Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ризосферная азотфиксирующая ассоциация Bacillus firmus-Klebsiella terrigena и ее влияние на яровой ячмень при инокуляции

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Ризосферная азотфиксирующая ассоциация Bacillus firmus-Klebsiella terrigena и ее влияние на яровой ячмень при инокуляции"



Злотников Артур Кириллович

На правах рукописи

РЮОСФЕРИАЯ АЗОТФИКСИРУЮЩАЯ АССОЦИАЦИЯ Bacillus firmus -Klebsiella terrigena И ЕЁ ВЛИЯНИЕ НА ЯРОВОЙ ЯЧМЕНЬ ПРИ ИНОКУЛЯЦИИ

Специальность 03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1998 г.

Работа выполнена на кафедре Биологии почв факультета Почвоведения Московского Государственного университета им. М. В. Ломоносова

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор М. М. Умаров. Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор В. Т. Емцев,

кандидат биологических наук, доцент Е. П. Дурынина. Ведущее учреждение: Институт фундаментальных проблем биологии РАН.

Защита диссертации состоится 24 ноября 1998 г. в 15 час. 30 мин. на заседанш Диссертационного совета К.053.05.86 в МГУ им. М. В. Ломоносова.

Адрес: 199899, Москва, Воробьёвы горы, МГУ, факультет Почвоведения, Учёньп совет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета Почвоведешм МГУ. Автореферат разослан 24 октября 1998 г.

Приглашаем Вас принять участие в обсуждении диссертации на заседани] Диссертационного совета. Отзывы на автореферат в 2х экземплярах просим направит по адресу: 199899, Москва, Воробьёвы горы, МГУ, факультет Почвоведения, Учёны совет.

Учёный секретарь Диссертационного совета

Актуальность темы. Важной проблемой современного сельского хозяйства остаётся снабжение растений доступным азотом. Производство минеральных азотных удобрений требует больших энергетических затрат (Avilio, 1998), а их использование нередко приводит к негативным экологическим последствиям (Bouwman, 1990).

Альтернативой применению удобрений является биологическая фиксация азота. Основным путём снабжения небобовых растений биологическим азотом признаётся ассоциативная азотфиксация (Ladha, 1998). С целью её усиления в агроэкосистемах предложены эффективные препараты на основе чистых культур диазотрофов pp. Azospirillum, Bacillus, Flavobacterium, Klebsiella, Pseudomonas, причём повышение урожая в производственных условиях может достигать 30 % (Zavalin et al, 1998).

Опыт применения диазотрофов показал, что, помимо активизации азотфиксации, стимуляция роста растений может также происходить за счёт синтеза физиологически активных веществ, антагонизма по отношению к фитопатогенам и других механизмов (Bashan, Holguin, 1997). Большое влияние па результат инокуляции может оказывать также естественное микробное сообщество, в которое попадает интродуцированный микроорганизм (Polyanskaya, Zvyagintsev, 1995). Кроме того, инокуляция растений диазотрофными микроорганизмами может усиливать процесс денитрификации (Zumft, 1997). Недостаточная изученность свойств бактерий и их взаимодействия с природной средой является одной из основных причин низкой воспроизводимости положительных результатов инокуляции (Майорова и др., 1996).

Одним из способов получения более надёжного эффекта считается использование искусственных или естественных смешанных культур, которые способны гибко реагировать на экологические факторы, полнее использовать потоки энергии и утилизировать субстраты, чем чистые культуры (Khammas, Kaiser, 1992, 1998). Однако, поведение этих культур в природной среде и, в частности, в ризосфере инокулированных растений, изучено плохо.

Как и при использовании чистых культур, для получения предсказуемых результатов инокуляции смешанными культурами необходимо детальное исследование взаимодействия компонентов ассоциаций между собой, с растениями и естественным микробным сообществом.

Целью работы явилось изучение биохимических, физиологических и экологических свойств естественной ризосферной азотфиксирующей ассоциации Bacillus firmus ЕЗ и Klebsiella terrigena Е6, а также исследование её влияния на ячмень при реинтродукции в ризосферу.

В задачи исследования входило:

1. Выделить коллекцию ризосферных диазотрофных ассоциаций.

2. Отобрать из коллекции наиболее активную ассоциацию, разделить её на компоненты и осуществить их идентификацию.

3. Провести исследование механизмов взаимодействия компонентов ассоциации и их функциональных особенностей в чистой культуре и при совместном культивировании, а также на фоне естественного ризосферного микробного сообщества.

4. Исследовать механизмы положительного действия ассоциации на растения и поведение исследуемых штаммов при интродукции в ризосферу ячменя.

5. Оценить влияние ассоциации на урожай инокулированных растений.

Научная новизна. В работе впервые проведено комплексное изучение функциональных свойств естественной ризосферной бактериальной азотфиксирующей ассоциации: азотфиксации, денитрификации, дыхания, выделения экзаметаболитов как in vitro, так и при реинтродукции в ризосферу. Показана ведущая роль фенольных соединений во взаимодействии и поддержании стабильности ассоциации. Изучение динамики численности компонентов ассоциации в лабораторных условиях и ризосфере показало, что в составе ассоциации рост бактерий более стабилен и меньше подвержен колебаниям. В двух вегетационных периодах установлено, что инокуляция смешанной культурой обеспечивает более высокий уровень азотфиксации в ризосфере, а также приводит к устойчивому повышению урожая по сравнению с чистыми культурами. Оценен вклад уровней инокуляции каждого из штаммов и состояния естественного микробного сообщества почвы в результат инокуляции растений.

Практическая ценность. Ассоциация Bacillus firmus ЕЗ и Klebsiella terrigena Е6 была испытана в производственных условиях в течение двух летних сезонов при инокуляции ячменя. Полученные данные свидетельствуют о перспективности её широкого применения в растениеводстве. Материалы исследований используются в курсе лекций по физиологии микроорганизмов, читаемых на факультете Почвоведения МГУ.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи и 6 тезисов.

Апробация работы. Основные положения работы доложены на X и XI Международных конгрессах по азотфиксации (С-Петербург, 1995 и Париж, 1997), Международной конференции "Современные проблемы микологии, альгологии и фитопатологии" (М, 1998), а также на международных конференциях студентов и

аспирантов "JIomoiiocob-96" и "JIomoiiocob-97".

Объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, 6 глав, содержащих результаты экспериментальных данных и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 140 стр. машинописного текста. Список литературы включает 207 источников, из которых 109 - на иностранных языках.

Объекты и методы исследования

Естественные азотфиксирующие микробные ассоциации выделяли в соответствии со стандартной методикой (Калининская, 1967) из образцов ризосферной почвы на безазотной среде Доберейнер. Критериями последующего отбора служили высокая нитрогеназная активность и устойчивость при лабораторном культивировании. Была отобрана коллекция из 170 культур, из них наиболее полно вышеназванным условиям отвечала бинарная культура, идентифицированная как Bacillus firmus (штамм ЕЗ) и Klebsiella terrigena (штамм Е6). Коллекцию поддерживали на азотсодержащей среде IPG-05 (Злотников и др., 1983).

Измерение активности азотфиксации и дешггрификации в суспензиях проводили на модифицированной безазотной среде Доберейнер для выделения ризосферных азотфиксаторов (Methods ..., 1995).

Азотфиксащпо измеряли ацетиленовым методом на газовом хроматографе Chrom-41 с пламенно-ионизационным детектором, активность денитрификации определяли по выделению N20 на газовом хроматографе с детектором по теплопроводности (Methods..., 1995). Активность процессов в суспензиях бактерий выражали в расчёте на белок, который определяли по Лоури в модификации для микроорганизмов (Методы..., 1984).

В периодической культуре на жидкой среде Доберейнер при встряхивании изучали динамику численности микроорганизмов, азотфиксации, дыхания и pH среды. Численность бактерий оценивали рассевом на чашки с IPG-05 после дезаггрегации ультразвуком (ЗОсек, УЗДН-2, 22 кГц, 0,4 А). Для дифференциации вегетативных клеток и спор В, firmus культуру инкубировали в течение 15 минут при 80°С на водяной бане. Дыхание (потребление кислорода) определяли полярографически (Методы..., 1984). pH культуральной жидкости измеряли на ионометре ЭВ-74.

Для анализа химического состава культуральной жидкости (КЖ) бактерии отбирали из экспоненциальной фазы периодической культуры (титр я 108 КОЕ/мл). КЖ отделяли от клеток 15-минутным центрифугированием при 5000 g и последующей

фильтрацией через мембранные фильтры с диаметром пор 0,45 и 0,22 мкм Низкомолекулярную фракцию получали фильтрацией через колонку со сфероноь 100000 и сфероном Ara (1:1). Состав фракции изучали с помощью тонкослойной, ¡ также высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ): ионообменной i обращённо-фазовой, с электрохимическим и спектрофотометрическим детекторам! (Fritz et al., 1983; Brega et al., 1990; Мышак и др., 1997).

