Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ РОСТА ТЕРМОАЦИДОФИЛЬНЫХ БАЦИЛЛ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ РОСТА ТЕРМОАЦИДОФИЛЬНЫХ БАЦИЛЛ"



ОРДЕИА ЛЕНИНА И ОРДЕН! ДРУХШ НАРСЩС© АКЩЖИ HAJK ТКРШЕКОЙ ССР

оишна -ПУДОВОГО КРАСНОГО энажни институт шкроаюаопм и вирусологии мм.д.к.забоклного

pyvonici

ЦИМБЕРГ Кч^ня Аюксаядравнв

гm 579.652. IX. 24

ИССЛВДСВШЕ «йЭИОНОГО-ШОХИШЧБСЮа ОСОБЕННОСТИ РОСТА ТЕГООАЦКЦОН1ДЫШ. БЩШ

03.00.07 - мяяробвалоии

Автореферат

днссерхаци вв. оожоканве ученой степенв каамдате бжапогтчесми наук

Киев - 1966

Набот выполнена в отделе технологи* бмосинтева ордена Трудового Красного Знамен* Инотхтута мхкроОаологх* ■ вхруоологин *м.Д.К.Эаболотиого АН УССР

Научхый руководитель: доктор йхолопгпвхжх хаух, старшжйж&уч-

ный сотрудник В.С.Подгорский.

*

СфяцжалкЕые оппоненты; доктор медицине*« наук, отариий научный

сотрудник С.Р.Реаних

каддждат биологических наук, доцент С.В.Ельчяц

Ведудее учрехдекив! Киевский государственный ордена Ленина

университет хм. Т.Г.Шевченко

Защита джссертадхи оостодтоя , 1987 г. .

в Ф чаоов на заоеданжи специализированного совета Д 016.05.01 во завдте диссертаций на соискание ученой отепеин доктора Около* хяческих наук прн Ияотитуте микробиологи к вирусологии ин.Д.К. Заболотного АН УССР по адресу; 252627, ГСП, Клев-143, ул. ЗаОО-лотиого, 26.

С джообртавдей можно ознакомиться в библиотек» Инотнтута микробиологии х вирусологии ин.Д.К, ЗаОолотного АН УССР.

Автореферат разослан " " 1907 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат Снологическях наук

Коваленко А.Г.

- г -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАШШ

' Актуаяык^ть проблема. В последние года возрос интерес в микроорганизмам, развивающимся & экстремальных условиях окружающей среда. Это обусловлено тем» что выяснение физиологических и биохимических особенностей их жизнедеятельности способствует решению ряда общебиологичес них проблем /возникновения и эволюции жизни, адаптации организма к условиям внешней среди/, углубляет понимание законов жиэ н еделт ельиостл микроорганизмов и клеток вообще /Кашер, 1981/, а также тем, что эти микроорганизмы имеют практическое заачекиэ, так как синтезируют необычные метаболиты, в частности лияиды и ферменты, отличающиеся со своим свойствам от липидов и формантов ыезофильных микроорганизмов.

Наибольший практический интерес представляют аэробные микроорганизмы, растущие при наличии#двух экстремальных факторов -высокой температур и низкой кислотности среди. Это связано с тем, что температура и кислотность среда являются наиболее точно управлявшим факторами при промышленном культивировашш микроорганизмов. Возможно, что именно совместное действие высокой температура и низкого значения рН среда могут обеспечить преимущество определенных культур, обладающих ценными производственными свойствами.

Известно несколько видов тедооецидофнлышх. бактерий, выделенных из горячих источников, о оптщумом температуры роста в . пределах 50-80°С и оптимальным значением рН среды от 2 до 4. Однако их физиологические свойства изучены недостаточно для того, чтобы можно было сделать вывод о перспективности использования этюс бактерий в биотехнологии. ,

' Пелъ работы и задачи рсрдедоващя. Целью настоящей работа явилось исследование закономерностей роста и фяэиол ого-биохиш-ческкх особенностей жизнедеятельности термошядофилышх бацилл я оценка возмошшх перспектив их использования в микробиологической промышленности.

При выполнения настоящей работы были поставлены следущие задачи:

I/ выделить термоецидофилыше бактерии из экологических ниш, в которых микроорганизмы подвергаются одновременному действию двух факторов - высокой температуры в низкого.значения рН среды; провести идентификацшо выделенных бактерий;

Ц'игральная Научаая Библиотека Чоскеесаей о<>л?£а ;еп»м

/

- г -

2/ выявить оптимальные условия культивирования и исследовать физиолого-био зскмический особенности роста термовцидофкль-шх бацилл;

3/ провести анализ химического состава биомассы и аминокислотного состава баллов в.acldocaldarlua XD4| пододрать опти-шлшцв условия для действия амилолитического комплекса, синтезируемого терло ацидофильным;! бациллами.

Цаучная новизна. Проведено изучение представителей новой грушщ термоацидофильных микроорганизмов, которое в настоящее время являются недостаточно исследованными в еще не нашли применения в микробиологической промышленности;

показана возможность выделения тедооацидофнльных бацилл из самэразогревашихся породных отьалов;

исолояованы кинетика и стехиометрия роста тердеацидофиль-тсс бацилл в условиях периоднчоскоро и непрерывного культивирования;

изучены составляющие части материального баланса роста В. »cidoceldarlusi

определен химкческий состав биомассы и аминокислотный состав дедков торыоацидофильных бацилл.

ppaKftf^cciaw значимость впботц. Показана возможность непрерывного, в течоние месяца не подвергающегося контаминации, культивирования термоацидофильных бацилл в лабораторных условиях на средах с глюкозой или крахмалом как единственных источников углерода. lía основании исследований кинетики и стехиометрии роста тершодид офилышх бацилл обоснован выбор оптимальных параметров ах культ ишровашм.

Культура Bacillus acidocaidarlue ID4 депонирована во Всесоюзной коллекции в Центральном Муэео промышленных микроорганизмов, коллекционный номер ЦГ.Ш D-2806.

Арробапкя работа- Материалы работи били представлены на Всесоюзной конфороиши "Термофильные микроорганизмы в природе и практике народного хозяйства" /Москва, 1983/; коррекции молодых ученых-микробпологов Узбекистана /Ташкент, 1983/; на конференции молодых ученых ."Макрооргянкзмц - продуценты биологически активных веществ" /Рига, 1984/; 111 съезде Всесоюзного микробиологического общества /Алма-Ата. 1385/; 1У симпозиуме социалистических стран по биотехнологии /Болгария, 1986/; 17 конференция по управляемому культивированию микроорганшмов /Пуищно, 1986/,

. рублшущия, результатов исследований. Материалы исследовав вий опубликованы в пяти научшх статьях и шести тезисах докладов. Две научные статьи находятся в печати,

. Структура и объем работы. Диссертационная робота изложена на 147 страницах машинописного текста и содержит г4таблвцы, 26 рисунков. Она состоит из введения» обзора литература /3 главы/, вксперименталькой части /5 глав/, обсуздения, выводов, списка использованной литературы /161 источник, из них S7 иностранных/ и приложения.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования. В работе использован штамм термофильных ацидофильных бактерий в. acldoсaldarlus id«, выделенный нами из дородных отвалов на территории Донецкого каменноугольного бассейна.

Выделение, отбор и исследование питательных потребностей B.aeidocaldarlue осуществлены на синтетической среде /carload. Brock, 1971/ и модифицированной синтетической среде, предложенной наш.

Чистые культуры хранили на твердой огаризоваяной срэде о 1% глюкозы, ра 3,5-4,0, пересевая каждые три месяца, а также в ампулах в лкофильно-высушенном веде.

Идентификации бактерий проводам но определителю Берт /Bergey" s Uaauai, 1974/, а также на основании работ отделышх исследователей /Darlaud, Broct, 1971; Логинова и др., 1976/.

Непрерывнее культивирование осуществляли в режима хемоста-та в аппарате непрерывного культивирования АИХУМ-2, разработанном в выпускаемом ОКБ биологического приборостроения АН СССР.

В хемостоте изучали установившееся состояние, характеризующееся постоянной концентрацией биомассы я сменой ев менее 5-20 генераций.

Периодическое и непрерывное культивирование B.ecidocolda-rlue ID4 осуществляли в аппарате АНКУМ-2 в незащищенных условиях. Чистоту культуры во всех опытах контролировали клкросколлро-ванием и высевали на агаразованную среду.

Дыхание бактерий: изучали ооляри^афическим методом с помощью полярогра$а ППТ-1 /СССР/.

Анализ химического. состава биомассы проводили следующими методами: определение белка - биуретоьым методом /СудонкоДЭбб/; определение липидов /Pedersen, 1962/; углеводов /Белозерский; 195Г/, нуклеиновых кислот - разделение по Шмидту и Таишуэеру /Белозерский, 1951/ и спектрофотометричвекое определение по Спирину /1958/. . - .

Аминокислотный состав dелков определяли о помощью автоматического анализатора аминокислот AAA-88I /ЧССР/.

Содержание глюкозы в культуральной жидкости определяли эбу- ' лшостатнческим методом /Емельянова, 1979/, а также о помощью ферментного электрода /ЛакшмннараянаЙах, 1979/ на основе датчика парциального давления растворенного кислорода.

Определение аымлолитической активности проводили, методом Рухлядевой и. Пшшгалиной /1981/.

Статистическую обработку данных осуществляли о помощью микро-ЭВМ "Электроника E3-2I" на основе специальных программ /Фран-цевич, 1979/,

Выделение и идентификация термоФшгт>ц;л^ риипо^илъны^ ' микроорганизмов

Выделение термофильных ацщофилышх микроорганизмов проводилось на территории Донецкого каменноугольного бассейна из двух саморазогреващахся отвалов. Температура в местах отбора проб колебалась от 25 до 85°С, а значение pH - от 0,2 до 3,8. Условия отбора проб и характеристика роста микроорганизмов в накопительных культурах представлены в табл.1.

Клетки выделенных бактерий грампелооителыше, палочковидные, размером 2-3 х 0,7-1 мкм, терминально образуют споры. На агаризо-ванной синтетической среде о глюкозой при рН 3,0 и температуре 60°С размер колоний не превышал 1,5 мм через трое суток роста.

, Дш более детальных морфологических и физиолого-йаохимичес-КЮС исследований использовался штамм Bacillus acidoealdarlue m, характеризующийся наиболее высокой скоростью-роста.

Кама била проверена способность к росту B.acidocaldariue ва 35 источниках углерода.. Выделенные ноисроорггннэмы используют в качестве источников углерода и энерпш следупаиа вещества: пш-козу, галактозу, ксилозу, сахарозу, мальтозу, крахмал, маянит, янтарнокислый натрий,.лимоннокислый натрий, яблочную, калриловую и квприновую кислоты.

TedJumal

Характеристика мест отбора проб и роста теризацвдофидышх -накопительных кулыур термоадидофпльшос микроорганизмов

Номер Едубина.см Температура. ^ Ростшкроорга-

пробы °С НИЗМОВ

Породный отвал шг&ты "Трудовская"

3 10 45 2,5 +

15 10 85 0,2 —

16 10 65. 3,0 •

17 10 45 1,6 —

18 10 65 0,9 —

19 10 55 1,6 —

3 ЭО 35 3,8

14 60 25 2,8

4 50 50 3,Э ' +

S . 70 55 3,5

8 80 55 2,5 -

10 80 70 1,7 —

Породный отвал шагтыим.акад .Скочинского

22 10 55 2,1 +

23 10 65 2,8 ■i-

84. ' 10 '60 2,8 +

25 10 60 0,8 +

26 10 60 1.0 +

Примечание: "V - среда помутнела; - среда прозрачная»

Нитрат ватряя не используется культурой в качества источника азота.

В отличие от литературных давшее о свойствах штамвдв в, ал1-¿ос(ЦД&г1ив, выделенные нами бактерии способны ассимилировать лимоайокяслий натрий.

Вуклеотвдкый состав ДНК В.воМосаДйах^в составил . 58.865 1Ц, что. совпадает с опубликованными рщше даншмж дая других: штаммов.

Таким образом, по морфолого-культуральныи и фиэиолого-био-хкмическим признакам выделенная ш культура кдадтифвддроввва как ЕаоШиа ас!(1о<1в4Даг1л1в.

В процессе исследований выявилось, что среда, предложенная для культивирования B.acldocaldariue . Г.Дарлендом и Т.Броком / Darland «ad Brock, 1971/, несбаяансирована по некоторым компонентам - источникам азота, фосфора и магния. Поэтому due произведен расчет дозировки этих компонентов. В рассчитанной нами среде содержание источника азота увеличено в 10 раз, фосфора и калия уменьшено в 10 раз, магния - в 5 раз, кальция - в 2,5 раза. Отмечалось уменьшение ценообразования, исчезновение оптически плотных клеточных включений, хотя показатели культивирования /концентрация биомассы, оптическая плотность, экономический коэффициент/ практически по изменились.

При уменьшении концентрации ионов кальция в среде наблюдалось изменение морфологии клеток: уменьшение размеров клеток,неравномерное деление. При увеличении количества кальция в среде до исходного отмечалось увеличение оптической плотности, уменьшение равновесной концентрации глюкозы в среде, при атом значение экономического коэффициента оставалось на прежнем уровне. По-видимому, »to свидетельствует о стимулирующем шшши ионов кальция на удальцу» скорость роста, во не на эффективность <5ио-синаетических процессов.

Кинотика и стехиометрия doçtb ^еd^anцрос^шьинх <?аиилд

Изучение физиологических особенностей роста и жизнедеятельности термаацидофильных микроорганизмов представляет как практический, так н теоретический интерес, что связано о необычной средой обитания этих микроорганкзмов в природе, т.о. с наличием двух экстремальных факторов, необходимых для роста B.aoidooalda-riue 104 - высокой температуры и низкого значения рН среды.

Исследование влияния температуры культивирования на удельную скорость роста проводили в условиях периодического и непрерывного культивирования.

Максимальное значение удельной скорости роста - 0,51 ч"1 получено при 60°С, что соответствует времени генерации 1,4 ч. При увеличении температуры культивирования до 65°С значение удельной скорости роста бактерий резко падало - 0,25 ч"1. Еше более значительное падание скорости роста наЛлвдалосъ при снижении температуры до 45°С - 0,20 ч-1. при -40°С рост термоацидофйяь-

них бацилл отсутспюоал /рис,1/.

Максимальная удельная скорость потребления кислорода B.aol-docaldariua наблюдалась при 70°С и составляла 0,019 мг О^/мг АСБ*мин.

Нами исследовано действие рН среди на скорость роста н интенсивность дыхания терлоацндофияышх бшиял. Максимальная удельная скорость роста B.acldocaldarlua ID4 отмечалась при значении рН 3,0 - 0,51 ч-1, минимальная - 0,06 ч при рН 1,5. При увеличении значения рЕ от 3,0 до 5,0 наблвдаяось незначительное падение удеяыюй скорости роста до 0,44 ч-^ при рН 5,0 /ряс,2/.

Максимальная скорость потребления кислорода наблюдалась при значении рН 3,0 и составляла 0,013 мг 02/мг АСБ-ман.

При увеличении температуры культивирования может наступить лимитирование роста бактерий кислородом.

Исследование влияния интенсивности аэрации на показатели роста термоацидофильных бацилл показало, что максимальная удельная скорость роста 0,51 достигается при интенсивности аэрации 2 л/л-мин. При снижении поступления воздуха в среду до 0,5 л/л*мин скорость роста в.Rcldocaidarlua ID4 уменьшается до 0,47 ч-1, а при увеличении интенсивности аэрации до 2,3 д/л. •мин - снижается до 0,42 ч""1.

Таким образом, оптимальныш параметрами для культквирова-ния в.•сidocalderiuв ID4 в периодических условиях с максимальной удельной скоростью роста являются: температура культивирования - 60°С; значение рН. среда - 3,0; интенсивность аэрации -1,5-2,0 л/л-шн;

Ори исследовании влиянпя температуры на значение экономического коэффициента выявлена следующая закономерность. Максимальное значение экономического коэффициента было получено в усдови-ях периодического культивирования при температуре 45°С - 0,29 г АСЕ/г глюкозы. При 60°С - температуре, оптимальной для роста, эффективность процесса составила 0,23 г АСЕ/г глюкозы.

При непрерывном -культивировании паблхщалооь два статистически достоверно отличавдихся максимума экономического коэффицнен-та - 0,29 г АСЕ/г глюкозы при 42°С и 0,24 г АСЕ/г глюкозы при 52°С. Первый соответствует минимальной концентрации биомассы и максимальной равновесной концентрации глюкозы в кульгуральвой жидкости, второй - «акекмальтой концентрации биомассы и минимаяь-ной концентрации глжкозы в хультуральноД жидкости /рис.3/«

- е -

Л !

0.09

90

Гис.1. Зависимость показателей культивирования В,ао1<1оса1<1вх1-иа 11)4 от температура, ^ - удельная скорость роста.ч ; Т - экономический коэффициент , г АСЕ/г глюкозы; К - ковф-фициент продуктивности, г АСЕ/л*ч.

аа

0.4

он

А.О

л а

О.С&

от

4.0

£0

Р*

Рис. 2. Зависнность показателей культивирования в.аоЫооаха&п.-. ия т от значения рН. у - удельная скорость роота.ч"*1; г - мсономический коэффициент, г АСЕ/г ХЗПОКСЗЫ* К — КОЭф" фнцишт продуктивности, г АСБ/л-ч.

« 50 SS 60

Температура, С

Рис.3. Влияние температуры ва экономический коэффициент при . хедастатном культивировании B.aoidocaldorlus nw,. I - интенсивность аэрации 0,74 л/л-шщ интенсивность ' перемешиьания - 400 од/мин; 2 - интенсивность аэрации 1,2 д/л*мпн, интенсивность, перемешивания - 600 об/мин* * - скорость разбавления - 0,10 х - скорость разбавления - 0,05 ч-1.

Два максимальных значения экономического коэффициента были получены при. периодическом культивировании термофильных ацидофильных бактерий Baotllue ер. Т4 - при 45 и 65°С. По-видимочу, при 45°С наиболее эффективна связь между энергодахкдими и. эшрго-потребляшимя реакциями клеточного метаболизма термоацидофильных бацилл/Uchtao, C&t&no, 1981/.

Поскольку . условия культивирования, при которых удельная скорость роста максимальна, не совпадаю! с таковыми для получения максимального значения экономического коэффициента, целее -образна ввести коэффициент продуктивности, который представляет собой произведение удельной скорости роста на экономический коэффициент. По атому показателю оптимальными условиями для культивирования B*»cidooaidariue ш являются, температура культи-

вирования - 60°С, значение р!1 среды - 3,0 и интенсивность аэрации - 2 л/л*шн.

При хемостатном культквироваиик термоацидофилышх бацилл повышение концентрации глюкозы в среде от 0,5 до 1,5$ приводит к линейному увеличении концентрация биомассы, экономический коэффициент составляет при атом неизменную величину - 0,20-0,22 г АСЦ/г глюкоз» /табл.2/.

Таблица 2

Показатели хемостатного культивирования В.*с1Дооа1<1аг1ив 1М

при скороств разбавления 0,15 ч

,-1

Концентрация глюкозы, % Концентрация в питательной в культурольной биомассы, г среде жидкости АСЕ/л

Экономический коэффициент, г кСЪ/т глюкозы

0,5 1.0 1.6

0,01 0,01 0,00

1,00+0,00 2,се±0,02

3,3QtO,28

0,20t0,00 0,20^0,01 o,22±o,ce

Экономический коэффициент остается практически на одном уровне в диапазоне скоростей разбавления от 0,05 до 0,20 ч-1, следовательно, затраты на поддержание жизнедеятельности этого микроорганизма, по-видимому, не столь валики; чтобы обусловливать такое низкое значение экономического коэффициента.-

Звая элементный состав оубстрата и биомассы,по уравнениям баланса, можно рассчитать теоретически предельное значение конверсии данного субстрата в продукт / ^теоретическое^'

Среднее значение экономического коэффициента ори росте в. aoldocaldarius П)4 - 0,21 г АСЕ/г глюкоза и практически ке меняется ш при изменении концентрация еяюкозн в среде от 5 до 15 г/л, ни щи изменении скорости разбавления от О,10 до 0,18 ни при повышении температуры культивирования от 52 до 60 °С /твбл.Э/.

Результаты проведенных нами исследований показали, что рост термоацидофальных блщлл характеризуется низким значением экономического коэффициента.

Нами был составлен материальный баланс роста B.actdocsida-rtue XD4. Общие принципы составления баланс* даны в работах И.Г.Кинкевяча с соавторами /1376,1977/, ВЛ.Иванова /1981/.

Таблица 3

Условия культивирования и экономический коэффициент термооцидофмдьнзд бацилл

1 "" 1 1 .■.■!■ ' Т "..........» 1 11 11 ...............'

Концентрация глюкозы Скорость разбаэ- Темпера- Экономический хо-в питательной среде ления, тура,°С гффициент.г АСЕ/

г глюкозн

S 0,06 ео 0,19

5 0,10 60 0,22

5 0,18 60 0,22

10 0,10 53 0,24

10 0,10 so 0,20

10 0,10 60 0,19

10 0,15 60 0,23

15 0,15 60 0,22

Среднее значение 0,21

Для составления баланса бшш определены исходные данные -содержание углерода в биомассе и культуральной жидкости, химический, состав биомассы, Так как химический:состав в содержание углерода в биомассе не отличаются существенно от средних значений ... для мезофилышх бактерий, то биомасса может быть представлена формулой '

Итоговое уравнение баланса имеет вид: °6aia°6 + °2 + 0,25 иа3 «1,56 СН1>7700(49«0)16 ♦ 4,го сог+

+ «,75 HgO ♦ 0,24 CB¿)..

Из уравнения материального баланса следует, что углерод потребленной глюкозы распределяется еледуадим образом: биомасса — 26£,. диоксид углерода - 7С# и окзометаболи-га - 4¡C..

Для проверки правильности составления: баланса экспериментально определяли соотношение образованного диоксида углерода и потребленного кислорода. При периодическом культивировании значение дыхательного коэффициента в фазе замедленного акспоненци-ального роста составляет I,03, что подтверждает результаты,полученные при составлении материального баланса роста B.aoldocal-

darlue Ю4,

Таким образом,, нами показано, что низкое значение экономического коэффициента у термоацидофильшх йацвялвв объясняется

необычным составом биомассы, высокими.тратамд на поддержание жизнедеятельности либо на образование большого количества экао-метаболитов. По-видимому, это сушарноэ воздействие ряда факторов.

Пийяка возможных перспектив использования тесмэ ацидо&кльных бапалл в биотехнологии

Для оценки перспектив использования в.«с1доса1Ааг1и8 как - продуцента балка проводили определение химического состава биомассы и аминокислотного состава белков термоавддофшьныг бацилл. Показано, что химический состав биомассы В.ас1аоса1йаг1ив не отличается от среднего химического состава биомассы бактерий /тайл.4/.

Таблица 4

Иакрамоле^улярный состав биомассы бактерий /¡6 от АСЕ/_

Средний химический состав Вещества в.ае1йоса1ааг1и»И>» Оиоиасс^бак^ервй Л1ванов,

Белки 57,01. 1Д 52,4

Полисахариды 17,5+0,4" 16,4

Липиди 1,6 ± 0,2 9,4

РНК 9,9 * 0,0 15,7

ДНК 0,6 ± 0,0 3,2

Для белков в.ас14оса10аг1ив, как в для белков термофильных бактерий, характерно пониженное содержание лизина, отмечено наличие следовых количеств шеи полное отсутствие пзстеина. Увеличено содержание алифатических аминокислот: аланяна, валика, нэолейцина, лейцина /табл.5/. Возможно, повышенное содержание алифатических аминокислот связало с высокой термальной стабильностью балков тершфшшшхи тердаацидофильных йактерай.

Для оценки кормовой ценности.биомассы проводили сравнительный анализ качества белков. Скор белка бактерий рассчитывали по аминокислотному числу. Расчет свидетельствует о высоком качестве белка термоацидофильных бацилл при лиматирупцей концентрации лизина, .

Однако низкий экономический коэффициент является существенным препятствием для использования биомасса В**с1<1оеа1йАг1л1в

- И -

Таблнца 5

Сравнительная характеристика аминокислотного состава белков тертацидофальных, - ыеэофальных а термофильных микроорганизмов

Аминокислота Термоацвдофиль- Мезофильные ные микроорганиз- микроорганизма, % массы бал- мы, % массы ка /наши данные/ балка Жвано^ Термофильные микроорганизмы % массы бедка

Алании 7,<^1,2 5,910,7 10,2*3,1

Аргинин 4,2^1,8 4,(^0,4 3,9+1,4

Аспарагин+аспара- 7,0^0,0 8,410,9 10,212,1

гиновая кислота

Палиц 10,99+3,9 5,^0,4 7,6+2.1

Еистадин 2,310,2 2,210,4 2,310,6

Глицин 4,510,0 4,210.4 8.711,8

Глутамин+глутами- - 13.4±1,8 9,3+0,8 10,212,6

новая кислота

Иэолейциа 4,5±0,3 4,3£0,4 6,Э±1.7

Лейцин 9,7±1,3 7,210,4 7Д±2,6

Лизин 2,7±0,2 6,3+0,4 6,9±Г.5

Метионвя 2,1+0,7 Х,6ЮД 1,е*0,2

Пролин. 1,0*0,0 3,9Ю,4 4.913,2

Серин 4,1±0,1 т 4,010,5 4,411.4

Тирозин з.э^о.б . 3,1±0.3 3,5^2,4

Треонин 7,е±о,з 4,410,4 6,111,4

Триптофан не определяли. 0,7+0,1 1.2±1,5

Фшшлаланин 4,010,7 * з.э+о.э 3,3+1,5

Цистеин следа 0,6+0,2. 1.610.4

как продуцента балка, хотя этот недостаток может компенсироваться отсутствием затрат на стерилизацию среды и оборудования.

Другим возможным путем применения В.&о1<1ос&1<иг1иэ является использование амцлолитических ферментов, синтезируемы* ими. При периодическом культивировании максимальная удельная скорость роста в.ао1ЛосаЫаг1ив: на среде с ялейстериэованным крахмалом составляет 0,15 ч"1, а значение экономическою коэффициента - 0,23 г АСЦ/г крахмала; Максиатышя активность ашлолитичв-ского комплекса биомассы 1*10^ мгалоль крахтлала/гАСБ»мин Наблюдается на 12-м часу роста и совпадает с максимальным накоплением ¿Йвмассы /ряо.4/.

Еис.4. Накопление биомассы /I/ и вмилолитическая активность /2/ при росте в,ас1Лоса1даг1ив на среде с картофельным крахмалом /1$/.

Оптимальное значение температуры для действия амилолитичео-ких ферментов В,«с14осаМаг1иЗ ПН - 80°С и значение рН 4,0-5,Э. При «том скорость гидролиза крахмала составляет 1,5 г крахмала аа г биомассн/час.

Таким образом« оптимальные значения температуры и рН для действия препарата ■ показывают, что это единственная бактериальная амилаза, которая обладает одновременно свойствами терто- в кислотостабилыюсти.

вывода

I. Впервые из самораэогревагацихся породных отвалов Донецкого каменноугольного бассейна выделен микроорганизм, аоторый по комплексу морфологических и культураяьных свойств, сумме Г+Ц оснований идентифицировав как ВяоШив а с Ыо саЫа г1ив,

2* Научено влияние некоторл фиэяко-хишгческих факторов ни. рост

и потребность этого микроорганизма в элементах питания, сбалансирована среда и подобраны оптимальные условия для культивирования .При температуре культивирования 60°С и pH среды 3,0 максимальная удельная скорость роста в периодическом процессе достигает значения 0,51 При лимитировании, роста источником углерода экономический коэффициент в среднем 0,21 г АСЕ/г пюокозы.при лимитировании роста кислородом он снижается вдвое. Зависимость удельной скорости роста от концентрации субстрата описывается уравнением Моно о константой аолунасыщеная К в, равной 32 мг глюкозы/л.

9. Биомасса B.aeidocaldariue XD4 содержит: белков - 57*; полисахаридов - 17,5*; лшгидов - 2-4*; FHK - 9,9*; ДНК - 0,6*,Аминокислотный состав белков отличается повышенным содержанием разветвленных аминокислот валика и глутамина и пониженным содержанием лизина, пролива и суммы асларагияовой кислоты и ас-парагина. Питательная ценность, белков лимитирована содержанием лизина,

4. Согласно материальному балансу роста, у тершацидофшгьшх б&-цилл B.acldooaldarlus nw- распределение использованного углерода происходит следующим образом: для построения биомассы-26*, 70* выделяется в видо диоксида углерода в 4* углерода выделяется в сроду в виде продуктов мотаболизма.

5. B.acidocaldarlue 104 синтезируют связанные с поверхностью клетки терш- и кисло тос табилыша амилоли тичоски е ферменты. Максимальная активность амилолитич еско го препарата достигав т-ся при температуре 80°С в диапазоне значений pil 4,1-5,3. Пре- • парат может быть использован для декстршшзашш крахмшсодер-жащих сред.

6. Впервые показано, что терло ацидофильные бациллы в лаборахоршх условиях можно культивировать в лабораторном ферментере в та-ченио месяца без мероприятий но защите, от контамшшруадей мед-рофлоры на средах с глюкозой или клейстеризованнш крахмалом. Это свойство может быть использовано для прошаленаого получения кордового белка на неполноценных средах или дая получения терло- и кислотостабильншс амилолитических ферментов.

По теме диссертации опубликованы следующие работы

.1* Иванов В.Н., Циыберг Е.А. Термоацидофклыше бациллы и закономерности их роста // Микробиол. журн. - 1983. - Т.45, Л 5. -

С. 20-27.

2. Цимберг Б.А., Иванов В.Н. Влияние ионов кальция ва рост я морфогенез термоацвдофилышх бацилл // Мщфобиол. хурн. - 1984.-Т.46, » I. - С,90-92.

О. Иванов В.Н., Цимберг В.А., Швинка Ю.Э., Банковский В.К. Стехиометрия а биоэнергетика роста термоааидофилышх бацилл // Термофильные микроорганизмы в природе и практике народного хозяйства : Тез.докл. Всесоиз. конф. - И,, 1983. - С.91.

4. Цимберг Е.А., Иванов В.Н. Кинетика и стехиометрия роста термо-ацидофклышх бацилл // Биология, культивирование и использование микроорганизмов /бактерий, грибов, водорослей/ в народном хозяйстве ; Тез. докл. конф. молодых учошх-микробиологов Уэ-бекистш;а. - Ташкент, 1983. - С.75.

5, Иванов D.E., Цимберг Е.А. Влияние аэрации и температуры на экономический коэффициент термоацвдофилыпл бацилл // Микробиал. жури, - 1904* - Т.46, Л 6. - С.3-6.

6. Цимберг Б.А. Кинетика роста я дыхания термоацидофилышх бацилл // Микроорганизма - продуцента биологически актившх веществ : Тез.докл. конф. молодых ученых. - Рига, 1984. - С.52.

7, Цимберг Б. А, Закономерности роста и дыхания термоацидофильных, бацилл // Достижения микробиологии - практике : Тез. УП съезда

. Всесоюэ. микробяол. об-ва. - Алма-Ата, 1985. - Т.2. - С.158.

8* Цимберг Е.А. Культивирование терулацидофильных бацилл // ГУ ' симпозиум сод. стран по биотехнологии : Тез. докл. - Варна, . X986¿ - С.300.

9. Цимберг Е.А,, Загреба В*Д..Химический состав биомассы тврдаапц-дофильаыг бацилл // Мшфобпол.яурн.- 1986.- Г.40,* 4,- С.73-76.

10. ЦкмЗерг Б* А. Биосинтез Tejwo- и кислотостабильшх амилолдтичв-скях ферментов в условиях периодического я непрерывного культивирования // Управляемое культивирование микроорганизмов í Тез. докл. Всесоюз: конф. - Пущине, 1986. - С. 155.

XI. Шшберг Е.А., Подгорский B.C., Иванов В.Н. Перспективы практического : использования термоацидофильных, микроорганизмов в биотехнологии // Шкробисл. журн, - 1986. - Т. 48, Кб. - С. 38-91.

Выражаю глубокута благодарность ведущему научному сотруднику отдела технологии биосинтеза Института микробиологии и вирусологии им.Д,К.Заболотного каяд. биол. наук В.Н.Иванову за консультации и помощь, оказанную при вшолкении данной работы. <Л

БФ 09639. Заказ Z$i , Формат 60x04/16. Уч.-нзд.л. 1,0. Подписало к печати 6.03.67. Тираж 100.

■. Полиграфический учаоток ИТФ АН, УССЕ *