Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование фаголизиса Lactobacillus plantarum, используемых в кормопроизводстве и хлебопечении

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование фаголизиса Lactobacillus plantarum, используемых в кормопроизводстве и хлебопечении"

АКАДЕМІЯ !Ш МХІУБЛИКИ ІІАШСТАП Институт мііщхзбпологич и впрусологі'и

На прягя.х ]..уиоиисп

ШІЛБАЕВ ІСШАКШі

ІІССЛШЛШБІК ФАГОЖМСА iJVCTOBACTM.un тїгсднш'., ИСПОЛЬОУШЯ В КОШОІІРОИеВОДСЧБВ и ХЄБОіШЛЕЇШ

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на сопскагао ученої! стспоїш кпудилата Лао.тогитеских наук

Алма-Ата,’ 1392-

шлюдн^ш в Институте ми кро (1ио ло 1 *н и II иирусолопа, :',;..!’илын наук Ресиублаю! Казахстан

ШУЧИЫ* г/КиьиШШЧ: _ доктор биологичьских наук,

, профессор БЛ1.КЯ1Л0В .

кандидат бнологич^склх наук

СПС

А.ъ.шстош

.1,ии(1 иыюпгшти: дакмр медицинских наук,

щщъ с.оо [, К.И.ШЕШШЖО

1саш;адат биологических наук

С!Ю

в.сз.ишэдшв

»»• -/чр.:хд.:пи<* - Иши-нтут шш}Х>биояогии АЛ Республики

УаЗои’сган

«л ааеодгшии сиедаалыаидеоаынаго Оончта К.1)03.01.Ш ш защите дт^сртаци!'.'на соискание училой стапани кацдида/и биологичос-КИХ наук щ-.и Институте ышфобаолипш и вирусологии АП Респуй-Д1'.!Ш Г-азакотаа. 400100, Алма-Ата, Кирова, ЮЗ.

О ллосортацией можно ознакомиться и йад-тютоко 1Ьшй лд г.:> ;.усыикн Киоа:д:4чш, ^.-(иила-иТ'!, ьирош, АШ.

Аьго реферат разослан _______________________________19:Х; р.

.'■;Мц!та «пк'-тоигмя “

г. 1; 14 часоь

УЧУ1ШЬ сокретарк. 1ШамнДйЯиро ванного Сошта, кан.гд.нат биолагнчоекмх наук

!■

/ /"

\ У.С.Му.-гаиодиока

А;:г;ал7-яро1ь тсчы. И^сгатря на шг-мvm;'o етслмх йяктеряЯ я ’шде ззквпсок п проязшлсп-р rn.^:!-."ni’■ гл-сло-

№> ЧСЧЖГС проектор, СРРОП, ХЛй(1п, ПРИ СПЛС'ПГЛИПИ !--Г»-р П '-Л"-

чпсоколбястп П!»целий ей»- яеррдкя случав гггг-о>>, ричюс-

СП МОИОЧКО-ГСПСЛОГО брО^СШМТ. Одной IH НРЧЧПГ ПГТО 7ПЛ ПТНЛ -f\-

гочизпс "-шзчгсокт'лн.т. '^-якт-'ртгй. ( СоюЫ?в «.я. .I\V 1; Кн.-г^я

Ч гтр.,1ЭН5; Toufrin, 1Л5; Г'о*ч11п ч. п., lLB1;) . .

$ПГ0.7Я!«1С ИПЧОРПТ гчтптплышй улсрб чяроцкомг ХОЯЯРСТР?, У?!ЧНЫШОТСЯ <10 ТОЛЬКО 0^309 К0ЛЯЧ0СТ1Ю (5ЭКТеП1ЯЯМЧ« КЛ9Т0К »»

.virwmkg, коаяйкаот ляп, других нсактмдг.ччх послод«тглЯ. и т-"-пясле ухудглотоя кчпестяо продуктов, Н?~зз подалота-т гИ^птгя--чооти иакоплогшл молочпоР. кяолоти происходит punvmprcn^ ИОСЧ^-

ро иней МТ’.КрО'КлОрН, ЧТО мояог rtHTb npmtlliofi ПВДРПШГ ОТГ!Г.Н‘ПЯ“

(Иономпшап, Г-вГ; Даурч, Иерее, 1Л2; Parn«?t, J372; a-pw. 197Э; Янкопокля, I9t»3; u.um, I!)3;>), '

Исследование ф:>гот:.чпса особенно лктуатыго л-ы ч>'Г'оир >яп-

РОДОПза II ХЛ^бОШЗЧСПШТ, рдо ТОХЯОЛОГВЧССКИО ПГОИСССУ рг'ЪГТОЯ п ШЗСТОРИЛЫШХ УСЛОВВПТ. Б ЗТНХ произвол,СТШХ «fOTOSMOr.T) 0С7Г(ПСт-

.'*ить гормотязяцпп, прсиести терму- и ультра-}иолотокуп oijjmdOTKn

- приемн бор*бН о фагол-дяисом, зфЬектншо ncna«.5yo?m П Vгг.? отраслей пэдеглй рро-лаапониоо-ги. Вол'-датаио этого суететпу°т постоянная опасность теТпгягов-днвя модочпогасяь'х баи-гг.-нй, гл> .:7лии’с 13 состав закв-чскх.

