: viroids containing hammerhead ribozymes. Adv Virus Res, 55: 271-323.

48. Flores, R. et al., 1999. Viroids with hammerhead ribozymes: some unique structural and functional aspects with respect to other members of the group. Biol Chem, 380(7-8): 849-54.

49. Gnatt, A.L., Cramer, P., Fu, J., Bushnell, D.A. and Romberg, R.D., 2001. Structural basis of transcription: an RNA polymerase II elongation complex at 3.3 A resolution. Science, 292(5523): 1876-82.

50. Gold, L., Polisky, B., Uhlenbeck, O. and Yarns, M., 1995. Diversity of oligonucleotide functions. Annu Rev Biochem, 64: 763-97.

51. Gong, X.Q., Zhang, C., Feig, M. and Burton, Z.F., 2005. Dynamic error correction and regulation of downstream bubble opening by human RNA polymerase II. Mol Cell, 18(4): 461-70.

52. Gourse, R.L. et al., 1998. Strength and regulation without transcription factors: lessons from bacterial rRNA promoters. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 63: 131-9.

53. Gross, C.A. et al., 1998. The functional and regulatory roles of sigma factors in transcription. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 63: 141-155.

54. Gruss, A.D., Ross, H.F. and Novick, R.P., 1987. Functional analysis of a palindromic sequence required for normal replication of several staphylococcal plasmids. Proc Natl Acad Sci US A, 84(8): 2165-9.

55. Guajardo, R. and Sousa, R, 1997. A model for the mechanism of polymerase translocation. J Mol Biol, 265(1): 8-19.

56. Handschin, J.C. and Wehrli, W., 1976. On the kinetics of the rifampicin-RNA-polymerase complex. Differences between crude and purified enzyme fractions. Eur. J. Biochem., 66(2): 309-317.

57. Härders, J., Lukacs, N., Robert-Nicoud, M., Jovin, T.M. and Riesner, D., 1989. Imaging of viroids in nuclei from tomato leaf tissue by in situ hybridization and confocal laser scanning microscopy. EMBO J, 8(13): 3941-9.

58. Harel-Sharvit, L. et al., RNA Polymerase II Subunits Link Transcription and mRNA Decay to Translation. Cell, 143(4): 552-63.

59. Haugen, S.P., Ross, W. and Gourse, R.L., 2008. Advances in bacterial promoter recognition and its control by factors that do not bind DNA. Nat Rev Microbiol, 6(7): 507-19.

60. Higashitani, A., Higashitani, N. and Horiuchi, K., 1997. Minus-strand origin of filamentous phage versus transcriptional promoters in recognition of RNA polymerase. Proc Natl Acad Sei USA, 94(7): 2909-14.

61. Higashitani, N, Higashitani, A., Guan, Z.W. and Horiuchi, K., 1996. Recognition mechanisms of the minus-strand origin of phage fl by Escherichia coli RNA polymerase. Genes Cells, 1(9): 829-41.

62. Higashitani, N., Higashitani, A. and Horiuchi, K., 1995. SOS induction in Escherichia coli by single-stranded DNA of mutant filamentous phage: monitoring by cleavage of LexA repressor. J Bacteriol, 177(12): 3610-2.

63. Higashitani, N., Higashitani, A., Roth, A. and Horiuchi, K., 1992. SOS induction in Escherichia coli by infection with mutant filamentous phage that are defective in initiation of complementary-strand DNA synthesis. J Bacteriol, 174(5): 1612-8.

64. Hinkle, D.C., Mangel, W.F. and Chamberlin, M.J., 1972. Studies of the binding of Escherichia coli RNA polymerase to DNA. IV. The effect of rifampicin on binding and on RNA chain initiation. J. Mol. Biol., 70(2): 209-220.

65. Holmes, S.F. and Erie, D.A., 2003. Downstream DNA sequence effects on transcription elongation. Allosteric binding of nucleoside triphosphates facilitates translocation via a ratchet motion. J Biol Chem, 278(37): 35597-608.

66. Horiuchi, K. and Zinder, N.D., 1976. Origin and direction of synthesis of bacteriophage fl DNA. Proc Natl Acad Sei USA, 73(7): 2341-5.

67. Hsu, L.M., 2002. Promoter clearance and escape in prokaryotes. Biochim Biophys Acta, 1577(2): 191-207.

68. Hsu, L.M., 2009. Monitoring abortive initiation. Methods, 47(1): 25-36.

69. Jin, D.J. and Gross, C.A., 1988. Mapping and sequencing of mutations in the Escherichia coli rpoB gene that lead to rifampicin resistance. J. Mol. Biol., 202(1): 45-58.