Определение продукции ауксинов осуществляли с реагентом Салковского (Bric, 1991 на среде Доберейнер с триптофаном; цигокининов и гиббереллинов - с помощь» биотестов на проростках щирицы и карликового гороха (Природны регуляторы..., 1983). Фунгистатическую активность бактерий определяли методо; агаровых блоков, для оценки антагонизма компонентов ассоциации использовал) рассев бактерий.

Для изучения динамики численности бактерий-инокулянтов в ризосфере растени использовали спонтанные мутанты, устойчивые к 1000 мкг/мл стрептомицина н агаризованной среде. Численность внесённой популяции определяли рассевом н чашки Петри со стрептомицином после ультразвуковой обработки. В случае B.firmu учитывали только вегетативные формы. В ряде опытов численность бактерий в почв учитывалась прямым микроскопическим методом.

Вегетационный опыт по инокуляции растений ячменя сорта "Подольский-21 суспензиями бактерий B.firmus и К. terrigena и их ассоциации проводили п ортогональной схеме (Ягодин и др., 1989). Варьировались три фактора:

1. Уровень внесения бацилл (4 градации: 0, 103, 105 и 108 КОЕ/зерно)

2. Уровень внесения клебсислл (4 градации: 0, 10\ 105 и 108 КОЕ/зерно)

3. Состояние естественного почвенного микробного сообщества (2 градацш "старая" почва (СП) - увлажнённая до 60 % полной полевой влагоёмкости (ППЕ за неделю до высева семян и "молодая" почва (МП) - увлажнённая в моме!; высева).

Растения выращивали в вегетационных сосудах, на открытом воздухе, закрыть: полиэтиленовой плёнкой. По завершении опыта (начало цветения) определяли длш: побегов и надземную биомассу, потенциальную активность азотфиксации деншрификации, численность шпродуцированных популяций в ризосфер (Методы..., 1991).

Деляночные опыты на ячмене "Подольский-21" проводили в г. Пущино Московскс обл. на серой лесной среднесуглинистой почве в течение двух вегетационных сезонс (1996 и 1997 гг). Размер делянок 2 x2 м, повторность четырёхкратная. До: инокуляции составляла 106 КОЕ/зерно. На стадии начала цветения в ризосфе]

растений определяли активность азотфиксации. Численность внесённых бактерий измеряли в динамике в течение всего опыта. Урожай зерна и соломы собирали после созревания.

Полевые производственные опыты по инокуляции ячменя "Зерноградский-584" были поставлены совместно со Всероссийским институтом защиты растений и Донским селекционным центром на чернозёмах в Ростовской обл. Доза инокуляции 106 КОЕ/зерно, обработка с помощью агрегата ПС-10, 1 л суспензии/т зерна. Способ учёта урожая: комбайнирование, учёт бункерного веса зерна с каждой делянки. Опыты проводили на фоне внесения удобрений (N50) и без внесения минерального азота.

Азот в зерне определяли по Кьельдалю (Практикум..., 1984), в культуральпой жидкости бактерий - по Любоишнскому и Зальту (Чсрнавкина, 1978).

Статистическую обработку проводили стандартными методами (Рокицкий, 1967).

Результаты и обсуждение

Азотфиксацияу В. firmus ЕЗ и К. terrigena Е6

Первым этапом нашей работы явилось изучение азотфиксирующей активности культур В. firmus ЕЗ и К. terrigena Е6. Результаты представлены в табл. 1. На безазотной среде Доберейнер в аэробных (микроаэробных условиях) бацилла практически не обнаруживала активности азотфиксации. Клебсиелла фиксировала азот на сравнительно невысоком, но обычном для почвенных диазотрофов уровне (Haahtela et al., 1981). Вместе с тем, при добавлении суспензии В. firmus, активность азотфиксации у клебсисллы возрастала (с 25 до 110 нмоль этилена/мг белка/час):

Таблица I

Азотфпкспрующая активность ассоциации В. firmus - К. terrigena неё компонентов на средах Доберейнер и IPG-05 (в аэробных и анаэробных условиях), нмоль С2Н4/МГ белка/час. Соотношение В. firmus и К. terrigena в ассоциации =1:1.___

Культура Условия

Аэробные и анаэробные условия, среда IPG-05 Аэробные условия, среда Доберейнер Анаэробные условия, среда Доберейнер

В. firmus 0,1 ±0,1 0,2 ± 0,1 0,3 ± 0,2

К. terrigena 3,2 ±0,3 23,7 ± 1,9 465,6 ±31,4

В. firmus - К. terrigena 0,4 ± 0,2 И 1,2 ±8,1 410,3 ±26,0

0% 20% 40% 60% 80% 100%

начальная доля B.Jirmus от общей биомассы ассоциации

Рис. 1. Зависимость азотфиксирующей активности (АФА) ассоциации B.firntus -К. terrigena от начального содержания B.firmus в ассоциации при периодическом культивировании на среде Доберейнер (экспоненциальная фаза роста)

0% 20% 40% 60% 80% 100%

количество КЖ, эквивалентное начальной доле бацилл в

ассоциации

Рис. 2. Зависимость азотфиксирующей активности (АФА) К. 1сгг1%епа в экспоненциальной фазе роста на среде Доберейнер о г количества внесённой бесклеточной культуральной жидкости (КЖ) В.Дгтиэ

наблюдался "ассоциативный эффект" - явление резкого повышения активности в ассоциации по сравнению с чистыми культурами. В анаэробных условиях шпрогеназная активность К. terrigena была заметно выше, чем в присутствии кислорода (465 нмолъ этилена/мг белка/час), однако ассоциативный эффект отсутствовал. Азотфиксация у изученных культур практически полностью подавлялась на азотсодержащей среде. Данное явление известно для большинства диазотрофов (Kennedy et al., 1994).

С целью количественного изучения вклада каждого из исследуемых штаммов в азотфиксацию ассоциации В. ftrmtts и К. terrigena, была проанализирована взаимосвязь нитрогеназной активности ассоциации и относительного содержания её компонентов (рис. 1). В большинстве работ, посвященных ассоциациям бактерий, они рассматриваются как таковые, без учёта соотношения компонентов (Рыбальский и Лях, 1990), хотя относительное содержание компонентов смешанных культур часто заметно влияет на их свойства (Печуркин и др., 1990). По полученным нами данным, в изучаемой ассоциации активность азотфиксации достигала максимума при начальном содержании бацилл 55 % по биомассе (рис. 1).

Можно было предположить, что усиление азотфиксации у К. terrigena при внесении бацилл вызывается какими-либо химическими веществами, выделяемых В. firmus. С целыо проверки этой гипотезы, изучали действие бесклеточной культуральной жидкости СКЖ) В. firmus на азотфиксацию в суспензии К. terrigena. Результаты экспериментов показали, что добавление КЖ повышало азотфиксацию примерно таким же образом, как и внесение живых бацилл (рис. 2). Максимум активности наблюдался при концентрации культуральной жидкости, эквивалентной добавлению 50-60 % живых клеток бацилл. Обратный опыт с добавлением культуральной жидкости клебсиелл к суспензии бацилл не привёл к усилению нитрогеназной активности.

Из полученных данных следует, что: (1) нитрогеназная активность у К. terrigena усиливается при помощи веществ, продуцируемых бациллой и (2) для достижения отмеченного эффекта достаточно однократного добавления этих веществ к суспензии клеток клебсиелл. Азотфиксирующие ассоциации, в которых один из компонентов сам не фиксирует азот, но устаивает азотфиксацию другого при помощи экзометаболитов, известны по литературным данным (Рыбальский, Лях, 1990; Holguin, Bashan, 1996).

Механизмы взаимодействия В. firmus и К. terrigena в ассоциации

С целью идентификации конкретных соединений, выделяемых В. firmus и усиливающих азотфиксацию у К. terrigena, изучали химический состав культуральной

жидкости бактерий. В предварительных опытах было установлено, что низкомолекулярная фракция (НМФ) с Мг < 100 кДа культуралыюй жидкости В. firmus усиливала азотфиксацию К. terrigena таким же образом, как и КЖ в целом, а фракция высокомолекулярных соединений данным свойством не обладала; поэтому химическому анализу подвергалась только НМФ. Результаты анализа культуральной жидкости показали, что изучаемые штаммы способны при развитии на средах Доберейнер и IPG-05 выделять во внешнюю среду ароматические соединения фенольного ряда: фенол и пара-оксибензойную кислоту (ПОБ).

В культуралыюй жидкости В. firmus. росшего на среде Доберейнер, обнаружен фенол в концентрации 200 мкг/л и не было найдено ПОБ и низкомолекулярных алифатических соединений. На азотсодержащей среде IPG-05 В. firmus не образовывал фенола. КЖ клебсиелл усиливала образование фенола у В. firmus. При росте на среде Доберейнер бацилла защелачивала среду.

