Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ЭНДОФИТНАЯ РИЗОБАКТЕРИЯ KLEBSJELLA PLANTICOLA, ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С РАСТЕНИЕМ И ЦЕНОЗОМ МИКРОМИЦЕТОВ В ФИТОПЛАНЕ И РИЗОСФЕРЕ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ЭНДОФИТНАЯ РИЗОБАКТЕРИЯ KLEBSJELLA PLANTICOLA, ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С РАСТЕНИЕМ И ЦЕНОЗОМ МИКРОМИЦЕТОВ В ФИТОПЛАНЕ И РИЗОСФЕРЕ"

Л) Ш/6

На правах рукописи

БИРЮКОВА ОКСАНА ВЛАДИМИРОВНА

ЭНДОФИТНАЯ РИЗОБАКТЕРИЯ KLEBSIELLA PLANTICOLA, ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С РАСТЕНИЕМ И ЦЕНОЗОМ МИКРОМИЦЕТОВ В ' ФИТОПЛАНЕ И РИЗОСФЕРЕ

Специальность 03.00.07. - Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

I

Москва 2001

Работа выполнена на кафедре микробиологии Московской сельскохозяйственной академии им. К А Тимирязева

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор В.Т. Емцев.

Официальные оппоненты - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Л.В. Васильева; кандидат биологических наук, доцент Ю.М. Отройков

*

Ведущее учреждение - Всероссийский институт удобрений и агропочвоведения им. Д Н. Прянишникова (ВИУА)

Защита диссертации состоится Г* . :Г> " ч 2001 г в « ! » часов на

заседании диссертационного совета Д 220 043 03 в Московской сельскохозяйственной академии им. К А Тимирязева

Приглашаем вас принять участие в обсуждении диссертации на диссертационном совете МСХА или прислать отзывы на автореферат по адресу 127550, Москва, ул. Тимирязевская, д 49, сектор защиты диссертаций

С диссертацией можнч ткомиться в центральной научной библиотеке

МСХА

Автореферат разослан «

^01 г

Ученый секретарь специализированного совета-кандидат сельскохозяйственны»

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Изучение свойств ассоциативных азотфиксаторов изначально было связано с перспективой их использования как альтернативы минеральным азотным удобрениям для небобовых культур. Рядом исследователей было выявлено, что эти бактерии оказывают комплексное действие на растения (Nehl et al., 1996; Bashan et al., 1997; Reddy et al., 1999). Кроме улучшения минерального питания растений они обладают ростстимулирующими свойствами, а также повышают резистентность растений к различным фитопатогенам, что объясняется их выраженной в той или иной степени антагонистической активностью по отношению к микромицетам (Hoeflich et al., 1994; Govedarica et a/., 1998). В то же время остается актуальным вопрос технологии инокуляции. При выборе метода применения микробных биопрепаратов наряду с корневой инокуляцией все больший интерес вызывает новый метод - нанесение азотфиксирующих микроорганизмов на филлосферу растений (Khotianovich, 1996). Эффективность метода инокуляции зависит от особенностей взаимодействия интродуцированных бактерий с растениями.

В настоящее время остаются менее освещенными такие вопросы, как влияние способов инокуляции на приживаемость бактерий, воздействие интродуцентов на сообщество микроорганизмов в ризосфере и фитоплане растений, поражаемость растений заболеваниями. Кроме того,. в последние годы получены результаты, свидетельствующие о том, ассоциативные диазотрофы, колонизирующие поверхность растений, могут нередко проявлять свойства эндофитов, т.е. колонизировать еще и внутренние ткани растений (Емцев с соавт., 1995; Wood et al., 1993; Quadt-Hallmann et al., 1997; Song et al., 1998; Cocking, 1999).

Целью настоящего исследования было изучение способности бактерий Klebsiella planticola к колонизации растений и инвазии при их инокуляции различными способами, а также воздействия интродуцента на изменение состава комплекса микромицетов ризосферы и фитоплана.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

1. Изучить приживаемость бактерий Klebsiella planticola в ризосфере и фитоплане растений при их . инокуляции различными способами: традиционным предпосевным и обработкой листьев вегетирующих растений.

2. Изучить колонизирующую способность и инвазивность штамма при его интродукции под растения.

3. Определить влияние колонизирующей способности бактерий Klebsiella planticola на такие показатели ассоциативного симбиоза, как стимуляция

роста семян, накордщид_ассимилированного углерода растением,

нитрогеназную активность. ЦиН ГPA/lbf-)дИ

НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА Моск. сель^оз академии ИМ. К. А.■ "|№ипяз0ва

4 Изучить влияние различных доз азотных удобрений на приживаемость Klebsiella planticola в ризоплане и филлосфере ячменя при различных способах инокуляции растений

5 Изучить влияние различных способов инокуляции Klebsiella planticola на динамику и родовой состав микромицетов, в том числе фитопатогенных

6 Определить воздействие инокуляции семян и листьев ячменя бактериями Klebsiella planticola по фону различных доз азотных удобрений на динамику и состав микромицетов, в том числе фитопатогенных

7 Оценить влияние различных способов инокуляции Klebsiella planticola на поражаемость растений ячменя темно-бурой пятнистостью листьев и корневыми гнилями

Научная новизна Впервые изучены инвазивные свойства Klebsiella planticola ТСХА-91 по отношению к небобовым растениям Установлено, что клетки Klebstella planticola при инвазии в растение персистентны и способны мигрировать в его внутренних тканях Выявленные особенности взаимодействия Klebsiella planticola с небобовыми растениями позволяют отнести этот микроорганизм к эндофитным ризобактериям

Показано, что независимо от способа инокуляции бактерии колонизируют весь фитоплан растений, при этом уровень стабилизации численности интродуцента в течение вегетации растений составляет 103-10л кл/г сухой массы.