70. Johnson, R.S., Strausbauch, M., Cooper, R. and Register, J.K., 2008. Rapid kinetic analysis of transcription elongation by Escherichia coli RNA polymerase. J Mol Biol, 381(5): 110613.

71. Kaguni, J.M. and Kornberg, A., 1982. The rho subunit of RNA polymerase holoenzyme confers specificity in priming M13 viral DNA replication. J Biol Chem, 257(10): 5437-43.

72. Kapanidis, A.N. et al., 2006. Initial transcription by RNA polymerase proceeds through a DNA-scrunching mechanism. Science, 314(5802): 1144-7.

73. Kaplan, C.D., Larsson, K.M. and Kornberg, R.D., 2008. The RNA polymerase II trigger loop functions in substrate selection and is directly targeted by alpha-amanitin. Mol Cell, 30(5): 547-56.

74. Kettenberger, H., Armache, K.J. and Cramer, P., 2004. Complete RNA polymerase II elongation complex structure and its interactions with NTP and TFIIS. Mol. Cell, 16(6): 955965.

75. Kettenberger, H. et al., 2006. Structure of an RNA polymerase II-RNA inhibitor complex elucidates transcription regulation by noncoding RNAs. Nat Struct Mol Biol, 13(1): 44-8.

76. Khan, S.A., 2000. Plasmid rolling-circle replication: recent developments. Mol Microbiol, 37(3): 477-84.

77. Kireeva, M., Kashlev, M. and Burton, Z.F., 2010. Translocation by multi-subunit RNA polymerases. Biochim Biophys Acta.

78. Kireeva, M. et al., 2009. Millisecond phase kinetic analysis of elongation catalyzed by human, yeast, and Escherichia coli RNA polymerase. Methods, 48(4): 333-45.

79. Kireeva, M.L. et .al., 2008. Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation. Mol Cell, 30(5): 557-566.

80. Koepsel, R.R., Murray, R.W., Rosenblum, W.D. and Khan, S.A., 1985. The replication initiator protein of plasmid pT181 has sequence-specific endonuclease and topoisomerase-like activities. Proc Natl Acad Sei USA, 82(20): 6845-9.

81. Komissarova, N. and Kashlev, M., 1997a. RNA polymerase switches between inactivated and activated states By translocating back and forth along the DNA and the RNA. J Biol Chem, 272(24): 15329-38.

82. Komissarova, N. and Kashlev, M., 1997b. Transcriptional arrest: Escherichia coli RNA polymerase translocates backward, leaving the 3' end of the RNA intact and extruded. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 94(5): 1755-1760.

83. Korzheva, N. et al., 2000. A structural model of transcription elongation. Science, 289(5479): 619-625.

84. Kovacic, R.T., 1987. The 0 degree C closed complexes between Escherichia coli RNA polymerase and two promoters, T7-A3 and lacUV5. J Biol Chem, 262(28): 13654-61.

85. Kramer, M.G., del Solar, G. and Espinosa, M., 1995. Lagging-strand origins of the promiscuous plasmid pMV158: physical and functional characterization. Microbiology, 141 (Pt 3): 655-62.

86. Kramer, M.G., Espinosa, M., Misra, T.K. and Khan, S.A., 1999. Characterization of a singlestrand origin, ssoU, required for broad host range replication of rolling-circle plasmids. Mol Microbiol, 33(3): 466-75.

87. Kramer, M.G., Khan, S.A. and Espinosa, M., 1997. Plasmid rolling circle replication: identification of the RNA polymerase-directed primer RNA and requirement for DNA polymerase I for lagging strand synthesis. EMBO J, 16(18): 5784-95.

88. Kramer, M.G., Khan, S.A. and Espinosa, M., 1998. Lagging-strand replication from the ssoA origin of plasmid pMV158 in Streptococcus pneumoniae: in vivo and in vitro influences of mutations in two conserved ssoA regions. J Bacteriol, 180(1): 83-9.

89. Kulbachinskiy, A., Feklistov, A., Krasheninnikov, I., Goldfarb, A. and Nikiforov, V., 2004. Aptamers to Escherichia coli core RNA polymerase that sense its interaction with rifampicin, sigma-subunit and GreB. Eur. J. Biochem., 271(23-24): 4921-4931.