■В скчяя с этш ;:'.'>31Г:;-/га :кобходт.!ост7> в цроглдон;;д с:лс>ат— ольигас чосярдопалк**. "о г-дзработко способов прмютнрапочпл iTo.rv;-лнзг.ел бпкгррпй г. з.тл«®мус лъх коргюиролпводстга и хлсдсиоченпч, , П?*т, плр-р?: г* источники ^агсян^ойгик в обгоктах ок-

рухащай среьи, изучить фаголизис штаммов ЬасіаЬасПіиа ріопіь-гшг. (І,, рі.і, асгюльзуамшс в кормогтроиз водстве и хлебопекарной иромиалешїости. .

Задачи исследования включали; .

1. Изучение распространения фагов молочнокислих бактерий в природные субстратах (почва, вода) различных географических 5ои (Казахстан, Киргизстан, Белоруссия, Россия - Московская, області.), ка растительных материалах (силос, сенаж, зерно, травяная мука, сено) и продуктах (молоко, мука, фрукты, овощи).

2. Сравнительное исследование морфологии фаговых частиц и

лігшческоіі активности выделенных фотов. ■

3. Получение фагоустойчивше вариантов культур і..ріаг^агші

с высокой клслотообразуицей способностью, изучение их стабильности. Сраьнеіше эффективности способов отбора фагоустойчивых вариантов. ,

4. Сравнительное исаледоваїше исходных и фагоустопчивнх

куль тур і.ріапіагшв . Вшівление морфологических особенностей

клеток и иных признаков,коррелирующих с фагоустойчивостыо.

5. Разработка практических рекомендаций по предотвращению фаголизиса штаммов молочнокислих бактерий, используемых в составе заквасок для кормопроизводства и хлебопечения.

Научная новизна. Впервые изучено распространение фагов различных шгакмов і-ріапіагшп в почвах, на растениях, в пищевых продуктах на территория республики Казахстан, Кыргызстана, Белоруссии, России - Московская область и определена частота их встречаемости. Среди группы из 28 фагов (из обуего числа 137 бактериофагов) отобранных дай детального изучения, ьшвлоно 7 груші фенотически. сходных бактериофагов.-

Источником (}.агов могут біт. лизопмншо кулі.тур». -т:і !:у;и,-тури обычно ИМОЮТ клеточную СТСШГ/ ТОЛЛИІІОІІ ДО ЬО ИМ. ilji',1 И НГО'к-цпи ультрафиолетовыми лучами или иитомищшом С лизог-чпих vj-г>-тур с таксі! сгенко'1, пиход '{ага шзрастапт проі:ор;Г)ігі:пльн:і Д'кл> и сроку воздействия аішуцирущого arrmu. Клотки, и:.:».-пч-лг* ctwi-ІСУ ТОЛВШИОЯ бОЛОО 80 ИМ, НО ИОДІИ’ІЯМВТСЇН шщукіш и не продуцируют dai’ дато поело обработки лот*игьнн?лі дозами іпідуїлора.

Виделонішо (Таги идонтичнн по [«реологии частиц. Они различается по активности :]аголизж;а, а тактів по и iiuto:!c;;d-

пост» образования вторичного роста бактериі! у, зонах лизиса. У с т л -новлсиа зависимость норуллизадоя молочнокислого брожшия, ;»осстч-і’/иїлешіл сахаролитнчоской актншостп культур от ср?гл мхр*”<:н:іл клетками признаков (Гагорозистентяос/ги.

Вияачим коррекция признако» фдгоустоіітогости и иитписии-ности кислотообразованил о толккної: глоточной стопки бактерії;;.

Нрчктичоскач значимость. /ля стабилизации тохиолоііпеохих процессов в кормопроизводство и хло^оіюкарноіі проміїлленности преллокен ке год отбора <Гнгоусто!ливігх культур ооноташшй на определенна толцішн клоточшяс стенок н отсоно ісультур нз портных колотій в зоно лнзиса, Рокомепдустся отбор куіьтур L.plO,ntarura с толщиной плиточной с тонки боле О £30 Iff.!, что коррелирует с фагорезистоитиостыэ и високим яислотосбіхазо-і'Ліиіем; отбор культур вторичного роста из зоні/ лизиса стабилизирует активность заквасок, по истечения срока фагорезистентиос-тп ютно получить повторно но виз фагоустойчивнв варианты.

ог/ корреляцию предложено использовать в качество критерия для отбора. Наряду с этим доказана также эффективность отбора устокчивтс культур из колоний вторичного роста в зонах лизиса после одпократного и повторного фагоинфицироволгая. В результате

- о -

отобран» штаммы, сохраняшцаа фагоустостнвость до 2В мосицов (срок наблюдения).

11л амии ту шлюсктсл положонпя : -

- О широкой 1<аСГ1)ОСТраИО!1ИИ ;]СГ01 Ь.р1ы^агит в объектах скруяатой «роды;

- о специфичности свойств внявченних фагов (ОЦР, сяактр т-тачоского д^Ьстши, влияние на бродильную активность культур, СрОКЦ И ИНТЕНСИВНОСТЬ ОбрЦЗОВиШи! вторичного гюста)5

- о припмуаостпе- отбора фагорсзистсштних культур по толщине 1Л1.точних стопок с сочоташп с отбором культур вторичного роста «осло однократного и попториого 4агопIг]а ци рош?Iшя.