Впервые установлено, что интродукция Klebsiella planticola приводит к изменению состава комплекса микромицетов, населяющих фитоплан и ризосферную почву

Показано, что различные приемы инокуляции растений (семена или листья) эндофитной ризобактерией Klebstella planticola ТСХА-91 позволяют снизить поражаемость растений корневыми гнилями и темно-бурой пятнистостью листьев При этом число пораженных растений сокращается на 25-36%, степень развития заболевания уменьшается на 3-8%

Практически» значимость Отработаны оптимальные параметры инокуляции семян ячменя бактериями Klebsiella planticola Наибольшая эффективность инокуляции наблюдается при 30-минутном воздействии на семена 1-суточной культуры Апробированы различные технологии применения биопрепарата «Биоплант-К» для инокуляции небобовых растений традиционная предпосевная обработка семян, обработка листьев и сочетание обоих способов Показано, что инокуляция снижает поражаемость растения ячменя корневыми гнилями и темно-бурой пятнистостью листьев вне зависимости от способа инокуляции Наибольшая антифунгальная активность интродуцента наблюдается при сочетании предпосевной обработки семян и последующей обработки тистьев Результаты проведенной работы свидетельствуют о новых перспективах использования риюбактерий и, в частности, Klebsiella planticola штамм ТСХА-91, применяющегося в качестве основы препарата «Биоплант-К»

г

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на международной научно-практической конференции «Savremena poljoprivreda», (Югославия, Новый Сад, 1998 год), на международной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Направления стабилизации развития и вывода из кризиса АПК в современных условиях» (Воронеж, 1999), на Ежегодной Конференции ученых МСХА (Москва, 2000), на Второй Интернациональной Российско-Иранской Конференции «Agriculture and natural resourees» (Москва, 2001), на 13-м Международном Конгрессе по азотфиксации (Hamilton, 2001).

Объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части с описанием объектов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы. Материалы диссертации изложены на-/^страницах машинописного текста, иллюстрированы«?/ рисунком, таблицами и G приложениями. Список литературы включаетг&Ф наименований источников, из них /«&*на иностранных языках.

Автор выражает глубокую признательность и благодарность сотруднику кафедры низших растений МГУ к.б.н. Александровой А.А. за помощь, оказанную при идентификации выделенных микромицетов, сотруднику кафедры биологии почв МГУ д.б.н. Степанову АЛ. за помощь и методические советы при определении нитрогеназной активности, профессору Штару К. за предоставление возможности проведения экспериментов по изучению инвазивности и миграции бактерий внутри растений, а также использование радиоиндикаторных методов на базе института почвоведения и ландшафтоведения Университета Хоэнхайм (Германия).

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования были бактерии Klebsiella planticola ТСХА-91, выделенные из ризопланы огурца в 1990 году и полученные из коллекции кафедры микробиологии МСХА им. Тимирязева.

Для изучения инвазивности бактерий и их колонизирующей способности в зависимости от способа инокуляции применяли рифампицинустойчивый мутант Klebsiella planticola ТСХА-91 Rif200, способный. расти на среде LB с концентрацией антибиотика рифампицина 200 мкг на 1 мл среды, полученный методом последовательной адаптации к повышенным концентрациям антибиотика (Звягинцев с соавт., 1991). Этот штамм характеризуется нестабильной и более низкой нитрогеназной активностью в отличие от исходного штамма.

При культивировании бактерии высевались на среду LB (Luria Bertoni), содержащую 10 г пептона, 5 г NaCl, 10 г дрожжевого экстракта (Миллер, 1976). Для получения накопительной культуры использовали жидкие среды LB и к'2. Среда К2 имеет следующий состав: пептона 1,25 г, К2НРО4 0,5 г, Н2Р04 0,3 г.

MgS04 0,1 г, CaCI; 0,03 г, сахарозы 6 г, (NHj)jS04 0,14 г, дрожжевого экстракта 0,1 г на титр водопроводной воды

Тест-культуры ячмень посевной, сорт Зазерскии 85, райграс, много четкий, овес посевной

В схему опыта по изучению роли инокуляции в стимулировании си ты роста семян входили 1- ,2- ,3- ,4- суточные культуры Klebsiella plant/cola 1СХА-91, выращенные на среде /./?, в разведении 1 50, с временем экспозиции 30 минут, 1 час, 2 часа и 5 часов Оценка эффективности инокуляции проводилась с исполыованием морфофизиологической оценки проростков по 5-балльной системе Котонизирующую способность и приживаемость бактерии Klebsiella planticola штамма ТСХА - 91 Rif5"" в ризоплане и филюсфере ячменя в зависимости от способа инокуляции растений оценивали в микродетяночных опытах, которые были заложены на станции защиты растений МСХА Схемы опытов включали следующие варианты инокуляции обработка семян, обработка листьев и совместная обработка семян и листьев Семена инокулировали в суспензии клеток суточной культуры с титром 10*-10' кл/мл в разведении 1 50 в течение 30 минут Инокуляцию филлосферы осуществляли путем опрыскивания вручную из пульверизатора по всходам жидкой культурой с титром 10х-10s кл/мл, в разведении I 50