90. Kulbachinskiy, A. and Mustaev, A., 2006. Region 3.2 of the sigma subunit contributes to the binding of the 3'-initiating nucleotide in the RNA polymerase active center and facilitates promoter clearance during initiation. J Biol Chem, 281(27): 18273-6.

91. Kulbachinskiy, A.V., 2007. Methods for selection of aptamers to protein targets. Biochemistry (Mose), 72(13): 1505-18.

92. Kuznedelov, K. et al., 2002. A role for interaction of the RNA polymerase flap domain with the sigma subunit in promoter recognition. Science, 295(5556): 855-7.

93. Kuznedelov, K., Minakhin, L. and Severinov, K., 2003. Preparation and characterization of recombinant Thermus aquaticus RNA polymerase. Methods Enzymol., 370: 94-108.

94. Laemmli, U.K., 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227(5259): 680-5.

95. Landick, R., 2005. NTP-entiy routes in multi-subunit RNA polymerases. Trends Biochem Sci, 30(12): 651-4.

96. Lane, W.J. and Darst, S.A., 2010. Molecular evolution of multisubunit RNA polymerases: sequence analysis. J Mol Biol, 395(4): 671-85.

97. Lee, C.A., Fournier, M.J. and Beckwith, J., 1985. Escherichia coli 6S RNA is not essential for growth or protein secretion. J Bacteriol, 161(3): 1156-61.

98. Lisitsyn, N.A., Gur'ev, S.O., Sverdlov, E.D., Moiseeva, E.P. and Nikiforov, V.G., 1984a. Nucleotide substitutions in the rpoB gene leading to rifampicin resistance of E. coli RNA polymerase. Bioorg. Khim., 10(1): 127-128.

99. Lisitsyn, N.A., Sverdlov, E.D., Moiseyeva, E.P., Danilevskaya, O.N. and Nikiforov, V.G., 1984b. Mutation to rifampicin resistance at the beginning of the RNA polymerase beta subunit gene in Escherichia coli. Mol. Gen. Genet., 196(1): 173-174.

100. Malhotra, A., Severinova, E. and Darst, S.A., 1996. Crystal structure of a sigma 70 subunit fragment from E. coli RNA polymerase. Cell, 87(1): 127-136.

101. McClure, W.R. and Cech, C.L., 1978. On the mechanism of rifampicin inhibition of RNA synthesis. J. Biol. Chem., 253(24): 8949-8956.

102. Meijer, W.J., van der Lelie, D., Venema, G. and Bron, S., 1995. Effects of the generation of single-stranded DNA on the maintenance of plasmid pMV158 and derivatives in Lactococcus lactis. Plasmid, 33(2): 91-9.

103. Mukhopadhyay, J. et al., 2008. The RNA polymerase "switch region" is a target for inhibitors. Cell, 135(2): 295-307.

104. Mukhopadhyay, J. et al., 2001. Translocation of sigma(70) with RNA polymerase during transcription: fluorescence resonance energy transfer assay for movement relative to DNA. Cell, 106(4): 453-63.

105. Murakami, K.S., Masuda, S., Campbell, E.A., Muzzin, O. and Darst, S.A., 2002a. Structural basis of transcription initiation: an RNA polymerase holoenzyme-DNA complex. Science, 296(5571): 1285-1290.

106. Murakami, K.S., Masuda, S. and Darst, S.A., 2002b. Structural basis of transcription initiation: RNA polymerase holoenzyme at 4 A resolution. Science, 296(5571): 1280-1284.

107. Murray, H.D., Schneider, D.A. and Gourse, R.L., 2003. Control of rRNA expression by small molecules is dynamic and nonredundant. Mol Cell, 12(1): 125-34.

108. Naji, S., Bertero, M.G., Spitalny, P., Cramer, P. and Thomm, M., 2008. Structure-function analysis of the RNA polymerase cleft loops elucidates initial transcription, DNA unwinding and RNA displacement. Nucleic Acids Res, 36(2): 676-87.

109. Naryshkin, N. Revyakin, A., Kim, Y., Mekler, V. and Ebright, R.H., 2000. Structural organization of the RNA polymerase-promoter open complex. Cell, 101(6): 601-611.

110. Naryshkina, T., Kuznedelov, K. and Severinov, K., 2006. The role of the largest RNA polymerase subunit lid element in preventing the formation of extended RNA-DNA hybrid. J Mol Bioi 361(4): 634-43.

111. Navarro, J.A., Daros, J.A. and Flores, R., 1999. Complexes containing both polarity strands of avocado sunblotch viroid: identification in chloroplasts and characterization. Virology, 253(1): 77-85.