Изучение КЖ К. terrigena при росте на среде Доберейнер показало наличие ПОБ и отсутствие фенола. Можно полагать, что К. terrigena ассимилировала фенол из КЖ бациллы, поскольку уже через несколько суток после добавления КЖ В. firmus (содержащего 200 мкг/л фенола) к клеткам К. terrigena, фенол в культуральной жидкости не обнаруживался. При этом, под действием КЖ бациллы у клебсиелл усиливался синтез ПОБ (с 0,01 до 73 мкг/мл). Ассимилированный в результате азотфиксации у К. terrigena азот выделялся в среду в количестве 30-40 mktN/л. Поскольку анализ КЖ бактерий не выявил заметных количеств низкомолекулярных органических соединений азота, окскретированный азот в среде, вероятнее всего, являлся минеральным или относился к высокомолекулярной фракции. В КЖ К. terrigena была обнаружена также щавелевая кислота, которая с течением времени подкисляла среду.

В культуральной жидкости ассоциации найдено наибольшее, по сравнению с чистыми культурами, количество обоих соединений (160 мкг/мл ПОБ и 980 мкг/л фенола), что могло свидетельствовать об их важной роли в ассоциативном эффекте. Кроме того, в составе НМФ ассоциантов, росших на среде с азотом, отмечены алифатические органические кислоты (цитрат, лактат, ацетат и пропиоаат).

Результаты химического анализа КЖ бактерий позволяют сделать некоторые выводы о возможных механизмах взаимодействия ассоциантов. Во-первых, это стабилизация рН среды в ассоциации. К. terrigena закисляла внешнюю среду, видимо, за счёт выделения оксалата, а В. firmus, наоборот, повышал рН с помощью Na+/H+-антипортера (Aono étal, 1996). Таким образом, в силу разнонаправленного действия В. firmus и К. terrigena, ассоциация способна длительное время поддерживать кислотность среды на оптимальном уровне (рис. 3).

■♦ — В. firmus □ - К. terrigena

firmus - К. terrigena

О 10 20 30 40 50 60 70

продолжительность культивирования, сутки

Рис. 3. Динамика pH среды при периодическом культивировании ассоциации В. firmus - К. terrigena и сё компонентов на жидкой среде Доберейнер

Стабилизация pH

н+

(органические кислоты)

N аССНИИЛИрОВ1ННЫб

НГ - нитрогеназа ПОБ - лирд-окси-бензойная кисло! а ДЦ - дыхательная цепь

Синтез и транспорт Влияние

Рис. 4. Предполагаемая схема взаимодействия компонентов ассоциации Bacillus firmus ЕЗ - Klebsiella terrigena Е6

Вторым механизмом может быть усиление азотфиксации у К. terrigena ароматическими соединениями, выделяемыми В. firmus. Алифатические соединения синтезировались В. firmus и ассоциацией только на азотсодержащих средах, и поэтому не могли играть заметной роли в усилении азотфиксации при росте бактерий на безазотной среде. Поскольку только фенол присутствовал в КЖ бациллы на безазотной среде, он с наибольшей вероятностью являлся соединением, с помощью которого В. firmus влиял на азотфиксацию у К. terrigena. Вместе с тем, то, что КЖ В. firmus оказалась способна индуцировать у К. terrigena синтез иа^а-оксибензоата, заставляет сделать предположение также и о важной роли ПОБ в усилении азотфиксации.

Для проверки выдвинутой гипотезы о роли указанных ароматических веществ в ассоциации, к суспензии К. terrizena добавляли фенол и ПОБ и изучали их действие на азотфиксацию. Из литературы известно, что фенол в концентрации порядка мкМ-мМ способен усиливать азотфиксацию у клебсиелл и других ассоциативных азотфиксаторов в аэробных условиях (Werner étal, 1992). Данное свойство фенола, как показали наши исследования, справедливо и в отношении штамма К. terrigena Е6. Так, добавление к клеткам К. terrigena 200 мкг/л фенола примерно в 3 раза усиливало их нитрогеназную активность. Характерно, что как фенол, так и КЖ В. firmus вызывали увеличение азотфиксации у клебсиелл только спустя несколько суток после добавления. При этом, увеличение азотфиксации у К. terrigena сопровождалось повышением концентрации шра-оксибензойной кислоты в КЖ, а внесение фенола индуцировало у клебсиелл образование ПОБ. Добавление всего лишь 0,1 мкг/мл фенола приводило к образованию клебсиеллами 133 мкг/мл ПОБ. При этом чистая ПОБ влияла на азотфиксацию у К. terrigena аналогично В. firmus, её культуральной жидкости и фенолу, но усиление азотфиксации наблюдалось не на 4ь,е сутки, а уже через несколько часов.

Полученные данные свидетельствуют о том, что (1) именно фенол в культуральной жидкости В. firmus активизирует азотфиксацию у К. terrigena; (2) фенол, вероятно, действует на нитрогеназную активность косвенно, через индукцию синтеза ПОБ.

После выявления конкретных веществ, усиливающих азотфиксацию у К. terrigena, встал вопрос о механизме их действия. Основываясь на литературных данных, мы предположили, что одним из возможных путей действия ароматических соединений на азотфиксацию у К. terrigena может являться увеличение потребления кислорода при дыхании, поскольку известно, что дыхательная защита нитрогеназы широко известна для ассоциативных азотфиксаторов (Готтшалк, 1982) и является главной у клебсиелл (Juty et al., 1997). Для проверки данного предположения, изучали действие КЖ бацилл и фенола на дыхание у К. terrizena. Установлено, что при добавлении

12 -г

10 --

ы с

О 6

1 —• -В. fírmus в ассоциации

2 "х-К. terrigena в ассоциации

3 --»--Чистая культура В. firmus

4 —х—Чистая культура К. terrigena

4 --

2 --

43

10 20 30 40

продолжительность культивирования, сутки

50

Рис. 5. Динамика численности S. firmus и К. terrigena в чистых культурах и в составе ассоциации при периодическом культивировании на жидкой безазотной среде Доберейнер

продолжительность культивирования, сутки

Рис. 6. Соотношение численностей В. firmus и К. terrigena в составе ассоциации при периодическом культивировании на жидкой среде Добереинер

суспензии В. firmus, её культуральной жидкости или фенола наблюдалось увеличение дыхания примерно на 10 мкмоль 02/мг белка/час, причём в контроле (чистая культура) его уровень составлял 0,2-2,2 мкмоль (Vmt белка/час. Усиление дыхания наблюдалось у К. terrigena одновременно с увеличением азотфиксации.

Таким образом, увеличение потребления кислорода при повышении азотфиксации у К. terrigena может свидетельствовать в пользу гипотезы о дыхательной защите нитрогеназы (усиления потребления 02 у этого штамма под действием ароматических соединений, выделяемых В. firmus). Данное предположение подтверждается также тем, что в анаэробных условиях при смешивании культур В. firmus и К. terrigena не наблюдалось усиления азотфиксации. Гидроксибензойные кислоты и другие фенольные соединения известны как разобщители дыхания и окслительного фосфорилирования, повышающие потребление кислорода при дыхании (Запрометов, 1996).

На основе полученных экспериментальных данных была составлена возможная схема взаимодействия компонентов ассоциации В. firmus и К. terrisena (рис. 4). В соответствии с предложенной схемой, бациллы выделяют фенол, индуцирующий у клебсиелл синтез пара-оксибензойной кислоты, которая активизирует потребление кислорода и, как следствие, усиливает азотфиксацию. Ассимилированный азот выделяется клебсиеллой в среду и можег служить источником N для бациллы. В свою очередь, соединения, выделяемые К. terrigena, усиливают синтез фенола у В. firmus. Кроме того, при развитии в составе ассоциации, культуры способны к оптимизации рН среды.

Динамика популяций В, firmus и К. terrigena в периодической культуре и при интродукции в ризосферу

Исходя из представленной схемы взаимодействия компонентов ассоциации В. firmus и К. terrigena, можно предположить важную роль азотфиксации в поддержании стабильности ассоциации. С целью проверки этого положения изучали динамику популяций В. firmus и К. terrigena в жидкой периодической культуре как в составе ассоциации, так и в чистых культурах.

Данные по динамике численности бактерий на жидкой безазотной среде Доберейнер (при азотфиксации) представлены на рис. 5. Бактерии в чистых культурах на начальном этапе поддерживали свой тигр на более высоком уровне, чем в составе ассоциации, однако их численность была в большей мере подвержена колебаниям и быстрее сокращалась. В. firmus в чистой культуре уже на 10ые сутки резко снижал свою численность, причём в популяции уменьшалась доля вегетативных клеток. Количество клебсиелл находилось на более высоком уровне, достигая Ю10, но затем и

их концентрация снижалась до 104 КОЕ/мл.