Для изучения влияния уровня азотного питания растении в диапазоне 30150 кг/га на приживаемось Klebsiella planticola в ризоплане и ришсфере растений ячменя также использовали рифампицинустончивый штамм Удобрения вносили в почву опытного участка за трое суток до посева вручную В качестве фосфорного удобрения исполыовали гранулированный двойной суперфосфат, калийного - хлорид калия, азотного - мочевину Уровни фосфорною и калийного фонов для всех вариантов 30 кг д в /га

Для изучения динамики численности и родового состава микроскопических грибов в качестве питательных сред использовали ю-агар (СА) и картофельно-гтюкозный агар (КГА) с добавлением молочной кислоты (4 г/т) Посевы производили методом предельных разведении пубинным способом в трехкратной новторности (Теппер с соавт, 1987) Колонии грибов подсчитывали через двое суток после инкубации, через семь дней определяли родовой состав доминирующих колоний с помощью определителей микроскопических почвенных грибов (Литвинов 1467 Кириленко, 1977, Билай, 1984, Bamett, 1972, Barron, 1968, Ellis 1971, Aix, 1981)

Нитрогеназную активность определяли ацетиленовым методом (Звягинцев, 1991) на газовом хроматографе CHROM-4-1 с пламенно ионизационным детектором

Фитосанитарное состояние посевов ячменя оценивали учетом поражаемости растений корневыми гнилями (Григорьев, 1976) и темно-бурой пятнистостью листьев (Чумаков, Захарова, 1990)

Инвазивные свойства штамма изучали в стерильном модельном опыте с семенами овса, которые выращивали на стерилизованной почвенной вытяжке в

бактериологических пробирках. Заражение субстрата проводили на 7а день выращивания с помощью введения шприцем с длинной иглой, избегая контакта с проростками, суспензии бактерий Klebsiella planticola ТСХА-91 Rif200 с концентрацией 109 кл/мл. Идентификацию штаммов, выделенных из гомогенатов тканей .корней и листьев проростков овса, проводили по фенотипическим признакам (рост на среде с рифампицином) и по наличию плазмидной ДНК. Выделение плазмидной ДНК осуществляли экпресс-методом Кадо с последующим электрофорезом. Электрофорез. ДНК проводили в агарозном геле (0,7%) следующего состава: агароза (тип 1 фирмы Сигма) с использованием трис-боратного буфера по классическому методу (Meyer et а/., 1976). .

Радиоавтографии райграса получали методом наложения фотобумаги на гербарий меченых растений в течение одного месяца.

Для исследования влияния разных способов инокуляции на ассимиляцию, накопление и распределение углерода в растениях ячменя, на транслокацию углерода в почву, а также для изучения приживаемости, инвазивности. и .миграции клеток инокулянта в растении в модельном эксперименте, проведенном в, Университете Хоэнхайм, использовали изотоп ,4С и' двухкамерные сосуды специальной конструкции, позволившей герметично изолировать верхнюю часть растений от нижней. Растения метили однократно в ат)«лсфере UC03, подаваемой в верхнюю камеру. По окончании эксперимента микробную биомассу в почве определяли методом экстракции -фумигации (Joerg<* tsen, 1995). Для определения содержания радиоактивного углерода в корнях,' листьях и почве их высушивали до постоянного веса при температуре 60"С, измельчали и на приборе Oxidazer Model 307 (Canberra Packard) сжигали, переводя выделяющийся при этом углерод в виде углекислого газа в раствор сцинцилляторного коктейля Permafluor Е* (Canberra Packard), Затем пробы анализировали на сцинцилляторном счетчике Liquid Scintillation Counter Tri-Carb 2000 CA (Canberra Packard). Статистическую обработку данных проводили с помощью компьютерной программы «Statistica» (ANOVA/MANOVA) и дисперсионным методом (Доспехов, 1979).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Колонизирующая способность н приживаемость ассоциативного дназотрофа Klebsiella planticola штамм ТСХА-91

1.1. Влияние физиологически активных веществ, продуцируемых Klebsiella planticola, на силу роста семян -

С целью выбора оптимальных режимов предпосевной, инокуляции семян для исследования колонизирующей способности Klebsiella planticola, влияния инокуляции на состав комплекса микромицетов, поражаемости растений болезнями,в микроделяночных полевых экспериментах был проведен

модепьный опыт по изучению влияния на силу роста семян ячменя метаболитов бактериальных культур Klebsiella planticola При -»том варьировали возраст кутьтур и продолжительность обработки семян Сила роста - показатель, соответствующий числу или массе сильных проростков Полученные данные показали, что при обработке семян 1-с\точной ку ii,турой в течение 30 минут образуется наибольшая масса сильных проростков (85,4 г и более, рис 1) При этом число непроросших семян было минимально - 8%, а остальные 92% проросли нормально Несмотря на то, что при увеличении возраста культуры (до 5 суток) и продолжительности обработки (до 4 часов) стимучирующее действие Klebstella planticola на силу роста семян возрастает растет и число непроросших и ненормально проросших семян Так, при применении 4-суточной культуры в течение I часа не проросли 33% семян, а 2% проросли ненормально

Рисунок 1 Изменение силы роста семян в зависимости от параметров инокуляции Klebsiella planticola возраста культуры и продолжительности обработки (модельный опыт)

Воздействие I-суточной культуры в течение S часов также было неблагоприятным (26% непроросших и 2% не соответствующих норме семян) По-видимому, длительное воздействие бактериальной суспенши с активными метаболитами молодой культуры подавляет силу роста семян, что сказывается на уменьшении коэффициента прорастания

9Д i

Ö3 82 147 CZ3 83 779

85 411 above

Таким образом, было выявлено влияние физиологически активных веществ Klebsiella planticola на эффективность прорастания семян и ее зависимость от параметров инокуляции. Было установлено, что эффективное воздействие на силу роста семян и прирост биомассы от инокуляции Klebsiella planticola достигается при 30-минутной предпосевной обработке 1-суточной культурой с титром Ю'кл/мл. Поэтому для дальнейшей работы были выбраны эти оптимальные сочетания режимов воздействия инокулянта.