112. Navarro, J.A., Vera, A. and Flores, R., 2000. A chloroplastic RNA polymerase resistant to tagetitoxin is involved in replication of avocado sunblotch viroid. Virology, 268(1): 218-25.

113. Nechaev, S. and Adelman, K., 2008. Promoter-proximal Pol II: when stalling speeds things up. Cell Cycle, 7(11): 1539-44.

114. Nedialkov, Y.A. et al., 2003. NTP-driven translocation by human RNA polymerase II. J Biol Chem, 278(20): 18303-12.

115. Nickels, B.E. et al., 2005. The interaction between sigma70 and the beta-flap of Escherichia coli RNA polymerase inhibits extension of nascent RNA during early elongation. Proc Natl Acad Sei USA, 102(12): 4488-93.

116. Nickels, B.E., Mukhopadhyay, J., Garrity, S.J., Ebright, R.H. and Hochschild, A., 2004. The sigma 70 subunit of RNA polymerase mediates a promoter-proximal pause at the lac promoter. Nat Struct Mol Biol, 11(6): 544-50.

117. Nudler, E., 1999. Transcription elongation: structural basis and mechanisms. J Mol Biol, 288(1): 1-12.

118. Nudler, E., 2009. RNA polymerase active center: the molecular engine of transcription. Annu Rev Biochem, 78: 335-61.

119. Nudler, E., Kashlev, M., Nikiforov, V. and Goldfarb, A., 1995. Coupling between transcription termination and RNA polymerase inchworming. Cell, 81(3): 351-357.

120. Nudler, E., Mustaev, A., Lukhtanov, E. and Goldfarb, A., 1997. The RNA-DNA hybrid maintains the register of transcription by preventing backtracking of RNA polymerase. Cell, 89(1): 33-41.

121. Orlova, M., Newlands, J., Das, A., Goldfarb, A. and Borukhov, S., 1995. Intrinsic transcript cleavage activity of RNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 92(10): 4596-4600.

122. Ovchinnikov, Y.A. et al., 1983. RNA polymerase rifampicin resistance mutations in Escherichia colt sequence changes and dominance. Mol. Gen. Genet., 190(2): 344-8.

123. Pelchat, M., Cote, F. and Perreault, J.P., 2001. Study of the polymerization step of the rolling circle replication of peach latent mosaic viroid. Arch Virol, 146(9): 1753-63.

124. Pelchat, M., Grenier, C. and Perreault, J.P., 2002. Characterization of a viroid-derived RNA promoter for the DNA-dependent RNA polymerase from Escherichia coli. Biochemistry, 41(20): 6561-71.

125. Pelchat, M. et al., 2000. Sequencing of peach latent mosaic viroid variants from nine North American peach cultivars shows that this RNA folds into a complex secondary structure. Virology, 271(1): 37-45.

126. Revyakin, A., Liu, C., Ebright, R.H. and Strick, T.R., 2006. Abortive initiation and productive initiation by RNA polymerase involve DNA scrunching. Science, 314(5802): 1139-43.

127. Ring, B.Z., Yarnell, W.S. and Roberts, J.W., 1996. Function of E. coli RNA polymerase sigma factor sigma 70 in promoter-proximal pausing. Cell, 86(3): 485-93.

128. Rozovskaya, T.A., Chenchik, A.A. and Beabealashvilli, R., 1982. Processive pyrophosphorolysis of RNA by Escherichia coli RNA polymerase. FEBS Lett, 137(1): 1004.

129. Rozovskaya, T.A. et al., 1984. The mechanism of pyrophosphorolysis of RNA by RNA polymerase. Endowment of RNA polymerase with artificial exonuclease activity. Biochem. J., 224(2): 645-650.

130. Rudd, M.D., Izban, M.G. and Luse, D.S., 1994. The active site of RNA polymerase II participates in transcript cleavage within arrested ternary complexes. Proc Natl Acad Sci U S A, 91(17): 8057-61.

131. Rutherford, S.T., Villers, C.L., Lee, J.H., Ross, W. and Gourse, R.L., 2009. Allosteric control of Escherichia coli rRNA promoter complexes by DksA. Genes Dev, 23(2): 236-48.

132. Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., 1989. Molecular cloning. Cold Spring Harbour Press.

133. Sasse-Dwight, S. and Gralla, J.D., 1989. KMn04 as a probe for lac promoter DNA melting and mechanism in vivo. J Biol Chem, 264(14): 8074-81.