В составе ассоциации бактерии поддерживали свою численность на более низком уровне по сравнению с чистыми культурами, однако их рост был менее подвержен колебаниям и популяции длительное время находились на достаточно высоком стабильном уровне (105-106 КОЕ/мл). Полученные данные о росте B.firmus и К. terrigena в составе ассоциации можно для наглядности представить в другом виде -как динамику отношения числа клебсиелл к числу бацилл (рис. 6). Из графика видно, что после колебаний в начальный период времени, отношение компонентов стабилизировалось на уровне =1:1. Таким образом, при росте в составе ассоциации на безазотной среде (при азотфиксации) культуры поддерживают определённый уровень численности и соотношение компонентов, т. е. ассоциация способна к саморегуляции. Такая способность характерна для природных ассоциаций микроорганизмов (Dangmann et al., 1996).

Напротив, при культивировании ассоциации В. firmus и К. terrigena на азотсодержащей среде IPG-05 не наблюдалась стабилизации численности или состава ассоциации. Кроме того, тест на антагонизм показал, что на агаризованной безазотной среде Доберейнер отсутствовало взаимное угнетение роста компонентами ассоциации В. firmus и К. terrigena, тогда как при использовании азотсодержащей среды антагонизм проявлялся. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о неустойчивости ассоциации при наличии доступного азота и ведущей роли азотфиксации в сохранении стабильности ассоциации.

В задачи наших исследований входило изучение динамики численности В. firmus и К. terrigena не только в лабораторных, но и в естественных условиях - при решпродукнии в ризосферу. Используя антибиотикоустойчивые штаммы, удалось показать, что динамика численности B.firmus и К. terrigena при развитии в ризосфере ячменя является в целом сходной с картиной, наблюдаемой при их культивировании на жидкой среде Доберейнер (рис. 7). Обе популяции в ассоциации достигали максимума (105 - 107 КОЕ/г почвы) примерно к 20м суткам после инокуляции, а к 40ым суткам стабилизировались на уровне я 104 КОЕ/г почвы. Известно, что при такой численности бактерии ещё сохраняют свою экологическую значимость в системе "почва-растение" (Gilbert et al., 1993). В вегетационном опыте было также установлено, что каждый из штаммов-компонентов при интродукции в ризосферу заметно влиял на нопуляционную динамику другого, причём характер зависимости определялся состоянием естественного микробного сообщества. Так, например, при внесении в "старую почву" (СП), численность выживших к концу опыта (стадия цвегения) клеток К. terrigena практически не зависела от уровня интродукции самих клебсиелл и увеличивалась при повышении уровня внесения другого ассоцианта -B.firmus (рис. 8). Свойство одного из компонентов ассоциации повышать

Рис. 7. Динамика численности В./тши и К. ¡егг^епа в ассоциации и в число» культуре при развитии п ршосферс ячменя

Численность КЛсгпдепа в конце опыта, 1дКОЕ/г

О О

Рис. 8. Зависимость численности К. ¡егг!цепа в ршосфере нчменн на стадии

начала цветения от уровней интродукции В.уш/ни и К. 1егп^епа (нсгоашшнныи опьп,

интродукции в «старую» почву)

конкурентноспособность другого предложено использовать для создания искусственных микробных ассоциаций с целью повышения урожая сельскохозяйственных растений (Bashan et al., 1995).

Таким образом, при интродукции в нестерильную ризосферу ассоциативные взаимодействия между B.firmus и К. terrigena сохранялись.

Азотфиксация и денитрификация в ризосфере ячменя при инокуляции ассоциацией В. firmus - К. terrigena

Азотфиксации принадлежит важная роль в повышении урожая растений при инокуляции ризосферными бактериями. При интродукции в ризосферу они могут как непосредственно снабжать растение доступным азотом, так и воздействовать на микробное сообщество почвы, повышая активность азотфиксации у других видов (Майорова и др., 1996; Burdman etal., 1998). Вместе с тем, для прикорневой зоны наряду с азотфиксацией характерен и обратный процесс - денитрификация, причём инокуляция может её усилить, способствуя ухудшению азотного питания растений (Zumft, 1997; Скворцова, 1998). С целью оценки влияния инокуляции на способность ризосферного микробного сообщества к проведению этих процессов, определяли потенциальную активность азотфиксации и денитрификации в ризосфере при инокуляции семян ячменя чистыми культурами B.firmus и К. terrigena и их смесью в различных соотношениях. Измерения проводили на стадии начала цветения.

В табл. 2 представлены некоторые данные по инокуляции ячменя в деляночном

Таблица 2

Гекоторые результаты деляночпых опытов по инокуляции ячменя сорта Подольскнн-21" бактериями В.Агтиь ЕЗ и К. ¡егщепа Е6 (вегетационные езоны 1996 и 1997 гг.)_

Показатель В. firmus К. terrigena В. firmus -К. terrigena контроль (без инокуляции)

Азотфиксирующая активность в ризосфере (опыт 1997 г., начало цветения), нмоль этилена/сутки/г ризосферной почвы 27,6 ± 0,8 32,0 ± 1,6 62,0 ± 1,5 41,3 ±4,1

Урожай зерна (опыт 1997 г.), г/м2 657,5 ± 14,5 656,0 ± 10,9 743,5 ± 7,5 665,0 ± 8,1

Урожай соломы (опыт 1997 г.), г абс. сух. биомассы/м2 223,1 ±5,1 247,8 ± 7,2 245,0 ± 4,8 219,4 ± 7,3

Урожай зерна (опыт 1996 г.), г/м2 310,4 ±3,5 313,9 ±5,7 343,0 ± 6,4 310,9 ±4,3

Число зёрен в колосе (опыт 1996 г.) 17,7 ±0,2 17,3 ± 0,4 18,5 ±0,1 17,7 ±0.1

Прибавка N по сравнению с контролем, % на абс. сух. массу 0,09 ±0,01 0,08 ± 0,02 0,12 ±0,01 -

опыте. Внесение ассоциации повышало нитрогеназную активность на 20 нмоль С2Н4/г почвы/сут. при уровне контроля (без инокуляции) 40 нмоль СгНд/г/сут. Применение чистых культур В. /¡гтш и К. 1еггщепа не только не увеличивало, но даже снижало активность по сравнению с контролем. При использовании ассоциации не отмечено превышения активности денитрификации над уровнем неинокулированного контроля.

Более детально влияние инокуляции на азотфиксацшо и денитрификацию в ризосфере было исследовано в вегетационном опыте. В опыте изучали зависимость потенциальной активности азотфиксации от начального уровня внесения штаммов-компонентов ассоциации и состояния аборигенного микробного сообщества на момент высева семян, которое характеризовали с помощью коэффициента к -отношения численности микроорганизмов, определённой прямым микроскопическим методом, к получешюй по результатам высева на питательные среды. В случае "старой почвы" (СП), или зрелого микробного сообщества, к составлял 200, для "молодой почвы" (МП) к- 15.

На рис. 9 представлена зависимость азотфиксации в ризосфере ячменя от уровней инокуляции В. Агтш и K.terrigena при внесении на стадии "старого" микробного сообщества (СП). Данная зависимость имела куполообразный характер с максимумом, соответствующим дозам инокуляции каждого из штаммов 104-105 КОЕ/зерно (рис. 9). Для "молодого" сообщества (МП) области максимальной азотфиксации соответствовали уровню внесения В./ггтш 103-104 КОЕ/зерно при дозе инокуляции К. гегг'^епа выше 103 КОЕ/мл.

Таким образом, для "старого" и "молодого" микробного сообщества наблюдался разный характер зависимости азотфиксации от численности внесённых бактерий. В случае МП нитрогеназпая активность составила в среднем 86,1 нмоль СгРЦ/кг почвы/час, в то время как для СП эта величина была в 2 раза меньше. Известно, что эффект от инокуляции ризосферными азотфиксаторами максимален при их внесении на ранних стадиях микробной сукцессии (Ро1уашкауа, 7ууа§1Шзеу, 1995). Таким образом, варьируя уровень внесения штаммов и состояние микробного сообщества, в вегетационном опыте можно было добиться изменения азотфиксации в ризосфере ячменя в весьма широких пределах - 0,1 до 381,3 С2Н4/КГ почвы/час.

Денитрификация в вегетационном опыте была обнаружена только при внесении чистых культур В./ггтш и К. 1еггщепа или при резком (на несколько порядков) преобладании одного из компонентов в ассоциации. При использовании стандартной ассоциации В. [1гтш - К. 1егг^епа превышения над контролем отмечено не было.

Дисперсионный анализ позволил оценить вклад различных факторов в процесс азотфиксации в ризосфере ячменя. Как видно из данных, приведённых в табл. 3, наибольшее влияние из контролируемых факторов оказывало состояние

;стественного микробного сообщества ("аборигенов") - 28,7 %, следующим по шачимости был уровень внесения активного азотфиксатора - клебсиеллы (8,3 %). Злияние численности популяций шпродуцировапных бактерий в конце опыта уровней стабилизации) было невелико, что могло свидетельствовать о том, что эактерии оказывали своё действие на ранних этапах после инокуляции.

На основании полученных в опытах с растениями данных можно сделать вывод, что внесение ассоциации - К. ¡еггщепа в несколько раз усиливало способность

ризосферного микробного сообщества к азотфиксации и не увеличивало уровень ценитрификации в прикорневой зоне. При этом, важную роль в конечном результате играли естественное микробное сообщество и дозы внесения ассошшггов.

Таблица 3

Влияние интродукции В. /¡г/та, К. /егп^епа и естественного микробного сообщества на азотфиксацию в ризосфере и продуктивность ячменя в вегетационном опыте _ _ _

Фактор Влияние па азотфиксацию (% от всех факторов) Влияпие па среднюю длину побегов (% от всех факторов)

Уровень внесения В./гтю 1,5% 10,7%

Уровень внесения К. (егп^епа 8,3% 2,1%

Уровень стабилизации В. Агтш 2,9% -

Взаимодействие В. /¡гтт и К. ¡ег^епа - 16,7%

Взаимодействие "аборигенов" и К. гегг\%епа - 7,8%

Взаимодействие "аборигенов" и В. /¡гтш - 55,9%

Взаимодействие "аборигенов", В.^гтю и К (ггг^епа - 39,7%

Естественное микробное сообщество ("аборигены") 28,7% -

Денитрификания 6,6% -

Растение 0,5% -

Неконтролируемые факторы 51,5% 23,0%

Образование ФЛВ ассоциацией В. firmus — К. tcrrigena и её действие на фитопатогенные грибы

Помимо азотфиксации, ризосферные бактерии способны увеличивать урожай растений с помощью других механизмов: синтеза физиологически активных веществ (ФЛВ) и подавления развития фитопатогенов (Höflich etal., 1994).

С целью выявления способности к синтезу ФАВ, у культур В. firmus я К. terrigena исследовали образование цитокининов и гиббереллинов, а также потенциальную активность ауксинообразования. Результаты выражали в единицах концентрации

стандартных веществ своего класса: для ауксинов - в эквивалентах Р-индолил-3-уксусной кислоты (ИУК), цитокиншшв - зеатина (6-(4-гидрокси-3-метил-бут-2-е1шла)), гиббереллинов - гиббереллина A3.

У штамма К. terrigena Е6 выявлена способность к синтезу ауксинов, причём уровень синтеза достигал 6 мкг экв ИУК/мг биомассы для недельной культуры титра 108КОЕ/мл (табл.4). В.firmus не образовывал ИУК, но в ассоциации К. terrigena с В. firmus синтез ауксинов существенно усиливался. Можно предположить наличие связи ауксинообразования с азотфиксацией, поскольку синтез родственных ИУК ароматических веществ (фенол, ПОБ), влияющих на повышение нитрогеназной активности, также усиливался в ассоциации по сравнению с чистыми культурами. У изучаемых бактерий установлена также способность к образованию гиббереллинов и цитокипинов. При этом, только В. firmus синтезировал гиббереллины, причём исключительно на безазотной среде. Гиббереллины, продуцируемые В. firmus (287 мкг эквивалентов Аз/мг биомассы) оказывали на удлинение проростков карликового гороха такое же действие, как если бы сами растения синтезировали 9 мкг гиббереллина А3 на кг сухого веса, что является высоким значением. Цитокинины продуцировались только бациллой и только на азотсодержащей среде. В. firmus был способен синтезировать 3,17 нг экв зеатина/г биомассы. В ассоциация с клебсиеллой эта активность снижалась, а К. terrigena способности к синтезу цитокининов не обнаруживала.

Таблица 4

Синтез физиологически активных веществ бактериями В. firmus и К. terrigena в чистых культурах и в ассоциации. Приведены только данные, статистически достоверно (Р > 0,95) отличающиеся от контроля. __

Среда Культура Ауксины, мкг экв ИУК/мг биомассы Цитокинины, нг экв зеатина/г биомассы Гиббереллины, мкг экв Аз/мг биомассы

IPG-05 В. firmus - 3,17 -

К. terrigena 6,12 - -

В. firmus-К. terrigena 55,58 1,59 -

Доберейнер В. firmus - - 287,08

К. terrigena 6,34 - -

В. firmus-К. terrigena 11,12 - -

Таким образом, синтез ФАВ изученными бактериями далеко не всегда более активно протекал в смешанной культуре. Поскольку наибольший эффект от инокуляции отмечен именно для ассоциации, то, видимо, продукция ФАВ не играет решающей роли в увеличении урожая растений при инокуляции ассоциацией.

Рис. 9. íaiiiiciiMocii. активпосш а^тфнксашш в ризосфере ячменя (вегетационный опыт, интродукции в «старую» почву) от начального уровня внесения В. firmas и К. terrigena

5 4 "

Л

□ В. flnnus - К. terrigena

□ В. firmus В К. terrigena

-ti

m

Рис. 10. Фуш »статический эффект ассоциации В. firmus - К. terrigena и её компонентов

Другой тип положительного действия бактерий на растения связан с синтезом веществ, угнетающих рост фитоиатогенных грибов. На рис. 10 представлены данные по фунгистатическому действию ассоциации B.firmus и К. terrigena и её компонентов на наиболее распространённые в почве фитопатогснные и факультативно-патогенные грибы. Ассоциация замедляла рост таких видов, как Acremonium hortícola (вызывающего офиоболёз зерновых), Alternaría sp. (альтернариоз), Botrytis cinerea (серая гниль), Mucor plumbeus (плесневый гриб), Fusarium solani (корневые шили), Fusarium oxysporum (фузариозное увядание), Phoma sp. (пятнистости, гниль), Cladosporium oxysporum (оппортунистические инфекции, пятнистости). Чистая культура B.firmus значительно слабее воздействовала на патогенов, тогда как клебсиелла проявляла бблыпую активность. Самая высокая способность к угнетению роста грибов отмечена в ассоциации: в случае Acremonium harticola, Fusarium solani, Fusarium oxysporum и Phoma sp. величина зон угнетения была почти вдвое больше, чем для чистых культур. По отношению к грибам Acremonium harticola, Alternaría sp. и Botrytis cinerea изученные бактерии проявляли также фунгицидные свойства (лизис мицелия). Практически не было отмечено угнетения в отношении сапрофитных почвенных грибов Aspergillus ustus и Penicillium funiculosum.

Данные о высокой фунгистатической активности ассоциации B.firmus и К. terrigena были подтверждены в полевых опытах. Опыт, проведённый совместно со Всероссийским институтом защиты растений, был поставлен на фоне высокого уровня заражения ячменя фитопатогенами. Инокуляция ассоциацией снижала поражённость ячменя корневыми гнилями (Ophiobolus graminis), септариозом (Septoria hordei) - на 27 %, ринхоспориозом (Rhynchosporium graminicola) - на 14 %, а особенно (на 60 %) сетчатой пятнистостью (Drechslera teres).

Наиболее вероятной причиной высокого фунгистатического эффекта ассоциации B.firmus и К. terrigena могли быть выделяемые ассоциантами фенольные соединения. Как было показано выше, в ассоциации их синтез усиливался, при этом происходило и усиление фунгистатической активности. Известно, что фенол обладает антигрибным действием (Singleton, Sainsbuiy, 1993), а оксибензойные кислоты играют важную роль в фитоиммунитете (De Meyer, Hofte, 1997).

Влияние ассоциации В. Jtrmus - К. terrigena па урожай ячменя

Приведённые данные о разнообразных свойствах ассоциации В. firmus и К. terrigena лишь частично характеризуют её возможное действие на растения. Наиболее ценную информацию о бактериальных штаммах как возможных биопрепаратах можно получить, изучая их влияние на урожай сельскохозяйственных культур.

В деляночных опытах, поставленных в г. Пущино Московской обл. на серых лесных

почвах, изучали действие инокуляции ярового ячменя бактериями B.firmus и К. terrigena в течение двух вегетационных сезонов (1996 и 1997 гг.)

Предпосевная обработка зерна смешанной культурой обеспечила статистически достоверную прибавку урожая на 10 % при абсолютном значении контроля 310 г/м2 в целяночном опыте 1996 г. Па следующий год было также достигнуто увеличение урожая зерна на 12 % при уровне контроля 665 г/м2. Повышался также урожай соломы [на 25 г. абс. сух. биомассы/м2) (табл. 2).

Положительное действие изучаемой ассоциации проявлялось также по целому ряду других признаков. Коэффициент размножения семян повысился на 10% по сравнению с контролем, достигнув 37,8. При инокуляции ассоциацией увеличивались гакже длина колоса (с 6,5 в контроле до 6,7 см), масса колоса (с 0,69 до 0,79 г) и 1000 зёрен (с 40,69 до 45,80). Внесение бактерий привело к увеличению азотфиксации в ризосфере, что могло явиться причиной повышения содержания азота в зерне при инокуляции ассоциацией по сравнению с контролем (на 0,12 % в расчёте на сухой вес) 'табл. 2).

В отличие от ассоциации, эффект от внесения чистых культур часто не превышал контроля. Такое различие в действии чистых культур и ассоциации (ассоциативный эффект) наблюдалось по многим показателям. Так, например, каждая из чистых культур снижала урожай зерна и число зёрен в колосе, в то время как ассоциация повышала (табл. 2). В деляночных опытах обработка чистыми культурами В. firmus и К. terrigena снижала полевую всхожесть ячменя. По литературным данным, такое ивление характерно для чистых культур (Gilbert ct а!., 1993). В то же время, эактеризация ассоциацией не изменяла всхожесть по сравнению с контролем.

Вегетационный опыт позволил более детально изучить закономерности ззаимодействия изучаемых бактерий и растений. В табл. 3 представлены данные по злияншо различных факторов на длину побегов ячменя, полученные с помощью иногофакторного дисперсионного анализа. Большое влияние на растения оказывала интродукция бацилл (11 %), что подтверждает их важную регуляторную роль. Злияние К. terrigena было выражено более слабо. Действие естественного микробного сообщества на продуктивность растений статистически не доказано, в то зремя как, по литературным данным, для чистых культур оно играет определяющую золь (Майорова и др., 1996). Тем не менее, взаимодействие "аборигенов" с бациллами эпределяет показатели продуктивности на 17 %, с клебсиеллами - на 8 %. Ззаимодействие компонентов ассоциации по силе эффекта было равно 17 %. Самое :илыюе влияние на продуктивность ячменя оказывала комбинация всех трёх сонтролируемых факторов (уровней внесения каждого из штаммов и состояния 1боригенного сообщества) - около 40 %. В целом, варьирование этих факторов

позволяло целенаправленно изменять среднюю длину побегов ячменя от 41,2 до 54,9 см, а абс. сухую биомассу - от 4,48 до 5,37 г/сосуд.

В полевых опытах, поставленных в Порт-Катоне и Зернограде Ростовской обл., сравнивали действие ассоциации и используемых сейчас средств защиты и стимуляции растений.

Опыт в Зернограде проходил с ранним (25 апреля) и поздним (5 мая) посевом ячменя, на фоне внесения минерального азота (Ы50) и без азотных удобрений. Как видно из представленных данных (табл. 5), внесение азота заметно не влияло на действие ассоциации; при позднем посеве она увеличивала урожай ячменя примерно на 30 %, при раннем - на 15 % (урожай в контроле 25 ц/га). Непосредственно перед вторым (поздним) посевом почва была увлажнена дождями и, таким образом, зерна высевались на ранней стадии микробной сукцессии (МП), чем, вероятно, и объяснялся больший эффект от инокуляции при позднем посеве.

Опыт в Порт-Катоне был проведён на фоне экстремальных условий: при дефиците влаги в начале вегетации, ливневых дождях на стадии цветения ячменя, полегании, высоком уровне поражёшюсти фитопатогенами. В этих условиях ассоциация повышала урожай на 16 % при уровне контроля 30,1 ц/га.

В полевых и деляночных опытах ассоциация показала результаты, близкие к таковым химических протравителей (Фундазол, Байтан, Премис, Гранит) и наиболее широко применяющемуся сейчас в России биопрепарату Агат-25К (на основе бактерий рода Рзеийотопаз).

Таблица 5

Зависимость урожая ячменя (ц/га) сорта "Зерноградскнй-584" в полевом опыте 1997 г. в Зернограде от обработки зерна ассоциацией £./1гтих-К. /егщепа и другими препаратами.

Вариант Без удобрений, ранний посев Удобрения, ранний посев Без удобрений, поздний посев Удобрения, поздний посев

Контроль 23,8 ±0,1 25,0 ±0,2 23,0 ±2,2 24,5 ±0,1

Агат-25К 25,1 ±0,8 31,7 ±0,9 24,6 ± 0,9 27,6 ± 2,3

Фундазол 25,5 ± 1,0 26,8 ±0,1 24,7 ± 0,1 25,1 ±1,1

Байтан универсал 25,4 ±0,1 23,3 ± 1,3 25,1 ± 1,4 27,2 ± 1,5

В. Агтиз -К. ¡егп^епа 27,6 ± 0,2 28,3 ±0,2 30,1 ± 1,0 32,5 ± 0,5

Таким образом, по полученным результатам можно сделать следующее заключение: положительное действие ассоциации на растения главным образом обусловлено специфическим механизмом взаимодействия её компонентов через фенольные соединения и азотфиксацшо, а также способностью ассоциации выделять ФАВ и

защищать растения от фнтопатогенов. В серии вегетационных, деляночных и полевых опытов в течение двух лет инокуляция ассоциацией повышала урожай зерна ярового ячменя на 10-30 %, увеличивала содержание азота в зерне на 0,12 % по сравнению с неинокулированным контролем, причём чистые культуры по отдельности не оказывали стимулирующего действия.

Выводы

1. Из коллекции в 170 естественных ризосферных азотфиксирующих ассоциаций отобрана смешанная культура Bacillus firmus ЕЗ - Klebsiella terrigena Еб, отличающаяся высокой нитрогеназной активностью и обладающая стабильностью состава и свойств при длительном культивировании в лабораторных условиях.

2. Ассоциация В. firmus ЕЗ и К. terrigena Е6 более активно фиксирует молекулярный азот, синтезирует ауксины и подавляет развитие фитопатогенных грибов, чем чистые культуры-компоненты. Свойства ассоциации зависят от соотношения компонентов: например, максимум азотфиксации наблюдается при содержании бацилл 55 % по биомассе.

3. Основой устойчивости и указанных свойств ассоциации является специфическое взаимодействие её компонентов через метаболиты - фенол, иора-оксибензойную кислоту и азотсодержащие соединения, а также азотфиксацию, дыхание и pH среды. При этом, фенольные соединения, предположительно, играют ключевую роль как агенты взаимодействия.

4. При инокуляции ярового ячменя, ассоциация повышала уровень азотфиксации в ризосфере в среднем на 30 нмоль С2Н4/Г почвы в сутки в сравнении с чистыми культурами, а также увеличивала содержание азота в зерне на 0,12 % по сравнению с неинокулированным контролем.

5. В течение двух вегетационных периодов на разных почвах в различных климатических условиях ассоциация устойчиво повышала урожай ячменя на 10-30 %. Возрастали также следующие показатели: число зёрен в колосе, длина колоса, масса 1000 зёрен и масса соломы. В основе действия ассоциации на растения лежит комплекс взаимосвязанных свойств (азотфиксация, выделение ФАВ, фунгистатическое действие).

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Глаголева О. Б., Злотников А. К., Умаров М. М. (1994) Нитрогеназная активность в ризосфере рапса при инокуляции естественными смешанными культурами диазотрофов. Тез. конф. "Интродукция микроорганизмов в окружающую среду", Москва, 1994. с. 27-28.

2. Глаголева О.Б., Умаров М.М., Злотников А.К. (1994) Нитрогеназная активность ризосферных диазотрофных бактерий в чистых и смешанных культурах. Микробиология. 63(2). с. 221-227.

3. Глаголева О.Б., Злотников А.К., Умаров М.М. (1995) Влияние аммония на азотфиксирующую активность смешанных культур ризосферных диазотрофных бактерий. Микробиология. 64(2). с. 201-204.

4. Злотников А. К. (1996) Ризосферные диазотрофные бактериальные ассоциации. Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов - 96". М. 1996. Тез. докл. Сер. Почвоведение, с. 32.

5. Злотников А. К. (1997) Почвенные азотфиксирующие бактериальные ассоциации. Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов - 97". М. 1997. Тез. докл. Сер. Почвоведение, с. 49.

6. Злотников А. К., Глаголева О. Б., Умаров М. М. (1997) Взаимосвязь нитрогеназной активности, устойчивости и относительного содержания компонентов смешанных культур диазотрофных бактерий. Микробиология. 66(6). с. 807-812.

7. Злотников А. К., Умаров М. М. (1998) Влияние инокуляции ризосферной бактериальной ассоциации Bacillus firmus и Klebsiella terrigena на поражённость ярового ячменя фитопатогенными грибами. Тез. междунар. конф. "Современные проблемы микологии, альгологии и фитопатологии". М, 21 - 23 апреля 1998 г.

8. Glagoleva О., Zlotnikov A., Umarov М. (1996) Ammonium influence on nitrogenase activity of rhizosphere nitrogen fixing bacteria in pure and mixed cultures. In: Biological Nitrogen Fixation for the 21st Century. Proc. 10th Int. Congr. on Nitrogen Fixation, St. Petersburg, May 28 - June 3, 1995. Kluwer Academic Publishers. Dordrecht Boston London, p. 757.

9. Glagoleva O., Zlotnikov A., Umarov M. (1996) Structure and functions of microbial consortia taking part in nitrogen cycle. In: Proc. 8 IUMS Congresses' 96. Jerusalem, Israel, 8 - 23 Aug. 1996. p. 116.

10.Zlotnikov A. K., Glagoleva О. В., Umarov M. M. (1998) Barley yield increase after inoculation with rhizosphere nitrogen fixing consortium Bacillus firmus + Klebsiella terrigena. In: Biological Nitrogen Fixation for the 21st Century. Proc. 11th Int. Congr. on Nitrogen Fixation, Paris, July 20-25, 1997. Kluwer Academic Publishers. Dordrecht Boston London, p. 140.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Злотников, Артур Кириллович, Москва

Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова

Факультет почвоведения

На правах рукописи

Злотников Артур Кириллович ризосферная азотфиксирующая ассоциация Bacillus firm us -

Klebsiella lerrigena и её влияние на яровой ячмень при инокуляции

I

Специальность 03.00.07 - микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -доктор биологических наук, профессор М. М. Умаров

Москва, 1998 г.

Оглавление

Оглавление...............................................................................................................2

1 Введение......................................................................................................................4

2 Обзор литературы....................................................................................................8

2.1 Экологические и физиолого-биохимические свойства Bacillus firmus и Klebsiella terrigena.....................................................................................................8

2.1.1 Особенности экологии и физиологии Bacillus firmus.........................................8

2.1.2 Особенности экологии и физиологии Klebsiella terrigena................................10

2.2 Ризосферные микроорганизмы и их использование с целью повышения продуктивности сельскохозяйственных растений...................12

2.2.1 Ризосферное микробное сообщество..................................................................12

2.2.2 Азотфиксация и денитрификация в ризосфере.................................................14

2.2.3 Действие микроорганизмов на фитопатогенные грибы и бактерии...............20

2.2.4 1^ыделение физиологически активных веществ (ФАВ) микроорганизмами..22

2.2.5 Инокуляция растений чистыми культурами микроорганизмов.......................24

2.3 Биологическая роль фенольных соединений............................................31

2.4 Микробные ассоциации.................................................................................34

2.4.1 Микробные ассоциации как биологический объект.........................................34

2.4.2 Природные ассоциации микроорганизмов и их использование в деятельности человека..........................................................................................................................38

2.4.3 Инокуляция растений смешанными культурами микроорганизмов...............42

3 Экспериментальная часть...................................................................................45

3.1 Объекты и методы исследования.................................................................45

3.1.1 Объекты исследования.........................................................................................45

3.1.1.1 Выделение микроорганизмов.......................................................................45

3.1.1.2 Среды и условия культивирования..............................................................46

3.1.2 Методы исследования..........................................................................................47

3.1.2.1 Определение активностей азотфиксации и денитрификации..................47

3.1.2.2 Измерение активности дыхания и выделения СОг....................................52

3.1.2.3 Изучение динамики численности, физиологических показателей и рН в периодической культуре...........................................................................................53

3.1.2.4 Вегетационный опыт....................................................................................54

3.1.2.5 Деляночные опыты.......................................................................................57

3.1.2.6 Полевые опыты..............................................................................................58

3.1.2.7 Изучение динамики численности бактерий при интродукции в ризосферу...................................................................................................................61

3.1.2.8 Определение содержания азота в зерне и бесклеточной культуральной жидкости бактерий....................................................................................................61

3.1.2.9 Идентификация веществ, содержащихся в культуральной жидкости компонентов ассоциации..........................................................................................62

3.1.2.10 Изучение выделения физиологически активных веществ компонентами ассоциации.................................................................................................................64

3.1.2.11 Изучение действия компонентов ассоциации на фитопатогенные грибы и друг на друга...........................................................................................................66

3.2 Результаты и обсуждение..............................................................................66

3.2.1 Идентификация штаммов - компонентов ассоциации.....................................66

3.2.2 Азотфиксация у К. terrigena и В. firmus.............................................................70

3.2.3 Механизмы взаимодействия в ассоциации В. firmus и К. terrigena.................75

3.2.4 Динамика популяций В. firmus и К. terrigena в периодической культуре и при интродукции в ризосферу.............................................................................................82

3.2.5 Азотфиксация и денитрификация в ризосфере при инокуляции растений ассоциацией В. firmus и К. terrigena............................................................................87

3.2.6 Действие ассоциации В. firmus и К. terrigena на фитопатогенные грибы и выделение физиологически активных веществ..........................................................90

3.2.7 Действие ассоциации В. firmus - К. terrigena на растения...............................94

4 Заключение.............................................................................................................100

5 Выводы....................................................................................................................101

Литература...........................................................................................................103

Рисунки.................................................................................................................119

Приложения..........................................................................................................140

1 Введение

Важной проблемой современного сельского хозяйства остаётся снабжение растений доступным азотом. Производство минеральных азотных удобрений требует больших энергетических затрат (Avilio, 1998). Кроме того, их применение в высоких дозах при интенсивном земледелии приводит к загрязнению продукции и грунтовых вод нитратами. Ещё более неприятные последствия вызывает образующаяся при микробной трансформации этих удобрен^ в почвах закись азота (N20), способствующая парниковому эффекту и разрушению озонового слоя (Bouwman, 1990).

Альтернативой применению удобрений в агроэкосистемах является биологическая фиксация азота. Широко известен вклад симбиоза ризобий и бобовых в обеспечение этих растений азотом. Основным путём снабжения небобовых растений (зерновые, кормовые, технические культуры) биологическим азотом остаётся менее эффективная ассоциативная азотфиксация в ризосфере и филлосфере растений (Ladha, 1998). С целью повышения ассоциативной азотфиксации используются различные приёмы, одним из которых является инокуляция растений эффективными штаммами диазотрофов. В их числе наиболее часто применяются представители бактерий родов Azospirillum, Bacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Azotobacter, Enterobacter, Flavobaclerium и др. • (Höflich etal, 1994). Бактеризация растений ассоциативными азотфиксаторами достоверно повышает уровень фиксации азота в ризосфере, увеличивает содержание азота в зерне, урожай зерна и биомассы (Kojemyakov et al., 1998; Sawicka et al, 1998; Zavalin et al., 1998).

Инокуляция ассоциативными диазотрофными бактериями является одним из перспективных путей решения проблемы азотного питания сельскохозяйственных растений (Хотянович, 1995; Ladha, 1998). По данным различных исследователей, применение диазотрофов значительно повышает

урожай небобовых растений - от 5 до 70% (Burdman etal., 1998). Так, в различных экологических и почвенно-климатических условиях увеличение урожая при инокуляции эффективными штаммами диазотрофов (.Azospirillum lipoferum, Agrobacterium radiobacter, Arthrobacter sp., Flavobacterium) составляло 10-30% для злаковых культур, 20-40% для овощных (Kojemyakov etal, 1998; Sawicka etal, 1998; Zavalin etal., 1998). В ассоциации с кукурузой некоторые диазотрофы фиксировали 30-90 кг азота/га, а урожай пшеницы возрастал на 200900 кг/га (Govedarica et al, 1998). Инокуляция сорго, ячменя и озимой пшеницы ассоциациями ризосферных азотфиксирующих бактерий оказывала значительное влияние на продуктивность растений. Урожай сорго увеличивался на 15-30% в зависимости от выбранного сорта, а в растения поступало до 25% азота атмосфер^ (Бойко, 1989; Чеботарь, 1987, 1995).

Необходимо отметить, что стимуляция роста растений под действием высокоактивных азотфиксаторов далеко не всегда является следствием исключительно снабжения растения доступным азотом (Bashan, Holguin, 1997). Важное место в общем эффекте могут занимать также продукция физиологически активных веществ, антагонизм по отношению к фитопатогенам и другие механизмы (Höflich etal, 1994). Кроме того, согласно современным представлениям, два противоположных процесса - азотфиксация и денитрификация могут протекать в рамках одной и той же бактериальной клетки, причём большая выраженность того или иного процесса определяются внешними условиями (Zumft, 1997). Таким образом, суммарный эффект от внесения ризосферных бактерий определяется целым рядом факторов (Nehl etal, 1996). Важную роль играет, в частности, естественное ризосферное микробное сообщество, в которое был интродуцирован микроорганизм (Polyanskaya, Zvyagintsev, 1995).

Способность ризосферных бактерий повышать урожай растений позволила создать на их основе целый ряд биопрепаратов. В настоящее время в сельском хозяйстве России успешно используются такие препараты, как Агат-25К, Ризоплан, Бактофит, Алирин, Бамил и др. (Рекомендации..., 1996; Гилев, 1998).

В последние годы большая часть посевов хлопка в США обрабатывается биопрепаратом Kodiak на основе Bacillus subtilis (Brannen, Kenney, 1997). Несмотря на успешное применение биопрепаратов, важной проблемой при их использовании остаётся слабая воспроизводимость результатов (Майорова с соавт., 1996).

Одним из способов решения этой проблемы является использование смешанных культур микроорганизмов, в частности, естественных азотфиксирующих ассоциаций. В составе смешанных культур один из компонентов, как правило, способен выполнять функции, несвойственные другому ассоцианту (Khammas, Kaiser, 1992, 1998). Благодаря такому разделению активностей смешанные культуры способны более гибко реагировать на экологические факторы, полнее использовать потоки энергии и глубже утилизировать субстраты, чем чистые культуры (Вавилин, 1986). К настоящему времени известны примеры выделения из ризосферы бактериальных азотфиксирующих ассоциаций и их успешного применения для повышения урожая растений (Lippi et al, 1992).

Как и в случае чистых культур, для получения воспроизводимых результатов инокуляции смешанными культурами необходимо детальное исследование взаимодействия компонентов ассоциаций между собой и с растениями, а также с естественным ризосферным микробным. Только на основе изучения структуры и свойств ассоциаций можно выявить причины их положительного действия на растения. В известной нам литературе нет сведений о комплексном изучении естественных ризосферных азотфиксирующих ассоциаций.

В связи с вышеизложенным, целью работы явилось изучение биохимических, физиологических и экологических свойств естественной ризосферной азотфиксирующей ассоциации Bacillus firmus ЕЗ и Klebsiella terrigena Е6, а также исследование её влияния на ячмень при реинтродукции в ризосферу.

В задачи исследования входило:

1. Выделить коллекцию ризосферных диазотрофных ассоциаций.

2. Отобрать из коллекции наиболее активную ассоциацию, разделить её на компоненты и осуществить их идентификацию.

3. Провести исследование механизмов взаимодействия компонентов ассоциации и их функциональных особенностей в чистой культуре и при совместном культивировании, а также на фоне естественного ризосферного микробного сообщества.

4. Исследовать механизмы положительного действия ассоциации на растения и поведение исследуемых штаммов при интродукции в ризосферу ячменя.

5. Оценить влияние ассоциации на урожай инокулированных растений.

«

Автор хотел бы выразить свою глубокую благодарность П. А. Кожевину за помощь в математической обработке результатов, акад. П. И. Сусидко (РАСХН) и А. И. Дёрову (Донской селекционный центр) за руководство и участие в постановке вегетационных, полевых и деляночных опытов.

2 Обзор литературы

2.1 Экологические и физиолого-биохимические свойства Bacillus firmus и Klebsiella terrigena

2.1.1 Особенности экологии и физиол огии Bacillus firmus

Клетки представителей рода Bacillus обычно прямые, палочковидной формы с закругленными или "обрубленными" концами, часто в парах или цепочках. Размеры - 0,5x2,5 - 1,2x10 мкм. Подвижны за счет перитрихиальных жгутиков. Важным свойством бацилл является образование эндоспор. Аэробы или факультативные анаэробы. Отношение к повышенной температуре, рН и солёности сильно варьирует. Хемоорганотрофы. Старые колонии бацилл часто тёмноокрашены в результате синтеза пигмента полифенольной природы (Bergey's..., 1984; Biotechnology Handbook, 1989; The Procaiyotes, 1993; Определитель..., 1997).

Представители этого рода широко распространены в почвах разных типов, в т. ч. в ризосфере растений (Чеботарь, 1995; Мальцева с соавт., 1995), хотя бациллы считаются более типичными для открытой почвы. Некоторые бациллы способны к фиксации атмосферного азота, наиболее ярким примером является широко распространённая в почве Bacilluspolymyxa (Андреюк и Валагурова, 1992). В известной нам литературе нет сведений о способности Bacillus firmus к азотфиксации.

Многие бациллы выделяют во внешнюю среду внеклеточные высоко- и низкомолекулярные эксудаты и слизи. Так, например, В. polymyxa продуцирует полисахаридные слизи, свободные аминокислоты, другие органические кислоты и антибиотики (Ninomiya, Kazaki, 1969; Черкесова, 1971). Как и В. licheniformis,

она образует 2,3-бутандиол. Многие бациллы, в т. ч. В. firmus и В. pasteur и, синтезируют экзоферменты (уреазу) (Шлегель, 1987). В. firmus известен как активный продуцент протеиназ (Ландау с соавт., 1997). Вещества, выделяемые В. firmus, вызывают антираковый иммунитет и приводят к рассасыванию опухолей у крыс (Trebichavsky etal., 1997). Прижизненное выделение эксудатов клетками бацилл, а также освобождение после отмирания микроорганизмов внутреннего пула аминокислот и других веществ может играть существенную роль во взаимодействии бактерий этого рода с растениями и другими микроорганизмами в ризосфере. В работе Stabb etal (1994) показано, что выделенный из ризосферы штамм В. cereus является эффективным агентом

защиты сельскохозяйственных растений от фитопатогенных грибов благодаря ®

синтезируемому им антибиотику цвиттеромицину. Будучи реинтродуцирован в ризосферу, штамм сохраняет высокий уровень численности (104-106 КОЕ/см корня) (Halverson etal, 1993).

В. firmus, наряду с В. alkalophilus, В. lentus, В. agaradhaerens, В. cohnii и др. принадлежит к группе алкалифильных бацилл, способных расти на средах с рН до 12 (Krulwich et al., 1996). Бактерии могут поддерживать внутриклеточный рН на несколько единиц ниже, чем за пределами клетки, с помощью специфического Ка+/Н+-антипортера, движущей силой которого является электрический мембранный потенциал (Д¥), а не разность химических потенциалов (АрН) (Aono et al, 1996, Krulwich et al, 1996). Это свойство данной группы бацилл, позволяя им обитать в средах со щелочными значениями рН, имеет и ряд негативных сторон. Во-первых, при росте клеток происходит дальнейшее защелачивание среды. Во-вторых, работа антипортера противоположна по направлению деятельности дыхательной цепи, по которой протоны перемещаются вовне клеточной мембраны, что приводит к недополучению энергии от дыхания. С целью избежать биоэнергетических проблем, клетки алкалифильных бацилл содержат значительно большее количество цитохромов, в особенности цитохрома с, чем нейтрофильные аналоги. Специфическим для данной группы является цитохром асо,

содержащий гемы типа с, а и протогем а. Цитохром асо обладает высокой кислород-восстанавливающей активностью и синтезируется в клетках конститутивно, независимо от условий аэрации (Orii etal., 1991). Увеличение содержания цитохромов и усиленная работа дыхательной цепи приводит к повышенному потреблению кислорода при дыхании (Yumoto etal, 1991, Aono etal, 1996). Изучение группы алкалифильных бацилл считается перспективным с точки зрения теории биоэнергетики и практических приложений и в настоящее время активно развивается (Yumoto et al., 1997).

2.1.2 Особенности экологии и физиологии Klebsiella terrigena

Род Klebsiella принадлежит к семейству Enterobacteriaceae, в которое входят широко известные роды Salmonella, Shigella, Proteus, Enterobacter и др., а также наиболее детально изученный вид бактерий Eschreichia coli.

Клетки клебсиелл - прямые палочки размером 0,3-1,0 X 0,6-6,0 мкм, одиночные, в парах или коротких цепочках, имеют капсулу. Грамотрицательные. Неподвижные. Факультативные анаэробы. Хемоорганотрофы с дыхательным и бродильным типом метаболизма. Встречаются в фекалиях человека и клиническом материале, • почве, воде, зерне, фруктах и овощах. К роду принадлежит группа сапрофитных видов, выделяемых из ризосферной почвы, растений и растительных остатков. К этой группе относятся виды К. oxytoca, ozaenae, planticola, а также К. terrigena, впервые описанная в 1981 г. (Определитель..., 1997) Многие несапрофитные виды рода Klebsiella способны к сапротрофному росту.

Многие виды энтеробактерий способны к фиксации молекулярного азота. Азотфиксирующие энтеробактерии широко распространены в природе. Отмечена их связь с высшими растениями: энтеробактерии являются представителями эпифитной микрофлоры и в большом количестве встречаются в ризосфере. Способность развиваться как в аэробных, так и в анаэробных

условиях и в широком интервале рН, а также их высокая численность в ризосфере позволяет отнести их к одной из ведущих групп ассоциативных диазотрофов (Азотфиксация..., 1987). При изучении таксономического состава энтеробактерий из ризосферной почвы Канады (Duncan et al., 1972) 64-71 % изолятов были отнесены к роду Klebsiella, 14-19% - Enterobacter, 8% Citrobacter, осталь