1.2. Приживаемость Klebsiella planticola в ризоплане и филлосфере ячменя в зависимости от способа инокуляции растений

Приживаемость корневого ассоциативного диазотрофа Klebsiella planticola штамм ТСХА - 91 Rit200 на листьях и стеблях в зависимости от, способа инокуляции растений изучали в микрополевых опытах. При предпосевной инокуляции семян бактерии переходят на поверхность растений, и их численность, возрастая в течение вегетации, достигает 104 кл/г сухой массы (рис. 2). Характер изменения численности интродуцента на растении в вариантах с инокуляцией филлосферы имеет тенденцию ко : временному снижению численности, а затем ее возрастанию и стабилизации на уровне 104 кл/r сухой массы, что свидетельствует о приживаемости популяции внесенного микроорганизма.

Рисунок 2. Изменение численности Klebsiella planticola штамм ТСХА-91 Rif200 в зависимости от способа инокуляции в течение вегетации ячменя (микроделяночный опыт 1997 года).

Отмеченное падение числа жизнеспособных клеток ' внесенной популяции микроорганизмов характерно для периода адаптации к новым условиям обитания: источникам питания, аборигенной эпифитной микрофлоре. : Дальнейшее увеличение численности живых клеток в' филлосфере характеризует способность Klebsiella planticola быстро осваивать

предложенную новую среду обитания и выходить на довольно высокий для эпифитных микроорганизмов, стабильный уровень численности Следоватечьно, приживаемость Klebsiella planticola на растениях не зависит от способа инокуляции

В 1998 году был проведен аналогичный опыт для подтверждения полученных данных о приживаемости интродуцента при некорневой инокуляции Посте инокуляции филлосферы (табл 1) клетки Klebsiella planticola были обнаружены в ризоплане растений без предпосевной инокуляции семян в количестве 3,2x104 кл/г сухих корней, что по сравнению с вариантами предпосевной инокуляции (5,3x10 - 9,3x10 ) ниже на три порядка Сам факт присутствия Klebsiella planticola на корнях растений >того варианта через сутки после инокуляции филлосферы говорит о способности бактерии мигрировать к корням (хемотаксис) и быстро колонизировать их поверхность Наличие клеток Klebstella planticola в филлосфере растений с предпосевной обработкой семян на уровне 1,5x105 кл/г сухих тистьев позволило предположить, что, адсорбируясь на семенах при предпосевной инокуляции, Klebsiella planticola колонизирует в дальнейшем поверхность всего проростка и приживается на надземных органах растения так же, как и на корнях

Таблица 1

Динамика численности Klebsiella planticola штамм ТСХА-91 Riiiuu в ризосфере.

филлосфере и ризоплане в зависимости от способа инокуляции _(в х Ю' кл/г сух м ) (1998 год)___

Варианты Инокуляция J Инокуляция J Иноку тяция семян ! семян и зистьев 1 чистьев

Кущение ризоплана 93000 ! 52000 i 32

филлосфера 140 620 I 620

Грубкование ризоплана - I 92

филлосфера 13 73 | 17

Цветение ризоплана 11 7 1 | 0

филлосфера 1 1 28 I 11

Уборка ризоплана 4 1 ; 83 ; о

филлосфера 0 i 2 1 1 1

нет данных

Таким образом. полученные данные подтвердили прежнее предположение, что клетки Klebsiella planticola способны приживаться не только в ризосфере, но и в филлосфере растений и сохраняться там в течение всей вегетации вплоть до уборки на достаточно высоком уровне (дня чпифнтных микроорганизмов) - 103-104 кл/г сухих листьев В то же время отмечена способность бактерий, нанесенных на филлосферу, быстро (в течение суток) колонизировать корни также на высоком уровне численности - 10"1 кл/j сухих корней

х

В полевом микроделяночном опыте представлялось интересным изучить влияние разных доз; минеральных азотных удобрений на приживаемость Klebstella planticola. Оказалось, что изученный диапазон доз 30 - 150 кг/га на приживаемость бактерий не влияет и динамика численности имеет тенденцию ко временному снижению, а затем стабилизации на уровне Ю'-Ю4 кл/г в течение вегетации. - г

1.3. Изучение инвазивности Klebsiella planticola ТСХА-91

Для доказательства проникновения клебсиелл в ткани растений и возможности миграции этих бактерий внутри растения, на базе института микробиологии и вирусологии им. Гамалеи был проведен лабораторный опыт в стерильных условиях с использованием рифампицинустойчивого мутанта Klebsiella planticola. Выделенные из органов молодых растений овса клетки бактерий были идентифицированы не только по признаку рифампицинустойчивости и по , фенотипическим характеристикам, но и с помощью экспресс-метода • выделения плазмидной ДНК клебсиелл с последующим электрофорезом. -

Таблица 2

Выявление ДНК плазмид штамма Klebsiella planticola ТСХ А-91 Rir<w в органах овса (стерильный опыт по инокулированию овса) ••

Органы растений Обнаружение ДНК плазмид Klebsiella planticola

Сроки наблюдений, сутки

1 .3 5 7

листья и стебли не обнаружено не обнаружено обнаружено обнаружено

корни обнаружено обнаружено обнаружено обнаружено

■ Как видно (табл. 2), выявлена инвазионная способность штамма Klebsiella planticola ТСХА-91 Rit400 по отношению к молодым растениям овса и установлен факт его проникновения в ткани растения через корневую систему и миграции в надземные органы растения — листья и стебли. По-видимому, можно считать, что изучаемые бактерии проявляют свойства эндофитов. Это позволяет предположить, что взаимоотношения растений с вносимым при инокуляции штаммом не ограничиваются ассоциативным взаимодействием, но являются более специфичными и тесными. Для подтверждения того, что присутствие Klebsiella planticola в филлосфере было обусловлено именно способностью штамма колонизировать все растение, мигрируя по его тканям, а не какой-то случайной контаминацией, и ответа на вопрос о возможности миграции бактерий по растению в обратном направлении - в область ризопланы при инокуляции поверхности листьев и стеблей, мы провели следующие эксперименты.

ч

В модельном эксперименте, проведенном в 1999 году на кафедре почвоведения и ландшафтоведения в университете Хоэнхайм (Германия) изучали приживаемость и миграцию клеток инокулянта внутри растения Были установлены пути проникновения клеток инокулянта в ризоплану при инокуляции листьев и в филлосферу при инокуляции корней растений ячменя В эксперименте одновременно изучали ассимиляцию углерода растением и его транспокацию в почву В работе использовали изотоп |4С и двухкамерные сосуды специальной конструкции, позволившей герметично изолировать верхнюю часть растений от нижней и полностью исключить возможное |ь миграции бактерий по поверхности растения По завершении опыта на корнях растений, которые были поверхностно инокулированы, клетки Klebsiella planticola были обнаружены на уровне 1,2x103 кл/г сухой массы, на листьях их количество было ниже на порядок и составило 7,1 х104 (таб i 3) В варианте предпосевной обработки семян численность инокулянта на корнях была практически такой же, как и на корнях растений варианта обработки поверхностных частей растений, и составила 4,9x10' кл/г, в филлосфере же количество клеток инокулянта было значительно ниже (на два порядка) и составило 6,2x10J кл/г. В отмывочной воде (в которой отмывали корни от почвы перед посевом разведений для анализа ризопланы) было выявлено довольно большое количество клеток инокулянта, которые мы отнести к обитателям ризосферной почвы

Таблица 3

Численность Klebsiella planticola в растении и почве в твисимости от способа инокуляции в условиях изоляции надземной части растений от корней, ( *10' кл/г сухой массы) (модельный опыт, Университет Хо>нхаим)

Вариант Численность Klebsiella planticola

Листья Корни Раствор Ризосфера Почва Сумма на еосуд

инокуляция семян 62 490 63 0.42 03 560

инокуляция листьев 71 120 94 0,99 0 8, 290 1

Таким образом, установлено, что клетки ассоциативной диазотрофной бактерии Klebsiella planticola штамм ТСХА-91 обладают свойством инвазивности, проникают во внутренние ткани растений и способны к миграции в двух направлениях от корней к листьям и от шетьев к корням в зависимости от способа инокуляции Присутствие клеток инокулянта в растении говорит об их персистентности и подтверждено генетическими методами

1.4. Изменение количества ассимилированного растением углерода при инокуляции

Ишестно. что ассоциативные диазотрофы стимулируют рост и развитие растений, способствуют усилению процессов ассимиляции углерода (Bashan et al, 1997, Reddv et al, 1999) Для того, чтобы выяснить, обладает ли Klebsiella planticola способностью влиять на ассимиляцию углерода, нами был проведен эксперимент по изучению скорости процесса ассимиляции и распределения ассимилированного углерода в растении при его инокуляции Растения были выращены в модельном эксперименте в условиях оптимальной влажности и при 12-часовом периоде освещения

Анализируя первый опыт (без инокуляции) по радиоавтографиям, полученным методом наложения фотобумаги на высушеный гербарий верхних и нижних частей растении меченого райграса (где наибольшее затемнение изображения говорит о сосредоточении активности |4С на поверхности тканей), можно заключить, что продукты

ассимиляции в виде различных органических соединений (кистот, углеводов, муцигеля) становятся доступны микроорганизмам уже через 6 часов после поглощения углерода растением в виде 1ЛСО (рис 3,4)

Зоны наибольшей активности растений располагаются в филлосфере (на листьях и стеблях) Для надземных органов растений

„ _ характерно равномерное

Рисунок 3 Распределение г г г г

ассимилированного "С по распределение активности по всей

радиоавтографиям надземной части площади (рис 3) На

растении райграса равномерное радиоавтографиях зистьев через 1 1 распределение активности через 6 часов суток после внесения метки после внесения метки изменений в распределении "С не

выявлено Корни также успели включить новый углерод, причем наибольшее ттемнение приходится на зоны кончиков корней Здесь распредетение активности носит более точечный, или локальный характер, в огличие от равномерно затемненной филлосферы Это говорит о гом, что часть ассимилированного растением углерода, пройдя ряд биохимических превращений, через 6 часов выделяется на поверхность корня (по данным

и

других исследователей через 30 минут^. Кузяков, 2000), где становится доступной микроорганизмам ризосферы и фитоплана. Другая часть его встраивается в ткани растения и через 11-14 суток уже равномерно распределяется по всему фитоплану.

■Следовательно, при оптимальной влажности почвы и 12-часовом периоде освещения создаются благоприятные условия для интенсивного фотосинтеза растений и высокого уровня экскреции корневых выделений и, как следствие, повышается численность ризосферных и ассоциативных микроорганизмов. Это поэоляет сделать вывод, что не только поверхность корней, но и поверхность филлосферы также может служить хорошим питательным субстратом для ассоциативных бактерий, так как здесь создаются благоприятные условия для их приживаемости и обитания.

Рисунок 4. Распределение ассимилированного "С по радиоавтографиям корней райграса: а - выделение в виде корневых экссудатов через 6 часов после внесения метки; б - встраивание в ткани корня через 11 суток после внесения метки.

Во втором опыте изучалось влияние инокуляции Klebsiella planticola на распределение ассимилированного углерода в растении и его транслокацию в почву с использованием изотопа углерода |4С. По результатам расчета баланса содержания |4С в сосуде с растением (рис. 5), большая часть ассимилированного углерода накапливается в листьях независимо от инокуляции. Картина распределения UC в растениях, инокулированных либо через семена, либо через филлосферу, была идентичной. ЙорЯич инокулированных растений накапливали в своих тканях больше углерода, чем контрольные растения, что можно объяснить ростстимулирующим действием Klebsiella planticola и активизацией процессов ассимиляции. В то же время

12

при инокуляции выделение |4С02 за счет почвенного и корневого дыхания а также количество |4С, грансюцированного в почву сосуда, почву ризосферы и в микробную биомассу почвы, уменьшается В целом, при инокуляции возрастает содержание усвоенного растением углерода на 8 11%

мшроорг 1% 2% Миквоорг почвы ризосферы ризосфера

коони"- -

, почва

5%

пистья

56%

"ЖерыпочвЬ'

2% ризосфера 2% почва

Рисунок 5 Диаграммы распределения ассимилированного 14С в системе атмосфера почва растение в зависимости от способа инокуляции растении 1 - без инокуляции 2 - инокуляция семян

1.5. Нитрогеназная активность в ризосфере, рнзоплане и в филлосфере ячменя в зависимости от способа инокуляции растений

При изучении влияния разных способов инокуляции на приживаемость К(еЬмеИа рктпиЛа на растениях ячменя также определяли особенности проявления свойств бактерий - интродуцентов как ассоциативных азотфиксаторов В 1аблице 4 представлены результаты измерений нитрогеназной активности в фазы кущения и трубкования ячменя

Выявлено, что в фазу кущения при предпосевной инокуляции нитрогеназная активность в ризоплане растений была в два раза выше, чем в контроле В почве ризосферы измеренная активность также была выше в 1,4 раза Следующее измерение, проведенное в фазу трубкования, через 14 дней после инокуляции филлосферы, позволило выявить значитетьное (в 4 раза) повышение нитрогеназной активности в ризоплане растений с предпосевной инокуляцией семян и с инокуляцией листьев В варианте с совместной инокуляцией нитрогеназная активность быта выше в 7,5 раз по сравнению с контрольной группой растений

■ . , Таблица 4

Нитрогеназная активность в ризосфере, ризоплане и филлосфере растений ячменя в зависимости от способа инокуляции растений

Варианты Фазы развития растений

Кущение Трубкование

листья корни почва Листья корни почва

,. без инокуляции - 20,02 13,81 7,41 11,59 9,51

инокуляция семян - 40,82 19,73 9,48 46,99 11,89

инокуляция семян и листьев 14,48 86,53 15,51

инокуляция листьев - - - 10,84 46,22 11,91

В почве ризосферы всех инокулированных растений (независимо от способа инокуляции) нитрогеназная активность была в 1,8-2 раза интенсивнее, чем у контрольных растений. В филлосфере растений варианта с одновременной обработкой семян и листьев нитрогеназная активность была выше, чем в контроле, в 2 раза. Обработка только семян или листьев не вызвала существенных изменений интенсивности этого процесса.

Следовательно, сочетание предпосевной обработки семян с инокуляцией филлосферы оказывает существенное стимулирующее влияние на нитрогеназную активность на корнях растений, а также на листьях и в почве.

2. Влияние инокуляции микроорганизмами Klebsiella plant'tcola ТСХА-91 на микромицеты в фитоплаие и ризосфере ячменя

В ранее проведенных модельных исследованиях была выявлена фунгистатическая активность диазотрофа Klebsiella planticola ТСХА-91 по отношению, к ряду фитопатогенных грибов родов: Pénicillium, Aspergillus, Thelaviopsis, Altemaria и Mucor, что объяснялось способностью диазотрофа вырабатывать антибиотические вещества антрамицинового ряда (Емцев с соавт., 1995). Нами было изучено влияние различных способов инокуляции на поведение естественных грибных сообществ, населяющих ризосферу и фитоплан ячменя^ в полевых условиях под воздействием различных способов интродукции бактерий Klebsiella planticola.

Для исследования были выделены и определены 11 доминирующих родов микромицетов, в том числе включающих фитопатогенные виды и типичных обитателей почвы, не оказывающих прямого инфекционного действия на растения. Выявлено действие Klebsiella planticola на те роды

грибов, к которым относится большинство фитотоксичных и фитопатогенных видов Установлено подавление роста Fusarium, Verticillium и Alternaría в филлосфере и ризоплане Мисог и PemciUtum в ризосфере на протяжении вегетации при инокуляции растений (независимо от способа инокуляции) Отмечено .сильное ингибирование развития Cladosporium u Helmmtosporium в филлосфере, Cladosporium Helmmtosporium Verticillium и Aspergillus в ризоплане, Cladosporium, Verticillium, Fusarium Acremonium и Pénicillium в почве ризосферы инокулированных растений Инокуляция приводит к возрастанию доли микромицетов рода Tnchoderma, которые обладают выраженными антагонистическими свойствами ко mhoi им фиюпатгенам

Установлено, что положительное действие инокуляции на состав микромицетов почвы ризосферы и фитоплана значительно ослабляется при исполыовании доз азотных удобрений выше 90 кг/га, а при донг 150 кг/га практически не проявляется Невысокий же уровень азотного питания растений (30 Ki/ra) стимулирует способность Klebsiella planticola регулировать состав фитотоксичных и фитопатогенных грибов

3. Эффективность Klebsiella planticola на ячмене против фитопатогенов

3.1. Поражаемость ячменя корневыми гнилями в зависимости от способа инокуляции н фона минерального азота

В подавляющем большинстве случаев возбудителями пятнистостей и корневых гнилей зерновых культур (пшеницы, ячменя) являются фитопатогенные грибы Fusarium culmorum Helmmtosporium sativum Alternaría Nees Cladosporium fulvum, Botrvtis cinerea Pénicillium sp Ведущее место по числу фитотоксичных видов занимает род Pénicillium которому несколько уступают Fusarium и Aspergillus Для подтверждения полученных результатов о том, что Klebsiella planticola подавляет развитие большинства названных микромицетов, в первом микродетяночном опыте была изучена поражаемость растений в зависимости от способа инокуляции Установлено что все способы инокуляции способствуют уменьшению поражаемости растении учитываемыми болезнями (рис 6) Как показали наблюдения второго микроделяночного опыта по изучению влияния азотных удобрений на эффективность инокуляции (рис 7), антагонизм Klebstella planticola .ю отношению к возбудителям корневых гнилей проявляется в большей степени на фоне 30 кг/га азотных удобрений При »том распространенность болезни уменьшается в 2 раза, степень развития - в 2-3 раза Повышение дозы удобрений до 90 и 150 кг/га оказывает стимулирующее действие на почвенные фитопатогены, возрастает и поражаемость растении Фунгистатический эффект от инокуляции при этом снижается, но степень развития корневых гнилей по сравнению с необработанными растениями на тех же фонах азота все же меньше

is

12 3 (ущение

12 3 4 трубювание

12 3 4 цветение

1 2 3 4 уоорни

Рисунок в. Поражаемость ячменя корневыми гнилями в зависимости от способа инокуляции. 1 - без инокуляции; 2 - инокуляция семян; 3 - инокуляция семян и листьев; 4 - инокуляция листьев.

100 п

90 80 ^70

£60

о

S 50 то

га 40

CL О

С 30 • 20 • 10 ■

о распространенность заболевания ■ степень развития заболевания

•1 2 3 4.5 6 7 8 цлцение

1 2 3 4 5 6 7 8 трубювание

1 2 3 4 5 6 7 8 молочная спелость

Рисунок 7. Поражаемость ячменя корневыми гнилями при инокуляции семян и листьев на разных фонах минерального азота. 1 - контроль; 2 • К. planticola; 3 - N30; 4 - N3o + К. planticola; 5 - N90; 6 - N90 + К. planticola ; 7 - N150; 8 - NiSq + К. planticola.

i6

3.2. Поражаемость ячменя темно-бурой пятнистостью листьев в зависимости от способа инокуляции к фона минерального азота

Применение предпосевной инокуляции позволяет снтип. распространенность темно-бурой пятнистости листьев в фазу кущения ячмени на 20-23% Обработка листьев растений с предпосевной инокуляцией и без нее на 17-25°о уменьшает распространенность болезни в фазу трубкования (рис 8)

Члцеиие трубювание цветение уборю

Рисунок 8 Поражаемость ячменя корневыми гнилями в зависимости от способа инокуляции 1 - без инокуляции 2 - инокуляция семян 3 - инокуляция семян и листьев 4 инокуляция листьев

Сочетание бактеризации семян перед посевом и листьев по вечода^ на разных фонах минеральных азотных удобрений способствует снижению развития ¡аболевания Особенно это заметно при применении дозы 30 кг'га. ко[да распространенность темно-бурой пятнистости от инокуляции снизилась на 48° о, а степень развития - в 3,5 раза (рис 9)

При повышении доз вносимых азотных удобрений до 90 и 150 кг,га развитие »аболевания растет, но инокутяцня достоверно снижает его только н > фоне 90 кг/ia Гаким образом, наименьшая степень развития темно-бурой пятнистости в течение вегетации ячменя была у инокулированных растений выращиваемых на фоне 30 кг/га минерального азота, те невысокая дом cthmvтирует антагонистические свойства KlebsiellaplantiLola

I 7

100 90 • SO ■ #70 ■

м

§60

Is SO 1

пз

^40

о.