134. Schickor, P., Metzger, W., Werel, W., Lederer, H. and Heumann, H., 1990. Topography of intermediates in transcription initiation of E.coli. Embo J, 9(7): 2215-20.

135. Schroeder, L.A. and deHaseth, P.L., 2005. Mechanistic differences in promoter DNA melting by Thermus aquaticus and Escherichia coli RNA polymerases. J Biol Chem, 280(17): 17422-9.

136. Schwartz, E.C. et al., 2008. A full-length group 1 bacterial sigma factor adopts a compact structure incompatible with DNA binding. Chem Biol, 15(10): 1091-103.

137. Seegers, J.F. et al., 1995. Structural and functional analysis of the single-strand origin of replication from the lactococcal plasmid pWVOl. Mol Gen Genet, 249(1): 43-50.

138. Severinov, K., Soushko, M., Goldfarb, A. and Nikiforov, V., 1993. Rifampicin region revisited. New rifampicin-resistant and streptolydigin-resistant mutants in the beta subunit of Escherichia coli RNA polymerase. J. Biol. Chem., 268(20): 14820-14825.

139. Severinov, K., Soushko, M., Goldfarb, A. and Nikiforov, V., 1994. RifR mutations in the beginning of the Escherichia coli rpoB gene. Mol. Gen. Genet., 244(2): 120-126.

140. Sosunov, V. et al., 2003. Unified two-metal mechanism of RNA synthesis and degradation by RNA polymerase. EMBO J., 22(9): 2234-2244.

141. Sosunov, V. et al., 2005. The involvement of the aspartate triad of the active center in all catalytic activities of multisubunit RNA polymerase. Nucleic Acids Res, 33(13): 4202-4211.

142. Spassky, A., Busby, S.J., Danchin, A. and Buc, H., 1979. On the binding of tRNA to Escherichia coli RNA polymerase. Eur J Biochem, 99(1): 187-201.

143. Steitz, T.A., 1998. A mechanism for all polymerases. Nature, 391(6664): 231-232.

144. Steitz, T.A., 2006. Visualizing polynucleotide polymerase machines at work. Embo J, 25(15): 3458-68.

145. Steitz, T.A., 2009. The structural changes of T7 RNA polymerase from transcription initiation to elongation. Curr Opin Struct Biol, 19(6): 683-90.

146. Steitz, T.A., Smerdon, S.J., Jager, J. and Joyce, C.M., 1994. A unified polymerase mechanism for nonhomologous DNA and RNA polymerases. Science, 266(5193): 2022-5.

147. Svetlov, V. and Nudler, E., 2009. Macromolecular micromovements: how RNA polymerase translocates. Curr Opin Struct Biol, 19(6): 701-7.

148. Svetlov, V., Vassylyev, D.G. and Artsimovitch, I., 2004. Discrimination against deoxyribonucleotide substrates by bacterial RNA polymerase. J. Biol. Chem., 279(37): 38087-90.

149. Sydow, J.F. et al., 2009. Structural basis of transcription: mismatch-specific fidelity mechanisms and paused RNA polymerase II with frayed RNA. Mol Cell, 34(6): 710-21.

150. Sydow, J.F. and Cramer, P., 2009. RNA polymerase fidelity and transcriptional proofreading. Curr Opin Struct Biol, 19(6): 732-9.

151. Temiakov, D. et al., 2005. Structural basis of transcription inhibition by antibiotic streptolydigin. Mol. Cell, 19(5): 655-666.

152. Thomas, M. et al., 1997. Selective targeting and inhibition of yeast RNA polymerase II by RNA aptamers. J. Biol. Chem., 272(44): 27980-27986.

153. Toulokhonov, I. and Landick, R, 2006. The role of the lid element in transcription by E. coli RNA polymerase. J Mol Biol, 361(4): 644-58.

154. Toulokhonov, I., Zhang, J., Palangat, M. and Landick, R, 2007. A central role of the RNA polymerase trigger loop in active-site rearrangement during transcriptional pausing. Mol Cell, 27(3): 406-419.

155. Trotochaud, A.E. and Wassarman, K.M., 2004. 6S RNA function enhances long-term cell survival. J Bacteriol, 186(15): 4978-85.

156. Trotochaud, A.E. and Wassarman, K.M., 2005. A highly conserved 6S RNA structure is required for regulation of transcription. Nat Struct Mol Biol, 12(4): 313-9.

157. Tuerk, C., MacDougal, S. and Gold, L., 1992. RNA pseudoknots that inhibit human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 89(15): 6988-6992.