Ангкоб.чция писанрт:л'1чош)о1’ работы. Материалы диссертации дилоашш н:: НорвоК кон^ф'дщцд вирусологов Казахстана (Алш-Ата, 1902), на Республиканской конференции "Микробиологические кон-сорван™ в ииьотноиодства" (Алма-Ата, 1Эо4), на УН съезде ШО (Алма-Ата, 1985), на ВсцсоюзиоЙ конференции "Интенсификация производства в повшаенио качества сира" (Барнаул, 1939), на Всесоюзной конкуренции "Инкрэйиологичоские и биотехнологические основы иитоншфишш! ристшшеьодст^а и кормопроизводства" (Алма-Ата, 1900), на Республиканской конфиропшш "Пробломи теоретической и прикладной танатики в Казахстане" (Алма-Ата, 1990), на Миавузошюй конф^рштан молод)» учвнда (Алнц-Иа, КазГУ, 1Э9Х) и на Заседании Кшадтота Ворхошоро Совета Казахской ССР по вопросам рышэгиин "Закона об охране окрукавдой природной ерэды в Казахстано” (Алиа-Ата, 1.991),

Объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литератур», ошсашщ объектов и методов исследовании, изложения и обсугдешш результатов работы, гаключошш и выводов, описка цитируемых литературных источников. Собственные исследо-

ванил автора иллвстряруштся 23 таблицами и рисушілми.

' СОДЕРЖАНИЕ ГАБОН!

Объекты и мотод» исследования В качество ИСТОЧНИКОВ ДЛЯ ПШШЛОН/Л ЫФУДГНГ’ШХ ■І.ЧГОІ) НС—

пользовались растятольнай мае си (силос, еоіглж и т.д.), попа вода, молоко, овощи И фрукты из различии» г';і‘иоі»от» (рчс.иублшл Казахстан, Киргизстан, Белоруссия я Росе;м - Иоскоиокзп огласи.), а умррпнннх (]>агоіз - ряэличиип штаммн молочнокислих бакторкР., в том числе музеііш.* культ/;;» яэ институтов; микробиологии и лиру оологии АН республики Казахстан, микробиологии ЛИ ІЧ'ЛОрусскп и других учреждений. -■

Б работа били лепояьзопани 130 стамшв і.рі'їмигта , гчделени ІЙ5 ізіірулсттша й 12 умерпшшх фагов.

Работы с фагами проводили яо моголам, оиисашш н книго Адамсз ( Адзмс, і 961).

ВяруЛОН'ПШО ']лт Ь.р1апЬа;'ип ЙОДОЛ/ШСЪ МЙТОДСИ ОбОГігіГ-НИЯ ( Сгозио, ’ШщсгпгЛ, 1958) и ДВУХСЛОЧНИМ МОТОДОМ ( СІМ! Ни, 1936),

Уморешшс 'іаги - мотодом индукции и баз иіідукщш (по Рау-тонетаїшу я модификации Мнтпята, 1974), в качоствб индуїшруших

п.

факторов ііснользовалисіі ,7£ - облучение (120, 240, ЗШ. ,1рг/мм' при І-*4 мий.) и шітоміїшш 0 (0,5, 1,0, 1,5 мкг/млЬ

Отбор фагорйзястеитшіх культур, изменив вдаліш фагов на кііслотообразущую способность различных шташюя молочнокислих бактерий, ввделешш вгорйчніл фягореэястентиих гсфнаняов с ис-слодомнием их свдііств гіротяй по К,И«Дерябшюі1 (1354) я йзиеЙ шдифшеация, . ' .

Ультраструктуру фато и й их хозяев, голишу іміятлндо: садки:,

гл<<2£& РАЕОЗЫ {Исслегсваняе *г?олг::::сг л 2цгслез;:е саг: вариантов 1с:-.с^:^:и5 т.'.г.г.-.г,—

Тт-

(Из разлгчянх*-всточкггог)

граструктура Адсорбция

горазистентностн

(I) Зкдс-леь:ис сактермогзров

■ (2) ИсслБЮваяг.е пс_в:;эте

УКЕ?»Нйа (Ка различая яагвв)

Лжтэтеекая активность к т.д. Роль прг кгслотссбрз-; зованы! различны:

! штампов

(3) Бцделоапс фатэусто1:чг5ых пультгр .

По ЙН^ЗГЕПСеЛЬЕОСТП

По толщине клеточных стекок

I

‘ (4) Заселение д исследование свойств вторичных фаторезкстентяых культур

- 1 ^ V * I

Зсял'л ьосстаяоьяангя Количество колоний к Патогенность Сахаролитичяость Срок еохра-

агтг.ЕЯОСтя вторичных ах оагорезястектность | (активная в нас- нения фаго-

гулыгр ' ! сивная по спектру резистент-

“ ' ! сахаролвтичяостгЛ носте

«

, (5) Повторное получение культур вторпчяого роста после потери

______йаторезистеятносга л сраБНЕтельянв свойства культур

> < » I *

Вг=:.п восстановления Количество колоний Патогенность Сахаролгтичность Срок сохранен!." ггт.глости вторичных ■ ?дгорезпстент-

кутьтур * ностп ,

о

стшгаїгь іі«дуци(3ел7.иоотя различии* втнлшв і..рип»*г-п опрчл*-лили «о методу А.С.Тихононко (1275, 1&М).

' РЕЗУЛЬТАТІ ИССЛШВАШІІІ

І. Распространенность і! числошюсть іїагоп Ьп.ПоЬасШиа ріапіашп в природних нсточн:5ках

Бактериофаги Ь-ріпигчз-іілі обнарухонн п рисокоЯ частою!: в различных образцах: в 20-30% зеленої: раститолт.но!1, насси, !Ю-40.2 почвм й волы, 40-50* образцов силоса и зориотш культур, 50-60$ - фруктов, овощей и молока (табл.І). Часта лнзогчншю штймми Ь.ріапіаги», і!3 ИспЛОДОМЖШХ 40 ІЗТамМОП 9 продуцируют фаги (табл.2).

Концентраті;! |агов составляет от дослтл до ноекольких дп-сятков с І грамме образна (тайл.і); ость й различия в тшцшт-рашіп в различных субстратах и по !юл[пста;шг> пх количпстла субстраты располагается о таком порлдко: почва, вода, расттшя, силос, сена*, оводи, фрукты я молоко. Вс?т^ из обследоаатшх образцов (язлТіїх 5 12 областях) п штаммов і..гічпііпт видс-локи 125 вирулентных и 12 уморешш фоготз.

2. Характеристика £игов ілсісЬюіПу - рі-л^тц-п н.І, Биологиччспіе свойства ї-.-гов '..го^гл-п:”',

5-аги Г-рдя.-іптіліі адсорбируются в теченпо 15-20 миггут (табл.З), инактивируется при 75-80°С. Размеры негативных колоний от 0,5 до 4 мм. Латентный период 25-40 минут, урояайнссть от 10 до 05 фаговых частиц из одной тфіцнрованно»! клетки. Они обладтот глірокими спекграліи этического действия (табл.4), фагд ■у.', і; $7 ліплруїчт 18 из 130 штздаов, тогда как фаги ф! и -$2 -

Распространенность фагсв Хас*оЪас111иЕ рІаа-Ьегиг: В природИЗГ ЯСТСГГЕИВ2І

Географическая зона !Количество йагов в одном граале к частота встречаемости (%) отбора проб ; почта і вода ізслек&я масса і сіуюс і ко

; растение

молоко

Ктстанайская обл. 1,1*10/20

{Натрзнский, Аркалык-СНИЙ, ДерзаБИНСЕЕЙ р-на)

Исснк-Хульсная обл. 0,7*10^/40

Иссык-Кульснвй р-ОН

Мннсяая область 0,7*10^/10

Ыякский район

Московская область 0,2*10^/10

Подольский р-ОЕ

1,3*10^/20 0,5*10^/10 2 Д*Ю3/30 6,2*104/30

0,2*Ю2Л0 і,3‘Ю2/40

0,5*10^/10 1,3*102/Щ

О^-Д^/ІО

1,2*10^/10

В,0*104/50 5,3-Ю4АО

2,0*Ю4/30 і,9*і02/40

2,2*Ю3/30 1,7*10^/40

Примечание: в таблица приведены средние? данные яз трехкратного анализа.

2, В числителе количество фагов в I г, в знаменателе частота встречаемости фагов в процентах.

Таблица 2

Лязогениость штаммов РасЪеЪасЗД Ніп |'1<іг.іпгип

Иіишкаторнно ,г ! Число исследован- ! Лкэопшшм

культуры ! ши штаммов ! шт;и.17.»

1121 40 ІМІ, ім;і

ЇІ25 20 ■ 1120

П 36 ■ 30 1Ш, ІШ

П50 40 1123, 117, 111 и

Шт.З 40 Л7-3

Шт.4 40 1138

78 и 60 штаммов соответственно. При этом і'Шівіиглсь такие особенности штаммов і-.ріпг-.їпгит ; но лизируктся іін одилм 'ілгом У:2 итамма Г-річі^агил с различно!! кисло тооАраэукгюй ахтіітіостк\ из тх - Ю шгашов с уровнем каслотоойразошши шлвд 1Ш0Т; а 12 штаммов - шиш 40°Т.

іісє Саги І.ріспг'ігая усгойчивк к и,#;~ому риспюру уксусной кислоти, применяемой и качество консаршнта явл^ией г.псси растений. Они устойчивы к действию 2Ь':' з шло ного оннрт.ч. Ирл обработке УС и течение 1,5 мин исс фати с одинаков-'*?. скорость?) пнактипиручтся.

2.іі. Електронношшрос:соиическое исслодсначдо фагоп

По ультраструктуро Ф.ігя j-.pl "іііг.г :>.• особо но отличаются мезду собой. Вирулентные >ї;іги с многогранно:! головної: рги?;;эрмли 75-85 нм :т отростком лднно;.' до 2и0 ш л ігприноіі 15-20 им, имоют базашіук г.ллс гпнку оломиого строения, !к отростка уороио про-сг.птрп).а<то>г. н.тфсч;? гт лкчорчепчость. ио ?.»р5ологла частин фиги

Свойства фаГОВ Lactobacillus plaaveraa

йаг' іВактєрия- і, ;газмер не-

^хозягн • гативные fcopCiviK, і

«г-О-тОііиГ- , } issh. і

; гял

si . ШІ 34 ' I-З 16 40

к ■ , . ■ H 4 ' ; : ■ -0,5-2 15 25

03 ' ■ ; . и & ■■ 2-4 15 35

£4 ' _ : ї 5 ' ■\ 2-4 15 35

©5 '■ і 3 с 0,5-2 15 25

£6 . Ч I 2-3 20 ■ 40

S7 " ’ ' ч г . 1-2 15 35

j "Урояаі1." фзга^Усто^тивость к і из олной ітеизературак,

; .клетки j £0

Т t

85-30 73

40-45 75 і

10-20 75 4-4 ю

45-50 ВО і

40-45 SO

90-35 $8 .

85-SC БО

Тайлица 4

Дитшшокая активность груап фагов

1,ас^аЬас111иа р1ап<:а1чот

Штаммы {Кислот- Г* б а г и

бактерий, номера ность !в °Т 1 11-15 12.16! 3.14! 4.10 !6.13 !6.13 II9.II

{17,18 | 25 | 22,27(21,23 ) 20 | 20 }19,26

В Т.Ч. I (Кб) ' 206 Фагоустойчивыа

2 (И) 183 ’ - - . - - - - -

3 (Щ) 181 - . - - - . - - . -

4 (К1) 179 - - - - - - -

5 С?ЛЭ8) 149 - - - - , - - -

6 (Г-Б) 142 - - - - - - -

7 (М4) 118 - - - - - — ‘ —

8 (ЫЭ) 112 - - - -. - - - '

9 (4К) 102 - - ~ - - - -

10 (?Л24) 100 - - - - - - -

II (М67) 145 Фагочувствителыша ~ + + + + + -

12 (69) 150 + + + + + - _

13 (МвЭ-1) 120 - + V - - + >

14 (145) НО + + - - + ■ - - .

15 (!Й8) 112 - ■ + - - + - -

103-114 40 и ника - - - - - - —

115-130 60-100 + + + + + + +

Всего исследованных 130 шт. В т.ч. фагочувствительных: 78 60 43 21 20 18 18

Примечание: (+) - лизис

(-) - отсутствий лизиса

отнесены но классификации А.С.Тихоненко к пятому типу, т.е. к (кігам с несокращавдимоа отростком (табл.5).

У умеренных фагов головка размолом 65-70 шл, хвостовой отросток длиной 255-160 нм и шириной 10-.'5 нм.

' Таблица 5

Ультраструктура фагов Lactobacillus plantarum

Фаги j Размеры, нм

і I

j головка j_______________отросток_____________

____________________________________________І ялина ! ширина

Вирулентные 75x85 180-200 15-20

.Уморенный - 65x70 155-160 10-15

■2.3. Влияние фагов на кислотообразование штаммов Lactobacillus plantarum . '

Фагочувствительные штамш при наличии фага резко теряют кислотообразование,.но кислотообразовашіо никогда не прекращается. Это объясняется активностью культур вторичного роста (До— рлбіша, 1954; Непомнящая, 1961;.Evans, 1979; таугпп, 1085).

При лизисе культур в ср.-ду ввделшзтся: ферменты, антибиотические продукти, перекиси, которые задерта *авт рост всей молочной микрофлоры. На активность фагсресис митного штадаа фаг и іпідуцирундае факторы не влияют (табл.6)„

Уровень іщслатообразования лнаогопнкглі ісультурами после їну-;у:и\ііи в три раза дакьие, чом в контроле, что сравнимо с показателями фагочувствительннх культур ним coiwcTHOM култ.тишцюса-j!mv; г.сслрдіШ-Х.со смот$ичеокякйі. йигаки.

Таблица В

Влияние фагов на кислотообраэоЕание штаммов

ЬаскоЬас±11иа р1аг^а1г1т

Кислотообтазованиа. °Т__________

! Контроль ! з присут- ! поело ]___________I ствин фага !ишгукнди

Фагорезистонтныэ Н6 206 205,5 206

Р1 181,5 182 182

Лизогошша П38 79,5 80 21

А7-3 70 69 17

Фагочувствиталышэ М69 ■ 148 26,5 148

_ М67 145 28 144,5

Фагочувствительныа плюс лизогеннне Ы6Э+А7-3 120 40 30

• Ы69+-П38 125 45 27

Фагоустойчивно штос фагочувстви- твлыше Я6+М69н$аг 142 139 141

■ Р1+М67+фаг 117 116 116

3, Приемы повшония фагоустойчивости штаммов

Народу с общим соблвдевдем есох санитарных норм технологического производства одним из способов повышения фагоустойчавости заквасочних культур является использование штаммов, отобранных по признаку устойчивости к коллекции цупвйннх фагов.

Из исслодоваших 130 штаммов 1..р1е1гЬагит 109 оказались чувствительными к 28 фагам, не липировался 21 штамм, т.'о, 16$ штаммов являются фагоустойчивыми. Интересно, что фагоустойчивно штаммы оказались в наших условиях и наиболее шелотообразуиршм. Среди фагоустойчивых встречаются и лизогонние штаммы, напришр: А?-3 и 1138 (табл.7). Выход фагов из клеток таких штаммов возрно-таот поело ицдухции. Используя большие лозы облучоншт, можно

пшрпть наиболее трудной ндугшбельные штаммн, как 4К и М24. Однако, как правило, среди штаммов с наиболее высокой кислотообразур-г(аЕ; способности ивдуцибельшх штаммов нет, например штаммн Нб, ('[, К1 не продуцируют фаг при дозах 240, 360, 480 (1-4 мин)

;рг/ммл У5. ' ■ -

Таблица 7

Критерии Фагорезйетентности штаммов

Г^сЬоЬасШиз рЛаг^агит '

~т:;

т.

(Кислотооб- |Ицдуцибель-|Толщина кле-^войсхпа

{разэваиие ( поста

{точных сге- (штаммон

! в °т 1.... ; нок, нм |

Н6 206 90-95 ФУ

Р1 182,5 . - 85-90 ФУ

К1 , 179. - ■ 85-90 ' ФУ

МЗЗ : 149 ~ 5Ь-Ш ФУ

М4 ' 117,5 - 40-45 ФУ

1*49 112,5 - . 40-45 ФУ -

мт,34 , 70 - -75-80 ФЧ

тэ ' 70 ’ - 55-60 $ч

4К 100,5 + 35-40 л

М24, - ■ 100 + . 30-35 . л

МЗГ . 80 ■ + ' ■ 30-35 ■ л

Л7-3 . . .70 + . 35-40 . л

[ -^ИржачаШю! (-) - не индуцибельныо

■ 1 ' (+) - ивдуцкбслышб прв ХФ 120, 240, 350,

. . ... 460/1-4 мин эрг/ш .

' ФЧ - фагочувстштелышо - , ФУ - фагоустойчлт-пп

' - ,. . Л - линогэикыо •

Поело отбора фагорезкстоитнш: культур исследовали коррелл-яшо Еютеуказанных показаюлоИ с голцшюй йлоточних стопок.

Как оказалось, кул вдм с чаиболыиои юлтьтообрэзуичэ]; спо-со5цоз*ь» (табл.?) шт.Лъ, (С07°Т), И(1ЙЯ,50Т) й К1(17Э°'Г) теш }ыя-5элсс тслопте глеточаис. стеикк (88-У5‘ км). .{«догодльо кулътурн:

1.124, П38, А7-3 - (100, 00, 70°Т соответственно) - тонкостенные (30-40 шл). Это свидетельствует, что существует определенная взаимосвязь мазду такими свойство.® Ь.ріапіагит как кислотсобразование, толщина іслеточніхх стенок и устойчивость к фатопораяи-нию. На основании изложенного можно заключить: для производства ну&но отбирать не лизогенные, толстостеннце фагоустойчнвие культура с высокой кислотообразувдєіі способностью.

4, Повышение фагоустоіічивосги лроизподственишс КУЛЬТУР Ьас^ЪасШиз ріапгахит 4.1. Свойства вторичных культур 1;.р1ап1;п:пт ,

‘ выделенных из зон лизиса

В процессо 4a.roлизиса заквасочные культуры временно теряют активность и от срока ее восстановления зависит как интенсивность течения в субстрате молочнокислого брожения, так и развитие нежелательной микрофлоры. Очевидно, что предпочтительно доминирование в закваске фагорезистонтнш: и на лизировашшг микробных клеток, так как они благо 11 р ия т с т ву ют скорому наступлению молочнокислого брохеїшя, что предотвращает развитие немолочнокислой микрофлоры.

После лизиса рост вторичной культуры ь.ріапіагига происходит 8 разное время для разных штаммов (табл.8) - через 68 часов у одной нары (штамм М4 и фаг 5), 66 - у другой (шт.34 и Ф2), 42 часа - у большинства пар, при этом молочнокислое брожение за счет вторичного роста пожат наступить как через 6-8 часов (как в случае с параш шташ Н69 и фаг 5, 114 с фагаш 4—5)» так и 24-26 часов (Т5 и ФІ, 34 и ФЗ). Вызываться оно может как наибольшим числом клеток і,.ріапіпгит : десятком, как в случае штамма М69 н фаг 4; сорока - в случае со штаммом 42 и фаг 2, так и болы.щ.ч (болео 1-Ю) - как в случао штзмт И69 и {ага 4, а тм :,-о пт 31 и

Свойства культур, ввделеннък ДЗ КОЛОНИЙ вторичного роста ЬасгоЬас111из рхалгагигз

Штаммы Количество колоний и.время (начало а конец) ■ • ■ ноеле лизиса Фатами образования

Ф1. 1 1 | | | Ф2 | 1 ! 1 ФЗ | г Ф4 | «5 •

М69 ' 34 96 ' 124 176 72

(42-53) (60-76) (42-68) (66-73) (42-50)

Фагоус-

тойч^-

вые.й

По С2::УТ“! Мес.,! Пата-ру !сох- 1гэя-

ролнтач. ! ране—! кзсть активные,!язя :

% !4агс-?

!р2зис4-. ' тент*-!

___________?носта!

К4

Т5

34

41

тг<э

64

114

(46-68)

97

(48-72)

140 . (42-60)

НО

(42-56)

120 (58-76)

Примечание:

(54-74)

117

(48-64)

137

(66-76)

63

(42-50)

НО

(56-70) а ,

ПО

НО

95

(56-68)

120

(44-58)

142

(48-74)

87

(56-87)

113

(56-64)

107 (44-58)

89 (си-74)

75

(56-72)

130

(68-74)

139

(42-54)

93

(54-66)

75

(42-62)

40

(42-56) (42-56) (42-54)

52

41

47

39

56

ЗС

88

32

83

88

88

92

26

24

25.2

25.2

(х-2х)

где а - количество колоний, х - начало, 2т - конец образования вторичных колоний в час.

(]*сІГОІЗ І И З, ХОМІ НО все вторичные культури ЯВЛЯЮТСЯ фсігоу(;■;■(,(! • чивими и активными по спектру сахаролитической активности.

Фагоустсйчивне вариант» у М69 и 41 составят 52 и 5*$, а у 42 и 34 - 36 и ЗЭ$. Спектр сахаролитическоіі активности сохраняется в большинстве случаев до уровня &з%, только у 114 к 4-1 - до 92%, при этом, возможно, но происходит сбраживание 1-2 углеводен.

Варианты вторичного роста, как правило, но проявляют патогенности и их фагорезистентность сохраплатся в течение 24-27 їм. ■ еяцев.

_ 5. Изучении культур ЬасіоЬасіїїиз р1аигагшпг ПОЛучен-

нкх после первой и повторной обработки фагами

Культури из вторичндх колоний зоны лизиса после определенного срока теряют фагоре зистентность И становятоя .{агочувстви-тельными. Но поело потери фагорезистеитности их можно снова обработать фагом и повторно отобрать фагоустойчивнй вариант. При стой отмечено изменение количественных и качественных показателей фагоустойчишх вариантов. Количество колоши! (табл.9) при повторном отборе увеличивается в 1,5-2,0 раза. Спектр еахаролютича о кой активности не изменяется, а признак фагоустойчивоста сохраняется на несколько месяцев дольше, чем у вариантов'после первой обработки фагами.

виводи

I. Установлено повсеместное распространенно фагов различных штаммов ЬаогоЬаоіНиа рЗипі;йгші : 20-30/о образцов зеленой растительной массы, 30-41$ образцов почва и води, 40~5и$ образцов силоса ц зернова культур, а также 50-60$ образцов Зруигав, ошщоН ц молока содержат ([яги. Максимальный титр Фагоп иыяшыа

'ГаЗлида г

Свойства культур из вторичных колоний после первой д повторной . обработки фагами

Штаьмы I лолошш вторичного роста послэ цервой ; 11 э них и повторной обработки фаггглн,

! Ч::сло колоний ! ■ ! % -ч.Тагоустойчдзнх % сахародитически!месяц сохранения активных : сиоторезистент-■ костя

1.169 ■ 58/135 52/05 ЗЗ/ТиО 26/27

КЗ 98/180 ' 41/82,5 52/100 • 24/25

Т5 ■ 116/185 : 47/91,8 68/100 25/26

34 120/152 ■ 39/31,2' . . 58/100 ■ 27Да

41 • 32 Д 30 56/95,5 35/100 25,2/27,2

42 102/187 . 36/95 32/100 25,2/25,4 •

б силосо (УхІО4 фаг/г) и л молоко (6,2х104 фаг/мл} .минимальный -

О О

п ночвах ( 0,2x10" фаг/г) и в воде - (0,2x10 фаг/мл).

2. Выделено 137 фато в ь.рінпіагига , из них 12 умеренных,

125 вирулентных. Фаги имеют сходное отроение: головку в формо многогранника размером 75x80 нм, отросток с поперечной исчерчен-иостыо длиной 180-200 нм, толщиной 15-20 нм. На основании зи-г: признаков исследованные фаги отнесены по классификации А.С.Тихо-ненко к V типу,

3. Время адсорбции фагов ь.ріапідаилі составляет до 20 ми-

нут ,с латентным периодом 40 минут, урожай до 95 фаговых частиц аз одной бактериальной клетки. Фаги инактивируются в 25$ спирте, при. нагревании выше 80°С. и после полуто'раминутной обработки ультрафиолетовыми лучами, .

4. При воздействии 28 вирулентных фагов на 130 штаммов I,. рі аг^агшп виявлено 7 фагорезистентных и 12 лизогенных культур. Фагорезистенише штаммы характеризуются повышенным кислотообразо-ваниом (Ю0-206°Т), лизогенные - пониженным (ниже 60°Т),

5. Показано, что критерием отбора фагоустойчивых вариантов монет быть толщина клеточных стенок. Для фагорезистентннх штаммов іі.ріапіагига характерны клеточные стенки толщиной более

80 нм, для фагочувствителышх - менее 60 нм.

6. Наиболее эффективным способом оабора фагоустойчивих та~ риантов ь.ріапьагшп является отбор культур из вторичных колоний из зоны лизиса, сочетавшийся с повторным фагоийфициро вашем и отбором. Из культур вторичного роста до 12% имеют широкий спега-р использования источников углерода, до 35;? их являются фяторезистентными.

7. Получены культуры, отличающиеся от исходных фягореяио-тсптностью, которая стабильно сохраняется в течение длительного

•г \б'.т-.в 2-к лет). :1пгор':оііотентішо слоями не являются

:-П<.--.<м;я^,тм. 0|И1 иілал'іг-т ГЛІС'іКИІШ ПрОИЗВОДСТВеННЬМИ П''Ч:іГ.-1ТО--г:,;, їі“ слиояші'М 'ісп) яэгив кулътут.; 'ШОЫЖКУЮТОЯ ГМ рпипт- ■

.г-1't'Kf л іг;фм')пр:!к:!і.с);с"Ті:з п хлобог!«г-! ия.

1Ь ; ’гггвпл.чм д'исоерт-"» у и гпуЛ”ішояа!Ш олрлуйцяп рп Iotf;

І, і>аяа£-*ге9 К,К., .v-'зшар I!.I, Спкяол^ш;;’ бактериофагов -■д^'.чпкне".их CaKTipv.v // Тоэ. .iro’.’f. пои?. тірусолоі'ов Кпялхпта-•п. ,\л.■■■■<-Ата, 120І.-С.Л)3-ІС4.

;і, К.ччуЗпєв К.К,, Евспалозд И„И,, Кочкияя И,А», Т^хонеико \,■.!, Рпру іентячч $агя шлочнокиглш: баи/ертііі, егдслршшо из cm го, ' Trt. ШО, УІІс мкробкологв’л - практик?. тРГЬ

І'.Ь.-ПЛ 3. '

3, чн кіапіз К.К,. Назкгав К.Й, Гаспроатріп^нпост/, бш.тгрлг. -

'•:і.гоп і'.уїцліах-иг’ в природник псіичшіклх: //Km, А!і fe?0,’F, '■у.'р.биол, Д957.~# 4. ,-0.50-53, -

4, ЧолокЗаїїв 1.1,Д,, рагшщшэтиэ. С.З., ї'анабчеч К. Ewn-jjiio--п; ii.pJ .'Mitariun, 'зцделоннне чз ц.яркпчиоЙ муга рчг-т-нинл cojvr -n

■■'/ Тр,ІЇЇІ АН КазССР ’’Непал, повкх п::\:роб;кпрггюр-тпр и п/л-ur-V t’v.vri -A'r;\, 193Э.-С,€с- (Ш,

’і-ідокбаов МД., Кун* 5 «в Г,, Новикова Ь.З. Фапшэг.с и хт/очіти'.'ннои измвшта-гэксаскп // Тс!3.докл.кэиф."йитмюи‘тита“ і.ї:iv /гр-па і! tcarrecw» eiya”. Барнаул, ІідЗУ.-Г ЛU. '

0. ілш-іЗаев К., Нокікокі А.С,, Чэлоко.э-?» ;.ї.д, Си?:ог.осої.'Ціі.н?-пости зсшкасок ддк сг.!;‘ч і/ Тгз.!;окл.кэнй>,,Яцт,?иса^!ка-* гдаї "Г'-п а качеезю сира'% Екрвчтз. ХЗД/’.-З.Лй.- . ' , . • •V. Чзлг»5ае:* ІЗ.Д». £акл.5;«?Б.К.,Д;лс~іот>окия Л,К,,

А,”. ;;г.т>’У2 3їкьй «о;од $ях:пкзаол.// їс.з.дои.

г:е•;:?:.р-ьк^>:*,г'^!::;;;осігодог^!?Оіс. '1;.с т?жш;;:~кі'е оснгйн ;і5і?иіся--

(|1:кацш! раст-ш и порюпроиагодства".Алта~Аам, 1 0..

8. Челокбаев 1ЛД.. Канабаои К«, Хмеловскш Л.К., Лоьпко;.,.

А.С. Несошестшлооть фагоуш'ойчяшх штаы.юв с фагочувстш-•/олышми в состава заквасок.//Тез.докл.всосоызп.кон£."Цикробао-м;

Л1ЧССК. биотехцол-кие ОСНОВ!] Ш1ТеНСГ.(ТИКГгПШ1 рПСЛ'-Еа И КОрШП] I' водства".Алма-Ата, ГЗШ. Секция I„-С.92.

9. Ыанабаев К., Чслокбаев М.Д., Гребонко В.В., Ьордшоьекг-и

&.Р. Фаголизис молочнокислых бактерий и' зависимо с ти от клоточию стопок // Тез.докл.всесоюзн.копф,"Микробиологичнск. бг.отехьол-кио основ» интенсификация раст-ва и 1юрюпройзшдетна".Алыа-А'и, 1900.-Секция II.-С.33. .

10. Чолокбаев М.Д.,- Паиабаев К., Бурашев &.С., Хигяогкв&ч л,К. Литичоская акчивиость молочяокислнх бактериофагов и ■пшноеть заквасок // Тйп.доклпнеосоюзн.конф."Микройнолотчсс.у., бпотохнол-кн»,- ос нош интенсификации Раст-ва и корпош'глпьол;'^:, ‘ Алма-Ата, 19Э0.-Секция II.-СЛОВ.

11. ^ишабаон К., Дкусупола А.Б. Получсил.; фагоустолчиашс нташоп шлош'-чшслих бакторий // Мат.роспубл.конК :"П|об”.Г|-.о;-..-. » нрикллцн.генотикп ь иага>:етан\)'\Алг:а-Атц, Ю^О.-С.'^иИ.

Подписана к иич!1'111 II,и4 г.

Тйрал 100» :;;ис.‘‘ :ч>3

О

т/1-С. '.’,ап, «';■> О Л ;г /> о Га ПК'&М Г >1