о

с зо • 20 • 10

п п п п п n

□ распространенность заболевания ш степень развития заболевания

Л

м

2 3 4 5 е »ущемив

7 8

8

1 2 3 4 S 6 7 8 молочная спелость

1 2 3 4 S б 7 ?рубювакие

Рисунок 9. Поражаемость листьев ячменя : темно-бурой пятнистостью при инокуляции семян и листьев на разных фонах минерального азота. 1 - контроль; 2 -К. planticola; 3 - N30; 4 - N30 + К- planticola; 5 - N90; 6 - N90 + К. planticola ; 7 - N150; 8 -N150 + К. planticola. ■

выводы

1 Применение метода выделения ДНК плазмид Klebsiella plant/cola позволило впервые установить инвазивность этих бактерий по отношению к небобовым растениям Обладая свойством инвазивности, Klebsiella planticola проникает во внутренние ткани растений

2 Присутствие клеток Klebsiella planticola в растениях указывает на их лерсистентность причем бактерии способны к миграции в двух направлениях от корней к листьям и от листьев к корням Это позволило впервые отнести Klebsiella planticola к эндофитным ризобактериям

3 Выявлено, что при инокуляции растений Klebsiella planticola традиционной предпосевной обработкой семян, а также обработкой листьев бактерии активно колонизируют весь фитоплан (корни, стебли, листья) При этом уровень стабилизации численности интродуцента в течение вегетации растении составляет 103-10* кл/г сухой массы

- Способность к миграции клеток Klebsiella planticola внутри растения может быть причиной колонизации поверхности всего фитоплана растения независимо от способа инокуляции

4 Эндофитные свойства Klebsiella planticola обусловливают ее высокую эффективность при взаимодействии с небобовыми растениями Так, в 4-7 5 раз усиливается нитрогеназная активность на корнях, в 2 раза возрастает накопление в корнях и листьях ассимилированного углерода

5 Впервые установлено, что эндофитная ризобактерия Klebsiella planticola, обладающая способностью к персистенции в инокулированном растении вызывает существенные изменения а составе комплекса микромицетов фитоплана и ризосферы

- Так было выявлено ингибирование Klebsiella planticola развития представителей именно тех родов микромицетов к которым относится большинство фитопатогенов Cladosponum u Helmmtosponum в филлосфере Cladosponum Helmmtosponum, Verticilhiim и Aspergillus в ризоплане Cladosponum Verticillium, Fusanum, Acremonium и Pénicillium в почве ризосферы инокулированных растений Рост Fusanum, Verticillium, и Aiternana в филлосфере и ризоплане. Мисог и Pénicillium в ризосфере при инокуляции был подавлен на протяжении периода вегетации растений

- В то же время показано, что при инокуляции семян и листьев растении Klebsiella planticola стимулирует развитие и рост микромицетов рода Tnchoderma в ризосфере, ризоплане и филлосфере ячменя

6 Установлено, что дозы минеральных азотных удобрений свыше 90 кг/га подавляют антифунгальную активность штамма-интродуцента При этом доля фитолатогенных представителей в микромицетных ценозах сопряженных с растением возрастает Внесение невысокой дозы азота - 30 кг/га, напротив, стимулирует антагонистические свойства Klebsiella planticola

7 Различные приемы инокуляции растений (нанесение на семена или на листья) эндофитной ризобактерией Klebsiella planticola ТСХА-91 позволяют снизить поражаемость растений корневыми гнилями и темно-бурой пятнистостью листьев Число пораженных растений сокращается на 25-36% степень развития заболевания уменьшается на 3-8%

ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ СЛЕДУЮЩИЕ РАБОТЫ:

1.Сарычева А.А., Виноградова Л.В., Бирюкова О.В. Сортовая специфика отзывчивости яровой пшеницы на инокуляцию ассоциативными диазотрофами. Бюлл. ВИУА им. Д.Н. Прянишникова, 1997, №110, 8-9 с.

2.Виноградова Л.В., Сарычева А.А., Бирюкова О.В. Фотосинтетические показатели посева различных сортов яровой пшеницы при применении препаратов ассоциативных диазотрофов. Бюлл. ВИУА им. Д.Н. Прянишникова, 1997, №110, 15 с.

3.Бирюкова О.В., Селицкая О.В., Емцев В.Т. Влияние инокуляции ячменя Klebsiella planticola на развитие микромицетов филлосферы и ризосферы. Международная конференция «ТЕМРО-НР'98», Югославия, Новый Сад, 1998, Т.46, 185-189 с.

4.Бирюкова О.В. Влияние инокуляции Klebsiella planticola на урожайность ячменя. Международная научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов «Направления стабилизации развития и вывода из кризиса АПК в современных условиях», Россия, Воронеж, 1999, т.3,78 с.

5.Бирюкова О.В. Высокая колонизирующая способность штамма Klebsiella planticola. Эффективность биологической защиты ячменя от фитопатогенов. Сборник, научных статей МСХА им. К.А. Тимирязева, 2001 (принято к публикации). -

6.Emtsev V.T., Bifjukova O.V., Selitskaja O.V. Diazotrophic Rhizobacteria Klebsiella Planticola And Its Ability To Colonization And Invasion. Abstracts for 13th Nitrogen Fixation Conference, Canada, Hamilton, 2001.

7.Birjukova O.V. Barley colonization by Klebsiella planticola in depends on the way of plant inoculation. The second International Iran and Rusia conference «Agriculture and natural resources». Russia, Moscow, February 1-2, 2001. 29-30

P- . .'.-..'.

Объем печ. л.

Зак. 24Г Тираж /00 экз.

AHO «Издательство МСХА» 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44