158. Vassylyev, D.G. et al., 2002. Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 A resolution. Nature, 417(6890): 712-719.

159. Vassylyev, D.G. et al., 2005. Structural basis for transcription inhibition by tagetitoxin. Nat Struct Mol Biol, 12(12): 1086-93.

160. Vassylyev, D.G., Vassylyeva, M.N., Perederina, A., Tahirov, T.H. and Artsimovitch, I., 2007. Structural basis for transcription elongation by bacterial RNA polymerase. Nature, 448(7150): 157-62.

161. Vassylyev, D.G. et al., 2007. Structural basis for substrate loading in bacterial RNA polymerase. Nature, 448(7150): 163-8.

162. Vuthoori, S., Bowers, C.W., McCracken, A., Dombroski, A.J. and Hinton, D.M., 2001. Domain 1.1 of the sigma(70) subunit of Escherichia coli RNA polymerase modulates the formation of stable polymerase/promoter complexes. J. Mol. Biol., 309(3): 561-572.

163. Walmacq, C. et al., 2009. Rpb9 subunit controls transcription fidelity by delaying NTP sequestration in RNA polymerase II. J Biol Chem, 284(29): 19601-12.

164. Walter, P. and Blobel, G., 1983. Disassembly and reconstitution of signal recognition particle. Cell, 34(2): 525-33.

165. Wang, D. et al., 2009. Structural basis of transcription: backtracked RNA polymerase II at 3.4 angstrom resolution. Science, 324(5931): 1203-6.

166. Wang, D., Bushnell, D.A., Westover, K.D., Kaplan, C.D. and Kornberg, R.D., 2006. Structural basis of transcription: role of the trigger loop in substrate specificity and catalysis. Cell, 127(5): 941-954.

167. Wang, D. and Hawley, D.K., 1993. Identification of a 3'—>5' exonuclease activity associated with human RNA polymerase II. Proc Natl Acad Sei USA, 90(3): 843-7.

168. Wassarman, K.M., 2007. 6S RNA: a small RNA regulator of transcription. Curr Opin Microbiol, 10(2): 164-8.

169. Wassarman, K.M. and Saecker, R.M., 2006. Synthesis-mediated release of a small RNA inhibitor of RNA polymerase. Science, 314(5805): 1601-3.

170. Wassarman, K.M. and Storz, G., 2000. 6S RNA regulates E. coli RNA polymerase activity. Cell, 101(6): 613-23.

171. Westover, K.D., Bushnell, D.A. and Kornberg, R.D., 2004. Structural basis of transcription: nucleotide selection by rotation in the RNA polymerase II active center. Cell, 119(4): 481-9.

172. Yarbrough, L.R., Wu, F.Y. and Wu, C.W., 1976. Molecular mechanism of the rifampicin-RNA polymerase interaction. Biochemistry, 15(12): 2669-2676.

173. Young, B.A., Gruber, T.M. and Gross, C.A., 2002. Views of transcription initiation. Cell, 109(4): 417-20.

174. Zaychikov, E. et al., 1996. Mapping of catalytic residues in the RNA polymerase active center. Science, 273(5271): 107-9.

175. Zenkin, N., Naryshkina, Т., Kuznedelov, K. and Severinov, K., 2006. The mechanism of DNA replication primer synthesis by RNA polymerase. Nature, 439(7076): 617-20.

176. Zenkin, N. and Severinov, K., 2004. The role of RNA polymerase sigma subunit in promoter-independent initiation of transcription. Proc Natl Acad Sci USA, 101(13): 4396400.

177. Zhang, G. et al., 1999. Crystal structure of Thermus aquaticus core RNA polymerase at 3.3 A resolution. Cell, 98(6): 811-24.

178. Zhang, J., Palangat, M. and Landick, R., 2010. Role of the RNA polymerase trigger loop in catalysis and pausing. Nat Struct Mol Biol, 17(1): 99-104.

179. Сологуб, М.Ю., Кочетков, C.H. and Темяков, Д.Е., 2009. Транскрипция и ее регуляция в митохондриях млекопитающих и человека. Молекулярная биология, 43(2): 215-229.

180. Туницкая, B.JI. and Кочетков, С.Н., 2002. Структурно-функциональный анализ РНК-полимеразы бактериофага Т7. Биохимия, 67(10): 1360-1373.

Информация о работе

Пупов, Данил Владимирович
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.03

Диссертация

Исследование функциональной роли специфических и неспецифических взаимодействий РНК-полимеразы Escherichia coli с ДНК на разных стадиях транскрипции - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы